Universitatea Babe-Bolyai Cluj-Napoca Facultatea de Chimie i Inginerie Chimic Catedra de Chimie-Fizic

PREPARARE I PROPRIETI FIZICO-CHIMICE ALE UNOR COMPOZITE NANOSTRUCTURATE FORMATE DIN COLAGEN, CHITOSAN I DIVERSE PULBERI ANORGANICE BIOACTIVE

TEZ DE DOCTORAT REZUMAT

Conductor tiinific: Prof.Univ.Dr. Maria Tomoaia-Cotiel

Autor: Lcrimioara-Bianca Pop

Cluj-Napoca 2011
1

CUPRINS
INTRODUCERE

PARTEA I
CAPITOLUL 1 6 1.1 Osul Compozit complex.................................................................................................. 6 1.1.1 Structura i compoziia osului.......................................................................... 7 1.1.1.1 Faza anorganic (mineral) a osului....................................................... 8 1.1.1.2 Faza organic ( matricea organic) a osului........................................... 1.1.1.3 Precursorii fazei minerale....................................................................... 10 11 1.2 Compozite i aplicaiile lor.................................................................................................. 1.2.1 Proprieti ale compozitelor osoase: biocompatibile, osteoconductive, osteoinductive...................................................................................................... 15 1.2.2 Hidroxiapatita i hidroxiapatita modificat......................................................... 18 1.2.3 Nanostructuri ale hidroxiapatitei cu polimeri...................................................... 19 1.2.3.1 Nanostructuri cu polimeri sintetici.......................................................... 19 1.2.3.2 Nanostructuri cu polimeri naturali........................................................... 19 1.2.4 Scafolduri (grefe) pentru ingineria esutului osos............................................... 22 1.2.4.1 Scafolduri pentru defecte de os............................................................... 22 1.2.4.2 Arhitectura scafoldurilor.......................................................................... 24

CAPITOLUL 2 2.1 Metode de preparare a fazei anorganice (pulberi anorganice bioactive)............................ 2.2 Baza teoretic a formrii fazei noi n procesul de obinere al nanoparticulelor................. 2.2.1 Nucleaia i creterea nucleelor............................................................................... 2.2.2 Cinetica nucleaiei primare...................................................................................... 2.2.2.1 Factorii care influeneaz nucleaia............................................................. 2.2.2.2 Cinetica creterii nucleului. Viteza de nucleaie......................................... 2.3 Transformrile chimice i de faz din structura fosfailor de calciu.................................. 2.4 Concluzii............................................................................................................................. 25 26 26 26 28 31 32 33

PARTEA a II-a
CONTRIBUII ORIGINALE
CAPITOLUL 3

PULBERE ANORGANIC BIOACTIV (PAB) 35 38 39 41 42 42 42 44 45 45 45 46 47 52 55 57 59 64 70 72 74 77

3.1 Prepararea pulberii anorganice bioactive.......................................................................... 3.1.1 Hidroxiapatit............................................................................................................ 3.1.2 Hidroxiapatit modificat cu siliciu.......................................................................... 3.1.3 Hidroxiapatit modificat cu magneziu..................................................................... 3.1.4 Hidroxiapatit modificat cu magneziu i siliciu..................................................... 3.1.5 Hidroxiapatit complex, modificat cu magneziu, siliciu i zinc 3.1.6 Hidroxiapatita complex, dopat cu argint ............................................................... 3.1.6.1 Prepararea argintului coloidal....................................................................... 3.1.6.2 Prepararea hidroxiapatitei complexe dopat cu argint................................. 3.1.7 Hidroxiapatita complex, dopat cu aur.................................................................... 3.1.7.1 Prepararea aurului coloidal........................................................................... 3.1.7.2 Prepararea hidroxiapatitei complexe dopat cu aur...................................... 3.2 Caracterizare i proprieti fizico-chimice ale pulberilor anorganice bioactive................ 3.2.1 Spectroscopie XPS.................................................................................................... 3.2.2 Spectroscopie FTIR................................................................................................... 3.2.3 Difractometrie de raze X........................................................................................... 3.2.4 Analiza granulometric.............................................................................................. 3.2.5 Analiza BET.............................................................................................................. 3.2.6 Analiza termic, TG, DTG, DTA, DSC.................................................................... 3.2.7 Imagistic TEM......................................................................................................... 3.2.8 Imagistic SEM......................................................................................................... 3.2.9 Imagistic AFM......................................................................................................... 3.3 Concluzii.............................................................................................................................

CAPITOLUL 4

PREPARAREA COMPOZITELOR NANOSTRUCTURATE

4.1 Compozite formate din PAB i colagen............................................................................ 4.1.1 Mineralizarea colagenului......................................................................................... 4.1.2 Prepararea compozitelor formate din PAB i colagen n mediu acid....................... 4.1.3 Prepararea compozitelor formate din PAB i colagen n mediu bazic..................... 4.1.4 Prepararea compozitelor formate din PAB i colagen reticulat cu GA n mediu acid........................................................................................................... 4.1.5 Prepararea compozitelor formate din PAB i colagen reticulat cu GA n mediu bazic........................................................................................................... 4.2 Compozite formate din PAB i chitosan........................................................................... 4.2.1 Prepararea compozitelor formate din PAB i chitosan n mediu acid...................... 4.3 Prepararea compozitelor formate din PAB, chitosan i colagen....................................... 4.3.1 Prepararea compozitelor formate din PAB, chitosan i colagen n mediu acid................................................................................................ 4.4 Caracterizare i proprieti fizico-chimice......................................................................... 4.4.1 Spectroscopie FTIR................................................................................................... 4.4.2 Difractometrie de raze X........................................................................................... 4.5 Caracterizarea structural i morfologic........................................................................... 4.5.1 Caracterizarea prin imagistic TEM.......................................................................... 4.5.2 Caracterizarea prin imagistic SEM.......................................................................... 4.5.3 Caracterizarea prin imagistic AFM.......................................................................... 4.6 Prepararea filmelor compozite............................................................................................ 4.6.1 Caracterizarea prin imagistic TEM.......................................................................... 4.6.2 Evaluarea proprietilor mecanice ale filmelor compozite........................................ 4.7 Determinarea proprietilor mecanice ale compozitelor................................................... 4.7.1 Rezistena la compresie............................................................................................. 4.7.2 Caracterizarea prin spectroscopie FTIR.................................................................... 4.8 Prepararea scafoldurilor din materiale compozite............................................................. 4.9 Caracterizarea scafoldurilor............................................................................................... 4.9.1. Imagistic AFM...................................................................................................... 4.9.2 Imagistic SEM...................................................................................................... 4.10 Concluzii...........................................................................................................................

80 80 81 82 82 83 83 83 84 85 86 86 88 89 89 91 95 100 102 104 106 106 108 109 110 110 113 114

CAPITOLUL 5

BIOCOMPATIBILITATEA COMPOZITELOR NANOSTRUCTURATE IN VITRO

5.1 Culturi de osteoblaste........................................................................................................ 5.1.1 Metodologia recoltrii i izolrii osteoblastelor din fragmente osoase........................................................................................... 5.1.2 Recoltarea, izolarea i obinerea culturii primare de osteoblaste................................................................................................. 5.1.2.1 Protocolul de cultivare al osteoblastelor........................................................ 5.1.2.2 Protocolul de ngheare al osteoblastelor....................................................... 5.1.2.3 Protocolul de dezgheare al osteoblastelor.................................................... 5.1.2.4 Protocolul de cultivare al osteoblastelor pe scafolduri.................................. 5.2 Biocompatibilitatea scafoldurilor n culturi celulare......................................................... 5.2.1 Investigarea scafoldurilor prin microscopie optic................................................... 5.2.1.1 Evaluarea viabilitii celulelor prin analiza MTT............................................ 5.2.1.2 Evaluarea fenomenului de adeziune i proliferare celular prin metode de analiz morfometric....................................................................................... 5.2.1.3 Evidenierea imunocitochimic a moleculelor implicate n adeziunea celular............................................................................................................. 5.2.2 Investigarea scafoldurilor prin imagistic SEM........................................................ 5.2.3 Investigarea scafoldurilor prin imagistic AFM........................................................ 5.3 Vizualizarea osteoblastelor prin imagistic TEM............................................................ 5.4 Analiza SEM i EDX a celulei osteoblaste i a constractelor celular............................. 5.5 Analiza SEM i EDX a osului natural............................................................................... 5.6 Analiza SEM i EDX a osului natural la interfaa cu proteza........................................... 5.7 Concluzii...........................................................................................................................

116 117 118 120 120 120 121 122 122 130 132 134 141 148 149 152 153 154 155

CAPITOLUL 6 6 Concluzii generale.............................................................................................................. CAPITOLUL 7 7 Bibliografie......................................................................................................................... CAPITOLUL 8 DISEMINAREA REZULTATELOR TIINIFICE 8.1 Lucrri tiinifice publicate................................................................................................. 188 8.2 Participri la congrese i conferine naionale i internaionale......................................... 189 8.3 Brevet de invenie............................................................................................................... 190 160 157

INTRODUCERE

Progresul n domeniul tiinei i tehnologiei materialelor compozite a modificat n mod semnificativ opiunile medicilor n rezolvarea problemelor de implanturi [1]. Materiale compozite reunesc ntr-un singur produs unele componente care, de obicei, nu se asociaz n mod natural. Compozitele trebuie s ndeplineasc dou criterii importante i anume biocompatibilitatea i biofuncionalitatea. Potrivit unui raport publicat n 1995 de ctre Institutul de Materiale din Londra, se estimeaz c pe piaa mondial se aloc pentru materialele compozite n jur de 12 miliarde dolari pe an [2]. Cheltuielile sunt justificate ntruct compozitele prezint o mare importan pentru viaa uman ele fiind vitale n multe cazuri. De exemplu, esutul dur al corpului uman (sistemul osos) este esenial i d forma corpului. Cele mai frecvente probleme cu care se confrunt esuturile tari sunt fracturile osoase. Cercetarea i dezvoltarea de noi materiale compozite rezolv anumite probleme referitoare la reconstruciile osoase i la obinerea osului artificial. Amploarea pe care a luat-o chirurgia ortopedic reconstructiv presupune dezvoltarea unor materiale care trebuie s ndeplineasc o mulime de caracteristici dintre care cele mai importante sunt: - biocompatibilitatea cu esutul osos natural uman; - osteointegrarea ct mai rapid i fr efecte secundare (necroze, umflturi); - s acioneze dup implantare ca matrie pentru creterea i diferenierea tisular; - s se resoarb prin procese de biodegradare i remodelare osoas. Aceste materiale trebuie s corespund ca structur i compoziie cu esutul osos natural. Osul este format din 69% fosfat de calciu (n principal hidroxiapatit), 21% colagen, 9% ap i 1% alte componente i are o microstructur ierarhic complex. Cercetrile originale din teza de doctorat sunt dedicate cercetrii i dezvoltrii de noi materiale compozite nanostructurate compuse n principal din pulberi anorganice bioactive bazate pe hidroxiapatit i un polimer natural, colagenul i/sau chitosanul. Hidroxiapatita are unele proprieti foarte bune cum ar fi bioactivitatea, biocompatibilitatea, netoxicitatea i osteoconductivitatea ns duritatea ei este sczut. Colagenul (COL), proteina cea mai abundent din corp, este un material biocompatibil, biodegradabil i osteoinductiv [3,4]. Chitosanul (CHI) este un polimer natural cu proprieti remarcabile, cum ar fi biocompatibilitatea i bioresorbabilitatea. Este netoxic i uor solubil n acizi organici slabi. Prezenta tez de doctorat a avut ca obiective principale dezvoltarea unor tehnologii inovative de realizare a unor astfel de materiale compozite. Cercetrile pentru mbuntirea caracteristicilor funcionale pe care trebuie s le ndeplineasc aceste materiale compozite au fost axate pe dou direcii principale, i anume: - mbuntirea compoziiei materialelor cu elemente care se regsesc n osul natural: siliciul, magneziul i zincul care pe lng rolul pozitiv pe care l au n dezvoltarea i proliferarea celulelor osoase asigur i o morfologie i structur poroas propice dezvoltrii celulelor osoase (osteoblastelor) 7

