2/8/2010

1
FIZIOLOGIA BACTERIILOR. FIZIOLOGIA BACTERIILOR.
METABOLISMUL METABOLISMUL
MICROBIAN. MICROBIAN.
NUTRI NUTRIIA I RESPIRAIA IA I RESPIRAIA
BACTERIILOR BACTERIILOR
Fiziologia bacterian Fiziologia bacterian studiaz viaa i studiaz viaa i
activitile bacteriilor activitile bacteriilor nutriia, respiraia, nutriia, respiraia,
creterea i multiplicarea, condiiile de creterea i multiplicarea, condiiile de
cultivare a bacteriilor. cultivare a bacteriilor.
Metabolismul Metabolismul bacterian reprezint bacterian reprezint
ansamblul de reacii biochimice care au loc ansamblul de reacii biochimice care au loc
n celula vie. n celula vie.
-- Catabolism Catabolism reacii chimice de reacii chimice de
descompunere a substanelor complexe n descompunere a substanelor complexe n
elemente simple, nsoit de degajarea elemente simple, nsoit de degajarea
energiei (metabolism energetic) energiei (metabolism energetic)
-- Anabolism Anabolism reacii chimice de sintez a reacii chimice de sintez a
substanelor complexe din elemente simple, substanelor complexe din elemente simple,
necesit energie (metabolism constructiv, de necesit energie (metabolism constructiv, de
sintez) sintez)
Particularitile metabolismului bacterian Particularitile metabolismului bacterian::
1. 1. Este un metabolism Este un metabolism necompartimentat necompartimentat , , toate toate
procesele metabolice se desfoar intr procesele metabolice se desfoar intr--o singur o singur
celul celul
2. 2. Este foarte flexibil, realizndu Este foarte flexibil, realizndu--se prin diverse ci se prin diverse ci
metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la
condiiile mediului) condiiile mediului)
3. 3. Este foarte intens (viteza reaciilor este mare) Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)
4. 4. Produsele intermediare din procesele catabolice Produsele intermediare din procesele catabolice
pot fi utilizate direct pot fi utilizate direct n calitate de precursori n calitate de precursori
pentru reac pentru reaciile anabolice (amfibolism) iile anabolice (amfibolism)
n toate reacii n toate reaciile metabolice le metabolice intervin catalizatori intervin catalizatori
proteici specifici proteici specifici -- enzimele enzimele
Enzimele bacteriene Enzimele bacteriene. . Caractere generale: Caractere generale:
-- Substane proteice Substane proteice
-- Active n limite largi de temperaturi (0 Active n limite largi de temperaturi (0--65 65 C) C)
i de pH (2 i de pH (2--9) 9)
-- Specificitate de substrat i de aciune Specificitate de substrat i de aciune
(reacioneaz cu un substrat cataliznd un (reacioneaz cu un substrat cataliznd un
tip de reacie) tip de reacie)
-- Specificitatea este determinat de centrul Specificitatea este determinat de centrul
activ al enzimei, complementar cu activ al enzimei, complementar cu
receptorul de pe substrat receptorul de pe substrat
-- Nu se modific n cursul reaciei Nu se modific n cursul reaciei
Clasificarea en Clasificarea enzzimelor imelor
I. I. Constitutive Constitutive ((permanente permanente))
II. II. Inductive Inductive ((adaptive adaptive)), se sintetizeaz n prezena , se sintetizeaz n prezena
substratului (ex.: lactaza) substratului (ex.: lactaza)
III. III. Represive, Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n sinteza lor este inhibat de acumularea n
exces a pro exces a proddusului reaciei catalizate usului reaciei catalizate
Dup locul de aciune Dup locul de aciune ((exoenzime, endoenzime exoenzime, endoenzime))
Dup tipul reaciei catalizate Dup tipul reaciei catalizate ((oxido oxido--reductaze, hidrolaze, reductaze, hidrolaze,
transferaze, liaze, izomeraze, ligaze transferaze, liaze, izomeraze, ligaze))
Dup impactul asupra ma/o Dup impactul asupra ma/o
-- Enzime metabolice Enzime metabolice
-- Enzime de patogenitate Enzime de patogenitate, responsabile de modificri , responsabile de modificri
patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, hialuronidaza,
colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina, colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina,
lecitinaza, proteaze, lecitinaza, proteaze, etc. etc.
Importana practic a studierii enzimelor Importana practic a studierii enzimelor
1. 1. Rol n identificarea i clasificarea Rol n identificarea i clasificarea
bacteriilor (enzimele determin activitatea bacteriilor (enzimele determin activitatea
biochimic specific a bacteriilor) biochimic specific a bacteriilor)
2. 2. Unele substane chimice, antibiotice Unele substane chimice, antibiotice
interfereaz cu activitatea unor enzime, interfereaz cu activitatea unor enzime,
inhibnd creterea bacteriilor (tratament) inhibnd creterea bacteriilor (tratament)
3. 3. Determinarea mecanismelor patogenezei Determinarea mecanismelor patogenezei
infeciilor (unele enzime sunt responsabile infeciilor (unele enzime sunt responsabile
de producerea leziunilor n esutul gazdei) de producerea leziunilor n esutul gazdei)
4. 4. Aplicarea industrial a enzimelor Aplicarea industrial a enzimelor
2/8/2010
2
NUTRIIA BACTERIAN NUTRIIA BACTERIAN
Nutriia Nutriia modalitile prin care bacteriile modalitile prin care bacteriile
asimileaz din mediu substanele necesare asimileaz din mediu substanele necesare
pentru metabolism. pentru metabolism.
Modul Modul (tipul) de nutriie la bacterii este (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv absorbtiv. .
Nutrieni Nutrieni substane, soluiile crora pot substane, soluiile crora pot
traversa MCP pentru a fi antrenate n traversa MCP pentru a fi antrenate n
metabolismul celulei. Se obin din metabolismul celulei. Se obin din alimente alimente prin prin
solvire solvire (sruri minerale, CO (sruri minerale, CO
22
, O , O
22
) sau dup o ) sau dup o
digestie digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide). prealabil (proteine, polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelular (la La bacterii digestia este extracelular (la
bacteriile G bacteriile G-- n spaiul periplasmic) n spaiul periplasmic)
Nutrienii servesc n calitate de Nutrienii servesc n calitate de material material
de construcie de construcie i i surs de energie surs de energie
pentru sinteza compuilor i meninerea pentru sinteza compuilor i meninerea
vieii bacteriei. vieii bacteriei.
Transportul transmembranar Transportul transmembranar
1. 1. Difuzie simpl Difuzie simpl (conform gradientului de (conform gradientului de
concentraie, fr utilizarea energiei): concentraie, fr utilizarea energiei):
OO
22
, CO , CO
22
, acizi grai, nutrieni liposolubili , acizi grai, nutrieni liposolubili
2. 2. Difuzie facilitat Difuzie facilitat (conform gradientului de (conform gradientului de
concentraie) concentraie) permite transportul permite transportul
transmembranar al moleculelor mari prin transmembranar al moleculelor mari prin
intermediul proteinelor de transport intermediul proteinelor de transport
specifice specifice -- permeaze permeaze. .
