METODE CROMATOGRAFICE DE ANALIZA

CROMATOGRAFIA-reprezinta o metoda de separare bazata pe repartitia

diferentiata a componentilor unui amestec de separate intre doua faze in
contact si care se situeaza intr-un raport de miscare relativ una fata de
cealalta (definita prin termenii de faza stationara si faza mobile).Separarea
cromatografica este rezultatul unor procese repetate de sorbtie-desorbtie a
componentilor probei in faza stationara si faza mobila[26] Repartitia
diferentiata a analitilor intre cele doua faze aflate in contact este controlata
prin constanta de distributie K, descrisa prin raportul:K = CS/CM, unde Cs
reprezinta concentratia analitului in faza stationara,iar CM reprezinta
concetratia analitului in faza mobila.
CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE DE ANALIZA Metodele cromatografice se clasifica dupa o serie de criterii: caracteristicile
fizico-chimice ale proceselor sau sistemelor, natura fazelor mobile si
stationara, aspectele de ordin tehnic(dispunerea fazei stationare, modul de
deplasare a probei, parametrii de operare), tabelul 1
1.Cel mai utilizat criteriu de clasificare este natura sau starea de agregare a
celor doua faze.
FAZA STATONARA poate sa fie solida sau lichida, in cel de al doilea caz
lichidul fiind depus pe un suport solid.fazele stationare lichide trebuie sa
indeplineasca unele conditii speciale cum ar fi volatilitatea foarte scazuta,
miscibilitate redusa cu solventii uzuali,viscozitate ridicate pentru a ramane
pe un support in timp ce faza mobila curge prin coloana.
FAZA MIBILA poate fi un lichid(L), un gaz(G) sau un fluid supercritic(FS),
nemiscibile cu faza stationara. Daca faza mobile este un gaz vorbim de
cromatografie de gaze(CG), daca este un lichid de cromatografie de
lichide(CL), iar daca este un fluid supercritic de cromatografie de fluide in
stare supercritical (CFS), fuidul supercritic este o substanta care se afla
deasura presiunii si temperaturii sale critice.

Tabelul 1. Clasificarea metodelor cromatografice in functie de natura fazelor

intre analiti se distribuie diferentiat
FAZA
FAZA
DENUMIRE
SIMB
MOBILA
STATIONARA
OL
gaz
solid
Cromatografia de repartitie gazCGS
solid
gaz
lichid
Cromatografia de repartitie gazCGL
lichid
lichid
lichid
Cromatografia de repartitie lichidCLL
lichid
lichid
solid
Cromatografia de repartitie lichidCLS
solid
Fluid
Solid sau lichid
Cromatografia de fluide in stare
CFS
supercritic
supercritica
2.In functie de PROCESUL DE SEPARARE metodele cromatografice se impart
in doua categorii : -metode bazate pe afinitatea diferiat a componentilor(in
care sunt incluse metodele de repartitie, absorbtie, schimb ionic, afinitate);
-metode bazate pe marimea diferita a componentilor(ex: excluziunea sterica)
3.Considerand MODUL DE DEPLASARE a probei se pot distinge urmatoarele
tehnici: cromatografia prin elutie, prin dizlocare, frontala si cu goluri sau
vacante 4.In ceea ce priveste PARAMETRII DE OPERARE-temperatura
coloanei si debitul purtatorului-acestia pot fi constanti sau variabili, rezultand
cromatografia izoterma, cu temperatura programata(gradient de
tempertatura) sau cu debit programat(gradient de presiune).
SCHEMA BLOC A UNUI CROMATOGRAF - Procesul cromatografic de
separare se realizeaza prin alternarea succesiva a starilorde echilibru si
neechilibru generate de repartitia analitului intre faze. Sistemul
cromatografic evolueaza in sensul realizarii starii de echilibru la
repartitie(este atinsa constanta de distributie K, pentru fiecare dintre analiti).
Starea de neechilibru, imediat consecutiva starii e echilibru este generata
prin miscarea fazei mobile.Elementele constructive ale unui cromatrograf
sunt prezentate schematic in fig. 1.

