2/8/2010

FIZIOLOGIA BACTERIILOR.
METABOLISMUL
MICROBIAN.
NUTRIIA
NUTRI
IA I RESPIRAIA
BACTERIILOR

Particularitile metabolismului bacterian:

bacterian:
1.
Este un metabolism necompartimentat , toate
procesele metabolice se desfoar intrintr-o singur
celul
2.
Este foarte flexibil, realizndurealizndu-se prin diverse ci
metabolice (bacteriile se adapteaz rapid la
condiiile mediului)
3.
Este foarte intens (viteza reaciilor este mare)
4.
Produsele intermediare din procesele catabolice
pot fi utilizate direct n calitate de precursori
pentru reac
reaciile anabolice (amfibolism)
n toate reaciile
reaciile metabolice intervin catalizatori
proteici specifici - enzimele

I.
II.
III.

Clasificarea enz
en zimelor
Constitutive (permanente
permanente))
Inductive (adaptive
adaptive)), se sintetizeaz n prezena
substratului (ex.: lactaza)
Represive, sinteza lor este inhibat de acumularea n
exces a prod
produsului reaciei catalizate
Dup locul de aciune (exoenzime, endoenzime)
endoenzime)
Dup tipul reaciei catalizate (oxido
oxido--reductaze, hidrolaze,
transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
ligaze )
Dup impactul asupra ma/o
Enzime metabolice
Enzime de patogenitate,
patogenitate, responsabile de modificri
patologice ale esuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza,
colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina,
lecitinaza, proteaze, etc.

Fiziologia bacterian
bacterian studiaz viaa i
activitile bacteriilor nutriia, respiraia,
creterea i multiplicarea, condiiile de
cultivare a bacteriilor.
Metabolismul bacterian reprezint
ansamblul de reacii biochimice care au loc
n celula vie.
Catabolism reacii chimice de
descompunere a substanelor complexe n
elemente simple, nsoit de degajarea
energiei (metabolism energetic)
Anabolism reacii chimice de sintez a
substanelor complexe din elemente simple,
necesit energie (metabolism constructiv, de
sintez)

Enzimele bacteriene.
bacteriene. Caractere generale:
Substane proteice
Active n limite largi de temperaturi (0(0-65 C)
i de pH (2(2-9)
Specificitate de substrat i de aciune
(reacioneaz cu un substrat cataliznd un
tip de reacie)
Specificitatea este determinat de centrul
activ al enzimei, complementar cu
receptorul de pe substrat
Nu se modific n cursul reaciei

1.

2.

3.

4.

Importana practic a studierii enzimelor

Rol n identificarea i clasificarea
bacteriilor (enzimele determin activitatea
biochimic specific a bacteriilor)
Unele substane chimice, antibiotice
interfereaz cu activitatea unor enzime,
inhibnd creterea bacteriilor (tratament)
Determinarea mecanismelor patogenezei
infeciilor (unele enzime sunt responsabile
de producerea leziunilor n esutul gazdei)
Aplicarea industrial a enzimelor

2/8/2010

NUTRIIA BACTERIAN

Nutriia modalitile prin care bacteriile

asimileaz din mediu substanele necesare
pentru metabolism.
Modul (tipul) de nutriie la bacterii este absorbtiv
absorbtiv..
Nutrieni substane, soluiile crora pot
traversa MCP pentru a fi antrenate n
metabolismul celulei. Se obin din alimente prin
solvire (sruri minerale, CO2, O2) sau dup o
digestie prealabil (proteine, polizaharide, lipide).
La bacterii digestia este extracelular (la
bacteriile GG- n spaiul periplasmic)

Nutrienii servesc n calitate de material

de construcie i surs de energie
pentru sinteza compuilor i meninerea
vieii bacteriei.
Transportul transmembranar
1. Difuzie simpl (conform gradientului de
concentraie, fr utilizarea energiei):
O2, CO2, acizi grai, nutrieni liposolubili

2. Difuzie facilitat (conform gradientului de

concentraie) permite transportul
transmembranar al moleculelor mari prin
intermediul proteinelor de transport
specifice - permeaze
permeaze..
3. Transport activ (contra gradientului de
concentraie, necesit energie). Particip
permeazele i alte proteine de transport
specifice. Nutrienii nu suport modificri.
4. Translocaie substratul este modificat
(ex.: fosforilat) n timpul transportului
membranar; necesit energie