- obinerea la scar nano a pulberii anorganice bioactive. n plus, hidroxiapatita utilizat n scopuri ortopedice pentru reconstrucii osoase trebuie s aib un nalt grad de cristalinitate. Acesta asigur o osteointregrare lipsit de fenomene secundare, cauzate de reactivitatea ridicat a materialelor cu grad sczut de cristalinitate. Cristalinitatea se poate monitoriza n timpul tratamentului termic i astfel am studiat influena temperaturii de calcinare asupra gradului de cristalinitate a hidroxiapatitei n intervalul de temperatur de la 4000C - 1150C. Rezultatele cele mai bune le-am obinut n cazul hidroxiapatitei calcinat n intervalul de temperatur 6500C - 800C, cu palier de 6h. n cadrul cercetrii, am preparat prin precipitare peste 20 de sorturi de nano hidroxiapatit (HAP) pur, HAP parial substituit cu ioni ce se regsesc n compoziia osului natutral, i HAP dopat cu nanoparticule de aur sau argint. Diferitele sorturi de HAP au fost testate n culturi de celule osoase (osteoblaste) i am pus n eviden rolul pe care l are suprafaa specific i porozitatea compozitelor asupra culturilor de osteoblaste. Principalii parametri de lucru studiai n procesul de precipitare au fost: - concentraia soluiilor reactanilor; temperatura din timpul precipitrii reactanilor; timpul i temperatura de maturare ale precipitatului; uscarea n condiii supercritice ( liofilizarea). Caracterizarea fizico-chimic a pulberilor de HAP i a nanobiostructurilor acestora cu chitosan i colagen s-a fcut prin metode de spectroscopie FTIR i XPS, difractometrie de raze X (XRD) i analize de suprafa specific i porozitat e prin metoda BET. Stabilitatea pulberilor s-a demonstrat prin analize termogravimetrice TG, DTG, DTA i DSC iar pentru determinarea structural i morfologic a materialelor compozite am folosit tehnici de imagistic SEM, TEM i AFM. Teza de doctorat este structurat n 8 capitole. n capitolele 1 i 2 sunt abordate, pe baza cercetrii bibliografice, principalele aspecte teoretice referitoare la structura i compoziia osului natural, la nanostructura fazei anorganice pe baz de HAP precum i baza teoretica n procesul de formare a fazei anorganice la scar nano (capitolul 2). Capitolul 3 cuprinde contribuiile originale referitoare la prepararea hidroxiapatitei nesubstituite i a celei substituite cu diferii ioni SiO44-, Mg2+, Zn2+, sau dopate cu nanoparticele de aur sau argint i caracterizarea fizico-chimic a materialelor sintetizate prin metode de spectroscopie FTIR i XPS, difractometrie de raze X i analize de suprafa specific i porozitate prin metoda BET. Capitolul 4 conine date referitoare la prepararea materialelor compozite formate din HAP i polimeri naturali, colagen i chitosan i caracterizarea fizico -chimic a acestora. 8

n capitolul 5 sunt prezentate rezultatele privind biocompatibilitatea nanostructurilor preparate sub form de scafolduri n culturi celulare de osteoblaste. Se evideniaz totodat proliferarea i adeziunea celular pe scafoldurile fibroase formate din HAP/CHI/COL, precum i producerea eficient de colagen a osteoblastelor cu formarea de os nou. Capitolele 6, 7 i 8 sunt destinate concluziilor generale, bibliografiei i diseminrii rezultatelor tiinifice.

CUVINTE CHEIE Hidroxiapatit Colagen Chitosan Compozite Celule ostoblaste

CAPITOLUL 3 - CONTRIBUII ORIGINALE

PULBERE ANORGANIC BIOACTIV (PAB)

3.1 Prepararea pulberii anorganice bioactive Hidroxiapatita dei prezint o biocompatibilitate ridicat, poate fi substanial mbuntit prin modificarea compoziiei chimice i a structurii morfologice. Aceste modificri sunt favorizate de capacitatea hidroxiapatitei de a accepta cu uurin n structura sa numeroi ioni substitueni att pentru ionii de Ca2+ ct i pentru cei de PO43- odat cu compoziia chimic modificndu-se i structura morfologic [223-226]. Analizele chimice i structurale au artat c partea anorganic a osului nu corespunde formulei stoechiometrice a hidroxiapatitei. Practic partea anorganic aflat n esuturile osoase reprezint un amestec de compui anorganici pe baz de hidroxiapatit n care ionii de Ca2+ i PO43- sunt parial substituii cu diferii ali ioni (anioni i cationi). Ionii substitueni trebuie s fie la rndul lor biocompatibili cu organismul astfel nct resorbia lor s nu provoace reacii nedorite i fenomene de respingere. Mai mult, prezena unor ioni strini n structura hidroxiapatitei confer acesteia o abilitate sporit la stimularea i creterea esutului osos. Pe lng condiiile amintite pe care trebuie s le ndeplineasc ionii substitueni, acetia trebuie s prezinte n plus i o bun biocompatibilitate cu o serie de polimeri naturali (chitosanul, colagenul) sau sintetici (acidul poliacrilic, polimetacrilatul de metil, etc.) [229]. Dei prezena ionilor substitueni n structura hidroxiapatitei este n proporie mic, ei confer acesteia proprieti biologice i fizice specifice, astfel c rolul lor este important i determinant n chimia osului. Din cele prezentate rezult c prezena ionilor substitueni n structura hidroxiapatitei este obligatorie pentru ca biocompozitele n compoziia crora aceasta intr s aib biostructura i biochimia osului natural. Totodat, prin intermediul lor se asigur o vitez mai mare de regenerare a esutului osos i parametri fizico -chimici ct mai apropiai comparativ de cei din osul natural. Cei mai importani ioni substitueni ai hidroxiapatitei din materialele cu aplicaii biomedicale sunt cei de Mg2+ i de Zn2+ pentru ionii de Ca2+ precum i cei de CO32- i SiO44- pentru ionii de PO43-. n ceea ce privete ionii de Mg2+, acetia joac un rol important prin natura transformrilor pe care le produc n matricea osoas. Lipsa magneziului n os afecteaz n mod negativ procesele fiziologice din metabolismul osos ducnd astfel la o fragilitate ridicat a oaselor [234-236] . Hidroxiapatita sintetic substituit cu magneziu fiind mai solubil dect hidroxiapatita pur, face ca resorbia ei n organism s fie mult mai rapid, accelerndu-se astfel procesul de regenerare a osului natural. Exist nsa o limit al raportului n care magneziul poate fi ncorporat, ntruct un raport molar Mg2+/ Ca2+ mai mare dect 0,3 determin formarea fosfatului tricalcic i a celui de magneziu Mg3(PO4)2 n defavoarea magneziu - hidroxiapatitei (MgHAP). Alturi de magneziu, un alt element esenial cu efect stimulator asupra formrii esutului osos 10

este zincul care se regsete n os n proporie de 0,012% - 0,0225 %. Prezena zincului contribuie pe de alt parte i la creterea coninutului de protein osoas (colagen) pentru c intensific activitatea fosfatazei alcaline i inhib procesul de resorbie a prii amorfe din hidroxiapatit evitndu-se astfel inflamaiile locale de la nivelul oaselor [234]. Mai mult, prezena ionilor de Zn2+ n soluii n timpul precipitrii inhib procesul de cretere al particulelor de HAP ceea ce faciliteaz obinerea de biocompozite la scar nano [236]. Siliciul prezent n hidroxiapatit sub forma ionilor de SiO44- joac un rol esenial n procesele biologice determinnd structura chimic a osului. Substituirea ionilor de PO43- din hidroxiapatit cu ionii de SiO44- crete activitatea celulelor ostoblaste n raport cu hidroxiapatita pur. Aceast cretere a activitii osteoblastelor conduce la o remodelare mai rapid a esutului osos, reducndu-se astfel timpul de regenerare al acestuia. Prezena siliciului n hidroxiapatit intensific i alte fenomene biologice cum sunt adeziunea celular i dezvoltarea mai rapid a matricei organice (a colagenului) din esutul osos [225]. Cu toate c exist mai multe procedee de sintez a hidroxiapatitei, nc nu s-a reuit fabricarea unui produs care s ndeplineasc la un nivel satisfctor toate condiiile de calitate care se impun bio compozitelor utilizate n implanturi i reconstrucii osoase: scara nano a particulelor, cristalinitate ridicat, bun biocompatibilitate cu esutul osos natural i vitez mare de resorbie . Procedeele existente de fabricare nu elimin apariia fazelor secundare formate din i fosfat tricalcic Ca3(PO4)2 i a silicocarnotitului (Ca10(PO4)4(SiO4)2), faze ce afecteaz negativ proprietile biologice [228, 231]. Gradul de cristalinitate pe care trebuie s-l ating structura hidroxiapatitei se realizeaz practic prin calcinarea la temperaturi cuprinse ntre 600C i 1300 C, condiii n care are loc sinterizarea materialului, fenomen nedorit, deoarece conduce la creterea dimensiunii particulelor, chiar dac acestea au fost obinute n prima etap la scar nano. n timpul tratamentelor termice aplicate, datorit fenomenului de sinterizare, particulele trec din domeniul nano n cel micro. Este cunoscut faptul c particulele la scar nano i cristalinitatea ridicat a acestora influeneaz n mod pozitiv creterea i dezvoltarea celulelor osoase (osteoblastelor) prin intermediul crora se reface esutul osos natural. Cercetrile proprii efectuate au avut ca obiectiv prepararea unei bioceramici pe baz de HAP cu o bun biocompatibilitate i bioactivitate, cu vitez mare de resorbie i fr efecte secundare. Aa dup cum am artat, diferii autori au evideniat n lucrrile lor efectul pozitiv pe care l au o serie de ioni substitueni Mg2+, Zn2+, CO32- i SiO44- introdui n structura ceramicilor. ns, n literatura de specialitate nu sunt semnalate compoziii ale ceramicilor pe baz de HAP cu structur complex, n care s fie introdui simultan toi aceti ioni n structura HAP. Principalele ci de sintez ale hidroxiapatitei sunt: metoda sol-gel, aerogel, reacia n faz solid, metoda hidrotermal i precipitarea [19]. Dintre acestea, metoda precipitrii pare a fi de cea mai mare perspectiv, ntruct utilizeaz reactivi ieftini, uor accesibili: o sare solubil de calciu (azotat sau acetat) Ca(NO3)2H2O sau Ca(CH3COO)2yH2O; un fosfat solubil de sodiu, potasiu, de preferin amoniu ( NH4)2 HPO4 i soluie de amoniac pentru corectarea pH-lui n limitele dorite. Metoda de preparare prin precipitare necesit instalaii simple, flux tehnologic 11

uor de controlat ceea ce permite obinerea de materiale cu proprieti superioare i uor reproductibile. Pentru realizarea sintezelor am folosit o instalaie proprie de preparare a hidroxiapatitei prezentat n figura 3.1. Materiile prime folosite sunt prezentate n tabelul 3.1

Figura 3.1 Instalaia de preparare a hidroxiapatitei Tabel 3.1 Materiile prime folosite n prepararea pulberilor de hidroxiapatit i a bio compozitelor: Compusul chimic Azotat de calciu Fosfat acid diamoniacal Amoniac Nonilfenol Acid acetic glacial Azotat de magneziu Ortosilicat de tetraetil (TEOS ) Alcool etilic absolut Azotat de zinc Azotat de argint Acid tetracloroauric (III) 99.5% Colagen tip I (bovin-tendonul lui Achile) Chitosan (masa moleculara medie) Glutaraldehida (GA) 25% n H2O Silicat de sodiu Formula chimic Ca(NO3 )2 4H2O (NH4 )2 HPO4 NH3 C15H24O CH3COOH Mg(NO3)26H2O SiC8H20O CH3-CH2OH Zn(NO3)2 AgNO3 HAuCl4 4H2O Productorul

