INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURI VEGETALE

Sfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiei n viaa omului, n toate domeniile de activitate. Cu a utorul metodelor biotehnologice s-au fcut progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plante i rase de animale cu nsuiri favorabile i cu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat. !ezvoltarea biologiei moleculare din ultima umtate de secol s-a fcut, n principal, pe organisme simple ca mod de organizare "bacterii, dro dii, alge, etc.#, organisme unicelulare. $dat cu abordarea organismelor pluricelulare trebuia verificat dac noiunile acumulate anterior erau valabile i dac e%istau i alte procese specifice modului comple% de organizare. Cunoscndu-se comportamentul organismelor simple, cercettorii au nceput s se gndeasc la cultura pe medii artificiale a unor poriuni de plante sau chiar celule. &roblema care a aprut a fost aceea a meninerii viabilitii acestor celule, de la prelevarea de pe planta mam pn la trecerea pe mediu nutritiv artificial sau mai departe pn la regenerarea "refacerea# unei noi plante. ' ungerea la cultura in vitro nu a fost aa de simpl cum s-a presupus fiind necesar mult timp i multe cercetri, la nceput fr succes, dar apoi totul s-a clarificat. (n )**+, Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeaz substanele ce determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar, iar primele ncercri de culturi de esuturi au fost fcute n ),-+, de ctre .aberland, din nefericire, fr rezultatele dorite. &rimele rezultate privind cultura de celule i esuturi ncep s apar din anul ),++, cnd /nudson reuete germinarea seminelor de orhidee in vitro iar 0obbins obine prima cultur de esut de rdcin n condiii artificiale. &e baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conine informaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, n anul ),1+ 2orel i 2artin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a e%plantelor meristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestora plante sntoase, libere de viroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze. (n acest mod se produce material de plantat devirozat, cu o rat de multiplicare ntr-un ritm imposibil de imaginat prin utilizarea tehnicilor tradiionale de nmulire vegetativ, evitnduse i degenerarea soiurilor din cauza infeciilor virale, transmisibile prin nmulire vegetativ. (n anul ),3+, dup muli ani de studii i ncercri, 2urashige i S4oog, au reuit s elaboreze un mediu de cultur considerat ca fiind de baz , care 5 cu mici modificri 5 poate fi utilizat pentru aproape toate tipurile de culturi de esuturi. 0euita e%perienelor lui Co4ing n ),3- privind izolarea enzimatic a protoplatilor din mezofil foliar, a fcut posibil obinerea unor populaii mari de protoplati iar apoi producerea de hibrizi somatici. 'nul ),33 este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind cultura de e%plante vegetale in vitro. 'ceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea de tehnici eficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu a utorul protoplatilor, odat cu descoperirea noilor tehnici "electrofuziune, vectori virali transmitori de gene izolate# s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresani cum ar fi6 pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc. 'tt pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite n special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea celor create prin inginerie genetic.

CAPITOLUL I 1.1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE I APLICABILITATE

1.1.1 Definiie (n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii de asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturi sau celule vegetale. 0euita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n momentul n care e%plantul crete. 7%plantul, numit i inocul, este poriunea de plant "organ, esut, celul# care se desprinde de pe planta donor "planta mam#, i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur. 7voluia e%plantului este diri at de operator n funcie de scopul urmrit. 'cesta poate evolua formnd o nou plant "sau mai multe plante - neoplantule#, prin stimularea dezvoltrii organelor aeriene "tulpina i frunzele# i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmulirii nedifereniate a celulelor. 7%plantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. 8otipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma o plant identic cu planta mam. 8eoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i e%prima acest caracter, datorit pe de o parte diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare de specializare al acelor celule. 'stfel, s-a demonstrat practic c, ntr-o plant matur, celulele specializate care constituie esuturile, de e%emplu6 traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipsete citoplasma i nucleul, nu sunt totipotente. 'cest aspect este e%plicat chiar prin faptul c ntreaga informaie genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu. 9a plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i pierd capacitatea de totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. 0mn, ns, anumite zone n care activitatea celulelor este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noi celule. 'ceste celule sunt mici n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuol mic i nucleu mare dispus central i prezint o membran celulozic, formnd esutul cu denumirea de meristem. 2eristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosime a plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini. 1.1. C!"!#$e"i%$i#i&e #'&$'"i&(" in )i$"( Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari de plant "marcote, butai, altoi#, la multiplicarea in vitro se folosesc e%plante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice "celule, protoplati#, e%plante care n condiii normale de cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni i sintetizndu-i singure substanele nutritive necesare. !in acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectate urmtoarele condiii6 -prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a e%plantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil e%plantelor:

-asigurarea i controlarea factorilor de mediu "temperatur, lumin, umiditate# n limitele optime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopul urmrit: -stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizarea corespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere: -asigurarea unei asepsii depline pe tot flu%ul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecia materialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturor operaiilor n hota cu flu% de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare. 1.1.* D(+enii ,e !-&i#!"e ! #'&$'"i&(" in )i$"( !atorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au rspuns afirmativ, sunt utilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar, etc. (n agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii secundari. 'vanta ele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim6 -asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantiti mici de material vegetal. 8eoretic, se asigur o multiplicare e%ponenial, prin care n circa 3 luni se pot obine ) milion de plante: -se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros, precoce i productiv: -necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pe vertical pe ;-1 nivele suprapuse: -obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte e%plante de esuturi generative "cu n cromozomi#: -d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care n condiii normale sunt imposibil de obinut: -selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori: -se evit efectul sezonier de pepinier: -se pot obine semine artificiale: -se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire: -asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale de cultur: -asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi ferme de multiplicare. Cu toate aceste avanta e, e%ist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care, deocamdat rmn s fie nmulite tradiional. 7%ist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n mas a plantelor, cum ar fi6 -necesitatea unui laborator cu dotrile minime6 instalaii i aparate indispensabile activitilor de micropropagare, care sunt costisitoare: -necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro: -utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de producie: -nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la metodele cunoscute de multiplicare: -e%ist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii soiurilor:

-riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri care se comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru unele specii.

1. PROCESE .ORFOFIZIOLOGICE E/PLANTELOR CULTIVATE IN VITRO

LA

NIVELUL

7%plantele inoculate pe medii aseptice i vor relua activitatea metabolic, se vor integra noilor condiii de via, i vor reamorsa procesele fiziologice vitale i vor ncepe un nou ciclu de via. (n dependen de mediul de cultur, de natura inoculilor, de seria de operaiuni prin care au trecut prealabil ultimei inoculri, de condiiile de cultur i de scopul urmrit, dup dediferenierea celulelor i regenerarea de noi celule, evoluia acestora poate fi diri at. <noculii pot fi meninui ntr-o stare primar de organizare cum ar fi6 culturi de celule n suspensie "fr a intervenii formarea de agregate celulare# sau de calus, ori pot fi induse procese de citodifereniere, de morfogenez sau organogenez. 1. .1 Dife"enie"e! Celulele meristematice, divizndu-se continuu, dau natere la noi i noi celule care, treptat, cresc i sufer o specializare morfofiziologic ce poart numele de difereniere. (n procesul de difereniere se pierd caracterele citologice i fiziologice de tip embrionar specifice celulelor meristematice, evolundu-se spre caliti proprii specializrii funcionale a diferitelor tipuri de esuturi sau organe n alctuirea crora celulele mature vor intra. (n primele faze de difereniere se remarc o modificare ultrastructural i funcional a celulelor, fenomen denumit citodifereniere. &e msura diferenierii, volumul celulei crete, scade raportul nucleoplasmatic, citoplasma devine pelicular i parietal, se e%tinde vacuomul care mpinge citoplasma i nucleul la periferia celulei. &lastidomul este constituit din cloroplaste, cromoplaste sau amiloplaste, n funcie de rolul ndeplinit de celule. $dat cu avansarea proceselor de difereniere peretele celular poate suferi modificri secundare de genul depunerilor de celuloz, lignin, mineralizare, gelificare sau chiar lichefiere, care conduc treptat la o ngreunare a comunicrii intercelulare, intervenind cu timpul un declin fiziologic sau chiar moartea celulelor "de e%emplu la sclerenchim#. Celulele odat difereniate nu se mai divid. Celulele care compun un esut sau organ nu posed acelai ritm de cretere i se afl sub un permanent endocontrol fitohormonal. Substanele elaborate de celule pot difuza nspre celulele nvecinate e%ercitnd un anumit rol n dezvoltarea acestora fenomen denumit inducie, i care st la baza interrelaiilor dintre esuturi, ce servesc la organizarea acestora n formaiuni funcionale, respectiv la organogenez. !up difereniere i generarea de noi celule se a unge la situaia n care celulele neoformate tind s se reorganizeze structural i funcional suferind o citodifereiere, histodifereniere, cu organizarea de esuturi "histogenez#, de organe "organogenez# i n final regenerarea unei noi plante. !iferenierea celular in vitro nu este foarte variat, unele funcii sunt reduse sau simplificate n timp ce altele sunt amplificate. 1. . De,ife"enie"e! #e&'&!"0 !ediferenierea const n transformarea progresiv a celulelor din starea de celul specializat n celul meristematic, rectignd aptitudinea de a se divide.

!ediferenierea natural a celulelor poate fi observat n organele care se ramific sau n cazul traumatizrii organelor i al generrii, la locul rnirii, de calus. &rocesul de dedifereniere este comple% i se instaleaz n momentul n care celulele primesc un impuls inductiv, de obicei fitohormonal, impuls ce declaneaz transformri la nivel molecular. (n cadrul unui esut nu toate celulele dedifereniaz, puine celule devin centrii generatori de noi i noi celule suficiente pentru a asigura ndeplinirea fenomenelor de restituie. (n caz de traumatism organele din esuturile lezate beneficiaz de acumularea unor substane cu rol esenial n inducerea i stimularea proceselor de dedifereniere. !eci, fitohormonii, condiiile de cultur, natura esuturilor implicate, starea lor fiziologic i vrsta plantelor donatoare constituie factori ce intervin n procesele de regenerare. 'ptitudinea celulelor de a se dediferenia este foarte inegal rspndit n corpul plantelor i chiar i n cadrul subunitilor structurale, morfofuncionale, care alctuiesc un organism, e%istnd diferene mari n ceea ce privete capacitatea de a se dediferenia, la celule aparinnd aceluiai organ sau chiar esut. Celulele e%plantelor inoculate pe medii aseptice, pentru a putea s-i reorganizeze un mod de via, trebuie sa sufere un proces de conversie din celule definitivate structural i funcional n celule meristematice, apte de multiplicare. 'ptitudinea celulelor e%plantelor inoculate in vitro de a se dediferenia este foarte inegal rspndit la specii, organe i esuturi variate. =azele de dedifereniere celular pot fi caracterizate astfel6 ).prima faza de dedifereniere6 -amorsarea proceselor de dedifereniere: -producerea dediferenierii celulelor pn la dobndirea caracteristicilor citologice specifice unui esut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate asemntoare ca aspect i structur cu cambiul. +.a doua faz de dedifereniere6 - dediferenierea n continuare a celulelor pn la stadiul de celule cu caracter de meristem primar: -generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau meristemoizi "centre organogene#, ori de embrioni somatici, iar din acestea regenerarea de plante: -generarea, prin proliferarea celulelor dedifereniate, a unui calus neorganizat, structurat omogen. 9a nivelul acestui esut calusal se pot apoi forma meristemoizi sau centri embriogeni. 1. .* Re1ene"!"e! 0egenerarea este capacitatea organismelor vii de a-i reface oricare parte le-a fost distrus. &rin intermediul tehnicilor de cultivare in vitro a organelor, esuturilor sau celulelor vegetale se e%ploateaz la ma%im capacitatea regenerativ a celulelor e%plantelor, respectiv se pune n valoare manifestarea integral a totipotenialitii celulare. 8eoretic, toate celulele vii ale plantelor sunt totipotente. !in celule somatice sau obinut plante diploide, iar din celule generative, prin androgenez i ginogenez, sau regenerat plante haploide. Ca i n cazul dediferenierii celulare, se poate spune c i n regenerare e%ist o mare variabilitate n ceea ce privete reactivitatea celular, capacitatea regenerativ este manifestat sau nu de ctre o celul vegetal sau de un grup de celule n funcie de numeroi factori endogeni i e%ogeni. =actorii endogeni ce oac un rol esenial n regenerare sunt6 vrsta celulelor, gradul de difereniere, capacitatea de a se dediferenia, coninutul n hormoni, natura balanei hormonale i echipamentul enzimatic. =actorii e%ogeni implicai n regenerare

sunt6traumele i natura acestora "stresul datorat introducerii unui e%plant n cultura in vitro#, precum i condiiile de mediu. 8otipotena este deinut de ctre fiecare celul a plantelor dar e%primarea sa aparine numai anumitor tipuri de celule numite meristemoizi. 'cestea sunt celule competente morfogenetic n a rspunde la variai stimuli i care, n condiii specifice, pot da natere la tulpini, rdcini sau embrioni. >umrul celulelor dintr-o populaie cultivat in vitro care-i e%prim potenialul organogen sau embriogen se afl sub controlul mai multor factori. S-e#i!. 7%ist specii la care regenerarea are loc n special prin organogenez i specii care regenereaz prin embriogenez, dar i specii care pot regenera att lstari ct i embrioni in vitro. Gen($i-'&. S-a constatat c nu toate soiurile aparinnd unei specii cultivate au potenial regenerativ. 'stfel, s-au evideniat genotipuri ?culturabile@, ce au permis o regenerare uoar din orice tip de esut, dar i genotipuri recalcitrante, la care stabilirea unui protocol de regenerare s-a fcut cu mare dificultate i cu rezultate slabe. N!$'"! e2-&!n$'&'i. 9a unele specii "lucerna# toate tipurile de e%plante genereaz calus regenerativ. 9a altele ns obinerea plantelor in vitro este condiionat de utilizarea anumitor e%plante, de e%emplu la graminee numai embrionii imaturi, inflorescenele foarte tinere i microsporii genereaz calusuri regenerative. V3"%$! e2-&!n$e&(". Calusurile iniiate din esuturi tinere regenereaz mult mai bine dect cele provenite din e%plante mature. (n embriogeneza somatic direct, e%primarea totipotenei depinde de stadiul de dezvoltare al e%plantelor. Sunt capabile sa parcurg embriogeneza direct celulele embrionare, celulele epidermei hipocotilului, celulele nucelei i sinergidele. 'li factori care influeneaz regenerarea sunt6 starea fiziologic a plantei donor, compoziia mediului de cultur, vrsta culturii, temperatura, fotoperioada, intensitatea i calitatea luminii, stresul "biotic sau abiotic#. 1. .4 .("f(1ene5! in vitro (ntruct la culturile in vitro morfogeneza prezint aspecte particulare, specifice acestui tip de cultur, vom adopta termenul de morfogenez n sens larg iar n acest conte%t, vom descrie procesele de morfogenez sesizabile la nivelul e%plantelor cultivate in vitro, respectiv organogeneza i embriogeneza. Aibliografia e%istent pn n prezent subliniaz dependena capacitii morfogenetice de natura e%plantelor: pe de alt parte sunt numeroase referiri bibliografice care evideniaz relaia care e%ist ntre genotip i competena morfogenetic a e%plantelor cultivate in vitro. Basil "),*C# a considerat ca factor decisiv n meninerea capacitii morfogenetice, starea fiziologic i de dezvoltare a e%plantului. !eci, adeseori, stadiul de dezvoltare al plantei donatoare condiioneaz regenerarea i reacia e%plantului , altfel spus un rspuns morfogenetic corespunztor a fost obinut numai atunci cnd e%plantul a prezentat un anumit stadiu de dezvoltare. =olosirea unor e%plante mai tinere sau mai avansate n dezvoltare, fa de cel optim, adeseori s-a soldat cu formarea unui calus nemorfogen. 2orfogeneza la culturile in vitro este influenat, n mare msur de anumii factori6 -coninutul endogen n fitohormoni i aportul e%ogen de regulatori de cretere: -srurile minerale prezente n mediul de cultur "mai ales natura sursei de azot#: -natura i concentraia glucidului din mediul de cultur: -prezena n substrat a unor compui organici, n special al unor aminoacizi: -prezena, natura i concentraia gazelor "$+, C$+, C+.C# dizolvate n mediu sau e%istente n atmosfera din recipientele de cultur:

-prezena n substrat a unor e%tracte comple%e, de origine biologic, sau a crbunelui activ: -factorii fizici "lumina, temperatura#. !eci lumina, temperatura, potenialul osmotic al mediului, starea fizic a acestuia, tipul vaselor de cultur sunt factori care pot influena n sens negativ morfogeneza. >u se cunoate nc dac morfogeneza este influenat i n ce msur, de substanele introduse iniial n mediul de cultur sau de ctre comple%ul ionic, format n substrat, ca o consecin a autoclavrii, sau n ce msur schimbrile intervenite n compoziia mediului, sub aciunea inoculilor, afecteaz morfogeneza. ).+.C.) $rganogeneza in vitro $rganogeneza in vitro este un proces foarte comple% care depinde care depinde de o serie ntreag de fenomene biologice, aflate n antecedena momentului e%plantrii esuturilor. &n n momentul e%plantrii esuturilor, celulele viitorului e%plant au parcurs, mpreun cu sistemul crora le aparineau, anumite trepte ale ciclului vital, trepte n care diferitele cerine fiziologice au fost satisfcute, mai mult sau mai puin. !intre aceste cerine amintim raportul endogen n fitohormoni i coninutul endocelular n nutrieni, ambele fiind dependente de iluminarea plantelor, de temperatura mediului ambiant, de aprovizionarea cu sruri minerale. !e modul n care au fost asigurate aceste cerine, prealabile e%plantrii, vor depinde, n mare msur, reacia e%plantelor, capacitatea regenerativ i mai ales organogeneza la nivelul inoculilor, derivai din acestea. 'spectele menionate au fost foarte clar relevate, mai ales n cazul studiilor de embriogenez somatic i de nrdcinare a tulpinilor recalcitrante n a genera rdcini adventive. !e e%emplu, pentru inducerea nrdcinrii tulpinilor de Sequoia sempervirens sau a altor plante lemnoase, se impune un pretratament, de scurt durat, a lor cu soluie nutritiv, coninnd )-- mgDl '<A. Cu toate acestea, nici o tulpin nu a nrdcinat dac tulpinile au fost pstrate, pe o durat lung de timp, n acest mediu: rdcinie s-au difereniat i au crescut numai dup ce e%plantele caulinare au fost scoase i reinoculate pe un alt mediu, lipsit de au%in "8ei%eira, ),*)#. !in cele prezentate, s-a putut reine faptul c factorul endogen este dominant n obinerea unei anumite reacii i c pe lng operarea unei modificri n condiiile de incubare ale inoculilor, alegerea e%plantului constituie factorul determinant n evoluia acestora in vitro, n procesele de morfogenez. '.0izogeneza in vitro En anumit fragment e%plantat se comport, n linii mari, ca un minibuta. 7l difer de un buta normal, ntruct cel clasic deine bogate rezerve endogene, are muguri i eventual frunze. 2ugurii i frunzele pot i dup desprinderea fragmentului de planta mam s sintetizeze anumii compui hormonali. 7%plantul ns, din cauza dimensiunilor sale reduse i a detarii sale, nu mai beneficiaz de susineri pe care s le primeasc de la muguri sau de la frunze i rmne n totalitate dependent de mediul de cultur. (n acest caz factorul genetic, mrimea e%plantului vrsta plantei mam, starea fiziologic a celulelor pe care le deine, sunt tot atia factori care concur la evoluia ulterioar a inoculului. Eneori, ns, in vitro, se produce o pierdere a capacitii rizogene, mai ales ca urmare a practicrii unor repicri "subculturi# succesive. Se pune problema pstrrii sau a redobndirii capacitii rizogene. =actorii care condiioneaz meninerea acesteia i mai ales, cei care cauzeaz pierderea aptitudinii rizogene sunt n mic msur cunoscui.

9umina poate e%ercita un efect pozitiv asupra rizogenezei dar numai la o intensitate slab sau n urma unei perioade scurte de aciune "3-- luci mai puin de o orDzi#. 8emperatura optim pentru rizogenez este aceea de +3 oC. Eneori, ns, se recomand practicarea unei alternane ntre o temperatur sczut "1-)1 oC# i ridicat, n prezena luminii, a au%inei i a unui mediu bogat n glucide. (n cele mai multe cazuri, formarea rdcinilor este localizat polar. 0dcinile se formeaz la polul radicular al e%plantului, n timp ce generarea mugurilor este localizat la polul foliar. 'portul de au%in, n concentraie ridicat, poate perturba polaritatea. (n concentraii optime au%ina stimuleaz rizogeneza. A.Caulogeneza in vitro =ormarea de mugurai in vitro, denumit i caulogenez, respectiv formarea de centri vegetativi, este esenial atunci cnd se urmrete, de e%emplu, multiplicarea sau ?reconstituirea@ unei noi plante ori a unui genotip, generat prin hibridare somatic. <nducerea caulogenezei, a formrii de mugurai i tulpinie, la nivelul inoculilor cultivai in vitro, este stimulat de prezena n mediul de cultur a citochininelor, adeseori, n condiiile asocierii acestora cu au%inele. !e asemenea trebuie menionat i faptul ca formarea de mugurai la nivelul calusului se afl sub controlul interaciunii celor dou categorii de fitohormoni. 0euita formrii mugurailor presupune nu doar prezena celor dou tipuri de fitohormoni, ci i a realizrii unui anumit raport al crui eficien este variabil n funcie de specie, de proveniena i natura inoculului. Se poate spune deci, c nu este important doar raportul fitohormonal, ci i natura i concentraia compuilor utilizai ca regulatori de cretere. Eneori, se poate declana caulogeneza reducnd concentraia de au%in. 'lteori, cel mai mare numr de mugurai este atins atunci cnd se folosesc concentraii relativ ridicate de citochinin. !ar nu e%ist reguli general valabile. 'deseori fiecare e%perien reprezint un caz aparte, iar reacia e%plantelor, la balana hormonal din substrat, variaz mult, n dependen de tipul materialului vegetal. 9a calus, n inducerea caulogenezei, se obin, uneori, rezultate pozitive prin cultivarea succesiv a acestuia, ntr-o prim etap, pe un mediu fie cu o concentraie foarte ridicat de +,C!, fie n prezena unei au%ine mai slabe ca eficien, dar administrat n concentraie mare, asociat eventual cu o citochinin, n concentraie moderat. 'cest calus subcultivat pe un mediu cu aport sczut n au%in i cu un coninut ridicat n citochinin, ar putea conduce cu succes la declanarea procesului de nmugurire. =actorii e%terni "lumina, temperatura, calitile fizice ale mediului# sunt controversai n ceea ce privete efectele lor asupra caulogenezei. 'ciunea acestora depinde foarte mult de tipul inoculilor i de etapele parcurse anterior. Cu toate c numeroase specii necesit o anumit fotoperioad pentru inducie floral, n general se apreciaz c formarea de mugurai este independent de fotoperioad. 8emperatura recomandabil pentru desfurarea optim a proceselor de caulogenez este aceea de +1 oC. =olosirea alternativ a mediilor lichide i a celor solide poate e%ercita un efect benefic asupra producerii proceselor de morfogenez. 'stfel, la orhidee, se cunoate c meninerea protocormilor n stare submers favorizeaz multiplicarea acestora, dar este inhibat organogeneza. 8recerea protocormilor din mediu lichid pe mediu agarizat declaneaz organogeneza. !ac dup o perioad de meninere a protocormilor pe mediu agarizat "cteva sptmni# se submerseaz protocormii, prin acoperirea lor cu soluie nutritiv diluat, sau cu ap distilat steril, se reuete o stimulare a proceselor de organogenez "Cachi, ),*;#. 9a monocotiledonate capacitatea caulogen este mai moderat. 'ptitudinea cerealelor de a forma muguri in vitro este foarte variabil. 'deseori aceast capacitate, la nivelul

calusului, se pierde n timp, pe msura practicrii unor subcultivri succesive "mai ales la gru#. ).+.C.+ 7mbriogeneza somatic &rocesul de formare a embrionului, respectiv succesiunea fazelor de multiplicare celular i de histogenez finalizate cu formarea unui embrion se numete embriogenez. <ndiferent de tipul embriogenezei, punctul de plecare n formarea viitoarei plante este o unic celul. 7mbriogeneza somatic este fenomenul prin care din celule somatice iau natere embrioni. 'adar dintr-o celul a sporofitului, pe cale se%uat se pot genera embrioni care se aseamn foarte mult cu embrionii zigotici. 7mbrionii somatici sunt, deci, un rezultat al multiplicrii repetate a unei celule somatice i nu a unei celule a gametofitului sau a celulelor generative. 7mbriogeneza somatic in vitro a fost semnalat la morcov de ctre SteFard i colab. "),1*# i de ctre 0einert "),1*, ),1,#. (n inducerea embriogenezei somatice un rol important l-a avut adugarea n mediul de cultur a laptelui din nuc de cocos datorit citochininelor naturale, aflate din abunden n acest produs natural. &rin dezvoltarea tehnicilor de embriogenez somatic s-a reuit o cotitur n cercetrile de embriologie e%perimental. 'stfel, s-a putut stabili6 -capacitatea embriogen este coninut n fiecare celul, aparent banal i c aceast aptitudine nu este numai un apana al zigotului rezultat din fecundare: -embrionul n formare are un anumit grad de autonomie i nu este strict dependent de prezena unui anumit mediu constituit din albumen, aa cum este cazul la embrionul zigotic: -att embrionul zigotic, ct i cel somatic trec prin faze morfologice identice, tipice cunoscute n embriogeneza clasic i anume6 celula generatoare d natere la un masiv celular care, treptat sufer o succesiune de transformri denumite arbitrar stadiul globular, stadiul cordiform, stadiul de torpil sau torpedo. (n embriogeneza somatic prin izolarea i detaarea e%plantelor se realizeaz eliberarea celulelor din intercorelaiile fiziologice n care se aflau integrate, prealabil desprinderii lor din corpul plantei, moment n care se rup nu numai legturile trofice i fitohormonale avute, ci se sisteaz i eventuala prezen a factorilor inhibitori endogeni care prin represie biochimic controlau i blocau dezvoltarea haotic a celulelor unui organism. 1. .6 7!8i$'!i! %!' !ne"1i%+'& .abituaia sau anergismul este un fenomen fiziologic care se refer la totalitatea schimbrilor ereditare survenite spontan, la un moment dat, n raport cu cerinele de aprovizionare a celulelor cultivate pe medii aseptice: acestea privesc lipsa de reacie, de rspuns, a materialului biologic, la anumii fitoefectori, regulatori de cretere sau vitamine, prezeni n mediul de cultur. .abituaia nu se refer numai la reacia inoculilor n raport cu fitohormonii e%ogeni, ci privete o gam mai larg de probleme, unele dintre ele nencadrate nc n aceast categorie de manifestri fiziologice. 'stfel, e%plantul detaat, lipsit de punctul vegetativ "dominana apical#, trece prin transformri particulare, specifice noii stri fiziologice. Celulele sale, devenind autonome, pot prezenta un comportament deosebit "Gautheret, ),*-#. 2ecanismul habituaiei este nc necunoscut. Se tie doar c, e%ist anumii factori de mediu care favorizeaz instalarea acestor fenomene. !intre ei amintim6 au%inele "mai ales +,C!# i temperaturile ridicate.

1. .9 Vi$"ifi#!"e! %!' %$i#&(5i$!$e! =enomenul de vitrificare sau sticlozitate este un proces de transparentizare a frunzelor i tulpinilor i a fost semnalat la culturile de salat n ser "Gautheret, ),*-#. Se apreciaz c, n cazul acestui fenomen, n anumite condiii "cum ar fi e%ces de umiditate#, organele aeriene ale plantelor devin translucide ca o consecin a infiltrrii apei n spaiile intercelulare, nlocuindu-se aerul din ele. (n condiii aseptice, plante vitroase pot s apar brusc. 7le sufer transformri morfofiziologice, frunzele lor recurbndu-se, devenind translucide, sticloase, rugoase, uneori ondulate i casante, prezentnd o cretere malformat, hipertrofiat. 'spectul general este degenerat. Studiile amnunite asupra structurii frunzei au artat c frunza nu are celulele difereniate n cele dou esuturi, palisadic i lacunar. 2eristemele lstarilor vitrificai sunt mai mici dect la cei normali. Celulele sunt mult hidratate i conin clorofil mai puin. S-a constatat c prin adugarea crbunelui vegetal n mediul de cultur se elimin sau se reduce foarte mult procesul de vitrificare. !e asemenea ridicarea concentraiei de agar la )),)H reduce vitrificarea "$rli4oFs4a, ),*1#. Concentraii mai mari de -,*H de agar duc ns la scderea ratei de multiplicare i de aceea este foarte dificil de mbinat cele dou aspecte.

CAPITOLUL II .1 FENO.ENE FIZIOLOGICE CORELATE CU REALIZAREA UNEI CULTURI IN VITRO

8ehnicile de cultur in vitro folosite n cercetare sau pentru producerea de plante, pornesc de la aceeai premiz6 posibilitatea de a controla ntr-un mod optim factorii de mediu "temperatur, lumin, compoziia mediului de cultur, p., umiditate# necesari fragmentului de plant inoculat n condiii artificiale de mediu, n ncercarea de a analiza funciile sale fiziologice sau de a-l conduce ntr-o anumit direcie, cum ar fi formarea de noi lstari "micropropagarea#. 8ehnicile de cultur in vitro, pe lng aspectul tehnologic, ne permit rezolvarea unui numr de probleme6 -meninerea unui e%plant viabil i activ din punct de vedere vegetativ: -permiterea creterii normale a unui e%plant reprezentat de o structur organizat "meristem, vrf de cretere sau mugure#: -inducerea proceselor de difereniere n cazul unor fragmente de calus pentru formarea de organe sau embrioni somatici: -inducerea proceselor de dedifereniere, n cazul unor e%plante formate din celule difereniate "fragmente de tulpin, frunz, peiol, rdcin, etc.# rezultnd o nou organizare tisular: -inducerea proceselor de diviziune celular, valabil tuturor cazurilor amintite mai sus. 'ceste probleme au fost parial rezolvate odat cu identificarea regulatorilor de cretere endogeni de tipul au%inelor "primul grup de fitohormoni recunoscut#, giberelinelor, citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de cretere. 'ceste substane par a determina orientarea dezvoltrii celulelor n cultura artificial, fapt pentru care li se acord prima atenie atunci cnd se ncearc e%plicarea unor fenomene fiziologice.

.1.1 Re1'&!$("ii ,e #"e:$e"e 7%istena hormonilor vegetali a fost bnuit nc de la nceputul secolului trecut. >umeroase lucrri tiinifice privitoare la aceste subiect au evideniat prezena lor, dar nu leau putut identifica dect mult mai trziu. &rimii fitohormoni descoperii au fcut parte din clasa au%inelor, n urul anului ),;C, giberelinele i citochininele fiind descoperite mai trziu, n anii I1-. 'ceste trei tipuri de regulatori de cretere e%ercit o aciune stimulativ asupra metabolismului celular. 7%ist i substane cu efecte inhibitoare asupra creterii i dezvoltrii celulelor vegetale cum ar fi acidul abscisic, identificat n anul ),31 i substanele fenolice identificate civa ani mai trziu. !e asemenea, etilena, un compus gazos, a fost recunoscut ca regulator de cretere atunci cnd metodele de msurare a acesteia au permis detectarea sa n organele plantelor. 7tilena poate avea fie efect stimulator, fie efect inhibitor asupra plantelor. 'ceste substane sunt endogene, ceea ce nseamn c sunt sintetizate de plante. 7%ist i fitoregulatori de cretere artificiali cu formule chimice asemntoare celor naturali, prezentnd o aciune fiziologic similar. 8oate aceste substane, sintetice sau naturale, sunt numite regulatori de cretere i au anumite caracteristice comune6 -acioneaz ntr-o concentraie foarte mic, n concentraie mare sunt to%ice, de aceea unele dintre ele sunt folosite ca erbicide: -acioneaz numai n interaciune cu ali fitoregulatori, funcia lor fiind determinat de balana hormonal stabilit ntre ei: -intervin ntr-un numr de fenomene fiziologice ce implic mai multe moduri de aciune astfel nct noiunea de hormon "cu un efect rizogenic sau caulogenic specific# a fost abandonat. $ diferen substanial ntre fitoregulatorii de cretere artificiali i cei naturali const n faptul c cei endogeni pot fi controlai de mecanismele metabolice ale celulelor fiind eliminai suficient de repede, pe cnd cei artificiali persist mult mai mult fiind deseori preferai aplicaiilor practice. .1.1.1 A'2ine&e 'u%inele au fost descoperite n urma unor e%perimente asupra coleoptilului la Gramineae. >umele de au%ine provine din grecescul au%ein 5 a crete, determinnd elongarea celulelor "au%esis 5 cretere ce se refer n special la mrimea celulei dect la numrul de celule#. 7ste un compus ce are la baz nucleul indolic cu formula de baz C)-.,$+> cunoscut sub numele de acid J- indolil acetic "=ig.)#.