proba 3
1

1121 2

5
4

Fig.1-schema unui cromatograf

1-sursa de eluent; 2-injector; 3-coloana;4-detector; 5-termostat,6inregistrator
1.Eluentul(faza mobila) are rolul de a transporta proba prin coloana
cromatografica.
2.Injectorul asigura reproductibilitatea probei introduse in coloana. Eficienta
separarii si exactitatea rezultatelor depend de introducerea probei si deci
constructia injectorului. Injectoarele sunt diferite pentru cromatografia de
gaze si cea de lichide .3.coloana cromatografica cotine la un moment dat
cele doua faze cromatografice si este locul unde se realizeaza separarea
componentelor probei. Din cauza interactiunii moleculelor cu faza stationara,
componentele din probaraman in urma eluentului in functie de diferentele
care exista intre constantele echilibrului de repartitie intre cele doua faze. Ca
urmare se produce o diferentiere a vitezelor lor de migrare si in final
separarea.4.Scopul Detectorului este de a pune in evidenta componentii ce
parasesc coloana cromatografica antrenati de faza mobila. Detectorul este
piesa cea mai importanta a unui cromatograf dupa coloana cromatografica
.Exista 2 categori de detector : universali si specifici . Cei universali sunt
sensibili la un nr. Mare de componenti , iar cei specifici sunt sensibili numai la
anumiti componenti .Un detector ideal trebuie sa indeplineasca o serie de
conditii : raspuns rapid in prezenta solutului ; stabilitate in timpul functionarii
;un domeniu larg de raspuns linear ; sensibilitate inalta ; manipulare si
etalonare usoara . Detectorii pot fi diferentiali si integrali. Detectorii
diferentiali masoara conc. instantanee sau debitul de masa al solutului ce
paraseste coloana cromatografica. Detectorii integrali acumuleaza raspuns
datorat componentilor probei , iar semnalul inregistrat ne indica cantitatea
totala care a parasit coloana cromatografica la un anumit moment.
Raspunsul detectorului este functie de unele schimbari in proprietatile fizice
ale gazului ce paraseste coloana cromatografica in prezenta componentilor
probei. Aceste schimbari pot fi : conductibilitate termica ;ionizare in flacara ;
conductibilitate electrica ; ionizare sub influenta radiatiei . 5.Termostatulasigura temp uniforma a intregului system prin care circula proba.
6.Inregistratorul-preia semnalele amplificate de circuitul detectorului ,
inscriind rezultatele analizei sub forma cromatografica . Cromatografele
moderne sunt conectate la un calculator , legat la randul sau la o imprimata
care preia rolul de inregistrator.

Cromatograma- reprezinta rezultatul unei separari cromatograme si este

generata de procesul de detective a analitilor . in ordinea elutiei
acestora(fig2.7.)Procesul de detect ie consta in masurarea continua , in
timp , a unei prop care caracterizeaza , dupa caz , totalitatea sau numai
specii de analiti separate in procesul cromatografic .Cromatograma
reprezinta deci o dependecnt functional reprezentabila intr-un system
bidimensional de coordonate .Pe abscisa ste reprezentat timpul scurs din
momentul injectiei probei in sist romatografic si pana in momentul elutiei
ultimei specii de analiti ( cea mai puternica retinuta in faza stationara ). Pe
ordonata se va reprezenta proprietatea masurata.
3
12

