BIOTEHNOLOGII NOTE DE CURS

Biotehnologie provine din doi termeni

bio deriva din grec. bios = viata
tehnologia studiul al masinilor si uneltelor (termen utilizat inca de Plutarh si
Cicero)
Se pare ca notiunea a aparut pentru prima data in Danemarca in 1908 (unii autori considera
ca a fost introdusa pentru prima data in 1919).
Definitie
Biotehnologia este o stiinta inginereasca, pluridisciplinara ce utilizeaza materia vie pentru
degradarea, sinteza si producerea de materiale noi utilizate in activitatile umane.
Foloseste microorganisme, enzime, structuri celulare si subcelulare, biocatalizatori, tehnici de inginerie
genetica etc. Se bazeaza pe discipline fundamentale:
Genetica;
Biologie moleculara
Biochimie;
Embriologie;
Biologie celulara;
si discipline aplicative:
Inginerie chimica;
Informatica;
Robotica.
Clasificarea biotehnologiilor
Biotehnologii - rosii - medicale - obtinere de produse farmaceutice
(antibiotice, vaccinuri etc.), Farmacogenetica, Terapie genetica, Clonare etc.
- verzi - agricole (Cresterea tolerantei la stresuri,
Micropropagare - culturi in vitro, Inginerie genetica, Reducerea cantitatilor de pesticide utilizate,
Cresterea valorii nutritionale a alimentelor, Imbunatatirea aromei, gustului si texturii alimentelor,
Biotehnologii zootehnice
- albe - industriale (enzime, compusi chimici utili, compusi
biologic activi din plante, biocombustibili, Bioremediere, Biodegradare, bioproteine, lipide
microbiene, glucide microbiene si vegetale, vitamine microbiene, enzime in produsele agroalimentare)
- albastre - marine
1 BIOTEHNOLOGIILE CLASICE
nc din antichitate erau utilizate, n mod empiric, unele metode biotehnologice cum ar fi
fermentaiile cu ajutorul microorganismelor, cunoscute cu cteva milenii nainte de era noastr.
Babilonienii cunoateau, nc din mileniul VI .H., modul de preparare a berii precum i
bioconversia alcoolului etilic n acid acetic (oet). Mai trziu, n mileniul III .H., sumerienii cunoteau
tehnologia fabricrii a peste 20 de tipuri de bere. Descoperirile au demonstrat c majoritatea
popoarelor antice utilizau drojdiile pentru fabricarea unor produse alimentare (pine, vin, bere etc)
precum i bacteriile pentru obinerea derivatelor lactate.
Progrese nsemnate sunt realizate ncepnd din secolul XVII cnd olandezul ANTON VAN
LEEUWENHOEK (1632- 1723) a descoperit, n anul 1680, la microscopul ce l-a inventat, existena
unei lumi microbiene, necunoscut pn atunci. La microscopul su cu putere de mrire de circa 300
de ori, a observat micile vieti pe care le-a numit animalcule, cu forme sferice, drepte sau spiralate,
care triesc n apa de ru, decoctul de fn, saliv i mustul de bere. Cercetrile sale au fcut obiectul a
112 comunicri tiinifice, prezentate la Royal Society of London.
n secolul XIX, savantul francez LOUIS PASTEUR (1822 - 1895) a demonstrat c n procesul de
fermentaie alcoolic are loc transformarea glucidelor n alcool etilic, cu degajare de CO2, proces care
1

furnizeaz energia necesar celulelor de drojdii ce se dezvolt chiar n absena O2. Concomitent
extinde studiile asupra fermentaiilor butiric i lactic.
n timpul primului rzboi mondial, WEIZMANN a descoperit fermentaia acetono- butanolic iar
produii derivai i-a folosit la sinteza cauciucului sintetic (butadien) i a unui exploziv denumit
cordi. Cercetrile biologului scoian ALEXANDER FLEMING, iniiate n anul 1929, au deschis era
microbiologiei industriale moderne, prin elaborarea bazelor de obinere a penicilinei. A urmat
descoperirea streptomicinei de ctre colectivul condus de WAKSMAN (1943) i al
chloramphenicolului creat de SMITH i WORREL (1953). Pn n anul 1959 s-au elaborat peste 4000
de antibiotice, perfecionndu-se tehnicile i instrumentarul necesar n industria farmaceutic
(bioreactoare automatizate).
Ca rezultat al acestor descoperiri, la jumtatea anilor 60 a aprut, cu o mare for de dezvoltare,
biologia industrial, capabil s produc o schimbare fundamental a tehnicilor de fabricare a unui
numr mare de produse alimentare, farmaceutice i chimice. Folosind microorganisme specifice,
implicate n diferite fermentaii anaerobe, s-au produs proteine alimentare i furajere, aminoacizi,
aromatizani, acizi organici, ndulcitori alimentari, solveni organici, enzime, medicamente precum i
noi surse energetice.

2 BIOTEHNOLOGIILE MODERNE
n centrul ateniei specialitilor n biotehnologii st asigurarea necesarului de alimente pentru
populaia globului, mai ales proteine i aminoacizi, producerea de medicamente pentru sntatea
public, pentru profilaxia i tratamentul celor 300 de boli ereditare i a celor unor maladii grave ale
sfritului de secol (cancerul i SIDA), combaterea efectelor nocive ale polurii mediului de via
precum i obinerea de biocombustibili.
2.1 Scurt istoric al biotehnologiilor moderne
Dup cel de al doilea rzboi mondial, n fruntea rilor care au iniiat dezvoltarea
biotehnologiilor moderne a fost Japonia care, ca i alte ri asiatice, avea o foarte veche tradiie n
domeniul producerii buturilor i a alimentelor fermentate, folosind ca materii prime orezul i soia.
Pe baza unui imens volum de date experimentale de biochimie microbian, microbiologia
industrial japonez a devenit rapid unul din principalele domenii ale cercetrilor tiinifice i
tehnologice, mai ales dup anul 1953 cnd s-a creat Institutul de Microbilogie aplicat din Tokyo.
Creterea preului petrolului, dup anul 1973, a stimulat industriile nipone s gseasc alte
materii prime, n afara celor de natur petrochimic, pentru a pstra avansul tehnologic n unele
sectoare prioritare. n aceste condiii, Japonia a trecut la industrializarea modern a fermentaiior
microbiene, satisfcnd rapid necesarul intern i devenind exportatorul principal cu produse de
fermentaie spre rile asiatice. Pn n anul 1980, Japonia a ajuns la o producie anual de 50 mil. hl
bere, 27 mil.hl sake, 12 mil. hl sos de soia i 3 mil. hl oet.
Dezvoltnd rapid ingineria genetic, orientat spre recombinare ADN din unele sue de
microorganisme, cercettorii japonezi i ulterior americanii, au devenit, nc din anul 1957, posesorii
primelor licene de fabricare a aminoacizilor eseniali ca: acid glutamic (1957), lizin (1957),
treonin (1960), fenilalanin (1961), producnd, nc din anul 1980, peste 85.000 tone anual de
aminoacizi proteici, precum i a licenelor de fabricare a vitaminei B12 (1959), a unor antibiotice, a
interferonului, a primelor medicamente de lupt mpotriva cancerului i a multor produse alimentare,
farmaceutice, cosmetice i chimice.
Miracolul japonez n lansarea biotehnologiilor se datorete i investiiilor de zeci de miliarde de
yeni anual, prin cele 70 de mari companii implicate.
n prezent, microbiologia face parte din cultura cotidian i obligatorie a tuturor universitilor
i ntreprinderilor japoneze. Aici exist peste 1.500 de specialiti cu doctorat n microbiologie.
Biotehnologiile de producere a diferitelor substane utile s-au extins rapid i n alte ri
dezvoltate sub aspect industrial, respectiv S.U.A., rile vest-europene, China, fosta U.R.S.S.

n S.U.A., activitatea uzinelor biotehnologice s-a concentrat, iniial, pe producerea siropului de

fructoz prin fermentarea porumbului, realizndu-se anual peste 500.000 tone High Fructose Corn
Syrup, cu multiple utilizri n industria alimentar i farmaceutic. Fructoza are o putere de ndulcire
superioar zaharozei i glucozei, fiind unicul glucid acceptat n alimentaia diabeticilor. Alte programe
naionale americane au urmrit obinerea, prin biotehnologii, a necesarului de medicamente, vaccinuri,
acizi organici (citric, acetic, fumaric, lactic), a unor aminoacizi, a proteinelor macromoleculare i a
drojdiilor de panificaie. Randamentele ridicate ale biotehnologiilor americane s-au datorat aplicrii n
producie a rezultatelor celor 45 companii de inginerie genetic, orientate n direcia recombinrii
acizilor nucleici din diferite specii vegetale i a celor circa 700 de societi specializate n
biotehnologii (firmele Cetus- 1970, Genentech- 1976, Eli Lilly, Genex, Genencor, Biogen, Centocor,
Immunex, Genzyme, Hybritech, Syntex etc).
n fosta U.R.S.S. existau n anii 80 peste 100 de uzine biotehnologice dintre care 86 produceau
proteine monocelulare pentru consum zootehnic iar celelalte produceau aminoacizi, hormoni,
vitamine, antibiotice, enzime i lipide. Ca substrat nutritiv pentru microorganisme se foloseau, cu
precdere, deeuri cu origine forestier, agricol i industrial.
n Europa de Vest programele naionale de investiii au stimulat apariia unor mari uzine
biotehnologice la Braunschweig (Germania), Cambridge, Mill Hill, Porton Down, Slough (Anglia),
Delft (Olanda), Strasbourg, Compigne, Toulouse, Rhne- Poulenc (Frana), Pavia (Italia) etc.
n uzinele biotehnologice, bazate pe tehnici moderne de microbiologie industrial, se folosesc
bioreactoare speciale cu factori dirijai, cu capaciti ntre 10.000-250.000 litri (cele mai frecvente de
20.000 litri). Prin perfecionarea tehnicii de cultivare s-a ajuns la un flux continuu n care se menin
constante condiiile de via microbian (temperatur, pH, oxigenare, nutriie mineral i organic),
folosind un sistem modern de programare pe computere.
Coordonarea activitii uzinelor biotehnologice i elaborarea programelor naionale de investiii
intr n atribuiile societilor specializate care devin, treptat, prioriti locale i naionale, asigurnd
legturi indispensabile ntre biotiine i bioindustrii precum i transferul de tehnologii ultramoderne.
Dac n anul 1983 existau, pe plan mondial, 450 societi de biotehnologie, n urmtorii 10 ani s-a
ajuns la 1.700 societi n S.U.A., Europa i Asia. O activitate intens desfoar cele peste 60 societi
biotehnologice din Frana: Immunotech, Genset, Transgne- Mrieux, Calliope, Zymogenetics, Germe,
Coletica, Gist- Brocades, Bio- Europe etc .
Bilanul activitii acestor societi i uzine specializate a fost prezentat la cel de al VII-lea
Congres European de Biotehnologie, inut la Nisa n februarie 1995, la care au participat 70 de
societi naionale, inclusiv din Romnia.
Evaluarea produselor tehnologice obinute pe plan mondial la nivelul anului 1990 totaliza cifra
de 250 miliarde de dolari din care: 50 miliarde din producerea de etanol, 42,8 miliarde dolari din
produse agroalimentare provenite din porumb, 40,7 miliarde de dolari din antibiotice, 21,3 miliarde
dolari din vaccinuri, 7,5 miliarde dolari din aminoacizi, 6,1 miliarde dolari din hormoni, 4,6 miliarde
de dolari din acizi organici etc .
Extinderea biotehnologiilor n toate rile dezvoltate i slab dezvoltate, ar putea conduce nu
numai la rezolvarea unor probleme economice locale ci i la modificri radicale n structura
industriilor alimentare, chimice i farmaceutice, cu efecte benefice imediate, pe plan naional i
mondial. Alegerea profilului de activitate pentru fiecare uzin biotehnologic, din diferite sau
macrozone populate, merit o atenie deosebit, urmrindu-se ca grefarea sistemelor tehnologice s
corespund cu situaiile economice i sociale ale populaiilor respective. Astfel, crearea de cicluri
scurte de producere a proteinelor monocelulare prin biotehnologii poate prezenta avantaje foarte mari
n rezolvarea problemei alimentaiei umane, n dezvoltarea sectorului zootehnic, protecia solului,
reducerea ritmului de despdurire i valorificarea eficient a forei de munc rmas disponibil.
Ca o imagine retrospectiv a evoluiei biotehnologiilor clasice i moderne se poate sublinia c
prima revoluie biotehnologic lansat prin lucrrile savantului LOUIS PASTEUR, a asigurat
difuzarea vaccinurilor i a primelor antibiotice, avnd ca efect imediat salvarea multor viei omeneti.
Cea de a doua revoluie biotehnologic, declanat de colile microbiologice japoneze i americane,
n ultimele 3 decenii, a nceput s-i fac simit contribuia benefic n asigurarea alimentaiei i a
dreptului la via a sute de milioane de oameni, mai ales a copiilor din lumea a III- a, care mor anual
din cauza subnutriiei cronice.
3

Progresele imense nregistrate n microbiologia mondial, dup cel de al doilea rzboi mondial,
l-au determinat pe ilustrul genetician FRANOIS JACOB, laureat al Premiului Nobel, s scrie: n
civa ani, omul a avut surpriza s constate c, fr microorganisme, aceast lume n-ar fi fost ceea ce
este n prezent.