Merck Germany

CH 2 (CH 2 CHO) 2 Na2SiO3 12

Sigma- Aldrich USA Preparat n laborator

3.1.1 Hidroxiapatita Pulberea de nanohidroxiapatit a fost preparat prin metoda precipitrii. S-a preparat o soluie A cu concentraia 0,15 M, obinut prin dizolvarea azotatului de calciu n ap deionizat. Acesteia i s-a adugat 0,5 ppm nonilfenol n calitate de surfactant. pH-ul soluiei A a fost de 6,3. Soluia B cu concentraia 0,09 M s-a obinut prin dizolvarea fosfatului diamoniacal n ap deionizat i adugarea a 0,5 ppm nonilfenol ca surfactant. pH-ul soluiei B a fost ajustat n intervalul 9,5-12 prin adugarea solu iei de amoniac 25%. Soluia A s-a adugat rapid (2-3 secunde) peste soluia B sub agitare intens (800 rot/min). Temperatura celor dou soluii n timpul precipitrii a fost de 60C. Dup precipitare, suspensia obinut a fost supus unui tratament hidrotermal ( maturare) timp de 24 de ore la temperatura de 70C. Precipitatul obinut a fost filtrat, splat cu ap deionizat i uscat n condiii supercritice (liofilizare) temperatura de -80C i presiunea de 5x10-3 torri. Pentru aceasta s-a folosit un liofilizator de tip ALPHA 1-2 LDplus, CHRIST. Pulberea obinut a fost supus tratamentului termic ntr-un interval de temperatur de 400C - 850C cu palier de 6 ore. Aglomerarea particulelor s-a evitat n timpul precipitrii prin adaugarea surfactantului (nonilfenol) i uscarea n condiii supercritice a pulberii. Mrimea final a nanoparticulelor poate fi determinat de raportul dintre viteza celor dou procese elementare: nucleaia i creterea cristalelor care sunt controlate prin nivelul suprasaturaiei i adaosului de substane tensioactive care se adsorb la suprafaa particulelor. Creterea controlat a cristalelor i evitarea aglomerrii particulelor s-a realizat prin adaosul de substane superficial active (nonilfenol, amidon, glucoz, lactoza i proteinele din zerul de lapte) folosite ca surfactani n alte sinteze care nu sunt prezentate n aceast lucrare. n final neam oprit la nonilfenol ca surfactant folosit n continuare. Cercetrile ntreprinse au fost orientate n direcia stabilirii modului n care cele dou procese importante sunt influenate de prezena i natura surfactanilor adugai [246]. Astfel am elaborat un procedeu de preparare al nanoparticulelor de fosfai de calciu (HAP), a crui schem este prezentat n figura 3.3.

13

Figura 3.3 Schema de preparare i caracterizarea hidroxiapatitei prin procesul de precipitare.

3.1.2 Hidroxiapatit modificat cu siliciu Hidroxiapatita poate fi multisubstituit cu specii de ioni compatibili, ce pot fi folosii pentru prepararea osului artificial i n reconstrucia esuturilor osoase. Ionilor substitueni prezeni ntr-o cantitate mic n hidroxiapatit le pot fi atribuite anumite proprieti biologice i fizice specifice i joac un rol important n biochimia osului i a din ilor. Siliciul este unul dintre elementele eseniale prezente n procesele biologice. Importana acestuia n formarea osului a fost dovedit tiinific. Substituirea ionilor de fosfat cu ionii de silicat n structura hidroxiapatitei crete activitatea celulelor osoase n raport cu hidroxiapatita fiziologic. Rezult astfel o remodelare rapid a esutului osos ce a fost observat la suprafa a implanturilor de hidroxiapatit substituit cu ioni de silicat (Si-HAP). Procentul de siliciu prezent n hidroxiapatita biologic 14

variaz ntre limitele 0,2% i 0,8% [226]. Prezena siliciului n HAP favorizeaz adeziunea celular i dezvoltarea prii organice din os, a colagenului. Procentul molar al ionilor de silicat n raport cu ionii de fosfst din hidroxiapatit este de preferat a fi cuprins ntre 0,1% pn la 2,5%. Literatura de specialitate indic faptul c o proprietate determinant a biocompozitelor este, alturi de cristalinitate, porozitatea i suprafaa specific [225]. Hidroxiapatite cu porozitate i suprafa specific controlate se pot obine dac n structura acestora se introduc ioni de SiO44sub diferite forme de exemplu sub form de TEOS sau Na2SiO3. Aceti ioni prin procesul de policondensare creaz grupri siloxan Si-O-Si- i silanol Si-OH (figura 3.4) care depind de raportul HAP : SiO2, temperatur, condiii hidrodinamice i viteza de adugare a componenilor reactani.

Figura 3.4 Structuri macromoleculare i tridimensionale ale SiO2 hidratat. n acest scop, n sintezele ce urmeaz a fi prezentate, parametrul modificat n structura HAP a fost concentraia final a SiO2 n structura hidroxiapatitei. Pe lng faptul c prin policondensare, SiO2 creaz o structur poroas, adsorbia sa la suprafaa particulelor de fosfai de calciu mpiedic creterea cristalitelor, avnd astfel i rol de inhibitor al creterii acestora [225, 226]. Din acest punct de vedere, siliciul se comport ca o impuritate adsorbit pe suprafat, adsorbia lui blocnd creterea cristalitelor. Un alt parametru care joac un rol esenial n procesul de cristalizare este temperatura. Procesul de cristalizare este un proces deosebit de complex fiind rezultatul rapo rtului n care se gsesc cele dou procese elementare: nucleaia (formarea germenilor) i procesul de cretere a germenilor. Ambele procese elementare sunt puternic influenate de temperatur. Pentru controlul mrimii finale a particulelor, n toate sintezele, procesul de precipitare a fost condus la temperatura de 60C. La aceast temperatur crete n mod semnificativ i viteza de transformare a -witchlonit-ului (compusul care se formeaz n prima faz a precipitrii) n structura hidroxiapatitei. Blocarea fenomenului de aglomerare i de cretere a particulelor de hidroxiapatit s-a realizat i prin adugare de surfactant, nonilfenol, care odat adsorbit la suprafaa particulelor mpiedic creterea lor. Pulberea de nanohidroxiapatit substituit cu 1%, 5% i 10% siliciu (SiO2) a fost preparat prin metoda precipitrii n mod asemntor ca i sinteza hidroxiapatitei pure cu diferena c 15

aportul de SiO2 s-a fcut prin adugarea silicatului de sodiu soluie 5% (n raportul Na2O : SiO2 = 1:3,2) n soluia de fosfat diamoniacal. n figura 3.5 este prezentat funcionalizarea nanoparticulei de HAP cu SiO2.

Figura 3.5 Funcionalizarea nanoparticulei de HAP cu SiO2. 3.1.3 Hidroxiapatit modificat cu magneziu Prezena ionilor substitueni n structura hidroxiapatitei este esenial pentru ca biocompozitele n compoziia crora acetia intr s conduc la o biostructur i biochimie asemntoare cu cea osului natural. Totodat, prin intermediul lor se asigur o vitez mai mare de regenerare a esutului osos. Cei mai importani ioni substitueni sunt cei de Mg2+, Zn2+, CO32i SiO44- [247]. n acest scop, am preparat diferite sorturi de hidroxiapatit cu structur complex, substituit cu magneziu, siliciu i zinc ce sunt redate n tabelul 3.3. Prepararea acestui sort de hidroxiapatit cu structur complex s-a realizat n mod similar ca i sinteza hidroxiapatitei pure, cu deosebirea c ionii de Mg2+ se introduc n soluia cu ionii de Ca2+. Tabel 3.3 Compoziia chimic a probelor de hidroxiapatit complex.

Nr. crt. 1 2 3 4 5 6 7 8

Compoziia hidroxiapatitei complexe (%) HAP_0,2%Mg HAP_1%SiO2 HAP_0,4%SiO2_0,2%Mg HAP_0,2%SiO2_1,5%Mg HAP_1%SiO2_1,5%Mg HAP_0,2%SiO2_0,6%Mg_0,2%Zn HAP_0,2%Mg_0,6%Si_0,2%Zn + 0,14% Ag HAP_0,2%Mg_0,6%Si_0,2%Zn+0,3% Au

Temperatura de calcinare C 450, 650, 850 450, 650, 850 450, 650, 850 450, 650, 850 450, 650, 850 450, 650, 850 450, 650, 850 450, 650, 850

16

3.1.4 Hidroxiapatit modificat cu magneziu i siliciu Prepararea acestor probe cu structur complex s-a realizat n mod similar ca i sinteza hidroxiapatitei pure, cu deosebirea c ionii de Mg2+ se introduc n soluia cu ionii de Ca2+ iar ionii de SiO44- se introduc sub forma de TEOS n soluia cu ionii de fosfat dup ce pH-ul acesteia s-a ajustat n intervalul 11,5-12 cu soluie de amoniac 25%, cu cteva minute nainte ca cele dou soluii s fie amestecate. Pentru evitarea reaciei de precipitare a SiO2 cnd acesta se introduce sub form de TEOS, se face diluarea n prealabil a TEOS-ului n soluie de 5% alcool etilic, apoi se dilueaz soluia la 0,5 % cu ap ultrapur. Concentraia substituenilor n structura HAP a fost de 0,2%SiO2, 0,6%Mg i 0,2%Zn. 3.1.5 Hidroxiapatit modificat cu magneziu, siliciu i zinc Prepararea acestor probe cu structur complex s-a realizat n mod similar ca i sinteza hidroxiapatitei pure, cu deosebirea c ionii de Mg2+ mpreun cu ionii de Zn2+ se introduc n soluia cu ionii de Ca2+ iar ionii de SiO44- se introduc sub forma de TEOS n soluia cu ionii de fosfat dup ce pH-ul acesteia s-a ajustat n intervalul 11,5-12 cu soluie de amoniac 25%, cu cteva minute nainte ca cele dou soluii s fie amestecate. Pentru evitarea reaciei de precipitare a SiO2 cnd acesta se introduce sub form de TEOS, se face diluarea n prealabil a TEOS-ului n soluie de 5% alcool etilic, apoi se dilueaz soluia la 0,5 % cu ap ultrapur. Concentraia substituenilor n structura HAP a fost de 0,2%SiO2, 0,6%Mg i 0,2%Zn.