4
6

Fig.2 Cromatograma

0
Momentul elutei unei specii de analit din sist cromatografic corespunde unei
variatii a raspunsului generat de sist de detectie , proportional cu masa sau
conc compusului in cauza .Un astfel de semnal produs de catre detector , in
momentul evolutiei unui anumit compus , este cunoscut sub numele de pic
cromatografic . Picul cromatografic poate fi caract. prin 2 tipuri de
parametri :-calitativi (timpul de retentie absolut, timpul de retentie relativ ,
volumul de retentie absolut , volumul de retentie relativ si factorul de
capacitate ) si cantitativi ( aria si inaltimea picului cromatografic ).
Timpul de retentie absolut (tR)-repre timpul scurs de la injectarea probei
in sist cromatografic si pana in momentul detectiei unui raspuns maxim , la
elutia uneia din speciile separate .
Timpul de retentie relativ (tR)- corespunde timpului pe care o specie de
analiti il petrece in faza stationara .Diferenta dintre timpul de retentie
absolute si timpul de retentie relativ corespunde perioadei de timp pe care
solutul a petrecut-o in faza mobila .Timpul necesar frontului de faza mobile
pt a parcurge coloana cromatografica se defineste ca fiind timpul mort (tM)
.Ca definitie alternativa , timpul mort poate fi considerat timpul de retentie
absolute al unui compus care nu se distribuie deloc in faza stationara (ct sa
de distributie K fiind nula ). Se stabileste in acestmod relatia : tR= tR + tM
Marimilor tR respective tR li se pot asocia valorile VR si respective VR
,cunoscute sub numele de volum de retentie absolute , respectiv volum de
retentie relative .Retentia se masoara de obicei in unitati de timp , dar
unitatile de volum sunt mai exacte .Relatia dintre unitatea de timp si cea de
volum se face prin intermediul debitului fazei mobile (D).
VR= tR*D .

Factorul de capacitate (kI)- poate fi definit ca marime care indica de cate

ori timpul de repartitie a specie de analit in faza stationara este mai mare
decat timpul cat acesta se gaseste in faza mobile .kI=tR /tM=tR-tM /tM
Marimile ce caracterizeaza procesul de separare : Eficienta-separarii
cromatografice se refera la capacitatea sist cromatografic de a elua analitii
supusi separarii sub forms unor picuri exrem de inguste .Acest termen este
corelat cu nr. de echilibre de repartitie intre faze , care se realizeaza pe toata
durata procesului de separare . Pt a caract acest proces se introduce
notiunea de taler teoretic ca fiind portiunea din coloana cromatografica in
care se realizeaza un proces elementar de repartitie la echilibru .Lungimea
de coloana pt care o astfel de stare de echilibru este atinsa poarta
denumirea de inaltime a talerului teoretic (H). Intre lungimea totala a
coloanei cromatografice (L)si inaltimea talerului (H) se stabileste relatia :
L=H*N , unde N reprez nr talerelor teoretice ale unei coloane cromatografice
( este practic echivalent cu nr de stari consecutive de echilibru pe parcursul
separarii cromatografice in acea coloana ). Nr de talere teoretice (N) poate fi
calculate cu aj marimilor ce caract picul cromatografic .
N=tR2/ 2=16tR2/w2b=5.545tR2 /w20.5=4 t2R/W2i
Selectivitatea-separarii cromatografice reprez capacitatea sist
cromatografic de a separa analiti cu proprietati extreme de asemanatoare si
este descrisa prin factorul de separare , notat cu . Factorul de separare
se refera la o pereche de analiti eluati consecutiv din coloana,reprezentati in
urma detectiei prin doua picuri adiacente. Daca =1, adica cei doi analiti au
acelasi coeficienti de distributie, ei nu pot fi separati si conditiile analitice
trebuie modificate.
=K2/K1=k2I/k1I
unde :K1 si K2 sunt coeficientii de repartitie(distributie)
intre cele doua faze, corespunzator celor doi analiti separati consecutive,1 si
2; iar K`1 si k`2 sunt factorii de capacitate corespunzatori.
REZOLUTIA unei separari cromatografice este o masura mai explicita a
gradului de separare a doi compusi. Rezolutia cromatografica(R s) se
defineste ca marimea ce caract global calitatea separarii, fiind masurabila
prin insasi parametrii care definesc picul cromatografic
RS=tR2-tR1/2*( 1+ 2)Unde: tR1 si tR2 sunt timpii de retentie ai celor doi
compusi; 1 si 2 repr distributiile lor exprimate in unitati de timp. Daca Rs=1,
aprox 94% din moleculele celor doi compusi vecini sunt separate. Se
considera ca separarea este totala atunci cand Rs=1,5.