2.2. BIOTEHNOLOGIILE PENTRU ASIGURAREA SNTII

Pentru sectorul de sntate uman i animalier, cercetrile de biotehnologie aplicativ vizeaz
trei cmpuri de activitate: producerea de molecule cu efecte terapeutice, producerea de vaccinuri i
elaborarea unor metode mai eficiente de diagnosticare a bolilor. Asociaia fabricanilor de produse
farmaceutice din Frana nregistra noi creaii pe cale biotehnologic (exceptnd antibioticele):
- hormoni de cretere 12
- interferoni
13
- interleucine
14
- anticorpi monoclonali 41
- vaccinuri
15

2.3. PRODUCEREA DE ANTIBIOTICE

Antibioticele sunt substane produse de diferite microorganisme care au capacitatea de a
inhiba sau distruge alte microorganisme, unele implicate n declanarea anumitor maladii
infecioase.
Istoricul producerii de antibiotice coboar nc n antichitate. Pe un papirus rmas din timpul
celei de a 11-a dinastie egiptean (n urm cu 4.000 de ani), se descrie utilizarea unor ciuperci i
mucegaiuri care creteau pe suprafaa iazurilor i erau utilizate n tratamentul rnilor deschise i
infectate. Tot pentru vindecarea rnilor i a furunculelor, grecii i chinezii din antichitate foloseau
sucul de soia i lutul fierbinte. Venind din vremuri mai apropiate, doctorul MOSSE (1852) propunea
tratamentul furunculozelor epidemice cu drojdie de bere (Saccharomyces cerevisiae) - o linguri de 3
ori pe zi, care asigur o vindecare fr recidive.
Baza teoretic a producerii antibioticelor a fost prezentat de savantul romn VICTOR BABE,
n anul 1885, care scria c unele microorganisme pot produce substane chimice capabile s inhibe
dezvoltarea altora iar o boal cauzat de unele bacterii va putea fi tratat cu ajutorul altor bacterii.
La scurt timp dup formularea teoretic a lui BABE apare descoperirea, din anul 1888, cnd
CHARDIN i GUIGNARD au demonstrat c bacteria Pseudomonas pyocyanea produce un pigment
solubil care este toxic pentru bacteria Bacillus anthracis, fr a cauza hemoliza globulelor roii din
sngele organismului gazd. Tot n acel timp, VUILLEMIN propune termenul de antibioz (contrar
simbiozei) care st la baza aciunii antibioticelor ce vor fi descoperite ulterior.
Dup unele experimentri cu rezultate contradictorii (SCHAPIRO - 1908, PORTER - 1924 la
actinomicete, PRAT i BOYLE la mucegaiuri), apare marea descoperire a scoianului ALEXANDER
FLEMING (1929) care demonstra c o cultur de stafilococ auriu a fost distrus prin suprainfectarea
cu mucegaiul Penicillium rubrum (notatum).
Era antibioticelor a fost inaugurat prin comunicarea despre penicilin prezentat de FLEMING
la Medical Research Club, n ziua de 13 februarie 1929. Comunicarea a fost primit de bacteriologi
cu mult rceal i zmbete de bunvoin. Ulterior, o serie de cercettori s-au ocupat de
perfecionarea peniciline (LOVELL, RAISTRICK, CLUTERBRUCK). Obiectivul acestei munci a fost
finalizat abia n anul 1939 cnd australianul FLOREZ i germanul CHAIN au reuit purificarea
penicilinei, n stare cristalizat, folosind procedeul liofilizrii. Prin infectarea animalelor de experien
cu stafilococi, streptococi i Clostridium, ei au reuit distrugerea acestora prin tratamente cu penicilin
pur. Pentru aceast extraordinar realizare, FLEMING, FLOREY i CHAIN au primit premiul Nobel
pentru medicin, n anul 1945.
Din aproape 5.500 de antibiotice cunoscute n prezent, circa 1.000 de tipuri sunt produse de 6
genuri de ciuperci filamentoase, dintre care cele mai importante sunt Penicillium, Streptomyces i
Cephalosporium. Peste 500 de forme sunt sintetizate de dou tipuri de bacterii nefilamentoase, iar
3.000 de forme sunt produse de 3 genuri de actinomicete. Aceste specii de microorganisme sunt mai
4

eficiente n cazul suelor ameliorate prin mutaii, recombinri de ADN i, eventual, prin inginerie
genetic.
Antibioticele au cptat o foarte larg utilizare medical, cu extindere rapid n ultima jumtate
de secol, cele mai mult comercializate fiind penicilinele (produse de mucegaiul Penicillium
chrysogenum), cefalosporinele (produse de mucegaiul Cephalosporium acremonium),
streptomicinele i tetraciclinele (produse de bacteriile din genul Streptomyces) la care se adaug, n
cantiti mai reduse, anthracidinele, aureomicinele, canamicinele i neomicinele.
2.4. PRODUCEREA DE HORMONI
a. Insulina. Este hormonul a crui absen din organismul uman provoac diabetul, boal
rspndit pe glob la peste 60 milioane de locuitori. Pentru corectarea acestei insuficiene hormonale,
insulina a fost extras, iniial, din pancreasul de cine (n 1921) i experimentat, n 1922, la un biat
de 9 ani, cu rezultate spectaculoase. Din anul 1923 firma american Eli Lilly a produs insulina pe cale
industrial, prin extragerea din pancreasul de bovine i porc, cu un randament de 100g insulin
cristalizat la 100 kg pancreas (0,01 %)
Perfecionri aduse tehnicilor de preparare au permis obinerea unor produse cristalizate cu
aciune lent i ultralent, fiind absorbite n 48 de ore. Aceast insulin, extras din bovine i porcine,
provoac unele efecte secundare iar unii diabetici fac intoleran la hormonul animal: pentru aceasta a
fost necesar purificarea insulinei animale pn la calitatea celei umane, procedeu realizat de firma
danez Novo Industrie (1981) prin substituirea aminoacidului alanina cu treonin, pe cale enzimatic i
separare cromatografic.
Ca structur chimic s-a constatat c insulina are dou catene polipeptidice (A i B), lungi de 21
i 30 de aminoacizi. Sinteza celor dou gene implicate n producerea catenelor polipeptidice a fost
realizat la universitatea din California (n 1979), prin includerea genei mutante ntr-o plasmid, cu rol
de vector i transferul n bacteria Escherichia coli care produce circa 100.000 molecule de insulin la
o celul bacterian. Pe aceast cale microbiologic, firma Eli Lilly a dezvoltat, n anul 1977, sistemul
industrial de producere a proinsulinei i insulinei identice cu cea uman, fr a provoca eventuale
efecte secundare (tulburri renale i oculare). La Centrul de microbiologie aplicat din Porton Down
(Anglia), folosind un bioreactor de 1.000 litri mediu de cultur, s-au obinut 200 g insulin,
echivalentul al cantitii extrase din 1.600 kg pancreas de bovine sau porcine: Insulina produs prin
aceast tehnic de inginerie genetic poart denumirea de humulin, nlocuind pe cea extras din
organismele animale.
b. Somatostatina. Este un hormon produs n organismul uman de gland hipotalamus, situat la
baza creierului, avnd rol n eliberarea insulinei i a unor hormoni de cretere.
Pentru suplinirea carenei organismului n somatostatin, ncepnd din anul 1977, a fost sintetizat
hormonul respectiv cu ajutorul bacteriilor recombinate genetic. Gena somatostatinei, sintetizat
artificial de ITAKURA (California), este alctuit din 52 de nucleotide, avnd la baz 14 aminoacizi.
Aceast gen a fost introdus ntr-o plasmid i transferat n bacteria Escherichia coli care poate
sintetiza circa 10.000 molecule de somatostatin la o celul bacterian. Este posibil sinteza a 1 mg
hormon la 1 litru de cultur bacterian, cantitate ce s-ar extrage din 5 milioane creiere de oaie. Firma
Genentech din San Francisco (S.U.A.) a obinut un randament care poate ajunge la 3% somatostatin.
c. Somatotropina. Este hormonul uman de cretere (HCU), secretat de celulele lobului anterior
al hipofazei, ntr-o cantitate foarte redus (4-6 mg/ hipofiz). n absena sa se provoac nanismul
hipofizar (piticirea), frecvent n lume la 7-10 persoane dintr-un milion de indivizi. Administrarea de
somatotropin prin injecii intramusculare n doze de 10 mg/ kg corp/ an, fracionate n cte 3 injecii
pe sptmn, ar asigura un ritm normal de cretere a copiilor suferinzi de piticire. Condiia reuitei
tratamentului este nceperea la vrsta de 4-5 ani, cu continuare pn la sfritul pubertii i chiar dup
aceasta.
Extragerea i purifucarea somatotropinei umane (HCU) a fost realizat de ROSS i colab. (1963)
din hipofiza cadavrelor, cu un randament foarte redus (4-5 mg hormon dintr-o hipofiz uman).
Societatea de inginerie genetic Genentech (S.U.A.) a reuit sinteza chimic a genei care
determin formarea acestui hormon, respectiv o protein complex alctuit dintr-o secven de 191
aminoacizi. Dup clonare n celula bacterian de Escherichia coli, a rezultat o su selecionat (K12) care poate produce circa 100.000 de molecule de somatotropin la o celul bacterian. Acest
5