3.1.6 Hidroxiapatita complex, dopat cu argint Argintul rol i efecte biologice Unul dintre cele mai remarcabile aspecte referitoare la argintul coloidal este faptul c are un spectru extrem de larg de aplicaii i ntrebuinri biomedicale. n timp ce un antibiotic farmaceutic convenional este eficient mpotriva a ase sau apte tipuri de germeni i total ineficient contra virusurilor, genernd cel mai adesea efecte secundare nedorite, argintul este letal pentru mai mult de 650 de tipuri de bacterii, virusuri i fungi, fr ns a fi toxic pentru organismul uman. Spre deosebire de medicamentele de sintez ce reacioneaz chimic cu anumite enzime, aciunea biologic a argintului este de tip catalitic, dezactivnd mecanismele enzimatice de oxigenare celular ale microorganismelor. Prezena sa sufoc viruii, bacteriile i fungii fr a face niciun ru organismelor multicelulare, care au un sistem enzimatic cu totul diferit.Testele de laborator au artat c argintul coloidal (5-10ppm) omoar majoritatea bacteriilor, fungilor i virusurilor n 2-6 minute de la contact. Particulele care genereaz coloizi se situeaz n gama de mrime 0.001 m pn la 100 m. 17

Aciunea ionilor de argint nu se limiteaz numai la bacterii, medicamentele care conin argint pot distruge sute de virui, fungi i protozoare. n ultimul timp nanotehnologiile au relevat capacitatea ionilor de argint de a lupta cu cancerul. Astfel, s-a demonstrat c soluiile de argint coloidal sunt capabile s inhibe aderena i mobilitatea celulelor tumorale [204-210]. S-a constatat c aceste particule cu dimensiuni cuprinse ntre 2 i 10 nm au capacitatea de a adsorbi i distruge bacteriile care afecteaz in situ esuturile umane i mbuntesc mecanismele imune i pe cele de reparaie tisular [211-216]. Experimentele tiinifice au artat c argintul coloidal este eficient i activ n tratarea multor afeciuni importante: infecii microbiene, fungice, parazitare i virale ale pielii, organelor senzoriale, ale tracturilor digestiv, respirator i urinar, boli autoimune i chiar cancer. Procesul de reconstrucie a esuturilor sau de vindecare a plgilor se accelereaz n prezena argintului. n plus, prezena argintului coloidal a permis vindecri ale unor rni grave fr s lase cicatrice sau cu cicatrice mult mai mici dect n mod obinuit. Cicatricele se dezvolt atunci cnd celulele nedifereniate nu exist n numr suficient de mare. Pe baza acestor dovezi se presupune c argintul coloidal ar reduce sau elimina cicatricele interne i ar accelera vindecarea dup operaiile chirurgicale. Rezultate deosebite s-au obinut n refacerea rapid dup fracturi, rupturi musculare sau ligamentare, entorse, luxaii, arsuri, ulceraii cutanate etc. Figura 3.6 Mecanismul de aciune al argintului Biofuncionalitatea i aciunea catalitic a argintului se atribuie faptului c se poate adsorbi pe suprafaa unor proteine implicate n procvesele biologice, mrindu-le astfel reactivitatea (figura 3.6) 3.1.6.2 Prepararea hidroxiapatitei complexe dopat cu argint Prepararea acestui material s-a realizat n mod similar cu sinteza hidroxiapatitei cu structur complex (magneziu, siliciu, zinc). Suspensia de HAP complex obinut se filtreaz, se spal i precipitatul se redisperseaz ntr-o soluie apoas pentru a obine o suspensie foarte diluat de HAP complex. In suspensie se adaug soluie de azotat de argint de concentraie 0.001 M. Suspensiei finale obinute i se adaug borohidrur de sodiu pentru reducerea argintului din sistem. Maturarea suspensiei finale (HAP+Ag) se face pe baie de ap la temperatura de 70C timp de 24h. Dup maturare, suspensia se filtreaz, se spal i se liofilizeaz. Pulberea obinut se calcineaz la temperatura de 650 C cu palier de 6 ore dup care se mojareaz la moara cu bile 18

de aluminiu timp de 4 ore pentru a obine o pulbere omogen cu dimensiuni aflate n domeniul nanometric. S-a obinut o pulbere de culoare alb cu compoziia chimic HAP_0,2%Mg_0,6%Si_0,2%Zn + 0,14% Ag.

3.1.7 Hidroxiapatita complex, dopat cu aur 3.1.7.2 Prepararea hidroxiapatitei complexe dopat cu aur Prepararea acestui material s-a realizat n mod similar cu sinteza hidroxiapatitei cu structur complex (magneziu, siliciu, zinc). Suspensia de hidroxiapatit obinut se filtreaz, se spal i precipitatul se redisperseaz ntr-o soluie apoas astfel nct obinem o suspensie foarte diluat de HAP complex. Acestei suspensii i se adaug soluie de 1% acid tetracloroauric trihidrat diluat n prealabil n soluie apoas astfel nct concentraia s fie n final de 10 -3 M. Se introduce n suspensia obinut borohidrur de sodiu pentru reducerea aurului din sistem. Maturarea suspensiei finale (HAP+Au) se face pe baie de ap la temperatura de 70C timp de 24h. Dup maturare, suspensia se filtreaz, se spal i se liofilizeaz. Pulberea obinut se calcineaz la temperatura de 650C cu palier de 6 ore dup care se mojareaz la moara cu bile de aluminiu timp de 4 ore pentru a obine o pulbere omogen i cu dimensiuni aflate n domeniul nanometric. S-a obinut o pulbere de culoare roz cu compoziia (HAP_0,2%Mg_0,6%Si_0,2%Zn+0,3% Au). Schema de preparare a hidroxiapatitei cu nanoparticule de aur este prezentat n figura 3.7.

Figura 3.7 Schema de preparare a hidroxiapatitei dopat cu nanoparticule de aur.

19

3.2 CARACTERIZARE I PROPRIETI FIZICO-CHIMICE ALE PULBERILOR ANORGANICE BIOACTIVE

n vederea corelrii activitii biologice n culturile de celule osteoblaste cu structura fizicochimic a fazelor minerale, am fcut o caracterizare ce a presupus msurtori de porozitate (BET), difractometrie de raze X, FTIR, XPS, SEM, TEM, AFM i TG, DTA, DSC.

3.2.1 Spectroscopie XPS

Aceast metoad, cunoscut i sub denumirea de spectroscopie electronic pentru analiz chimic (ESCA), este utilizat pentru analiza compoziiei chimice a suprafeelor. Aceasta este o metod de analiz ce permite identificarea tuturor elementelor chimice, n afar de H i He (care nu au nivele electronice interioare). S-au realizat spectre survey (ex. figura 3.9) pentru probele HAP_MgSiZn; HAP_MgSiZn+Ag; HAP_MgSiZn+Au; HAP_MgSiZn+CHI/SiO2+COL/SiO2. Pe baza spectrelor survey s-a ntocmit un tabel (tabelul 3.4) ce conine concentraia relativ a principalelor elemente din probele studiate.

O 1s

Intensity (a.u.)

Na 1s Zn 2p

Ca 2p
C 1s

P 2p

N 1s

(d) (c)

(b) (a)

1200

900

600

300

Binding Energy (eV)

Figura 3.9 Spectre XPS survey ale probelor: (a) HAP_MgSiZn; (b) HAP_MgSiZn+Ag; (c) HAP_MgSiZn+Au; (d) HAP_MgSiZn+CHI/SiO2+COL/SiO2.

20

Tabel 3.4 Concentraia relativ a principalelor elemente determinate din spectrele survey. Compoziia elemental (at %) Proba de hidroxiapatit HAP_0.67%Mg_0.28%Si_ 0.2%Zn HAP_0.67%Mg_0.28%Si_ 0.2%Zn+0.14%Ag HAP_0.67%Mg_0.28%Si_ 0.2%Zn+0.3%Au HAP_0.67%Mg_0.28%Si_ 0.2%Zn+CHI/SiO2+COL/SiO2 Ca O C 1.1 1.2 1.1 P Mg Zn 0.2 0.1 0.2 N Na Si Ag Au 0.1 0.3 -

23.2 53.7 23.1 55.2 23.6 54.3

21.2 0.6 20.1 0.2 20.1 0.4

15.9 41.4 24.1 13.3 0.5

0.1 1.5 1.7 1.5

Spectrele survey prezint fotopicuri corespunztoare elementelor ce intr n compoziia sistemelor. Astfel fotopicuri corespunztoare Ca 2p, O 1s, P 2p, C 1s, Zn 2p au fost identificate pentru toate probele investigate, excepie fcnd fotopicurile N 1s i Na 1s din proba (d) HAP_MgSiZn+CHI/SiO2+COL/SiO2 datorate prezenei colagenului i chitosanului din structura probei. Fotopicul Na 1s este datorat funcionalizrii colagenului i chitosanului cu silicat de sodiu. Conform tabelului se mai poate observa c pentru proba funcionalizat cu COL detecia elementelor de baz din probe a fost mai puin evident datorit stratului de protein fo rmat la suprafaa particulelor. Totodat se poate observa faptul c fotopicul C 1s este n cantitate mult mai ridicat n proba cu COL i CHI tocmai datorit prezenei acestora n sistem. Fotopicul N 1s nregistrat n apropiere de 400 eV este tipic pentru azotul din matricile organice.

21

Figura 3.10 Spectre de nalt rezoluie pentru fotopicurile: (a) Ca 2p; (b) P 2p; (c) O 1s; (d) C 1s; (e) Zn 2p; (f) Mg 2p. Din spectrele XPS de nalt rezoluie (Fig. 3.10) se poate observa o deplasare uoar a semnalului dat de fotoelectronii O 1s, de la energia de legatur 531,6 eV (proba HAP_MgSiZn) la 531,1 eV (proba HAP_MgSiZn +0.14% Ag), respectiv 531,2 eV (probele HAP_MgSiZn + 0,3% Au i HAP_MgSiZn+CHI/SiO2+COL/SiO2) (figura 3.10 c). Scderea energiei de legtur indic o densitate de electroni mult mai mare pe atomii de oxigen dect pe cationii de care se leag n uniti structurale. Spectrele de nalt rezoluie (figura 3.10 a, b i c) pentru fotopicurile Ca 2p, P 2p i O 1s prezint o deplasare uoar a semnalului n proba cu coninut de aur 22

(HAP_MgSiZn + 0.3% Au). Aceast deplasare este datorat densitii mari de electroni la suprafaa nanoparticulelor de aur care prin efectul inductiv determin interaciuni cu Ca2+, P5+ i O2- din structura hidroxiapatitei. 3.2.2 Spectroscopie FTIR Am folosit spectroscopia FTIR pentru a determina picurile caracteristice pentru hidroxiapatit i interaciunile ce au loc ntre compuii existeni n structura acesteia [233]. n figura 3.11 a-h sunt prezentate spectrele FTIR ale probelor de HAP nainte i dup tratament termic la 650C, HAP cu 1%, 5%,10% SiO2, HAP_MgSiZn, HAP_MgSiZn+Au i HAP_MgSiZn+Ag dup tratament termic la 650C.

23

Figura 3.11 a-h. Spectre FTIR ale HAP nainte i dup tratament termic la 650C, HAP cu 1%, 5%, 10% SiO2, HAP_MgSiZn, HAP_MgSiZn+Au i HAP_MgSiZn+Ag dup tratament termic la 650C pentru domeniile spectrale 4000-2500 cm-1 i 1800-400 cm-1. Figura 3.11 a, c i g prezint benzile specifice pentru punile de hidrogen din gruparea OH..O la 3426 cm-1 3438 cm-1 n toate probele de HAP studiate. n zona 3566 cm-1 apar gruprile OH libere de pe suprafaa particulelor pentru toate probele de HAP. Figura 3.11 b indic existena gruprii NO3 - la 1380 cm-1 n probele de HAP netratat termic n care, prezena impuritilor este mai accentuat dect n proba de HAP tratat la 650C. Astfel rezult c aplicarea tratamentului termic duce la scderea impuritilor din prob. La 1463 cm-1 apar benzi specifice pentru CO32- atribuite faptului c fosfaii n general absorb CO2 din aerul atmosferic. Benzile de la 1090 cm-1, 1030 cm-1 i 960 cm-1 corespund vibraiilor PO43-. Spectrul FT-IR pentru figura 3.11 d prezint dou benzi caracteristice: una la 980 cm-1 atribuit vibraiei Si-OH din gruparile de silanol i banda de la 1100 cm-1 care corespunde vibraiei Si-O-Si- din legtura 24

siloxan. Prezena lor se datoreaz introducerii n sistem a ionilor silicat, care intr n structura hidroxiapatitei i formeaz legturi silanolice i siloxanice. 3.2.3 Difractometrie de raze X Prin difractometria de raze X se poate determina gradul de cristalinitate al pulberilor i mrimea cristalitelor din structura particulelor [233]. n figura 3.12 a-c sunt prezentate difractogramele probelor de HAP, HAP_MgSiZn, HAP + 5% SiO2, HAP + 10% SiO2, HAP_MgSiZn+Ag i HAP_MgSiZn+Au. Toate probele au fost calcinate la temperatura de 650C cu palier de 6 ore.

