12.11.

2010

FAMILIA HERPESVIRIDAE.
MICROBIOLOGIA I DIAGNOSTICUL
DE LABORATOR AL INFECIILOR
CAUZATE DE HERPESVIRUSURI

FAMILIA HERPESVIRIDAE
Virusurile herpetice - ageni patogeni ai omului, primatelor i
altor mamifere (porci, cai, vite), ai psrilor (gini, curcani,
etc), petilor i broatelor, reunind peste 100 de virusuri.
Clasificarea virusurilor herpetice de interes medical:
Subfamilia Alphaherpesvirinae
genul Simplexvirus (HSV-1, HSV-2)
genul Varicellovirus (VZV)
Subfamilia Betaherpesvirinae
genul Cytomegalovirus (CMV )
genul Roseolovirus (HHV-6/7)
Subfamilia Gammaherpesvirinae
genul Lymphocryptovirus (EBV)
genul Rhadinovirus (HHV-8)

CARACTERE GENERALE ALE HERPESVIRUSURILOR

Structura virionului
Virion sferic, 150-200 nm diametru, constituit din:
centru dens, de forma unui mosor (bobin), de natur
proteic, pe care este nfurat acidul nucleic;
genomul viral ADNd.c., constituit din 80-100 gene
capsida de simetrie icosaedric, format din 162 capsomere;
tegument structur proteic fibrilar, situat ntre capsid i
supercapsid;
peplos (supercapsida), dublu strat lipidic, pe suprafaa creia
proiemin spiculi scuri, constitui din 5-8 glicoproteine,
responsabile de adeziune i fuziune
Enzime (ADN-polimeraza ADN-dependent, timidin-kinaza,
ribonucleotid-reductaza, serin-proteaza)

12.11.2010

Caractere biologice
virusuri dermo, limfo i neurotrope
determin infecii latente, recurente
majoritatea prezint potenial oncogen
posed numeroase enzime ce intervin n
multiplicarea viral
prezint un spectru foarte larg de gazde i o
gam divers de forme clinice
sunt virusuri fragile i se transmit numai prin
contact direct

Rezistena la ageni fizici i chimici

n stare liofilizat, la 4 grade, virusurile
herpetice se menin ani de zile.
Relativ instabile la temperaturi ambientale
(+ 22 grade C), inactivate de solveni lipidici,
detergeni, dezinfectani uzuali, pH extreme.
Prezint sensibilitate la aciunea inhibitorilor
sintezei ADN (acyclovir, etc).

Human herpes
type

Name

Sub Family

Target cell type

Latency

Transmission

Herpes simplex-1
(HSV-1)

Alphaherpesvirinae

Mucoepithelia

Neuron

Close contact

Herpes simplex-2
(HSV-2)

Alphaherpesvirinae

Mucoepithelia

Neuron

Close contact
usually sexual

Varicella Zoster
virus (VZV)

Alphaherpesvirinae

Mucoepithelia

Neuron

Contact or
respiratory
route

Epstein-Barr Virus
(EBV)

Gammaherpesvirina
e

B lymphocyte,
epithelia

B lymphocytes

Saliva

Monocytes,
lymphocytes
and possibly
others

Contact, blood
transfusions,
transplantation
, congenital

Cytomegalovirus
(CMV)

Betaherpesvirinae

Epithelia,
monocytes,
lymphocytes

Herpes
lymphotropic
virus

Betaherpesvirinae

T lymphocytes and
others

T lymphocytes and
others

Contact, respiratory
route

Human herpes
virus-7 (HHV7)

Betaherpesvirinae

T lymphocytes and
others

T lymphocytes and
others

Unknown

Human herpes
virus-8 (HHV8)
Kaposi's sarcomaassociated
herpes virus
(KSHV)

Gammaherpesvirina
e

Endothelial cells

Unknown

Exchange of body
fluids?

Multiplicarea viral
Adsorbia virionului la suprafaa celulei-int
Penetrarea NC prin fuziunea supercapsidei virale cu membrana
celular
Degradarea partiala a capsidei de enzime celulare i
ptrunderea ADN viral n nucleul celulei. Sinteza proteinelor
celulare se oprete.
Biosinteza: n 3 runde consecutive are loc transcrierea ARNm
viral cu sinteza ulterioar a 3 tipuri de proteine: foarte precoce
(alpha, immediate early), precoce (beta, early), care sunt n
majoritate enzime i proteine tardive (gamma, late), care sunt
proteine de structur.
Replicarea ADN
Asamblarea NC are loc n nucleu. Prsindu-l prin inmugurire,
NC se nvelesc cu membrana nuclear intern, n care sunt
nserate GP virale imature, pe care o dezbrac n procesul de
nmugurire prin membrana nuclear extern. n citoplasm NC
capt proteinele tegumentului i sunt ulterior re-nvelite n
supercapsid ntr-o vezicul de exocitoz, n membrana creia
se conin GP virale mature.
Virionii sunt eliberai prin exocitoz .