hormon de cretere, obinut prin inginerie genetic, este pur din punct de vedere chimic, foarte
omogen, liber de viroze i cu o metionin n plus fa de hormonul uman.
Firma Kabi Vitrum din Suedia a preluat sua american K-12 i a produs hormonul pe cale
industrial astfel c 1 litru de cultur bacterian s realizeze, n 7 ore, o cantitate de hormon egal cu
cea extras din 60 hipofize umane i la un pre de cost mai redus de 3 ori. Hormonul obinut prin
biotehnologie poate fi folosit la stimularea creterii, att la oameni ct i la animale domestice.
d. Interferonul. A fost descoperit de ISAACS i LINDENMANN (1957), n Anglia, sub forma
unei proteine globular, produs de leucocitele din celula animal sau uman, avnd rol de aprare
antiviral i antitumoral, atunci cnd un virus ptrunde n organism. Interferonul endogen, ct i cel
administrat prin injecii, stimuleaz sistemul imunitar, nhib nmulirea celulelor anormale i combate
bolile de origine viral (grip, hepatit, zona Zoster).
ntruct producerea interferonului prin extracii din celule sanguine i fibroblaste este foarte
scump i laborioas, W. GILBERT (1980) din Boston (S.U.A.) a ncercat procedeul de sintez a
secvenelor de ADN corespunztoare unor gene modificate, pe care le-a inclus ntr-o plasmid i le-a
transferat n celulele bacteriene de Escherichia coli. Ulterior, n anul 1981, cercettori de la
universitatea Seattle-Washington, n colaborare cu firma Genentech din California, au reuit s
transfere genele interferonului leucocitar n celulele drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae) cu
genom modificat. Randamentul a devenit destul de mare n sensul c la 1 litru de mediu nutritiv de
celule de levuri s-au produs 25.000 de uniti de interferon.
n prezent, interferonul leucocitar i fibroblastic se produce la un pre de cost destul de redus, n
urma reuitei de transfer a genelor n celulele bacteriene de Escherichia coli i Methylophilus
methylotrophus. Purificarea i testele chimice i farmacologice s-au fcut n uniti de profil din
S.U.A., Japonia, Anglia, Frana, Suedia i Israel, urmrindu-se efectele n combaterea cancerului, prin
aprarea limfocitelor capabile s distrug celulele canceroase. De asemenea s-a testat, cu bune
rezultate, eficacitatea n tratarea altor boli cum ar fi keratita herpetic, papilomul laringian, scleroza n
plci, guturaiul, gripa, hepatita i zona Zoster.
Mai recent, firma internaional de biotehnologie Biogen din S.U.A. a reuit s perfecioneze o
tehnologie prin care se produce o cantitate de interferon de 1.000 de ori mai mare dect cantitatea
obinut prin prelucrarea aceluiai volum de snge uman, produsul fiind utilizat, cu mare succes, i n
combaterea hepatitei (B, C)
e. Cortizonul- Este un hormon steroidic cu o eficacitate foarte ridicat n tratamentul
reumatismului articular. Sinteza chimic a cortizonului se realizeaz n 37 de etape. Folosind calea
biotehnologiilor, prin nmuliea ciupercii Rhizopus arhizus care hidrolizeaz progesteronul, sinteza
cortizonului s-a redus la numai 11 etape, cu un pre de cost mai redus de 400 de ori.
f. Hormonii sexuali. Numeroase microorganisme eucariote conin molecule de tip hormonal care
joac un mare rol n manifestrile sexualitii, unele dintre ele fiind de natur steroid. O mare parte
dintre hormonii sexuali sunt sintetizai prin metabolismul bacterian dar, n majoritatea cazurilor,
aciunea microbian const dintr-o simpl bioconversie a unui compus natural sau obinut printr-o
sintez chimic.
Sterozii sexuali, cu aplicaii n chimia farmaceutic, sunt transformai (bioconvertii) prin
procese de oxidare, reducere, hidroliz, condensare i izomerizare.
Reaciile de oxidare sunt de 4 tipuri: hidroxilarea, dehidroxilarea, n oxidarea gruprilor hidroxil
i degradarea oxidativ a catenelor laterale, n urma crora se obin corticosteron, hidroxiprogesteron,
homoprogesteron, hidrocortizon etc. La aceste reacii particip, dup caz, microorganisme din genurile
Aspergillus, Curvularia, Fusarium, Flavobacterium, Glomerella, Mycobacterium, Pellicularia i
Rhizopus.
Reaciile de reducere se realizeaz prin hidrogenarea la nivelul gruprilor cetonice sub aciunea
microorganismelor din speciile Rhodotorula glutinis i Kloeckera jensenii, implicate n sinteza unor
prostaglandine (sulprostone).
Reaciile hidrolitice au aciune asupra esterilor, cu eliberarea gruprii OH din steroid sau asupra
eterilor, cu transformarea saponinelor, n prezena mucegaiului Penicillium chrysogenum, activnd
compuii cu proprieti terapeutice.

2.5. BIOSINTEZA VITAMINELOR

nc din anul 1906, HOPKINS a stabilit c n alimentaia animalelor sunt absolut necesari
factori accesorii care se gsesc n drojdia de bere. Ulterior, CAZIMIR FUNK (1912) a izolat din
drojdie acidul nicotinic i a dat denumirea de vitamine pentru acest grup de substane.
Majoritatea microorganismelor sunt capabile s sintetizeze toate vitaminele sau provitaminele de
care au nevoie, uneori n cantiti mult superioare fa de necesarul propriu, pentru procesele de
cretere. Astfel bacteria Ashbya gossypii, cultivat pe un mediu mbogit n lipide, sintetizeaz de
20.000 de ori mai mult riboflavin (vitamina B2) fa de necesarul propriu, iar bacteria Pseudomonas
denitrificans produce de 50.000 de ori mai mult cianocobalamin (vitamina B12) dect i este
necesar. De altfel, vitamina B12 are ca surs unic biosinteza microbian. De asemenea, betacarotenul, precursorul vitaminei A, este sintetizat, n cantiti foarte mari, pe cale biotehnologic.
n corpul microorganismelor s-a constatat prezena provitaminelor A, C i D precum i a
vitaminelor B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B5 (acidul pantotenic), B12 (cianocobalamina), C (acidul
ascorbic), F (acidul folic), H (biotina), K (acidul para-aminobenzoic), PP (nicotinamida).
Vitamina B1 (tiamina, aneurina) este sintetizat de drojdii (mai ales Endomyces vernalis) i de
mucegaiuri din genul Aspergillus. Se pare c levurile au i capacitatea de a concentra vitamina B1
dispersat n mediul de cultur. Este indicat n numeroase afeciuni maladive, gastro-intestinale,
renale, hepatice, diabetice, alcoolism, psihopatii, stri de nervozitate, hipertiroidie, pelagr, precum i
dup tratamente prelungite cu sulfamide i antiobitice. Tiamina este cunoscut i sub denumirea de
vitamina performanei intelectuale deoarece are efecte pozitive asupra activitii sistemului nervos,
asigurnd creterea randamentului intelectual.
Vitamina B2 (riboflavina). Este sintetizat de numeroase microorganisme: bacterii (Aerobacter,
Azobacter, Mycobacterium i, mai ales, Clostridium la care riboflavina este un subprodus al
fermentaiei acetono-butilice), levuri (mai ales Candida floreri i Mycocandida riboflavina) i
mucegaiuri.
S-a constatat c cele mai bune productoare de riboflavin sunt mucegaiurile (Ashbya gossypii i
Eremothecium ashbyii) cnd sunt cultivate ntr-un mediu agitat, suplimentat cu lipide i la
temperatura de 300C, metaboliznd riboza i un compus triciclic flavinic. Dup 5 zile se obin cantiti
de riboflavin care ajung la 5.000- 6.000 uniti / ml mediu de cultur i se izoleaz prin cristalizare.
Conform recomandrilor O.M.S., necesarul mediu de vitamin B2 este de 0,6 mg la 1000 kcal i este
indicat n numeroase afeciuni maladive ca: stomatite, dermatite, conjuctivite, cataracte, keratoze,
psoriazis etc. Riboflavina are rol determinant n fixarea fierului la nivelul hemoglobinei, n sinteza
proteinelor precum i n degradarea lipidelor i glucidelor.
mbuntete vederea prin mrimea sensibilitii retinei i contribuie la dezvoltarea fizic a
organismului.
Vitamina B5 (acidul pantotenic). Este produs prin cultur de Sporobolomyces holsaticus ca
urmare a condensrii beta-alaninei i a acidului pantoic, care deriv din valin. Prin cuplri fosforilate
cu riboza i adenina intr n structura coenzimei A, produs de diferite bacterii. Acidul pantotenic are
rol n catabolismul glucidelor i lipidelor, cu eliberarea energiei necesare proceselor fiziologice i n
desfurarea multor reacii enzimatice. Favorizeaz meninerea structurii normale a pielii i stimuleaz
creterea i pigmentarea prului.
Vitamina B12 (cianocobolamina). Este cel mai eficient factor de prevenire i combatere a
anemiei pernicioase. Are un ciclu pseudoporfirinic, legat de un atom de cobalt.
Este produs intracelular de microorganisme din genul Streptomyces i din speciile Bacillus
megaterium i Propionibacterium freundenreichii, ncepnd din anul 1949. Vitamina B12 a fost
izolat prima dat din ficat de ctre FOLKERS i SMITH (1948) (din o ton de ficat au rezultat numai
28 mg vitamin B12). Cea mai important surs de vitamin B12 este microflora din intestinul
rumegtoarelor sau din cecul i colonul erbivorelor nerumegtoare. Producerea pe cale fermentativ a
fost realizat, pentru prima dat, de STOKSTAND (1948) prin cultivarea bacteriei Flavobacterium
solare. Ulterior, cercetrile au progresat rapid obinndu-se culturi de Propionibacterium shermanii,
P.freundenreichii etc. care sintetizeaz cantiti mari de vitamin. Mediul nutritiv este format din
glucoz, extract de drojdie, hidrolizat de casein, sruri de cobalt etc. Necesarul uman de vitamin B12 ,
recomandat de O.M.S., este de 2g/ zi. Este cunoscut i sub denumirea de vitamina roie deoarece
favorizeaz formarea i regenerarea globulelor roii (hematii), prevenind anemia. Intensific procesul
de cretere n greutate a copiilor, mrind pofta de mncare. Menine funcionalitatea normal a
7

sistemului nervos, scade iritabilitatea, mbuntete capacitatea de concentrare i memorare la copii,