3. 3. Transport activ Transport activ (contra gradientului de (contra gradientului de
concentraie, necesit energie). Particip concentraie, necesit energie). Particip
permeazele i alte proteine de transport permeazele i alte proteine de transport
specifice. Nutrienii nu suport modificri. specifice. Nutrienii nu suport modificri.
4. 4. Translocaie Translocaie substratul este modificat substratul este modificat
(ex.: fosforilat) n timpul transportului (ex.: fosforilat) n timpul transportului
membranar; necesit energie membranar; necesit energie
Substanele care au ptruns n citoplasm Substanele care au ptruns n citoplasm
sunt descompuse de ctre enzimele sunt descompuse de ctre enzimele
bacteriene conform cilor metabolice proprii bacteriene conform cilor metabolice proprii
fiecrei specii bacteriene (ex.: Embden fiecrei specii bacteriene (ex.: Embden--
Meyerhof, Entner Meyerhof, Entner--Doudoroff, ciclul Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine
energie i precursori care vor fi antrenai n energie i precursori care vor fi antrenai n
biosintez (anabolism). biosintez (anabolism).
Excreia metaboliilor Excreia metaboliilor difuzie, proteine de difuzie, proteine de
transport, liza bacteriei transport, liza bacteriei
2/8/2010
3
Necesitile nutritive ale bacteriilor Necesitile nutritive ale bacteriilor
-- Necesiti elementare Necesiti elementare, de baz: , de baz: C, H, O, N C, H, O, N n n
cantiti importante cantiti importante;; S, P, Fe, Ca, Mg, K S, P, Fe, Ca, Mg, K n n
cantiti mici i urme de cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo Co, Cu, Zn, Mo..
Bacteriile Bacteriile prototrofe prototrofe sunt capabile a sunt capabile a--i realiza i realiza
integral sinteza metaboliilor eseniali. integral sinteza metaboliilor eseniali.
-- Necesiti specifice Necesiti specifice. . Bac Bacterii teriile le auxotrofe auxotrofe
solicit suplimentar compui organici solicit suplimentar compui organici
preformai preformai ((factori de cretere factori de cretere)), care nu pot fi , care nu pot fi
sintetizai de sintetizai de bacterie bacterie (ex.: AA, baze purinice, (ex.: AA, baze purinice,
pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul
de cultur este indispensabil creterii acestor de cultur este indispensabil creterii acestor
bacterii. bacterii.
Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon
Bacterii Bacterii autotrofe autotrofe utilizeaz CO utilizeaz CO
22
ca unic ca unic
surs de carbon (nepatogene) surs de carbon (nepatogene)
Bacterii Bacterii heterotrofe heterotrofe utilizeaz carbonul din utilizeaz carbonul din
compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli, compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli,
etc) etc)
-- Bacteriile care utilizeaz materia organic Bacteriile care utilizeaz materia organic
mo moaart rt sunt sunt saprofite saprofite (reciclarea materiei (reciclarea materiei
organice) organice)
-- Bacterii Bacteriile le parazite parazite (obligate, facultative) (obligate, facultative) triesc triesc
pe contul organismelor vii, aducndu pe contul organismelor vii, aducndu--le le
prejudicii prejudicii
-- Bacteriile Bacteriile patogen patogenee reprezint reprezint parazit parazitee care care
afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau
moarte moarte..
Surse de azot Surse de azot
-- AA sau acizi nucleici AA sau acizi nucleici
-- Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic
Surse de substane minerale Surse de substane minerale: :
-- S S -- din AA, sulfuri, sulfai; din AA, sulfuri, sulfai;
-- P P -- din fosfai din fosfai;;
-- K, Mg, Ca, Na K, Mg, Ca, Na -- din sruri minerale; din sruri minerale;
-- Zn, Cu, Mn, Mo Zn, Cu, Mn, Mo din ap din ap
Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie
Bacterii Bacterii fototrofe fototrofe utilizeaz energia solar utilizeaz energia solar
(fotosint) (fotosint)
Bacterii Bacterii chemotrofe chemotrofe folosesc energia degajat din folosesc energia degajat din
reaciile chimice de oxido reaciile chimice de oxido--reducere. Ele necesit un reducere. Ele necesit un
substrat substrat donor donor de hidrogen de hidrogen (e (e
--
i H i H
++
) i un substrat ) i un substrat
acceptor acceptor de hidrogen de hidrogen. n transfer particip . n transfer particip
transportori intermediari de electroni (lanul transportori intermediari de electroni (lanul
respirator, NAD, NADH, FAD, etc.) respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)
-- Bacteriile Bacteriile chemolitotrofe chemolitotrofe donorul de H este o donorul de H este o
substan anorganic substan anorganic
-- Bacteriile Bacteriile chemoorganotrofe chemoorganotrofe donorul de H este o donorul de H este o
substan organic (glucoza, lipide...) substan organic (glucoza, lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe
Mecanismele de obinere a energiei Mecanismele de obinere a energiei la la
chemoorganotrofe chemoorganotrofe n funcie de acceptorul n funcie de acceptorul
final de H : final de H :
Respiraie aerob Respiraie aerob. Acceptorul final este . Acceptorul final este
oxigenul gazos. Implic lanul respirator de oxigenul gazos. Implic lanul respirator de
transport al electronilor asociat MCP. Produs transport al electronilor asociat MCP. Produs
final final HH
22
O sau H O sau H
22
OO
2 2
. .
Respiraie anaerob Respiraie anaerob. Acceptori finali . Acceptori finali
compui anorganici (nitrat, sulfat compui anorganici (nitrat, sulfat, S , S). ).
Transportul de electroni prin lanul respirator. Transportul de electroni prin lanul respirator.
Produse finale Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura nitritul, amoniacul, sulfura
((n prezen n prezena O a O HH
22
OO
22
))..
Fermentaie Fermentaie. Substratul organic este . Substratul organic este
metabolizat fr intervenia unui agent metabolizat fr intervenia unui agent
oxidant extern. Const n procese de ox oxidant extern. Const n procese de ox--red red
care realizeaz numai o oxidare parial a care realizeaz numai o oxidare parial a
substratului, donorul i acceptorul de H substratului, donorul i acceptorul de H
+ +
fiind fiind
substane organice. Astfel se ajunge de la un substane organice. Astfel se ajunge de la un
substrat mai redus la o molecul mai oxidat substrat mai redus la o molecul mai oxidat
(ex.: fermentare lactic, fermentare (ex.: fermentare lactic, fermentare
alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc). alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc).
Fermentaia se poate desfura n prezena Fermentaia se poate desfura n prezena
OO22, dar fr intervenia acestuia. , dar fr intervenia acestuia.