12.11.2010

Celula infectat este alterat ireversibil prin:

Inhibarea rapid a metabolismului celular
Fragmentarea cromozomului i apariia
incluziilor intranucleare corpusculii Cowdry
Apariia de sinciii i celule gigante

12.11.2010

SUBFAMILIA ALPHAHERPESVIRINAE

GENUL Simplexvirus
Specii: Herpes simplex virus tip 1 (HSV-1)
Herpes simplex virus tip 2 (HSV-2)

Cultivare:
1. Culturi celulare primare umane sau din rinichi de iepure,
fibroblaste de embrion de gin, linii celulare HeLa
2. Ou embrionate de gin (pe membrana chorioalantoic produc
pustule pocks-uri)
3. Animale de laborator
- oarece nou-nscut (letal)
- Iepure (keratoconjunctivit dup scarificarea corneei)
- Cobai infectat intraplantar (erupie vezicular local)

Patogeneza infeciilor cu HSV

Sursa de virus omul (90% au Ac anti-HSV1 i
20% anti-HSV2)
Transmiterea virusului:
- Contact direct prin saliv sau lichidul vezicular,
mai rar prin obiecte contaminate recent cu
saliv (preponderent HSV 1)
- Contact sexual (preponderent HSV 2)
- n timpul naterii (herpes neonatal, HSV 2)
- Transplacentar (herpes congenital, HSV 2))
- Prin intermediul transplantelor de organe
infectate
- Autoinocularea

Infecia cu HSV -1
Primo-infecia este precoce, la 1-3 ani, n 90% cazuri
asimptomatic.
Manifestri clinice:
- herpesul labial
- gingivostomatit (erupie vezicular i ulceroas, adenopatie
cervical, febr)
- kerato-conjunctivit (prezint riscul ulceraiei corneei i
orbirii)
- eczema herpeticum (survine la pacieni cu eczeme cronice,
se manifest ca o dermatit vezicular generalizat)
- panariiu herpetic (la personalul medical, la copii
autoinoculare)
- meningite, menindo-encefalite, consecutiv infeciei pe calea
nervilor trigemen sau olfactiv (letalitate 70%).

12.11.2010

Dup infecie (clinic sau

asimptomatic) virusul se localizeaz
n ganglionul trigemen, determinnd o
infecie latent. Genomul viral persist
sub form de episom. Replicarea ADN
nu are loc, exprimndu-se doar cteva
gene de laten.

Reactivarea infeciei (herpesul recurent)

are loc consecutiv scderii rezistenei
organismului: stress, radiaii, frig, infecii,
perturbri hormonale, etc. Virusul se
propag centrifug pe cale nervoas,
determinnd o infecie local (frecvent la
jonciunea cutaneo-mucoas): herpes
labial, nazal, keratita herpetic (buchet de
vezicule, se acoper cu cruste n cteva
zile, vindecarea survine n 10 zile).

12.11.2010

Infecia cu HSV -2

Manifestri clinice:
herpesul genital (leziuni veziculo-ulcerative ale penisului,
vulvei, vaginului, colului uterin, perineului, feselor, proctita
herpetic.
Dup infecia primar virusul rmne latent n ganglionii lombari
i sacrali, determinnd recurene, cu aceeai localizare, care
sunt mai puin severe.
herpesul neonatal. Contractat de nou-nscut la natere sau
de la personalul medical cu herpes oral sau panariiu herpetic.
Se manifest prin septicemie sau conjunctivit. Netratat
progreseaz cu diseminare visceral i deces (65%). Infecia
poate fi asimptomatic.
infecie congenital. Transmiterea transplacentar determin
malformaii congenitale, vicii.
cancer de col uterin i vulvar

Determin preponderent infecii genitale.

Primo-infecia are loc la persoane de 1525 ani (primele contacte sexuale) sau la
nou-nscui (herpes congenital, neonatal).
75% cazuri primo-infecia este inaparent.

La gazde imunocompromise infecia cu HSV

evolueaz grav, cu diseminare masiv i
afectarea organelor interne. Recurenele sunt
mai frecvente, cu ulcerare, necroz, extindere.