cu pstrarea echilibrului psihic. Vitamina exercit o aciune de detoxifiere a ficatului, bazat pe
capacitatea de activare a enzimelor tiolofore. Are i efecte lipotrofe, prin intensificarea biosintezei
colinei.
Vitamina C (acidul L-ascorbic, vitamina antiscorbutic) a fost descoperit de A. SZENTGYRGYI, n anul 1927, la nivelul cortexului glandelor suprarenale, iar biochimitii americani KING
i WANGH (1932) au gsit vitamina C n sucul citricelor. Acidul ascorbic este obinut pe cale
industrial prin oxidarea substratului nutritiv cu ajutorul bacteriei Acetobacter suboxidans. D- glucoza
din substrat este transformat, prin reducere electrolitic, n D-sorbitol care se oxideaz, pe cale
microbian, n L-sorboz. Urmeaz tratarea cu aceton i formarea complexului diaceton- L- sorboz
care este oxidat n acid 2-cetogluconic i apoi transformat, prin fenolizare, n acid ascorbic.
Un alt procedeu de sintez a vitaminei C are la baz oxidarea, pe cale bacterian, a D- glucozei
n acid 5- ceto- D- gluconic, urmat de o alt oxidare a acidului L- idonic n acid 1,2- ceto- gulonic. n
aceste reacii intervin mai multe specii din genurile Acetobacter, Aerobacter i Pseudomonas.
Rolul fiziologic al vitaminei C este multilateral, cuprinznd majoritatea proceselor metabolice
eseniale care au loc la nivelul organismelor. Este implicat n procesele de biosintez a ADN,
respectiv n biosinteza substanelor proteice din esuturile de cretere. Acidul ascorbic acioneaz ca
transportor de hidrogen la nivel intracelular. Vitamina C stimuleaz sistemul imunitar i mrete
rezistena organismului la bolile infecto-contagioase i fa de substanele cancerigene. Accelereaz
vindecarea rnilor, regenerarea esuturilor, a cartilagiilor i a oaselor. Faciliteaz absorbia fierului i
stimuleaz maturarea hematiilor.
Sucul de lmie, proaspt recoltat, servete la oprirea hemoragiilor scorbutice (scorbutul),
deoarece coninutul n acid ascorbic i bioflavonoide micoreaz permeabilitatea i mresc rezistena
capilarelor sanguine.
Vitamina D (calciferol-vitamina antirahitic). Este constituit din substane care provin prin
iradierea microsterolilor (ergosterol, zimosterol, escosterol etc). Cel mai cunoscut este ergosterolul
care a fost izolat, prima dat, din Claviceps purpurea i ulterior din miceliile unor mucegaiuri ca
Penicillium, Fusarium i Aspergillus. La o cultur de Aspergillus fischerii, pe un mediu nutritiv cu
10% glucoz, se obine 1,1% ergosterol, n condiiile unui raport optim C/N de 20/ 4.
Pe cale biotehnologic, ergosterolul se obine prin culturi de drojdii sau micelii de Aspergillus
niger i Penicillium notatum. Urmeaz operaia de transformare a ergosterolului n vitamina D prin
iradiere cu lmpi de mercur sau cu srm incadescent de magneziu. Are rol esenial n fixarea
calciului i fosforului cu implicaii directe n formarea sistemului osos i a dentiiei, prevenind
rahitismul la copii, osteoporoza i cariile severe. Ajut la tratarea rcelilor i a conjuctivitelor.
Vitamina H (biotina) este sintetizat, pe cale microbiologic, n prezena unor microorganisme
ca: Phycomyces blakesleana, Torulopsis utilis, Hansenula anomala i Aspergillus niger. Se prezint
sub trei forme: bios I (mezoinozitol), bios II- A (acid pantotenic) i bios II- B (biotina). Din mediu de
cultur, separarea se face prin filtrare i absorbie pe norit. Biotina este component a unor enzime
implicate n metabolismul proteic, lipidic i glucidic. Amelioreaz durerile musculare dup oboseal
excesiv i contribuie la meninerea integritii pielii. mpiedic ncrunirea prului i previne
alopecia (chelia).
Vitamina K (acidul para-aminobenzoic). Deriv din menadion, prin cultura algei Chlorella sau a
anumitor specii din genul Bacillus. n organismul uman contribuie la metabolismul fierului i la
formarea hematiilor, prevenind sngerrile i hemoragiile interne prin coagularea rapid a sngelui.
Vitamina PP (nicotinamida). Nu este realizat prin culturi de microorganisme ci este sintetizat
numai n plantele superioare. n schimb, niacina, o form dezaminat a vitaminei PP, poate fi obinut
prin culturi de bacterii din genul Corynebacterium. Are rol n prevenirea pelagrei i a dermatitelor
severe, intensific circulaia sangvin, reduce tensiunea arterial i atenueaz tulburrile gastrointestinale, meninnd starea de sntate a aparatului digestiv, a creierului i a sistemului nervos. Este o
vitamin esenial n sinteza hormonilor sexuali (estrogeni, progesteron, testosteron), a cortizonului i
insulinei.
Provitamina A (carotenul). Este un pigment carotenoidic de natur terpenic, sintetizat din izopentil- pirofosfat. Se gsete n anumite alge, n Mucoraceae i n mucegaiul Choanephora. Betacarotenul protejeaz mucoasa nazal, bucal, faringian, laringian, traheal i pulmonar, constituind
un bun remediu n tratamentul infeciilor respiratorii i emfizemului pulmonar. Are rol profilactic n
8

bolile maligne (cancer gastric i esofagian, cancer de prostat), transformnd metaboliii cancerigeni n
substane mai solubile i mai puin nocive. Vitamina A contribuie la profilaxia tulburrilor de vedere,
este un factor n meninerea sntii pielii, prului, danturii i gingiilor. Totodat stimuleaz
activitatea sistemului imunitar i previne pigmentrile cauzate de bolile ficatului sau de btrnee.
Tot prin culturi microbiene pot fi produse: vitamina B6 (piridoxina), vitamina F (acidul folic) i
acidul lipoic, fr a prezenta o mare importan pentru producia industrial i farmacologic.
Biosinteza multor vitamine pe cale biotehnologic poate fi realizat prin anumite intervenii
genetice (mutaii) sau prin reglarea proceselor metabolice din celulele diferitelor microorganisme.
2.6. PRODUCEREA DE VACCINURI SI SUBSTANTE IMUNOGENE
Primul vaccin a fost obtinut de Louis Pasteur a salvat un copil muscat de un caine turbat.
In trei ani, a tratat 5374 persoane (sub 1% mortalitate)
Ulterior s-au elaborat vaccinuri pentru diferite maladii:
- Hepatita B, rujeola, turbarea, poliomelita, holera, lepra, malaria, pseudopesta aviara,
pseudoturbarea, pesta porcina, leucemia felina etc.

3. Biotehnologiile n agricultura modern

Intr-o lume n care creterea populaiei este accelerat (se preconizeaz c pn n anul 2050
populaia globului va numra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producia agricol crete ntrun ritm mai lent este necesar gsirea unor soluii moderne prin care agricultura s asigure cantiti
suficiente de hran, cu o calitate corespunztoare. Agricultura tradiional se confrunt n prezent cu o
serie de limitri extrem de serioase:
- limitri ce in de pia: n condiiile globalizrii, regulile unei piee libere ngrdesc politicile
locale de preuri, acestea fiind dictate de tendinele i politicile internaionale
- resursele naturale devin, din ce n ce mai mult, factori limitativi ai dezvoltrii agriculturii
tradiionale datorit modificrilor climatice, a industrializrii i urbanizrii care determin
deteriorri ale solului, apei i a calitii aerului.
- resursele biologice (genetice) sunt, n mod inevitabil, limitate. Astfel, dei considerat la nceput
foarte eficient, obinerea i eliberarea n mediu a plantelor ameliorate prin metode tradiionale a
devenit extrem de nceat, nu fac fa cerinelor, iar numrul de nsuiri naturale care pot fi
mbuntite prin aceste metode este foarte mic.
Specialitii consider c pentru depirea acestor probleme, pe lng mbuntirea continu a
practicii agricole, exist dou soluii: gsirea unor surse alternative de hran (de exemplu, valorificarea
resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode biotehnologice (Altman, 1999).

Evoluia populatiei planetei (estimativ):

Acum 240.000 ani 10.000 locuitori

4000 Hr.
- 30 milioane
1 dHr.
- 210 milioane
1900
1.650 milioane
2008
6.7 md.
2014
7,27 md.
2050
10 md.
Evolutia populatiei modiale (16.09.2014, http://www.geohive.com/earth/population_now.aspx)
rank

country

area sq.km. population (16.09)

World

510,072,000 7,257,175,868

1.10%

215,060

7,257,390,928

1.

China

9,596,960

1,395,717,615

0.61%

22,966

1,395,740,581

2.

India

3,287,590

1,270,865,772

1.24%

42,367

1,270,908,139

3.

USA

9,826,630

323,182,268

0.81%

7,085

323,189,353

4.

Indonesia

1,919,440

253,532,864

1.21%

8,297

253,541,161

5.

Brazil

8,511,965

202,417,002

0.85%

4,649

202,421,651

6.

Pakistan

803,940

185,806,215

1.66%

8,289

185,814,504

7.

Nigeria

923,768

179,460,046

2.78%

13,223

179,473,269

8.

Bangladesh 144,000

158,857,249

1.19%

5,118

158,862,367

9.

Russia

17,075,200 142,465,272

-0.21%

-834

142,464,438

10.

Japan

377,835

-0.08%

-293

127,013,953

11.

Mexico

1,972,550

124,124,887

1.21%

4,055

124,128,942

12.

Philippines

300,000

100,434,623

1.71%

4,618

100,439,241

56

Romania

237,500

21,630,267

127,014,246

yearly growth

-0.26%

daily increase population today

-155

21,630,113

10

Cresterea populaiei pe continente pn n 2020

.
Former Soviet Union 0%

Europe 0%
North
America 5%

Asia 51%

Africa 35%
South America 8%

Benefits of biotechnology More food

Declinul cresterii productiei agricole

Percentage per year

19671982
19821994
19952020

Developing countries

World

Developed countries

11

Consumul de calorii in lume (2001 - 2003)

12

4. Biotehnologiile n agricultura modern

Prima revolutie verde, initiata dupa cel de al doilea razboi mondial de Norman Borlaug
pentru a incerca sa rezolve o parte din probleme grave ale nutriiei omenirii pentru care a primit
Premiul Nobel pentru Pace. Cercetrile au fost dezvoltate in Mexic si Filipine la grau, orez, porumb,
sorg, mei etc.
A doua revoluie verde este considerata a fi reprezentata de Biotehnologiile moderne
4.1.Tendinte actuale in agricultura
Msuri diversificarea cultivarelor i a speciilor cultivate
Introducerea biotehnologiilor (10% din necesarul de fora de munc din agricultura pentru
producerea aceleiai cantiti de proteine)
Fixarea azotului atmosferic
Valorificarea solurilor srturoase
Prevenirea efectelor toxice ale pesticidelor
(anual la cele 200 mii de produse chimice se adauga 1-2 mii noi, se nregistreaz 1 mil
intoxicatii acute soldate cu 20 mii mori )
Folosirea biotehnologiilor in ameliorarea plantelor
Schimbarea treptat a tuturor modelelor de producie
Promovarea conceptului de dezvoltare durabil
Modificarea legislaiei privitoare la OMG (ORGANISME MODIFICATE GENETIC)
4.2 Suprafete cultivate cu plante modificate genetice
Peste 90 si, respectiv 183 de milioane de hectare cu plante modificate genetic au fost
cultivate n anul 2005 si 2014, n ntreaga lume. Potrivit raportului dat publicitii de Internaional
Service of the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA), suprafeele nsmnate cu plante
modificate genetic au crescut cu 11%, fa de anul 2004. Creterea din 2005 nu este att de nsemnat
precum cea nregistrat pe parcursul anului 2004 (20%), dar s-a previzionat c se va menine de-a
lungul ntregului deceniu.
n 1996, anul introducerii acestor plante, doar ase ri le utilizau, iar suprafeele erau de
doar 1,7 milioane de hectare.
n 2005 ase ri au cultivat 98% din suprafaa mondial de plante modificat genetic. Pe
primul loc se situeaz SUA, cu 48 milioane hectare, urmate de Argentina 17 milioane hectare,
Canada 6 milioane ha, Brazilia 6 milioane ha, China 4 milioane ha, Paraguay 1,4 milioane ha.
Restul de 2% din suprafaa estimat cultivat de 15 ri, printre care Mexic, Spania, Germania,
Romnia, Africa de Sud. Estimrile ISAAA sunt puternic contestate de organizaiile ecologiste,
contestaii cu marea caren de a nu avea nici o prob practic. Aflate de civa ani n centrul unor
dezbateri contradictorii aprinse, organismele modificate genetic i continu expansiunea fulminant
preconizat de oamenii de tiin. n mai puin de 10 ani ele au nregistrat un ritm mediu de dezvoltare
realizat n agricultura tuturor timpurilor. Cantitativ acest ritm nregistreaz o cretere anual de peste
10 milioane hectare, iar analitii anticipeaz o extindere a suprafeelor cultivate la orizontul anului
2020 la dimensiunea total de 350 milioane hectare, adic de aproape trei ori mai mult ct reprezint
suprafaa cultivat a rilor UE 15. Reticena europenilor fa de aceste plante pare a fi una fals din
punct de vedere tiinific, singura explicaie plauzibil innd de imposibilitatea acestora de a valorifica
eficient actuala abunden alimentar. Din acest punct de vedere, Romnia este o ar european
atipic, dac avem n vedere c ea este incapabil, n momentul de fa, s-i asigure securitatea
alimentar din resurse proprii.
Cea mai mare parte a suprafeelor cultivate cu varieti modificate genetic este acoperit de
soia (60%). Valoarea pe pia a culturilor transgenice a atins, n 2005, 5,25 miliarde de dolari. Raportul
ISAAA remarc faptul c agricultorii francezi i portughezi au reintrodus, n 2005, cultura de porumb
Bt, la care renunaser de 2 i respectiv 5 ani. Cehia a introdus pentru prima dat cultura de porumb Bt.
Pn n 2005, culturile de porumb Bt au ptruns n cinci ri din Uniunea European (Cehia, Frana,
Germania, Portugalia, Spania). Spania ar membr a UE cultiv, nc din anul 1998, porumb
modificat genetic pe suprafee care n timp ar permite transformarea acestei ri n principalul furnizor
de semine de porumb modificat genetic al Europei.
13

