HISTOCHIMIE SI

HISTOENZIMOLOGIE

METODA FROTIURILOR
se

realizeaz intinderea celulelor n

monostrat pe o lamel de sticl.
Pot fi examinate :
1. celulele sangvine
2. celulele epiteliale descuamate sau
exfoliate
3. sedimentele celulare
4. amprente de esuturi sau organe
parenchimatoase
2

TIMPII
recoltare
ntindere:

se folosesc dou lame de

sticl
lama portobiect cea pe care se
efectueaz frotiul
lama executoare cu care se
ntinde frotiul , prin glisare la un
unghi de 45.
uscare

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

pentru colorarea frotiului sangvin.

1. solutia

May-Grunwald conine
EOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN
solubilizat in amestec de alcool metilic i
glicerin neutr
2. solutia Giemsa contine EOZINAT DE
AZUR DE METILEN solubilizat in amestec
de alcool metilic si glicerina neutra
4

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

Frotiul trebuie sa fie :
subire cu un singur strat de celule
ntins uniform
ambele margini pe lama
se termin n franjuri pe lam , ocupnd
cca. 2/3 din aceasta
la margine se scrie numele pacientului
sau un nr. de ordine
5

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

REZULTATE
nuclei violet
citoplasmele agranulocitelor albastru
citoplasmele granulocitelor roz
granulaii:
neutrofile rou- violet
bazofile albastru nchis spre negru
eozinofile rou portocaliu

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

HISTOCHIMIA
interpretarea

biochimic a celulelor
sau esuturilor n raport cu
oranizarea lor celular.
PRINCIPIU
Se bazeaz pe afinitatea pe care o
au unii colorani pentru anumite
grupri chimice pe care vrem s le
localizm.
10

HISTOCHIMIA
Substanele

chimice celulare i
tisulare se identific prin reacii
chimice care duc la obinerea de
compui colorai , insolubili i
observabili la M.O.

HISTOFOTOMETRIA =

analiz
cantitativ, n funcie de intensitatea
culorii
11

Conditiile minime necesare unei reactii

histochimice

substana analizat
s se conserve in situ ,
fixarea utilizat trebuie s conserve
structura celulei i s mpiedice
deteriorarea componentelor celulare
metoda folosit trebuie s fie specific
pentru substana sau gruprile
chimice care vor fi examinate.
12

Conditiile minime necesare unei reactii

histochimice
produsul

de reacie
- insolubil previne dispersia sau
difuzia produsului de reactie
colorat permite examinarea

reactivul

histochimic trebuie s fie

specific.
13

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
monozaharide

solubile
oligozaharide
polizaharide

- libere sau combinate

cu proteine

14

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
METODA PAS

( per-iodic acid

Schiff)
METODA CU CARMIN
AMONIACAL BEST
BAZOFILIA
METACROMAZIA
15

METODA PAS
evidenierea

glicogenului, GAG,
glicoproteinelor si glicolipidelor.

PRINCIPIU

grupri glicol oxidare cu acid periodic grupri

aldehidice + cu reactivul Schiff
precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.
16

METODA PAS- GLICOGEN

specificitatea

metodei depinde de
pretratamentul cu enzime
glicogenolitice de tipul amilazei
salivare. Se consider c structurile
colorate PAS care dispar n urma
pretratamentului cu amilaz conin
glicogen
17

METODA PAS

18

CARMIN AMONIACAL BEST

evideniaz glicogenul - polimer cu

solubilitate redus n ap . Daca fixarea
lui nu este prompt, enzimele hidrolitice
l descompun n glucoz care este foarte
solubil n ap i difuzeaz.

REZULTATE : granule roii n citoplasm

19

CARMIN AMONIACAL BEST

20

BAZOFILIA
proprietatea

substanelor glucidice de
a se colora cu colorani bazici de tipul
albastru alcian i albastru de metil.

poate

fi utilizat i pentru evidenierea

lipidelor i proteinelor cu caracter acid
21

ALBASTRU DE METIL

22

METACROMAZIA
Capacitatea

unui substrat de a se colora

ntr-o alt culoare dect cea a
colorantului.

PRINCIPIU:

- existena unor grupri anionice aflate la o

distan foarte mic una de alta formnd
agregate cu proprieti de absorbie a
luminii vizibile diferite de a moleculelor
neagregate.
23

METACROMAZIA

24

HISTOCHIMIA LIPIDELOR
PRINCIPIU:
colorantul trebuie
s fie mai solubil
n lipide dect n
propriul solvent

SUDANOFILIA
Colorani Sudan :
III rou-portocaliu
IV rou
B negru
BB albastru
25

COLORAII SUDAN

26

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
detecteaz

proteinelor

structura primar a

Reacii

nespecifice proteinele
celulare i tisulare sunt identificate
pe seama aminoacizilor
Reacii specifice folosite pentru
identificarea heteroproteinelor
27

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reacii nespecifice
Tirozina Reacia MILLON
Arginina Reacia SAKAGUSHI
pentru studiul distributiei
proteinelor bazice in nucleu
Triptofan

28

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii specifice

folosite pentru identificarea

heteroproteinelor de ex.
nucleoproteinele care se evideniaz
pe seama acizilor nucleici.

1. Metoda

FEULGEN
2. Bazofilia
3. Metoda BRANCHET
29

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii specifice
METODA FEULGEN

Molecula AND hidroliza acida dezoxiriboza

+ reactiv Schiff
precipitat
rou-violaceu
30

METODA FEULGEN

31

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reactii specifice
METODA BRANCHET( verde metil-pironin)
cercetarea

bazofiliei dat de acidul fosforic

din structura acizilor nucleici

verde

de metil are afinitate pentru ADNul nuclear pe care l coloreaz n verde

pironina ARN-ul nucleolar si
citoplasmatic, pe care l coloreaz n rou
32

HISTOCHIMIA ENZIMELOR

evideniaz localizarea i activitatea

enzimelor.

PRINCIPIU:

- reacii chimice care au ca rezultat un

compus colorat i insolubil. In cazul n care

produsul rezultat este solubil , se
insolubilizeaza printr-o reacie de CAPTUR.
33

ETAPELE OBINERII UNUI

PREPARAT
CITOENZIMOLOGIC

recoltarea
fixarea prin congelarea rapid la
temparaturi foarte joase
secionarea
incubarea ntr-un mediu care ofer
enzimei conditii ct mai apropiate de cele n
vivo.
montarea se realizeaza n mediu
hidrosolubil glicerina sau sirop Apathy

34

REACII CITOENZIMOLOGICE
METODA PEARSE-

evideniaz

dehidrogenazele
METODA GMRY ( captura de
ioni metalici)- evidentierea
hidrolazelor

35

METODA PEARSE
peroxidaze
Succinatdehidrogenaz

APLICAII PRACTICE
- SDH enzima marker a
mitocondriilor
36

METODA PEARSE

37

METODA GMRY( captura de

ioni metalici)
pentru

evidentierea fosfatazelor

PRINCIPIU

o reacie de precipitare a acidului

fosforic eliberat de enzim de la nivelul
substratului
38

METODA GMRY
Compusul rezultat din aciunea
enzimei reacioneaz cu:
sulfura de amoniu pentru a
produce un precipitat negru
sulfura de cobalt pentru hidrolaza
alcalin
sulfura de plumb pentru cea acid
39

METODA GMRY
APLICAII PRACTICE
- evidenierea fosfatazei alcaline
enzim cu rol de transport

40

METODA GMRY

41

42

43