Rspuns imun: umoral i celular, se instaleaz

dup 1-3 sptmni de la infecie. Ig M apar i n
reactivri i sunt martor de multiplicare viral. Ig
nu sunt protectoare, reactivrile au loc n
prezena Ac. Imunitatea celular joac rolul
principal n controlul infectiei cu HSV.

12.11.2010

Diagnosticul de laborator al infeciei cu

HSV
Prelevate: lichid din vezicule, ulceraii,
cruste, fragmente bioptice sau necroptice.
A. Diagnosticul direct
1. Examenul microscopic
ME
Microscopia optic pe frotiuri colorate cu
hem-eozin se observ celule mari, cu
incluzii intranucleare eozinofile (Cowdry)
2. Detectarea Ag virale: RIF cu Ac
monoclonali

3. Examenul virusologic
Izolarea virusului pe animale sensibile, ou embrionat
de gin sau culturi celulare
Indicarea virusului: manifestri clinice la animal,
apariia veziculelor pe membrana chorio-alantoica a
oului embrionat, ECP specific pe culturile de celule
(celule gigante sincitiale cu incluzii intranucleare)
Identificarea virusului cu ajutorul serurilor imune
specifice (RN, RIF, ELISA)
4. Detectarea genomului viral prin tehnici de biologie
molecular (hibridare in situ, PCR)

B. Diagnosticul indirect
Serodiagnostic. Examinarea serurilor perechi
(precoce i tardiv) cu evidenierea creterii titrului
de Ac de cel puin 4 ori. Reacii utilizate: RFC,
RN, RIFI, ELISA.
Tratamentul specific al infeciei cu HSV
Vidarabin (adenin-arabinosid). Analog nucleozidic
al guaninei. Inhibitor competitiv al ADN
polimerazei virale
Acyclovir, Valacyclovir, Zovirax (acycloguanosid),
Penciclovir, famciclovir. Analogi nucleozidici ai
guaninei. Inhibitori ai ADN polimerazei virale,
manifest activitate numai asupra virusului n
curs de replicare.
Foscarnet (phosphonoformat). Dezechilibreaz
reacia de polimerizare a ADN.

GENUL Varicellovirus
Specia virusul Varicella-Zoster (VZV),
agentul etiologic al varicelei n primoinfecie i al zonei-zoster prin reactivare.
Cultivarea numai pe culturi celulare
(celule primare de origine uman, simian,
din rinichi de iepure, linii celulare)

12.11.2010

Patogeneza infeciei cu VZV

Infecia primar varicela
Sursa de virus omul
Transmiterea aerogen, prin secreii rinofaringiene
sau prin contact cu lichidul vezicular sau obiecte
recent contaminate cu lichid vezicular.
Varicela se manifest n special la copii de 2-6 ani,
evolund epidemic iarna i primvara.
Contagiozitate maxim cu 1-2 zile naintea erupiei
i o sptmn dup ultimul puseu eruptiv.
Perioada de incubaie 14 zile
Dup ptrundere virusul se multiplic local n cile
respiratorii (mai rar conjunctiv) i ganglionii limfatici
locali. Urmeaz faza de viremie primar, cu durata
de 10-11 zile i cu afectarea sistemului reticuloendotelial.

Peste 5 zile urmeaz viremia secundar cu

rspndirea i multiplicarea virusului n tegument,
conjunctiv, tractul respirator (esuturilor de origine
ectodermic). Apare febra i succesiunea unor valuri
de erupie pruriginoas care evolueaz independent
(macul papul vezicule cu lichid clar, apoi cruste)
i ating tot corpul. Dispar fr cicatrice.
Odat cu apariia Ac (2-3 sptmni) simptomele
dispar. Evoluia este benign.
La persoane cu deficiene imunitare leziuni
hemoragice, suprainfecie bacterian, encefalite,
pneumonii, varicela diseminat, letal.
La gravide n primele 20 sptmni de sarcin
varicela poate determina o embriofetopatie

12.11.2010

Reactivarea (Zona-Zoster)
n cursul primoinfeciei, prin nervii senzitivi sau
hematogen, VZV disemineaz spre ganglionii
spinali sau ai nervilor cranieni, unde persist
latent. n caz de reactivare virusul se multiplic i
se deplaseaz pe cale nervoas centrifug spre
sectorul cutanat corespunztor, determinnd
Zona-Zoster. Infecia debuteaz cu neuralgie
sever, hiperestezie i erupie vezicular
localizat unilateral n dermatomul nervului
afectat. Poate fi asociat cu meningit sau
paralizii.
Forme clinice: zoster oftalmic, zoster motor,
encefalomielita.
Erupiile persist pn la apariia rspunsului
imun (umoral, celular).