Din cele 21 de ri care cultivau varieti modificate genetic n anul 2005, 13 o fceau pe
suprafee care depeau 50.000 de hectare. Potrivit ISAAA, rile n cauz erau: Africa de Sud,
Argentina, Australia, Brazilia, Canada, China, Filipine, India, Mexic, Paraguay, Spania, Statele Unite,
Uruguay.
n anul 2005, Brazilia este ara care a cunoscut cea mai important cretere de suprafeelor cultivate cu
organisme modificate genetic: culturile de soia transgenic au progresat cu 88%, ajungnd s acopere
9,4 milioane de hectare, (40,3 mil ha in 2013). n India, suprafeele cultivate cu bumbac Bt (modificat
genetic) au crescut de la 500.000 de hectare, n 2004, la 1,3 milioane de hectare, n 2005 pana la 11 mil
ha in 2013.
Potrivit Institutului Service of the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA),
Iranul i China sunt rile cu potenialul cel mai mare n comercializarea de orez modificat genetic. 250
de milioane de agricultori din ntreaga lume, cultiv orezul transgenic, care se constituie n aliment de
baz pentru 1,3 miliarde de persoane. International Service of the Acquisition of Agri-biotech
Applications (ISAAA), asociaie sponsorizat, ntr-o anumit msur, de industria biotehnologiilor, se
autocaracterizeaz ca fiind un organism caritabil, fr a avea ca scop obinerea de profit, care lucreaz
pentru nlturarea srciei din rile n curs de dezvoltare. Acest scop ar putea fi atins prin facilitarea
transferului de cunotine i prin transferarea aplicaiilor din domeniul geneticii vegetale.
In Romnia, in 2006 s-au cultivat in jur de 100 de mii de hectare cu organisme
modificate genetic .
Ministerului Agriculturii a interzis a cultivarii de soia modificata genetic (Roundup Ready)
n Romnia ncepnd cu anul 2007, pe motivul c UE nu ar permite acest lucru.

Situatia suprafetelor cultivate si principalele specii utilizate in 2007

14

n 2014, existau 19 tri care cultivau PMG (din totalul de 28 in care sunt admise) pe mai
mult de 50000 ha, Romania a cultivat numai porumb Bt pe aproximativ 850 ha.
Suprafete cultivate cu plante modificate genetic in lume 1996-2014

Evolutia principalelor specii cultivate (1996-2014)

15

Evolutia suprafetelor cultivate cu pricipalele modificari (1996-2010)

Raportul dintre plantele transgenice si cele non-transgenice 2014

16

5. BAZELE MOLECULARE ALE INGINERIEI GENETICE

Ereditatea: transmiterea caracterelor codificate de materialul genetic ADN
Celula la celulele fiice
Individ la descendenti
Genotip: totalitatea materialului genetic al unui organism
Fenotip: totalitatea trasaturilor observabile ale unui organism, determinate de materialul genetic si de
mediul inconjurator
Dogma central a geneticii
ADN-ARN-proteine

Replicatie
ADN
Transcriere
ARN
Translatie

Nucleu

Proteina
Citoplasma

5.1. Structura acizilor nucleici

Compozitia chimica a ARN
Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), uracilul (U)
Riboza (monozaharid)
Radicali fosfat
Compozitia chimica a ADN
Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), timina (T)
Dezoxiriboza (derivat mai stabil al ribozei)
Radicali fosfat
Bazele purinice: A, G (dublu nucleu aromatic)
Bazele pirimidinice: C, T, U (un singur nucleu hexagonal)

Structura nucleozidelor si a nucleotidelor

Nucleozide = baze azotate + monozaharid (pentoza)
Baze azotate + riboza (ribo-nucleozide)
Baze azotate + dezoxiriboza (dezoxiribo-nucleozide)
Nucleotide = nucleozide + fosfat
5.1.1 Hibridizarea bazelor azotate
Nucleotidele formeaza intre ele legaturi de hidrogen
Aceste legaturi se realizeaza intre bazele azotate, care se asociaza 2 cate 2 (hibridizare) astfel:
A = T (ADN) sau A = U (ARN), C G
Legaturile se stabilesc intotdeauna intre o baza purinica si o baza pirimidinica
Hibridizarea A = T este mai putin stabila (mai usor de disociat) decat hibridizarea C G

17

5.1.2. Structura acidului dezoxiribonucleic (ADN)

ADN este format din nucleotide (A, G, C, T), ale caror pentoze sunt dezoxiriboze. Legaturile dintre

nucleotide sunt de tip fosfodiester.

Molecula ADN este formata din 2 lanturi polinucleotidice ale caror nucleotide sunt unite intre ele, 2
cate 2, prin legaturi de hidrogen, pe toata lungimea
Bazele azotate sunt orientate spre interior
Ribozele si resturile fosfat formeaza un schelet exterior
Cele 2 lanturi sunt antiparalele: extremitatea 5 a unui lant se hibridizeaza cu extremitatea 3 a
celuilalt lant
Secventele lor sunt complementare: pentru ca toate nucleotidele sa poata fi hibridizate, trebuie ca
ordinea legarii lor pe un lant (secventa) sa fie complementara cu cea a lantului opus
Lanturile polinucleotidice sunt spiralate unul in jurul celuilat
dubla spirala (modelul J.D. Watson
si F.H.C. Crick, 1953)
Cele doua lanturi unite prin legaturi de hidrogen pot fi disociate la cald: denaturarea ADN; refacerea
legaturilor: renaturarea (una din caracteristicile prin care se poate amplifica ADN).

Replicarea: sinteza ADN identic cu materialul genetic al celulei, inainte de diviziunea mitotica

dublarea cantitatii de ADN
Replicarea este semiconservativa: fiecare lant este matrita pentru sinteza lantului complementar: 1
molecula ADN
2 molecule, fiecare avand un lant vechi si unul nou sintetizat
5.1.3 Comparaie dintre ADN i ARN

18

5.2. Codul genetic si caracteristicile sale

Marshall Nirenberg a descifrat codul genetic in 1961, realizare pentru care a primit premiul Nobel.

Caracteristicile codului genetic:

1. UNIVERSAL - in toate organismele aceeasi codoni codifica aceeasi aminoacizi.
2. NEACOPERIT / NESUPRAPUS - 2 codoni vecini nu au nucleotide comune.
3. FARA VIRGULE - nu exista spatii libere intre nucleotide si nici alte semne de punctuatie.
4. DEGENERAT - un acelasi aminoacid poate fi codificat de mai multi codoni.
5. AMBIGUU - un anumit codon poate sa includa mai multe tipuri de aminoacizi intr-o proteina
in functie de pozitia lui in catena.
5.3. Expresia genica
Transcriptia si translatia genereaza expresia genica
Informatia genetica codificata in ADN unui embrion include toate genele necesare pentru a mentine si
dezvolta organismul.
Diferite tipuri de celule exprima diferite tipuri de gene.
Expresia genica diferita in timpul dezvoltarii stabileste rolul celulei in corp.
TRANSCRIPTIA- Prin intermediul ARN polimerazei se sintetizeaza o molecula de ARNm
complementara.
Procesul citirii ARM mesager si transformarea informatiei in proteine se numeste TRANSLATIE.
ADN

ADN
Transcriptie

ARN
Mesenger

ARNm
Codon

Codon

Codon

Lizina

Serina

Valina

Translatie

Proteine

Polipeptide
(amino acid
sequence)

19

5.4.Structura genelor la eucariote

Caracteristicile celulelor eucariote:
Celulele au un nucleu protejat de o membrana dubla
ADN este complexat de "histone," si este organizat in cromozomi
Contin un numar fix de cromozomi in nucleu
ADN este linear
Gena: secventa de nucleotide care contine informatia necesara sintezei unei proteine sau a unei
molecule de ARN
Alcatuirea unei gene
1. promotorul (Elemente reglatoare) secventa situata inaintea genei, leaga ARN polimeraza si
determina locul de unde incepe transcrierea
2. Secventa codificatoare (informationala) formata dintr-o succesiune de exoni (secvente transcrise,
pastrate in ARNm si traduse sau exprimate in proteine) si introni (secvente eliminate, absente din
ARNm)
3. Secventa terminala (terminator)- O secventa semnal (AAUAAA) pentru terminarea transcrierii la
sfarsitul ultimului exon

PROMOTOR

INTRON

Secventa codificatoare

poly A
signal

6. INGINERIA GENETIC, ETAPELE TRANSGENEZEI

Ingineria genetica poate fi definita ca un ansamblu de metode si tehnici care permit fie
introducerea in patrimoniul genetic al unei celule a uneia sau mai multor gene noi, de interes, fie
modificarea expresiei unei/unor gene prezente, deja, in celula. Genele transferate sunt denumite
transgene. Ingineria genetica mai este numita, uneori, si modificare genetica, transformare
genetica sau transgeneza, iar produsele obtinute poarta numele de organisme modificate genetic
(OMG) sau organisme transgenice (Badea, 2000).
In Germania, definitia data organismelor modificate genetic este urmatoarea:
OMG sunt organisme al caror material genetic a fost modificat intr-un mod care nu exista in
natura in conditii naturale sau de recombinare naturala. Organismul modificat genetic trebuie sa fie o
unitate capabila de autoreplicare sau transmitere a materialului genetic.
In Statele Unite, termenul de organism modificat genetic se refera la plante si la animale care
contin gene transferate de la alte specii, pentru a obtine anumite caractere, precum rezistenta la
anumite pesticide si erbicide.
In Romania (conform OG nr. 49/2000), organismul modificat generic este un organism care
contine o combinatie noua de material genetic, obtinut prin tehnicile biotehnologiilor moderne care ii
confera noi caracteristici.
6.1. Autoritati in domeniul biotehnologiei
In SUA, obtinerea prin biotehnologii si utilizarea organismelor modificate genetic se afla sub
controlul strict al US Food and Drug Administration (USFDA).
In Europa, pe baza modelului USFDA, a fost stabilit un cadru de lucru pentru regimul de
siguranta al alimentelor in Europa. Legea pentru infiintarea autoritatii in domeniu, European Food
Authority (EFA), a fost aprobata de catre Ministerele Consiliului si Parlamentului European

20

SARCINILE EFA - EFA are 6 sarcini principale:

Furnizeaza opinii stiintifice independente (pentru aspectele de siguranta alimentara,
nutritie, sanatate/bunastare a animalelor, sanatatea plantelor, organisme modificate genetic) la
cererea Comisiei, Parlamentului European (PE), Statelor Membre sau organismelor nationale
pentru alimentatie in scopul acordarii suportului pentru managementul riscului;
Furnizeaza opinii asupra aspectelor de tehnologie alimentara pentru a sprijini
dezvoltarea reglementarilor si legislatiei problemelor de siguranta in fluxul alimentar;
Colecteaza si analizeaza datele asupra modelelor dietetice, expune articole din
programele monitorizate si orice alte date relevante pentru orice risc potential in vederea
monitorizarii sigurantei de-a lungul lantului alimentar in UE;
Identificarea si avertizarea timpurie a riscurilor potentiale;
Functionarea unui sistem de alertare rapid care acopera atat alimentele, cat si furajele;
Comunica publicului general toate sarcinile care i-au fost alocate
ROMANIA este prima tara din Balcani care a stabilit legea organismelor modificate genetic.
Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei Nationale pentru Securitate
Biologica (CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare dispozitiile legislatiei nationale si
internationale referitoare la regimul activitatilor care implica utilizarea organismelor modificate
genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, numai dupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal
National.