Substanele care au ptruns n citoplasm

sunt descompuse de ctre enzimele
bacteriene conform cilor metabolice proprii
fiecrei specii bacteriene (ex.: EmbdenEmbdenMeyerhof, EntnerEntner-Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obine
energie i precursori care vor fi antrenai n
biosintez (anabolism).
Excreia metaboliilor difuzie, proteine de
transport, liza bacteriei

2/8/2010

Necesitile nutritive ale bacteriilor

- Necesiti elementare,
elementare , de baz: C, H, O, N n
cantiti importante;
importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K n
cantiti mici i urme de Co, Cu, Zn, Mo.
Mo.
Bacteriile prototrofe sunt capabile aa-i realiza
integral sinteza metaboliilor eseniali.
- Necesiti specifice.
specifice. Bac
Bacterii
teriile
le auxotrofe
solicit suplimentar compui organici
preformai (factori de cretere)
cretere), care nu pot fi
sintetizai de bacterie (ex.: AA, baze purinice,
pirimidinice, vitamine). Prezena lor n mediul
de cultur este indispensabil creterii acestor
bacterii.

Surse de azot
AA sau acizi nucleici
Sruri de amoniu, nitrii, azot atmosferic
Surse de substane minerale:
minerale:
S - din AA, sulfuri, sulfai;
P - din fosfai;
fosfai;
K, Mg, Ca, Na - din sruri minerale;
Zn, Cu, Mn, Mo din ap

Mecanismele de obinere a energiei la

chemoorganotrofe n funcie de acceptorul
final de H :
Respiraie aerob.
aerob. Acceptorul final este
oxigenul gazos. Implic lanul respirator de
transport al electronilor asociat MCP. Produs
final H2O sau H2O2 .
Respiraie anaerob.
anaerob. Acceptori finali
compui anorganici (nitrat, sulfat,
sulfat, S).
S).
Transportul de electroni prin lanul respirator.
Produse finale nitritul, amoniacul, sulfura
(n prezen
prezena O H2O2).

Clasificarea bacteriilor dup sursa de carbon

Bacterii autotrofe utilizeaz CO2 ca unic

surs de carbon (nepatogene)
Bacterii heterotrofe utilizeaz carbonul din
compuii organici (glucide, acizi grai, alcooli,
etc)
Bacteriile care utilizeaz materia organic
moa
mo
art sunt saprofite (reciclarea materiei
organice)
Bacteriile
Bacterii
le parazite (obligate, facultative) triesc
pe contul organismelor vii, aducnduaducndu-le
prejudicii
Bacteriile patogen
patogene
e reprezint
reprezint
parazite
parazite care
afecteaz grav gazda, provocnd maladie sau
moarte..
moarte

Clasificarea bacteriilor dup sursa de energie

Bacterii fototrofe utilizeaz energia solar
(fotosint)
Bacterii chemotrofe folosesc energia degajat din
reaciile chimice de oxidooxido-reducere. Ele necesit un
substrat donor de hidrogen (e- i H+) i un substrat
acceptor de hidrogen.
hidrogen. n transfer particip
transportori intermediari de electroni (lanul
respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)
- Bacteriile chemolitotrofe donorul de H este o
substan anorganic
- Bacteriile chemoorganotrofe donorul de H este o
substan organic (glucoza, lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Fermentaie. Substratul organic este

Fermentaie.
metabolizat fr intervenia unui agent
oxidant extern. Const n procese de oxox-red
care realizeaz numai o oxidare parial a
substratului, donorul i acceptorul de H+ fiind
substane organice. Astfel se ajunge de la un
substrat mai redus la o molecul mai oxidat
(ex.: fermentare lactic, fermentare
alcoolic, acid mixt, acetoinic, etc).
Fermentaia se poate desfura n prezena
O2, dar fr intervenia acestuia.

2/8/2010

Conservarea energiei
O parte din energia eliberat se pierde sub
form de cldur sau poate fi utilizat direct
sub form de energie electroelectro-chimic (fpm) la
nivelul MCP (ex.: rotaia flagelilor, transport
transmembranar) sau stocat n compui
chimici macroergici bogai n energie: ATP
(sintetizat prin fosforilare oxidativ sau
fosforilare la substrat),
substrat), fosfoenol
fosfoenol--piruvat,
acetilfosfat i acetilacetil-CoA.
n procesele de respiraie se elimin mai mult
energie dect din fermentaie (n glicoliz dintrdintr-un
mol de glucoz
glucoz
- 38 moli
moli ATP
ATP,, prin fermentaie - 2
moli ATP)
ATP).. n procese de fermentare se formeaz
deeuri rejetate de ctre celul.