2/8/2010
4
Conservarea energiei Conservarea energiei
O parte din energia eliberat se pierde sub O parte din energia eliberat se pierde sub
form de cldur sau poate fi utilizat direct form de cldur sau poate fi utilizat direct
sub form de energie electro sub form de energie electro--chimic (fpm) la chimic (fpm) la
nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport
transmembranar) sau transmembranar) sau stocat stocat n compui n compui
chimici macroergici bogai n energie: chimici macroergici bogai n energie: ATP ATP
((sintetizat prin fosforilare oxidativ sau sintetizat prin fosforilare oxidativ sau
fosforilare la substrat fosforilare la substrat), ), fosfoenol fosfoenol--piruvat, piruvat,
acetilfosfat i acetil acetilfosfat i acetil--CoA. CoA.
n procesele de respiraie se elimin mai mult n procesele de respiraie se elimin mai mult
energie dect din fermentaie energie dect din fermentaie ((n glicoliz dintr n glicoliz dintr--un un
mol mol de de glucoz glucoz -- 38 mol 38 molii ATP ATP, prin fermentaie , prin fermentaie -- 2 2
moli moli ATP) ATP). n procese de fermentare se formeaz . n procese de fermentare se formeaz
deeuri rejetate de ctre celul. deeuri rejetate de ctre celul.
Clasificarea bacteriilor dup Clasificarea bacteriilor dup
sursele de energie i carbon sursele de energie i carbon
I. I. Bacterii fotoautotrofe (energie solar, Bacterii fotoautotrofe (energie solar,
CO CO
22
))
II. II. Bacterii fotoheterotrofe (en. sol., Bacterii fotoheterotrofe (en. sol.,
subst.org) subst.org)
III. III. Bacterii chemoautotrofe Bacterii chemoautotrofe
IV. IV. Bacterii chemoheterotrofe Bacterii chemoheterotrofe
(chemolitoheterotrofe, (chemolitoheterotrofe,
chemoorganoheterotrofe chemoorganoheterotrofe))
2/8/2010
5
CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR
Creterea Creterea mrirea coordonat a masei i mrirea coordonat a masei i
volumului structurilor bacteriene ca rezultat al volumului structurilor bacteriene ca rezultat al
proceselor de sintez proceselor de sintez
Multiplicarea Multiplicarea creterea numrului de celule pe creterea numrului de celule pe
o unitate de suprafa sau de volum o unitate de suprafa sau de volum
-- Divizi Diviziuune binar ne binar
-- nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme) nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
-- Autoreproducere (virusuri) Autoreproducere (virusuri)
-- Spori (micete) Spori (micete)
-- Fragmentare (actinomicete) Fragmentare (actinomicete)
Ciclul celular Ciclul celular procesele care au loc procesele care au loc de de
la formarea la formarea celul celulei p ei pna la urm na la urmtoarea toarea
diviziun diviziunee
1. 1. Faza C Faza C replicarea ADN replicarea ADN
2. 2. Faza G Faza G de laten, segregarea de laten, segregarea
cromozomilor cromozomilor
3. 3. Faza D Faza D de diviziune, formarea septului de diviziune, formarea septului
Replicarea ADN depinde de masa critic a Replicarea ADN depinde de masa critic a
celulei, iar separarea cromozomilor i celulei, iar separarea cromozomilor i
diviziunea intervin n momentul cnd diviziunea intervin n momentul cnd
celula atinge o lungime celula atinge o lungime -- limit limit
Perioada dintre 2 diviziuni reprezint Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul timpul
(perioada) de generaie (perioada) de generaie ((TT
GG
))..
Durata T Durata T
GG
depinde de specie i de condiiile de depinde de specie i de condiiile de
cretere (condiii optime cretere (condiii optime vitez maxim) vitez maxim)
Bacteria T
G
in vitro
(min)
T
G
in vivo
(ore)
Escherichia coli 20-40 5
Staphylococcus aureus 40 3-5
Vibrio cholerae 10 2-3
Mycobacterium
tuberculosis
120-240 24-48
2/8/2010
6
Creterea bacteriilor n laborator Creterea bacteriilor n laborator cultivare cultivare. .
Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din
medii naturale (prelevate patologice, medii naturale (prelevate patologice,
alimente, ap, etc). alimente, ap, etc).
Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru: Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:
1. 1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic) Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2. 2. Testa Testarrea sensibilitii lor fa de antibiotice ea sensibilitii lor fa de antibiotice
3. 3. Obinerea unor produi de biosintez Obinerea unor produi de biosintez
(antibiotice, AA), bioconversie (hormoni (antibiotice, AA), bioconversie (hormoni
steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici, steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici,
etc), producerea vaccinurilor, probioticelor... etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...
Pentru cretere bacteriile au nevoie de Pentru cretere bacteriile au nevoie de
nutrieni i condiii fizico nutrieni i condiii fizico--chimice adecvate. chimice adecvate.
Condiiile (principiile) Condiiile (principiile) de de cultivare cultivare
-- Surs nutritiv adecvat Surs nutritiv adecvat
-- Surs de energie Surs de energie
-- Ap Ap
-- Temperatura potrivit Temperatura potrivit
-- pH adecvat pH adecvat
-- Concentraie optim a oxigenului i a Concentraie optim a oxigenului i a CO CO22
-- Presiune osmotic adecvat Presiune osmotic adecvat
Temperatura de cretere Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime Exist temperaturi minime, maxime i optime
de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu
temperatura optim deosebim: temperatura optim deosebim:
1. 1. Bacterii psichrofile Bacterii psichrofile tt optim 10 optim 10--20 20 C. C.
Cresc i la 0 Cresc i la 0 C. C.
2. 2. Bacterii mezofile Bacterii mezofile optimum 30 optimum 30--37 37 C C
(limite 15 (limite 15--45 45 C) C)
3. 3. Bacterii termofile Bacterii termofile optimum 50 optimum 50--60 60 C C
(pn la 95 (pn la 95 C) C)
4. 4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70 Bacterii hipertermofile (cresc la 70110 110 C) C)
pH pH
1. 1. Bacterii Bacterii neutrofile neutrofile (majoritatea, inclusiv cele (majoritatea, inclusiv cele
patogene) patogene) pH 6 pH 6--7,5 7,5
2. 2. Bacterii Bacterii acidofile acidofile pH 2 pH 2--66 (Lactobacillus) (Lactobacillus)
3. 3. Bacterii Bacterii alcalofile alcalofile pH pH >>88 (Pseudomonas, (Pseudomonas,
Vibrio) Vibrio)
Presiunea osmotic Presiunea osmotic
1. 1. Bacterii Bacterii halotolerante halotolerante (osmotolerante) (osmotolerante) cresc cresc
n concentraii reduse de NaCl (mediu n concentraii reduse de NaCl (mediu
izotonic cu mediul intern al gazdei) izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o mi/o
patogene patogene
2. 2. Bacterii Bacterii halofile halofile prefer concentraii mari de prefer concentraii mari de
NaCl (1 NaCl (1--30%) 30%) stafilococi, vibrioni ( stafilococi, vibrioni (VVibrio ibrio
parahaemolyticus parahaemolyticus) )
Oxigenul Oxigenul
1. 1. Bacterii Bacterii strict aerobe strict aerobe cresc doar n prezena O cresc doar n prezena O
22
. .