Tratament acyclovir, valacyclovir, famciclovir.

Tratament simptomatic (analgezice,
antipruriginoase)
Profilaxie vaccin viu atenuat, tulpina Oka (n
special la imunodeprimai).
Pentru prevenirea evoluiei grave la contaci
(nou-nscui, copii pn la 15 ani, gravide
neimunizate, persoane cu imunodeficiene) se
administreaz Ig uman hiperimun specific
sau gammaglobuline de convalesceni de zona.

SUBFAMILIA GAMMAHERPESVIRINAE
GENUL Lymphocryptovirus
Specia virusul Epstein-Barr (EBV)
EBV este agentul cauzal al mononucleozei
infecioase, implicat n etiologia unor tumori:
limfomul Burkitt, carcinomul nasofaringean,
leucoplakia proas a limbii. Este limfo i
epiteliotrop.
Structura antigenic a EBV:
- antigen precoce (early antigen) EA enzime
implicate n replicare
- antigen de membran MA
- antigen nuclear EBNA
- antigen al capsidei virale VCA

Cultivare:
Culturi din limfocite B, provenite din snge
din cordonul ombilical. Infectate cu EBV
sufer transformare prin proliferare
continu - imortalizarea limfocitelor.
Inocularea de celule limfoblastoide la
obolani nou-nscui, hamsteri, oareci
induce tumori secretoare de IgM sau IgG.

12.11.2010

Celulele-int pentru EBV exprim pe suprafaa

membranei celulare moleculele CR2 (CD21)
receptor pentru fracia C3b a complementului, de
care se ataeaz virusul limfocitele B i celulele
epiteliale ale oro- i rinofaringelui.
Infecia celulelor epiteliale este litic, cu moartea
celulei i producere de virus. Celulele infectate
astfel exprim pe membran Ag EA i VCA.
n contrast, EBV induce infecie latent a
limfocitelor B in vivo i transform limfocitele B
normale in vitro cu proliferarea lor continua - linii
limfoblastoide imortalizate. Limfocitele infectate
latent exprim Ag EBNA i MA.

Patogeneza mononucleozei infeciose

Afecteaz n special copiii i adolescenii.
Sursa de infecie omul.
Transmiterea se efectueaz prin intermediul salivei
(boala srutului), obiecte contaminate recent, rareori
transfuzii.
Poarta de intrare orofaringele. EBV afecteaz limf B
direct sau dup traversarea esutului epitelial
amigdalian prin transcitoz. Aceste limfocite B
prolifereaz i produc virus, care infecteaz alte
celule, astfel afectnd toate esuturile limfoide din
organism.
Incubaia 30-50 zile
Semne clinice angin, astenie, febr, adenopatie
generalizat, splenomegalie i hepatit

Complicaii: anemie hemolitic, purpur

trombocitopenic, meningit.
n snge limfocite B atipice, care prezint
Ag EBNA i MA.
Vindecarea survine peste cteva zile sau
sptmni (rspunsul imun).
Reactivarea endogen a EBV conduce la
sindromul de mononucleoz cronic, cu
febr, astenie i producere anormal de Ig.

10

12.11.2010

Imunitate:
umoral prin prezena Ac (IgM antiVCA
sunt markeri de infecie recent, IgG
antiVCA si antiEBNA semnal de infecie
persistent)
imunitatea celular este supresat,
numrul de Ts fiind majorat pentru o
perioad de 8 sptmni. Pe suprafaa
limfocitelor B apar neoantigene (antigene
Paul-Bunnell), ce induc Ac heterofili (Ac
fa de hematii de oaie).

Diagnosticul de laborator
Prelevate: spltur faringian, snge
(limfocite), bioptate (ganglioni limfatici, splin)
Examenul microscopic: pe frotiuri din snge
limfocite B mari, anormale, cu citoplasma
bazofil i nucleu fragmentat
Detectarea Ag EBNA n RIF cu Ac
monoclonali
Examenul virusologic: izolarea virusului pe
cultur de limfocite B i observarea
transformrii maligne cu apariia unei linii
continui

Diagnosticul serologic:
In infecia primar se evideniaz Ac heterofili
(testul Paul-Bunnell)
Teste pentru detectarea Ac specifici fa de Ag
virale pe probe duble de ser:
n infecii primare IgM i Ig G (peste 2 spt)
anti VCA (persist n titru mic toat viaa), n
convalescen anti EBNA
n infecia reactivat i n neoplazii reapar
Ig G anti EA n titru mare i sunt prezeni Ac
antiEBNA

SUBFAMILIA BETAHERPESVIRINAE

GENUL Cytomegalovirus
Specia Virusul cytomegalic (CMV)
Cultivarea numai pe culturi de celule primare
din fibroblaste umane sau culturi de miometru.
Celulele int: macrofagele, celulele endoteliale,
limfocitele T i B, celulele-su din mduva
osoas, celulele epiteliale ale canalelor
glandulare.