=ig.) 'cidul J- indolil acetic '. &roprietile fiziologice ale au%inelor

'u%inele intervin n multe fenomene fiziologice, iar aciunile lor depind de concentraiilor i de interaciunile cu ali regulatori de cretere. Studiind cteva din efectele lor s-a putut concluziona c6 -e%ercit o aciune clar asupra elongrii celulare, aceste efect urmeaz creterii plasticitii peretelui celular i penetrrii apei n celul. 'poi rezistena peretelui scade i celula crete n lungime: -modific permeabilitatea membranei plasmatice, ceea ce duce la o descrcare de ioni de .K, determinnd o cretere a aciditii responsabil de diminuarea rezistenei peretelui celular i o absorbie de ioni de /K: -influeneaz n general metabolismul celular i n particular sinteza '0>-ului ribozomal "ribozomii particip la sinteza proteinelor#: -stimuleaz diviziunea celulelor cu origine cambial "acest tip de aciune a determinat insuccesele din primele ncercri de iniierea a culturilor in vitro#: 'cest efect este descris ca histogenic deoarece conduce la formarea unui numr de celule asemntoare, numite calus: -acioneaz asupra sintezei etilenei ntr-o anumit concentraie, etilena intervine n schimb n reglarea nivelului de au%in cel puin la nivelul vaselor conductoare: -acioneaz asupra tropismului plantelor i asupra corelaiei dintre organe, n particular asupra fenomenelor de dominan apical: -determin ntrzierea cderii frunzelor i a fructelor: -au aciune rizogenic fiind folosite n special n micropropagarea speciilor ornamentale destinate comerului de flori tiate: 'ceste efecte numeroase nu pot rezulta doar din aciunea singular a au%inei deoarece concentraia optim este diferit pentru fiecare tip de aciune n parte i se schimb n funcie de concentraia celorlali fitoregulatori. 2odul de aciune al au%inelor. >u se poate da un rspuns precis, dar cercetrile n domeniu au evideniat e%istena unor receptori fie membranari, fie citoplasmatici specifici au%inei. &e baza acestei ipoteze au rezultat urmtoarele concluzii6 -n funcie de prezena sau absena unuia sau a celuilalt receptor apar diferene de reacie n concordan cu originea celulei ce reacioneaz la acest fitohormon: -n funcie de afinitatea receptorului pentru au%in unii sunt angrenai mai repede dect alii. 'u fost descoperii receptori i pentru alte tipuri de fitoregulatori de cretere, de aici se poate e%tinde ideea e%istenei de receptori pentru toate tipurile de regulatori endogeni. A. 'u%inele n plante 8oate plantele sintetizeaz au%ine, sintez modulat de stadiul de dezvoltare ale acestora. Sinteza au%inelor are loc la nivelul frunzelor tinere, a mugurilor i n florile i fructele tinere. 'u%inele circul de la vrful spre baza organelor cu o polaritate puternic pronunat n organele tinere, dar n cursul transportului lor sunt descompuse de au%in-o%idaze, ceea ce nseamn c au%inele sunt n concentraie mai mare n apropierea situsurilor de sintez. 'stfel, au%inele sunt prezente ntr-o concentraie suficient n vrful plantelor n cretere, n mugurii florali sau foliari, pentru a asigura multiplicarea i elongarea celulelor. C. 'u%inele sintetice !e cnd au fost identificate au%inele, s-au sintetizat compui chimici similari acestora, care au generat n celulele vegetale efecte similare au%inelor endogene, ceea ce confirm

e%istena receptorilor pentru au%ine. 2ai mult, fiind influenai mai puin de activitatea au%inenzimelor , vor putea avea un efect prelungit n plante. &rintre numeroasele substane folosite, cele mai importante sunt6 -acidul.indolil butiric "'<A#: -acidul naftalen acetic "'>' 5 =ig.+# i derivaii si6 acidul naftoo%iacetic "'>$'# i naftilacetilamida ">'!#: -acidul +,C diclorfeno%iacetic "+,C !#.

=ig.+ 'cidul naftalen L-acetic (n practic, au%inele endogene pot fi folosite, fiind mai puin to%ice dar i mai puin eficiente deoarece activitatea acestora este rapid inhibat de aciunea au%in-o%idazelor. !e aceea produsele sintetice le-au luat locul chiar dac implic un risc mai mare de to%icitate. (n aplicaiile agricole, compuii au%inici sunt folosii pentru cicatrizarea rnilor rezultate n urma tierilor anuale din pomicultur, n evidenierea fructelor partenocarpice sau pentru ntrzierea cderii frunzelor sau a fructelor pn la recoltare, ca urmare a efectului invers e%ercitat de acidul abscisic. Mi n domeniul culturilor in vitro se folosesc aceleai substane urmrindu-se n principal efectele rizogenice i de multiplicare a celulelor pe care acestea le genereaz. .1.1. Gi8e"e&ine&e 'semeni au%inelor, efectul giberelinelor a fost evideniat nainte ca acestea s fie identificate. &rimele observaii "),+3# au fost fcute pe plante de orez atacate de o ciuperc "Giberella fujikuroi# care prezentau internoduri mult elongate i frunze clorotice. 7%tractul apos din ciuperc a provocat simptome similare la plantele testate, ceea ce a condus la ideea e%istenei unei substane responsabile de aceste efecte. &rima giberelin identificat a fost acidul giberelic sau G'; "un comple% izolat n ),;, i numit ?giberelina '@#. 'ceast prim descoperire a fost urmat de descoperirea altor gibereline pn cnd n plante i n ciuperci au fost identificate n total apro%imativ cincizeci de gibereline. 'cetia sunt toi compui endogeni. (n practic, giberelinele folosite sunt e%tracte purificate. Cea mai folosit giberelin este G'; "=ig.;# i mai puin folosite sunt amestecul G'CKG'N sau G'N. 7ste posibil ca n urmtorii ani s fie folosite gibereline sintetice, avnd n vedere c primele gibereline sintetice au fost obinute prin anii I*-.

=ig.; 'cidul giberelic 8oi aceti compui au un nucleu similar "nucleul giberelic# diferind doar prin calitate i poziia substituenilor n nucleu. '. &roprietile fiziologice ale giberelinelor &roprietile fiziologice ce urmeaz a fi descrise corespund acidului giberelic "G';#. >u toate giberelinele au activitate similar, unele sunt inactive sau doar forme intermediare, ceea ce le face dificil de studiat, iar mai mult, nu toate plantele posed aceleai gibereline. &rincipalele proprieti ale acidului giberelic sunt6 -acioneaz asupra elongrii internodurilor, uneori determinnd rezultate spectaculoase "e%6 s-au obinut plante de varz cu tulpina de ; m#, dar nu asupra tuturor speciilor. !oar unele dintre varietile pitice ale unor specii pot atinge talii normale n urma aplicrii de G';, n general varietile pitice nu reacioneaz la efectul de elongare al acidului giberelic. 'cidul giberelic acioneaz i asupra pedunculilor florali, mpiedic maturizarea timpurie "cu )1 pn la +- de zile la Cyclamen# sau alungirea inflorescenelor prea dezvoltate "e%6 la viele de vie cu ciorchini deni, acidul giberelic a inhibat dezvoltarea racemelor la%e#: -n cultura in vitro giberelinele acioneaz i la nivelul meristemelor, care, n absena acestora, prezint un aspect globular: -stimuleaz metabolismul celular deoarece favorizeaz sinteza enzimelor hidrolitice. S-a dovedit c la seminele de orz, acumularea L-amilazei, o enzim cu rol n transformarea amidonului n zaharuri solubile, este datorat acidului giberelic, care acioneaz direct sau dup asocierea cu un receptor. Giberelinele acioneaz, de asemenea, n prezena au%inelor, i sunt deseori stimulate de sinteza sau inhibarea sintezei au%in-o%idazelor: -acioneaz asupra nfloririi, avnd ca efect fie inhibarea inducerii florale, cum ar fi cazul pomilor fructiferi, sau stimuleaz nflorirea speciilor ce necesit temperaturi sczute pentru a nflori, astfel nct n prezena giberelinelor aceste specii nfloresc i fr temperaturi sczute "morcov#. 9a alte specii, ce necesit de asemenea temperaturi sczute pentru nflorire, prezena giberelinelor induce doar alungirea tulpinii fr formarea florilor "sfecl#. 'ceste contradicii n aparen au o e%plicaie simpl6 n plantele prezentate mai sus frigul acioneaz doar asupra creterii tulpinii, pe cnd n cellalt caz asupra procesului de nflorire. 'stfel, giberelinele, i e%ercit doar rolul de stimulatori ai elongaiei neinfluennd, n acest caz, procesele fiziologice normale: -acioneaz asupra formrii fructelor partenocarpice la pr, mandarin, prun: -e%ercit o aciune comple% asupra germinrii seminelor sau pornirii n vegetaie a mugurilor dorminzi, atunci cnd condiiile climaterice "temperaturi sczute# nu permit acest lucru, inducnd i ramificarea sau creterea ramurilor la Hydrangea: -n organogenez, aciunea giberelinelor poate fi antagonic. &ar a se opune fenomenului de dedifereniere, neputnd fi folosite in vitro n acest scop, acionnd ns

asupra meristemelor apicale sau a%ilare i asupra butonilor florali, prin stimularea creterii i dezvoltrii acestora. A. Giberelinele n plante Giberelinele au fost descoperite att n plante ct i n ciuperci cu o distribuie inegal. Enele gibereline se pot ntlni doar n plante, altele doar n ciuperci i unele n ambele grupe "acizii giberelici ),;,C,N,,#. Enele plante posed doar un fel de gibereline, n alte specii se afl i acioneaz mai multe tipuri de gibereline. 9ocurile de sintez a giberelinelor se afl la nivelul frunzelor foarte tinere, n mugurii foliari i florali, n lstarii activi, n vrful rdcinilor i n embrioni. Giberelinele circul liber prin plant fr e%istena unei polariti fiind asociate deseori zaharurilor, eliberndu-se n situsurile int. .1.1.* Ci$(#;inine&e Citochininele au fost descoperite n timpul studiilor efectuate asupra esuturilor vegetale cultivate in vitro. S-a descoperit i acum este bine cunoscut faptul c adiia de lapte de nuc de cocos n mediile artificiale de cultur are un efect favorabil asupra multiplicrii celulare i n lstrire. Cercetrile ce au ncercat s descopere factorul responsabil de aceste efecte au dus la izolarea unui comple% chimic activ de natur purinic, care nu a putut fi iniial identificat. 'ceste rezultate au dat posibilitatea continurii cercetrilor asupra purinelor i n ),13, S4oog a izolat, din '0> denaturat, o substan activ numit ?chinetina@. Citochininele sunt nlocuitori ai adeninelor la care sunt cunoscui doi compui endogeni6 -zeatina "=ig.C# -izopenteniladenina, a crei compui sintetici sunt6 chinetina "/in 5=ig.C# "3furfurilaminopurina# i benziladenina "A'&# "3-benzilaminopurina#.

a# b# =ig.C Citochinine6 a# zeatina, b# 4inetina Se mai folosesc i ali nlocuitori ai adeninelor, sintetici, liberi sau n asociere cu zaharuri. '. &roprietile fiziologice ale citochininelor Citochininele sunt foarte active n plante i asemeni celorlalte dou clase de fitohormoni prezentate anterior au o serie de proprieti dintre care6 -au un efect foarte clar asupra diviziunii celulare. (n acest proces citochininele sunt indispensabile, dar ineficiente fr aciunea au%inelor, cele dou complementndu-se reciproc. 'u%inele favorizeaz duplicarea '!>, iar citochininele permit separarea cromozomilor: -au un rol la fel de important n organogenez stimulnd formarea lstarilor, fiind ns antagonice rizogenezei:

-e%ercit un efect de stimulare a metabolismului celular, favoriznd sinteza proteinelor, prin rolul ce-l oac n compoziia '0>-ului de transfer i prote nd metaboliii de aciunea enzimelor hidrolitice. 'cest efect determin ntrzierea senescenei pn la punctul n care frunzele mature tratate cu citochinine se comport asemntor celor tinere din punct de vedere metabolic: -e%ercit un efect antagonic asupra dominanei apicale stimulnd lstrirea a%ilar: Citochininele prezint o importan deosebit n domeniul culturii in vitro deoarece au permis obinerea unor progrese importante n micropropagarea plantelor. &roprietile citochininelor permit rezolvarea dificultilor enumerate mai sus, cum ar fi meninerea viabilitii celulelor vegetale, stimularea diviziunii celulare, orientarea celulelor spre dedifereniere. A. Citochininele n plante &rima citochinin endogen a fost identificat n ),3; n embrioni imaturi de porumb, de unde i numele de zeatin, urmat de izopentenil adenina "<&'#, descoperit puin mai trziu n plante atacate de bacteria Corynebacterium fasciens. 8oate plantele conin citochinine sintetizate n special n rdcini i n embrioni. 'plicarea citochininelor pe frunze determin atragerea substanelor nutritive spre aceste zone datorit efectului de stimulare a metabolismului e%ercitat de citochinine la acest nivel. Creterea n dimensiuni a tuberculilor i fructelor se datoreaz prezenei citochininelor endogene localizate n aceste organe. Citochininele se pot asocia cu zaharurile i circula prin plante fr polaritate. Se presupune ca ele circul ntr-o form inactiv i c rmn localizate la anumite nivele unde vor fi activate ulterior, ca n cazul aplicaiilor pe frunze. .1.1.4 E$i&en! 7tilena "fig.1# este un compus gazos identificat cu mult timp n urm n ncperile de depozitare a fructelor sau plantelor, dar funcia sa de regulator de cretere nu a fost evideniat pn n momentul dezvoltrii tehnicilor de analiz n plante. 7tilena se afl n plante n cantiti infime i poate fi produs de toate prile acesteia.

=ig.1 7tilena &rincipalele proprieti ale acestui regulator de cretere sunt6 -determin iniierea procesului de maturare a fructelor, etilena fiind folosit la nceput pentru coacerea fructelor la lmi, iar acum pentru determinarea coacerii simultane a fructelor la mr i cire: -accelereaz procesele de cdere a frunzelor i fructelor, fiind folosit atunci cnd se urmrete recoltarea mecanizat a fructelor la cirei i mslini: -induce formarea florilor la speciile familiei Bromeliaceae "ananas#, o proprietate folosit n horticultur: -modific ritmul de cretere prin aciunea pe care o e%ercit asupra polaritii transportului au%inelor: -are aciune favorabil asupra tuberizrii. 'ceste proprieti au unele puncte comune cu au%inele "nflorirea Bromeliaceaelor, corelaii de cretere# iar unele antagonice "cderea frunzelor i fructelor, tuberizarea#.

'ciunea antagonic a etilenei pare a depinde de interaciunea dintre cele dou substane ce pot controla sinteza, concentraia i circulaia lor. 'plicaiile practice ale etilenei, dificil de utilizat n starea sa gazoas, au fcut progrese doar dup descoperirea acidului +-cloro-etan fosforic. 'cest produs, aplicat prin pulverizare penetreaz esuturile, unde se elibereaz etilena. 8oate prile plantelor sunt capabile s sintetizeze etilena, ns cantitatea cea mai mare se sintetizeaz n fructe, apoi ntr-o concentraie mai mic n flori i organe rnite. .1.1.6 In;i8i$("i !i #"e:$e"ii 2ulte substane au efecte inhibitoare asupra creterii plantelor, printre substanele endogene enumerndu-se compuii fenolici i acidul abscisic.

'. <nhibitorii fenolici <nhibitorii fenolici, ntr-un numr mare n plante, inhib metabolismul i intervine n multe procese fie ca antagonici ai regulatorilor de cretere, fie ca inhibitori ai reaciilor metabolice. 7i intervin n inducerea strii de laten a mugurilor i seminelor, la nceput prin ncetinirea creterii acestora urmat de stoparea total a acesteia. >u se tie e%act rolul i mecanismul lor n inducerea strii de laten. (n culturile in vitro aceti compui sunt deseori sintetizai i eliberai n mediul de cultur, unde se o%ideaz cauznd brunificarea mediului ceea ce duce deseori la moartea e%plantelor, de aceea n unele medii de cultur se utilizeaz substane anti-o%idante sau adsorbani pentru a deto%ifia mediul. 7%ist cteva e%emple referitoare la folosirea substanelor fenolice n cultura in vitro, cum ar fi utilizarea florizinei pentru inducerea nrdcinrii la altoii de mr. A. 'cidul abscisic 'cidul abscisic "fig.3# a fost identificat n ),31 i de atunci a fost descoperit n toate plantele. 'cest inhibitor pare s fie sintetizat de fiecare dat cnd o plant este supus unor condiii stresante "lipsa apei, rnire, cldur e%cesiv#. 7%istena acidului abscisic n celule este una din cauzele crora plantele supuse unor factori stresani i ncetinesc activitatea metabolic. (ncetinirea activitii plantelor este reversibil atunci cnd condiiile de stres sunt trectoare i poate induce starea de laten sau chiar decesul plantei atunci cnd condiiile nefavorabile sunt prelungite.

=ig.3 'cidul abscisic &roprietile acidului abscisic sunt similare celor ale compuilor fenolici. 'stfel, cele mai importante proprieti ale acidului abscisic sunt6

-aciune favorabil asupra cderii frunzelor i fructelor: -determin creterea permeabilitii celulelor fa de ionii de potasiu, ceea ce poate influena nchiderea stomatelor: -acioneaz asupra nfloririi. 'plicarea acidului abscisic la plantele de zi scurt cultivate n condiii perfecte de periodism, poate inhiba complet nflorirea acestora "Volubilis# sau inhiba parial "C enopodium rubrum#, sau chiar stimula nflorirea "!lumbago#. (n cazul n care plantele de zi scurt sunt supuse unor condiii de zi lung poate induce nflorirea unora dintre specii i inhibarea altora. 'plicat asupra plantelor de zi lung, acidul abscisic poate inhiba nflorirea atunci cnd plantele sunt supuse unor condiii normale de fotoperiodism "spanac, "olium temulentum#. 'ceste observaii pot conduce la supoziia c nopile lungi favorizeaz sinteza acidului abscisic, dar aceast supoziie este prea simpl pentru e%plicarea modului diferit de aciune a acidului abscisic. 'cidul abscisic este foarte puin folosit n culturile in vitro, i n funcie de speciile folosite i de condiiile de cultur utilizate poate induce reacii foarte diferite i greu de interpretat. C(n#&'5ii 0egulatorii de cretere endogeni sunt prezeni n plante pe tot parcursul vieii acestora, dar prezena acestora nu este constant. Concentraiile lor se schimb n cursul diferitelor stagii fiziologice i sunt diferite pentru fiecare parte a plantei, pentru aceeai etap fiziologic. Bariaia continu n plante a coninutului n regulatori de cretere determin problemele legate de alegerea momentului de recoltare a e%plantului. 8ehnicile de cultur in vitro pot fi controlate de echilibrul fitohormonal, dintre care cele mai importante sunt au%inele i citochininele. 0aportul citochinin5au%in influeneaz procesele fiziologice din e%plante, determinnd evoluia acestora n diferite sensuri n funcie de concentraia celor doi fitohormoni. 'stfel, dup S4oog, comportamentul fiziologic al e%plantelor va fi6 -dac raportul au%ine 5 citochinine este mare, se induce rizogeneza: -dac raportul este subunitar se induce lstrirea, e%plantele tind spre o funcionare caulogenic: -dac raportul este apropiat de unitate, e%plantele au tendina s genereze formaiuni calusare. 'ceast schem general este ntotdeauna valabil, chiar dac e%ist variaii n funcie de tipul de e%plant i mai ales n funcie de specia luat n cultur. &e lng aceti fitoregulatori principali e%ist i ali regulatori de cretere ce s-ar putea dovedi indispensabili, dar n cele mai multe cazuri acetia au doar rol stimulator sau favorizant i rareori esenial.

. ALEGEREA E/PLANTULUI
Celulele vegetale vii au capacitatea potenial de a intra n diviziune i de a reproduce un individ ntreg similar plantei donor. 'ceast capacitate denumit ?totipotena celular@, indic faptul c fiecare celul deine toate informaiile necesare regenerrii unei plante ntregi, proprietate ce este tot mai mult e%ploatat n culturile in vitro. Chiar dac toate celulele au totipoten nu este uor, cel puin pentru moment, s se foloseasc n practic aceast calitate, ns cu ct cercetrile avanseaz, cu att numrul acestora va crete. 7ste mai uor de ales un grup de celule, de e%emplu un e%plant, capabil s reacioneze n condiii artificiale de cultur unde s evolueze spre multiplicare clonal mai mult sau mai puin semnificativ n funcie de rspunsul obinut. 2icropropagarea face posibil obinerea

de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mam, ns uneori este i surs de variabilitate genetic atunci cnd e%plantul este supus anumitor condiii. (nainte de a decide criteriile de selecie ale unui e%plant este necesar cunoaterea evoluiei fiziologice ce va a uta la nelegerea diferenelor dintre comportamentul celulelor unui segment de plant atunci cnd este detaat de planta mam. . .1 E$!-e&e fi5i(&(1i#e !&e 'nei -&!n$e (n conte%tul reproducerii se%uate se poate preciza, ntr-o manier simplist, c ciclul de via al unei plante se mparte n patru stadii principale. '. 7mbriogeneza 7mbriogeneza ncepe cu fecundarea unei oosfere de ctre un anterozoid. $ul astfel format este prote at de ovul unde ncepe s se divid. Celulele se organizeaz la nceput ntr-o mas sferic "faza globular a embrionului#, apoi se dezvolt forme simetrice reprezentnd cotiledoanele rudimentare "faza cordiform a embrionului dicotiledonat# dup care se dezvolt structurile cotiledonare, hipocotilul, gemula i radicula "stadiul de torpedou al embrionului#. !e la acest stadiu ncepe diferenierea celular. Specializarea celulelor este nc foarte puin datorat unei funcionri programate i mai mult datorit unui program genetic ce se va pstra i n celulele mature ce n anumite condiii se vor comporta similar unor celule gametice, dnd natere unor organe sau embrioni, de aceast dat somatici. (n momentul de fa, nu se cunoate pe deplin mecanismul diferenierii celulare. Se presupune c poziionarea celulelor n relaie cu celelalte celule, dar i cu mediul de cultur, determin un schimb de semnale biochimice, ce moduleaz funcionarea fiecrei celule. (n conte%tul ipotezei mai sus menionate, diferenierea celular intervine ca urmare a dou cauze6 pe de o parte, datorit ereditii genetice a celulei "fiecare celul are acelai echipament informaional genetic#, n care acioneaz programul embriogenic, iar pe de alt parte, datorit poziionrii specifice a celulei care va fi recunoscut de structurile membranare. 'ceste structuri filtreaz informaiile i permit sau mpiedic circulaia unuia sau altui semnal capabil s modifice programul informaional spre un anumit tip de celul. Sfritul acestei prime etape este marcat, n general, dup ce substanele sunt depozitate n albumen sau cotiledoane, de deshidratarea seminei, ce induce intrarea embrionului n starea de laten. Seminele pot fi apoi diseminate, putndu-se pstra i rezista condiiilor nefavorabile din mediul ncon urtor. A. Stadiul vegetativ Cnd condiiile e%terne sunt favorabile i starea de laten este ntrerupt seminele germineaz i din embrion ia natere o nou plant. !e creterea plantelor sunt responsabile dou tipuri de meristeme6 meristemul caulinar ce determin creterea prii aeriene a plantei i meristemul radicular, ce determin creterea prii subterane a plantei. 2eristemul caulinar are o structur bine definit, fiind alctuit dintr-o parte e%tern, epiderma de dou sau trei straturi numit tunica, i o parte intern sau corpus. (ntr-o seciune transversal se poate observa o parte apical unde celulele au o activitate mitotic redus, ncon urat de un inel de celule aflate n diviziune activ, celule responsabile de creterea tulpinii. !iviziunea ncepe de la inelul iniial6 zona epidermal difereniaz n frunze rudimentare spre e%terior, iar spre interior n parenchim cortical i vase conductoare. Centrul este umplut de meristemul medular. 2eristemul caulinar are o funcionare ritmic programat genetic cu o precizie aflat, n primul rnd, n aran amentul filota%ic al frunzelor "distribuie

corespunztoare unei simetrii particulare fiecrei specii# i, n al doilea rnd, n forma frunzelor. Se remarc aici c florile ce permit identificarea i clasificarea plantelor se bazeaz aproape e%clusiv pe caracterele morfologice. <poteza prezentat mai sus privitoare la diferenierea celulelor n interiorul embrionului poate fi luat n considerare similar celei privitoare la meristeme. 9a nceput, plantula este hrnit din rezervele nutritive aflate n endospermul seminei, primele frunzulie, deseori conturate n interiorul embrionului, sunt diferite de frunzele adulte, fiind cunoscute sub denumirea de frunze uvenile. &lanta crete i devine capabil s se hrneasc singur, rdcinile transport spre frunze srurile minerale i compuii organici odat cu regulatorii de cretere. (n schimb, rdcinile primesc de la frunze substane nutritive bogate n glucozide, vitamine i de asemenea n regulatori de cretere. 'ceste schimburi stau la baza construirii scheletului unei plante, stabilind corelaii de cretere ntre sistemul aerian i cel subteran al plantei.

=ig.N 2eristem apical Corelaiile, specie specifice, vor favoriza dezvoltarea unuia sau a altui mugure caulinar, ceea ce va conduce la dezvoltarea formei specifice fiecrei plante "arbore, tufi, tulpini ntortochiate sau mprtiate, etc#. 'ceast arhitectur poate fi modificat prin curarea de uscturi sau ramuri nefolositoare, prin conducerea ramurilor sau prin aplicarea regulatorilor de cretere. (n contrast frunzele i menin forma.

=ig.* 2eristem radicular

'ceast diferen indic faptul c principalele corelaii implic, n general, informaii despre ntietatea mugurilor, care e controlat mai degrab de fenomene de cretere relative dect de motenirea genetic. Stadiul vegetativ dureaz, n funcie de specie, de la cteva sptmni la cteva luni pe an, un an pentru plantele bienale sau mai muli ani pentru cele perene. (n ultimul caz, sistemul vegetativ va fi construit pe parcursul mai multor sezoane, perioadele de cretere alternnd cu cele de repaus. 'ceast succesiune, care reflect adaptarea plantei la climatul mediului ncon urtor, este determinat de stimulrile sau inhibrile reliefate ca rspuns la variaiile condiiilor de mediu "temperatur, lumin, secet, umiditate, etc#. &lantele ce intr n perioada de laten i sisteaz creterea, substanele glucizidice nefolosite sunt pstrate n rezerve, iar frunzele speciilor lemnoase cad, sau prile aeriene ale plantelor ierboase se usuc. 'tunci cnd revin condiiile favorabile "latena mugurilor este indus de obicei de temperaturile sczute# rencep creterile, formarea frunzelor i a prilor aeriene. C. Stadiul reproductiv Stadiul reproductiv este marcat de modificrile de ritm n funcionarea meristemului caulinar. <nelul iniial nceteaz progresiv s mai funcioneze i se observ c celulele centrului latent intr n diviziune activ iniiind formarea florii sau a inflorescenei. !iferenierile ncep la margini unde se formeaz staminele i prile fertile ale plantei6 staminele i pistilul. =lorile angiospermelor sunt considerate lstari modificai constituite dintr-un a% central i ane%ele sale sterile "periantul# sau fertile "staminele i pistilul#. 'ceste nou program este la fel de precis ca i precedentul i se presupune c mecanismele de difereniere sunt similare. <nstalarea strii generative este progresiv i la nceput poate fi reversibil, n unele condiii este posibil s se revin la starea vegetativ. 2odificrile modului de aciune pot fi controlate fie de plant i n aceste condiii variaiile climatice nu au nici un efect, fie de variaiile climatice "temperatur, lumin, umiditate#, caz n care planta percepe aceste variaii i drept rspuns emite stimuli ce vor direciona meristemul spre stadiul reproductiv. 9a unele specii, e%istena un timp ndelungat a condiiilor nefavorabile de mediu poate duce la mpiedicarea nfloririi. =loarea constituie ultimul stadiu n viaa unui meristem, asigurnd prin fertilizare, continuitatea speciei. 9a unele specii perene ierboase unele meristeme terminale nu pot induce formarea florilor. 'ceast caracteristic permite plantei s supravieuiasc mai muli ani "Saintpaulia, cerenelGeum urbanum, cpun, etc#. !ac aceste meristeme sunt induse artificial s nfloreasc, plantele nfloresc i mor comportndu-se asemeni unei plante anuale. Cercetrile asupra naturii stimulilor ce acioneaz asupra meristemelor florale nu sunt concludente, tiindu-se doar c intervin unii fitohormoni dar i alte substane. Se pot cita cteva modele de culturi in vitro, n care, variind componentele mediului de cultur i proporia fitoregulatorilor de cretere s-au putut obine meristeme caulinare, radiculare sau chiar reproductive. !. Stadiul de senescen Stadiul de senescen urmeaz stadiului reproductiv la plantele anuale deoarece meristemele sunt la sfritul vieii lor, fructificarea epuiznd rezervele, rdcinile nu mai hrnesc planta n mod normal, schimburile de substane nutritive se reduce i plantele se pregtesc de iernare. 9a speciile perene, aceast etap ncepe prin ncetinirea funciilor rdcinilor odat cu debilitarea ntregii plante, ce devine mult mai sensibil la toate tipurile de atac. >u este imposibil ca regulatorii cu rol inhibitor s intervin cel puin la nceputul acestui stagiu fiziologic "acidul abscisic i etilena, alturi de alii#.