Obin energia prin respiraie aerob Obin energia prin respiraie aerob
2. 2. Bacterii Bacterii microaerofile microaerofile necesit concentraii reduse necesit concentraii reduse
de O de O
22
i 2 i 2--10% 10% CO CO22. Obin energia prin respiraie . Obin energia prin respiraie
sau fermentaie (Neisseria, Brucella, sau fermentaie (Neisseria, Brucella,
Campylobacter Campylobacter))
3. 3. Bacterii Bacterii strict anaerobe strict anaerobe cresc doar n absena O cresc doar n absena O
22
. .
Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie
anaerob. Toxicitatea O anaerob. Toxicitatea O
22
formarea H formarea H
22
OO
2, 2,
a a
radicalilor superoxizi O radicalilor superoxizi O
22
--
, sau peroxizi O , sau peroxizi O
22
22--
pe care pe care
anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei, anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei,
superoxid dismutazei, peroxidazei) superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium, Clostridium,
Bacteroides Bacteroides
4. 4. Bacterii Bacterii anaerobe aerotolerante anaerobe aerotolerante pot crete n pot crete n
prezena O prezena O
22
, obin energia prin fermentaie, posed , obin energia prin fermentaie, posed
peroxidaz (Lactobacillus, streptococi) peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)
5. 5. Bacterii Bacterii facultativ anaerobe facultativ anaerobe cresc n orice condiii, cresc n orice condiii,
obin energia prin respiraie sau fermentaie obin energia prin respiraie sau fermentaie
2/8/2010
7
Mediile de cultur Mediile de cultur soluii sau substrate solide soluii sau substrate solide
care asigur nutrienii i condiiile fizico care asigur nutrienii i condiiile fizico--chimice chimice
necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate
pentru c pentru cultiva ultivarea rea (izolarea) (izolarea) bacteriilor, testarea bacteriilor, testarea
sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul
culturilor bac culturilor bacte teriene. riene.
Cerinele fa de mediile de cultur Cerinele fa de mediile de cultur
-- S asigure necesitile nutritive i energetice S asigure necesitile nutritive i energetice ale ale
bacteriilor bacteriilor
-- Umiditate optimal Umiditate optimal
-- pH optimal (7,2 pH optimal (7,2--7,4) i constant (caracter de 7,4) i constant (caracter de
tampon) tampon)
-- Potenial de oxido Potenial de oxido--reducere optimal (anaerobi reducere optimal (anaerobi --
rH rH
22
<<5, aerobi 5, aerobi rH rH
22
>>10) 10)
-- S fie izotonice (0,5% NaCl) S fie izotonice (0,5% NaCl)
-- S fie sterile i transparente S fie sterile i transparente
CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR
Dup provenien Dup provenien
1. 1. Empirice, naturale Empirice, naturale. Au la baz produse de . Au la baz produse de
origine animal sau vegetal (snge, ser, origine animal sau vegetal (snge, ser,
lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord, lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord,
creier, ficat, pete, levuri, etc) creier, ficat, pete, levuri, etc). C . Compoziia ompoziia
lor lor chimic precis nu poate fi controlat chimic precis nu poate fi controlat
2. 2. Sintetice Sintetice includ ingrediente chimic includ ingrediente chimicee pure, pure,
compoziia chimic este cunoscut cu compoziia chimic este cunoscut cu
exactitate exactitate
3. 3. Semisintetice Semisintetice
Dup consisten Dup consisten
1. 1. Medii lichide Medii lichide (bulion) (bulion) utilizate pentru utilizate pentru
obinerea biomasei bacteriene obinerea biomasei bacteriene i a i a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine) produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
2. 2. Medii solide Medii solide conin 10 conin 10--15% gelatin sau 2 15% gelatin sau 2--3% 3%
agar agar--agar (polizaharid extras din alge roii, t agar (polizaharid extras din alge roii, t
topire 80 topire 80--100 100 C, solidificare 42 C, solidificare 42 CC)). Placa de . Placa de
geloz n cutii Petri geloz n cutii Petri este utilizat este utilizat pentru pentru
izolarea culturilor pure izolarea culturilor pure, geloza nclinat (n , geloza nclinat (n
pant) pant) pentru pentru acumularea culturilor pure acumularea culturilor pure
3. 3. Medii semisolide Medii semisolide 0,2 0,2 0,5 % agar 0,5 % agar--agar. Se agar. Se
utilizeaz pentru utilizeaz pentru studierea activitii studierea activitii
biochimice sau a mobilitii bacteriilor. biochimice sau a mobilitii bacteriilor.
Dup compoziia chimic Dup compoziia chimic (complexitate) (complexitate) i i
destinaie destinaie
A. Medii uzuale (universale, simple) A. Medii uzuale (universale, simple)
1. 1. Ap peptonat Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5% (ap+1% pepton+0,5%
NaCl) NaCl)
2. 2. Bulion peptonat Bulion peptonat BP BP (extract apos din carne (extract apos din carne
+ 1% pepton+0,5% NaCl) + 1% pepton+0,5% NaCl)
3. 3. Geloza Geloza nutritiv nutritiv (BP + 2 (BP + 2--3% agar 3% agar--agar) agar)
4. 4. Gelatina nutritiv Gelatina nutritiv (BP + 10 (BP + 10--15% gelatin) 15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor
nepretenioase la cultivare nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120 Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min C, 20 min
B. B. Medii complexe Medii complexe
I. I. Medii elective Medii elective formate din medii simple cu adaos formate din medii simple cu adaos
de componente care permit creterea mi/o de componente care permit creterea mi/o
exigente nutritiv ( exigente nutritiv (bulion bulion--ser, bulion glucozat, ser, bulion glucozat,
geloz geloz--snge snge streptococi, streptococi, neisserii neisserii; ; ser ser
coagulat coagulat corinebacterii corinebacterii, etc) , etc)
II. Medii selective II. Medii selective medii solide cu adaos de medii solide cu adaos de
componente sau cu condiii fizico componente sau cu condiii fizico--chimice chimice
particulare care stimuleaz creterea unor specii particulare care stimuleaz creterea unor specii
i inhib creterea altor specii ( i inhib creterea altor specii (geloza salin geloza salin --
stafilococi stafilococi, , geloza alcalin geloza alcalin -- vibrioni vibrioni, mediul , mediul
Ploskirev Ploskirev -- Salmonella, Shigella, etc) Salmonella, Shigella, etc)
2/8/2010
8
Mediile de mbogire Mediile de mbogire reprezint medii selective reprezint medii selective
lichide, utilizate pentru mbogirea florei lichide, utilizate pentru mbogirea florei
patogene i inhibarea florei de asociaie dintr patogene i inhibarea florei de asociaie dintr--
un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale) un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale). .
Etap Etap premergtoare nsmnrii pe medii premergtoare nsmnrii pe medii
selective. selective.
