Definitie Secvenializarea ADN-ului - procesul de identificare a ordinii precise a nucleotidelor

(ATCG) ntr-o molecul de ADN.

Secventializarea AND reprezinta identificarea tipului, felului si succesiunii nucleotidelor dintr-un
fragment ADN de analizat
n prezent exist numeroase metode de secveializare a ADN-ului clasificate n:
- metode derivate de la metoda chimic a lui Maxam i Gilbert
- metode derivate de la metoda enzimatic a lui Sanger - metode de ''nou generaie''
pirosecveniere, ion-torrent, etc
Secventierea chimica (Maxam Gilbert)
Bazata pe inducerea unor modificari chimice ale ADN-ului si apoi clivarea
lantului la nivelul acestor modificari
Utilizata in prezent doar in domenii restranse (studiul interactiunilor
ADNproteine etc)
fiind o metod complicat i laborioas, n ultimii ani nu se mai utilizeaz;

Fig. 12.1. Secvenierea ADN prin clivarea chimic (Maxam-Gilbert)

Metoda de terminare a lantului (Chain-termination method; metoda Sanger)

- una din primele metode de secvenializare a fost descris n 1977 de Frederick Sanger care a
primit cel de-al doilea premiu Nobel pentru descoperirea sa
- se bazez tot pe reacia de replicare a ADN-ului catalizat de o polimeraz ADN-dependent
Elementele eseniale realizrii unei reacii de secveniere prin metoda Sanger
a) fragment ADN de secveniat o molecul de ADN monocatenar
b) polimeraza ADN
c) cele 4 deoxinucleotide obinuite (dNTP: A, T, C, G)
c) o oligonucleotide amors (primer) complementare cu molecula de secveniat marcat
radioactiv i care ofer un capt 3' liber
d) 4 di-deoxinucleotide (ddNTPs: ddA, ddC, ddG, ddT) nucleotide ce nu au gruparea fosfat n
poziiile 2' (deoxi) i 3' (di).i
2) calea enzimatic (Sanger) n care ADN-ul este sintetizat in vitro pe baza
matriei ADN studiat, n aa fel nct reacia se termin specific n poziia care
corespunde unei baze anumite. Pentru a determina o secven de nucleotide pe
una din cile menionate, ADN-ul este supus seriei de patru reacii separate,
fiecare reacie fiind specific pentru una din baze. Prin electroforez produii de
reacie vor migra n patru curse paralele, pe acelai gel. Urmrind band cu
band, poate fi identificat ordinea nucleotidelor n ADN (fig. 12.2).

Fig. 12.2. Secvenierea ADN prin metoda dideoxi (Singer)

Aplicatii:

n scopuri de diagnostic al purttorilor de gene normale sau mutante se

compar rezultatele secvenierii cu datele structurii primare normale a genei din
bibliotecile de ADN. Spre regret, nu se cunoate nc secvena tuturor genelor
umane, de aceea n diagnostic se utilizeaz metode indirecte: nlnuirea cu
markeri genetici apropiai (repetiii hipervariabile de ADN mini- i microsatelitic),
determinarea situsurilor de restricie caracteristice genei date, hibridarea cu
sonde specifice etc.

i https://mail.uaic.ro/~marius.mihasan/teaching/pdfs/general_biology_courses/curs_12_PCR.pdf