I.

II.

III.
IV.

Clasificarea bacteriilor dup

sursele de energie i carbon
Bacterii fotoautotrofe (energie solar,
CO2)
Bacterii fotoheterotrofe (en. sol.,
subst.org)
Bacterii chemoautotrofe
Bacterii chemoheterotrofe
(chemolitoheterotrofe,
chemoorganoheterotrofe))
chemoorganoheterotrofe

2/8/2010

CRETEREA I MULTIPLICAREA BACTERIILOR

Creterea mrirea coordonat a masei i

volumului structurilor bacteriene ca rezultat al
proceselor de sintez
Multiplicarea creterea numrului de celule pe
o unitate de suprafa sau de volum
Diviziu
Divizi
une binar
nmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
Autoreproducere (virusuri)
Spori (micete)
Fragmentare (actinomicete)

Ciclul celular procesele care au loc de

la formarea celul
celulei
ei p
pna la urm
urmtoarea
diviziune
diviziun
e
1. Faza C replicarea ADN
2. Faza G de laten, segregarea
cromozomilor
3. Faza D de diviziune, formarea septului
Replicarea ADN depinde de masa critic a
celulei, iar separarea cromozomilor i
diviziunea intervin n momentul cnd
celula atinge o lungime - limit

Perioada dintre 2 diviziuni reprezint timpul

(perioada) de generaie (TG).
Durata TG depinde de specie i de condiiile de
cretere (condiii optime vitez maxim)
Bacteria

TG
in
(min)

vitro TG in
(ore)

Escherichia coli

20-40

Staphylococcus aureus

40

3-5

Vibrio cholerae

10

2-3

Mycobacterium
tuberculosis

120-240

24-48

vivo

2/8/2010

Creterea bacteriilor n laborator cultivare

cultivare..
Se cultiv bacteriile pentru izolarea lor din
medii naturale (prelevate patologice,
alimente, ap, etc).
Izolarea bacteriilor se realizeaz pentru:
1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
2. Testa
Testarrea sensibilitii lor fa de antibiotice
3. Obinerea unor produi de biosintez
(antibiotice, AA), bioconversie (hormoni
steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici,
etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

Temperatura de cretere
Exist temperaturi minime, maxime i optime
de dezvoltare a bacteriilor. n raport cu
temperatura optim deosebim:
1. Bacterii psichrofile t optim 1010-20
20 C.
Cresc i la 0
0 C.
2. Bacterii mezofile optimum 3030-37
37 C
(limite 1515-45
45 C)
3. Bacterii termofile optimum 5050-60
60 C
(pn la 95
95 C)
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70
70110
110 C)

1.
2.

3.

4.

5.

Pentru cretere bacteriile au nevoie de

nutrieni i condiii fizicofizico-chimice adecvate.
Condiiile (principiile) de cultivare
- Surs nutritiv adecvat
- Surs de energie
- Ap
- Temperatura potrivit
- pH adecvat
- Concentraie optim a oxigenului i a CO2
- Presiune osmotic adecvat

pH

1.

Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele

patogene) pH 66-7,5
Bacterii acidofile pH 22-6 (Lactobacillus)
Bacterii alcalofile pH >8 (Pseudomonas,
Vibrio)
Presiunea osmotic
Bacterii halotolerante (osmotolerante) cresc
n concentraii reduse de NaCl (mediu
izotonic cu mediul intern al gazdei) mi/o
patogene
Bacterii halofile prefer concentraii mari de
NaCl (1(1-30%) stafilococi, vibrioni (V
(Vibrio
parahaemolyticus))
parahaemolyticus

2.
3.

1.

2.