-- Mediul Muller Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO (BP+Lugol+CaCO
33
+hiposulfit ) +hiposulfit )
-- Mediul Kauffmann Mediul Kauffmann ((mediul mediul Muller+bil+verde de Muller+bil+verde de
briliant) briliant) Salmonella Salmonella
-- Bulion cu selenit Bulion cu selenit Shigella, Salmonella Shigella, Salmonella
-- Ap peptonat alcalin Ap peptonat alcalin (pH (pH==8) 8) Vibrio cholerae Vibrio cholerae
-- Kitt Kitt--Tar Tarrrozzi ozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat) (BP+0,5% glucoz+buci de ficat)
pentru anaerobi pentru anaerobi
III. Medii diferenial III. Medii diferenial--diagnostice (DD) diagnostice (DD) permit permit
diferenierea speciilor bacteriene n baza diferenierea speciilor bacteriene n baza
activitii lor biochimice (zaharolitice, activitii lor biochimice (zaharolitice,
proteolitice, lipolitice, de oxido proteolitice, lipolitice, de oxido--reducere reducere))
Sunt construite dup urmtoarea schem: Sunt construite dup urmtoarea schem:
Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate) Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietilor Studierea proprietilor zaharolitice zaharolitice
Endo Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na de Na))
Levin Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen) (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de
acizi biliari+verde de briliant) acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile Coloniile lactozo lactozo--pozitive pozitive vor fi vor fi colorate colorate ((ro roii ii pe pe
Endo, Ploskirev, Endo, Ploskirev, albastru albastru--violete violete pe pe Levin Levin))
Studierea proprietilor de oxido Studierea proprietilor de oxido--reducere reducere
Mediul cu sulfit de Bi Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella pentru Salmonella
(c (colonii negre olonii negre reducerea reducerea sulfitului sulfitului n n
sulfura de Bi) sulfura de Bi)
2/8/2010
9
Mediul Klauberg Mediul Klauberg (geloz (geloz--snge cu telurit de snge cu telurit de
K) K) pentru pentru Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium diphtheriae
(colonii negre) (colonii negre)
Studierea proprietilor lipolitice Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu bacteriile cu
lecitinaz formeaz un halou opac n jurul lecitinaz formeaz un halou opac n jurul
coloniei coloniei
Studierea proprietilor hemolitice Studierea proprietilor hemolitice
Geloza Geloza--snge snge (geloza+5 (geloza+5--15% snge 15% snge
defibrinat) defibrinat)
n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o
zon clar zon clar
Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure
i identificare preliminar i identificare preliminar
Russel Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H
22
S) S)
Olkeniki Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede Indicatorul Andrede fucsin+NaOH fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor Scindarea glucidelor ((acid acid -- AA, , acid acid i i gaz gaz -- AG) duce la AG) duce la
modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n
galben. galben.
n pant n pant se apreciaz se apreciaz lactoza/zaharoz lactoza/zaharozaa (oxidare), n (oxidare), n
coloan coloan--glucoza (fermentare). glucoza (fermentare).
Producerea H Producerea H
22
SS n nnnegrirea mediului egrirea mediului
Medii DD pentru identificarea Medii DD pentru identificarea final final
a a culturii pure culturii pure
-- irul pestri Hiss irul pestri Hiss (lichid sau semi (lichid sau semi--solid) solid) un ir un ir
de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite
glucide i indicator. glucide i indicator.
Aprecierea Aprecierea dup modificarea culorii (acid dup modificarea culorii (acid -- A) A)
i apariia bulelor de gaz (acid i gaz i apariia bulelor de gaz (acid i gaz -- AG) AG)
-- Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i
indicatori indicatori
IV. Medii speciale IV. Medii speciale pentru izolarea unor pentru izolarea unor
anumite bacterii ( anumite bacterii (Finn, Popescu, Finn, Popescu,
Lo Loeewenstein wenstein--Jensen Jensen pentru agenii pentru agenii
tuberculozei tuberculozei, , Sabouraud Sabouraud fungi fungi) )
V. Medii de transport V. Medii de transport destinate transportrii sau destinate transportrii sau
stocrii unui material (prelevat), care va fi stocrii unui material (prelevat), care va fi
examinat ulterior. examinat ulterior.
Menine n via bacteriile, f Menine n via bacteriile, frr a favoriza a favoriza
multiplicarea lor. multiplicarea lor.
-- Mediul cu glicerin Mediul cu glicerin 30% 30%
-- Soluie tampon Soluie tampon--fosfat fosfat
-- Soluie NaCl 3% Soluie NaCl 3%
-- Mediul Cary Mediul Cary--Blair Blair
-- Mediul Stuart Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de
Na, albastru de metilen) Na, albastru de metilen) pentru anaerobi, pentru anaerobi,
neisserii, etc neisserii, etc
2/8/2010
10
Pentru Pentru cultivarea cultivarea bacteriilor o cantitate mic bacteriilor o cantitate mic
de material ce conine bacterii ( de material ce conine bacterii (inoculum inoculum) se ) se
ntroduce ntr ntroduce ntr--un mediu de cultur un mediu de cultur
((nsmnare, inoculare nsmnare, inoculare), care ulterior va fi ), care ulterior va fi
incubat incubat n termostat (pentru asigurarea n termostat (pentru asigurarea
temperaturii optime). temperaturii optime).
n timpul incubrii (18 n timpul incubrii (18--24 24--48 ore 48 ore.. ..) bacteriile ) bacteriile
cresc i se divid, formnd o cresc i se divid, formnd o cultur cultur
bacterian bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate (totalitatea bacteriilor acumulate
prin multiplicare intr prin multiplicare intr--un mediu) un mediu). .
M.tuberculosis M.tuberculosis 33--5 sptmni 5 sptmni
V.cholerae V.cholerae 66--12 ore 12 ore
Cultur pur Cultur pur format din bacterii de format din bacterii de
aceeai specie (indispensabil identificrii) aceeai specie (indispensabil identificrii)
Cultur mixt Cultur mixt compus din bacterii de compus din bacterii de
specii diferite specii diferite
Tulpin Tulpin populaie microbian constituit populaie microbian constituit
din descendenii unei singure izolri n din descendenii unei singure izolri n
cultur pur, care va fi studiat ulterior. cultur pur, care va fi studiat ulterior.