Organismele implicate n reglementare n

Romnia (Legea 214/2002)

Atribuii

Emite autorizaii/acorduri, controleaz, informeaz

i consult publicul, solicit avize celorlalte
autoriti.
Comisia Naional pentru Securitate Biologic
Emite o concluzie tiinific
(autoritate tiinific)
Avizeaz
Ministerul Agriculturii, Pdurilor i Dezvoltrii
Avizeaz i controleaz
Rurale
Ministerul Mediului i Gospodririi Apelor
(autoritatea naional competent).

Ministerul Sntii

Avizeaz i controleaz

Agenia Naional pentru Protecia

Consumatorilor

Avizeaz i controleaz

COMISIA NAIONAL PENTRU SECURITATE BIOLOGIC are drept obiect de activitate:

punerea n aplicare a dispoziiilor legislative naionale n domeniu i a actelor juridice
internaionale la care Romnia este parte;
s organizeze i s realizeze msurile prevzute de legislaie n domeniu;
s exercite controlul privind regimul OMG prin tehnicile biotehnologiilor moderne i ale
produselor rezultate din acestea.
Comisia se organizeaz, funcioneaz ca un organism interdepartamental i este compus dintr-un
numr de 19 membri.

21

6.2. Avantajele transgenezei

Comparativ cu metodele clasice de ameliorare, transformarea prin ingineria genetica prezinta,
cel putin,doua avantaje:
- ofera posibilitatea introducerii unui singur caracter la o varietate, deja evaluata ca
performanta;
- gena transferata poate proveni din orice sursa, ceea ce extinde, practic, in mod
nelimitat, posibilitatile de ameliorare.

Ameliorarea traditionala
Cultivar

Donor

Cultivar nou
(mai multe gene sunt transferate)

X
(hibridare)

Gena dorita

Gena dorita

Biotehnologii
Gena dorita

Cultivar comercial

Cultivar nou

(numai gena de interes )

=
(transfer)
Gena de interes

22

6.3. Elementele necesare pentru modificarea genetica a plantelor:

- gene de interes;
- metode care sa permita patrunderea si integrarea transgenelor in nucleul celulei care va
fi la originea unei noi plante;
- - selectia plantelor in care transgena se exprima la un nivel adecvat scopului urmarit
(toleranta la erbicid, rezistenta la atacul unui daunator etc.).

6.4. Transgeneza presupune parcurgerea a trei etape:

- identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes;
- transferul genelor de interes la plantele de cultura ;
- selectia plantelor care exprima, la un nivel optim, caracterul transferat si testarea
acestora in camp pentru evaluarea stabilitatii expresiei transgenei in timp, in conditii
naturale.
6.4.1. Identificarea, izolarea si clonarea genelor de interes
Pentru obtinerea enzimelor de restrictie (substante de natura proteica ce pot sectiona
fragmentul de ADN):
- Peste 10.000 de specii de bacterii au fost evaluate
- Peste 2500 de enzime au fost identificate
- Peste 250 de secvente specifice

Exemple de enzime de restricie i secvenele recunoscute de acestea

Identificarea i izolarea genelor se face cu ajutorul enzimelor de restricie

23

Clonarea genelor de interes

1. Vectorul de clonare (de obicei un plasmid) este secionat cu ajutorul enzimelor de

restricie.
2. Fragmentul de ADN de interes este detaat de din cromozom cu ajutorul aceleiai
enzime de restricie.
3. Fragmentele rezultate sunt ataate vectorului de clonare cu ajutorul ligazelor rezultnd
un vector recombinant.

4. Vectorul recombinant este introdus (de exemplu prin metoda biolistic) n celula gazd
24

(de regul o bacterie).

5. Bacteria mpreun cu vectorul recombinant se nmulete (cloneaz) producnd multe

copii de ADN recombinant.
6. ADN recombinant se extrage si se purific.

25

Obtinerea unui construct

Constructia unei transgene

intrerupator
PROMOTOR INTRON

Sinteza proteinei

Semnal stop

Secventa codificatoare

poly A signal

Gena de interes

Gena marker pentru

selectia plantei

Plasmid ADN
Construct
Gene bacteriene
antibiotic marker
replication origin

6.4.2.Transferul genelor de interes la plantele de cultura;

Principalele metode utilizate pentru transferul genelor de interes:
METODE INDIRECTE TRANSFORMAREA MEDIATA
1. Transformarea mediata de bacterii
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes
2. Transformarea mediata de virusuri
METODE DIRECTE
1. Metoda biolistics mpucarea direct a ADN n celule
2.Transformarea protoplastelor
a. Microinjectarea
b. Electroporarea
c. Sonicarea3. Electroforeza4. Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu
6.4.2.1. TRANSFORMAREA MEDIAT DE AGROBACTERIUM
Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium rhizogenes realizeaz ceea ce
adeseori s-a numit inginerie genetic natural. Aceaste bacterii sunt capabile s transfere n esutul
vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (tumor inducing) n cazul
speciei A. tumefaciens sau Ri (root inducing) n cazul speciei A. rhizogenes, care se integreaz n
genomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului
(crown gall disease) iar A. rhizogenes formarea de rdcini firoase (hairy roots). In decursul
coevoluiei plant microorganism aceste bacterii au devenit capabile s transforme plantele pentru a
le exploata mai bine ca i surse de energie. ADN T se transmite dup legile Mendeliene, ca gen
dominant. Exist date care confirm faptul c o astfel de transformare genetic are loc n natur fr
intervenia omului.
Astfel, s-a demonstrat c plasmida Ri poate purta una sau dou copii de ADN-T, iar o parte
din una dintre aceste secvene a fost regsit n genomul unor plante nemodificate genetic. Celulele
vegetale care poart ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conine gene cu
26

efect oncogen. Deleia acestor gene din ADN-T nu interfer, din fericire, cu transferul i integrarea
ADN-T n genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aa numitele latur dreapt i
stng constnd din o secven alctuit din 24 de nucleotide care se repet, reprezint situri de
recunoatere pentru sistemul de transfer. Prin nlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de interes
este posibil transferul acestora n celule vegetale int, celule care nu mai dobndesc caracter tumoral
i deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes fie ele gene marker sau raportoare
sau gene cu importan economic pot fi introduse n plante fie prin linkage (legare) cu regiunea
ADN-T dezarmat prin recombinare, obinndu-se un aa numit vector de integrare, fie prin clonarea
lor ntre secvenele repetate laterale ntr-un replicon independent, ceea ce se numete vector binar.
Existena mai multor regiuni T n celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora n celula
vegetal int cu eficien crescut. Pe de alt parte pentru integrarea ADN-T n celula vegetal se pot
utiliza secvene omoloage ADN vegetal int care induc, cu frecven relativ sczut, recombinarea
omolog ntre ADN-T i ADN vegetal.
A. tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dac unele dintre
acestea nu formeaz tumori. Dei spectrul de gazde pentru aceast bacteriei este limitat la plantele
dicotiledonate s-au obinut tulpini supervirulente, capabile s infecteze eficient i celulele plantelor
monocotiledonate. S-a deschis, astfel, calea transformrii cerealelor i prin intermediul acestui vector
bacterian. Eficiena transformrii celulei vegetale de ctre A. tumefaciens, variaz destul de mult n
funcie de specie, genotip sau chiar de esutul int. Este foarte important, totodat, ca esutul supus
transformrii s fie totipotent (omnipotent) i deci s regenereze plante transformate genetic. De cele
mai multe ori, ns, dintr-un esut doar un numr limitat de celule sunt totipotente i nu ntodeauna
acestea sunt i cele transformate de Agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat
metode potrivite pentru transformarea eficient mediat de A. tumefaciens. Ca esuturi int pot fi
utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rdcini, hipocotile, peiol, cotiledoane sau
semine ntregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate n
1983, succesele iniiale limitndu-se la solanacee, n particular la sistemul model tutunul (Nicotiana
tabacum L.). Ulterior au fost transformate: soia, bumbacul, orezul, ovzul, sorgul, trestia de zahr,
grul i multe altele. Eficiena transformrii variaz foarte mult de la o specie la alta n funcie de:
identificarea metodei optime de cultur a esutului int, condiiile de cultur a materialului surs, sau
sua bacterian utilizat. Aceti factori afecteaz i numrul de copii de ADN-T care se integreaz n
genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei
singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetrile au vizat descifrarea mecanismelor implicate n
colonizarea esuturilor vegetale de ctre bacterii, relevndu-se noi detalii privind controlul genetic al
virulenei bacteriene .
Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oar pentru transformarea plantelor de
tutun n anul 1977. Aceast bacterie transfernd ADN-T de pe plamida Ri determin formarea
rdcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rdcini care pot purta gene de interes, dac acestea
au fost integrate n ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etap intermediar,
n procesul de transformare mediat de A. rhizogenes, este cultura rdcinilor firoase care au
capacitatea de a se alungi i ramifica. Astfel, prin cultura rdcinilor firoase se pot obine metabolii
secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creterea i dezvoltarea rdcinilor. Acest
sistem experimental este foarte potrivit i pentru analize biochimice, rdcinile prezentnd ci
biochimice mai simple i, deci, mai uor de analizat. Rdcinile firoase pot fi cultivate uor, folosind
un echipament simplu i ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile
din punct de vedere genetic. Asemntor sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate cotranfera ADN-T de pe plasmida Ri i un vector binar, de obicei o plasmid mai mic. Aceasta din
urm poate purta n ADN-T o gen marker, de exemplu o gen care confer rezisten la un antibiotic,
o gen raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipic i o gen cu importan economic.
Avantajul acestui sistem este acela c cele dou tipuri de ADN-T, cel care determin dezvoltarea
rdcinilor firoase, i ADN-T de pe vectorul binar, se integreaz de obicei pe cromozomi diferii n
plantele transformate i deci, vor segrega independent n descenden. Un avantaj aparte al sistemului
de transformare Ri este faptul c toate celulele vegetale care integreaz ADN-T de pe plasmida Ri pot
fi uor identificate i selectate prin prezena fenotipului de rdcin firoas. Sistemul de transformare
mediat de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare numr de specii de plante (n jur de 200 nc n
1989), dar asemntor sistemului A. tumefaciens rspunsul optim variaz n funcie de specie, genotip
27

sau sua bacterian. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente
de tulpin de la plante tinere, fragmente de peiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau
cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezerv cum ar fi rdcinile de morcov sau tuberculii de
cartof. Uneori astfel de explante prezint un rspuns polar, formnd rdcini firoase numai la una din
extremele explantului, rdcini capabile s ignore fora gravitaional. Mai mult, exist date
experimentale care sugereaz efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulen,
rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importan practic mai ales pentru unele plante horticole

Metoda discurilor pentru transformarea mediata de Agrobacterium

Pregatirea discurilor

Regenerarea

Co-cultivarea cu Agrobacterium

Selectia transformantilor

Aclimatizarea in sera
Photographs by Dr. Paul Bottino

6.4.2.2. TRANSFORMAREA MEDIAT DE VIRUSURI

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda numeroaselor eforturi
experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Dei, n 1984 a fost posibil transferul unei gene de
rezistena la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN cercetrile ulterioare au demonstrat c genomul
viral nu poate accepta i transfera fragmente mai lungi de ADN strin. Descoperirea faptului c
virusurile ARN pot genera ADN prin transcripie invers a generat sperana c, mult mai numeroasele
virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetal. Din pcate, ns, s-au
ntmpinat alte dificulti. ADN viral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principala
surs de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizai
n experimentele de transformare genetic a plantelor.