Oxigenul
Bacterii strict aerobe cresc doar n prezena O2.
Obin energia prin respiraie aerob
Bacterii microaerofile necesit concentraii reduse
de O2 i 22-10% CO2. Obin energia prin respiraie
sau fermentaie (Neisseria, Brucella,
Campylobacter))
Campylobacter
Bacterii strict anaerobe cresc doar n absena O2.
Obin energia prin fermentaie sau uneori respiraie
anaerob. Toxicitatea O2 formarea H2O2, a
radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care
anaerobii nu le pot descompune (absena catalazei,
superoxid dismutazei, peroxidazei) Clostridium,
Bacteroides
Bacterii anaerobe aerotolerante pot crete n
prezena O2, obin energia prin fermentaie, posed
peroxidaz (Lactobacillus, streptococi)
Bacterii facultativ anaerobe cresc n orice condiii,
obin energia prin respiraie sau fermentaie

2/8/2010

1.

2.

3.

Mediile de cultur soluii sau substrate solide

care asigur nutrienii i condiiile fizicofizico-chimice
necesare cultivrii bacteriilor. Ele pot fi utilizate
pentru cultiva
cultivarea
rea (izolarea) bacteriilor, testarea
sensibilitii la antibiotice, stocarea sau transportul
culturilor bacte
bacteriene.
riene.
Cerinele fa de mediile de cultur
S asigure necesitile nutritive i energetice ale
bacteriilor
Umiditate optimal
pH optimal (7,2(7,2-7,4) i constant (caracter de
tampon)
Potenial de oxidooxido-reducere optimal (anaerobi rH2<5, aerobi rH2>10)
S fie izotonice (0,5% NaCl)
S fie sterile i transparente

Dup consisten
Medii lichide (bulion)
(bulion)
utilizate pentru
obinerea biomasei bacteriene i a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine)
Medii solide conin 1010-15% gelatin sau 22-3%
agar--agar (polizaharid extras din alge roii, t
agar
topire 8080-100 C, solidificare 42 C). Placa de
geloz n cutii Petri este utilizat
utilizat pentru
izolarea culturilor pure,
pure, geloza nclinat (n
pant) pentru acumularea culturilor pure
Medii semisolide 0,2 0,5 % agaragar-agar. Se
utilizeaz pentru studierea activitii
biochimice sau a mobilitii bacteriilor.

CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTUR

Dup provenien
1.
Empirice, naturale.
naturale. Au la baz produse de
origine animal sau vegetal (snge, ser,
lapte, ou, cartof, extracte din carne, cord,
creier, ficat, pete, levuri, etc).
etc). Compoziia
Compoziia
lor chimic precis nu poate fi controlat
2.
Sintetice includ ingrediente chimice
chimice pure,
compoziia chimic este cunoscut cu
exactitate
3.
Semisintetice

Dup compoziia chimic (complexitate) i

destinaie
A. Medii uzuale (universale, simple)
1.
Ap peptonat (ap+1% pepton+0,5%
NaCl)
2.
Bulion peptonat BP (extract apos din carne
+ 1% pepton+0,5% NaCl)
3.
Geloza nutritiv (BP + 22-3% agaragar-agar)
4.
Gelatina nutritiv (BP + 1010-15% gelatin)
Sunt utilizate pentru creterea bacteriilor
nepretenioase la cultivare
Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min

B. Medii complexe
I. Medii elective formate din medii simple cu adaos
de componente care permit creterea mi/o
exigente nutritiv (bulion
(bulion--ser, bulion glucozat,
geloz--snge streptococi, neisserii
geloz
neisserii;; ser
coagulat corinebacterii
corinebacterii,, etc)
II. Medii selective medii solide cu adaos de
componente sau cu condiii fizicofizico-chimice
particulare care stimuleaz creterea unor specii
i inhib creterea altor specii (geloza
(geloza salin stafilococi,, geloza alcalin - vibrioni
stafilococi
vibrioni,, mediul
Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

2/8/2010

Mediile de mbogire reprezint medii selective

lichide, utilizate pentru mbogirea florei
patogene i inhibarea florei de asociaie dintrdintrun prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).
fecale).
Etap
Etap
premergtoare nsmnrii pe medii
selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bil+verde de
briliant) Salmonella
- Bulion cu selenit Shigella, Salmonella
- Ap peptonat alcalin (pH
(pH=
=8) Vibrio cholerae
- Kitt
Kitt--Tar
Tarrrozzi (BP+0,5% glucoz+buci de ficat)
pentru anaerobi