'ceast scurt prezentare a proceselor fiziologice ce au loc de-a lungul vieii unei plante ne permite nelegerea importanei interaciunilor ce regleaz morfogeneza plantelor. 'stfel, interaciunile pe distan scurt, predominant genetice, au loc la nivelul embrionilor i al meristemelor vegetative i regenerative. 'lt tip de interaciuni sunt interaciunile dintre organe ce permit plantelor s recunoasc mediul ncon urtor i variaiile ce intervin la nivelul acestuia. &lanta va putea s se adapteze noilor condiii datorit schimbului de semnale sub forma fitohormonilor sintetizai n anumite locusuri, circulnd n direcia unui punct int ce rspunde la acel stimul. (n cursul deplasrii lor fitohormonii sunt controlai de sistemele enzimatice e%istente n plante. 'ceste interaciuni sunt de aa natur nct de-a lungul unui ciclu de via al unei plante, echilibrul endogen dintre regulatorii de cretere evolueaz continuu i reflect la un moment dat, nu doar starea prezent a mediului ncon urtor al celulei, ci i ultimele evenimente petrecute cu acea celul. !atorit acestui fapt, la recoltarea unui e%plant trebuie s se in seama de valoarea acestui echilibru, ce depinde de stadiul fiziologic i de vrsta plantei donor, dar i de organul de pe care se prelev, precum i de mrimea i natura fragmentului e%cizat. . . Se&e#i! e2-&!n$e&(" <n f'n#ie ,e %$!,i'& fi5i(&(1i# :i )3"%$! -&!n$ei +!+0 (n funcie de stadiul fiziologic i vrsta plantei donor e%plantele pot reaciona diferit la condiiile culturii in vitro. (n general, plantele tinere sunt sursa cea mai potrivit de e%plante, potenialul de adaptabilitate al e%plantelor la condiiile artificiale de via diminundu-se cu vrsta plantei mam. (n cursul embriogenezei, embrionii pot fi e%cizai din ovul i inoculai pe mediul de cultur dac se afl n stadiul globular, putnd reproduce un individ normal i complet. 'ceast tehnic prezint un interes sczut atunci cnd se are n vedere micropropagarea "potenialul genetic al embrionilor este rareori cunoscut cu e%cepia cazului strict de autogamie#. &e de alt parte, aceast tehnic permite studierea cerinelor speciale necesare unui embrion izolat. (n unele cazuri, de ncruciare interspecific sau intergeneric, cnd embrionii pot fi avortai sau mor imediat n ovul, aceast tehnic permite creterea i dezvoltarea normal a acestor embrioni. Oesuturile embrionare sunt uor regenerative, dar la unele specii doar din cotiledoane s-au obinut rezultate notabile, ceea ce a permis specificarea cerinelor nutritive pentru cultura esuturilor speciilor studiate. 'cesta poate fi primul mod de abordare a culturilor in vitro iniiate din e%plante btrne. (n unele cazuri aceasta este singura cale cunoscut. !up germinarea n stadiul uvenil, esutul prelevat prezint un rspuns favorabil in vitro i este sursa multor succese n domeniu. $dat cu naintarea n vrst a plantei donor, potenialul de cultur in vitro a e%plantelor prelevate de la acesta se diminueaz. 'cest fenomen este specific mai ales plantelor perene, i n mod deosebit la arbori. 9a aceste specii, calitatea tehnic a lemnului nu este msurabil, cu e%cepia arborilor aduli. (n acest stadiu, totui, pentru multe specii, iniierea culturii doar din butai nu mai este posibil, deoarece n stadiul tnr acetia au o capacitate rizogenic ridicat. 7%ist dou tehnici ce permit obinerea de puiei la speciile pomicole i arboricole6 -una ar fi utilizarea lstarilor tineri de la baza speciilor pomicole i arboricole. (n acest caz lstarii par a avea caracteristici uvenile i nrdcineaz mai repede "de e%emplu la nuc i eucalipt#. 9a aceste specii esuturile de origine ale noilor lstari sunt genetic apropiate de stadiul uvenil, probabil datorit faptului c se afl n apropierea rdcinilor: -a doua tehnic este aplicat pentru multiplicarea speciilor pomicole i arboricole tropicale i a coniferelor. 'ceast tehnic permite re uvenilizarea i obinerea de altoi. En altoi prelevat dintr-un arbore sau pom este altoit pe un portaltoi crescut din smn. 'ltoiul

crete i este apoi nlturat fiind ulterior altoit pe alt portaltoi. !up mai multe altoiri altoiul ncepe s prezinte caracterele uvenile, ceea ce-l face apoi apt pentru propagare prin butire. 9a culturile in vitro, s-au observat fenomene similare la meristeme. &rima frunzuli ce se formeaz are caractere uvenile "prima frunzuli a meristemului la vi de vie are caracteristici similare celei dezvoltate din smn, de asemenea, i la orhidee meristemele dezvolt, n cultura in vitro, protocorm identic cu cel obinut din smn#. 0e uvenilizarea observat este deseori obinut din prima subcultur, ns uneori sunt necesare mai multe subculturi pentru a obine aceste efect, n funcie de specie. (ntoarcerea la stadiul uvenil poate fi datorat supresiei de informaii citoplasmatice sau datorit diminurii considerabile a acestora determinnd astfel posibilitatea regenerrii de noi celule. 2ecanismele e%acte ce determin aceste fenomen nu sunt nc pe deplin cunoscute. Se pare c citochininele sunt implicate, cel puin parial, n acest proces, dar ele nu acioneaz singure. Cultivarea organelor reproductive in vitro, se poate realiza cu succes atunci cnd plantele donor sunt n stadiul reproductiv. Se pare c schimbrile ce apar n ritmul de funcionare al meristemelor este favorabil i determin n esuturi un echilibru optim culturii in vitro. Se pot obine culturi din esuturi prelevate de la plante aflate n stadiul de senescen, dar rezultatele sunt n general slabe sau incomplete. . .* Se&e#i! e2-&!n$e&(" <n f'n#ie ,e )3"%$! e2-&!n$'&'i &roblemele legate de vrsta e%plantului apar la speciile perene n care se poate distinge un stadiu activ i unul lent, latent, ntre care reaciile fiziologice sunt diferite. 'stfel, primele e%perimente, ce vizau cultivarea de meristeme la plantele lemnoase, au euat atunci cnd s-a ncercat iniierea unei culturi de esuturi din meristeme prelevate de pe ramuri n vegetaie, dar au avut succes atunci cnd s-a pornit de la meristeme prelevate din muguri dorminzi. !e-a lungul unui ciclu anual, echilibrul intern al plantelor se schimb. &rimvara organele cresc i analizele relev prezena regulatorilor de cretere de tipul au%inelor, giberelinelor i citochininelor. Bara transportul fitohormonilor prin vasele conductoare se diminueaz, iar toamna se sintetizeaz inhibitorii creterii. !e aceea, nu e surprinztor faptul c e%plantele, prelevate de la aceeai plant n perioade variate ale vegetaiei, vor da rspunsuri diferite chiar dac vor fi plasate pe acelai tip de mediu. !e aceste considerente trebuie s se in seama atunci cnd se are n vedere micropropagarea speciilor lemnoase. Enele e%plante au tendina de a nrdcina uor atunci cnd sunt prelevate n anumite faze de vegetaie, n special dac sunt e%cizate n perioada de vegetaie, cnd concentraia de au%in este ma%im. 9a speciile cunoscute de a ca ?recalcitrante@ la cultura in vitro, pentru realizarea re uvenilizrii se poate supune planta mam, pentru o perioad scurt, unui tratament cu temperaturi sczute, unui regim de lumin particular sau unui tratament cu fitohormoni pentru modificarea echilibrului lor intern n vederea stimulrii rizogenezei. . .4 Se&e#i! e2-&!n$e&(" <n f'n#ie ,e !+-&!%!"e! -&!n$ei ,(n(" !up determinarea stadiului i perioadei optime e%plantele pot fi prelevate. !up tipul de organizare a fragmentului ce urmeaz a fi cultivat in vitro se pot lua n considerare dou cazuri6

).7%plantele ce au o structur rudimentar sau organizat, cum e cazul mugurilor, ape%urilor caulinare, meristemelor i ape%urilor florale, sunt cele mai utilizate pentru iniierea unei culturi de esuturi, deoarece acestea sunt receptive i ridic cele mai puine probleme, genernd cu uurin, n condiiile unui mediu de cultur adecvat, structuri organizate "de e%emplu, organe#. !ac mediul de cultur nu este potrivit poate tulbura funciile e%plantului i conduce la dediferenierea celulelor, genernd calus. Etilizarea acestui tip de e%plante este similar unei microbutiri i este tehnica cel mai des folosit atunci cnd se urmrete micropropagarea pe scar larg a unei specii. <nteresant de amintit este faptul c e%plantele posed un fel de memorie a tipului de cretere ce l-au prezentat in vivo, acest fenomen fiind n special ntlnit la speciile lemnoase. 9a mai multe plante la care corelaiile de cretere sunt puternice, e%plantele provenite din ramuri laterale au generat plante cu rdcini, dar de tipul lianelor, sub forma unor plante culcate la pmnt i nu erecte. Enele cercetri au evideniat faptul c aceast ?memorie@ aparine celui mai apropiat internod de lng meristem. +.7%plantele constituite din diferite tipuri de esuturi, cum ar fi fragmente de tulpin, frunze, flori i fructe, crora, inoculate pe mediu de cultur, li se induce o reversie complet cu scopul de a restaura capacitatea celulelor de a se divide i de a-i ctiga din nou capacitatea organogenic. &entru aceste e%plante, n funcie de specie, s-a dovedit c toate prile plantei sunt capabile s urmeze procesul dediferenierii conducnd spre o nou organizare structural. !ar, n acest caz, diferenele ntre specii sunt uriae. Enele specii, cum ar fi violetele de &arma, sunt capabile s regenereze din toate prile plantei "peiol, limb, rdcini, petale, stamine, polen, ovule#, alte specii sunt mai recalcitrante, cum ar fi #ctinidia sinensis, la care rezultate notabile au fost obinute doar din fragmente de tulpin. Enele specii sunt total recalcitrante, nereuindu-se iniierea culturii de esuturi din e%plantele amintite, iar la unele conifere s-a reuit obinerea de propaguli doar din cotiledoane. (n general, cele mai bune rezultate au fost obinute, la cele mai multe specii, din fragmente de limb foliar i tulpini tinere. . .6 Se&e#i! e2-&!n$e&(" <n f'n#ie ,e +0"i+e! :i n!$'"! !#e%$("! 2rimea e%plantului ce urmeaz a fi cultivat prezint cea mai mare importan. Cu ct e%plantul este mai mare cu att echilibrul endogenic al acestuia este mai determinant i mediul de cultur va avea o influen limitat. (n cazul e%plantelor de dimensiuni mici direcionarea acestuia n sensul dorit se face mai uor, deoarece e%plantul este receptiv la substanele din mediul de cultur, i anume la regulatorii de cretere e%isteni. 7%plantele organizate cuprind n general un nod, un ape% sau un mugure "solzii protectori sunt nlturai#, fiind o unitate suficient de complet pentru care mediul va favoriza creterea, sau n cazul diferenierii a%ilare, va bloca creterea apical. &entru meristemele ce trebuie s aib dimensiuni foarte mici, e%ist o mrime minim ce conine domul meristematic cu dou primordii foliare. Sub aceast mrime supravieuirea e%plantului este foarte dificil i pierderile sunt mari, peste aceast dimensiune, rspunsul la cultura in vitro este mult mai bun , ns n detrimentul eliminrii virusurilor. !imensiunile e%plantelor variaz ntre 1 i )- mm, ceea ce corespunde unei manipulri uoare a materialului vegetal, sub aspectul e%cizrii sau prelevrii, fasonrii i inoculrii acestora. !e e%emplu, prin cultivarea pe acelai mediu de cultur, a mai multe fragmente de peiol de Saintpaulia, de ),1: ;: 1 i N mm, s-a observat c doar fragmentele de peste ; mm au generat plantule normale. =ragmentele de ),1 mm au generat dou tipuri de rezultate6 unele e%plante s-au vete it, iar altele au format doar rdcini. =r ndoial, n

ultimul caz, au%inele prezente n mediu au ucat cel mai important rol, pe cnd n cazul fragmentelor de dimensiuni mai mari au intrat n oc i fitohormonii endogeni. Se pot fasona e%plante din diferite tipuri de esuturi6 epidermal, cortical, parenchim medular, dar i rspunsurile vor varia. Cel mai regenerativ tip de esut este cel epidermal. Oesuturile corticale i cambiale prezint de asemenea rezultate bune, dar rmn deseori n stadiul de calus. &arenchimul medular este esutul cel mai puin regenerant, aceste esuturi cer o armonizare perfect ntre regulatorii de cretere, un e%emplu fiind dat de S4oog, care a folosit mduv de tutun pentru a determina rolul echilibrului dintre au%ine i citochinine. !in esuturi epidermale de cteva straturi grosime a fost posibil orientarea regenerrii spre stadiul caulogenic "lstari#, rizogenic "rdcini#, calusogenic sau reproductiv. 'cest e%periment confirm ipoteza unei activiti crescute a fitohormonilor asupra e%plantelor de dimensiuni reduse. Cel mai mic e%plant este constituit dintr-o singur celul, cum e cazul protoplatilor izolai mecanic sau enzimatic. &rotoplatii sunt capabili de a se divide i a reproduce plante, dar nun sunt capabili de inducerea meristemelor florale.

.* R=SPUNSUL E/PLANTELOR N CULTUR=

&rima problem ce trebuie rezolvat, atunci cnd se iniiaz o cultur in vitro este meninerea viabilitii "pe lng problema asepsiei# e%plantului. !eseori se poate observa, dup fasonarea e%plantului, o brunificare a celulelor,mai ales a celor ce vin n contact direct cu mediul de cultur, fenomen datorat o%idrii substanelor fenolice sintetizate n mediu, o%idare ce are efect to%ic asupra celulelor vegetale. 2ai mult, celulele moarte pot diminua sau anula schimburile dintre e%plant i mediul de cultur. >u toate speciile prezint fenomenul de brunificare a e%plantelor, deoarece la aceste specii problema este parial rezolvat prin imersia e%plantelor ntr-o soluie antio%idant "soluie de acid ascorbic cu acid citric n proporie de -,1 H respectiv -,-1H#, imediat dup fasonarea acestuia sau prin adiia n mediul de cultur a unor substane adsorbante sau deto%ificante, cum ar fi crbunele activ ") pn la C gDl# sau polivinilpirolidon "1 pn la )-gDl#. $dat rezolvat aceast problem este necesar orientarea e%plantului, n funcie de natura sa, n direcia dorit de operator. .*.1 E2-&!n$e #' %$"'#$'"0 "',i+en$!"0 7%plantele din aceast categorie pot fi cultivate prin dou metode. &rima metod const n inducerea creterii apicale prin adiia n mediul de cultur a fitohormonilor din clasa au%inelor iDsau a giberelinelor, foarte rar se pot aduga i citochinine, ntotdeauna ntr-o doz foarte mic. !up iniierea pe acest tip de mediu se observ apariia unor formaiuni calusare la baza e%plantelor. 7ste de dorit ca aceste e%plante s rmn de dimensiuni mici, deoarece dac acest calus crete n dimensiune, ceea ce deseori se ntmpl, indic e%istena unui dezechilibru ntre substanele minerale sau fitohormonii din mediul de cultur. !up formarea calusului, ce are rol protector "asemeni calusului format la o ran# se formeaz prima frunzuli, apoi prima rozet de frunze i mai trziu are loc elongarea tulpinii "a%ului principal#. 'ceste etape morfogenice pot avea loc pe acelai tip de mediu la unele specii ornamentale "crizanteme, garoafe# sau pe dou medii succesive, la speciile lemnoase. &rimul mediu va iniia creterea, putnd fi utilizat ulterior i pentru propagarea fragmentelor cu un nod "microbutire#. 'l doilea mediu, mbogit cu au%ine "cel mai frecvent, acidul indolil acetic#, servete ca mediu de nrdcinare "#ctinidia, mr, numeroase specii lemnoase#.

' doua metod const n blocarea creterii ape%ului caulinar favoriznd regenerarea i dezvoltarea lstarilor laterali "a%ilari#, caz n care mediul de cultur este adiionat cu citochinin "de la ) la )-mgDl#. 9starii regenerai pot fi izolai i crescui pe mediu pentru cretere, fr hormoni sau cu acid giberelic n concentraie mic. (n unele cazuri este nevoie de al treilea mediu de cultur pentru nrdcinarea lstarilor, mediu adiionat n general cu au%ine. Etilizarea acestui tip de e%plante este important deoarece asigur posibilitatea efecturii unui numr foarte mare de subculturi i, din punct de vedere genetic, un minim de variabilitate. .*. E2-&!n$e #(n%$i$'i$e ,in ,ife"i$e $i-'"i ,e e%'$ 'ceste e%plante sunt compuse din diferite celule asociate n esuturi fr o organizare structural, putnd proveni din orice parte a sistemului vegetativ "tulpin, frunze, rdcini# sau generativ "a% floral, sepale, petale, stamine, polen, ovul, fruct#. Celulele ce rspund la cultura in vitro trebuie s treac prin procesul de dedifereniere, adic sa se ntoarc la stadiul de celule nedifereniate. 'cest tip de reversie este mai uor de obinut la celulele vegetale i mai greu la cele animale. $bservaiile asupra acestui tip de celule au evideniat cteva modificri ce intervin n procesul dediferenierii6 se reduce volumul vacuolar, dispar moleculele specializate, nucleul se mrete, citoplasma devine mai dens. !up realizarea acestor modificri celulele ncep s se divid, stadiu denumit histogenez, uor de realizat prin adiia n mediul de cultur a au%inelor. (n al doilea stadiu, numit organogenez, citoplasma celular devine i mai dens, cu vacuole mici i nucleu voluminos. Celulele pstreaz capacitatea de a se divide, dar celulele fiice vor fi capabile s se organizeze ntr-o mas meristematic ce se va dezvolta ntrun nou individ. $bservnd un e%plant n cultur se observ formarea, mai nti, a unei formaiuni calusare cu rol protector. Celulele aflate n imediata apropiere a mediului sunt primele ce ncep s se divid i s se dediferenieze. !ac celulele ce vin n contact cu mediul brunific, nu se mai formeaz calus i deci tot e%plantul moare. Celulele ce rspund la cultura in vitro au o poziie precis, de e%emplu la Begonia re$, celulele generatoare sunt cele subepidermale situate la baza periorilor glandulari. (n general celulele int, adic celulele ce rspund uor culturii pe mediu artificial, sunt cele epidermale, n special cele provenite din tunic, dar pot avea i alte origini. 'ceste celule se vor organiza ntr-un meristem, care va dezvolta ulterior o plantul ntreag cu tulpini i rdcini, cum este cazul la Begonia i Saintpaulia. 9a alte specii, cum ar fi !elargonium, se observ n primul stadiu formarea de calus "calusogeneza#, unde celulele regenerante se divid activ, i doar n al doilea stadiu, ce poate avea loc pe acelai mediu de cultur sau pe alt mediu, se dezvolt meristemul ce va da natere noii plantule. Cnd se formeaz meristemul prezint, n funcie de specie, acelai mod de a se dezvolta ca i e%plantele organizate, doar c se cere un mediu mai comple% pentru a asigura elementele nutritive necesare dezvoltrii complete pn la stadiul de plantul. 'l doilea proces de organizare, mai puin frecvent, este acela n cursul cruia celulele se vor comporta ca un ou fertilizat, urmnd etapele embriogenezei. Bom vorbi astfel de embrioni sau embriogenez somatic. 'cest fenomen, descris pentru prima dat la celule de morcov, a fost descoperit la mai multe specii, att anuale ct i perene. Ca o trstur general, inducerea embriogenezei depinde n cea mai mare msur de compoziia mediului de cultur, dar i de genotipul de la care se prelev celulele generatoare. (n multe cazuri embriogeneza somatic, este precedat de formarea de calus, n acest caz izolarea celulelor nu mai este un factor decisiv "=ig ,#.

(n cursul dezvoltrii se observ cum celulele se divid i embrionii a ung n stadiul globular, apoi apare simetrie ntre forme i embrionul evolueaz spre stadiul cordiform i apoi ntr-un embrion capabil s genereze o plantul "=ig )-#. &entru celulele capabile s genereze embrioni somatici sunt suficiente dou medii de cultur. &rimul asigur formarea embrionilor, putnd servi i ca mediu de micropropagare, iar al doilea va induce germinarea embrionilor. Eneori sunt necesare mai multe subcultivri pe medii fr hormoni pentru a induce germinarea embrionilor somatici i creterea plantulelor, n timpul acestor subcultivri are loc diluia fitohormonilor la nivel celular permind astfel dezvoltarea normal a celulelor.

=ig. , 7mbrioni somatici de morcov regenerai din calus Etilizarea e%plantelor difereniate este foarte avanta oas deoarece sursa de e%plante este nelimitat i rata de multiplicare poate atinge valori considerabile. (n funcie de rspuns, aceste e%plante prezint unele dezavanta e la nivel genetic. (n primul rnd, celulele ce dau natere noilor plantule sunt somatice i e%ist probabilitatea ca celule mutante s genereze embrioni din care s ia natere noi plante.

=ig.)- 7mbrioni somatici de citrice6 a# n stadiul globular, b# n stadiul cordiform, c# genernd o plantul (n al doilea rnd, cea mai mare rat de inducere a embriogenezei somatice are loc din calus, caz n care, datorit ritmului intens de diviziune celular numeroase celule pot prezenta modificri la nivel genetic "modificri cromozomale de tipul poliploidiei sau aneuploidiei, sau modificri citoplasmatice#. 'ceast variabilitate poate fi suficient de mare i n unele cazuri a fost chiar folosit pentru inducerea de mutani, prin stimularea formrii calusului pe medii adecvate fitohormonal i chiar prin subculturi succesive ale calusului pentru creterea

probabilitii mutaiilor. !up fragmentarea calusurilor i inocularea lor pe medii pentru regenerare, s-a observat c printre plantulele neoformate unele prezentau modificri morfologice evidente mai ales citoplasmatice. (n consecin, de fiecare dat cnd propagarea unei specii necesit trecerea prin stadiul de calus se impune verificarea calitii genetice a plantelor obinute. Ca o concluzie a celor spuse mai sus, cercetrile asupra culturilor ce au pornit de la e%plante difereniate au permis nelegerea modului de aciune al fitoregulatorilor de cretere, a cror echilibru n mediul de cultur este determinant pentru orientarea celulelor s funcioneze ntr-un ritm ales de operator, innd cont de echilibrul endogenic. >u se tie nici n prezent care este modalitatea de a determina e%act concentraia i balana hormonal atunci cnd se apeleaz la fitoregulatori e%ogeni, dar pe de alt parte, acetia din urm permit cercettorilor manipularea materialului biologic n sensul dorit. 'ceste cercetri, ce sunt nc incomplete, sunt baza de la care s-a pornit n realizarea multor aplicaii practice, unele dintre ele fiind acum parte din procesul de micropropagare ce a nceput s fie tot mai mult folosit.

CAPITOLUL III *.1 ORGANIZAREA UNUI LABORATOR DE CULTURI DE CELULE I ESUTURI VEGETALE
(ncperile destinate cultivrii in vitro a e%plantelor vegetale trebuie s fie6 luminoase, lipsite de igrasie, s prezinte instalaii de iluminare, canalizare, curent electric, toate n perfect stare de funcionare. $rice defeciune poate perturba desfurarea normal a lucrrilor efectuate n acest laborator. (n toate compartimentele laboratorului trebuie asigurat o curenie perfect, praful i murdria constituind surse de infecii. 8oate operaiunile, cum ar fi6 repartizarea mediilor de cultur, prelevarea, dimensionarea i inocularea e%plantelor vegetale se realizeaz n condiii aseptice. $ condiie esenial n reuita unei culturi in vitro const n realizarea unei asepsii perfecte, att a materialului biologic ct i a mediului de cultur. (n cazul n care aceast asepsie nu este asigurat, n mediul de cultur pot aprea infecii microbiene i fungice n circa +-1 zile de la inoculare, ceea ce duce la modificarea proprietilor substratului de cultur, eliberarea de to%ine, modificarea p.-ului i astfel dezvoltarea e%plantelor este inhibat. *.1.1 O"1!ni5!"e! %-!ii&(" <n$">'n &!8("!$(" ,e #'&$'"i in vitro 9aboratorul de culturi in vitro trebuie s cuprind mai multe ncperi, grupate n funcie de lucrrile care se e%ecut n ele, n dou zone6 -%ona nesteril& 5 cuprinde6 spltorul, camera de distilare a apei, laboratorul de preparare a mediilor, laboratorul de testare a infeciilor, camera pentru sterilizarea sticlriei i a mediilor de cultur, camera de cretere, camera frigorific, camera de aclimatizare, ser i solarii: -%ona steril& 5 este constituit dintr-o camer sau incint steril. !imensionarea ncperilor i dotarea lor cu aparatur depinde de specificul muncii prestate "cercetare, producie sau miniproducie#.

A. Z(n! ne%$e"i&0 ).Spltorul !estinaie6 este ncperea n care are loc splarea sticlriei i recipientelor destinate culturilor in vitro. 'ceast ncpere trebuie s fie organizat astfel6 -s fie prevzut cu ciment pe os i cu canalizare n pardoseal: -splarea sticlriei se va face n bazine de capacitate corespunztoare, n funcie de volumul de munc e%istent n laborator: -s fie dotat cu o chiuvet cu ap cald i rece, suporturi pentru uscarea sticlriei, dulapuri pentru depozitarea sticlriei, couri pentru gunoi: -poate s fie dotat i cu un distilator pentru ap. 2odul de splare6 -se pregtete sticlria care urmeaz a fi splat: -se elimin resturile de mediu i resturile vegetale din vasele de cultur: -mediile de cultur cu agar se colecteaz i se arunc la gunoi: -n cazul vaselor contaminate este obligatoriu ca acestea s fie autoclavate nainte de a fi deschise pentru a se evita rspndirea infeciei n laborator: -se pune sticlria la nmuiat n ap cald cu detergent, n bazinele destinate splrii: -se efectueaz splarea propriu-zis folosind perii utilizate n splarea sticlriei: -se cltete sticlrie n ap de robinet i apoi n dou reprize de ap distilat: -se aeaz sticlria pe suporturile speciale destinate uscrii acesteia. Se consider sticlria curat atunci cnd la suprafaa acesteia nu mai ader nici o pictur de ap. +.Camera pentru sterilizare !estinaie6 este locul n care se efectueaz sterilizarea mediilor de cultur, a apei distilate i a vaselor de cultur. $rganizare6 -trebuie s fie prevzut cu pardosea din ciment i instalaie de canalizare, sa fie racordat la reeaua de gaze, conectat la curent electric i s posede o surs de ap: -este dotat cu autoclave pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate: trebuie s e%iste dou tipuri de autoclave6 unul conectat la reeaua de curent electric "fig. )# iar cellalt avnd ca surs de energie gazul metan: sterilizarea vaselor cu mediu de cultur se realizeaz n casolete metalice sau couri de srm: -n unitile cu activitate mai redus sterilizarea mediilor de cultur i a apei distilate se poate face i n 4u4te: -este dotat cu etuve pentru sterilizarea sticlriei. ;.Camera pentru prepararea mediilor de cultur !estinaie6 este ncperea n care se realizeaz prepararea mediilor de cultur. $rganizare6 -trebuie s fie spaioas i iluminat corespunztor: -trebuie s fie dotat cu instalaii de canalizare, curent electric, gaz, ap curent: -pardoseala trebuie s fie acoperit cu un material uor lavabil, iar mesele s fie placate cu faian sau folie melaminat pentru a fi uor de ntreinut: -aceast ncpere va fi dotat cu etuve, pupinele pentru presterilizarea instrumentarului, agitatoare magnetice, bi marine, p.-metru "=ig.+#, frigider, congelator,

distilator "=ig.;#, balan tehnic i balan analitic "=ig.C#, precum i un variat sortiment de sticlrie. C.Camera de cretere !estinaie6 este destinat pstrrii inoculilor n condiii optime n vederea creterii i dezvoltrii acestora. $rganizare6 -trebuie s fie perfect curat, faianat, bine izolat de mediul e%tern, dotat cu instalaie de curent electric, sistem de climatizare: -camera va fi ocupat cu rafturi pe care se aeaz vasele de cultur, avnd polie situate la distane de C--1- cm, fiecare poli avnd sistem de iluminare ce poate fi ntrerupt separat: -iluminarea se realizeaz cu tuburi fluorescente, realiznd o intensitate luminoas de ;----C--- luci: -fotoperioada n camera de cretere trebuie s fie, de regul, de )3 ore lumin i * ore ntuneric: studii recente "8eodorescu 'l. i colab., ),,C,),,1# reliefeaz c durata Pzilei@ poate fi redus fr probleme la )--)+ ore realizndu-se astfel importante economii de energie: -nivelul temperaturii trebuie s fie, n general, ntre ++-+CoC: n funcie de specie, scopul urmrit i tipul de cultur aceasta poate varia ntre )1-;-oC: -umiditatea din camera de cretere trebuie s fie cuprins ntre N--N1H: reducerea umiditii sub aceste valori poate determina deshidratarea mediului de cultur cu consecine grave asupra plantelor: -pentru culturile pe mediu lichid, n camera de cretere trebuie sa e%iste unui sistem de agitare, pentru asigurarea o%igenrii esuturilor e%plantului inoculat. B. Z(n! %$e"i&0 Camera steril !estinaie6 n aceast ncpere se e%ecut repartizarea mediului de cultur precum i prelevarea, sterilizarea i inocularea e%plantelor sau subcultivarea materialului biologic crescut in vitro. $rganizare6 -trebuie s fie ct mai izolat de restul ncperilor din zona nesteril pentru a prentmpina vehicularea germenilor: -trebuie s fie prevzut cu instalaii de gaz, curent electric, dar fr ap curent i canalizare: -pardoseala va fi placat cu gresie, iar pereii cu faian: -cea mai important dotare din camera steril este hota cu flu% de aer steril: sunt dou tipuri de hote 5 cu flu% de aer orizontal i flu% de aer vertical, ambele fiind dotate cu baterii de filtre ce permit reinerea particulelor mai mari de -,+ micrometri: ele trebuie s permit lucrul a dou persoane concomitent: cele mai folosite sunt hotele cu flu% de aer orizontal: -hota cu flu% de aer steril trebuie s posede sistem propriu de iluminare i posibilitatea atarii a )-+ becuri de gaz: -nainte de nceperea lucrului cu cel puin +- minute hota se pornete pentru a se realiza sterilizarea incintei de lucru: n acelai timp se pune n funciune lampa EB i se pulverizeaz alcool n interiorul hotei: -alte dotri n camera steril sunt6 scaune rotative pentru personalul care lucreaz la hot, dulapuri pentru sticlria steril, cuptor cu microunde, msue pentru depunerea vaselor cu medii i a celorlalte materiale folosite n perioada de lucru:

-nainte de nceperea lucrului personalul se va spla pe mini n antecamer, iar n camera steril se va clti cu alcool i va purta echipamentul specific6 halat alb, boneta i masc pe figur. *.1. D($0"i&e ne#e%!"e <n$">'n &!8("!$(" ,e #'&$'"i in vitro Sticl&ria Se utilizeaz toate tipurile de recipiente de sticl, folosite ntr-un laborator de chimiebiologie. 7ste bine ca vasele s fie din sticl termorezistent de tip &Qre% sau din silicat de bor. (ntr-un laborator sunt necesare pipete, cilindri gradai, baloane cotate, pahare Aerzelius, pahare 7rlenmaQer, plnii, vase &etri, sticle i borcane pentru reactivi. Se are n vedere tipul de vase utilizate pentru inocularea materialului biologic, pentru a evita pasarea repetat a plntuelor chiar dac mediul de cultur nu a fost epuizat, ceea ce conduce la risip de substane chimice. !e reinut6 orice recipient nou din sticl elibereaz, cu ocazia primei utilizri, compui to%ici n mediul de cultur. !e aceea, se recomand ca sticlria nou s fie splat cu ap i detergent i apoi limpezit, dup care se umple cu ap bidistilat i se autoclaveaz de +-; ori cte ;- minute. !up aceast operaiune se poate utiliza n inoculri. !in ce n ce mai des, pentru inoculri, se folosesc vase speciale din material plastic autoclavabile i cutii &etri din material plastic de unic folosin, care sunt livrate steril. #paratura 'i dispo%itivele !otrile necesare ntr-un laborator de culturi in vitro sunt "=ig.))#6 -hota cu flu% de aer steril: -autoclav: -aparat de distilat i bidistilat apa: -frigidere de mare capacitate: -agitatoare magnetice: -balane analitice i tehnice: -p.-metru: -etuve: -microscoape i lupe binoculare: -centrifug: -aparat pentru repartizarea mediului de cultur: -aparat de fotografiat. (nstrumentar (n lucrrile de culturi in vitro se lucreaz cu instrumentar de tip chirurgical6 -pense de diferite forme i mrimi: -foarfeci: -bisturie, cuite, lame de ras: -ace, anse, seringi. Substane necesare (n laboratorul de culturi in vitro se utilizeaz o serie de substane6 -sruri anorganice: -compui organici: -reactivi de uz comun: -substane indispensabile pentru sterilizarea materialului vegetal: -alte materiale chimice6 detergeni, spunuri, praf de curat, alcool, amestec cromic.