c Figura 3.12 Difractograma probelor HAP i HAP_MgSiZn (a); Difractograma probei HAP_MgSiZn+Ag (b); Difractograma probelor HAP, HAP + 5% SiO2 i HAP + 10% SiO2 (c). 25

Din difractograma figurii 3.12 (a) i (c) se poate observa c nu exist diferene de structur ntre proba de HAP pur i proba de HAP_MgSiZn deci, introducerea de ioni substitueni n sistemul hidroxiapatitei nu produce schimbri n structura acesteia. n mod similar putem spune i despre probele din difractograma figurii 3.12 (b) c ionii de SiO44- introdui n sistemul HAP n diferite proporii nu influeneaz i nu schimb structura acesteia. Picurile corespunztoare ionilor de Mg2+, SiO44- i Zn2+ datorit concentraiei sczute n care acetia au fost introdui n structura hidroxiapatitei nu sunt evideniate n aceste difractograme. 3.2.5 Analiza BET Pentru a evidenia modul n care porozitatea i suprafaa specific influeneaz comportamentul n culturile de celule osteoblaste, am efectuat o analiz B.E.T a probelor, dup ce au fost calcinate n prealabil la temperaturi diferite. Rezultatele pentru probele preparate n diferite condiii de lucru sunt prezentate n tabelul 3.6. Tabel 3.6 Analiza B.E.T a probelor de HAP cu diferite compoziii i concentraii calcinate la diferite intervale de temperatur: TemperaSuprafaa Nr. Porozitatea tura de specific 3 crt Proba de hidroxiapatit (cm /g) calcinare (m2g-1) C 1 HAP standard Aldrich 67.81 0.14 2 HAP 61.22 0.15 44.83 0.05 400 3 HAP 4 HAP 25.11 0.05 650 5 HAP 19.23 0.05 950 69.22 0.15 6 HAP + 1%SiO2 400 7 HAP + 1%SiO2 59.12 0.12 650 8 HAP + 1%SiO2 38.12 0.10 950 HAP + 5%SiO 96.14 0.21 9 400 2 10 HAP + 5%SiO2 76.12 0.21 650 11 HAP + 5%SiO2 50.25 0.06 950 112.78 0.20 12 HAP + 10%SiO2 400 13 HAP + 10% SiO2 92.13 0.13 650 14 HAP + 10% SiO2 77.56 0.08 950 15 HAP_0,28%SiO2_0,67%Mg_0,2%Zn 104.51 0.19 400 16 HAP_0,28%SiO2_0,67%Mg_0,2%Zn 54.18 0.07 650 HAP_0,28%SiO2_0,67%Mg_0,2%Zn+ 17 110.78 0.35 650 0.14%Ag HAP_0,28%SiO2_0,67%Mg_0,2%Zn + 18 131.64 0.46 650 0.3%Au

26

Analiza datelor din tabelul 3.6 arat c att ionii substitueni ct i temperatura de calcinare influeneaz puternic suprafaa specific i porozitatea probelor. Diferenele cele mai mari comparativ cu HAP pur se constat a fi la probele care conin n structur SiO2 . Cu ct coninutul de SiO2 este mai ridicat cu att porozitatea i suprafaa specific sunt mai mari. Temperatura de calcinare influeneaz puternic suprafaa specific, n sensul c aceasta scade odat cu creterea temperaturii. Influena temperaturii se manifest cel mai puternic la probele cu coninut ridicat de SiO2. Comparnd HAP pur cu probele parial substituite cu ioni, se constat diferene ale suprafeei specifice care depesc 100%. Datele tabelului relev faptul c porozitatea i raza medie a porilor sunt i ele puternic influenate de coninutul de SiO2 i mai ales de temperatura de calcinare. Odat cu creterea temperaturii de calcinare, crete raza porilor ntruct la temperaturi ridicate are loc spargerea microporilor din structur.

3.2.6 Analiza termic, TG, DTG, DTA, DSC Unele rezultate obinute sunt prezentate n figura 3.17. Din analizele TG-DTA rezult c, odat cu creterea temperaturii cresc pierderile de mas datorit pierderii apei i descompunerii carbonailor de calciu i magneziu, cu formarea oxizilor corespunztori care confer caracter bazic suspensiilor apoase ale bioceramicilor de hidroxiapatit. Analiza diagramelor din figura 3.17 a-b indic complexitatea i numrul mare de compui i faze care se formeaz. Astfel n intervalul de temperatur 20C-300 C se nregistreaz pentru HAP pur o pierdere total de 7,17 % din care 3,83 % corespund apei legate fizic, n timp ce diferena de 3,34 % reprezint apa din fosfaii de calciu hidratai. n intervalul de temperatur 300C-600C pierderile de mas sunt doar de 0,43 % i sunt atribuite descompunerii unor hidrai mai stabili termic ai fosfatului de calciu. Pierderi semnificative de 3 % se nregistreaz n intervalul de temperatur 600C-820C cu dou maxime pe curba DTG corespunztoare descompunerii carbonatului de magneziu respectiv de calciu la 800C. Curba DTA n intervalul de temperatur 600C-800C prezint dou maxime ce corespund unor procese exoterme. n intervalul de temperatur 810C-1200C pierderile de mas fiind doar de 0,32 % corespund ruperii unor grupri OH de la suprafa cu eliminar de ap. Curba DTA i DSC mai arat si un proces puternic endoterm care se desfoar cu vitez maxim la 1050C cnd are loc un proces de transformare, descompunerea fosfatului tetracalcic Ca4 (PO4)2O: Ca4 (PO4)2O Ca3 (PO4)2 + CaO

27

b Figura 3.17 Termograma probei HAP 650 (a); Termograma probei HAP_MgSiZn 650 (b) (10/min).

28

3.2.7 Imagistic TEM Prin imagistica TEM se pot determina att morfologia particulelor de HAP ct i mrimea acestora. Astfel n figura 3.19 sunt prezentate imagini TEM ale unor pulberi de HAP pur, calcinat la 650oC. n fig. 3.22 sunt prezentate imagini TEM ale nanoparticulelor de argint.

Figura 3.19 Imagini TEM ale particulelor de HAP pur calcinat la 650C; barele din figuri corespund la 500 nm (a) respectiv 200 nm (b).

Figura 3.22 Imagini TEM ale nanoparticulelor de argint preparate. Barele din imagini corespund la 100 nm. Din imaginile TEM ale probei de HAP pur (figura 3.19) se observ particule aciculare mici de 7-15 nm cu diametre de cca 10 nm i lungimi de pn la 100 nm Figura 3.22 prezint imagini TEM ale nanoparticulelor de argint cu dimensiuni de sub 100 nm.

29

3.2.9 Imagistic AFM Pentru exemplificare, imaginile AFM din figura 3.25 caracterizeaz suprafaa hidroxiapatitei nesubstituite, calcinate la 650C.

Figura 3.25 Imagini AFM ale pulberii de HAP calcinate la 650C. Aria scanat 100 nm x 100 nm a) imagine topografic 2D; b) imagine de faz; c) imagine de amplitudine ;d) imagine topografic 3D; e) seciune transversal de-a lungul sgeii n panoul a. Tabel 3.9 Diametre medii ale particulelor, determinate din seciuni transversale ale imaginilor AFM Nr. crt. 1 2 3 4 Proba de hidroxiapatit HAP pur HAP + 10% SiO2 HAP_MgSiZn HAP_MgSiZn + Ag Diametrul mediu al particulelor determinat din cross section (nm) 24 40 80 35

Din analiza datelor din tabelul 3.9 se observ c dimensiunile cele mai mici ale particulelor sunt n cazul HAP nesubstituit (24 nm). Acest lucru este posibil datorit faptului c procesul de cretere al particulelor a fost blocat de surfactantul nonilfenol introdus n sintez care, adsorbindu-se pe suprafa, oprete creterea n continuare a particulelor.

30

PREPARAREA COMPOZITELOR NANOSTRUCTURATE

Cele mai recente progrese n domeniul cercetrii tiinifice biomedicale se refer la materialele compozite (biocompozite) procesate la scar nanometric. n cadrul studiilor ntreprinse n cadrul acestei lucrri, s-a urmrit asamblarea colagenului i a chitosanului cu hidroxiapatit n vederea obinerii unor biocompozite cu o structur i compoziie ct mai apropiate de cea a osului natural. n acest context am preparat o hidroxiapatit parial substituit cu ioni de Mg2+, Zn2+i SiO44- aa cum am artat n capitolul 3 i am asamblat aceste particule pe fibre de colagen i chitosan pentru a obine biocompozite cu structur i compoziie comparabile cu cele ale osului natural [257]. n tabelul 4.1 sunt prezentate sorturile de biocompozite preparate cu hidroxiapatit, chitosan i colagen. Tabelul 4.1 Biocompozitele preparate cu hidroxiapatit, chitosan i colagen. Componente, adaosuri, preparare Cod prob
M 650 = HAP_ 0,28%SiO2_0,67 %Mg_0,2%Zn (%)

COLAGEN (%)

CHITOSAN

(%) 7 5.5 -

GLUTARALDEHIDA (GA)

Mediul de preparare Acid Bazic Acid Acid Acid Bazic

B1 B6 B2 B3 B4 B5

73 73 93 68.5 75 75

27 27 26 24.5 24.5

0.5 0.5

4.4.1 Spectroscopie FTIR Spectrele FTIR ale materialelor COL, CHI, HAP_MgSiZn, HAP_MgSiZn +CHI /SiO2, HAP_MgSiZn +COL /SiO2 i HAP_MgSiZn +CHI /SiO2+ COL /SiO2 sunt prezentate n figura 4.4 a-f. Pe baza acestor spectre se pot face aprecieri asupra interaciunilor ce au loc ntre fazele sistemului.

31

f e Figura 4.4 Spectre FTIR ale probelor CHI, HAP_MgSiZn, HAP_MgSiZn +CHI /SiO2 (a) i (b);COL, HAP_MgSiZn, HAP_MgSiZn +COL /SiO2 (c) i (d); HAP_MgSiZn , HAP_MgSiZn +CHI /SiO2+ COL /SiO2 (e) i (f). 32

n cazul colagenului (format din cca 33% glicin i 22% prolin sau hidroxiprolin) pe baza datelor din literatur [264], avem urmtoarele atribuiri: la 3433 cm-1 gruparea H-O-H (alungire) iar n zona alifatic 2925 i 2858 cm-1 gruparea C-H (vibraie de alungire). n zona 1656 cm-1 vibraia de alungire C=O din amida I iar la 1542 cm-1 combinaia vibraiilor de deformare N-H i alungire C-N din amida II. La 1452 cm-1 avem vibraia de deformare a gruprilor CH3 iar la 1243 cm-1 vibraia de alungire C-N i de deformare N-H din amida II. Chitosanul pe baza datelor din literatur [265] prezint la frecvene nalte 3421 cm-1 vibraia H-O-H cuplat cu N-H iar la 2925 i 2858 cm-1 vibraia de alungire C-H. Banda pentru amida I (C=O) este localizat la 1637 cm-1, iar amida II (N-H) este localizat la 1564 cm-1. La 1383 cm-1 identificm vibraia de deformare a gruprii CH3. Pe baza datelor din literatur [262] se pot observa frecvenele de vibraie specifice pentru hidroxiapatit, localizate n domeniul de frecvene nalte atribuite gruprilor H-O-H la 3426 cm-1 din apa legat prin puni de hidrogen. La 3566 cm-1 se observ prezena gruprilor OH libere de pe suprafaa particulelor. n zonele de vibraie de la 2800-2925 cm-1 identificm benzi minime de absorbie atribuite gruprilor CH2 provenite din partea organic introdus n sinteze sub form de surfactant (nonilfenol). La 638 cm-1 apar benzile specifice pentru gruparea CO32- provenite din bicarbonatul de amoniu introdus n sinteze. Frecvenele de vibraie PO43- sunt localizate n domeniul de frecvene joase la 1090 cm-1, 1030 cm-1 i 590 cm-1. 4.5.2 Caracterizarea prin imagistic SEM n imaginile de mai jos se poate observa natura fibroas a colagenului mineralizat cu nanoparticule de hidroxiapatit.

a b Figura 4.11 Imagini SEM ale probei HAP_MgSiZn+COL/SiO2 B1; (a) Fibre de colagen mineralizate; (b) Fibra colagen, distribuie Ca2+ .