III. Medii diferenialdiferenial-diagnostice (DD) permit

diferenierea speciilor bacteriene n baza
activitii lor biochimice (zaharolitice,
proteolitice, lipolitice, de oxidooxido-reducere
reducere
)
Sunt construite dup urmtoarea schem:
Baz nutritiv+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietilor zaharolitice
Endo (geloz+lactoz+fucsin+hiposulfit de Na)
Na)
Levin (geloz+lactoz+eozin+albastru metilen)
Ploskirev (geloz+lactoz+rou neutru+sruri de
acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo
lactozo--pozitive vor fi colorate (ro
roiiii pe
Endo, Ploskirev, albastru
albastru--violete pe Levin
Levin))

Studierea proprietilor de oxidooxido-reducere

Mediul cu sulfit de Bi pentru Salmonella
(colonii
(c
olonii negre reducerea sulfitului n
sulfura de Bi)

2/8/2010

Mediul Klauberg (geloz

(geloz--snge cu telurit de
K) pentru Corynebacterium diphtheriae
(colonii negre)
Studierea proprietilor lipolitice
Geloza cu glbenu de ou bacteriile cu
lecitinaz formeaz un halou opac n jurul
coloniei

Studierea proprietilor hemolitice

Geloza--snge (geloza+5
Geloza
(geloza+5--15% snge
defibrinat)
n cazul hemolizei n jurul coloniilor apare o
zon clar

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure

i identificare preliminar
Russel geloz+1% lactoz, 0,1% glucoz, indicator
Kligler identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H 2S)
Olkeniki identic Kligler+1% zaharoz+uree
Indicatorul Andrede fucsin+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid i gaz - AG) duce la
modificarea pH i virajul culorii mediului din rou n
galben.
n pant se apreciaz
apreciaz lactoza/zaharoza
lactoza/zaharoza (oxidare), n
coloan--glucoza (fermentare).
coloan
Producerea H2S n
nn
negrirea mediului

Medii DD pentru identificarea final

final

a culturii pure
- irul pestri Hiss (lichid sau semisemi-solid)
solid)
un ir
de tuburi ce conin soluii 0,5% de diferite
glucide i indicator.
Aprecierea dup modificarea culorii (acid - A)
i apariia bulelor de gaz (acid i gaz - AG)
- Medii cu AA (lizin, arginin, ornitin) i
indicatori
IV. Medii speciale pentru izolarea unor
anumite bacterii (Finn,
(Finn, Popescu,
Loe
Lo
ewenstein
wenstein--Jensen pentru agenii
tuberculozei,, Sabouraud fungi
tuberculozei
fungi))

V. Medii de transport destinate transportrii sau

stocrii unui material (prelevat), care va fi
examinat ulterior.
Menine n via bacteriile, fr a favoriza
multiplicarea lor.
- Mediul cu glicerin 30%
- Soluie tampontampon-fosfat
- Soluie NaCl 3%
- Mediul CaryCary-Blair
- Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de
Na, albastru de metilen) pentru anaerobi,
neisserii, etc

2/8/2010

Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mic

de material ce conine bacterii (inoculum
(inoculum)) se
ntroduce ntrntr-un mediu de cultur
(nsmnare, inoculare),
inoculare), care ulterior va fi
incubat n termostat (pentru asigurarea
temperaturii optime).
n timpul incubrii (18(18-24
24--48 ore..
ore..)) bacteriile
cresc i se divid, formnd o cultur
bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate
prin multiplicare intrintr-un mediu).
mediu).
M.tuberculosis 3-5 sptmni
V.cholerae 6-12 ore

Manifestarea creterii i multiplicrii

bacteriilor
n mediu lichid
- Turbiditate uniform
- Formarea unei pelicule la suprafaa
mediului (vibrioni, yersinia)
- Formarea unui sediment
la fundul tubului sau pe perei
(streptococi, Bacillus anthracis)
anthracis)

Cultur pur format din bacterii de

aceeai specie (indispensabil identificrii)
Cultur mixt compus din bacterii de
specii diferite
Tulpin populaie microbian constituit
din descendenii unei singure izolri n
cultur pur, care va fi studiat ulterior.
Clon populaie care rezult din
multiplicarea unei singure celule

n mediu solid formarea coloniilor

Colonie o aglomerare de bacterii care
se dezvolt dintrdintr-o singur celul sau
un grup de celule (UFC - unitate
formatoare de colonii)
colonii) pe suprafaa unui
mediu solid
Fiecare specie bacterian formeaz
colonii specifice (caracter util n
identificare)

Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) rotunde, netede, umede,
lucioase
Colonii R (rough) margini neregulate, suprafaa
uscat, rugoas