28

METODE DIRECTE
6.4.2.3. METODA BIOLISTICS mpucarea direct a ADN n celule
Metoda biolistic (biolistics) sau particle gun, de mpucare direct a ADN n esuturi
int este o metod de transformare genetic a plantelor foarte rapida.
Metoda const n accelerarea unor particule foarte mici (1m diametru) din tungsten, wolfram
sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, n esuturi vegetale int. Aceast tehnic are
numeroase avantaje care o recomand pentru aplicabilitate general: este o metod uor de aplicat,
printr-o mpuctur pot fi intite mai multe celule, celulele supravieuiesc dup mpucare, genele
purtate de particule i pstreaz activitatea biologic, particulele pot fi mpucate n straturile
superficiale sau n profunzimea unui organ vegetal. Celulele int pot fi foarte diferite: polen, celule n
suspensie, embrioni imaturi, celule din esuturi difereniate sau chiar meristeme. Datorit avantajelor
sale biolistica a devenit metoda favorit n numeroase laboratoare, permind transformarea cu succes
a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovzul, orezul,
sorgul, trestia de zahr, grul, plante forestiere etc. O aplicaie aparte a fost utilizarea mpucrii de
microproiectile pentru rnirea apexurilor (vrfurilor de crestere) la floarea soarelui, eficientiznd astfel
transformarea mediat de Agrobacterium tumefaciens. Mai mult, s-a reuit mpucarea direct n
esuturi vegetale a celulelor bacteriene ntregi

BioRad Particle Gun

Helios Gene Gun

29

6.4.2.4. Utilizarea protoplastelor (protoplatilor) pentru transferul direct de ADN

Dintre sistemele de transformare, transformarea utiliznd protoplaste este una dintre metodele
de finee. Protoplastele sunt izolate fiecare printr-un proces mecanic sau enzimatic prin ndeprtarea
peretelui celular. Protoplastele sunt frecvent obinute dintr-o suspensie de linii celulare, de la calus
obinut din embrioni imaturi, inflorescene imature, mezocotil, frunze imature bazale i antere.
Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezint limita de expresie a
totipotenialitii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate pn astzi numrul
plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibil a crescut permanent, ajungnd
actualmente la aproximativ 400 de specii de plante.
Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN i selecia
transformanilor. Indeprtarea peretelui celular elimin principala barier n calea ptrunderii ADN
strin n celula vegetal. Izolarea enzimatic a protoplastelor acioneaz ca un factor de stress care
induce reacii de rspuns la rnire reacii presupuse a declana starea de competen, important
pentru transformarea eficient. Suspensia de protoplaste se aseamn cu o suspensie bacterian avand
avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaii mari de celule individuale n medii de cultur
bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au n general origine clonal provenind din celule
individuale. Eficiena seleciei transformanilor este maxim n cazul protoplastelor deoarece se evit
formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare.
Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, n protoplastele izolate se pot utiliza diferite
metode, i anume:
a. Microinjectarea const n introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct n
protoplaste, acestea fiind fixate cu o alt micropipet. Microinjectarea celulei vegetale ntregi sau a
esuturilor este posibil, dar se realizeaz mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistem eficient a fost
utilizat mai recent i const n imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun ntr-un strat foarte subire
de mediu solidificat cu agaroz sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a
permis localizarea i monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a
celulelor sau calusurilor derivate din acestea.
b. Electroporarea implic permeabilizarea reversibil a membranei plasmatice n prezena
unor pulsuri de curent continuu avnd amplitudine crescut i durat foarte scurt, porii formai n
membran permind intrarea ADN strin n citoplasm . Electroporarea a devenit o metod de rutin
pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar i pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La
plante, electroporarea protoplastelor se folosete eficient pentru transformarea permanent la
numeroase specii de plante incluznd cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimin
necesitatea utilizrii unor gene marker, ceea ce reprezint un avantaj deosebit n condiiile oponenei
acerbe a opiniei publice fat de eliberarea n cmp a unor plante purtnd gene marker. Avantajele
electroporrii constau n eficiena crescut a incorporrii ADN strin, reproductibilitatea i simplitatea
acestei metode. Singura limitare a aplicrii electroporrii o reprezint capacitatea de regenerare a
protoplastelor, dar i acest dezavantaj a fost depit prin extinderea aplicrii electroporrii celulelor sau
chiar esuturilor ntregi
c. Sonicarea permeabilizarea membranei protoplastelor n prezena ultrasunetelor s-a
dovedit, de asemenea o metod eficient pentru transferul ADN n protoplaste vegetale. Ulterior
metoda a fost aplicat i celulelor sau esuturilor ntregi, dar este utilizat pe scar mai redus
comparativ cu electroporarea

6.4.2.5. ALTE METODE DE TRANSFER DIRECT AL ADN N CELULELE VEGETALE

30

Electroforeza Migrarea ADN printr-un esut vegetal int a fost o alt idee interesant pentru
transferul de gene i a fost aplicat pentru prima oar embrionilor de orz.
Principalul avantaj al metodei consta in posibilitatea de a realiza plante modificate genetic fara
parcurgerea fazei de cultura in vitro

Utilizarea fibrelor de carbur de siliciu (silicon carbide technology)

Fibrele de carbur de siliciu se utilizeaz n industrie. Transformarea genetic prin aceast
tehnologie este relativ simpl, constnd n vortexarea (agitarea) esuturilor mpreun cu ADN i fibre
de carbur de siliciu. Astfel, fibrele penetreaz pereii celulari permind ADN s ptrund n
citoplasm. Metoda a fost aplicat iniial transformrii embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit
eficient i n transformarea celulelor vegetale. Cercetrile de microscopie electronic au relevat
penetrarea peretelui celular de ctre astfel de fibre, sugernd c ADN ader de suprafaa fibrelor i este
introdus odat cu acestea n celul. Avnd proprieti fizice asemntoare azbestului fibrele de carbur
de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetic a fost raportat folosind aceast
tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovz, tutun i Agrostis alba. Transformarea stabil a
fost, de asemenea posibil folosind suspensii celulare de porumb i tutun. Datele obinute au indicat
transformarea preponderent a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun
cercetri ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezint avantajul de a fi foarte simpl
i ieftin, dar datorit riscurilor poteniale pentru sntatea uman se caut materiale alternative,
eventual biodegradabile .
Alte metode cu aplicabilitate restrns de transformare a celulei vegetale sunt: mbibarea
ADN n esuturi utiliznd semine uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic,
macroinjectarea ADN n esuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular i
plasmalema. Astfel de metode se afl, actualmente, n diferite faze de experimentare. De un interes
deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesit faze de cultur in vitro. O astfel de
metod, cu potenial deosebit este transformarea gruncioarelor de polen, dar deocamdat rezultatele n
acest domeniu sunt relativ modeste
6.7.3. SELECIA TRANSFORMANILOR
Selecia este o parte importan a proceselor de transformare. n general, genele de interes sunt
co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uurin a celulelor recipiente transformate.
Markerii de selecie cei mai utilizai confer rezisten la ageni chimici, cum ar fi antibiotice
i erbicide.
Genele de selecie pot fi utilizate ntr-o prim generaie i eliminate mai trziu prin ncruciare
convenional. O posibilitate este de a obine dou ADN-T separate; una cu gene de interes i alta cu
markeri de selecie, n aceeai sau dou celule diferite de Agrobacterium. Cele dou ADN-T sunt
inserate n situsuri ne-link-ate n genomul plantei gazd, permind mai trziu segregarea genetic.
Transformarea optim se caracterizeaz printr-o singur copie a transgenei care va segrega
mendelian cu o expresie uniform de la o generaie la alta. Transformanii ideali pot fi identificai cu
31

dificultate, depinznd de materialul vegetal care va fi transformat i de cantitatea i complexitatea

transgenelor. O gen inserat este esenial randomizat n genom, se observ o variabilitate de la o
plant transgenic la alta, fenomen cunoscut sub numele de variaie cu efect de poziie.
Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizat gena nptII, sau neo, gen izolat din
transpozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Aceast gen codific neomicinfosfotransferaza
enzima implicat n detoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina, kanamicina,
paramomicina sau geneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi
tutunul, cartoful, Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul ca s le amintim pe cele mai
importante. Pentru aceast gen ca ageni de selecie se utilizeaz cel mai mult kanamicina (50 100
mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au dovedit insensibile la
kanamicin, n acest caz geneticina dnd rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat c la unele
specii kanamicina poate interfera cu procesele de organogenez, afectnd eficiena regenerrii
plantelor transformate.
O alt gen marker mult utilizat este gena hpt sau hph, gen izolat tot de la bacteria E. coli
codificnd enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Aceast enzim detoxific antibioticul
higromicin B, antibiotic fa de care majoritatea esuturilor vegetale sunt foarte sensibile. De aceea,
aceast gen marker a fost utilizat pentru transformarea multor specii de plante, cum ar fi: tutunul,
Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina este ndeosebi foarte potrivit ca
agent de selecie pentru cereale, folosindu-se n concentraii de 25-200 mg/l. Secvena codant a genei
a fost, de asemenea, modificat pentru o expresie mai bun n celula vegtal.Dintre genele care confer
rezisten la erbicide cel mai mult a fost utilizat gena bar, izolat de la bacteria Streptomyces
hygroscopicus i gena pat de la S. viridochromogenes, ambele codificnd enzima
fosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ cel mai mult utilizat ca erbicid de
selecie a plantelor transformate genetic, genele amintite fiind transferate cu succes la plante ca:
tutunul, rapia, porumbul, orezul, grul i altele. O alt gen marker este gena dhfr pentru enzima
dihidrofolatreductaz (DHFR), izolat tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR confer
rezistena la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la
concentraii mici ale acestui compus. Gena dhfr a fost transferat la specii cum ar fi: tutunul, petunia i
grul.
Genele raportoare, spre deosebire de markerii de selecie, nu confer celulelor rezisten
fa de un anumit compus. Ele codific proteine care pot fi detectate direct sau catalizeaz reacii
specifice ai cror produi pot fi detectai prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul
factorilor de transcripie cis sau trans, n condiiile transformrii tranziente sau permanente, precum i
monitorizarea i optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare sunt:
gena gus (uidA) codific -glucuronidaza (GUS) i a fost izolat de la E. coli K12
(Jefferson i colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizat la plante. Exist pentru aceast
hidrolaz compui substat pentru evidenierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau
histochimice la nivelul esuturilor rezultnd un compus de culoare albastr uor de evideniat. La pHul utilizat pentru determinarea GUS nu exist activitate -glucuronidazic detectabil n nici un esut
vegetal. Toate metodele de determinare se aplic ns, numai celulelor fixate, nonviabile. gena
raportoare luc pentru enzima luciferaz folosete un sistem substrat-enzim care produce
bioluminescen. Gena luc a fost izolat de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus
pyralis, fiind exprimat n plante. Produsul genei, luciferaza poate fi extras din esuturi iar activitatea
ei poate fi determinat n prezena luciferinei. Dar, exist i o metod de determinare non-letal i
neinvaziv direct n esuturile i organele plantelor transformate, pentru msurarea bioluminescenei
fiind necesar un luminometru.
gena gfp pentru proteina cu fluorescen verde (GFP) reprezint cea mei nou gen
raportoare i totodat cea mai spectaculoas i avantajoas. Gena a fost izolat de la o meduz,
Aequarea victoria, fiind transferat la cteva specii de plante. GFP prezint o serie de avantaje i
anume: nu necesit un substrat, proteina se evideniaz n esuturi intacte in vitro i in vivo, prin
excitarea n UV, proteina poate fi fuzionat cu alte proteine permind monitorizarea traficului proteic
i a metabolismului. gena cat izolat de la E. coli, codific enzima cloramfenicolacetiltransferaza
(CAT), fiind, de asemenea, mult utilizat ca gen raportoare la plante. Determinarea sa este mai
32

pretenioas bazndu-se pe monitorizarea acetilrii cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetilCoA, fie a cloramfenicolului, produii fiind separai prin cromatografie n strat subire (TLC) i
msurai prin densitometrie sau prin scintilaie. Uneori poate exista activitate CAT i n unele esuturi
vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce afecteaz eficiena acestui sistem.
antocianii
sunt
pigmeni roii sau purpurii care se acumuleaz n vacuole n unele esuturi ale plantelor. Sinteza de
antociani este controlat de gene structurale i reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate i
clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare n esuturile i organele unor genotipuri care
conin gene structurale dar nu sintetizeaz antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezint o serie
de avantaje: nu necesit un substrat, se exprim doar n celulele viabile i metabolic active, sunt uor
de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcripie R i C1 de la porumb.
genele care confer rezisten la streptomicin i/sau spectinomicin au fost, de
asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care l au, prin inactivarea
cloroplastelor