=ig.)) !otrile necesare ntr-un laborator de culturi de celule i esuturi vegetale a# etuv: b# p.-metru: c# microscop binocular: d# lup binocular: e# distilator: f# balan analitic: g# centrifug: h# balan tehnic: i# autoclav

CAPITOLUL IV 4.1 CERINELE NUTRITIVE ALE ESUTURILOR VEGETALE CULTIVATE N CONDIII ASEPTICE
4.1.1 .e,i'& ,e #'&$'"0 7%plantele vegetale pentru a putea tri, dup desprinderea de planta donator, au nevoie de condiii speciale de cultur, s fie prote ate de agenii patogeni "asepsie total# i s aib ca surs de hran o soluie nutritiv comple%, format din ap, sruri minerale, substane organice i fitohormoni. &entru meninerea e%plantelor la suprafa i pentru ca acestea s nu fie asfi%iate, mediul de cultur se solidific cu un agent de solidificare. Soluia nutritiv comple% lichid sau solid se numete mediu de cultur sau substrat de cultur. 'cest mediu de cultur trebuie sa fie steril i cu o compoziie comple% deoarece e%plantul nu are capacitate de a se hrni autotrof, el triete heterotrof pe baza substanelor e%istente n mediu. (n funcie de scopul urmrit, evoluia e%plantului poate fi diri at prin modificarea compoziiei mediului, obinndu-se calus sau regenerarea de noi plante prin stimularea organogenezei. Compoziia mediului de cultur este specific pentru fiecare specie, soi i faz de dezvoltare, cerinele fiind diferite i n funcie de e%plantul folosit, momentul de prelevare i zona din care s-a prelevat, chiar n cadrul aceluiai soi. (n prezent se cunosc i se utilizeaz o serie de medii de cultur ce poart numele celor care le-au creat6 Rhite, 2urashige-S4oog, >itsch, Gamborg, .eller "8abelul C.)#. Compoziia mediului s-a stabilit att prin tatonri repetate cu diferite substane, ct i prin studii ale sevei brute i elaborate la diferite specii, studii privind absorbia i desorbia, schimbul ionic care e%ist ntre plant i mediul ncon urtor. (n prezent se cunosc destul de bine modificrile pe care le sufer plantele cnd elementele chimice sunt n e%ces sau n deficit. 8rebuie evitate pe ct posibil aceste stri de stres pentru plante att la cultura n cmp, ct mai ales la culturile in vitro. 4.1.1.1 C(+-(5ii! #;i+i#0 A. C(+-':ii !n("1!ni#i :i "(&'& &(" A-! 'pa reprezint componentul esenial al vieii, al materiei vii. 7ste utilizat n tot ?flu%ul tehnologic@ de producere a plantelor in vitro, de la splarea materialului vegetal i a vaselor de cultur, pn la utilizarea ei ca solvent pentru celelalte componente i elemente de diluie pn la concentraia dorit. &ierderea apei din esuturi provoac perturbri metabolice direct proporionale cu cantitatea de ap pierdut. Stresul hidric este suportat de plante dac este de scurt durat i dac nu se atinge nivelul de vete ire. (n aceast ultim faz plantele sunt capabile de rehidratarea esuturilor puse n condiii favorabile de umiditate, dac deficitul de ap se menine plantele mor. 9a culturile in vitro e%ist momente cnd e%plantele pot s-i piard turgescena prin pierderea apei, momente n care trebuie acordat atenia cuvenit, pentru asigurarea succesului culturii. Sterilizarea materialului vegetal este o etap critic din acest punct de vedere, deoarece soluiile utilizate sunt concentrate pentru distrugerea agenilor patogeni. 8rebuie corelate foarte bine timpul de sterilizare i concentraia soluiilor utilizate n funcie de starea

de vegetaie a materialului vegetal, pentru evitarea pierderii apei prin e%osmoz. &relevarea e%plantelor trebuie fcut repede, altfel datorit dimensiunilor mici pierd repede apa prin transpiraie, prin rnile care sunt mari comparativ cu mrimea lui. 2anipulrile sub hot trebuie fcute destul de repede deoarece curentul de aer deshidrateaz relativ uor e%plantele care stau descoperite. &e timpul creterii e%plantelor n camera de cretere, vasele trebuie s fie nchise pentru a evita pierderea apei prin transpiraie, ce ar determina concentrarea mediului n elemente nutritive, ar provoca crparea mediului i ca atare slaba cretere a culturilor. &entru respectarea strict a concentraiilor soluiilor stoc sau a mediului, apa trebuie distilat, deci eliberat de ionii minerali pe care i conine. 9a splarea materialului vegetal dup sterilizare se folosete ap steril, sterilizare ce se face n autoclav odat cu sterilizarea mediului sau separat. S0"'"i&e !n("1!ni#e Substanele anorganice sunt introduse n mediu sub form de sruri. Cele mai utilizate sunt6 azotaii, fosfaii, clorurile i sulfaii de Ca, /, 2g, 2n, 'l, =e, 2o, Sn, Cu, >a, etc. 'bsorbia elementelor din mediu se face sub form de ioni, utilizarea uneia sau alteia din sruri este n funcie de cerinele fiecrei specii i de faza de vegetaie. (n funcie de cantitatea de elemente ce se folosete n mediu, elementele se mpart n6 -macroelemente - utilizate n concentraii de ordinul milimolilor 5 C, $, ., >, /, Ca, &, S, 2g: -microelemente sau oligoelemente, utilizate n concentraii de micromoli. T!8e&'& 4.1 &rincipalele medii de cultur utilizate n culturi in vitro "dup Street, ),NN#
C(n%$i$'eni 7e&&e" ?;i$e Ni$%#; +1A& Macroelement /Cl >a>$; 2gS$C % N.+$ >a.+&$C % .+$ CaCl+ % +.+$ CaCl+ />$; >a+S$C ">.C#+S$C >.C>$; /.+&$C Ca">$;#+ % C.+$ Microelemente =eS$C % N.+$ >a+7!8' % +.+$ 2nS$C % .+$ 2nS$C % C.+$ /< >iCl+ % 3.+$ CoCl+ % 3.+$ SnS$C % N.+$ CuS$C % 1.+$ -,-) -,-) -,-; ),-,-; N,-,N1 ;,+N,* ;N,; +1 )-,-,-+1 +N,* ;N,; ++,; -,*; -,-+1 *,3 -,-+1 +N,* )-,-,N1 -,-+1 +,-,-+1 N13-+1)+1 N1 31 N+)3,1 *+-;-)*1 )33 ,1N+3* ;NCC),-)31)N+1)1)1+1-);C .'"!%;i1e S@((1 G!+8("1

.;A$; =eCl; % 3.+$ >a+2o$C % +.+$ 'lCl; =e"S$C#; C(n%$i$'eni ("1!ni#i <nozitol 'cid >icotinic &irido%in .Cl 8iamin .Cl Glicin 'cid folic Aiotin Saharoz

),),-,-; -

),1 +,1 -,-1 -,-) -,-) ;,+H

)-,-,+1 )-1 -,1 -,1 + -,1 -,-1 +H

3,+ -,+1 )--,1 -,1 -,) +,;H

;,-,+1 )-),),)+H

!iferenele ce e%ist ntre diferite reete de mediu, constau n raportul dintre diferii ioni. 0olul fiziologic al fiecrui element depinde de forma chimic n care se gsete n mediu, de concentraia lui, de natura e%plantului. (n prezent se cunosc principalele reete utilizate pentru speciile cultivate care se preteaz la cultura in vitro. 'colo unde nu s-a e%perimentat nc, trebuie fcute tatonri pentru gsirea celei mai adecvate compoziii pentru mediu. Carenele pentru elementele minerale in vitro se manifest dup +-; subculturi, deci trziu, cnd nu se mai poate face mare lucru pentru salvarea culturii. !e e%emplu > are rol important n embriogeneza somatic, n funcie de forma lui nitric sau amoniacal influeneaz vitrificarea. Carena de > duce la acumulri de antociani n vacuolele celulelor, iar dac aceasta persist provoac dereglri n metabolismul glucidelor i proteinelor. &otasiul influeneaz creterea esuturilor, carena determin o dezvoltare slab. (mpreun cu calciul, regleaz permeabilitatea membranelor celulare, a fluiditii protoplasmei, intervine n schimbul ionic la nivelul membranelor. 2agneziul ntr n compoziia clorofilei, carena provocnd dereglri grave n structura frunzei. 2icroelementele e%ercit roluri metabolice i fiziologice diferite de cele ale macroelementelor. <ntr n compoziia multor combinaii organo-metalice comple%e, cu valoare biologic ridicat de tipul enzimelor, care controleaz ntreg procesul metabolic al plantelor. B. C(+-':ii ("1!ni#i Sursele de carbon Biaa in vitro este aproape n e%clusivitate heterotrof, n special n primele faze ale e%istenei, pn la formarea unui numr suficient de mare de frunze pe fiecare plantul sau lstar. !atorit acestei nutriii heterotrofe mediul de cultur trebuie s conin un compus care s asigure carbonul organic necesar n metabolism. &rincipalele surse de carbon sunt glucidele. 'cestea sunt substanele cele mai utilizate i mai accesibile plantelor ca surs energetic. !ozele pe litru sunt de cca. +-;H n funcie de faza de vegetaie i tipul de e%plant folosit. !intre glucide zaharoza rspunde cel mai bine cerinelor culturilor in vitro. 'minoacizii Sunt utilizai ca surse de azot amoniacal disponibil imediat pentru celule i esuturi, fa de azotul organic care este mai greu accesibil. Se adaug n mediu sub form de compui simpli sau compleci. &rincipalii aminoacizi utilizai sunt6 glicina, asparagina, acidul aspargic, cisteina, alanina, glutamina etc.

Bitaminele &lantele spre deosebire de animale sunt capabile de sinteza vitaminelor, dar nu i esuturile cultivate in vitro. S-a demonstrat e%perimental ca in vitro esuturile i plantulele rspund favorabil la adaosul e%ogen de vitamine n cantiti mici. 2a oritatea vitaminelor sunt termolabile, sunt distruse la temperaturi ridicate, uneori cu ocazia autoclavrii, dar s-a observat c i substanele reziduale au rol favorabil asupra culturii. &rincipalele vitamine utilizate n mediile de cultur sunt6 -tiamina "vitamina A), aneurina#, se folosete n concentraii cuprinse ntre -,)-)mgDl: stimuleaz creterea vegetativ, sporirea biomasei produs in vitro: -pirido%ina "vitamina A3#, -,)-) mgDl: precursor a unor coenzime, cataliznd reacii de baza n metabolismul aminoacizilor: -riboflavina "vitamina A+#, -,)-) mgDl, rezistent la temperaturi ridicate "+*-oC#: inhibitor al creterii rdcinilor, rol n metabolismul celular: -acidul pantotenic "vitamina A1#, este mai puin utilizat ca atare: pantotenatul de calciu se folosete n concentraii cuprinse ntre -,1-+,1 mgDl: -cobalamina "vitamina A)+#, este mai rar folosit, stimuleaz sinteza nucleoproteidelor: -acidul nicotinic "vitamina A;, niacina#, -,1-1 mgDl, rezistent la temperaturi ridicate "+;C-+;NoC#: rol n metabolismul intermediar: -biotina "vitamina .#, -,) mgDl: stimuleaz creterea esuturilor meristematice i proliferarea celulelor: -acidul folic, -,-) mgDl: efect stimulator asupra creterii esuturilor la lumin: la ntuneric are efect to%ic: -acidul para-aminobenzoic, ) mgDl: stimuleaz biosinteza acidului pantotenic i a biotinei: -acidul ascorbic "vitamina C#, )-)-- mgDl, prin autoclavare se distruge n bun parte: este activator general al metabolismului celular: -vitamina 7 "tocoferolul#, mrete sensibilitatea celulelor la au%ine: -inozitolul "mio-inozitolul, mezo-inozitolul, he%ahidro%i-ciclohe%an#, )---)--- mgDl: este considerat att vitamin ct i glucid: stimuleaz diviziunea celular. =itoregulatorii =itohormonii, fitoregulatorii sau substanele regulatoare de cretere sunt substane organice utilizate n cantiti mici cu rol de a stimula, inhiba sau controla procesele fiziologice de cretere i dezvoltare. 7%ist fitohormoni endogeni, sintetizai de plante i fitohormoni e%ogeni sau de sintez. Oesuturile in vitro nu sunt capabile s-i sintetizeze ntreaga cantitate de care au nevoie, fiind necesar adugarea lor n mediul de cultur pentru a asigura o bun cretere a e%plantelor. Cei mai folosii fitohormoni n culturile in vitro sunt au%inele, citochininele i giberelinele. A'2ine&e 5 sunt mult utilizate pentru reglarea proceselor de morfogenez alturi de citochinine. 'u%ina natural descoperit este '<' "acidul indolil-acetic# care se produce i prin sintez pe cale industrial. Cele mai folosite au%ine de sintez sunt6 -<A' "acidul ; indolil butiric#: '>' "acidul naftilacetic#: +,C! "acidul +,C diclorfeno%iacetic#: '>$' "acidul beta nafto%iacetic#. 'ciunea au%inelor este foarte comple% datorit intreaciunii pe care o are cu alte substane regulatoare i interveniei asupra unor procese fiziologice. 0olul au%inelor poate fi redat astfel6 -stimuleaz diviziunea celular: - influeneaz alungirea celulelor prin mrirea plasticitii peretelui celular:

-modific permeabilitatea membranelor plasmatice pentru ap i ioni: -rol important n dominana apical: -inhib formarea embrionilor somatici n suspensiile celulare: 'u%inele sunt sintetizate n partea aerian a plantelor n muguri, frunze, fructele tinere i bobocii florilor de unde circul n toat planta. Cel mai mult se folosesc '>' i +,C! care sunt mai stabile, nu se o%ideaz n prezena luminii. +,C! este mult utilizat pentru inducerea i creterea calusului i pentru rizogenez. 9a calus asigur friabilitate mare uurnd separarea calusului pentru cultura de suspensii celulare i n embriogeneza somatic. Ci$(#;inine&e sunt substane ce se gsesc n cantiti relativ ridicate n fructe, semine, etc., iar ca structur au la baz adenina i un nucleu purinic. &rima citochinin izolat a fost chinetina, e%perimentat cu succes la culturile in vitro. 9a scurt timp s-a sintetizat benzil aminopurina "A'&#. (n prezent se folosesc pentru culturile de esuturi patru citochinine dintre care dou naturale "+ <& i zeatin# i doua de sintez "chinetina i A'&#. 7fectul fiziologic al citochininelor const n6 -acioneaz asupra diviziunii celulare alturi de au%ine: -stimuleaz formarea mugurilor adventivi i din calus: -stimuleaz formarea lstarilor laterali: -stimuleaz sinteza proteic: -inhib formarea rdcinilor. Aiosinteza citochininelor endogene are loc n rdcini i n embrioni, iar migrarea este dependent de cea a glucidelor. Sunt substane termostabile suportnd uor autoclavarea. Gi8e"e&ine&e sunt substane care acioneaz la nivelul ntregii plante i nu asupra celulei, cu rol n stimularea creterii, nfloririi i fructificrii. Cea mai utilizat giberelin este acidul giberelic "G';# fiind i cea mai activ. 'ciunea fiziologic este urmtoarea6 -produce alungirea internodiilor tulpinilor: -stimuleaz creterea frunzelor i rdcinilor. Giberelinele sunt sintetizate n frunzele i fructele tinere, n mugurii activi, n embrioni i vrful rdcinilor, circulnd n plante prin vasele liberiene. &entru meristeme giberelina este indispensabil n vederea alungirii lor. 9a alte tipuri de e%plante nu se recomand giberelina deoarece inhib dediferenierea celular. E$i&en! a fost recunoscut ca fitoregulator mult mai trziu i este utilizat puin n culturile in vitro. 0olul fiziologic poate fi prezentat sintetic astfel6 -e%ercit un control asupra creterii permeabilitii membranelor: -induce senescena esuturilor: -are rol n transportul au%inei: -se produce n cantiti mai mari n esuturile i celulele rnite: -inhib e%tensia celular. A#i,'& !8%#i%i# este implicat n procesele de laten a mugurilor i seminelor. &oate fi utilizat pentru6 -inducerea latenei embrionilor somatici: -inducerea latenei seminelor artificiale n vederea pstrrii lor o perioad mai lung: -inhibarea creterii esuturilor i organelor pe timpul stocrii: -are rol antagonist cu au%inele i giberelinele. 'genii de solidificare Substratul nutritiv utilizat la culturile in vitro este de obicei semisolid sau solid, utilizarea mediului lichid fiind limitat doar la unele e%periene i la cultura de suspensii celulare. Cel mai utilizat agent de solidificare este agarul obinut din alge i are urmtoarele caracteristici6

-formeaz cu apa un gel care se topete la )--oC i se solidific la C1 oC, rmnnd solid n condiii normale de cultur: -nu este to%ic pentru plante i nu este asimilat de plante: -nu conine elemente minerale care s afecteze echilibrul dintre ioni n mediul de cultur, fa de reeta de mediu folosit: -nu reacioneaz cu constituenii mediului. Cantitatea de agar utilizat la litru de mediu difer n funcie de consistena dorit, ntre -,1-)H. Cu rol similar n solidificarea mediului de cultur se mai folosesc6 -agaroza are un nalt grad de purificare i se folosete mai ales pentru cultura protoplatilor i n prepararea gelului pentru electroforez: -acidul alginic se folosete pentru cultura protoplatilor, suspensiilor celulare i pentru ncapsularea embrionilor somatici n vederea obinerii seminelor artificiale: -phQtagelul "Gelrite# produce un gel limpede. Se folosete n concentraii de ),1-+,- H i se gelifica la +N-;)oC. Se utilizeaz mai ales la speciile care necesit un p. mai acid, asigurnd solidificarea mediului i n aceste condiii. C. A&$e %'8%$!ne '$i&i5!$e A,enin! are rol regulator n mediul de cultur, favorizeaz formarea mugurilor adventivi, stimuleaz creterea i alungirea ape%urilor ct i rata de multiplicare. Se pare c are o aciune sinergic cu a citochininelor putnd fi un precursor al acestora. !e regul se folosete sub form de sulfat de adenin, n doz de C--*- mgDl. C(+-':ii fen(&i#i stimuleaz creterea calusului, favorizeaz nrdcinarea, creterea lstarilor i a ratei de multiplicare. 're o aciune sinergic cu a au%inelor, n special cu '<'. !up unii autori are rol n prevenirea degradrii au%inelor. !intre compuii fenolici cel mai utilizat este fluoroglucinolul i procaina. =loroglucinolul este mult utilizat n multiplicarea meristematic a pomilor i arborilor, se gsete n seva brut, mai ales la mr. &rocaina are rol n multiplicarea i respiraia celulelor, stimuleaz creterea biomasei e%plantelor, a coninutului n pigmeni, stimuleaz germinaia seminelor i creterea plantelor. !ozele utilizate sunt cuprinse ntre -,)-)- mgDl. S'8%$!ne&e !n$i(2i,!n$e se utilizeaz pentru prevenirea brunificrilor e%plantelor i a mediului, n special, la speciile ce conin substane fenolice n cantiti mari, evitnd o%idarea lor. Se folosesc fie ca soluii n care se ine materialul vegetal naintea prelevrii e%plantelor, fie se adaug n mediul de cultur. !intre substanele antio%idante, cele mai folosite sunt6 acidul ascorbic "1--)-- mgDl#, acidul citric ")1- mgDl#, cisteina .Cl ")-- mgDl#. P(&i)ini&-i"(&i,(n! BPVPC este un poliamid utilizat pentru absorbia i blocarea fenolilor, mpiedicnd astfel o%idarea lor cu brunificarea i moartea e%plantului. Se folosete n concentraii de +1--)--- mgDl. C0"8'ne&e !#$i) este un crbune vegetal, bine mrunit ce se adaug mediului, cu scopul de a absorbi i bloca substanele to%ice din mediu. &oate avea aciune i asupra fitohormonilor "au%ine#, blocndu-le parial efectul, are aciune de inhibare a formrii calusului, stimuleaz embriogeneza, favorizeaz formarea rdcinilor. Eneori se mai pot folosi i alte substane cu rol de a mbuntii, de a completa compoziia mediului, cum sunt6 laptele de cocos, sucul de tomate, sucuri de fructe. &rezena acestora n mediul de cultur este facultativ.

4.1.1. C!"!#$e"i%$i#i&e fi5i#e !&e 'n'i +e,i' ,e #'&$'"0 2etabolismul unui esut vegetal poate fi modificat integral n funcie de consistena mediului de cultur. 0dcini de cicoare cultivate pe hrtie de filtru mbibat cu mediu lichid pot produce doar lstari vegetativi, n timp ce cultivate pe mediu solidificat cu agar pot genera muguri florali. 'legerea tipului de mediu de cultur, lichid sau solid, prezint o importan deosebit. 9a mediul solid, concentraia de agar-agar, precum i calitatea acestuia au un efect distinct. 2asa calusului de cartof se dubleaz atunci cnd concentraia de agar-agar din mediu crete de la -,* la )H, iar microbutaii de anghinare prezint fenomenul de hiperhidricitate pe mediu cu o concentraie de agar-agar de -,3H , ce dispare atunci cnd concentraia agarului crete la ),)H. Concentraia optim de agar variaz n funcie de tipul de organ cultivat, de calitatea agarului folosit i de p.-ul mediului. (n general, consistena mediului de cultur crete odat cu p.-ul acestuia. 8recerea unor e%plante pe mediu lichid poate constitui o faz necesar n procesul de micropropagare, ca n inducerii embriogenezei somatice la morcov din celule de calus n mediu lichid. (n cazul garoafelor, meristemele izolate sunt cultivate n mediu lichid cu agitare pentru a induce lstrirea a%ilar multipl. Biteza de agitare a mediilor lichide este n general sczut atunci cnd se cultiv organe "cca )rpm# i ridicat n cazul culturii de suspensii celulare "cca )-- -)1-rpm#. !ac n alte tipuri de culturi nu se acord o mare importan schimbului de gaze, la culturile in vitro schimbul de gaze cu e%teriorul prezint o mare importan pentru inoculi. Schimburile de gaze se realizeaz prin difuzie, diferenele de concentraie ntre gazele din interiorul containerelor i cele din mediul ambiant e%terior, precum i variaiile de temperatur influennd aceste schimburi. $rganogeneza indirect la morcov este stimulat de reducerea concentraiei de o%igen, pe cnd nrdcinarea lstarilor a fost stimulat de creterea acesteia. 2ai multe e%perimente au dovedit c difuzia liber a o%igenului n esuturi a afectat semnificativ capacitatea organogenic a acestora. 'lte studii au demonstrat c intervenirea unei modificri n schimburile de gaze dintre esuturile cultivate in vitro i mediu a indus apariia unor modificri n morfologia plantulelor. !e aceea, este demn de luat n considerare i tipul de vas de cultur folosit pentru culturile de celule i esuturi, precum i de capacele utilizate6 capace cu burete, parafilm, folie de aluminiu, etc. En alt factor important pentru mediul de cultur i implicit pentru plntuele regenerate in vitro este p.-ul. (n practic, a ustarea p.-ului se face la 1,1-1,* n timpul preparrii mediului de cultur. 8otui, n dese cazuri p.-ul mediului scade n timpul autoclavrii sau chiar n timpul culturii ceea ce poate avea efecte nedorite asupra materialului vegetal. Se tiu nc foarte puine despre efectele acestor variaii ale p.-ului i despre cauzele determinante.

4. FACTORII FIZICI CARE INFLUENEAZ= CULTURILE DE ESUTURI

&rincipalii factori ai mediului ncon urtor sunt lumina i temperatura. Emiditatea relativ este irelevant atta timp ct n interiorul vaselor de cultur aceasta atinge valori de apro%imativ )--H. 4. .1 L'+in! Cerinele fa de lumin pot fi divizate n mai muli parametri6

-intensitatea luminii pe unitatea de suprafa& e%primat n RDm+ "unitatea lu% nu ar mai trebui folosit ca unitate de msur a intensitii luminoase, deoarece depinde de fiziologia ochiului uman, ceea ce este total neadecvat necesitilor unei plante#: -durata ilumin&rii, e%primat n oreDzi: -calitatea spectral& a luminii primite de plante. &entru culturile de esuturi, fotosinteza nu este o activitate necesar atta timp ct energia este furnizat sub forma carbohidrailor. 8otui, unele cercetri au evideniat c fotosinteza nu este eliminat n totalitate din culturile de esuturi vegetale, dar este considerabil redus probabil datorit prezenei zaharurilor n mediu. >umeroase studii au dovedit c lumina este indispensabil reglrii multor procese morfogenetice. '.<ntensitatea luminoas $ intensitate luminoas foarte mare poate duce la pierderi importante n culturile in vitro. Etilizarea unei intensiti luminoase de 1- RDm + "apro%imativ )----luci# n camerele de cretere, intensitate folosit n mod obinuit n fitotron, duce la ncetinirea creterii i scderea capacitii de regenerare la multe specii vegetale. <ntensitatea luminoas optim culturilor in vitro variaz ntre 1 i +1 RDm+ ")----1--- luci# cele mai folosite valori fiind de )- pn la )1 RDm+. deseori, n faza a treia a micropropagrii, se urmrete creterea treptat a intensitii luminoase n vederea aclimatizrii plantulelor la condiiile de lumin din fitotron. A.!urata iluminrii >u e%ist multe date cu privire la influena fotoperiodismului asupra morfogenezei esuturilor in vitro, aa cum e%ist dovezi clare ale influenei acestui parametru asupra plantelor donor, in vivo. Se pare c n medie, calitatea luminii "intensitatea T durata luminii# este important dezvoltrii armonioase a plantulelor n condiii aseptice de cultur. (n practic, marea ma oritate a camerelor de cretere au o durat a iluminrii de )3-)* oreDzi. Cerinele fa de durata de iluminare, din camerele de cretere sunt diferite n funcie de natura e%plantului, scopul urmrit dar i de specia la care se e%perimenteaz. 'stfel, la gru, n cazul culturii de antere, n vederea obinerii de produi androgenetici, s-a dovedit c, anterele cultivate n primele ase sptmni la ntuneric, vor forma un procent mai ridicat de produi androgenetici. !up aceast perioad, culturile vor fi incubate n condiii normale de fotoperioad cu )3 ore lumin i * ore ntuneric. C.Calitatea luminii >umeroase studii au evideniat c spectrul luminos influeneaz procesele fiziologice i morfologice ale celulelor cultivate in vitro. 9umina albastr "cca C3Nnm# sau violet "cca C),nm# induce formarea de lstari din calus de tutun, iar cea roie "cca 33-nm# induce rizogeneza. 'ceste rezultatele asemntoare altora indic faptul c procesele morfogenetice par a fi reglate de pigmenii fotoreceptori, cum ar fitocromul. (n mod normal, lumina ?de zi@ conine radiaii n principal albastre, iar lumina numit ?lumin alb@ conine radiaii roii, dar nu se cunosc cu e%actitate curbele spectrale de emisie ale acestora. (n general, tuburile fluorescente albe aflate n comer sunt adecvate culturilor de esuturi. (n ultimul timp au aprut n comer dou tipuri de tuburi fluorescente6 tuburi cu ?lumin cald@ i tuburi cu ?lumin rece@, astfel c, o combinaie ntre cele dou tipuri de tuburi s-a dovedit a fi foarte potrivit pentru culturile incubate n camerele de cretere.

4. . Te+-e"!$'"! (n general, temperatura folosit n camerele de cretere este de ++-+CoC. 'ceste temperaturi sunt la pragul critic, deoarece n interiorul vaselor de cultur temperatura poate fi cu + pn la CoC mai mare dect n camera de cretere. &ractic, temperatura din camera de cretere trebuie s fie cu + oC mai mic dect cea necesar speciei cultivate in vitro. Speciile provenite din climatul temperat sunt obinuite la temperaturi mai sczute dect speciile tropicale, de aceea ar fi de dorit ca pentru speciile din zonele temperate s se seteze temperatura n camera de cretere la +-U) oC , iar pentru cele tropicale la +1U) oC. !e asemenea, temperatura n camera de cretere va fi diferit i n funcie de scopul urmrit n cultura in vitro. 'stfel, la cartof, s-a observat c o temperatur de cca ), oC, influeneaz pozitiv formarea minituberculilor, n timp ce la gru, cultura de antere necesit o temperatur de cca +NoC. !e aceea, se recomand ca fiecare unitate de cercetare s beneficieze de cel puin dou camere de cretere, n care temperatura s poat fi reglat n funcie de necesitile e%plantelor i tipurilor de culturi e%istente. (n natur, plantele sunt supuse unor fluctuaii de temperatur, iar reproducerea lor n camera de cretere ar fi fr ndoial avanta oas. 8otui, prea puine studii au fost fcute n aceste sens pentru a putea trage o concluzie relevant.

CAPITOLUL V 6.1 ASEPSIA I ASEPSIZAREA

$ condiie esenial, n realizarea culturilor de celule i esuturi vegetale, este asigurarea unei perfecte sterilizri, nu doar a mediului de cultur i a recipientelor, ci i a tuturor celorlalte componente unei culturi in vitro, cum ar fi materialul biologic, instrumentar dar i a suprafeelor n care se desfoar astfel de activiti. Cile posibile de infecie trebuie e%cluse cu rigurozitate. Contaminarea cu microorganisme a recipientelor, mediului de cultur i materialului biologic se poate produce foarte uor, att n faze incipiente, n momentul inoculrii, ct i n momentul repicrii culturilor: alteori infeciile se produc n mod pasiv, datorit ineficienei sistemului de nchidere a vaselor de cultur, a manipulrii lor neatente, sau a dezvoltrii ntrziate a unor germeni care au stat n stare latent n esuturile profunde ale inoculilor. 6.1.1 S$e"i&i5!"e! "e#i-ien$e&(" ,e #'&$'"0 (ntruct, o serie de microorganisme au spori rezisteni la temperaturi ridicate i la diferii ageni sterilizani, se recomand presterilizarea prin cldur uscat, a sticlriei, n etuve, prealabil introducerii mediului de cultur n recipiente. 'poi se va proceda la o resterilizare a recipientelor cu medii, prin cldur umed, respectiv, prin autoclavare. Sterilizarea prin cldur uscat se va face la )3- oC, timp de +-; ore, ntruct e%ist anumite forme de bacterii termorezistente. !urata e%punerii sticlriei la temperatur ridicat depinde i de modul n care aceasta a fost splat, dac a fost sterilizat prin autoclavare, prealabil deschiderii flacoanelor infectate, precum i n dependen de gradul de infectare al atmosferei din laborator. !ac ns se depete temperatur de sterilizare a sticlriei, peste )*- oC se poate produce degradarea calitii acesteia i eliberarea de compui to%ici n mediul de cultur.

&entru a prentmpina infeciile rebele se recomand, n primul rnd o corect curire a sticlriei, prin meninerea acesteia minim patru ore n amestec cromic. Splarea se va face cu mult atenie, ntruct o splare incorect poate reprezenta primul pas n realizarea unei infecii n mas a flacoanelor cu pierderi uriae de material biologic i mediu de cultur. Sticlria nou va fi folosit abia dup splarea i autoclavarea acesteia, umpluta fiind cu ap distilat, pentru a prentmpina trecerea unor ioni din sticlrie n mediul de cultur. (n unitile cu activitate intens se recomand splarea mecanic a sticlriei, ntruct astfel crete operativitatea muncii, beneficiind astfel i de o temperatur mai ridicat a apei de splare, fa de splarea manual. $ foarte bun curire a recipientelor poate fi asigurat prin splarea acestora cu a utorul ultrasunetelor. $biectele din sticl, cutiile &etri, pipetele, lamele de microscop, se mpacheteaz n hrtie, iar pachetele se aeaz n tvi metalice i se sterilizeaz n etuv, n condiii de cldur uscat, la )+- oC, timp de )-+ ore. 'sepsizarea aparatelor introduse n hota cu flu% de aer steril "microscop, lup binocular, etc.# se va face prin tergerea lor periodic cu alcool N- o. &rentmpinarea infeciilor derivate din incorecta pregtire a recipientelor de cultur se face, n primul rnd, prin manipularea corect a acestora, avndu-se n vedere i faza de transport a lor de la autoclav pn la hota cu flu% de aer steril. (n condiii de producie se recomand chiar utilizarea autoclavelor cu deschidere dubl. (n acest caz, recipientele de cultur se introduc n autoclav dintr-o ncpere situat n afara perimetrului steril i se vor scoate printr-o a doua u, direct n camera steril, ele fiind transportate cu un risc minim de a mai putea fi contaminate. 2etodele moderne utilizate n ultimul timp presupun utilizarea recipientelor de cultur din material plastic, fie de unic folosin, livrate steril de ctre furnizor, fie reutilizabile care pot fi sterilizate prin autoclavate. 6.1. S$e"i&i5!"e! +e,ii&(" ,e #'&$'"0 :i ! !-ei ,i%$i&!$e !up prepararea mediilor de cultur, n cel mai scurt timp se va proceda la autoclavarea acestora. (n vederea autoclavrii, vasele prevzute cu dopuri nfiletante nu vor fi nchise etan pentru a permite astfel accesibilitatea aburului nclzit n recipientele cu mediu: n caz contrar, sterilizarea mediilor se produce defectuos, doar cldura nefiind suficient n sterilizarea substratului de cultur folosit in vitro, cldura umed fiind aceea care distruge germenii. 7%ist diferite tipuri de autoclave, electrice sau folosind gazul ca surs de energie, cu orientare vertical sau orizontal, de capacitate mare sau mic. 7senial este ca autoclavul s funcioneze la parametri stabilii, care s asigure asepsizarea corect a mediilor de cultur, distrugnd germenii, fr a altera i degrada substanele ncorporate n substratul de cultur. (n general se recomand autoclavarea mediilor i a apei distilate, la temperatura de )+) oC "echivalent cu presiunea de ) atmosfer#: durata meninerii recipientelor cu medii n autoclav depinde de volumul de lichid, respectiv de mediul introdus n flacoane, dup cum urmeaz6 -vase de mediu coninnd ntre +--1- ml 5 +- minute la )+)oC : -vase de mediu coninnd ntre 1--1-- ml 5 +1 minute la )+)oC : -vase de mediu coninnd ntre 1---1--- ml 5 ;1 minute la )+)oC. Supraautoclavarea mediilor de cultur conduce la o alterare a proprietilor i calitilor acestora i la o deteriorare a raportului ionic. Subautoclavarea mediilor duce la dezvoltarea de colonii de microorganisme i care fac ca mediul s fie inutilizabil. &entru a ne asigura c nu ratm o serie e%perimental este indicat s amnm inocularea i cteva recipiente cu mediu s le inem +-; zile ntr-un incubator la ;N oC. (n acest mod ne vom convinge de calitatea sterilizrii substratului de cultur.