Caracteristica coloniilor
Dimensiuni colonii mici (0,1(0,1-1mm), medii (1(12mm), mari (2(2-3mm)
Contur (margini) neted, ondulat, zimat, lobat,
etc
Suprafa plat, bombat, convex, ombilicat,
etc
Form punctiform, circular, filamentoas,
neregulat
Culoare (pigmentaie) alb, galben, aurie, etc
Densitate opac, transparent, etc
Consisten cremoas, untoas, uscat,
mucoid

10

2/8/2010

Caracterele de cultur ale bacteriilor

reprezint exigenele nutritive (medii,
temperatur, pH, aerare, etc), timpul
apariiei
apari
iei culturii i manifestarea
creterii pe medii lichide i solide

Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi

n funcie de modul de dezvoltare a culturilor

bacteriene se disting:
- Culturi discontinue/periodice
- Culturi continue
- Culturi sincrone
Culturile discontinue se obin la cultivarea
bacteriilor n volum limitat de mediu. Astfel de
culturi sunt obinute i utilizate n laboratorul
microbiologic

Fazele dezvoltrii unei culturi discontinue

I. Faza de lag faza de adaptare la condiiile
mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc
n dimensiuni, dar nu se divid.
Durata este variabil (2(2-4 ore); depinde de starea
bacteriei, condiiile mediului, etc
II. Faza logaritmic bacteriile cresc i se divid cu
vitez maximal constant, curba evolueaz
exponenial. Bacteriile sunt foarte sensibile la
ageni antimicrobieni (culturi
(culturi utile pentru testarea
sensibilitii la antibiotice).
Durata 8-10 ore

III. Faza staionar rata celulelor care se multiplic

scade treptat, numrul celulelor vii rmne
constant mai multe ore.
Cauza consumarea nutrienilor, acumularea
metaboliilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipic speciei, apar
incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare).
Sensibilitatea la agenii
agenii antimicrobieni scade.
Durata 10
10--12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) bacteriile mor
progresiv

11

2/8/2010

EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Cultura continu se realizeaz cnd mediul
Cultura
de cultur este continuu rennoit i
mbogit cu oxigen cu evacuarea unei
cantiti de cultur. Se realizeaz n
chemostate sau turbidostate
turbidostate,, cultura
aflndu--se permanent n faza exponenial.
aflndu
Se utilizeaz n microbiologia industrial.
n intestin culturi continue.
Culturi sincrone culturi n care bacteriile se
divid n acelai timp

Faza prepre-analitic (responsabilitatea medicului)

Prescrierea investigaiei (n funcie de datele
examenului clinic i paraclinic). n ordonan se
fixeaz identitatea medicului, a pacientului,
scopul analizei, manifestrile patologice, locul,
data apariiei, alte date: imunosupresie,
tratament cu antibiotice,
antibiotice, graviditate, etc.
Prelevarea probelor
Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare,
locul multiplicrii sau/i din cile de eliminare ale
agentului patogen) i momentul prelevrii

Materiale de examinat din mediul extern:

extern :
- Ap
- Alimente
- Sol
- Aer
- Lavaje
- Vectori, etc

Examen
xamenul
ul bacteriologi
bacteriologic
c const
const
n inocular
inocularea
ea
(nsmnarea) prelev
preleva
atelor pe me
medii
dii de
cultur
cultur
pentru izolarea cultur
culturilor
ilor pure de
bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior
identificate
identifi
cate,, test
testate
ate la sensibilitate vis
vis--a-vis
de antibiotice
antibiotice,, eventua
eventual conservat
conservate.
e.
Examen
xamenul
ul bacteriologi
bacteriologicc const din cteva
etape succesive,
succesive, de la prelev
prelevarea
area
(recoltarea) probelor biologi
biologice
ce pn la
remiterea
remi
terea re
rezzultat
ultatelor
elor..

Materiale de examinat (prelevate) de la pacieni:

pacieni:
- Secreii rinorino-faringiene, bronice
- Sput
- Puroi
- Exsudate, transsudate
- Snge
- LCR
- Urin, secreii genitale
- Mase fecale, bil, suc duodenal
- Bioptate, punctate
- Material cadave
cadaveric
ic,, etc

Modul de prelevare (recoltare)

- n recipiente sterile
- Respectnd regulile de autoprotecie
- La debutul bolii
- Pn la administrarea antibioticelor
- Cantitate suficient
Transportarea
- Imediat sau utiliznd medii de transport, cu
respectarea
respect
area condiiilor speciale dup necesitate
- n ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- n fia de nsoire s fie indicat identitatea
pacientului, vrsta, sexul, natura prelevatului, data,
ora prelevrii, scopul investigaiei, .a.)