33

a b Figura 4.12 Imagini SEM ale probei HAP_MgSiZn+COL/SiO2 (mediu bazic) B6; (a) Fibr de colagen mineralizat; (b) Fibra colagen, distribuie calciu i fosfor.

a b Figura 4.13 Imagini SEM ale probei HAP_MgSiZn+COL/SiO2 (mediu acid+GA)B4; (a) Fibr de colagen mineralizat;(b) Fibra colagen, distribuie Ca2+. Din figurile imaginilor SEM se poate observa morfologia i structura biocompozitelor preparate n difer ite condiii precum i fibrele de colagen mineralizate cu HAP att n mediu acid ct i n mediu bazic. 4.5.3 Caracterizarea prin imagistic AFM O selecie a imaginior AFM ale particulelor de bio compozite este prezentat n figurile 4.17, 4.18 i 4.19. Imaginile AFM arat diferite structuri morfologice ale auto -asamblrii fibrei de colagen cu nanoparticulele de hidroxiapatit. Acestea sugereaz c nanoparticulele de HAP conduc la formarea autoasamblrilor de COL cu un grad mare de stabilitate. Interaciunile ce au loc ntre COL i nanoHAP pot fi explicate prin intermediul lagturilor de hidrogen, ns nu excludem nici mecanismul de simpl nglobare al nanoparticulelor de HAP n matricea de colagen. 34

Figura 4.17 Imagini AFM ale fibrei de colagen mineralizat. Aria scanat 2 m x 2 m; a) imagine topografic 2D; b) imagine de faz; c) imagine de amplitudine d) imagine topografic 3D; e) seciune longitudinal de-a lungul sgeii n panoul a.

4.8 PREPARAREA SCAFOLDURILOR DIN MATERIALE COMPOZITE

Pentru prepararea scafoldurilor din materiale compozite am folosit tehnica depunerii n multistrat ( layer by layer) a hidroxiapatitei cu colagenul i chitosanul pe suport de sticl ITO. n aceast lucrare este prezentat metoda optim de obinere a scafoldurilor. Pna am ajuns ns la aceast formul, s-au fcut o serie de ncercri pentru a obine scafoldul optim cu caracteristicile: stabilitate chimic, morfologie, compoziie chimic i design. Astfel am folosit suspensii apoase de 1% HAP cu diferite compoziii i structuri, soluie 0.3% COL i soluie 2% CHI. Pe sticla optic tratat cu HCl 5% timp de 1 or, activat cu ioni de siliciu, s-au depus prin adsorbii verticale (imersii) straturi succesive de silicat de sodiu 5% - HAP - silicat de sodiu - CHI silicat de sodiu - COL. S-au efectuat cte 5 splri succesive dup fiecare strat depus iar uscarea a fost facut la temperatura camerei timp de 30 de minute/strat. Silicatul de sodiu de concentraie 5% a fost depus cu rol de liant ntre straturile de HAP, CHI i cel de COL pentru a realiza o stabilitate chimic puternic ntre straturi. Totodat ionii de SiO2 ofer i porozitate ridicat i controlat scafoldurilor. Schema de preparare a scafoldului este prezentat n figura 4.40.

35

Figura 4.40 Schema de preparare a scafoldului.

4.9 CARACTERIZAREA SCAFOLDURILOR

4.9.1. Imagistic AFM Scafoldurile preparate prin tehnica layer by layer descris anterior au fost investigate pe suprafa prin imagistica AFM. n imaginile AFM din tez sunt prezentate mai multe tipuri de scafolduri preparate cu diferite structuri i morfologii, de exemplu cel format din HAP pur + SiO2 + CHI + SiO2 + COL. (Fig. 4.41), sau cel pa baz de HAP cu siliciu (Fig. 4.42).

36

Figura 4.41 Imagini AFM ale suprafeei scafoldului HAP pur + SiO2 + CHI + SiO2 + COL. Aria scanat 500 nm x 500 nm; a) imagine topografic 2D; b) imagine de faz; c) imagine de amplitudine; d) imagine topografic 3D; e) seciune transversal de-a lungul sgeii n panoul a.

37

Figura 4.42 Imagini AFM ale suprafeei scafoldului HAP+10% SiO2 + SiO2+CHI+SiO2+COL. Aria scanat 500 nm x 500 nm; a) imagine topografic 2D; b) imagine de faz; c) imagine de amplitudine; d) imagine topografic 3D; e) seciune transversal de-a lungul sgeii n panoul a. n imaginile AFM se observ pe scafolduri fibre de colagen mineralizate cu nanoparticule de hidroxiapatit (o mineralizare intrafibrilar) cu o distribuie omogen a acestora pe suprafa.

38

5. BIOCOMPATIBILITATEA COMPOZITELOR NANOSTRUCTURATE IN VITRO

5.2.1.1 Evaluarea viabilitii celulelor prin analiza MTT

Investigarea proliferrii celulelor osteoblaste este o tehnic important de a evalua viabilitatea, biocompatibilitatea i toxicitatea bio compozitelor pe scafolduri in vitro. Testul MTT (bromur de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) se bazeaz pe capacitatea dehidrogenazei mitocondriale de a cliva inelul tetrazoliu al MTT, de culoare galben, din celulele viabile i de a forma cristale de culoare alba stru nchis de formazan care nu pot traversa membrana celular i astfel se acumuleaz n celulele viabile. Numrul de celule viabile este direct proporional cu cantitatea de formazan format. Solubilizarea cristalelor se realizeaz prin adugare de izopropanol iar cantitatea de formazan format este determinat spectrofotometric la lungimea de und de 492 nm.

Figura 5.17 Structura chimic a MTT (bromur de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazoliu) Celulele osteoblaste aflate la pasajul 6 sunt detaate de pe scafold cu tripsin 0.25% cu EDA timp de 5 minute dup 3 splri cu PBS. Tripsina este inactivat prin adugarea mediului de cultur cu 10% ser fetal. Suspensia de celule este centrifugat timp de 5 minute la 1000 rpm. Viabilitatea celular a fost verificat cu 0,4% tripan albastru iar numrarea celulelor a fost efectuat cu un hemocitometru Thoma. Analiza statistic a rezultatelor testului MTT s-a fcut cu testul multicomparison Dunnett n cadrul acestui test am comparat grupul de control (plastic) cu fiecare scafold preparat cu substrat HAP-MgSiZn; substrat CHI; substrat COL; substrat HAP-MgSiZn+CHI+COL.

39

a b Figura 5.18 Analiza MTT a viabilitii celulelor la 2 ore (a) la 48 de ore (b) pe scafoldur i comparate cu proba control (plastic) n aceleai condiii de cultur.

Din analiza MTT se poate observa c viabilitatea celular la 2 ore (figura 5.18 a) pe scafolduri este mult mai intens dect pe proba control (plastic). Valorile absorbanei apar a fi semnificativ diferite la scafoldul cu COL i scafoldul cu structur complex HAP_MgSiZn+CHI+COL fa de proba control. Acelai lucru se ntmpl i la 48 de ore (figura 5.18 b) de cultur a celulelor pe scafolduri. Aceste diferene semnificative sunt influenate n mod cert de compoziia, morfologia i structura scafoldului. Cu ct acesta prezint o structur i o compoziie mai complex, cu att viabilitatea celular este mai ridicat. Testul MTT arat c scafoldurile preparate nu au efect toxic asupra celulelor i prezint o bun biocompatibilitate cu acestea. 5.2.1.3 Evidenierea imunocitochimic a moleculelor implicate n adeziunea celular Osteoblastele conin molecule specifice implicate n fenomenul de adeziune celular osteopontina i molecula de adeziune celular CD44. n experimentele noastre am marcat cu anticorpi monoclonali celulele cultivate pe scafolduri i pe cele cultivate pe plastic pentru a observa dac exist diferene n exprimarea acestor antigene n funcie de scafoldul utilizat. Investigarea scafoldului: celule de control cultivate pe o plac Petri tratat cu colagen de tip I la 3 zile de cultur. Osteoblastele la pasajul 6 au fost nsmnate n mediu osteogenic de cultur Promoocell timp de 3 zile. Mediul de difereniere Promocell este un mediu ce conine factori specifici 40

ce induc diferenierea osoas. Coloraiile imunocitochimice s-au efectuat pentru osteopontin, actin i DAPI.

a.OP-FITC (400x)

b. OP-FITC+ DAPI (400x)

c.Faloidina TRITC (400x) Figura 5.20 Celule osteoblaste de control pe substrat de colagen, ziua 3. Celulele prezint pozitivitate pentru osteopontin (figura 5.20 b). Morfologia celulelor la 72 ore este cea de celule tinere, alungite, cu aspect fibroblastoid. Modificrile citoscheletului determinate de aderarea celulelor la suprafaa de plastic acoperit cu colagen au constat n orientarea microfilamentelor de actin paralel cu axul longitudinal al celulelor (figura 5.20 c).

41

Investigarea scafoldului : HAP_MgSiZn + SiO2 + CHI + SiO2 + COL n mediu de cultur cu celule la 7 zile, coloraie - colagen FITC-faloidina TRITC-DAPI.

a COL-FITC (400x)

b COL- FITC-faloidina TRITC-DAPI (400x)

c Tripl coloraie: OP-FITC, faloidina TRITC, DAPI (400x) Figura 5.23 a-c. Scafold cu celule la 7 zile.

n aceast prob s-a urmrit evidenierea sintezei colagenului de novo de ctre celulele osteoblaste. Spre deosebire de probele de control fr celule coloraia fibrelor de colagen este mult mai intens, aceste fibre sunt n contact direct cu celulele i sunt acoperite de mici depozite de cristale de hidroxiapatit (figura 5.23 b i c). 42

Investigarea scafoldului : HAP_MgSiZn + SiO2 + CHI + SiO2 + COL n mediu de cultur cu celule la 3 zile.

a. OP-FITC (400x)

b. faloidina TRITC (400x)

c. Tripl coloraie: OP-FITC + faloidina TRITC+ DAPI (400x);

d. OP-FITC+Actina TRITC+DAPI (200x)

e. OP-FITC+Actina TRITC+DAPI (400x)

Figura 5.24 a-e. Scafold cu celule n mediu de cultur la 3 zile. 43

Cultivarea n mediul de cultur standard timp de 3 zile a osteoblastelor pe acest scafold a indus o intens exprimare a osteopontinei intracelulare fa de cultivarea n mediul osteogenic Promocell (figura 5.20 a-c). Astfel se remarc o morfologie mai tnr a celulelor (aspect mai alungit) i o accentuat densitate a filamentelor de actin care sunt dispuse n fascii paralele cu axul longitudinal al celulei ( Fig. 5.24 a i b) iar pe suprafaa celulelor apar cristale mici de hidroxiapatit ( Fig 5.24 c). Figura 5.24 (d) reprezint tripl coloraie pentru OP-FITC, actinafaloidina TRITC i DAPI iar Figura 5.24 (e) ofer detalii ale citoscheletului, cu apariia fibrelor de stres. Comportamentul osteoblastelor n condiii de cultur 3D pe suporturi matriceale este diferit n funcie de structura i compoziia chimic a substratului scafoldului. Un substrat osteoinductiv induce o aderare i proliferare celular ridicate i orienteaz celulele spre un fenotip mai matur de celul osteocit (celula matur). Pentru suporturile matriceale ce conin hidroxiapatit modificat cu Mg2+, Zn2+, SiO44- s-au obinut rezultatele cele mai bune. Astfel s-a constatat o proliferare accelerat a celulelor ntr-un interval scurt de timp (3 zile) pe scafolduri indus de prezena acestor substitueni n structur, care influeneaz n mod pozitiv dezvoltarea celulelor osteoblaste. Metodele de evaluare a adeziunii celulare tatonate n aceast etap i anume aprecierea morfologiei osteoblastelor, numrarea celulelor la diferite intervale de timp, coloraiile imunocitochimice pentru proteinele implicate n procesul de aderare i a filamentelor de actin, au artat diferene semnificative ntre scafoldurile cu substratele matriceale diferit preparate.