(n laboratoarele de mic capacitate, care nu dein n dotarea lor autoclave, sau pentru sterilizarea unor cantiti reduse de mediu de cultur, se pot utiliza 4u4te n care se va introduce ap, astfel nct s se asigure umiditatea necesar formrii vaporilor. !urata sterilizrii va fi de )1-+1 minute, n funcie de volumul de mediu, din momentul n care a nceput s se evacueze aburul prin supap. !eschiderea 4u4tei se va face dup depresurizarea acesteia. 2ediile de cultur lichide pot fi sterilizate i la rece, prin filtrare. &entru acest mod de sterilizare sunt preferate nucile filtrante din sticl cu porozitatea de ) micron. 'vanta ul acestor nuci filtrante este ca se pot refolosi. Substanele termolabile folosite la prepararea mediilor de cultur "zeatina, acidul giberelic, tiamina, pirido%ina # se sterilizeaz prin filtrare folosind filtre de unic folosin "2illipor# i se adaug n mediul de cultur la o temperatur a acestuia cuprins ntre C1-1-oC. =iltrele 2illipor au porozitatea cuprins ntre -,1--,+ microni, fiind livrate steril de ctre productori, ceea ce presupune utilizarea lor numai n hota cu flu% de aer steril. Sterilizarea la rece a unor substane termolabile se mai poate face i prin dizolvarea lor n alcool, eter etilic sau aceton, acestea evaporndu-se uor, dup care substana solid solubilizat se va dizolva n ap distilat steril i apoi n condiii aseptice se va aduga mediului de cultur aseptic. 6.1.* S$e"i&i5!"e! +!$e"i!&'&'i 8i(&(1i# &roveniena materialului vegetal va constitui un prim reper n alegerea modului de sterilizare a organelor donatoare de e%plante. Substanele alese pentru asepsizarea materialului biologic, concentraia acestora i durata sterilizrii vor fi selecionate n funcie de calitatea materialului biologic. 7stimrile de acest tip se fac fie prin aprecieri de ordin subiectiv, fie pe baza e%ecutrii unor e%perimente de tatonare. Gradul de infecie i procentul de viabilitate realizat n cultur ne a ut n adoptarea celei mai bune metode de sterilizare. !e regul, rdcinile sau organele subterane sunt purttoare de nenumrai germeni, iar sterilizarea lor poate ridica probleme. 2ugurii i tulpinile cu lenticele, precum i organele cu pilozitate ridicat prezint inconvenientul aderrii sporilor i a germenilor la nivelul formaiunilor epidermale, ceea ce creeaz serioase impedimente n sterilizare cu att mai mult cu ct, n momentul imersiei lor n soluia dezinfectant, se interpune, ntre suprafaa epidermei i soluie, un strat de aer, pelicul care mpiedic accesibilitatea dezinfectantului la epiderm. &entru micorarea tensiunii superficiale n soluia de sterilizat se vor aduga cteva picturi de 8Feen +- sau 8Feen *-. !ezinfectantul trebuie s fie suficient de puternic nct, n scurt timp, s distrug microorganismele aderente la suprafaa organelor dar, totodat, s nu ptrund prea mult n profunzimea acestora. $ alt condiie pe care trebuie s o ndeplineasc agenii dezinfectani este aceea de a putea fi ndeprtai cu uurin de pe materialul biologic, prin splri succesive cu ap distilat steril. !ezinfectanii utilizai frecvent asigur o sterilizare de suprafa, dar foarte multe bacterii, virusuri sau micoplasme sunt localizate n celule situate n profunzimea organelor, ceea ce ridic probleme deosebit de complicate privind depistarea i prevenirea dezvoltrii lor. &entru a reduce posibilitatea apariiei unor astfel de infecii, dar i pentru a cunoate cu e%actitate natura lor, este obligatorie efectuarea unui control fitopatologic sever al plantelor donatoare de e%plante. 9a unele plante "mucate, 4iFi# se pot lua msuri mai speciale de dezinfectare. 'stfel materialul se introduce n alcool ",3 o# dup care acesta va fi trecut rapid trecut prin flacr, iar dup aprindere va fi plon at n ap distilat steril.

En dezinfectant cu utilizare frecvent, cu aciune rapid i eficient este alcoolul etilic. 8rebuie avut n vedere faptul c alcoolul este liposolubilizant, coaguleaz proteinele, dup ptrunderea lui n celule i cauzeaz o deshidratare puternic a esuturilor. Ca atare, fragmentele de organe vor fi plon ate un timp foarte scurt n alcool ";--3- secunde# dup care vor fi introduse rapid n ap distilat steril. 2aterialul biologic puternic infectat, dup splare n ap, imersie n alcool i apoi n ap distilat steril, necesit o continuare a sterilizrii cu unul dintre agenii de sterilizare utilizai frecvent "tabelul 1.)#. $binuit se utilizeaz soluiile de hipoclorit de calciu i sodiu n concentraii variabile. !e regul, se procedeaz la imersia n dezinfectant a unor fragmente mult mai mari, ca dimensiune, dect viitorul inocul "pentru a prote a celulele e%plantului de necrozele provocate de ctre agentul sterilizant#. 9a nivelul suprafeelor secionate, hipocloritul cauzeaz o albire a zonelor traumatizate, sub aciunea direct a clorului, ceea ce ne d i o certitudine privind eficacitatea dezinfectantului. (ntruct zonele albite sunt traumatizate, respectiv distruse de ctre agentul sterilizant, ele vor fi ndeprtate, n momentul delimitrii i fasonrii e%plantelor. 8abelul 1.) 'genii de sterilizare utilizai frecvent n culturile in vitro "dup Street, ),NN#
>r. crt. ). +. ;. C. 1. 3. N. Compus chimic .ipoclorit de calciu .ipoclorit de sodiu 'p o%igenat 'p bromat 'zotat de argint Clorur mercuric 'ntibiotice Concentraia utilizat ,-)- H +-1 H )--)+ H )-+ H )H -,)-) H C-1- mgDl Eurina de nlturare KKK KKK KKKKK K K K KK !urata sterilizrii "minute# 1-;1-;1-)1 +-)1-;+-);--37ficacitate f. bun f. bun f. bun f. bun f. bun Satisfctoare !estul de bun

.ipocloritul este puternic alcalin i, n unele cazuri, se recomand ca n prima cltire cu ap distilat steril s se adauge cteva picturi de acid clorhidric diluat, acidulnd astfel uor ap distilat steril: operaiunea are drept scop e%tragerea clorului prezent n straturile superficiale de celule. &entru ndeprtarea soluiei dezinfectante se recomand cltirea repetat, n cinci reprize, cu ap distilat steril, a cte )--)1 minute fiecare. 'tt n cursul sterilizrii ct i al cltirii, materialul vegetal trebuie agitat continuu. 6.1.4 S$e"i&i5!"e! <n#0-e"i&(" :i ! %'-"!fee&(" $ prim msur, cu caracter preventiv, const n meninerea unei curenii e%emplare n ncperile destinate laboratorului de culturi de celule i esuturi vegetale. (nainte de efectuarea tuturor operaiunilor dintr-un astfel de laborator, se impune sterilizarea cu radiaii EB a ncperilor i mai ales a camerei sterile, unde se e%ecut cea mai important etap 5 inocularea pe medii aseptice.

0adiaiile EB vor fi ntrerupte, cu apro%imativ ;- minute nainte de nceperea operaiunilor n zona steril, ntruct pericliteaz sntatea operatorilor. $zonul acumulat n ncperi, n cursul iradierii va fi lsat s difuzeze pasiv din zonele sterilizate. Casoletele cu recipiente, coninnd mediile sterile sau flacoanele dup inoculare, vor fi stocate n apropierea surselor de EB. (n cazul n care mediile, dup autoclavare, nu sunt utilizate imediat, ele pot fi pstrate pentru cteva zile n camerele frigorifice, la C oC. (nainte de nceperea activitilor de inoculare n hota cu flu% de aer steril, se terge suprafaa de lucru cu alcool N- o, iar incinta steril se pune n funciune cu +--;- minute nainte de orice activitate pentru ca flu%ul de aer steril s baleeze suprafaa de lucru. !ac se lucreaz i se inoculeaz la cca +- cm de flacr, pericolul de contaminare cu germeni este minim. (n perioada e%ecutrii operaiunilor n hota cu flu% de aer steril, este indicat ndeprtarea bi uteriilor, a ceasului i brrilor de pe mini i sterilizarea cu alcool N- o a degetelor, insistnd la unghii. <nstrumentarul cu care se va lucra n camera steril, este bine s fie presterilizat, fie n baia electric de aseptizat instrumentar chirurgical fie n pupinel, timp de cca o or, sau prin meninerea acestora sub aciune direct a razelor EB. (nainte de nceperea operaiunilor, instrumentele vor fi introduse n alcool i flambate, apoi vor fi aezate pe diverse suporturi "cutii &etri sterile, tvie folosite doar n hot, etc.# pentru a se rci. 7le vor fi utilizate pentru dimensionarea e%plantelor abia dup rcire, n caz contrar, temperatura ridicat a acestora poate traumatiza profund e%plantul. <nstrumentele tioase, dup introducere n alcool, se trec prin flacr, timp de o fraciune de secund, iar apoi vor fi plon ate ntr-un recipient cu ap distilat steril. =lacoanele cu medii, atunci cnd modul de obturare l permite, prealabil deschiderii lor vor fi trecute prin flacr, rotindu-se gtul acestora astfel nct flacra s a ung n contact cu toat circumferina deschiderii. !up scoaterea dopurilor, sau capacelor, flacoanele vor fi flambate din nou, apoi se e%ecut inoculare urmnd ca la final operaiunea de flambare s se repete. $peratorii care e%ecut lucrri n camera steril, la hota cu flu% de aer steril, trebuie s fie bine instruii din punct de vedere teoretic, s fie echipai corespunztor, cu halate albe, bonet i masc pe figur, pentru a evita e%pirarea direct pe materialul vegetal. !e asemenea, la hotele care permit lucru a dou persoane concomitent, acestea vor evita discuiile ntre ele, rezumndu-se la strictul necesar. 7ste indicat ca personalul s-i spele minile cu ap i spun, nainte de nceperea activitii, dup care att nainte ct i n mod repetat, n timpul operaiunilor efectuate, s se clteasc cu alcool N- o.

CAPITOLUL VI 9.1 INIIEREA UNEI CULTURI IN VITRO

9.1.1 A%-e#$e 1ene"!&e -"i)in, #(n,iii&e !%e-$i#e ,e #'&$'"0 &rima condiie n realizarea cu succes a unei culturi de celule sau esuturi in vitro este asepsia. 2ediile de cultur sunt foarte favorabile dezvoltrii bacteriilor i ciupercilor, creterea crora este mult mai rapid dect cea a celulelor vegetale i duce la inhibarea proceselor fiziologice ale esuturilor cultivate. !e aceea un laborator de culturi de esuturi este organizat i pstrat ntr-o asepsie strict asemeni unei sli de operaie. &rincipalele cauze ale apariiei infeciilor n culturile in vitro sunt6 )# #erul care conine o cantitate mare de organisme patogene de tipul bacteriilor sau fungilor.

+# )esuturile vegetale sunt acoperite la suprafa cu fungi iDsau bacterii. Cele mai infectate organe sunt cele ce se dezvolt n pmnt "rdcini, bulbi, tuberculi#. Aacteriile i ciupercile se dezvolt i n interiorul esuturilor, n vasele conductoare libero-lemnoase sau n spaiile intercelulare, caz n care este imposibil sterilizarea esuturilor, iar folosirea antibioticelor nu este recomandat. ;# Corpul uman, care poart numeroase microorganisme pe piele sau n respiraie. 2etodele de eliminare ale acestor surse de infecie sunt6 a# &rodusele chimice, care distrug microorganismele6 -hipoclorit de sodiu: -hipoclorit de calciu: -mercurobutol: -clorid mercuric: -produse bactericide i fungicide: -etanol N--*-H. b#Aecuri de gaz pentru sterilizarea instrumentarului prin flambare. c# 'erul cald6 la )+-oC timp de +- minute "autoclav#, cldur umed pentru sterilizarea mediilor de cultur i a apei sau )*- oC timp de +-; ore, cldur uscat "etuv# pentru sterilizarea sticlriei. d# 0azele ultraviolete, care distrug doar o parte din spori. e# Sisteme de filtrare a aerului6 se folosesc filtre speciale ce nu permit trecerea particulelor mai mari de -,++Vm. =iltrarea este realizat de un ventilator-e%tractor ce asigur o ventilaie constant cu o vitez optim i are avanta ul de a menine steril aerul din incinta hotei cu flu% laminar. (n momentul de fa toate laboratoarele de culturi aseptice sunt prevzute cu hote cu flu% laminar de aer steril. 9.1. P"e-!"!"e! +e,i'&'i ,e #'&$'"0 !atorit faptului c n prepararea unui mediu de cultur intervin mai muli factori este necesar alctuirea unei liste de materiale nainte de a se trece la prepararea lui. &e parcursul preparrii se vor bifa, pe rnd, toate elementele msurate i introduse, inndu-se seama cu strictee de volumul final al mediului. Se vor nota cu atenie toate detaliile legate de proveniena substanelor chimice sau a soluiilor stoc, erorile, coreciile, proveniena agarului, calitatea apei. (n aparena sunt factori ce nu prezint o mare importan, dar n realitate succesul unei culturi depinde ntr-o foarte mare msur de calitatea mediului i implicit de factorii menionai mai sus. 7tapele preparrii unui mediu de cultur sunt6 )#!iluia srurilor minerale6 macro- i microelemente, apoi a ustarea la volumul final. +#2surarea p.-ului, corectarea cu /$. )->: n general p.-ul este de 1,1-1,*. ;#'diia zaharurilor "sucrozei# urmat de adiia agarului, care se adaug n ploaie n timp ce mediul este amestecat tot timpul. C#Sterilizarea mediului de cultur la )+-oC ntre +--;- minute, n funcie de cantitatea de mediu din recipient. 1#'dugarea vitaminelor i hormonilor "sterilizai prin filtrare# n mediu se face atunci cnd temperatura mediului a unge la C--1- oC. 3#0epartizarea mediului n vasele de cultur sterile se face imediat dup adiia vitaminelor i fitohormonilor. $bservaii 2ediile de cultur pot fi preparate n vase 7rlenmeQer, dac se prepar cantiti mici "mai puin de un litru#, iar agarul este sterilizat odat cu mediul prin autoclavare n 4u4t.

&entru cantiti mai mari de un litru se folosesc vase speciale, borcane cu capac termorezistent. !ac mediul conine substane labile termic, substanele vor fi dizolvate separat, apoi sterilizate prin filtrare i incorporate n mediul autoclavat n prealabil. 'cest procedeu se e%ecut n hota cu flu% laminar de aer steril. !ac se folosesc vase de cultur din plastic achiziionate din comer sterilizate, adiia mediului de cultur sterilizat se va face de asemenea n condiii sterile, la gura becului de gaz unde temperatura este de apro%imativ C-oC, dup ce gura vasului 7rlenmeQer n care se afl mediul s-a trecut prin flacr pentru flambare. ' ustarea p.-ului se face de preferat cu p. metrul nainte de sterilizarea mediului. ' se evita hrtia de p. deoarece aceasta nu d rezultate precise i importana stabilirii unui p. corect se reflect n succesul culturii in vitro. 'garul i zaharoza nu schimb p.-ul mediului, de aceea a ustarea acestuia se face nainte de adiia celor dou componente. &entru a se evita infectarea soluiilor stoc este recomandabil folosirea unor recipiente au%iliare, n care se va goli o cantitate apro%imativ egal cu cea necesar preparrii mediului de cultur, din care se va lua cu a utorul pipetei cantitatea optim. 9.1.* I5(&!"e! :i in(#'&!"e! e2-&!n$e&(" !in punct de vedere teoretic, toate prile unei plante pot constitui e%plante pentru iniierea unei culturi de esuturi, datorit totipotenei celulare, proprietate a celulei vegetale de a regenera n mod normal un individ ntreg, identic cu planta donor. !in punct de vedere al asepsiei, pot fi distinse dou tehnici obligatorii6 -stabilirea unei culturi aseptice din esuturi prelevate de la o plant ntreag cultivat n condiii nesterile "prima etap a micropropagrii vegetale#: -meninerea asepsiei unei culturi de a iniiate prin transplantarea inoculilor n condiii aseptice pe alte medii de cultur "etapele a doua i a treia n tehnica de micropropagare vegetativ#. &rima categorie prezint cele mai mari dificulti deoarece implic efectuarea unei sterilizri corect a esuturilor ce urmeaz a fi introduse n condiii aseptice de cultur. #.Sterili%area esuturilor Sterilizarea materialului vegetal nainte de iniierea unei culturi in vitro este dificil deoarece gradul de infectare al esuturilor este variabil i pentru fiecare tip de manipulare trebuie utilizate diferite substane chimice, n diferite concentraii cu durate diferite de timp pentru imersarea esuturilor. (n general, prile aeriene ale unei plante sunt mult mai puin infectate cu bacterii i fungi dect cele subterane. !ificultatea sterilizrii const n necesitatea absolut de a distruge toate microorganismele patogene folosind produse chimice, astfel nct s nu se distrug i celulele vegetale "care sunt cel puin la fel de sensibile precum bacteriile sau fungii#. !e aceea, este absolut necesar stabilirea unui timp optim de imersare a esuturilor n soluiile sterilizante. !rept e%emplu, pentru micropropagarea Saintpauliei tehnicile de sterilizare optime sunt6 -fasonarea peiolului n fragmente de apro%imativ )cm lungime: -imersia fragmentelor de peiol n etanol N-H timp de +- secunde: -imersia n hipoclorit de calciu CH timp de )+ minute, cu agitarea continu a vasului n care se realizeaz imersia: -efectuarea a trei cltiri succesive cu ap distilat steril pentru ndeprtarea agentului de sterilizare.

Cel mai utilizat produs de sterilizare este hipocloritul de calciu Ca"$Cl#+ deoarece nu penetreaz esutul vegetal. 7ste totui un produs puin stabil n soluie apoas i trebuie preparat imediat nainte de utilizare cantitatea dorit de hipoclorit este dizolvat n ap prin agitare continu timp de apro%imativ )- minute, dup care, soluia format se filtreaz, iar filtratul se utilizeaz imediat. Concentraiile standard folosite sunt de CH i *H, iar timpul de imersie variaz ntre 1 i ;- de minute. 'li produi chimici ce pot fi folosii pentru sterilizarea materialului vegetal sunt6 Hipocloritul de sodiu, >a$Cl - acest produs este comercializat n pungi de plastic cu titrul colorimetric de C*o. Se folosesc concentraii ntre 1H i +-H vDv. 8impul necesar pentru realizarea unei sterilizri optime la o diluie de 1H este de la 1 minute la ;- de minute. 'cest produs penetreaz esuturile putnd cauza leziuni la nivel celular ducnd la scderea capacitii regenerative a esuturilor cultivate in vitro. Biclorura mercuric& "otrav puternic#, .gCl+ 5 este un sterilizant foarte eficient, folosit n doze mici de ordinul -,-)H pn la -,-1H. 7ste dificil de nlturat deoarece are aderen crescut la esuturi, necesitnd cltiri repetate, fiind recomandate cinci-ase cltiri comparativ cu trei n alte cazuri. *ercurobutol 5 este de asemenea un sterilizant foarte bun i se poate gsi n farmacii. Conine un detergent ce-i mrete puterea de penetrarea i eficiena, dar este foarte dificil de nlturat necesitnd efectuarea a dou, trei cltiri cu alcool etilic de N-H. 8rebuie subliniat faptul c sterilizarea materialului biologic vegetal se realizeaz numai la suprafa i dac accidental esuturile sunt infectate n interior nu este posibil sterilizarea lor. (n unele cazuri sterilizarea e%plantelor nu este necesar, cum ar cazul meristemelor bine prote ate de numeroase frunzulie rudimentare sau a anterelor prote ate n spic. B.!reg&tirea ec ipamentului necesar sterili%&rii 'i lucrului la ota cu flu$ laminar steril (nainte de realizarea sterilizrii materialului vegetal i nceperea operaiilor de fasonare i inoculare pe mediu de cultur artificial a materialului vegetal, activiti ce se realizeaz n condiii sterile, este necesar pregtirea hotei cu flu% laminar de aer steril, locul unde se vor realiza etapele precizate. Sterilizarea hotei necesit parcurgerea mai multor etape6 - se terg, cu o bucat de vat nmuiat n alcool etilic de N-H, toate suprafeele orizontale i verticale din interiorul hotei insistndu-se pe suprafaa de lucru: - se pulverizeaz puin alcool pe filtrele de aer ale hotei: - se pulverizeaz alcool n toate colurile i colioarele interiorului hotei: - se pornete lampa EB, iar dup cinci minute se pornete i ventilaia. (n cazul hotelor cu flu% de aer laminar "alctuit din lamele dispuse n straturi paralele# steril este suficient, ca nainte de utilizare, s se tearg cu alcool etilic N-H toate suprafeele interioare, n special suprafaa de lucru. 9a acest tip de hot, filtrul de aer nu trebuie pulverizat cu alcool sau alte lichide deoarece este foarte fragil. &regtirea instrumentarului se face nainte de nceperea lucrului6 - se flambeaz instrumentele de metal la flacra becului de gaz, dup nmuierea n alcool ,-H: este recomandabil folosirea concomitent a cte trei buci din fiecare instrument: - instrumentele se imerseaz n alcool etilic N-H n vase de sticl dac nu se folosete flambarea i n alcool de ,--,3H dac se dorete flambarea acestora: - hrtia de filtru sau aluminiu folosit ca suport pentru fasonarea materialului biologic se sterilizeaz prin autoclavare:

- vasele &etri sterilizate n prealabil n etuv la )*-oC timp de +-;ore se scot, din pachetele de hrtie sau din cutiile de metal speciale n care au fost sterilizate, doar n hota sterilizat: - mediul de cultur sterilizat se va turna n vase de sticl sau plastic sterilizate n prealabil doar la hot, cnd aceasta este pornit: - se pregtesc vasele de cultur cu sau fr mediu: - se pregtesc dou borcane cu ap distilat steril, pentru cltirea materialului vegetal, sau a instrumentarului n cazul cnd acesta este introdus doar n alcool, fr flambare. C.+peraiunile ce se e$ecut& la ota cu flu$ de aer steril 2eninerea condiiilor aseptice se face urmnd cteva reguli stricte i necesare6 - nainte de a ncepe lucrul la hot, operatorul trebuie s-i spele minile cu spun "preferabil cu mercurobutol sau alt substan sterilizant#, s-i suflece mnecile halatului pn mai sus de coate, s-i frece palmele, ncheieturile minilor i antebraele cu alcool N-H sau cu mercurobutol i s se clteasc cu ap distilat steril: - minile operatorului vor fi sterilizate cu alcool de N-H, de fiecare dat cnd vin n contact cu materiale nesterile "pr, haine, etc#: - instrumentarul se schimb des, dup dou pn la ma%imum cinci e%plante, i se sterilizeaz prin flambare sau imersie n alcool i cltire cu ap distilat steril: - e%plantele se fasoneaz cu a utorul unui bisturiu chirurgical cu lama foarte fin, mai ales cnd se dorete obinerea unor e%plante de dimensiuni mici, cum e cazul meristemelor, sau e%trase cu a utorul pensetelor cu vrf subire, n cazul anterelor, ovulelor, etc: - e%plantele sunt inoculate pe mediu imediat pentru a se evita deshidratarea lor i intrarea n contact cu germenii, viteza de lucru fiind un factor important n succesul culturilor in vitro: - orice e%plant ce a czut pe masa de lucru sau a fost atins de altceva n afar de hrtia de lucru steril, va fi eliminat: - dopurile de vat nu vor fi lsate niciodat pe masa de lucru, iar capacele pot fi plasate cu gura n os: - gturile borcanelor, vaselor 7rlenmeQer i sticlelor sunt sterilizate prin trecerea prin flacra becului de gaz: - odat cu terminarea lucrului, alcoolul rmas va fi pstrat n containere nchise, pentru siguran. 9.1.4 .enine"e! #'&$'"i&(" (n general, culturile sunt plasate pe rafturi iluminate cu tuburi neon fluorescent alb cu o intensitate de )+RDm+ "apro%imativ +1-- luci# la o temperatur de +--+1o i un fotoperiodism de )3 ore lumin i * ore ntuneric. $dat cu instalarea culturilor se va urmri apariia infeciilor, care se vd n general dup cteva zile. 9.1.6 Infe#ii&e :i #!'5e&e !-!"iiei !#e%$("! 'pariia infeciilor n culturile in vitro are mai multe cauze. !up simptomele manifestate putem s ne dm seama dac infecia este cauzat de o ciuperc sau de o bacterie. !ac este generat de o ciuperc, se va observa dezvoltarea unui miceliu cu o te%tur mat sau pufoas, de cele mai multe ori de culoare alb sau gri. !enicillium genereaz un miceliu de culoare gri mat, pe cnd , i%opus nigricans, care se i multiplic foarte repede i care trebuie distrus prin autoclavarea culturilor nainte de deschidere i splare, sau aruncare, formeaz miceliu de culoare nchis cu aspectul unor fructificaii de culoare neagr.

!ac infeciile se datoreaz unei bacterii se va manifesta de forma unei paste lptoase n interiorul mediului i pe suprafaa acestuia. 'ceast past este uneori colorat roz sau galben. Se va observa dac infecia a pornit de la zona de contact dintre esut i mediul de cultur, i dac e aa se poate concluziona c sursa de infecie este nsui e%plantul. !ac infecia pornete din alt punct al mediului de cultur, sursa poate fi aerul, sterilizarea ineficient a mediului sau din apa condensat pe capacul recipientului de cultur. (n unele cazuri, din fericire rare, sporii unor bacterii pot rezista autoclavrii, de aceea este necesar cltirea sticlriei n clorur lichid. 'tunci cnd se observ dezvoltarea unui miceliu de !enicillinium se constat o capacitate de lucru slab a operatorului. 2anipularea necorespunztoare a materialului vegetal i aplicarea ineficient a tehnicilor de cultur in vitro, genernd infecii ale culturilor se poate datora6 vorbitului n timpul lucrului la hota cu flu% de aer laminar steril, sterilizarea necorespunztoare i insuficient a instrumentarului, transportul microorganismelor de la e%plantele infectate la cele neinfectate. Se poate ca, n cursul culturii, s nu se observe apariia unei infecii cu bacterii, caz n care mediul de cultur folosit nu permite dezvoltarea acestora. 8otui, culturile pot fi infectate i cea mai sigur cale este subcultivarea lor pe mediu adiionat cu +gDl pepton "un component obligatoriu n mediile de cretere ale bacteriilor#. &rin aceast metod se testeaz culturile i de elimin vasele de cultur infectate, obinnd culturi de esuturi libere de bacterii. 9.1.9 P"(8&e+e $e;ni#e +in("e #e -($ #!'5! -ie",e"i <n #'&$'"i&e in vitro Se poate ntmpla ca unele culturi s mearg foarte bine n anumite condiii, iar alteori, n aceleai condiii s mearg prost sau deloc. &roblema poate fi dat de condiiile de cultur, care sunt rareori identice, condiiile climaterice din camera de cretere se pot schimba, s-a schimbat tipul vasului de cultur sau calitatea sticlei acestuia. En singur detaliu minor n aparen, poate schimba ntreaga evoluie a culturii, de aceea atenia i meticulozitatea sunt caliti absolut necesare unui operator in vitro. (n continuare se prezint cteva e%emple concludente6 - creterea volumului vasului de cultur poate ncetini schimbul de gaze cu e%teriorul ceea ce duce la ncetinirea creterii inoculilor: - utilizarea parafilmului ncetinete considerabil schimbul de gaze i poate modifica funcionarea esuturilor: - unele capace cptuite conin cleiuri to%ice ce pot, prin evaporare sau prin dizolvare n apa condensat, s otrveasc esuturile: de aceea, este recomandat ndeprtarea acestor cptueli nainte de folosirea capacelor: - condensul apei n vasele de cultur apare atunci cnd temperatura din e%teriorul vasului este cu cteva grade mai mic dect cea din interior, cauza putnd fi e%punerea direct a culturilor la aerul rece suflat de aparatele de climatizare. 9.1.D .e$(,e ,e iniie"e ! 'n(" $i-'"i ,e #'&$'"i ,in ,ife"i$e e2-&!n$e 9.1.D.1 C'&$'"! ,e "0,0#ini Cultura de rdcini const n creterea pe medii aseptice a rdcinilor detaate. 8ehnicile de cultivare in vitro a rdcinilor au fost realizate nc n etapa de pionierat a cercetrilor efectuate n aceast direcie. 'stfel, Rhite a dovedit c rdcini detaate de la plantule de tomate pot fi cultivate in vitro timp nelimitat, prin subculturi repetate. (n general, se utilizeaz rdcina primar, embrionar, prelevat de la plantulele formate prin germinarea seminelor n condiii aseptice. &rincipala problem care se ridic, n