12

2/8/2010

EXAMENUL BACTERIOLOGIC
PENTRU CULTURILE AEROBE
Prelev
releva
atul est
este
e su
supu
puss examen
examenului
ului
macroscopicc (modifica
macroscopi
modificarea
rea aspect
aspectului
ului,, a
mirosului,, etc) - orientare n diagnostic
mirosului
Dup necesitate, probele sunt supuse
pregtirii pentru investigaie (diluare,
omogenizare, centrifugare, etc)
Examinarea microscopic (preparate
native, Gram, ZiehlZiehl-Neelsen, BurriBurriHinsss...) prezena mi/o, forma,
Hins
cantitatea, G+/G+/-.

I etap IZOLAREA CULTURILOR PURE

Scopul izolrii - de a ob
obine o cultur
cultur
pur
pur
dintr
dintr-un melan
melanjj de celule bacteriene sa
sau
u dintr
dintr--un
produss patologi
produ
patologicc. O colonie separat
constituie o cultur
cultur
pur
pur
.
Tehni
ehnici
ci utilizate:
1.
Prin epui
epuizarea
zarea inoculului pe suprafaa gelozei
din cutia Petri (nsmnare n striuri
striuri paralele,
paralele,
ns
ns
mnare n cadran
adrane
e, etalarea
etalarea consecutiv
consecutiv

pe tr
trei
ei cutii
cutii).
).
2.
Metoda diluiilor logaritmice a inoculului n
geloz topit i rcit la 50
50 C (10-1, 10-2,...),
apoi turnate n cutii Petri sau eprubete.
Incubare n termostat la 37
37 C, 1818-24 h (n funcie
de TG).

13

2/8/2010

Metode speciale de izolare n culturi pure:

- A bacteriilor sporulate: nclzirea prealabil a
prelevatului 80
80 C 20 min
- A bacteriilor acidoacido-rezistente: tratarea prealabil
cu acid a prelevatului i neutralizarea ulterioar
cu o baz
- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene:
mbogirea prealabil a florei patogene utiliznd
medii de mbogire
- A bacteriilor cu virulen nalt i pretenioase la
cultivare: inocularea la animalel
animalele
e de laborator
sensibile

III etap IDENTIFICAREA CULTURII PURE

II etap ACUMULAREA CULTURII PURE

- Examinarea macroscopic a coloniilor crescute
(form, culoare, dimensiuni, etc)
- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte, confirmarea puritii culturii
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloz n
pant (nclinat) pentru acumularea culturii
pure
- Termostat, 37
37 C, 1818-24 ore

Verificarea puritii culturii (frotiu Gram)

Identificarea culturii pure const n evidenierea unor
caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include ntrntr-o
familie, gen, specie, variant
Se studiaz caracterele:
Morfologice
Tinctoriale
De cultur
Biochimice
Antigenice (seroidentificarea)
De patogenitate
Sensibilitatea la bacteriofagi (fago(fago-identificarea)
Sensibilitatea la antibiotice
-

14

2/8/2010

1.
2.
-

STUDIEREA ACTIVITII
BIOCHIMICE A BACTERIILOR
Activitatea zaharolitic (irul Hiss, coagularea
laptelui,, etc)
laptelui
etc)
Activitatea proteolitic
Degradarea proteinelor native (lichefierea
gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea
laptelui,, etc)
laptelui
etc)
Evidenierea enzimelor ce intervin n
degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze,
desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele
finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol,
etc
etc

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2)

(cultura se amestec cu o pictur de ap oxigenat
apariia bulelor de gaz)

Depistarea oxidazei (detectarea prezenei citocromoxidazei

din lanul respirator)
Reactiv di (tetra)metil(tetra)metil-parafenilen
parafenilen--diamin (benzi sau
rondele de hrtie mbibate cu reactiv, creioane, etc)
Oxidarea reactivului culoare violetviolet-neagr
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas

Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii

de fer de culoare neagr n mediile
multitest Kligler, Olkeniki, etc; plasarea
unei benzi de hrtie de filtru mbibat cu
acetat de Pb deasupra BP n care crete
cultura studiat (formarea sulfurii de Pb
nnegrete hrtia)
Depistarea indolului (produs al hidrolizei
triptofanului) benzi de hrtie mbibate cu
acid oxalic.
oxalic. n prezena indolului indicatorul
vireaz n roz.
Depistarea amoniacului (ureaza) hrtia de
turnesol se coloreaz n albastru.

