HISTOCHIMIE SI

HISTOENZIMOLOGIE


1
METODA FROTIURILOR

se realizeaz intinderea celulelor n
monostrat pe o lamel de sticl.
Pot fi examinate :
1. celulele sangvine
2. celulele epiteliale descuamate sau
exfoliate
3. sedimentele celulare
4. amprente de esuturi sau organe
parenchimatoase
2
TIMPII
recoltare
ntindere: se folosesc dou lame de
sticl
lama portobiect cea pe care se
efectueaz frotiul
lama executoare cu care se
ntinde frotiul , prin glisare la un
unghi de 45.
uscare
3
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

pentru colorarea frotiului sangvin.

1. solutia May-Grunwald conine
EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN
solubilizat in amestec de alcool metilic i
glicerin neutr
2. solutia Giemsa contine EOZINAT DE
AZUR DE METILEN solubilizat in
amestec de alcool metilic si glicerina
neutra

4
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
Frotiul trebuie sa fie :
subire cu un singur strat de celule
ntins uniform
ambele margini pe lama
se termin n franjuri pe lam , ocupnd
cca. 2/3 din aceasta
la margine se scrie numele pacientului
sau un nr. de ordine
5
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
REZULTATE
nuclei violet
citoplasmele agranulocitelor albastru
citoplasmele granulocitelor roz
granulaii:
neutrofile rou- violet
bazofile albastru nchis spre negru
eozinofile rou portocaliu
6
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
7
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
8
METODA PANOPTICA PAPPENHEIM
9
HISTOCHIMIA
interpretarea biochimic a celulelor
sau esuturilor n raport cu
oranizarea lor celular.

PRINCIPIU
Se bazeaz pe afinitatea pe care o
au unii colorani pentru anumite
grupri chimice pe care vrem s le
localizm.
10
HISTOCHIMIA
Substanele chimice celulare i
tisulare se identific prin reacii
chimice care duc la obinerea de
compui colorai , insolubili i
observabili la M.O.

HISTOFOTOMETRIA = analiz
cantitativ, n funcie de
intensitatea culorii

11
Conditiile minime necesare unei reactii
histochimice
substana analizat
s se conserve in situ ,
fixarea utilizat trebuie s conserve
structura celulei i s mpiedice
deteriorarea componentelor celulare
metoda folosit trebuie s fie
specific pentru substana sau
gruprile chimice care vor fi
examinate.
12
Conditiile minime necesare unei reactii
histochimice
produsul de reacie
- insolubil previne dispersia sau
difuzia produsului de reactie
colorat permite examinarea

reactivul histochimic trebuie s fie
specific.
13
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR

monozaharide
solubile
oligozaharide
polizaharide - libere sau combinate
cu proteine
14
HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
METODA PAS ( per-iodic acid
Schiff)
METODA CU CARMIN
AMONIACAL BEST
BAZOFILIA
METACROMAZIA

15
METODA PAS
evidenierea glicogenului, GAG,
glicoproteinelor si glicolipidelor.

PRINCIPIU
grupri glicol
oxidare cu acid periodic
grupri
aldehidice + cu reactivul Schiff
precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.
16
METODA PAS- GLICOGEN
specificitatea metodei depinde de
pretratamentul cu enzime
glicogenolitice de tipul amilazei
salivare. Se consider c structurile
colorate PAS care dispar n urma
pretratamentului cu amilaz conin
glicogen

17
METODA PAS
18
CARMIN AMONIACAL BEST
evideniaz glicogenul - polimer cu
solubilitate redus n ap . Daca fixarea
lui nu este prompt, enzimele hidrolitice
l descompun n glucoz care este
foarte solubil n ap i difuzeaz.

REZULTATE : granule roii n
citoplasm
19
CARMIN AMONIACAL BEST
20
BAZOFILIA
proprietatea substanelor glucidice
de a se colora cu colorani bazici
de tipul albastru alcian i albastru
de metil.

poate fi utilizat i pentru
evidenierea lipidelor i proteinelor
cu caracter acid
21
ALBASTRU DE METIL
22
METACROMAZIA
Capacitatea unui substrat de a se
colora ntr-o alt culoare dect cea a
colorantului.

PRINCIPIU:
- existena unor grupri anionice aflate
la o distan foarte mic una de alta
formnd agregate cu proprieti de
absorbie a luminii vizibile diferite de a
moleculelor neagregate.
23
METACROMAZIA
24
HISTOCHIMIA LIPIDELOR
PRINCIPIU:
colorantul trebuie
s fie mai solubil
n lipide dect n
propriul solvent



SUDANOFILIA
Colorani Sudan :
III rou-portocaliu
IV rou
B negru
BB albastru


25
COLORAII SUDAN
26
HISTOCHIMIA PROTEINELOR

detecteaz structura primar a
proteinelor

Reacii nespecifice proteinele
celulare i tisulare sunt identificate
pe seama aminoacizilor
Reacii specifice folosite pentru
identificarea heteroproteinelor
27
HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reacii nespecifice
Tirozina Reacia MILLON
Arginina Reacia SAKAGUSHI
pentru studiul distributiei
proteinelor bazice in nucleu
Triptofan

28
HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii specifice
folosite pentru identificarea
heteroproteinelor de ex.
nucleoproteinele care se evideniaz
pe seama acizilor nucleici.

1. Metoda FEULGEN
2. Bazofilia
3. Metoda BRANCHET
29
HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii specifice

METODA FEULGEN

Molecula AND
hidroliza acida
dezoxiriboza + reactiv Schiff
precipitat rou-violaceu
30
METODA FEULGEN
31
HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii specifice
METODA BRANCHET( verde metil-pironin)

cercetarea bazofiliei dat de acidul
fosforic din structura acizilor nucleici

verde de metil are afinitate pentru
ADN-ul nuclear pe care l coloreaz n
verde
pironina ARN-ul nucleolar si
citoplasmatic, pe care l coloreaz n
rou

32
HISTOCHIMIA ENZIMELOR
evideniaz localizarea i activitatea
enzimelor.

PRINCIPIU:
- reacii chimice care au ca rezultat un compus
colorat i insolubil. In cazul n care produsul
rezultat este solubil , se insolubilizeaza
printr-o reacie de CAPTUR.
33
ETAPELE OBINERII UNUI
PREPARAT
CITOENZIMOLOGIC
recoltarea
fixarea prin congelarea rapid la
temparaturi foarte joase
secionarea
incubarea ntr-un mediu care ofer
enzimei conditii ct mai apropiate de
cele n vivo.
montarea se realizeaza n mediu
hidrosolubil glicerina sau sirop Apathy
34
REACII CITOENZIMOLOGICE
METODA PEARSE- evideniaz
dehidrogenazele
METODA GMRY ( captura de
ioni metalici)- evidentierea
hidrolazelor
35
METODA PEARSE
peroxidaze
Succinatdehidrogenaz

APLICAII PRACTICE
- SDH enzima marker a
mitocondriilor
36
METODA PEARSE
37
METODA GMRY( captura de
ioni metalici)
pentru evidentierea fosfatazelor

PRINCIPIU
o reacie de precipitare a acidului
fosforic eliberat de enzim de la nivelul
substratului
38
METODA GMRY
Compusul rezultat din aciunea
enzimei reacioneaz cu:
sulfura de amoniu pentru a
produce un precipitat negru
sulfura de cobalt pentru hidrolaza
alcalin
sulfura de plumb pentru cea
acid

39
METODA GMRY
APLICAII PRACTICE
- evidenierea fosfatazei alcaline enzim
cu rol de transport
40
METODA GMRY
41
42
43