acest caz, este aceea a realizrii unei perfecte sterilizri a seminelor. Smna sntoas, cu tegumentele ntregi, nelezate, are esuturi embrionare neinfectate. Seminele pot fi dezinfectate folosind ageni puternici de sterilizare ntruct prezena tegumentului prote eaz formaiunile embrionare de to%icitatea soluiei de sterilizare. 'stfel, un e%emplu de realizare a sterilizrii, izolrii i cultivrii in vitro poate fi cel al unei rdcini primare prelevate de la o plantul de mazre. 'pro%imativ +- semine de mazre, cu tegumentul ntreg, se introduc ntrun vas 7rlenmaQer, n apro%imativ +1- ml alcool etilic N-o: se agit seminele, iar dup cca )secunde se decanteaz etanolul iar peste semine se adaug soluie de hipoclorit de calciu )-H, timp de +- minute, toate operaiunile efectundu-se n camera steril. !up cele +minute se decanteaz soluia de hipoclorit de calciu iar seminele se cltesc n trei reprize de ap distilat steril. !up cltire se ndeprteaz seminele devenite translucide, ca urmare a infiltrrii apei sub tegument, iar seminele ntregi se inoculeaz, tot n condiii sterile, n vase &etri, n care a fost repartizat un mediu de cultur 2S "2urashige-S4oog# simplu constituit din soluia stoc de macroelemente i agar 3,1H. Seminele se incubeaz la ntuneric, n condiii controlate, timp de C* ore, dup care, cnd rdcinia plantulei atinge lungimea de apro%imativ +- mm, n condiii aseptice, se detaeaz vrful rdciniei "cca 1-)- mm# i se inoculeaz tot n vase &etri, )-+ e%planteDvas, pe un mediu de cultur constituit din macroelemente i zaharoz, p.-ul fiind 1,* "0einert i Weoman, ),*+#. Se poate constata c mediul de cultur recomandat este unul simplu lipsit de microelemente, vitamine sau hormoni. Se pot utiliza i medii mai comple%e, clasice, iar ca surs de carbon organic poate fi folosit glucoza n loc de zaharoz. Creterea rdcinilor in vitro are loc pe medii de cultur lichide neagitate. Silnic se poate urmri dezvoltarea radicelelor secundare, prin aplicarea sub cutia &etri a unei hrtii milimetrice. !e obicei, dup +) zile de cultur se constat o plafonare a creterii, moment n care se recomand subcultivarea rdcinilor, prin e%cizarea ape%ului i transferarea lui pe mediu proaspt. Subcultura se poate face i la interval de N zile. !up apro%imativ dou subculturi, este oportun introducerea n mediul de cultur a tiaminei i a acidului nicotinic, n dozele normale, utilizate pentru alte tipuri de e%plante. &rin cultura de rdcini s-a putut cerceta efectul au%inelor asupra celulelor radiculare. Street precizeaz c au%ina stimuleaz att creterea n lungime a fragmentelor de rdcini de tomate ct i diviziunea celulelor meristemului apical. Etiliznd culturi de rdcini, pe diferite tipuri de medii, ca i compoziie i consisten, s-a putut stabili efectul diferiilor fitohormoni de cretere, al elementelor chimice sau al unor substane organice, n formarea rdcinilor, n creterea lor, precum i urmrile carenrii celulelor lor n anumite elemente. &rin e%trapolarea acestor rezultate, s-a reuit mbogirea, an de an, a cunotinelor privind funcionarea rdcinilor i rolul lor n metabolismul general. !e asemenea, din cultura de rdcini se poate obine uor calus, mai ales din cele principale sau din cele ngroate secundar. &rocesele de organogenez, la nivelul rdcinilor netransformate n calus, se rezum la ramificarea acestora n radicele secundare. Geneza de mugurai i tulpinie are loc la nivelul esutului calusal, provenit din rdcini, sau pe e%plante radiculare. 9.1.D. C'&$'"! ,e +e"i%$e+e 2eristemele sunt esuturi de tip formativ, cu celule tinere, ce-i menin, n tot cursul vieii plantelor, capacitatea de a prolifera, respectiv proprietatea de a se divide, formnd mereu noi celule. 2eristemele sunt localizate n vrful ramificaiilor organelor "tulpini sau rdcini#, fiind meristeme apicale, de tip primar, cu rol n creterea n lungimea organelor: meristeme primare gsim i n straturile profunde ale rdcinilor i tulpinilor. 9a organele ce sufer procese de modificare secundar morfo-anatomic, ngrori, ntlnim meristeme

secundare, respectiv cambiul i felogenul. !e regul, prin termenul de cultur de meristeme se nelege cultivarea in vitro a meristemelor apicale, caulinare. 2asivul de celule care alctuiete meristemul apical se apreciaz c msoar ma%imum 1-- V "2argara, ),*+# sau altfel spus, cca -,) mm diametru i -,+1--,;- mm lungime "/artha, ),*)#. (n cazul n care se depete aceast dimensiune, vorbim despre o cultur de ape%. Celulele meristematice dein caracteristici structurale particulare, ce le confer capacitatea de a se menine ntr-o continu stare de proliferare, cum ar fi6 -au pereii celulari subiri, celulozici, nemodificai secundar: -sunt bogate n citoplasm, au mitocondrii numeroase, nucleul este mare, cu nucleoli bine reliefai: -vacuolele sunt mici i nu dein metabolii. (n raport cu celulele parenchimatice sau cu cele prozenchimatice, celulele meristematice sunt mici, strns unite ntre ele, fr spaii intercelulare. 2eristemele primare au celule de forma poligonal iar meristemele secundare au form tabular. Celulele derivate din multiplicarea meristemelor secundare au o dispoziie radial, respectiv toate celulele generate dintr-o celul meristematic mam sunt dispuse liniar, perpendicular pe celula ce le-a dat natere. Celulele meristemului apical, caulinar, sunt uniforme din punct de vedere anatomic, dar arbitrar, la angiosperme, straturile de celule componente sunt submprite n tunica i corpusul. 9a meristemul radicular pturile celulare prezint o structur diferit de aceea descris la tulpin. =orma, mrimea i conformaia meristemului apical, caulinar variaz mult la diferitele specii dar, n mare, s-au delimitat trei tipuri principale structurale6 meristemul criptogamelor vasculare, meristemul la gimnosperme i meristemul de angiosperme. 2eristemul caulinar terminal este localizat n vrful ramurilor i de regul, este prote at n mugur. 7l poate fi apical, a%ilar sau adventiv. 2ugurele este constituit dintr-un a%, n ape%ul cruia se afl meristemul. &rin diviziunea continu a meristemului rezult celule care, pe msur ce se ndeprteaz de ape% se difereniaz funcional. Celulele e%terne ale masivului tisular "numit con de cretere sau vrf vegetativ# se pliaz, iar protuberanele rezultate constituie primordiile. Cu timpul, primordiile se difereniaz n primordii foliare sau florale. !e regul, n primordiile florale se produce o cretere a intensitii ratei de multiplicare celular, aceti muguri devin mai bombai, mai voluminoi. Celulele din zona central se difereniaz n %ilem, floem i esut parenchimatic. Centrifug, dinspre centru spre periferia mugurelui, se ntlnesc primordii transformate fie n frunzulie, din ce n ce mai mari, fie n boboci, respectiv n componente florale. 2ugurii i bobocii au capacitate regenerativ ridicat, graie faptului c dein esuturi tinere, slab difereniate i celule meristematice. 2eristemele apicale posed o relativ autonomie, fapt nc insuficient argumentat i dovedit e%perimental. (n evoluia in vitro a e%plantelor meristematice, un rol important l are stadiul de dezvoltare al primordiilor. &rimordiile florale recoltate n faze prea avansate de dezvoltare, cultivate in vitro, se transform n floare. 'deseori, funcie de specie, la nivelul nveliurilor florale se poate induce neogeneza de formaiuni meristematice adventive. Cambiul i felogenul sunt meristeme prezente n organele ngroate secundar sau n cele metamorfozate "rdcini tuberizate#. !e regul, cambiul constituie o principal zon regenerativ. Oesuturile inoculate pe medii aseptice, de regul, difereniate morfofuncional, trebuie s se dediferenieze, fenomen ce se petrece n etape succesive, pn la rentoarcerea lor la starea de meristem primar, respectiv neoformarea de meristeme. =enomenul de dedifereniere

celular se produce i spontan, de e%emplu n cazul iniierii unor meristeme, sau al genezei de rdcini secundare din celulele periciclului radicular. !ediferenierea celulelor inoculate in vitro poate consta n formarea de calus, dedifereniere primar, din care se poate a unge la un stadiu de dedifereniere secundar, cnd o parte din celulele calusului se transform n meristeme, generatoare de rdcini sau tulpini. !ediferenierea celulelor inoculate in vitro constituie o condiie a formrii de promeristeme i de iniiere a organogenezei. (n cultura de meristeme, meristemul este prelevat mpreun cu dou primordii foliare subiacente acestuia. Aall "),C3# a fost primul care a obinut plantule din meristeme de "upinus albus i -ropaeolum majus, prin cultivarea lor in vitro. 'ceste e%perimente au relevat potenialitatea organogenetic a diferitelor pri ale ape%ului. (n prezent, o atenie deosebit se acord studiilor privind cunoaterea reaciei meristemului cultivat in vitro, n raport cu condiia funcional a meristemului in situ, precum i a rolului primordiilor. 7ste evident faptul c un meristem izolat, cultivat pe medii aseptice, i poate manifesta totipotenialitatea sa real: n condiiile inoculrii lui mpreun cu primordiile, ori in situ, aceast capacitate este mascat de corelaiile e%istente ca urmare a prezenei alturi de meristem i a celorlalte esuturi. !ezvoltarea in vitro a meristemului solitar, sau a celui nsoit de primordii, este dependent de fitohormonii de cretere prezeni n mediul de cultur. Se pare c primordiile, chiar n faza n care frunzele sunt abia schiate, se pot transforma fie n frunze, fie n muguri floriferi. 7%perienele de microchirurgie ale lui RardlaF "),C,#, Steeves "),3+#, .aight i /oehnert "),3,#, precum i ale altor autori, au permis stabilirea faptului c tinerele mucroane foliare se afl ntr-o stare nedeterminat nc morfofuncional. &roblema transformrilor morfologice i structurale, n cadrul proceselor de tranziie care au loc n trecerea strii vegetative a meristemului n stare floral, precum i a celor legate de reversia meristemelor iniial florale, n meristeme vegetative constituie punctul de plecare n multiplicarea vegetativ in vitro, pornind de la e%plante constnd din boboci sau din nveliuri florale. 9a conopid, n faza de preinflorescen, 2argara "),*+# se pot distinge trei categorii de meristeme6 vegetativ, de generare a inflorescenei i de formare a florilor. !efinitivarea direciei de evoluie a meristemului apical, din vegetativ n floral, depinde de o serie de factori e%ogeni 5 fotoperioad, temperatur 5 sau endogeni 5 specie, hormoni. (n condiiile cultivrii unor e%plante in vitro, celulele esuturilor inoculate pe medii aseptice sufer un proces de dedifereniere i genereaz meristeme. !in aceste meristeme, prin redifereniere, vor lua natere organe. $rganogeneza constituie momentul de baz n asigurarea multiplicrii vegetative. !e multe ori la nivelul calusului se pot identifica formaiuni meristematice, aflate ntrun stadiu tnr, nedifereniat funcional n meristem generator de rdcini, sau n meristem generator de tulpini, fiind numite promeristeme. 8ot legat de activitatea meristematic incipient, e%ist i un alt termen, ntlnit n literatura de specialitate 5 meristemoid "8orreQ, ),33#. 'ceast noiune se refer la formaiuni meristematice, abia schiate, cu direcie de dezvoltare nedeterminat, aparent identice din punct de vedere morfologic. Se tie c meristemul radicular al angiospermelor se deosebete funcional de cel al tulpinilor nefiind interconvertibil, cu toate c a%a caulinar i cea radicular, n evoluia filogenetic, au o origine comun. !iferenierea funcional a meristemului se face, probabil, n stadiul de promeristem: n cazul meristemoizilor pot fi de a identificate trei tipuri de meristeme ce evolueaz n6 meristem proliferativ, meristem generator de rdcini i meristem de tip caulogen. !ar nu se cunoate dac aceti meristemoizi sunt identici sau prezint de a amprenta determinismului lor funcional, radicular i caulinar. 2eristemele radiculare, funcie de originea lor se mpart n mai multe categorii6

-meristem apical 5 situat n vrful rdcinilor: -meristem lateral 5 format pe rdcina principal: -meristem adventiv 5 provocat n a se forma la nivelul tulpinilor, frunzelor sau al altor organe, care n mod natural nu sunt purttoare de rdcini. <nducerea formrii acestor meristeme radiculare adventive constituie baza multiplicrii vegetative prin butai, marcote sau organe de rezerv: -meristeme neoformate la nivelul calusului, ca o varietate de meristem adventiv. 2eristemele caulinare pot fi mprite astfel6 -meristeme apicale "terminale# 5 derivate din muguraul embrionului: -meristeme a%ilare 5 aflate la a%ila frunzelor: -meristeme adventive 5 formate pe diverse organe: -meristeme neoformate 5 generate la nivelul calusurilor cultivate in vitro. =ormarea meristemelor i organogeneza sunt procese care se petrec treptat, sub control genetic i hormonal. =actorii de mediu pot i ei stimula inducerea i viteza de desfurare a proceselor de organogenez. .ormonii sau regulatorii de cretere de sintez constituie factori cu rol hotrtor n direcionarea proceselor de difereniere a meristemelor, n meristeme radiculare sau caulinare. 'u%inele intervin n reglarea formrii meristemelor radiculare iar citochininele n neogeneza de mugurai. 7%plantele meristematice caulinare sunt frecvent folosite n tehnicile de multiplicare i de micropropagare a o serie de specii de interes economic. 'stfel, se poate concluziona faptul c, la plantele superioare e%ist o diversitate de meristeme clasificate, dup localizarea lor n plant. 2eristemele mai pot fi clasificate i n alte dou categorii6 -meristeme histogene 5 care produc obinuit numai esuturi: -meristeme organogene 5 care dau natere la esuturi ce formeaz organe: Spre deosebire de meristemele radiculare, care sunt foarte simple ca structur i funciune, meristemele caulinare sunt deosebit de comple%e structural i funcional. 7le variaz ca aspect i potenialitate, de la o specie la alta. 2eristemele caulinare, terminale, constituie, n fapt, un microbuta, ntruct vrful vegetativ al plantei, inoculat in vitro i formeaz un propriu sistem radicular, n partea sa bazal. (n consecin, acest tip de meristem este frecvent folosit n tehnicile de multiplicare i de propagare accelerat a plantelor, pe medii aseptice. &otenialitatea regenerativ a acestor meristeme este, de regul, e%trem de mare. 7le se adapteaz bine la condiiile in vitro, suport uor traumatismul provocat de e%plantare, relundu-i activitatea n urma trecerii lor pe medii aseptice, genernd plante. 'cest fapt presupune att creterea a%ei mugurelui i a primordiilor sale, cu dezvoltarea frunzulielor, ct i neogeneza de rdcini. (n final, meristemul terminal, apical sau a%ial genereaz una sau mai multe plante, n funcie de balana hormonal prezent n mediul de cultur. 2eristemele terminale, caulinare ale plantelor lemnoase ridic probleme speciale, ntruct ele aparin unor plante perene, multianuale, de talie mare, ceea ce ngreuneaz o alimentare optim a lor cu ap, cu nutrieni i hormoni. 'cest lucru constituie impedimente fiziologice care, pe plan funcional, se traduc printr-o regresie a capacitii regenerative a celulelor lor, soldat cu o scdere a totipotenialitii acestor meristeme. 2eristemul apical se formeaz n momentul organizrii embrionului i rmne activ n tot cursul vieii plantei. 7%cepie fac plantele perene din zonele temperate, la care meristemul apical n decursul sezonului de iarn se afl n stare de laten. &rin intermediul culturii de meristeme 5 apicale, terminale sau laterale, se poate realiza o rapid multiplicare clonal a plantelor, ndeosebi a celor horticole i a unor specii silvice.

&rin cultivarea in vitro a meristemelor se obine o regenerare de plante identice din punct de vedere genetic cu planta mam donatoare, fapt deosebit de important n horticultur, asigurndu-se astfel o multiplicare clonal. En alt aspect, foarte important, care deriv din nmulirea meristematic a plantelor, este acela al obinerii de material sditor sntos, n esuturile cruia este prevenit orice fel de atac fitopatogen. &lantulele generate in vitro din meristeme, nsoite numai de prima pereche de primordii foliare, sunt libere de viroze, deosebit de pgubitoare i imposibil de evitat i de combtut n condiiile nmulirii vegetative a plantelor. >umai propagarea plantelor prin semine poate asigura, ntr-o oarecare msur, eradicarea parial, temporar, a virozelor, tiut fiind faptul c, chiar i prin semine se transmit o serie de viroze. !ar nenumrate plante horticole nu se pot nmulii prin semine sau, la unele soiuri, multiplicarea prin semine este dificil "orhidee#, ori seminele nu sunt fertile, ceea ce a fcut ca nmulirea acestora pe cale vegetativ s constituie unica metod de multiplicare a lor. &e de alt parte, multiplicarea plantelor pe cale ase%uat, prin metode de nmulire vegetativ clasic, a condus la degenerarea descendenilor ca o consecin a perpeturii, an de an, a infeciilor virale. 'stfel, o cultur sntoas de garoafe "0udelle, ),NN#, nmulite timp de cinci ani prin butire clasic, a prezentat o rspndire n mas a virozelor, multe din ele, cauznd degenerri. 8otodat, multiplicarea vegetativ, prin metode tradiionale, are drept consecin i o perpetuare a unor mutaii somatice. Birozele plantelor aduc mari daune culturilor, la cartofi i cpun, n floricultur i n arboricultur, ntruct reduc vigurozitatea plantelor, scad potenialul productiv al acestora, producia realizat este mediocr i produsele agricole au un grad naintat de depreciere a calitii lor. Autaii obinui din plante virozate au o capacitate redus de nrdcinare i realizeaz un procent sczut de prindere. &e de alt parte, din cauza meninerii n cultur a unor plante virozate se creeaz pericolul transmiterii virusurilor i la alte plante, prin vectorii biologici prezeni n cultur. &rimele ncercri de cultivare a e%tremitilor de tulpini i de rdcini sunt citate ca fiind realizate nc din ),++, de ctre /otte i de ctre 0obbins, la mazre i porumb, dar fr mare succes. Elterior, n ),C3, Aall a reuit s obin plante din ape%uri meristematice la "upinus albus i la -rapaeolum majus. &n n urul anilor ),C,-),1- cultura propriu-zis de meristeme nu era cunoscut, abia ncepnd din anul ),C,, prin lucrrile lui Retmore i 2orel s-au pus bazele cercetrilor sistematice privind cunoaterea reaciei e%plantelor meristematice la condiii de cultur, precum i cu privire la comportamentul in vitro al meristemelor diverselor specii, de diferite dimensiuni, cultivate n condiii variate de mediu. !ac meritul de a fi reuit regenerarea de plante din meristeme izolate revine lui Aall, n schimb prioritatea n ceea ce privete obinerea de plante sntoase, devirozate, prin cultura in vitro a meristemelor apicale, recoltate de la plante bolnave, revine lui 2orel "),1,-),3-#. <nspirat fiind de rezultatele obinute ntre anii ),C,-),1- de ctre 9imasset i Cornuet, 2orel a avut intuiia de a cultiva in vitro meristeme apicale de apro%imativ N1-)-- Vm lime i )1-+-- Vm nlime, cu )-+ primordii foliare. 7%perienele efectuate de 9imasset i Cornuet au constat n urmrirea, prin analize serologice, a gradului de rspndire i a evalurii intensitii virozrii organelor vegetative aeriene a plantelor la diferite distane de ape%. 7i au constatat o distribuie inegal a virusurilor n corpul plantelor i au observat un gradient mai sczut de infecie viral, pe msura apropierii de vrful vegetativ, respectiv de meristemul apical. Cea mai redus infecie viral a fost semnalat n sucul e%tras din frunzele aflate nc n mugur. &ornind de la aceste fapte, 9imasset i Cornuet au e%tirpat, aseptic o calot de esut apical sau meristem i cteva primordii foliare i au depus-o pe o frunz tnr de tutun, lezat printr-o scarificare superficial. !up trecerea unei perioade de incubaie s-a putut constata c frunzele de tutun, pe care s-a amplasat e%clusiv calota meristematic, au fost virozate n proporie de 3-H, n

timp ce frunzele pe care s-au aplicat esuturi subiacente meristemului "primordii foliare mai ndeprtate de meristem# s-a infectat n procent de )--H. 'ceste e%periene ia condus pe 9imasset i Cornuet la concluzia c n ape%ul caulinar migrarea i nmulirea virusurilor este oprit. (nc din ),1+, 2orel i 2artin au intuit faptul c, pornind de la plante virozate, prin e%plantarea i cultivarea in vitro a meristemului caulinar, apical, se poate obine o plant sntoas, conservnd, n acelai timp, caracterele genetice ale plantei mam. 'ceast ipotez a fost atestat de ctre 2orel i 2artin prin e%periene efectuate cu plante de dalie. Cultura de dalii a beneficiat prima de eradicarea virozelor, prin procedeul imaginat i pus n practic de ctre 2orel i 2artin. 8ulpinile generate in vitro, neposednd rdcini, au fost transformate n minibutai. 'cetia au dat natere la plante libere de viroze. 'u urmat apoi cartofii i orhideele. (n ),1N, Xua4 a remarcat c metoda lui 2orel i 2artin este posibil de aplicat, cu aceleai rezultate, la garoafe. !in acel moment s-au demarat cercetrile n scopul stabilirii unor metode intensive, industriale, de controlare i producere a unui material sditor sntos, cu randament economic asigurat, avnd ca obiectiv obinerea de flori de calitate superioar. (n acest mod a fost elaborat ipoteza imunitii poteniale a celulelor meristematice la atacul viral. !ac prelevarea se face de la o plant neinfectat, sau care prezint o infecie viral slab, atunci cresc i mai mult ansele de a preleva e%plante meristematice, lipsite de infecii virale. !in pcate, plantele devirozate nu sunt imune la viroze. 7le se pot mbolnvi tot att de repede ca i oricare alt plant. !e regul, din plantele devirozate, aflate in vitro se asigur multiplicarea lor, tot pe medii aseptice, prin minibutai, sau se induce formarea de colonii de propagule, sau se constituie o plantaie mam, donatoare de meristeme ori chiar de butai, plantaie e%ecutat n condiii speciale de protecie, nct plantele s fie ferite de atac zoopatogen. Concomitent cu eradicarea virozelor, multiplicarea in vitro a plantelor, prin e%plante meristematice, asigur i eliminarea din materialul sditor a fungilor i a bacteriilor. 'stfel, la garoafe s-a realizat eliberarea plantelor de infecii cu .usarium roseum, iar la !elargonium i /iffenbac ia eradicarea bacteriozelor sistemice "Ral4eQ, ),N,#. Cercetrile recente au dovedit ns, c nu toate meristemele sunt libere de infecii virale. <nvazia meristemelor cu virusuri este dependent de tipul meristemului, al virusului i de specia plantei parazitate. Cu ct e%plantele meristematice sunt mai mici, cu att ansa prelevrii de celule lipsite de virusuri este mai mare, dar cu ct inoculul meristematic este mai mare, cu att este mai ridicat capacitatea lor regenerativ. >u toate virozele pot fi eradicate prin procedeele de nmulire meristematic "2artin, ),NN#. !e e%emplu, la cartof, virusul Y poate fi nlturat, prin nmulire meristematic, numai n procent de )H. Enele virusuri pot e%ista chiar i n meristemele apicale ".ollings, ),3+#. 8ermoterapia vine n a utorul culturilor de meristeme pentru a completa metodele de combatere a infeciilor virale, la plante. 8ermoterapia a fost elaborat de ctre /un4el, n ),;3. 'ceasta const n supunerea plantelor bolnave la temperaturi cuprinse ntre ;1-;,oC, timp de +-C sptmni. (n cursul aplicrii termoterapiei virusurile nu se multiplic: ele rmn la nivelul celulelor n care au fost surprinse n momentul declanrii tratamentului termoterapeutic. Combinnd cultura de meristeme cu termoterapia se realizeaz, cu anse foarte mari de reuit, eliminarea virusurilor din plantele generate in vitro. (n consecin, mersitemele sunt prelevate de la plante supuse, prealabil e%plantrii, tratamentului termoterapeutic. !ar, n aceast situaie, descrete vitalitatea plantelor donatoare, concomitent cu scderea capacitii de supravieuire i de regenerare a celulelor meristematice. &e durata termoterapiei, ape%ul se alungete iar virusurile, nemultiplicndu-se, rmn n celulele bazale ale conului vegetativ, ceea ce nlesnete prelevarea unor e%plante apicale mai mari de pn la ) mm, micornd

pericolul recoltrii unor esuturi subiacente meristemului, infectate cu germeni fitopatogeni. (n consecin, e%plantele meristematice prelevate de la plante supuse termoterapiei, fiind mai mari, capacitatea lor regenerativ i de cretere va fi mai ridicat, ceea ce compenseaz epuizarea fiziologic, cauzat de termoterapie. /assanis "),1-# a dovedit c unul din virusurile cartofului, localizat n frunze, poate fi inactivat la nivelul tuberculilor, prin aplicarea termoterapiei. !ar tot /assanis a precizat c la tomate e%ist virusuri a cror activitate este suprimat abia la *-oC. acesta a fost unul dintre motivele care i-a determinat pe cercettori s prelungeasc durata termoterapiei, de la cteva zile la cteva luni i s ridice temperatura de la ;1 la C-oC "Xua4, ),NN#. .a44aart i Xua4 "),3C#, e%perimentnd cu meristeme e%cizate de la crizanteme, de pn la ) mm lungime cu +-; primordii foliare, au constatat c prelungirea duratei de termoterapie de la )--+- zile la ;- zile a dus la sporirea procentului de plante devirozate, de la , la ,-H dar prelungirea tratamentului termoterapeutic peste aceast durat de timp "pn la 1--3- zile#nu a condus la depirea procentului de plante devirozate. (n unele cazuri, se poate realiza distrugerea virusului din vrful meristematic i n decursul cultivrii esuturilor in vitro. 'stfel, .ollings i Stone "),3C#, au reuit aceast performan la garoafe, iar Ral4eQ i colab. "),3,# la cire. 'ceast eradicare endogen a virozei, n interiorul celulelor cultivate pe medii aseptice, poate fi un rezultat al unui proces metabolic dereglat, ca o consecin a traumatizrii celulelor e%cizate. Cu ct a fost mai mic fragmentul de esut e%cizat, cu att traumatismul a fost mai puternic i efectul endogen, distructiv, e%ercitat asupra virusului, a fost mai mare "Ral4eQ, ),*-#. !e regul ns, este imposibil s regenerm anumite specii de plante din fragmente att de mici de esuturi: ori n alte condiii, nu poate fi realizat o traum de o aa amploare nct s se produc o disturbare a metabolismului virusurilor din celulele e%plantate, soldat cu suprimarea atacului viral. 7%plicaiile privind modul n care celulele meristematice rezist infeciilor nclin spre ustificri de ordin molecular. Ena din ipoteze susine c e%ist o competitivitate ntre celula gazd i parazit, n ceea ce privete utilizarea unor enzime implicate n procese de restituie: alt ipotez, susine c celula meristematic utilizeaz '0> viral, sau c substanele generate n urma traumatizrii celulelor ar suprima virusurile prezente n celule. (n anul ),N*, Ral4eQ, a reuit obinerea de plante sntoase i prin cultivarea in vitro a esutului gametofitic femel, respectiv ovare sau esut nucelar, sau a meristemului floral. 8rebuie subliniat i marele merit pe care 2orel l-a avut n intuirea importanei deosebite a descoperiri posibilitii de a obine plante sntoase din plante bolnave, precum i a direciilor aplicative pe care le-a deschis aceast tehnic, efectuat n condiii aseptice. Cele mai mari realizri le-a avut 2orel n multiplicarea in vitro la orhidee. 'stfel, n anul ),3;, 2orel comunica primele rezultate cu privire la cultivarea in vitro a meristemului apical de orhidee. 'cestea se refereau la faptul c meristemele de orhidee, cultivate pe medii aseptice, genereaz un glomerul de )-+ mm, de culoare verde, numit protocorm. &rin ruperea i cultivarea in vitro a fragmentelor va rezulta o mas globuloas, un glomerul de cca ;-C mm slab difereniat histologic, constituit dintr-un parechim, cu celule mari, srace n citoplasm i cu vacuole ntinse. (n partea central a glomerulului se disting cteva fascicule vasculare. =ragmentnd periodic aceast mas i cultivnd-o in vitro s-a putut remarca o foarte mare capacitate de multiplicare vegetativ a celulelor detaate. (n anul ),N*, 2urashige afirma c, dintr-un meristem de orhidee, n decursul unui an, prin fragmentri i subcultivri repetate ale protocormilor, se pot obine cca C milioane de noi plante de orhidee. &rotocormul produs in vitro este asemntor cu protocormul de germinaie, rezultat din embrionii seminelor. (n ),1,, 2artin a intuit posibilitatea crerii unei bnci cu e%plante, n care s fie conservat materialul biologic meristematic sntos. &rin aceast tehnic, astzi, materialul vegetal generat in vitro este uor conservat, esuturile deinnd nealterat, ntreaga lor capacitate regenerativ.

Baloarea mare a culturii de meristeme const deci n6 -asigurarea uniformitii genetice a materialului sditor, generat in vitro: -eliminarea agenilor fito sau zoopatogeni: -creterea la ma%imum a coeficientului de multiplicare, n cel mai scurt timp, a unui e%emplar vegetal: -obinerea unui material sditor uvenilizat, imposibil de realizat prin metode tradiionale de nmulire vegetativ: -conservarea prin temperaturi sczute a inoculilor meristematici, pentru o lung perioad de timp, ntr-o anumit faz de dezvoltare, pentru a avea un stoc permanent, ce s asigure, oricnd, necesarul de material sditor solicitat pe pia: -conservarea germoplasmei n bnci de gene. (n e%tinderea rapid a acestor practici, n regim industrial a predominat factorul economic rezultat, n primul rnd, din aspectele fitosanitare, respectiv din obinerea unor culturi viguroase, sntoase. 'stfel, cartoful, plat e%trem de important att n hrana omului i pentru industrializare dar i n hrana animalelor, a beneficiat primul de e%tinderea metodelor de redresare a vigurozitii culturilor prin eradicarea virozelor, cultivnd in vitro meristemele caulinare. Cartoful este atacat de nenumrate virusuri care, de cele mai multe ori, pot fi prezente concomitent n esuturi, ceea ce epuizeaz planta i scade, considerabil recolta. &ierderile sunt cifrate la )1-+1H. !in nefericire, nu toate tipurile de virusuri pot fi n egal msur combtute. 'stfel, la cartof, dintre toate virusurile prezente foarte des n cultur "', W, 2, S, Y# virusul ' este mai uor de ndeprtat, comparativ cu virusul Y. 2ultiplicarea in vitro prin meristeme a luat o mare amploare i la garoafe. 'stfel, n =rana, cifra de afaceri realizat, n categoria florilor tiate, prin vnzarea garoafelor, ocup locul doi iar e%portul horticol francez este reprezentat n proporie de *-H de garoafe, ,-H dintre acestea provenind din mutaii de culoare, practicate la tipul american de garoaf creat de Rilliam Sim, n ),;,. 2ultiplicarea acestui cultivar s-a fcut n miliarde de e%emplare. Conservarea calitilor sale genetice se datoreaz metodei de multiplicare prin cultura in vitro a meristemelor caulinare, apicale. <nfeciile virale afecteaz nu numai calitatea florilor, ci reduce foarte mult i capacitatea de nrdcinare a butailor. (n laboratoarele unei singure uniti se produc anual, in vitro, cca )- --- de garoafe. (nmulirea meristematic a permis vindecarea garoafelor i de boli vasculare, respectiv eradicarea atacului de ! ialop ora cinerescens0 .usarium o$ysporum0 i a bacteriozelor !seudomonas caryop ylli i !ectobacterium part enii. !e o mare importan este cultura orhideelor, obinerea de material sditor devirozat la garoafe, cpun, crizanteme, la pomi fructiferi, la arbori i arbuti. !ar cultivarea in vitro a meristemelor nu nseamn urmrirea, ca scop n sine, numai eradicarea bolilor ci pur i simplu, multiplicarea unor clone, respectiv genotipuri valoroase. 'ceast metod este cu att mai important cu ct se pleac de la un material iniial devirozat. Se practic diferite metode de multiplicare in vitro prin intermediul meristemului de tip caulinar i anume6 -unele procedee vizeaz cultivarea e%clusiv a celulelor conului meristematic, fr primordii foliare, pentru studierea proceselor regenerative, n dependen de dimensiunea redus a e%plantelor i de consecinele traumatismelor provocate: -altele privesc obinerea de material sditor devirozat, e%plantele constnd din meristeme recoltate mpreun cu prima pereche de primordii foliare, lungimea e%plantelor fiind de pn la 1-- Zm, respectiv -,+1--,N mm: -altele au n vedere obinerea unui numr foarte mare de plantule, n timp scurt utiliznd e%plante mai mari de )-1 mm sau impulsionnd diferenierea de meristeme a%ilare i de muguri adventivi pe ape%ul iniial. (n oricare din cazuri trebuie s avem n vedere selectarea, cu mare atenie i pricepere, a plantelor mam, donatoare de e%plante. 7ste de dorit ca ele s fie sntoase i s se afle ntr-