5.2.2 Investigarea scafoldurilor prin imagistic SEM

Imagistica SEM este o metod de investigare a structurii i suprafaei scafoldurilor cu sau fr celule. Astfel am reuit s observm apariia unor structuri noi pe scafolduri la anumite intervale de timp i modul de proliferare i dezvoltare al celulelor pe acestea. Etapele pregtirii probelor biologice pentru imagistica SEM au fost: - fixarea probelor cu glutaraldehid 2,5% ; - splarea probelor cu tampon fosfat (PBS); - acoperirea probelor cu 6nm strat pulverizat de aur.

44

Figura 5.28 Imagini SEM ale scafoldului HAP_MgSiZn + SiO2 + CHI + SiO2 + COL + celule la 3 zile (a), (b) i 7 zile de cultur (c), (d), (e), (f).

45

n imaginile SEM se observ o organizare tridimensional a scafoldurilor cu inducerea maturizrii (diferenierii) celulelor osteoblaste spre osteocite cu form caracteristic i cu prelungiri dendritice. n figura 5.28 c i d se observ n spaiul intercelular apariia unei reele matriceale proprii create de celulele osteoblaste cu sinteza de matrice osoas de novo. 5.3 Vizualizarea osteoblastelor prin imagistic TEM Testarea viabilitii celulelor osteoblaste s-a fcut prin imagistic TEM. n acest scop, s-a efectuat secionarea celulelor dup 7 zile de cultur, printr-o metod special. Astfel, celulele au fost desprinse de pe scafolduri prin tripsinizare i apoi centrifugate. Se obine un "buton" de celule care se ncapsuleaz ntr-o rain special i apoi se face secionarea probei cu microtomul, obinndu-se seciuni ultrafine de 40 nm.

Figura 5.35 (a). Seciune transversal prin celul cu intense procese de exocitoz (export din interior n mediul extracelular). Se disting microvili (1), vezicule (2), formaiuni exocitate din celul n afar (3), lizosomi (4); nucleul celulei (5), citoplasma (6); (b). Seciune transversal printr-o poriune din celul:1 mitocondrii; 2 lisosomi; 3 vezicule; 4 microvezicule de endocitoz; 5 REG. Se observ att procese de exocitoz ct i procese de endocitoz. Din imaginile TEM ce prezint seciuni la diferite nivele prin celul, se observ toate organitele celulare specifice importante, ceea ce demonstreaz viabilitatea excelent a acestora. De exemplu se poate observa existena nucleului la nivelul cruia se sintetizeaz ADN i ARN; nucleolul ce are rol n pregtirea celulei pentru diviziunea mitotic; mitocondriile care genereaz cea mai mare parte a ATP ului utilizat ca surs energetic n reaciile biochimice din celul. De asemenea se constat prezena reticulului endoplasmatic (RE) la nivelul cruia are loc biosinteza proteinelor i a lipidelor. n figura 5.35 se observ att procese de exocitoz ct i procese de endocitoz ale celulei. Acestea demonstreaz faptul c celula prezint o activitate biologic intens ce conduce la o viabilitate remarcabil a acesteia.

46

5.2.6 Analiza SEM i EDX a osului natural Pentru a investiga suprafaa i compoziia chimic a osului natural am fcut o analiz SEM i EDX a acestuia prezentate n figura 5.37 a-d.
Quantitative results

Ca 3.4% P 2.2%

O 26.7%

Weight%
C 67.8%

Bb B b

Quantitative results

Ca 6.3% P 1.4% O 9.8%

Weight%

C 82.5%

Figura 5.37 Imagine SEM a osului natural (a) i (c); analiza chimic elemental a osului natural (b) i (d). 47

Din imaginile SEM i analiza EDX a osului natural se poate observa structura i compoziia chimic a acestuia. Fragmentele de os natural au fost obinute n timpul interveniei chirurgicale de reconstrucie a articulaiei genunchiului, dup obinerea acordului pacientului.

Concluzii generale
Am efectuat o sintez i o analiz asupra factorilor din ecuaiile cinetice ale formrii i creterii germenilor i am evideniat rolul pe care l au concentraia reactanilor, pH-ul mediului de reacie i suprasaturaia asupra mrimii particulelor. De asemenea am stabilit natura i proporia n care surfactanii sunt adugai n sintez. Am stabilit ordinea i modul de adugare al ionilor substitueni pentru a evita formarea i fosfatului tricalcic. Prin determinri experimentale am optimizat durata tratamentului hidrotermal (24 h) prin care se aduce compoziia fazei solide la raportul Ca/PO4 =1.67, raport corespunztor hidroxiapatitei. Utiliznd n calitate de surfactani amidon, gelatin, zer de lapte de vac i nonilfenol am stabilit c surfactantul cel mai potrivit este nonilfenolul urmat de zer, care are n compoziie lactoz i o serie de proteine. Am stabilit temperatura optim de calcinare pentru realizarea gradului de cristalinitate, factor important pentru materialele folosite n ortopedie i stomatologie, fiind cuprins ntre 650C - 750C interval de temperatur la care carbonaii nu se descompun termic. Am elaborat metode de asamblare a HAP/COL, HAP/CHI precum i a HAP/CHI/COL att n cimenturi (biocmpozite B1, B2 si B3) ct i sub form de scafolduri prin adsorbie pe suprafee de sticl ITO dup metoda strat cu strat (layer by layer) prin imersii verticale succesive n suspensiile componente. Hidroxiapatita preparat dup metoda original, parial substituit cu ioni de SiO44-, Zn2+ i Mg2+ n proporiile indicate la capitolul 3, a artat cea mai bun biocompatibilitate cu celulele osteoblaste n comparaie cu celelalte probe de HAP pur i HAP substituit cu SiO2. Pe cale experimental am stabilit condiiile optime de preparare a scafoldurilor prin care s se asigure fenomenele de adeziune, proliferare i difereniere celular cele mai ridicate. 48

Prin adaosul de silicat de sodiu soluie 5% i controlul pH-ului la care se realizeaz policondensarea acestuia, n cadrul sistemelor studiate, am obinut scafolduri cu diferite morfologii i cu porozitate controlat. Caracterizarea microstructurilor s-a fcut prin analize de microscopie TEM, SEM i AFM; prin difractometrie de raze X i spectrosopie FTIR i XPS. Rezultatele au artat c acestea prezint o structur cu o cristalinitate bine conturat i dimensiuni ale particulelor cuprinse n domeniul nanometric. Introducerea argintului la scar nano (10 nm) n structura HAP confer acesteia proprieti (adeziunea, proliferarea) net superioare fa de HAP pur (figurile 5.16 i 5.17). Analiza imaginilor de microscopie optic arat c pentru nanostructurile de HAP parial substituite cu ioni de SiO44-, Mg2+ i Zn2+ fenomenul de adeziune se manifest mai intens nc din primele 3 zile de cultur a celulelor osteoblaste comparativ cu nanostructurile cu HAP pur. Dup 7 zile de cultur n mediu cu celule osteoblaste se constat c numrul celulelor pe unitatea de suprafa (1mm2) scade datorit faptului c se intensific procesul de adeziune care este n raport invers proporional cu fenomenul de proliferare celular. Nanostructurile de HAP care conin argint i aur arat proprieti de biocompatibilitate puin inferioare celor de HAP complex. Aceast caracteristic sugereaz faptul c utilizarea nanostructurilor HAP cu coninut de Ag0 i Au0 sunt de preferat datorit proprietilor pe care acetia le au. Argintul are proprietatea de a "sufoca" viruii i bacteriile, iar nanoparticulele de aur au capacitatea de a fi utilizate pentru fabricarea unor teste de diagnosticare rapid, prin care s se identifice prezena unor ageni toxici, microbi sau alergogeni n fluidele corpului (snge). Imaginile TEM ce prezint seciuni la diferite nivele prin celul, relev c acestea au toate organitele specifice importante, demonstrnd astfel excelenta lor viabilitate. Tot prin imagistic TEM n figura 5.34 s-au pus n eviden procesele de exocitoz i de endocitoz ale celulei care dovedesc faptul c celula prezint o activitate celulara intens ce conduce la o viabilitate remarcabil a acesteia. Analizele EDX a celulei osteoblaste, a osului natural i a osului la interfaa cu proteza relev compoziia chimic a acestora, asemntoare cu compoziia chimic a nanostructurilor pe care le-am preparat n aceast lucrare.

49

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Temenoff J.S., Mikos A.G.; Injectable biodegradable materials for orthopedic tissue engineering; Biomaterials, 21: 2405-2412, 2000. 2. Kelly E.B.; New Frontiers in Bone Grafting; Orthopedic Technology Review, 2:28-33, 2000. 3. Crane G.M., Ishaug S.L., Mikos A.G.; Bone tissue engineering; Nature Medicine, 1:1322-1324, 1995. 4. Athanasiou K.A., Zhu C.F., Lanctot D.R., Agrawal C.M., Wang X.; Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone; Tissue Engineering, 6:361-381, 2000. 204. Gravens D., Margraf H., Butcher H., Ballinger W.; The antibacterial effect of treating sutures with silver. Surgery, 73:122- 127, 1973. 205. Heard S.O., Wagle M., Vijayakumar E.; The influence of triple-lumen central venous catheters coated with chlorhexidine/silver sulfadiazine on the incidence of catheter-related bacteremia: a randomized; Controlled clinical trial. Arch Intern Med,158:81-87, 1998. 206. Kerker M.; The optics of colloidal silver: something old and something new; Journal of Colloid and Interface Science,105:297-314, 1985. 207. Liedberg H., Lundeberg T.; Silver alloy coated catheters reduce catheter-associaled bacteriuria. Br J Urol, 65:379-381, 1990. 208. Livingston-Wheeler V., Wheeler O.W.; The microbiology of cancer: Physician's Handbook; Spring Valley, CA: A Livingston-Wheeler Medical Clinic Publication, 1977. 209. Madden M.R., Nolan E., Finkelstein J.L, Yurt R.W, Smeland J., Goodwin C. W., Hefton J., Staiano-Coico L.; Comparison of an occlusive and a semi-occlusive dressing and the effect of the wound exudate upon keratinocyte proliferation; J.Trauma, 29:924-930, 1989. 210. Maki D.G., Cobb L., Garman J.K., Shapiro J.M,. Ringer M., Helgerson R.B.; An attachable silver-impregnated cuff for prevention of infection with central venous catheters: a prospective randomized multicenter trial. Am J Med, 85:307-314, 1988. 211. Maki DG, Stolz SM, Wheeler S, Mermel LA.; Prevention of central venous catheter-related bloodstream infection bz use of an antiseptic-irnpregnated catheter: a randomized. controlled study; Ann Intern Med; 127:257-266, 1997. 50