Clon Clon populaie care rezult din populaie care rezult din
multiplicarea unei singure celule multiplicarea unei singure celule
Manifestarea creterii i multiplicrii Manifestarea creterii i multiplicrii
bacteriilor bacteriilor
n n mediu lichid mediu lichid
-- Turbiditate uniform Turbiditate uniform
-- Formarea unei pelicule Formarea unei pelicule la suprafaa la suprafaa
mediului (vibrioni, yersinia) mediului (vibrioni, yersinia)
-- Formarea unui sediment Formarea unui sediment
la fundul tubului sau pe perei la fundul tubului sau pe perei
(streptococi, (streptococi, Bacillus anthracis Bacillus anthracis) )
n mediu solid n mediu solid formarea formarea coloniilor coloniilor
Colonie Colonie o aglomerare de bacterii care o aglomerare de bacterii care
se dezvolt dintr se dezvolt dintr--o singur celul sau o singur celul sau
un grup de celule (UFC un grup de celule (UFC -- unitate unitate
formatoare de colonii formatoare de colonii) pe suprafaa unui ) pe suprafaa unui
mediu solid mediu solid
Fiecare specie bacterian formeaz Fiecare specie bacterian formeaz
colonii specifice (caracter util n colonii specifice (caracter util n
identificare) identificare)
Caracteristica coloniilor Caracteristica coloniilor
Dimensiuni Dimensiuni colonii mici (0,1 colonii mici (0,1--1mm), medii (1 1mm), medii (1--
2mm), mari (2 2mm), mari (2--3mm) 3mm)
Contur Contur (margini) (margini) neted, ondulat, zimat, lobat, neted, ondulat, zimat, lobat,
etc etc
Suprafa Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat, plat, bombat, convex, ombilicat,
etc etc
Form Form punctiform, circular, filamentoas, punctiform, circular, filamentoas,
neregulat neregulat
Culoare Culoare (pigmentaie) (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc alb, galben, aurie, etc
Densitate Densitate opac, transparent, etc opac, transparent, etc
Consisten Consisten cremoas, untoas, uscat, cremoas, untoas, uscat,
mucoid mucoid
Tipurile de colonii Tipurile de colonii
Colonii S Colonii S (smouth) (smouth) rotunde, netede, umede, rotunde, netede, umede,
lucioase lucioase
Colonii R Colonii R (rough) (rough) margini neregulate, suprafaa margini neregulate, suprafaa
uscat, rugoas uscat, rugoas
2/8/2010
11
Caracterele de cultur Caracterele de cultur ale bacteriilor ale bacteriilor
reprezint exigenele nutritive (medii, reprezint exigenele nutritive (medii,
temperatur, pH, aerare, etc), temperatur, pH, aerare, etc), timpul timpul
apari apariiei culturii i manifestarea iei culturii i manifestarea
creterii pe medii lichide i solide creterii pe medii lichide i solide
Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi
n funcie de modul de dezvoltare a culturilor n funcie de modul de dezvoltare a culturilor
bacteriene se disting: bacteriene se disting:
-- Culturi discontinue/periodice Culturi discontinue/periodice
-- Culturi continue Culturi continue
-- Culturi sincrone Culturi sincrone
Culturile discontinue Culturile discontinue se obin la cultivarea se obin la cultivarea
bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de
culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul
microbiologic microbiologic
Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue
I. I. Faza de lag Faza de lag faza de adaptare la condiiile faza de adaptare la condiiile
mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc
n dimensiuni, dar nu se divid. n dimensiuni, dar nu se divid.
Durata este variabil (2 Durata este variabil (2--4 ore); depinde de starea 4 ore); depinde de starea
bacteriei, condiiile mediului, etc bacteriei, condiiile mediului, etc
II. II. Faza logaritmic Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu bacteriile cresc i se divid cu
vitez maximal constant, curba evolueaz vitez maximal constant, curba evolueaz
exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la
ageni antimicrobieni ( ageni antimicrobieni (culturi culturi utile pentru testarea utile pentru testarea
sensibilitii la antibiotice). sensibilitii la antibiotice).
Durata Durata 88--10 ore 10 ore
III. Faza staionar III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic rata celulelor care se multiplic
scade treptat, numrul celulelor vii rmne scade treptat, numrul celulelor vii rmne
constant mai multe ore. constant mai multe ore.
Cauza Cauza consumarea nutrienilor, acumularea consumarea nutrienilor, acumularea
metaboliilor toxici. metaboliilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar
incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare). incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare).
Sensibilitatea la ageni Sensibilitatea la agenii i antimicrobieni scade. antimicrobieni scade.
Durata Durata 10 10--12 ore 12 ore
IV. Faza de declin IV. Faza de declin (letalitate) (letalitate) bacteriile mor bacteriile mor
progresiv progresiv
2/8/2010
12
Cultur Cultura a continu continu se realizeaz cnd mediul se realizeaz cnd mediul
de cultur este continuu rennoit i de cultur este continuu rennoit i
mbogit cu oxigen cu evacuarea unei mbogit cu oxigen cu evacuarea unei
cantiti de cultur. Se realizeaz n cantiti de cultur. Se realizeaz n
chemostate chemostate sau sau turbidostate turbidostate, cultura , cultura
aflndu aflndu--se permanent n faza exponenial. se permanent n faza exponenial.
Se utilizeaz n microbiologia industrial. Se utilizeaz n microbiologia industrial.
n intestin n intestin culturi continue. culturi continue.
Culturi sincrone Culturi sincrone culturi n care bacteriile se culturi n care bacteriile se
divid n acelai timp divid n acelai timp
EXAMENUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL BACTERIOLOGIC
EExamen xamenul ul bacteriologi bacteriologicc const const n n inocular inocularea ea
(nsmnarea) (nsmnarea) prelev prelevaattelor elor pe pe me medii dii de de
cultur cultur pentru pentru izolarea izolarea cultur culturilor ilor pure pure de de
bacterii (tulpinilor) bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior care vor fi ulterior
identifi identificate cate, , test testate ate la sensibilitate la sensibilitate vis vis--aa--vis vis
de antibioti de antibiotice ce, eventu , eventuaal conserv l conservat ate. e.
EExamen xamenul ul bacteriologi bacteriologicc const din cteva const din cteva
etape succesive etape succesive,, de la de la prelev prelevarea area
(recoltarea) (recoltarea) probelor probelor biologi biologice pn la ce pn la
remi remiterea terea re rezzultat ultatelor elor. .
Faza pre Faza pre--analitic analitic (responsabilitatea medicului) (responsabilitatea medicului)
Prescrierea investigaiei Prescrierea investigaiei (n funcie de datele (n funcie de datele
examenului clinic i paraclinic). n ordonan se examenului clinic i paraclinic). n ordonan se
fixeaz identitatea medicului, a pacientului, fixeaz identitatea medicului, a pacientului,
scopul analizei, manifestrile patologice, locul, scopul analizei, manifestrile patologice, locul,
data apariiei, alte date: imunosupresie, data apariiei, alte date: imunosupresie,
tratament cu antibiotice tratament cu antibiotice, graviditate, etc. , graviditate, etc.