11

12.11.2010

Patogeneza infeciei cu CMV

Sursa de infecie omul
Transmiterea:
Prin contact direct cu secrete i excrete ale
bolnavilor (saliv, lacrimi, lapte, urin, secreii ale
colului uterin, vaginale, sperm, mase fecale,
snge)
Congenital (vertical)
Neonatal (n timpul naterii, prin lapte)
Transfuzii de snge sau transplante de organe

Primoinfecia este n general asimptomatic

(80-90%). n caz de viremie este urmat de
persistena latent a virusului n glandele salivare
i limfocite B.
Manifestri clinice:
Infecia congenital
- moarte in utero cu avort
- natere prematur, cu dezvoltarea bolii cu incluzii
citomegalice (microcefalie, hepatosplenomegalie,
purpur trombocitopenic, pneumonie
interstiial, defecte neurologice). Patomorfologic
- celulele infectate devin gigante (citomegalie), cu
incluzii intranucleare specifice n ochi de
bufni.

Infecia postnatal (infectarea n timpul

naterii sau cu laptele matern). Copiii elimin
virusul prin urin i saliv. Decurge inaparent n
majoritatea cazurilor. La prematuri
pneumonie interstiial, sechele neurologice i
retardare psihomotorie.
Infecia primar a copilului sau a
adolescentului. Dup o incubaie de 30 de zile
diseminarea viral se manifest prin febr,
hepatosplenomegalie, adenopatii asociate cu
sindrom mononucleozic (neutropenie,
limfocitoz, bazofilie). Evoluie benign.
Infecia adultului (doar la imunodeprimai,
persoane cu transfuzii sau transplante). Se
aseamn cu mononucleoza infecioas (cu
febr i splenomegalie, dar fr angin, fr
adenit i fr Ac heterofili )

Dup primoinfecie virusul persist latent n

limfocite.
Reactivrile se traduc prin apariia unei
viremii tranzitorii i excreia virusului. La
imunodeprimai pneumonie, hepatit,
infecie generalizat.
Imunitate umoral (Ac neutralizani, fixatori
de complement) i celular prin intermediul
limfocitelor Tc i celulelor NK. CMV are efect
imunosupresor, ducnd la creterea nr
limfocitelor Ts i diminuarea limfocitelor Th.

12

12.11.2010

Diagnosticul de laborator al infeciilor citomegalice

Prelevate: fracia leucocitar a sngelui, urin,
spltur rinofaringean, secreii cervicale, probe
bioptice sau necroptice.
Diagnosticul microscopic. Prezena celulelor mari, cu
incluzii intranucleare n ochi de bufni pe frotiuri
din leucocite, plasm, sediment urinar sau seciuni
tisulare
Detectarea Ag virale cu Ac monoclonali (RIF, ELISA)
Examenul virusologic dificil. Cultivarea pe culturi
de celule este lent (2-8 sptmni). ECP- celule
mari, incluziuni eozinofile intranucleare i bazofile
intracitoplasmatice
Detectarea genomului viral (PCR)
Serodiagnostic. Cercetarea serurilor perechi n RFC,
RHAI, RIFI, ELISA

Infecie congenital izolarea virusului n

primele 2 sptmni de via, depistarea
Ig M.
Infecie recurent: reapariia excreiei
virale la pacieni seropozitivi.
Tratament: gancyclovir, valgancyclovir,
foscarnet, cidofovir
Profilaxie: vaccin viu atenuat sau/i
plasm sau globulin hiperimun se
administreaz gravidelor seronegative,
recipienilor de transplant

HHV 6 ntlnit la aduli n 90%. Agent

implicat n etiologia unei afeciuni
cutanate - exanthum subitum. La
persoane cu imunosupresie pneumonii,
encefalite, retinite, etc.
HHV 7 izolat de la aduli sntoi
(aprox. 75%), care excret virusul prin
saliv. Sediul latenei epiteliul glandelor
salivare, limfocite T CD4. Omologie de
50% cu CMV.
HHV 8 asociat cu sarcomul Kaposi.

13