212. Margraf H.W, Covey T.H Jr; A trial of silver-zinc-allantoinate in the treatment of leg ulcers; Arch Surg, 112:699-704, 1977. 213. Morones J.R.; The bacteriocidal effects of silver nanoparticles; Nanotechnology, 16:23462353, 2005. 214. Moyer C.A., Brentano L., Gravens D.; Treatment of large human burns with silver 0.5% nitrate solution; Arch Surg, 90:812867, 1965. 215. Niizeki K., Hashimoto K.; Treatment of molluscum contagiosum with silver nitrate; Paste. Pediatric Dermatology, 5:395397, 1999. 216. Olson M.E., Wright J.B., Lam K.; Healing of porcine donor sites covered with silver-coated dressings; Eur J Surg, 166:486489, 2000. 217. Cai L., Wang Q., Gu C., Wu J., Wang J., Kang N., Hu J., Xie F., Yan L., Liu,X., Cao, Y. , Xiao R. ; Vascular and micro-environmental influences on MSC-coral hydroxyapatite constructbased bone tissue engineering; Biomaterials, 32:8497-8505, 2011. 218. Russell A.D., Path F.R., Hugo W.B.; Antimicrobial activity and action of silver; Prog Med Chem., 31:354, 1994. 219.Sosa I.O., Noguez C., Barrera R.G.; Optical properties of metal nanoparticles with arbitrary shapes; Journal of Physical Chemistry B., 107:6269-6275, 2003. 223. Haghbin N. M., Solati-Hashjin M., Moztarzadeh F.; Preparation of hydroxyapatite ceramics for biomedical applications; Journal of Ceramic Processing Research, 10:54-57, 2009. 224. Faming Z., Jiang C., Jianxi L., Kaili L., Congqin N.; Bioinspired structure of bioceramics for bone regeneration in load-bearing sites; Acta Biomaterialia, 3:896904, 2007. 225. Sung-Baek C., Fumiaki M., Tadashi K., Kazuki N., Naohiro S., Takashi N.; Apatiteforming ability of silicate ion dissolved from silica gels; Journal of Biomedical Materials Research, 32:375-381, 1996. 226. Sz-Chian L., San-Yuan C., Hsin-Yi L., Jong-Shing B.; Structural characterization of nanosized calcium deficient apatite powders; Biomaterials, 25 : 189196, 2004. 228. Karin A. H., Peter A. R., Nigel S., Thomas B.; Effect of silicon level on rate, quality and progression of bone healing within silicate-substituted porous hydroxyapatite scaffolds; Biomaterials, 27:50145026, 2006. 51

229. Yoshinobu F., Hiroshi Y., Kunio K., Tsugio S. , Akitsugu O.; Preparation of needle-like hydroxyapatite by homogeneous precipitation under hydrothermal conditions; Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 57:349 353, 2007. 230. Shigeru S., Takayuki Y., Toshihiro M., Hiromu H., John B. M.; Preparative enhancement of the thermal stability of calcium hydroxyapatites ; Journal of Solid State Chemistry, 142:319 -324, 1999. 231. Mara V. R, Daniel A.; Silicon substituted hydroxyapatites. A method to upgrade calcium phosphate based implants; J. Mater. Chem., 15:15091516, 2005. 232. Mahdi R., Fathollah M., Mohammadreza T.; Formation of hydroxyapatite nanoneedles on the surface of a novel calcium phosphate/blood plasma proteins biocement in simulated body fluid (SBF); Journal of Ceramic Processing Research, 10:669-673, 2009. 233. Anna S., Zofia P., Czesawa P.; FTIR and XRD evaluation of carbonated hydroxyapatite powders synthesized by wet methods; Journal of Molecular Structure 744747, 657661, 2005. 234. Wang H.X., Guan S.K., Wang X., Ren C.X., Wang L.G. ; In vitro degradation and mechanical integrity of MgZnCa alloy coated with Ca-deficient hydroxyapatite by the pulse electrodeposition process; Acta Biomaterialia, 6:1743-1748, 2010. 235. Dietrich E., Oudadesse H., Lucas-Girot A., Le Gal Y., Jeanne G. S. ; Effects of Mg and Zn on the surface of doped melt-derived glass for biomaterials applications; Applied Surface Science, 255:391-395,2008 236. Kim S. R., Lee J. H. , Kim Y. T., Riu D. H., Jung S. J., Lee Y. J., Chung S. C., Kim Y. H.; Synthesis of Si, Mg substituted hydroxyapatites and their sintering behaviors; Biomaterials, 24:1389-1398, 2003. 255. Mocanu A., Cernica I., Tomoaia Gh., Bobos L-D,, Horovitz O., Tomoaia-Cotisel M.; Selfassembly characteristics of gold nanoparticles in the presence of cysteine; Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, 338: 93101, 2009. 256. Yogita G., Mathur G. N., Sandeep V.; Biomimetic synthesis and ultrastructural characterization of a zerovalent goldhydroxyapatite composite; Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 16:363366, 2006.

52

257. Barbu-Tudoran L., Tomoaia Gh., Horovitz O., Mocanu A., Tomoaia-Cotisel M., Selfassembly characteristics of gold nanoparticles in the presence of arginine; Journal of optoelectronics and advanced materials, 10: 2293 2297, 2008. 262. Sionkowska A., Kozowska J.; Character ization of collagen/hydroxyapatite composite sponges as a potential bone substitute; International Journal of Biological Macromolecules, 47:483487, 2010. 263. Sena L. A., Caraballo M. M., Rossi A.M., Soares G.A ; Synthesis and characterization of biocompomposites with different hydroxyapatite-collagen ratios ; J. Mater Sci: Mater Med, 37:2395-2400, 2009. 264. Sionkowska A., Wisniewski M., Skopinska J., Mantovani D.; Effects of solar radiation on collagen-based biomaterials; International Journal of Photoenergy ,45:16; 2006. 265. Al-Sagheer F., Muslim D.; Thermal and Mechanical Properties of Chitosan/SiO2 Hybrid Composites; Journal of Nanomaterials, Article ID 490679, 7 pages, 2010. 303.Tomoaia Gh., L.-B. Pop, Petean I., Tomoaia-Cotisel M.; Significance of surface structure on orthopedic materials; Materiale Plastice, 49:1-12, 2012. 317. Tomoaia Gh., Soritau O., Tomoaia-Cotisel M., Pop L.-B., Pop A., Mocanu A., Horovitz O., Bobos L.-D.; The effect of self-assemblies based on nanostructured phosphates and collagen mixtures on cell cultures, in Metal Elements in Environment, Medicine and Biology, Editors, G. Garban and R. Silaghi-Dumitrescu, Tome IX, pp. 135-140, 2009, Cluj-Napoca University Press, ISSN: 1583-4204. 318. Tomoaia Gh., Pop L.-B., Tomoaia-Cotisel M.; Cell scaffolds mimic bone structure. The effect of calcium phosphates and collagen mixtures on osteoblasts cultures, in Promovarea dezvoltarii durabile in spatiul Dunarean prin cooperare culturala si stiintifica, Humboldt-Kolleg Monography, Cluj-Napoca, 20-23 May, 2010; Monography, Mediamira Press, Cluj-Napoca, pp. 233-240, 2010. 319. Tomoaia Gh., Soritau O., Tomoaia-Cotisel M., Pop L.-B., Pop A., Mocanu A., Horovitz O., Bobos L.-D.; Scaffolds made of nanostructured phosphates, collagen and chitosan for cell culture; Paper Identification P-126-Cotisel; The 5th International Granulation Conference, Lausanne, Switzerland, June 20-22, 2011, 18 pagini. 320. Tomoaia Gh., Tomoaia-Cotisel M., Mocanu A., Horovitz., Bobos L-D., Crisan M., Petean I.; Supramolecular organization of collagen and anti-cancer drugs; J. Optoelectronics Advanced Materials, 10:961 964, 2008. 53

321. Tomoaia Gh., Soritau O., Tomoaia-Cotisel M., Pop L.-B., Pop A., Mocanu A., Horovitz O., Bobos L.-D.; Nanostructured phosphates, collagen and chitosan scaffolds for cell culture; Journal Powder Technology, 2011, in press. 322. Prejmerean C., Tomoaia-Cotisel M., Vasile E., Furtos G., Pop L-B, Moldovan M., Sarosi C., Petean I.; Characterization of surface organization and morphology of some new experimental dental resin-based composites; International Journal of Nano and Biomaterials, 2011, in press. 323. Tomoaia Gh., Soritau O., Tomoaia-Cotisel M., Pop L.-B., Pop A., Mocanu A., Horovitz, O., Bobos L.-D.; The effect of self-assemblies based on nanostructured phosphates and collagen mixtures on cell cultures; in The 9th International Symposium of Roumanian Academy, ClujNapoca Branch and Timisoara Branch, on Metal Elements in Environment, Medicine and Biology, Cluj-Napoca, October 16-17, 2009. 324. Pop L.-B., Pop A., Tomoaia Gh., Mocanu A., Bobos L.-D., Horovitz O., Jumate N., Bratu I., Tomoaia-Cotisel M.; Synthesis and physico-chemical characterization of Inorganic powders of nano- and micro-structures based on calcium phosphates; in The 9th International Symposium of Roumanian Academy, Cluj-Napoca Branch and Timisoara Branch, on Metal Elements in Environment, Medicine and Biology, Cluj-Napoca, October 16-17, 2009. 325. Tomoaia Gh., Pop L.-B. , Tomoaia-Cotisel M., Cell scaffolds mimic bone structure. The effect of calcium phosphates and collagen mixtures on osteoblasts cultures, Humboldt-Kolleg Conference, Cluj-Napoca, May 20-23, 2010. 326. Tomoaia Gh., Soritau O., Tomoaia-Cotisel M., Pop L.-B., Pop A., Mocanu A., Horovitz O., Bobos L.-D.; Scaffolds made of nanostructured phosphates, collagen and chitosan for cell cultures; International Physical Chemistry Conference, (ROMPHYSCHEM 14, 2010), Bucharest, June 2-4, 2010. 327. Furtos G., Tomoaia-Cotisel M., Prejmerean C., Baldea B., Pop L.B., Pop A., Moldovan M.; New antimicrobial bone cement based on hydroxyapatite and silver; The 4th International Conference Biomaterials, Tissue Engineering & Medical Devices, BiomMedD'2010, Sinaia, 23-25 September, 2010. 328. Prejmerean C., Tomoaia-Cotisel M., Furtos G., Pop L-.B., Trif M., Sarosi C., Petean I.; Characterization of surface organization and morphology of some new experimental dental resinbased composites; The 4th International Conference Biomaterials, Tissue Engineering & Medical Devices. (Poster: P89), Sinaia, 23-25 September, 2010.

54

329. Tomoaia Gh., Soritau O., Pop L.-B., Furtos G., Prejmerean C., Mocanu A., Tomoaia-Cotisel M.;

Scaffolds of hydroxyapatite, collagen and chitosan for improved adhesion and bioactivity of osteoblastic cells; COST Meeting, Action TD0906, University of Mons, Mons, Belgium, May 18-20, 2011. 330. Furtos G., Tomoaia-Cotisel M., Baldea B., Pop L.-B., Jumate N., Prejmerean C., Barbu T.L.; The effect of CaF2 content on mechanical properties of some bone cements based on hydroxyapatite; The annual meeting of the European Chapter of the Tissue Engineering and Regenerative Medicine International Society (TERMIS), in Granada Congress and Exhibition Centre, Spain, June 7-10, 2011. 331. Tomoaia Gh., Soritau O., Tomoaia-Cotisel M., Pop L.B., Pop A., Mocanu A., Horovitz O., Bobos D.L.; The effect of self-assembled composites based on calcium phosphates and biopolymers on the adhesion of osteoblast cells; The 10th International Conference on Colloid and Surface Chemistry (Cea de a 10-a Conferinta de Chimia Coloizilor si a Suprafetelor cu Participare Internationala , Ediie omagial dedicat Anului Internaional al CHIMIEI 2011), Dunarea de jos University of Galati, Galati, June 9-11, 2011.

55