Prelevarea probelor Prelevarea probelor
-- Alegerea prelevatului Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare, (de la poarta de intrare,
locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale
agentului patogen) i agentului patogen) i momentul prelevrii momentul prelevrii
Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni::
-- Secreii rino Secreii rino--faringiene, bronice faringiene, bronice
-- Sput Sput
-- Puroi Puroi
-- Exsudate, transsudate Exsudate, transsudate
-- Snge Snge
-- LCR LCR
-- Urin, secreii genitale Urin, secreii genitale
-- Mase fecale, bil, suc duodenal Mase fecale, bil, suc duodenal
-- Bioptate, punctate Bioptate, punctate
-- Material cadav Material cadaveerric ic, etc , etc
Materiale de examinat din mediul extern Materiale de examinat din mediul extern::
-- Ap Ap
-- Alimente Alimente
-- Sol Sol
-- Aer Aer
-- Lavaje Lavaje
-- Vectori, etc Vectori, etc
Modul de prelevare (recoltare) Modul de prelevare (recoltare)
-- n recipiente sterile n recipiente sterile
-- Respectnd regulile de autoprotecie Respectnd regulile de autoprotecie
-- La debutul bolii La debutul bolii
-- Pn la administrarea antibioticelor Pn la administrarea antibioticelor
-- Cantitate suficient Cantitate suficient
Transportarea Transportarea
-- Imediat sau utiliznd medii de transport, cu Imediat sau utiliznd medii de transport, cu
respect respectarea condiiilor speciale dup necesitate area condiiilor speciale dup necesitate
-- n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...) n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
-- n fia de nsoire s fie indicat identitatea n fia de nsoire s fie indicat identitatea
pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data, pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data,
ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.) ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.)
2/8/2010
13
EXAMENUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL BACTERIOLOGIC
PENTRU PENTRU CULTURILE AEROBE CULTURILE AEROBE
-- PPrelev relevaattul ul est estee su supu pus s examen examenului ului
macroscopi macroscopicc ((modifica modificarea rea aspect aspectului ului, , a a
mirosului mirosului, , etc) etc) -- orientare n orientare n diagnostic diagnostic
-- Dup necesitate, probele sunt supuse Dup necesitate, probele sunt supuse
pregtirii pentru investigaie (diluare, pregtirii pentru investigaie (diluare,
omogenizare, centrifugare, etc) omogenizare, centrifugare, etc)
-- Examinarea microscopic Examinarea microscopic (preparate (preparate
native, Gram, Ziehl native, Gram, Ziehl--Neelsen, Burri Neelsen, Burri--
Hins Hinsss...) ...) prezena mi/o, forma, prezena mi/o, forma,
cantitatea, G+/ cantitatea, G+/--..
I etap I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE IZOLAREA CULTURILOR PURE
Scopul izolrii Scopul izolrii -- de de a ob a obiine ne o o cultur cultur pur pur dintr dintr--
un un melan melanjj de celule bacteriene de celule bacteriene sa sau u dintr dintr--un un
produ produss patologi patologicc. . OO colonie colonie separat separat
constituie constituie oo cultur cultur pur pur..
TTehni ehnici utilizate: ci utilizate:
1. 1. Prin e Prin epui puizarea inoculului zarea inoculului pe suprafaa gelozei pe suprafaa gelozei
din cutia Petri din cutia Petri ((nsmnare nsmnare n stri n striuri paralele uri paralele, ,
ns nsmmnnare are n n ccadran adranee, etal , etalarea area consecutiv consecutiv
pe pe tr trei ei cutii cutii). ).
2. 2. Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n
geloz topit i rcit la 50 geloz topit i rcit la 50 C (10 C (10
--11
, 10 , 10
--22
,...), ,...),
apoi turnate n cutii Petri sau eprubete. apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.
Incubare n termostat la 37 Incubare n termostat la 37 C, 18 C, 18--24 h (n funcie 24 h (n funcie
de T de T
GG
). ).
2/8/2010
14
Metode speciale de izolare n culturi pure: Metode speciale de izolare n culturi pure:
-- A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a
prelevatului 80 prelevatului 80 C C 20 min 20 min
-- A bacteriilor acido A bacteriilor acido--rezistente: tratarea prealabil rezistente: tratarea prealabil
cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar
cu o baz cu o baz
-- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene: A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene:
mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd
medii de mbogire medii de mbogire
-- A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la
cultivare: inocularea cultivare: inocularea la la animalel animalelee de laborator de laborator
sensibile sensibile
II etap II etap ACUMULAREA CULTURII PURE ACUMULAREA CULTURII PURE
-- Examinarea macroscopic a coloniilor crescute Examinarea macroscopic a coloniilor crescute
(form, culoare, dimensiuni, etc) (form, culoare, dimensiuni, etc)
-- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii
-- Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n
pant (nclinat) pentru acumularea culturii pant (nclinat) pentru acumularea culturii
pure pure
-- Termostat, 37 Termostat, 37 C, 18 C, 18--24 ore 24 ore
III etap III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE IDENTIFICAREA CULTURII PURE
-- Verificarea puritii culturii (frotiu Gram) Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)
-- Identificarea Identificarea culturii pure culturii pure const n evidenierea unor const n evidenierea unor
caractere specifice ale caractere specifice ale acestei culturi acestei culturi pentru a o include ntr pentru a o include ntr--o o
familie, gen, specie, variant familie, gen, specie, variant
Se studiaz caracterele: Se studiaz caracterele:
-- Morfologice Morfologice
-- Tinctoriale Tinctoriale
-- De cultur De cultur
-- Biochimice Biochimice
-- Antigenice (seroidentificarea) Antigenice (seroidentificarea)
-- De patogenitate De patogenitate
-- Sensibilitatea la bacteriofagi (fago Sensibilitatea la bacteriofagi (fago--identificarea) identificarea)
-- Sensibilitatea la antibiotice Sensibilitatea la antibiotice
2/8/2010
15
STUDIEREA ACTIVITII STUDIEREA ACTIVITII
BIOCHIMICE A BACTERIILOR BIOCHIMICE A BACTERIILOR
1. 1. Activitatea zaharolitic Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea (irul Hiss, coagularea
laptelui laptelui, etc , etc) )
2. 2. Activitatea proteolitic Activitatea proteolitic
-- Degradarea proteinelor native (lichefierea Degradarea proteinelor native (lichefierea
gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui laptelui, etc , etc))
-- Evidenierea enzimelor ce intervin n Evidenierea enzimelor ce intervin n
degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze,
desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele
finale ale descompunerii AA: H finale ale descompunerii AA: H
22
S, NH S, NH
33
, indol, , indol,
etc etc
Depistarea producerii Depistarea producerii HH
22
S: S: formarea sulfurii formarea sulfurii
de fer de culoare neagr n mediile de fer de culoare neagr n mediile
multitest multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea Kligler, Olkeniki, etc; plasarea
unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu
acetat de Pb acetat de Pb deasupra BP n care crete deasupra BP n care crete
cultura studiat (formarea sulfurii de Pb cultura studiat (formarea sulfurii de Pb
nnegrete hrtia) nnegrete hrtia)
Depistarea Depistarea indolului indolului (produs al hidrolizei (produs al hidrolizei
triptofanului) triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu benzi de hrtie mbibate cu
acid oxalic acid oxalic. n prezena indolului indicatorul . n prezena indolului indicatorul
vireaz n roz. vireaz n roz.
Depistarea Depistarea amoniacului amoniacului (ureaza) (ureaza) hrtia de hrtia de
turnesol turnesol se coloreaz n albastru. se coloreaz n albastru.