o perioad de cretere activ. 9atena organelor uneori ridic probleme speciale i implic aplicarea unor tratamente termice sau hormonale, pentru a stimula emergena meristemelor. 'legerea e%plantelor, sterilizarea organelor, tipul de mediu de cultur folosit, regimul din camerele de cretere influeneaz supravieuirea e%plantelor. 0estabilirea proceselor biologice, de diviziune i de regenerare precum i sensul desfurrii histo i organogenezei, diferenierea de plante, dezvoltarea lor i apoi capacitatea adaptativ a acestora la mediul normal sunt influenate att de factori endogeni, ct mai ales de cei e%ogeni, n special de balana hormonal i de regimul de lumin, respectiv de temperatur. !e regul meristemele caulinare, terminale, apicale, dovedesc cea mai rapid cretere. Cu toate acestea i meristemele laterale, prelevate din mugurii a%ilari, pot fi folosite n culturile de meristeme. 9a crizanteme din 1--- de vrfuri meristematice, ;+H din mugurii apicali, terminali, au crescut, genernd plante mature, n timp ce numai )*H din mugurii laterali au format noi plante. 2rimea e%plantelor se stabilete n funcie de specie i de scopul urmrit. Cnd se are n vedere obinerea de plante libere de viroze la garoafe, e%plantul nu trebuie s depeasc -,1 mm dar nici s fie mai mic de -,+ mm, deoarece, n acest caz, este dificil nrdcinarea plantulelor generate din meristeme. (n cazul n care s-a aplicat corect termoterapia e%plantul poate fi mai mare, de pn la ) mm. (n camerele de cretere intensitatea luminii se recomand s fie de +C---+3-- luci, n regim de fotoperioad cu )3 ore lumin i * ore ntuneric. (n alte cazuri, lumina trebuie intensificat la ;1---C--- luci, iar la conifere se poate a unge chiar la o intensitate de peste )- --- luci. 8emperatura trebuie s fie stabilizat ntre ++-+1oC. Eneori e%ist indicaii stricte cu privire la regimul termic i de iluminare, cerute de un anumit tip de cultur, potrivit unei anumite specii sau corespunztor unei anumite etape de dezvoltare a inoculilor. (n literatura de specialitate sunt recomandri i cu privire la sezonul cel mai potrivit pentru prelevarea i inocularea unui anumit tip de meristem. 'stfel, se specific c meristemele de garoafe supravieuiesc, n proporie mai mare, dac sunt recoltate primvara sau toamna devreme: meristemele recoltate iarna nrdcineaz mai uor iar cele recoltate vara dau cel mai ridicat procent de plantule libere de viroze "Ban $s, ),3C#. 9a cartof, meristemele recoltate primvara sau vara, de timpuriu, nrdcineaz mult mai repede n raport cu cele care sunt prelevate i inoculate la finele anului. (n ceea ce privete substratul de cultur, de cele mai multe ori, se utilizeaz medii de cultur solide. 9a cartof, garoafe i la alte specii se pot folosi i mediile lichide. &.-ul mediului de cultur poate constitui un factor limitativ al creterii i dezvoltrii meristemului cultivat in vitro. 'stfel, de regul, p.-ul de 1,1-1,* este indicat ca fiind optim: dup autoclavare, p.-ul scade, iar n decurs de o sptmn de la cultivarea esuturilor, p.-ul descrete pn aproape de 1,C. En p. iniial sczut inhib formarea rdcinilor. (n compoziia mediilor de cultur sunt incluse macro i microelemente, =e7!8', vitamine, aminoacizi i o surs de carbon organic, reprezentat, de regul de zaharoz n concentraie de +-;H. >atura hormonilor i concentraia acestora variaz de la o specie la alta, n funcie de scopul urmrit. 'stfel, pentru nrdcinare se folosesc cu precdere '>' i '<', care ns folosite timp ndelungat pot duce la inhibarea creterii rdcinilor. (n acest caz, se recomand subcultivarea e%plantelor pe medii lipsite de au%ine. Citochininele stimuleaz creterea meristemelor, mai ales n cazul n care ele se fal n laten, precum i formarea de nenumrai mugurai. Concentraia fitohormonilor de cretere variaz n diferitele faze de evoluie ale meristemelor. &lantele complet formate prezentnd rdcini i tulpini vor fi scoase din condiiile in vitro, fiind trecute n condiiile mediului septic. 7le vor fi transferate n ghivece mici, n amestec de perlit cu pmnt. Se poate realiza transferul lstrailor n mediul septic,chiar nenrdcinai, aceast operaiune putnd determina nrdcinarea lor. AuQs "),3,#

recomand transferarea timpurie n sol a plantelor de garoafe neoformate in vitro, ntruct rdciniele generate in vitro sunt n mic msur folositoare n sol, iar prelungirea duratei de meninere a plntuelor n flacoanele de cultur, ridic ne ustificat costul materialului plantat rezultat. 'tunci cnd plantele sunt suficient de mari, se va testa serologic, eventuala prezen a virusurilor i gradul de infecie. 2etodele de testare a virozelor i natura acestora variaz de la o specie la alta. (n ),NN, Clar4 i 'dams au pus la punct un procedeu 79<S' de identificare a prezenei virusurilor, iar n ),N;, !erric4, a preparat un ser septic pentru electronomicroscopie, metode de mare sensibilitate n determinrile de virusologie vegetal. &entru a uura e%actitatea investigaiilor este de dorit s se fac o analiz a infeciilor la nivelul plantelor donatoare de meristeme, precum i n cultura, sau culturile apropiate. !up stabilirea unei culturi lipsite de germeni este absolut indispensabil ca plantele s fie meninute n condiii speciale fie c ele sunt prezervate n condiii de temperaturi sczute, n recipientele lor de cultur, pe medii aseptice, fie c sunt cultivate n teren, ntr-un perimetru ferit de infecii, metodele fiind menite s realizeze evitarea unei reinfectri a plantelor. 2etodele criobiologice de prezervare a materialului obinut in vitro sunt economice i indispensabile pentru conservarea, pe termen lung, a germoplasmei precum i a unei cantiti limitate de material iniial, devirozat. Crioconservarea poate fi realizat la temperaturi e%trem de sczute. (n aceste condiii se asigur reducerea tuturor funciilor metabolice. &rimele ncercri de crioconservare au fost fcute de ctre Seiberg n anul ),N3, la garoafe. Elterior sa reuit i conservarea altor tipuri de inoculi6 calus, celule sau protoplati. 8ehnicile de crioconservare presupun utilizarea unor substane crioprotectoare, cu rol n prevenirea daunelor cauzate de nghearea brusc a celulelor, respectiv formarea cristalelor de ghea. Cele mai folosite substane crioprotectoare sunt dimetilsulfo%idul "!2S$# i glicerolul "/artha, ),*), citat de Cachi, ),*C#. 2eristemul este esutul cel mai potrivit pentru a fi conservat la temepraturi sczute, graie alctuirii particulare a celulelor lui. 'stfel, el i poate pstra ntreaga capacitate regenerativ, ntruct n momentul repunerii lui n condiii optime de mediu, celulele i reiau activitatea metabolic i fiziologic normal. 2eristemul se preteaz cel mai bine conservrii prin crioconservare, celulele lui fiind srace n vacuole i avnd o citoplasm dens. &entru e%ecutarea operaiunilor de congelare, ndeosebi pentru coborrea gradat a temperaturii, e%ist dispozitive speciale. $ metod accesibil preconizeaz introducerea flacoanelor cu inoculi ntr-o baie de alcool, mediu n care se produce descreterea gradat a temperaturii. (n anul ),*-, !ale i colab. 'u pus la punct o metod de stocare la temperaturi sczute a unor graminee sau a unor plante legumicole, constnd n conservarea ndelungat a plantelor, generate in vitro, prin meninerea lor la temperaturi de +-CoC, n regim de * ore lumin pe zi si o intensitate de ;-- luci. Cultura poate fi meninut astfel )--)) luni, dup care se recomand ca aceasta s fie transferat pe mediu proaspt. $ alt problem deosebit de biologie se ridic n cazul plantelor generate in vitro. &lantele provenite att din meristeme ct i din e%plante de alt natur, prezint un grad de uvenilitate similar plantelor dezvoltate din embrionii seminelor. 'stfel, materialul de plantat, generat in vitro, este superior celui obinut prin metodele tradiionale6 butire, marcota , altoire. [uvenilitatea plantelor generate in vitro poate fi constatat morfologic, de e%emplu la plantulele de cpun, difereniate din meristeme. 9a cpun, frunzele tinere sunt ntregi, n timp ce frunzele plantelor btrne sunt trifoliate. Generarea de frunzulie ntregi sisteaz la inoculi n momentul n care se depete faza de morfogenez, constnd n proliferarea a noi muguri a%ilari, prin repicri repetate i cultivarea inoculilor pe mediu cu citochinin.

En caz particular este acela al rentineririi unor organe de pe care urmeaz s fie prelevate meristeme apicale. En e%emplu l constituie plantele lemnoase, multianuale. 7%plantele sau butaii prelevai de la astfel de plante i pierd capacitatea de nrdcinare. 9a aceste plante se practic diferite metode de rentinerire a materialului biologic prin butiri sau microbutiri in vitro, altoiri de ape%uri de plante adulte pe tinere plantule. Sfecla constituie un alt e%emplu de plant a crei esuturi adulte prezint o foarte sczut capacitate organogenetic. !e aceea se recomand inducerea formrii de meristem prin repicri succesive. $ problem deosebit o constituie aceea a meninerii meristemului vegetativ, inoculat pe medii aseptice, ntr-o stare primar, ntruct n cazul n care se inoculeaz un meristem vegetativ, prelevat de pe o tulpin florifer, e%ist pericolul ca anumii factori de mediu s induc formarea florilor sau invers, s grbim, prin reglarea fotoperioadei i a altor factori de mediu, transformarea unui mugur vegetativ, n mugure florifer. 0eglarea fotoperioadei i sporirea cantitii de zaharoz din mediu la C--1- gDl sunt factori care par s determine transformarea ape%ului vegetativ n florifer. 9a numeroase plante, detaarea meristemelor florale i cultivarea lor in vitro imprim esuturilor capacitatea de a redeveni meristeme vegetative, genernd mugurai. 'deseori, se formeaz muguri a%ilari sau adventivi acolo unde altfel, normal ar trebui s se formeze boboci. <nocularea in vitro, pe medii, cu sau fr fitohormoni, a unor fragmente desprinse din inflorescene tinere conduce la formarea a numeroi muguri. 9a conopid, prelevarea unui mic e%plant din ape%ul preinflorescenei i cultivarea lui pe mediu lichid, cu o au%in "'<'#, provoac reveria esuturilor din florifere n vegetative. 'stfel, poate fi nmulit planta pe cale vegetativ "Crisp i colab., ),NC, citat de Cachi,),*C#. $riginea comun a meristemului vegetativ i a celui florifer face ca transformarea, n direcia diferenierii morfologice i funcionale s fie posibil, ntr-o anumit faz de dezvoltare a plantelor sau a organelor. 0euita este dependent de vrsta esutului, de specie i de condiiile de mediu. 'mbele tipuri de meristeme, diri ate corect, pot servi la multiplicarea in vitro a unor plante. 9.1.D.* C'&$'"! ,e #!&'% Calusul este o formaiune particular constituit dintr-o mas nedeterminat de celule deinnd o structur histologic uniform. !e regul, cnd este tnr, posed celule nedifereniate, care se divid activ. En anumit tip de calus se produce i n mod natural, fie la nivelul zonelor traumatizate, avnd rol n cicatrizarea rnilor, fie se formeaz la baza butailor plantai pentru nrdcinare, constituind zona de genez a rdcinilor adventive. (n funcie de obiectivul urmrit, obinerea de calus poate constitui un scop n sine, alteori apariia i dezvoltarea lui poate fi un dezavanta . <nducerea formrii de calus ct mai friabil constituie scopul principal atunci cnd se urmrete iniierea unei culturi de celule, iar din acestea a unei culturi de protoplati. <nstabilitatea genetic a celulelor sale i poliploidizarea facil a lor, n anumite condiii de cultur, fac din calus si din cea de celule, un material biologic valoros asupra cruia agenii mutageni i factorii stresani pot opera modificri, selectndu-se linii cu caliti speciale. 2ultiplicarea clonal, via calus nu este posibil tocmai din cauza facilei poliploidizri a celulelor sale. &e aceast cale se practic ns nmulirea regenerativ, rapid a unei specii, fr a avea sigurana conservrii genotipului. 9a unele specii6 morcov, tutun, crizanteme din calus se pot obine uor plante. 9a specii ierboase "bumbac#sau la plante lemnoase "ste ar#, geneza de plante din calus este e%trem de dificil. 'tunci cnd se urmrete multiplicarea clonal rapid, formarea de calus n poriunea bazal a e%plantului sau transformarea ntregului inocul ntr-o mas de calus constituie un

fenomen care perturb diri area proceselor de morfogenez. 'stfel, administrarea unei balane hormonale neechilibrate, face ca la baza e%plantului s se genereze calus, cauznd dezvoltarea preponderent a rdcinilor, n defavoarea diferenierii mugurailor sau invers, se formeaz unul sau mai muli mugurai, iar pentru inducerea rizogenezei fiecare mugura trebuie detaat i subcultivat pe un mediu cu sau fr au%in. 'ceast metod se practic cu succes, atunci cnd se procedeaz la multiplicarea in vitro a unor specii ornamentale "Saintpaulia i Gerbera#, constnd n desprinderea de propaguli, de pe un esut calusal comun de dimensiuni minime generat din inoculul iniial, situat n poriunea bazal a coloniei de propaguli. Creterea calusului este considerat ca fiind nedefinit, ntruct el poate fi nmulit i cultivat la nesfrit, atunci cnd, periodic, se procedeaz la repicarea, respectiv la fragmentarea lui. =iecare fragment este apoi subcultivat pe un mediu proaspt. Calusul crescut la +1oC se recomand a fi repicat la un interval de C-3 sptmni, n dependen de natura esuturilor din care a provenit i de condiiile n care a fost cultivat. >umai prin subcultivri repetate poate fi conservat vitalitatea celulelor sale. !ac calusul nu este subcultivat n timp util, se produce o mbtrnire a celulelor sale, masa tisular i schimb culoarea, din glbui, galben-verzui ori verde, devenind cenuie sau galben-brun: uneori culoarea calusului devine roiatic sau viinie, datorit formrii i acumulrii de antociani n sucul vacuolar. &roveniena calusului i natura inoculului iniial influeneaz sinteza antocianilor. Street "),N;# precizeaz c trecerea calusului n suspensie celular duce la scderea substanial a cantitii de antociani. !e altfel, s-a constatat c anaerobioza inhib formarea antocianilor "Gautheret, ),1,, citat de Cachi, ),*C#. (n general, prezena luminii i natura acesteia intensific acumularea n celule a antocianilor. 'ntocianii sunt sintetizai ns i la ntuneric. 'stfel 7ri4sson "),3N# iradiind o cultur de celule de Haplopappus cu raze EB, a izolat o linie celular cu un coninut foarte ridicat de antociani. =itohormonii de cretere i natura acestora influeneaz i ei sinteza antocianilor. 'stfel, au%ina inhib, iar citochininele stimuleaz formarea antocianilor "Street, ),NN: /alinin, ),*)#. 8emperatura sczut, carena de azot i coninutul ridicat al mediului de cultur n glucide stimuleaz sinteza de antociani. Se pare c zaharoza intervine prin presiunea osmotic pe care o creeaz, ntruct i un coninut ridicat de >aCl stimuleaz formarea acestor pigmeni. 9a plantele dicotiledonate calusul este indus cu mai mult uurin, dect la gimnosperme sau la monocotiledonate. &e msur ce calusul depete un numr de zile de cultur, n profunzime se difereniaz centri vasculari, ori noduli organoformatori. (n morfo i organogeneza calusului un rol determinant l au mediul de cultur i condiiile de cultur, natura esuturilor din care a provenit calusul i vrsta acestora. =ormarea, creterea i aspectul calusului sunt dependente de natura i concentraia fitohormonilor de cretere, prezeni n mediile de cultur. !e regul, concentraiile ridicate de au%in conduc la formarea de calus. Cele mai eficiente au%ine n inducerea de calus s-au dovedit a fi acidul +,C diclorfeno%iacetic "+,C!# i acidul +,C,1 triclorfeno%iacetic "+,C,1 8#, folosite n concentraii cuprinse ntre )-)- mgDl. (n general, calusul poate fi generat cu uurin din material vegetal de provenien diferit, chiar i din esuturi cu structur definitiv. 'stfel, prin inocularea de liber secundar, muguri, meristeme, internodii, fragmente de frunze, pe mediu bogat n +,C!, se a unge uor la formarea de calus. Celulele esutului calusal pot fi mai compacte, legate ntre ele, sau pot fi mai la%e, formnd un calus friabil, grun os, separabil n fragmente granulate, de mrimi diferite, mai greu dezagregabile, sau spumos, ce se separ n formaiuni tisulare fine, adecvat pentru iniierea unei culturi de celule. Consistena i friabilitatea esutului calusal depind de specie, de natura organelor din care au fost detaate e%plantele generatoare de calus, de tipul fitohormonilor de cretere prezeni n substratul de cultur i uneori de condiiile de cultur.

Capacitatea organogen sau embriogen a esutului calusal este dependent att de factorii endogeni i e%ogeni, de numrul repica elor fcute, de condiiile de cultur i de vrsta calusului. Se cunosc cazuri de calusuri care subcultivate periodic, chiar i dup cinci ani, i menin o potenialitate ridicat de a regenera plante "la tutun#. Calusul provenit din plantele monocotiledonate "cereale# are o capacitate regenerativ sczut, evaluat la cteva sptmni "Conger, ),*)#. !intr-un inocul iniial se obine calus de tip primar, ce conine un numr de apro%imativ 1- --- celule. !up cca ase sptmni, calusul primar este suficient de bine dezvoltat pentru a putea fi subcultivat pe un mediu nou. Calusul transferat pe mediu proaspt, se numete calus secundar. Calusul obinut poate fi de tip regenerativ care totdeauna d natere la noi plante i un calus de tip neregenerativ ce prezint, de regul, o cretere lu%uriant, din el difereniindu-se rdcini, i uneori mugurai, dar niciodat plante ">abors, ),*+#. 'ceste dou tipuri de calus au mai fost denumite calusuri embriogene i neembriogene. Calusul embriogen este dens, translucid sau opac de culoare alb-lptoas, spre galben, ori galben-verde. Citologic se remarc zone compacte, cu celule nedifereniate, ce pot genera embrioni sau embrioizi, din care ulterior se vor forma plante complet formate. Calusul neembriogen este constituit dintr-o mas cristalin, transparent, de culoare alb, brunie sau verde. 'cest tip de calus prezint o consisten mai la%, fiind mai friabil, desfcndu-se uor n pachete de celule. 0egiunile friabile prezint celule mari, mult vacuolizate. 'ceste regiuni genereaz rdcini i mai rar mugurai dar niciodat plante. >abors a fost primul care a dovedit c cea mai ridicat capacitate regenerativ, meninut timp ndelungat o prezint calusul embriogen, denumit de tip regenerativ. 8ot >abors a observat c acest calus regenerativ tinde s devin neregenerativ: dup producerea acestei reversibiliti procesul este definitiv, ntruct cele dou forme sau tipuri de calusuri, diferite funcional, nu sunt interconvertibile. !e altfel, cele dou tipuri de calusuri necesit fitohormoni diferii, n doze variate, att pentru impulsionarea i susinerea creterii ct i pentru difereniere. !e regul, calusul neregenerativ crete abundent, n timp ce calusul regenerativ are o cretere mult mai lent, chiar i pe medii potrivite scopului meninerii unei creteri susinute a acestuia. &entru a prentmpina dezvoltarea neomogen a calusului se urmrete obinerea unui calus regenerativ omogen sau cel puin predominant ca mas, ntr-o populaie de celule calusale. >abors a remarcat i faptul c ceea ce la un anumit moment, ntr-un anumit stadiu de dezvoltare a calusului, pare s fie esut de tip neregenerativ, poate genera, n continuare, regiuni regenerative, ce pot fi izolate i subcultivate "Cachi, ),*C#. =recvent, cele mai bune medii de cultur, adecvate creterii optime a esutului calusal, nu constituie medii corespunztoare producerii calusului de tip regenerativ. (n general, mediul 9insmaier-S4oog "),31# sau cele de compoziie similar, respectiv srace n azot cu p.-ul 1,1 sunt de preferat. 9a cereale se recomand adugarea n mediu a acidului +,C,1 triclorfeno%iacetic, avnd efect pozitiv n susinerea creterii calusului. 'cest mediu ns nu este cel mai potrivit pentru inducerea i meninerea proceselor regenerative. (n general, calusul care provine din rdcini de plantule de cereale posed mai multe regiuni cu calus de tip regenerativ, n raport cu calusul derivat din embrioni imaturi. !ar i la calusul bogat n zone regenerative acestea reprezint numai cca )-)-H din totalul masei calusale. !ac regiunile cu calus de tip regenerativ sunt subcultivate pe medii care s impulsioneze i s susin procesele regenerative, celulele lui vor da n final natere la plante. Calusul de tip regenerativ poate fi obinut i din calusul secundar, prin meninerea calusului regenerativ pe mediu potrivit creterii acestuia i nefavorabil obinerii de plante, intervenindu-se periodic, prin subcultivri de ntreinere. &e alt cale se pot identifica i izola insulele de calus regenerativ, pe msur ce ele apar pe calusul de tip neregenerativ, realizndu-se transferarea lor pe un mediu de cretere adecvat.

(n decursul timpului s-a constatat c se obine mai mult calus din inoculii cultivai la ntuneric dect din cei crescui la lumin. 0egiunile cu calus regenerativ sunt mai greu depistabile pe calusurile crescute la ntuneric. &rocentul de formare al calusului regenerativ crete ns la calusul crescut n condiii de ntuneric. 9a gru, calusul trebuie transferat la interval de cinci sptmni, pe mediu potrivit induciei diferenierii de plante. 9a calusul de gru, regenerarea se realizeaz pe un mediu lipsit de fitohormoni de cretere: astfel din calusul de tip regenerativ, n cca +-1 sptmni dup transferarea pe mediu adecvat proceselor regenerative, are loc formarea de plante. &e un astfel de mediu, calusul de tip regenerativ nu va mai crete. !ac calusul este mi%t, componenta neregenerativ continu s creasc mult: concomitent, ns, din poriunile de calus de tip regenerativ, n cultur se difereniaz i plante. !up dou subcultivri ale calusului de tip regenerativ, pe mediu lipsit de fitohormoni de cretere, potrivit inducerii neoformrii de plante, se recomand transferarea calusului rmas, pe un mediu coninnd au%in, pentru a favoriza continuarea creterii acestuia. &lantele obinute sunt detaate de calus i sunt plasate n vase deschise, coninnd perlit, care va fi udat cu ap de la robinet, urmnd ca dup )-+ sptmni, plantele bine nrdcinate, s fie transferate n ghivece cu pmnt n amestec cu perlit. Calusul poate fi folosit i n obinerea unei culturi de celule, cultivndu-l pe medii lichide, obinnd-se astfel suspensiile celulare folosite n diferite scopuri. (n vederea obinerii de calus se parcurg urmtoarele etape6 -alegerea materialului vegetal, din care se va e%ecuta prelevarea e%plantelor. Calusul poate fi obinut din e%plante provenite din diverse surse6 semine, embrioni, rdcini, esut de rezerv, frunze, ramuri, antere, ovare: -prepararea mediilor de cultur i alegerea tipului de mediu se vor face n funcie de scopul propus. 'tunci cnd scopul este doar obinerea de calus se poate utiliza un mediu de cultur oarecare, coninnd substane anorganice "macro i microelemente# i substane organice "surs de carbon organic, vitamine, aminoacizi i fitohormoni#, iar solidificarea mediului se realizeaz cu agar: -sterilizarea recipientelor i a mediilor de cultur: -pregtirea materialului vegetal n vederea dimensionrii e%plantelor. Se realizeaz curirea organelor i dezinfectarea lor, folosind diverse procedee n funcie de tipul de e%plant utilizat: -dimensionarea e%plantelor este diferit n funcie de specia la care se lucreaz i de tipul de organ folosit ca surs de e%plante: -inocularea e%plantelor se realizeaz n condiii aseptice, la hota cu flu% de aer steril, fie pe mediu solid fie pe mediu lichid cnd ns este necesar agitarea n vederea aerrii culturii: -incubarea inoculilor se face fie la ntuneric, fie la lumin, de regul la temperatura de o +1 C: -observarea proceselor de formare a calusului i urmrirea creterii acestuia se face periodic, la diverse intervale de timp: -subcultivarea periodic se realizeaz prin fragmentarea calusului i inocularea fragmentelor pe medii proaspete. Subcultivarea se efectueaz la cca C-3 sptmni, fiind obligatorie pentru meninerea viabilitii calusului. 7ste important inerea unei evidene stricte a numrului de subcultivri suportate de ctre fiecare fragment de esut calusal: -urmrirea proceselor de organogenez sau de embriogenez funcie de condiiile n care a fost cultivat calusul, de provenien i de vrsta acestuia. Oesutul calusal are o utilizare variat. 7l constituie unul din materialele biologice asupra cruia se pot aplica diferii ageni selectivi, n scopul obinerii de linii rezistente, pentru selecionarea de plante care s fie tolerante la prezena n mediul lor de via a unui anumit factor de stres. >abors "),*+# a reuit s obin calus i apoi plante rezistente la concentraii

ridicate de >aCl, substan introdus n concentraii crescnde n mediul de cultur. 'stfel, a raportat obinerea de plante de -riticum0 +risa i !ennisetum tolerante la concentraii ridicate de >aCl "-,3--,,H#, precum i la #vena la care pragul de suportabilitate a fost ridicat la -,-;H. 9a gru, cel mai bun calus, care rspunde pozitiv la astfel de tratamente este acela obinut din rdcinia embrionar, dezvoltat n condiiile germinrii cariopselor pe medii aseptice. 'tunci cnd se urmrete cultivarea in vitro a embrionilor imaturi, boabele de gru se sterilizeaz, dup care, la microscop, se detaeaz embrionii, evitndu-se lezarea acestora i inoculndu-i pe mediu de cultur. 2ediul de cultur recomandat pentru gru "cariopse sau embrioni imaturi# este 9insmaier-S4oog, coninnd macro i microelemente, vitamine, surs de carbon "zaharoz#, fitohormoni "+,C! sau +,C,1 8# i agar. 'genii selectivi la care dorim s obinem toleran pot fi introdui fie n mediul de cultur, preparat pentru inducerea formrii de calus, fie se adaug n substratul de cultur destinat repicrii calusului. (n cazul n care se utilizeaz ca material biologic de iniiere a culturii de calus, o varietate n mod natural mai rezistent la aciunea duntoare a agentului selectiv n cauz, se realizeaz o reducere a timpului de obinere a unei linii rezistente, cu caracterele dobndite stabilizate, transmisibile descendenilor. S-a constatat c stabilitatea caracterelor dobndite este dependent de durata n care s-a petrecut imprimarea acestor caractere, respectiv durata de timp n care s-a operat selecia. &entru a fi atins o stabil toleran, chiar i n condiiile absenei ndelungate din mediu a agentului selectiv, sunt necesare cel puin ase luni de clire i selecie, prin subcultivri repetate. 2enionm c i n situaia unor e%perimente de acest gen este prezent fenomenul de manifestare a diferenierii capacitii regenerative a calusului, n calus de tip regenerativ i neregenerativ. >umai din calusul de tip regenerativ se poate induce formarea de noi plante: calusul de tip neregenerativ este inutilizabil n acest gen de e%perimente. Calusul poate fi utilizat i ca instrument de cercetare n diferite e%perimente de fiziologie, n studierea problemelor de morfogenez, n urmrirea unor modificri ultrastructurale, n analize de ordin biochimic, sub aciunea unor anumii factori, administrai e%ogen sau n dependen de natura inoculilor din care a provenit calusul. (n concluzie, calusul poate fi utilizat ca monitor al reaciei celulei vegetale la o serie de substane sau condiii de cultur, permind efectuarea unor e%perimente de fiziologie privind6 creterea, reacia la pesticide, no%e, ioni grei, respiraia, morfo i organogeneza, testarea viabilitii celulare, a biogenezei unor produi primari sau secundari de metabolism. 9.1.D.4 C'&$'"! ,e e+8"i(ni :i en,(%-e"+ Cultura de embrioni sau de segmente embrionare se practic n diferite scopuri, att pentru cercetri de fiziologie a seminei ct i n e%periene de hibridri intersoiuri, interspecii i intergenuri. (nc din ),-C, .anning a demonstrat posibilitatea cultivrii pe medii aseptice a embrionilor de ,ap anus i Cac learia pe soluii minerale cu adaos de zaharoz, obinnd plantule transferabile n sol. 2etodele de cultivare a embrionilor pe medii aseptice au fost perfecionate continuu. Ban Xverbee4 i colab. "),C)# au definitivat un procedeu care le-a sugerat lui 9ee "),11# i 2orel "),13# s efectueze e%periene de multiplicare in vitro folosind ca material iniial embrioni e%trai din semine coapte. Seminele au fost sterilizate, dup care au fost mbibate n ap, )+-+C ore, i apoi, n condiii aseptice a fost izolat embrionul. 7mbrionii pot fi cultivai in vitro, ca atare sau se opereaz detari de fragmente embrionare, sau sunt cultivai n scopul obinerii de calus, care este utilizat ulterior n alte

e%perimente. 7%ist i practici constnd n grefarea de embrioni pe endospermul aparinnd altor specii sau genuri, operaie denumit hibridare in vitro. &roblemele ridicate de cultura embrionilor sunt, asemenea celorlalte tipuri de e%plante, comple%e. En rol deosebit revine momentului n care se e%ecut e%plantarea embrionului, respectiv timpul scurs dup fecundare, din clipa formrii zigotului i pn la inocularea lui in vitro, perioad care e%prim vrsta embrionului n zile. $vulul fertilizat adpostete zigotul care, dup formare, ncepe s se divid i se hrnete din rezervele endospermului. (n aceast faz celulele embrionului sunt heterotrofe: pentru creterea i dezvoltarea lor ele au nevoie de6 glucide, aminoacizi, vitamine i hormoni. (n aceast etap e%plantarea embrionului i inocularea lui pe medii aseptice creeaz probleme deosebite pentru realizarea cadrului fiziologic optim, adecvat continurii proceselor de cretere i de dezvoltare. !e regul, la dicotiledonate, embrionul este apt pentru cultivare pe medii aseptice n momentul n care sunt formate cotiledoanele, respectiv cnd ncepe diferenierea intern a celulelor embrionului. stadiul critic de transformare endogen a structurii embrionare variaz de la specie la specie i uneori este dependent de condiiile meteorologice. (n unele cazuri, cnd este important izolarea timpurie a embrionului de sub aciunea plantei mam, poate fi realizat o cretere corespunztoare a acestuia numai dac embrionul este izolat mpreun cu nucela sau cu esutul nutritiv, sau dac se detaeaz ovulul n ntregime realizndu-se astfel inocularea lui pe medii aseptice, corespunztoare ca i compoziie. &rin cultura in vitro de embrioni se poate prentmpina avortarea sau dezvoltarea anormal a embrionilor ca urmare a instalrii unei incompatibiliti ntre embrion i esutul nutritiv, aa cum este cazul hibrizilor se%uali intervarieti interspecii i intergenuri, sau al formrii de hibrizi sterili. Spre deosebire de cultura de embrioni imaturi, care ridic mari probleme, cultura de embrioni maturi este mult mai uor de realizat. 7mbrionii maturi necesit un mediu de cultur simplu, care are n compoziia sa sruri minerale i o component glucidic. 'dugarea la mediul de baz a vitaminelor "acidul nicotinic, acidul ascorbic, pirido%in# impulsioneaz creterea esuturilor, iar adugarea fitohormonilor de cretere are drept scop urmrirea evoluiei embrionilor n prezena acestora, pentru a asigura stimularea creterii unui anumit organ sau pentru inducerea formrii de calus. (n mediile aseptice destinate culturii embrionilor imaturi, adesea se recomand adiionarea unor e%tracte naturale6 hidrolizat de casein, lapte din nuc de cocos, suc din fructe de tomate sau e%tract de endosperm. (n general, dezvoltarea embrionilor in vitro se petrece natural, cu condiia ca ei s fie e%plantai n acea faz de formare care s le permit, n continuare parcurgerea evoluiei fireti a proceselor de ontogenez i s se respecte integritatea lor morfoanatomic: cu ct stadiul n care au fost prelevai a fost mai timpuriu cu att i factorii de care depinde dezvoltarea lor sunt mai compleci i greu de reprodus. (n timp ce plantulele provenite din embrionii maturi au o dezvoltare similar cu cei dezvoltai n condiii naturale, sau prezint chiar un uor avans n cretere plantulele dezvoltate din embrionii imaturi sunt plpnde, iar n sol dovedesc o cretere mai lent i sunt mai firave. Cultura de embrioni imaturi, recoltai foarte tineri, uneori conduce la obinerea de plantule malformate, chiar dac mediile de cultur au o compoziie adecvat dezvoltrii acestora. (n unele cazuri, dup polenizarea interspecific sau intergeneric, dezvoltarea embrionilor a fost e%trem de lent, ceea ce a fcut ca e%plantarea embrionilor i cultivarea lor in vitro, s fie imposibil. 8aira i 9arter "),N*# au tratat ovulele fertilizate cu acid 7-aminon-caproic, facilitnd astfel, creterea embrionilor hibrizi, realizai ntre gru i secar, depind barierele fiziologice care mpiedicau creterea acestora. !eci, pretratamentul florilor femele cu anumii regulatori de cretere, dup polenizare, impulsioneaz creterea embrionilor pn la faza n care ei pot fi e%trai i cultivai, cu succes, pe medii aseptice.