Depistarea lecitinazei mediu cu glbenu de ou 10% formarea unui halou opac n jurul coloniilor

Depistarea lipazei mediu cu Twin 80 1%

1% halou opac n
jurul coloniilor (precipitarea acizilor grai)
Depistarea hemolizinei geloz
geloz--snge 55-10% - zon clar n
jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei,
fosfatazei, etc
Probele sunt incubate la 37
37 C, 1818-24 h

Oxidazo-- : Enterobacteriaceae
Oxidazo

Identificarea rapid
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde
(economie de timp, spaiu, material)
Sistemul API o galerie din plastic format
din numeroase alveole care conin fiecare
un mediu deshidratat diferit (glucide, AA,
etc).. Alveolele sunt inoculate cu o
etc)
suspensie bacterian testat i incubate.
incubate.
Ulterior la necesitate se adaug reactive
pentru detectarea metaboliilor particulari.
particulari.
Lectura conform unui cod de cifre sau
computerizat

15

2/8/2010

IV etap EVALUAREA
REZULTATELOR, FORMULAREA SI
ELIBE
ELI
BERAREA
RAREA RSPUNSULUI
- Compararea rezultatelor obinute cu
caracterele speciilor bacteriene
cunoscute pentru a gsi asemnri.
- Exemplu de rspuns: Din proba
examinat a fost izolat tulpina de
Corynebacterium diphtheriae,
diphtheriae, biovar
gravis,, tox+, sensibil la ...., rezistent la
gravis
.....

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU

CULTURI ANAEROBE
(clostridiene, neclostridiene)
Condiia principal cultivare n absena
oxigenului
1.
Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt
(Kitt--Tar
Tarrrozzi
regenerat - 100
100 C, 20 min, rcit, acoperit cu
vazelin;; nsmnarea n geloz n coloan)
vazelin
2. Crearea condiiilor de anaerobioz
Metoda fizic utilizarea anaerostatului
Metoda chimic n exicator se ntroduc
substane ce fixeaz oxigenul (pirogalol+baz);
utilizarea gas
gas-pachetelor
Metoda biologic Fortner cultivarea
concomitent a aerobilor i anaerobilor

Recoltarea cu precauie, evitnd contactul

cu aerul (n seringi, utiliznd medii
speciale)
I etap MBOGIREA ANAEROBILOR
- nsmnarea prelevatului n 2 eprubete cu
mediul KittKitt-Ta
Tarrrozzi regenerat
- nclzirea unui tub la 80
80 C, 20 min
distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37
37 C, 2424-48 h (va avea loc
nmulirea anaerobilor)

16

2/8/2010

II etap - IZOLAREA CULTURII PURE

DE ANAEROBI
Studierea caracterelor de cultur tulburarea
mediului, descompunerea bucilor de ficat,
etc
Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda
Zeissler (nsmnarea a 0,1 ml din mediul
K-T pe 3 cutii cu gelozgeloz-snge glucozat
consecutiv). Incubarea n
anaerostat/exicator/gass-pack, 24anaerostat/exicator/ga
24-48 h

Metoda Weinberg diluii succesive ale

culturii n geloz glucozat lichefiat i
aspirarea n tuburi lungi i nguste, nchise
ermetic. Incubarea n termostat, 24 h
III etap - ACUMULAREA CULTURII PURE
- Studierea macroscopic a coloniilor
- Examinarea microscopic (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte
- Repicarea n mediul KK-T regenerat pentru
acumularea culturii pure
- Incubarea n termostat, 24 h
-

IV etap - IDENTIFICAREA CULTURII

PURE DE ANAEROBI
Verificarea puritii culturii pure (frotiu
Gram)
Studierea caracterelor culturii pure izolate
(cu respectarea condiiilor de
anaerobioz)
V etap - EVALUAREA REZULTATELOR,
FORMULAREA I ELIBERAREA
RSPUNSULUI

17