ANALIZA CALITATIVA SI CANTITATIVA IN CROMATOGRAFIE

ANALIZA CALITATIVA(IDENTIFICAREA SUBSTANTELOR SEPARATE) se
realizeaza la iesirea din coloana cu ajutorul detectorului. Cromatograma
reprez succesiunea de picuri cromatografice produsa de detector. Detectorul
transforma o prop a compusilor da analizat in semnal electric, proportional
cu cantitatea de substanta. Identificarea componentilor corespunzatori
picurilor cromatografice se poate face in doua moduri:-prin compararea
timpilor de retentie ai componentilor cu al unor etaloane cunoscute in
aceleasi conditii experimentale; aceasta metoda nu asigura certitudinea
identitatii unei substante;-prin retinerea componentilor eluati pentru o
analiza ulterioara prina alte tehnici analitice, cum ar fi spectometria in IR sau
spectometria de masa, contribuind astfel la cresterea procentelor de
certitudine.
Daca pentru caract sunt utilizate datele de retentie este necesar sa se
controleze cu grija parametrii de curgere si de temperatura, deoarece
comparatia dintre proba necunoscuta si standard se face tocmai pe baza
acestor date. Intrucat foarte multi compusi diferiti pot avea acelasi timp(sau
volum) de retentie este necesar sa se utilizeze mai multe coloane cu
selectivitati diferite.
Pentru ANALIZA CANTITATIVA este foarte important standardizarea
conditiilor de lucru si cunoasterea factorului de raspuns al detectorului
pentru fiecare component determinat. Analiza cantitativa consta in trei
etape:-obtinerea comtogramei;
-masurarea maximelor(picurilor) sau a suprafetelor -interpretare
rezultatelor
Suprafata integrate a unui pic este direct prop cu cantiatea de solut eluat. Se
poate utilize si inaltimea picului, dar rezultatele sunt mai putin precise.
Masurarea suprafetei se face prin urmatoarele metode:metoda triunghiului,
metoda planimetrarii(care consta in determinarea ariei cu ajutorul unui
planimetru), metoda decuparii si cantaririi, integrarea electronica. Calculul
rezultatelor se poate face in mai multe moduri: normalizarea interna,
standardizarea interna, metoda adaosului standard.In cadrul metodei de
normalizare comnpozitia procentuala este determinate prin masurarea ariei
fiecarui pic si impartirea ariilor individuale la toata aria totala. Acest lucru
presupune ca au fost eluate toate picurile probei si ca raspunsul detectorului
este acelasi pentru fiecare compus.
STANDARDIZAREA INTERNA consta in adugarea la proba de analizat,
inainte de a fi analizata, a unei cantitati cunoscute dintr-o substanta

standard. Se determina apoi raportul dintre suprafetele picurilor substantei

standard si cele ale substantei de analizat, pe baza caruia se poate
determina cantiatea de substanta din proba. Ci=Ai*fi /AS*fs *CS
Unde: Ci este concentratia compusului de analizat ; Cs este concentratia
standardului ; Ai este aria corespunzatoare picului compusului de analizat;
As este aria corespunzatoare picului standard; fi , fs sunt factorii de raspuns
ai detectorului pentru cele doua substante.
In cazul metodei adaosului standard se obtin cromatograme pentru proba
ca atare si dupa ce s-a adaugat in proba o cantiate cunoscuta din substanta
de analizat.
Diferenta dintre suprafetele celor doua picuri cromatografice este suficienta
pentru a determina cantiatea initiala de substanta din proba . Ci=CS*Ai /A-Ai
-unde A este aria obtinuta dupa adaugarea cantitatii standard.