&rin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante mature din hibrizi de trifoi +n % Cn, mbinndu-se caracterul de perenitate cu cel al calitii fura ului realizat "7vans, ),3+#. 0ezultate bune s-au obinut i n regenerarea de plante din embrionii altor specii fura ere, obinndu-se hibrizi interspecifici de *elilotus0 "otus0 ! aseolus0 i *edicago. 8ot prin cultura de embrioni s-a reuit obinerea de plante la specii ale cror semine nu germineaz "banane# sau a celor care se nmulesc greu prin semine "specii forestiere#. (n unele cazuri scoaterea embrionilor din starea de laten, prin cultivarea lor pe medii aseptice a constituit o metod eficient n scurtarea ciclului de dezvoltare a plantelor. !e asemenea, embrionii pot s serveasc i ca esuturi de plecare n multiplicarea i propagarea rapid a unor plante "la specii ornamentale# atunci cnd acest lucru este dificil de realizat prin utilizarea altor tipuri de e%plante. $ atenie deosebit trebuie acordat aspectelor teoretice i practice pe care le ridic problemele de embriologie e%perimental la gimnosperme. Cea mai veche cultur de embrioni la gimnosperme este citat ca fiind efectuat de ctre Schmidt n anul ),+C, cnd a cultivat pe un mediu organic embrioni de !inus sylvestris. 2ai trziu, n ),;3 0ue a reuit cultivarea in vitro a embrionilor provenii de la cteva specii6 !inus resinosa0 !icea canadensis0 -suga canadensis i !seudotsuga men%iensii i a demonstrat, totodat, c embrionul imatur de gimnosperme "de +-C mm# poate fi cultivat pe medii aseptice, pn la stadiul de plantul. 7%perimentele ulterioare au reliefat faptul c embrionii de gimnosperme pot fi crescui in vitro, n lipsa megagametofitului "Cachi, ),*C#. 9a cultura de embrioni, presiunea osmotic, sau sursa de carbon organic, oac un rol important n evoluia acestora, atunci cnd embrionii sunt e%cizai i sunt cultivai in vitro. !e e%emplu, embrionii de !inus strobus0 pe mediu 2urashige-S4oog, cun un coninut de ;-3H zaharoz i hormoni, vor genera plantule, n timp ce pe un mediu cu numai )-+H zaharoz, se constat o serioas limitare a dezvoltrii primordiilor radiculare. &rin cultivarea in vitro a embrionilor de -a$aus embryo s-a reuit scoaterea acestora din starea de laten, odat cu detaarea i desprinderea lor de sub aciunea megagametofitului. Cultura de endosperm constituie un e%celent instrument pentru studierea problemelor de morfogenez i se refer la cultura endospermului de tip secundar, derivnd din diviziunea nucleului secundar al sacului embrionar, avnd celule triploide, gimnospermele avnd un endosperm de tip primar. 'mbele tipuri de endosperm dein un rol important n alimentarea i susinerea creterii embrionilor. 9a plantele dicotiledonate, de regul endospermul este consumat n primele faze ale dezvoltrii embrionului, rolul de depozitare a rezervelor nutritive revenind cotiledoanelor. &rimele e%perimente constnd n proliferarea endospermului imatur de porumb au fost efectuate nc din anul ),;; de ctre 9ampe i 2ills. 9a 0ue, n anul ),CN, a realizat creterea nelimitat a endospermului de porumb. Cercetrile menionate au deschis calea unor e%perimente prin care s-a dovedit c acest esut iniial are o capacitate ridicat de proliferare, formeaz uor rdcinie, mugurai i chiar plantule. (n aceast direcie, Straus i 9a 0ue n ),1C, au obinut rezultate e%celente cultivnd endosperm de porumb, la )+ zile de la polenizare. Cele mai bune varieti, potrivite pentru acest scop sunt cele de porumb zaharat. 7ndospermul de porumb, la * zile dup polenizare, nu crete pe medii aseptice. !eci, pentru reuita iniierii culturii este important stadiul n care se afl diferenierea celulelor embrionului. 7ndospermul matur, doar la cteva specii sau varieti, corespunde scopului inducerii formrii de calus i anume6 1ea mays0 "olium0 Santalum0 ,icinus0 Coffea arabica0 Croton0 !etroselinum ortense. !intre acestea numai la unele specii se manifest procese de organogenez. 7ndospermul de porumb, de ricin, precum i la alte specii, genereaz o mas

de calus n continu cretere, fr organogenez, n timp ce la nivelul valusului de !etroselinum se observ embriogeneza. Cultura de embrioni ofer un important instrument n cercetrile de embriologie i n embriogeneza e%perimental, constituind un sistem de tip monitorial n redarea fazelor de cretere ale diferitelor pri componente ale embrionilor. 'ceste etape pot fi studiate n dependen de natura substratului de cultur, de vrsta embrionului, n funcie de condiiile de mediu, oferind importante informaii privind interferena diferitelor etape metabolice cu regulatorii de cretere, procesele de depozitare ale substanelor de rezerv n esuturi, cu factorii care pot intervenii, pozitiv sau negativ, n formarea i creterea embrionilor. 9.1.D.6 C'&$'"! ,e ()!"e, ()'&e :i ,e e%'$ n'#e&!" (n hibridare poate e%ista, adeseori, o incompatibilitate ntre partenerii se%uali. !e aceea prin utilizarea metodelor culturilor in vitro se poate, uneori, facilita fie accesul polenului la ovul, fie acceptarea de ctre ovule a autopolenizrii ori a polenizrii ncruciate, nvingndu-se astfel barierele de autoincompatibilitate, a celor de incompatibilitate la ncruciri, operaiunile fiind fcute n scopul obinerii de semine viabile. <ncompatibilitatea dintre ovule i polen este provocat de ctre diferite cauze, de ordin endogen i anume6 o prim selecie a polenului se face la nivelul stigmatului. 'ceasta poate prezenta o conformaie morfologic necorespunztoare, mpiedicnd angrenarea ornamentaiilor e%inei polenului pe vilozitile stigmatului: pe de alt parte, natura umed sau uscat a suprafeei stigmatului poate constitui un impediment n reinerea polenului pe stigmat i n crearea mediului optim: substanele secretate de ctre celulele epiteliale ale stigmatului pot stimula sau inhiba, germinarea polenului precum i creterea tubului polinic. (n unele cazuri e%ist o autoincompatibilitate natural, generat de faptul c plantele care trebuie ncruciate prezint diferene morfologice constnd n mrimea polenului, amplasarea anterelor n floare etc. 'lteori, maturitatea organelor se%uale se face n momente diferite, caz n care se impune ca, n prealabil, polenul s fie recoltat i s fie conservat, pentru o anumit perioad de timp. 7%perimentele de polenizare i fecundare artificial in vitro trebuie precedate de o cunoatere a bilogiei florilor cu care se dorete efectuarea e%perienelor, att n ceea ce privete morfologia, etapele de morfogenez ct i a compatibilitii i a incompatibilitii, a antezei i a factorilor care pot intervenii favorabil sau pot inhiba fiecare din fazele respective. &e de alt parte trebuie fcute testri prealabile cu privire la mediile de cultur adecvate meninerii microsporilor la un potenial biologic i ntr-o stare optim de viabilitate, pentru asigurarea creterii tubului polinic, pentru meninerea viabilitii prilor componente ale pistilului. &olenizarea i fecundarea artificial in vitro se poate face, deci, la nivelul stigmatului unui pistil cultivat pe mediu aseptic, ori prin punerea n contact a polenului, respectiv a tuburilor polinice, cu ovarele sau cu ovulele e%cizate. 'plicarea polenului pe stigmatul pistilelor, cultivate pe medii aseptice, se practic n cazul speciilor compatibile se%ual, cnd nu e%ist impedimente morfofiziologice, privind fi%area i germinarea polenului la nivelul stigmatului. &rin aceast metod s-a reuit autopolenizarea la #ntirr inum majus "Esha, ),31#, n schimb la !etunia violacea, specie autocincompatibil s-a constatat c autopolenizarea in vitro a fost urmat de o cretere a pistilului dar dup un timp acesta s-a brunificat "Shivanna, ),31, citat de Cachi, ),*C#. !eseori, ns, polenizarea i fecundarea in vitro a ovulelor au euat, n condiiile utilizrii tehnicilor constnd n folosirea, ca partener femel, a pistilului,motiv pentru care s-a trecut la reproducerea acelorai ncruciri, dar opernd cu ovare sau ovule.

2eritul primei culturi de ovare i revine lui 9a 0ue "),C+#, care a reuit cultivarea in vitro a ovarelor de "ycopersicon pimpinellifolium, neobinnd, ns n final semine viabile. (n aceast perioad, >itsch "),C,-),1)# a cultivat in vitro ovare de "ycopersicon esculentum0 Cucumis angeria0 ! aseolus vulgaris i 2icotiana tabacum. 2ediile de cultur au fost comple%e i au coninut ca fitohormoni6 acidul +,C diclorfeno%iacetic i acidul +,C,1 triclorfeno%iacetic. $varele au fost recoltate fie nainte de polenizare fie dup ce polenizarea s-a petrecut n mod natural. (n vitro ele au crescut, dar n final nu au format semine. &rin tehnicile de cultur in vitro a ovarelor au fost obinui hibrizi din ncruciarea hibrizilor diploizi de Brassica c inensis i autotetraploidul Brassica pekinensis "<nomata, ),3*#. .ibrizii triploizi au prezentat caracterele intermediare ntre cei doi prini. 9a +ry%a sativa i la Ha3ort ia turgida, 2a umdar a obinut, n anul ),N-, plantule din ovare nepolenizate, cultivate pe medii aseptice. 2itra "),N+# a reuit obinerea de embrioizi din pereii ovarelor nepolenizate de Citrus aurantifolia i Citrus sinensis, cultivate in vitro. (n general cultura de ovare servete la inducerea artificial a poliembrioniei, la seminele care, normal, sunt monoembrionare. 7%ist numeroase cercetri care atest rolul deosebit pe care l oac prile florale n dezvoltarea fructului. 'stfel, 2aheshFari i 9al "),3), citai de Cachi, ),*C# e%perimentnd cu flori e%cizate, cultivate in vitro, au constatat la (beris amara formarea unor fructe normale, numai dac, n condiiile inoculrii lor la o zi dup polenizare, acestea prezentau caliciu. 9ipsa caliciului poate fi suplinit prin adugarea n mediul de cultur a unui surplus de zahr. (n cazul n care florile au fost e%cizate i inocularea s-a fcut la opt zile dup polenizare, lipsa caliciului nu a mai fost resimit. Cultivarea pe medii aseptice a ovulelor a permis stabilirea unui contact direct ntre polen i ovule, ceea ce a facilitat accesibilitatea tubului polinic pn la sacul embrionar. (n acest mod, s-a realizat actul de fecundare ntre indivizii ndeprtai filogenetic, nlturndu-se barierele incompatibilitilor genetice i obinerea, n final, de semine viabile. (nc din anul ),;+, Rhite a ncercat s cultive ovule de #ntirri inum, dar a obinut calus, generat din integumentele ovulului. 'poi, 9a 0ue cultivnd in vitro ovule de 4ryt ronium americanum, observat o cretere a acestora fr ca s obin maturizarea lor. (n anumite cazuri, de e%emplu la ovulele de ,ibes rubrum, n condiiile cultivrii in vitro a acestora, s-a observat apariia fenomenelor de poliembrionie. 7mbrionii izolai au continuat s prolifereze numeroi ali embrioni "SatQ4o, ),N1#. S-a constatat c esutul placentar e%ercit un efect pozitiv asupra creterii ovulelor cultivate in vitro, favoriznd formarea i maturarea seminelor. Se presupune c esutul placentar cedeaz ovulelor anumite substane stimulatoare. Substanele respective nu prezint o specificitate, ntruct ovule fertilizate, provenind de la diferite specii sau genuri, au fost grefate, cu rezultate favorabile, pe placent de Capsicum. (n condiiile cultivrii acestora in vitro, ovulele s-au maturizat i au format semine viabile. &ot fi cultivate in vitro att ovule fertilizate ct i ovule nefertilizate. $vulele pot fi recoltate ca fiind fertilizate n condiiile naturale sau pot fi fertilizate prin polenizarea lor, cultivate fiind pe un mediu aseptic. 7%ist perspective mari n ceea ce privete realizarea prin culturi in vitro a unor polenizri ncruciate, interspecifice i intergenerice care n condiiile obinuite, n natur duc fie la incapacitatea embrionului format n a-i menine viabilitatea, fie smna rezultat se dovedete inapt n a suporta dezvoltarea embrionului. (n literatur se citeaz hibridul realizat ntre "olium perene i .estuca rubra, utilizndu-se ovule detaate din floare, la cinci zile de la polenizare. &lantele rezultate au fost asemntoare cu .estuca rubra.

(nvingerea barierelor morfo-fiziologice creeaz posibilitatea realizrii de hibrizi interspecifici care, n viitor, pot prezenta un interes economic ma or i care n mod natural nu pot fi obinui prin hibridare se%uat. S-au reuit realizarea de e%perimente privind cultivarea pe medii aseptice a nucelei. &ornind de la acest tip de esut, in vitro se poate induce poliembrionia. 'stfel, n ),N3, 2ullins i Srinivasan au provocat formarea de embrioizi la nivelul ovulelor de Vitis vinifera 5 Cabernet Sauvignon, specie n mod normal monoembrionar. !in ovulele nefertilizate s-a format un calus nucelar, din celulele cruia s-au difereniat embrioizi, ceva mai mari dect embrionii zigotici. &lantulele rezultate au fost viabile. 9a fertilizarea ovulelor poate fi folosit fie polen proaspt, recoltat n perioada iniierii culturilor de ovule, ovare sau de pistile, fie polen conservat, mai ales n cazul urmririi realizrii de polenizri interspecifice sau intergenerice. (n ambele cazuri este necesar ca prealabil inoculrii, polenul s fie testat n ceea ce privete capacitatea germinativ, creterea tubului polinic i s se studieze comparativ eficiena ctorva reete de medii de cultur, n vederea asigurrii unei creteri optime a tubului polinic, respectiv conservarea i susinerea ntregului potenial biologic al celulei generative i a celei vegetative. (n cazul n care polenizarea se face la nivelul stigmatului, este necesar s se apro%imeze dac tubul polinic are o lungime corespunztoare pentru a fi asigurat accesibilitatea lui la ovule: n caz contrar se renun la cultura de pistile i ovulele vor fi e%cizate i cultivate ca atare. (n acest mod, va fi facilitat fecundarea i se prentmpin epuizarea celulei generative, n decursul parcurgerii traseului de la stigmat, pn la sacul embrionar "Cachi, ),*C#. Cultivarea in vitro a pistilelor, ovarelor, ovulelor i a altor pri florale, precum i a ansamblelor de componente florale a permis completarea cunotinelor actuale privind funcionarea organelor respective i privind biologia fecundrii, a formrii embrionului, a seminei i a fructului. 'ceste cunotine servesc la obinerea de noi succese n nvingerea barierelor incompatibilitilor e%istente n hibridarea se%uat, fapt deosebit de important, ntruct prin nmulirea se%uat se poate rennoi continuu, potenialul biologic al plantelor, mbogindu-se zestrea ereditar, cu caracterele motenite de la doi prini, posednd acumulri genetice diferite. 9.1.D.9 C'&$'"! ,e #e&'&e &oate fi definit ca o cretere a celulelor libere sau a unor mici agregate celulare pe un mediu de cultur lichid. (n funcie de momentul n care se face aprecierea acestui aspect, gradul de agregare al celulelor poate fi mai mic sau mai mare, fiind mai redus n momentul iniierii culturii i mult mai accentuat n perioada optim de cretere. 'gregatele celulare pot fi datorate unei ineficiente dezmembrri a celulelor inoculate, a separrii i individualizrii pariale a acestora. !e asemenea ele pot fi i rezultatul unor repetate diviziuni celulare, fr separarea celulelor, iar n astfel de cazuri frecvena agregatelor crete pe msura atingerii perioadei ma%ime de diviziune celular. Elterior dei frecvena diviziunilor scade, mrirea agregatelor celulare se datoreaz creterii n volum a celulelor. Cea mai perfect cultur de celule nu este alctuit numai din celule libere. &entru a reduce numrul de agregate se practica filtrarea culturii. 'gregatele care persist i dup filtrare vor deine ma%imum C-)- celule, uniforme din punct de vedere genetic "Street, ),N3#. Gradul de dispersare a celulelor, ntr-o suspensie celular, depinde de durata creterii celulelor n cultur, originea acestora, compoziia mediului i condiiile de cultur "Street, ),NN#. 2ediul de cultur optim, de cultivare la celulele de gimnosperme difer de mediul de folosit pentru cultivarea celulelor la plantele monocotiledonate, dar i fa de mediul folosite la dicotiledonate. Enul din constituenii mediului de cultur de care depinde meninerea

celulelor n suspensie sunt fitohormonii de cretere care pot influena cultura celulelor in vitro prin natura lor i concentraia folosit. 'stfel un coninut ridicat de au%in determin creterea numrului de celule n suspensie, iar reducerea coninutului n acest fitohormon, descrete capacitatea celulelor de a se separa "8orreQ i 0einert, ),3+#. !e asemenea s-a constatat c procesele de agregare celular sunt influenate i de prezena n mediul de cultur a etilenei dar i de creterea concentraiei n glucide. $ cultur celular ideal trebuie s fie omogen din punct de vedere morfologic i biochimic. >umai o cultur de celule individualizate, obinute prin clonarea unei singure celule, meninut n condiii care s pstreze stabilitatea nuclear, constituie un material biologic valoros pentru operaiunile de mutagenez, n izolarea de linii celulare, n selectarea de mutani, de un anumit tip. Culturile de celule de lung durat manifest o diversitate genetic n cadrul populaiei de celule "Cachi, ),*C#. &entru meninerea celulelor ntr-o stare activ de diviziune i astfel creterea gradului de agregare, suspensiile celulare trebuie subcultivate la intervale scurte de timp. !in momentul iniierii unei culturi celulare i pn n momentul practicrii unei subculturi se parcurge un interval de timp care se numete ciclu de cretere a culturii. (n decursul acestui ciclu se produc schimbri n ceea ce privete viteza de diviziune i de cretere a celulelor. Se distinge o faz incipient de cretere a vitezei de multiplicare celular, urmat de o perioad de plafonare a frecvenei diviziunilor, dup care, fr o subcultivare a celulelor, apare un declin, finalizat cu oprirea diviziunilor. Celulele cultivate ntr-un volum finit de mediu nutritiv constituie celule izolate sau agregate celulare cuprinse n acelai flacon de cultur. (n aceste condiii creterea nceteaz atunci cnd nutrienii de baz din mediu s-au redus sau au fost epuizai. 7%ist i sisteme nchise de cultur care asigur remprosptarea continu a mediului consumat: celulele sunt separate mecanic din mediul eliberat din vasul de cultur aciune care asigur funcionarea sistemului i recoltarea biomasei produse. (n acest sistem se realizeaz un echilibru ntre cantitatea de mediu introdus n sistem i mediul evacuat. !urata meninerii n condiii de viabilitate a unei culturi, fr a se produce modificri, depinde de specie, de condiiile de cultur, de epuizarea din mediu a constituenilor, care pot limita diviziunea i creterea, de p.. !ea asemenea o%igenul i glucidele din mediu pot influena creterea, astfel c o reducere a celor dou componente determin reducerea sau chiar stoparea creterii celulelor. Subcultivarea celulelor nainte de finalizarea perioadei e%poneniale de cretere a celulelor permite obinerea unor populaii de celule mai stabile. &rin ncorporarea n mediul de cultur a unor concentraii reduse de enzime se poate realiza separarea celulelor, ntruct enzimele, n diluii adecvate, nu influeneaz negativ rata de cretere, permind obinerea de suspensii celulare cu celule mai uniforme din punct de vedere morfologic i metabolic. 0ata de cretere a numrului de celule n decursul ciclului de cretere a culturii se modific din momentul iniierii culturii, pn la oprirea diviziunilor. $ prim faz, imediat dup inoculare, const ntr-o ntrziere a declanrii proceselor de multiplicare i de cretere, dar n urmtoarele )- zile numrul de celule per unitatea de volum crete e%ponenial, urmnd apoi faza de staionare i apoi faza de declin. =aza e%ponenial de cretere se caracterizeaz ca o perioad finit de timp, n care rata de cretere a biomasei, raportat la unitatea concentraiei de biomas este constant. =aza de cretere e%ponenial este e%tins n condiiile n care cultura este iniiat cu o densitate redus a celulelor per unitatea de volum "Cachi, ),*C#. &entru a menine culturile ntr-o faz de cretere e%ponenial trebuie prevenit situaia limitrii nutrienilor din mediu ca o consecin a epuizrii acestora. (n acest sens se impune subcultivarea frecvent a celulelor. 7ri4sson a subcultivat cultura de Haplopappus

gracilis i la un interval de C* ore. 9a o cultur de #cer pseudoplatanus, !orre i colab. "),N)# au realizat subculturile la un interval de N zile, obinnd o densitate iniial de + % )-1 celuleDml. &entru culturile de celule se pot folosi urmtoarele tipuri de dispozitive6 -fermentatoare 5 de cca ) l sau chiar mai mari, utilizate i n cultura cu volum de mediu limitat, stabilit iniial: -chemostate 5 pentru cultura continu, deschis: -fitostate 5 chemostat pentru reglarea culturii semicontinue aparate n care rata de cretere i densitatea celular sunt meninute constante, prin fi%area unei rate de introducere a factorilor nutritivi i hormonali: -turbiostate 5 sistem deschis de cultur continu, n care mediul proaspt se adaug n momentul creterii turbiditii culturii i a eliberrii, prin splare i eliminare a e%cedentului de celule. $ cultur de celule poate fi obinut pe mai multe ci. Cea mai folosit metod const n realizarea n mediul de cultur lichid a unei suspensii utiliznd ca material iniial calus, pentru ca s se realizeze o dispersare a celulelor i a agregatelor ce alctuiesc masa de calus, condiie ce poate fi ndeplinit prin efectuarea unor subculturi repetate de calus, pe medii cu balan hormonal adecvat scopului respectiv. Cel mai folosit fitohormon este acidul +,C diclorfeno%iacetic, n diferite concentraii. (n cazul n care gradul de dispersie al calusului este redus, chiar i n condiiile agitrii mediilor de cultur lichide, se vor efectua subculturi prin recoltarea supernatantului i diluarea agregatelor celulare mici n mediu de cultur proaspt. !e asemenea, n acelai scop, se poate practica recoltarea fragmentelor de calus din mediul lichid i recultivarea lor, din nou pe mediu solid, astfel c, coloniile de celule formate vor avea un procent mult mai ridicat de dispersie atunci cnd se reiniiaz suspensia celular "Street, ),N3#. $ alt metod const n omogenizarea organelor plantulelor prin triturare moderat, n omogenizator de sticl i apoi inocularea pe mediu lichid a suspensiei ce celule rezultate. (n acelai scop se pot utiliza protoplati obinui prin digestie enzimatic. Cultura de suspensii celulare se menine prin inocularea unei cantiti de mediu, dintro cultur de a e%istent, avnd o densitate cunoscut de celule, dilund-o cu mediu proaspt. !ensitatea celulelor n subcultur nu trebuie s depeasc iniial -,1-+,1 % )-1 celuleDml. (n decurs de )1-+1 zile densitatea va crete pn la cca C % )-3 celuleDml "Street, citat de Cachi, ),*C#. Cultura de celule prezint foarte multe avanta e. 7%ist specii care constituie modele n ceea ce privete reacia la condiiile create i la care procesele de citodifereniere, de organogenez i embriogenez pot fi controlate i diri ate n sensul dorit "morcov, tutun#. 'stfel, cultura de celule prezint avanta e deosebite n efectuarea unor studii la nivel celular, privind aspecte ale creterii, citodiferenierii, ale metabolismului celular. !e asemenea cultura de celule, fiind constituit ntr-o populaie omogen de celule se poate folosi n vederea inducerii variabilitii genetice i seleciei de mutani, prin e%punerea culturii la aciunea unor anumii ageni fizici sau chimici. Enul din marile obiective urmrite prin culturile de celule l constituie acela al selectrii de mutante biochimice, cum ar fi mutante rezistente la antibiotice, erbicide, metale grele, sruri, etc. &rin astfel de e%perimente au fost create linii celulare mutante, iar modificrile genetice operate la nivel celular pot fi regsite n plantele regenerate pornind de la celula care a suferit un proces de mutaie. Selectarea liniei celulare se poate face uor prin etalarea suspensiei pe medii de cultur solide, recoltarea efectundu-se n perioada creterii e%poneniale "Cachi, ),*C#. Capacitatea regenerativ depinde de gradul de agregare al celulelor, viabilitatea acestora, vrsta culturii, compoziia substratului i de condiiile de cultur.

(ntruct e%perienele de ameliorare i genetic din cmp sunt costisitoare, necesitnd mult for de munc i suprafa mare de teren, prin tehnicile de culturi in vitro aceste e%perimente se simplific, reducndu-se activitatea, n prima faz, doar n laborator, astfel c se reduc att suprafeele de lucru ct i timpul necesar obinerii rezultatelor dorite. (n plus materialul biologic valoros obinut, prin cultura de celule se poate pstra timp ndelungat prin crioconservare, n azot lichid. $ problem deosebit este aceea a obinerii de culturi de celule fotoautotrofe. Celulele cultivate pe medii aseptice dei au clorofil nu pot supravieui n lipsa zahrului din mediul de cultur. (n ncercrile fcute pe medii aseptice s-a constatat c succesul cultivrii esuturilor i celulelor clorofiliene autotrofe a fost minim, nregistrndu-se o rat sczut a creterii acestora. Bigurozitatea slab a celulelor crescute n astfel de condiii a fost e%plicat printr-o activitate fotosintetic sczut, datorat unor deficiene de cultur, care mpiedic dezvoltarea cloroplastelor i a fotosintezei. Wamada i colab."),N*# s-au ocupat de aceast problem i au a uns la concluzia c n realizarea culturilor de celule fotoautotrofe trebuie s se aib n vedere selectarea de celule care produc mult clorofil. 9umina puternic stimuleaz sintetizarea clorofilei, dar numai la o concentraie sczut de zaharoz. &rezena n mediul de cultur a unor concentraii ridicate de zaharoz inhib sinteza clorofilei. Culturile de celule au implicaii practice deosebite n industria aa zis de tip fermentativ, dup modelul biotehnologiilor care folosesc microorganismele n scopuri industriale. Mi n culturile de celule s-a asimilat i adoptat termenul de fermentatoare pentru recipientele n care se cultiv celule. 9a plantele superioare, spre deosebire de microorganisme, produii secundari de metabolism sunt depozitai n vacuole, nefiind e%cretai n mediul de cultur. 9a suspensiile celulare, derivnd din plantele superioare, durata de fermentaie este de cca )- ori mai mare dect la culturile de tip microbian. En aspect particular l constituie capacitatea celulelor cultivate in vitro de a transforma precursori sau anumii compui prezeni n mediul de cultur. Aiotransformarea poate fi utilizat pentru diferite tipuri de reacii6 hidro%ilare, dehidrogenare, hidrogenare, glicozidare, adiia de carbon, ruperea lanului de carbon. Culturile n mediu lichid prezint avanta ul unui contact mai bun al celulelor cu nutrienii, se asigur un schimb de gaze optimizat, se evit nea unsurile provocate de o eventual orientare polar neadecvat, precum i depozitarea i concentrarea n urul celulelor a produilor de metabolism, eliminai n mediu. 9.1.D.D C'&$'"! !&$(" $i-'"i ,e e2-&!n$e 8eoretic, oricare parte a plantei poate fi folosit ca e%plant pentru iniierea culturilor in vitro. <nducerea neoformrii de esuturi este dependent de specie, de natura organului, de mrimea e%plantului, natura esuturilor prezente n e%plant, sezonul n care s-a recoltat organul, modul de sterilizare, compoziia mediului de cultur, orientarea lor pe mediu precum i balana hormonal folosit n mediul de cultur. !e regul, n afar de meristemele apicale, la nivelul nodurilor, al frunzelor, al inflorescenelor, cotiledoanelor i mai rar, n poriunea internodal a tulpinilor se constat e%istena unei capaciti regenerative, a crei intensitate depinde de specie, de vrsta organului din acre se preleveaz esuturile, mrimea e%plantului, orientarea lui pe mediu de cultur, de compoziia mediului sau de condiiile din camera de cretere. (ntr-un e%periment efectuat de 9azr i Cachi "),*--),*+#, cu e%plante de crizantem de natur diferit, cultivate pe mediu de baz cu adaos de '<' "+ mgDl# i A' "+mgDl# s-a constatat c, n afar de meristeme, alte tipuri de e%plante folosite 5 de la peduncul floral, peiol, inflorescena, minibutai 5 frecvent au generat calus. 9a nivelul calusului s-a observat inducerea proceselor de organogenez, pe suprafaa superioar, formare de mugurai

iar pe cea inferioar, generarea de rdcinie. !in meristemele apicale, dup dou luni de cultivare pe medii aseptice s-au format plante, complet conformate. !in meristemele a%ilare, diferenierea plantelor s-a fcut mai lent. &lantele formate din meristeme au avut o conformaie proporionat i s-au adaptat bine la viaa mediului septic. 7%plantele nodale i cele constnd din teaca frunzelor, au generat, pe un e%plant, un numr variabil de mugurai. !intre acetia unul pn la trei s-au dezvoltat, ceilali rmnnd n diferite faze de cretere. separai i subcultivai pe medii proaspete au format rdcinie i s-au dezvoltat normal. <noculii constnd din e%plante de form cilindric "e%. internod#, au prezentat o pregnant polaritate morfogenetic, chiar dac e%plantul a fost acoperit de calus. &rocesul de organogenez a fost i mai sczut la fragmentul desprins din mi locul peiolului frunzelor. (n general, inoculii constnd din internod i mai ales cei dimensionai din peiol au generat mult mai mult calus dect cei de form i mrime similar, obinui din peduncul floral. 7%plantele dimensionate din poriunea limbului foliar, n care nervura principal a frunzei era bine reprezentat, au generat o cantitate mai redus de calus, n schimb au dat natere la mugurai, din care s-au format plante "9azr i Cachi, ),*+#. (n general, lstraii formai la nivelul calusurilor au un aspect diferit de acela al tulpinielor formate din meristeme, ceea ce atest c din celulele calusului se pot diferenia plantule cu o conformaie particular, diferit de aceea a plantelor din care au provenit, nefiind asigurat, pe aceast cale nmulirea clonal. Concluzia final a constat n aceea c regenerarea i diferenierea rapid a noi plante sa realizat din inoculii meristematici. 9starii pot fi transformai n minibutai i prin aceasta se ridic coeficientul de multiplicare a clonei respective. Se poate deci concluziona c, n funcie de specia la care se dorete e%perimentare, dar innd cont i de scopul urmrit, natura e%plantului este diferit, iar rezultatul preconizat a se obine este influenat de o serie de factori, de la compoziia mediului de cultur, natura fitohormonilor de cretere i concentraia acestora, pn la vrsta organului donor sau condiiile din camerele de cretere. 7%ist, aadar, o ?gam@ variat de posibiliti de inducere a unei culturi in vitro, astfel c se pot depista pentru fiecare specie de cultur, ornamental sau forestier, sursele de e%plante cele mai potrivite n vederea realizrii unor astfel de e%periene. <ar acolo unde literatura nu ofer posibiliti de inducere a culturilor de celule, e%periena cercettorului poate permite depistarea prin tatonri a celor mai bune metode n vederea realizrii obiectivelor n acest domeniu.