Depistarea Depistarea catalazei catalazei (H (H
22
OO
22
.... H .... H
22
O + O O + O
22
))
(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat (cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat
apariia bulelor de gaz) apariia bulelor de gaz)
Depistarea Depistarea oxidazei oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei
din lanul respirator) din lanul respirator)
Reactiv Reactiv di (tetra)metil di (tetra)metil--parafenilen parafenilen--diamin diamin (benzi sau (benzi sau
rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc) rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului Oxidarea reactivului culoare violet culoare violet--neagr neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo Oxidazo-- : Enterobacteriaceae : Enterobacteriaceae
Depistarea Depistarea lecitinazei lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% mediu cu glbenu de ou 10% --
formarea unui halou opac n jurul coloniilor formarea unui halou opac n jurul coloniilor
Depistarea Depistarea lipazei lipazei mediu cu Twin 80 1% mediu cu Twin 80 1% halou opac n halou opac n
jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai) jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)
Depistarea Depistarea hemolizinei hemolizinei geloz geloz--snge 5 snge 5--10% 10% -- zon clar n zon clar n
jurul coloniei jurul coloniei
Depistarea Depistarea ADNazei, fosfatazei ADNazei, fosfatazei, etc , etc
Probele sunt incubate la 37 Probele sunt incubate la 37 C, 18 C, 18--24 h 24 h
Identificarea rapid Identificarea rapid
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde
(economie de timp, spaiu, material) (economie de timp, spaiu, material)
Sistemul Sistemul API API o galerie din plastic format o galerie din plastic format
din numeroase alveole din numeroase alveole care conin fiecare care conin fiecare
un mediu deshidratat diferit (glucide, AA, un mediu deshidratat diferit (glucide, AA,
etc) etc). . Alveolele sunt inoculate cu o Alveolele sunt inoculate cu o
suspensie bacterian testat i incubate suspensie bacterian testat i incubate. .
Ulterior la necesitate se adaug reactive Ulterior la necesitate se adaug reactive
pentru detectarea metaboliilor particulari pentru detectarea metaboliilor particulari..
Lectura Lectura conform unui cod de cifre sau conform unui cod de cifre sau
computerizat computerizat
2/8/2010
16
IV etap IV etap EVALUAREA EVALUAREA
REZULTATELOR, REZULTATELOR, FORMULAREA SI FORMULAREA SI
ELI ELIBE BERAREA RSPUNSULUI RAREA RSPUNSULUI
-- Compararea rezultatelor obinute cu Compararea rezultatelor obinute cu
caracterele speciilor bacteriene caracterele speciilor bacteriene
cunoscute pentru a gsi asemnri. cunoscute pentru a gsi asemnri.
-- Exemplu de rspuns: Exemplu de rspuns: Din proba Din proba
examinat a fost izolat tulpina de examinat a fost izolat tulpina de
Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium diphtheriae, biovar , biovar
gravis gravis, tox+, sensibil la ...., rezistent la , tox+, sensibil la ...., rezistent la
..... .....
EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU
CULTURI ANAEROBE CULTURI ANAEROBE
(clostridiene, neclostridiene) (clostridiene, neclostridiene)
Condiia principal Condiia principal cultivare n absena cultivare n absena
oxigenului oxigenului
1. 1. Utilizarea mediilor anaerobe Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt (Kitt--Tar Tarrrozzi ozzi
regenerat regenerat -- 100 100 C, 20 min, rcit, acoperit cu C, 20 min, rcit, acoperit cu
vazelin vazelin;; nsmnarea n geloz n coloan) nsmnarea n geloz n coloan)
2. 2. Crearea condiiilor de anaerobioz Crearea condiiilor de anaerobioz
-- Metoda fizic Metoda fizic utilizarea anaerostatului utilizarea anaerostatului
-- Metoda chimic Metoda chimic n exicator se ntroduc n exicator se ntroduc
substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz); substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz);
utilizarea ga utilizarea gass--pachetelor pachetelor
-- Metoda biologic Metoda biologic Fortner Fortner cultivarea cultivarea
concomitent a aerobilor i anaerobilor concomitent a aerobilor i anaerobilor
Recoltarea Recoltarea cu precauie, evitnd contactul cu precauie, evitnd contactul
cu aerul (n seringi, utiliznd medii cu aerul (n seringi, utiliznd medii
speciale) speciale)
I etap I etap MBOGIREA ANAEROBILOR MBOGIREA ANAEROBILOR
-- nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu
mediul Kitt mediul Kitt--Ta Tarrrozzi regenerat rozzi regenerat
-- nclzirea unui tub la 80 nclzirea unui tub la 80 CC,, 20 min 20 min
distrugerea florei nesporogene distrugerea florei nesporogene
-- Incubarea la 37 Incubarea la 37 C, 24 C, 24--48 h (va avea loc 48 h (va avea loc
nmulirea anaerobilor) nmulirea anaerobilor)
2/8/2010
17
II etap II etap -- IZOLAREA CULTURII PURE IZOLAREA CULTURII PURE
DE ANAEROBI DE ANAEROBI
-- Studierea caracterelor de cultur Studierea caracterelor de cultur tulburarea tulburarea
mediului, descompunerea bucilor de ficat, mediului, descompunerea bucilor de ficat,
etc etc
-- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda
Zeissler Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul (nsmnarea a 0,1 ml din mediul
KK--T pe 3 cutii cu geloz T pe 3 cutii cu geloz--snge glucozat snge glucozat
consecutiv). Incubarea n consecutiv). Incubarea n
anaerostat/exicator/ga anaerostat/exicator/gass--pack, 24 pack, 24--48 h 48 h
-- Metoda Metoda Weinberg Weinberg diluii succesive ale diluii succesive ale
culturii n geloz glucozat lichefiat i culturii n geloz glucozat lichefiat i
aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise
ermetic. Incubarea n termostat, 24 h ermetic. Incubarea n termostat, 24 h
III etap III etap -- ACUMULAREA CULTURII PURE ACUMULAREA CULTURII PURE
-- Studierea macroscopic a coloniilor Studierea macroscopic a coloniilor
-- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte coloniilor suspecte
-- Repicarea n mediul K Repicarea n mediul K--T regenerat pentru T regenerat pentru
acumularea culturii pure acumularea culturii pure
-- Incubarea n termostat, 24 h Incubarea n termostat, 24 h
IV etap IV etap -- IDENTIFICAREA CULTURII IDENTIFICAREA CULTURII
PURE DE ANAEROBI PURE DE ANAEROBI
-- Verificarea puritii Verificarea puritii culturii pure culturii pure (frotiu (frotiu
Gram) Gram)
-- Studierea caracterelor culturii pure izolate Studierea caracterelor culturii pure izolate
(cu respectarea condiiilor de (cu respectarea condiiilor de
anaerobioz) anaerobioz)
V etap V etap -- EVALUAREA REZULTATELOR, EVALUAREA REZULTATELOR,
FORMULAREA I ELIBERAREA FORMULAREA I ELIBERAREA
RSPUNSULUI RSPUNSULUI