33

7. PRIMA GENERAIE DE PLANTE TRANSGENICE

Prima generaie de plante transgenice este constituita din cultivare care au fost modificate prin
introducerea unuia sau a cel mult dou caractere noi, cum sunt tolerana la unul sau mai multe erbicide,
toleran la insecte sau la duntori sau tolerana combinat (caractere input/ tehnologice).Ponderea
pierderilor produse de diferii factori din producia potenial

13
Productia realizata
Boli
Insecte
Buruieni

14

63

15

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivate cu OMG
In anul 2002

8
Toleranta la
erbicide(TE)
Rezistenta la insecte(RI)

17

TE/RI
75

In anul 2014

28

58

Toletanta la erbicide(TE)
Rezistenta la insecte(RI)
TE/RI

24

34

7.1. PLANTE TRANSGENICE TOLERANTE LA ERBICIDE

Erbicidele molecule chimice care actioneaza selectiv, afectand buruienile
-Specifice actioneaza selectiv
-Totale distrug toate plantele normale
Avantajele erbicidelor totale:
-toxicitate redusa
-efecte minore asupra mediului
-costuri reduse
Strategii privitoare la obtinerea OMG tolerante la actiunea erbicidelor:
-modificarea tintei erbicidului (cantitativ si calitativ)
-introducerea in plantele cultivate a unui sistem de degradare a erbicidului
I. Erbicidele sikimice (glifosat) sunt sistemice totale si actioneaza avand ca tinta o enzima din
calea metabolica ce duce la sinteza aminoacizilor aromatici (prezenta la plante si microorganisme nu si
la om sau animale). O gena mutanta care sa determine sinteza unei enzime insensibile la actiunea
erbicidului poate fi izolata de la bacterii sau chiar de la plante.
Soia Roundup Ready (RR) poseda o gena transferata de la E. coli
Porumbul RR poseda o gena transferata de la porumb
Roundup (glifosat) aprobat in Romania de peste 40 de ani
II. A doua strategie aplicata in cazul erbicidului glufosinat de amoniu (fosfinotricin) care
inhiba o enzima cheie in procesul de asimilare a azotului, rezultand concentratii letale de amoniac la
numai cateva ore.
Gena cu care au fost obtinute plante tolerante de rapita codifica o enzima ce detoxifica
fosfinotricinul, inactivandu-l.
Gena izolata de la o actinomiceta din genul Streptomyces a fost transferata cu
Agrobacterium
7.2. PLANTE REZISTENTE LA ATACUL INSECTELOR
Pierderile globale cauzate de insecte s-ar putea ridica anual la 4000 de md. dolari (daca nu s-ar
aplica nici o masura de combatere) actualmente fiind de aproximativ 100 md.
Avantaje folosirii PMG tolerante la atacul insectelor:
- reducerea poluarii chimice
- protejarea entomofaunei utile
- eliminarea reziduurilor din apa si alimente
Strategia introducerea in plante a unor gene ce determina sinteza unor proteine insecticide
(origine vegetala, animala sau microorganisme).
Cel mai frecvent se utilizeaza la gene din bacteria de sol Bacillus thuringiensis.In conditii de stress
bacteria formeaza un endospor.
Pentru constructia endosporului celula bacteriana sintetizeaza proteine specifice. Surplusul este
depozitat sub forma unui corp proteic paracristalin. Celula bacteriana se degradeaza eliberandu-se
sporul si cristalul.
Insectele ingereaza cristalele proteice, iar proteina este fragmentata in doua de enzimele din aparatul
digestiv. Un fragment (delta endotoxina) formeaza un complex cu receptori specifici cu membrana
epiteliului intestinal.
S-au studiat 40000 de tulpini de B. thuringiensis - 1000 toxine diferite fiecare cu spectru specific
Genele Bt au fost transferate la peste 26 de specii vegetale.
Compania Monsanto porumb Yieldgard ce sintetizeaza Cry I A (b) construind o gene sintetica in
proportie de 65%

35

Combaterea sfredelitorului porumbului

(Ostrinia nubilalis)
A) Bacillus thuringiensis

Zellkern
mit DNA

B) Bt - Porumb
Bt-Mais

Bt-Gen
Wirkstoff
Bt-Eiwei

8. A DOUA GENERATIE DE PLANTE TRANSGENICE

A doua generatie de plante transgenice se refera la noi cultivare (hibrizi, soiuri) care au modificate
caractere legate de calitatea produselor obtinute (caractere output).
Exemple:
-modificarea continutului de amidon, proteine, zaharuri
-modificarea insusirilor de panificatie
-cresterea duratei de pastrare a fructelor
-sporirea continutului de beta-caroten
36

-imbunatatirea digestibilitatii furajelor

37

8.1. Modificarea procesul de coacere a fructelor

Tomatele comercializate in stare proasp\t\ sub numele FLAVRSAVRR sunt primul produs
alimentar recoltat de pe plante transgenice care a fost aprobat pentru consum. Acest a fost primul
produs OMG comercializat pe piata SUA in 1994 si primul in Europa (UK) 1996.~n general, tomatele
sunt culese cnd sunt `nc\ necoapte [i tari - stadiu pe care cultivatorii `l numesc maturitate in verde.
Coacerea este indus\ dup\ ajungerea la destina]ie, printr-un tratament cu etilen\ (hormon natural
implicat `n coacerea fructelor). Din cauza recolt\rii timpurii, aceste tomate nu au arome [i gustul
maturate pe plant\. Evident, o recoltare ceva mai trzie ar ameliora considerabil calitatea tomatelor
proaspete. ~n consecin]\, s-a procedat la modificarea genetic\ `n sensul p\str\rii consisten]ei dup\
cules, fapt ce face posibil\ nu numai recoltarea `ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat, cnd s-au
acumulat [i aromele specifice, ci [i reducera pierderilor determinate de zdrobirea `n timpul
transportului.Pentru modificarea procesului de coacere al tomatelor, au fost aplicate dou\ strategii.
Prima a fost conceput\ pornind de la faptul c\ `nmuierea fructelor, `n general, se produce
atunci cnd pere]ii celulelor sunt degrada]i de enzime specifice; dou\ dintre aceste enzime au fost
identificate [i la tomate. Cercet\torii de la Calgene, din Davis (California), au blocat sinteza uneia
dintre ele - poligalacturonaza (PG)- [i, ca urmare, procesul de degradare a pere]ilor celulari a fost
`ntrziat, iar fructele [i-au conservat fermitatea mai mult timp.
A doua strategie se bazeaz\ pe faptul c\, `ntr-o anumit\ faz\ a dezvolt\rii lor, fructele produc
etilen\ - hormonul men]ionat mai sus, care declan[eaz\ [i accelereaz\ procesul de coacere. Evident,
dac\ se suprim\ sinteza acestui hormon- sinteza `n care sunt implicate tot dou\ enzime - `ntregul
proces de coacere este `ntrziat. Mai precis, se folosesc genele care codific\ una sau alta dintre cele
dou\ enzime implicate `n sinteza etilenei, dar orientate `n sens invers. Transferate la tomate, aceste
transgene antisens determin\ reducerea cu 95% (!) a cantit\]ii de etilen\ sintetizate [i prelungirea
duratei coacerii de la una la patru s\pt\mni.
~n Fran]a, a fost ob]inut\ o linie de pepene galben care exprim\ o gen\ antisens ACC oxidaz\.
Fructele acestei linii se `nmoaie mult mai trziu dect fructele variet\]ilor conven]ionale. Prin urmare,
ele pot r\mne mai mult timp pe plant\, acumulnd zaharuri solubile [i componente ale aromei `n
cantit\]i superioare.
8.2. Cresterea continutului in substanta uscata
Tomatele constituie materia prim\ pentru o industrie care produce ketchup, supe, paste, sosuri,
conserve etc. Toate acestea se ob]in din variet\]i special create pentru industrializare. Totu[i, 95% din
fruct este ap\, care trebuie par]ial eliminat\ `n procesul prelucr\rii. Ca urmare a acestui fapt, o parte
din pre]ul produselor pe baz\ de tomate este reprezentat\ de costul elimin\rii apei. Cre[terea ponderii
substan]elor solide solubile (`n principal, zaharuri, acizi organici [i compu[i aromatici) `n fruct cu
numai un procent- de la 5% la 6%- ar permite economisirea `n industria tomatelor din SUA a nu mai
pu]in de 75 de milioane de dolari anual. Evident, [i acest obiectiv poate fi atins tot prin modificare
genetic\, adoptndu-se diferite strategii.
8.3.Tipuri noi de amidon
De[i amidonul este prezent `n `ntreaga lume vegetal\, sunt exploatate industrial doar cteva
surse: porumbul, cartoful, grul, maniocul [i orezul. Produc]ia european\ se ridic\ la 10 milioane de
tone, iar cea mondial\ - la 35 milioane de tone. 60% din amidonul produs provine din porumb, 25% din gru [i 15% - din cartof. O treime dintre produse sunt naturale, iar dou\ treimi sunt derivate, dintre
care 20% - amidonuri modificate [i 55% - zaharuri. Exist\ deja numeroase brevete referitoare la
aplica]ii ale amidonului modificat prin transgenez\.~n SUA, cartofii se consum\ sub form\ de chips
sau cartofi pr\ji]i. Pentru a putea fi folosi]i `n acest scop, ei trebuie s\ con]in\ amidon `n propor]ie de
25%. Un con]inut mai mic - de exemplu, 21- 22% - impune evaporarea unei cantit\]i mari de ap\, fapt
ce duce la absorb]ia gr\similor `n timpul prepar\rii. Recurgnd la o gen\ bacterian\, cercet\torii de la
Monsanto au reu[it s\ sporeasc\ con]inutul de amidon al tuberculilor de cartof de la 22 la 25%.

38

Amidonul - glucid puternic polimerizat- are doi constituien]i esen]iali: amiloza [i amilopectina.
Diferen]ele de structur\ molecular\ le confer\ acestora [i propriet\]i reologice foarte diferite, care sunt
exploatate `n industria agroalimentar\: amiloza formeaz\ u[or geluri, `n timp ce amilopectina este un
agent de `ngro[are foarte eficace. ~n amidonurile cerealelor predomin\ amilopectina, raportul
amiloz\/amilopectin\ variind `ntre 20/80 [i 30/70. Avnd `n vedere faptul c\ amiloza prezint\
avantaje, `n prezent se `ncearc\ r\sturnarea acestui raport prin inginerie genetic\.
8.4.Sinteza unor glucide de interes industrial
Metabolismul plantelor poate fi deturnat `n sensul sintetiz\rii unor molecule de interes pentru
industrie prin introducerea unor noi echipamente enzimatice. O strategie de acest tip a fost aplicat\
pentru sinteza unor oligozaharide - ciclodextrinele. Acestea au o structur\ ce le confer\ capacit\]i de
adsorb]ie utilizate `n industriile cosmetic\ [i farmaceutic\, `n agrochimie sau `n industria
agroalimentar\, pentru stabilizarea parfumurilor [i aromelor, pentru complexarea produ[ilor cu
eliberare treptat\, ca [i pentru extragerea unor substan]e speciale (cofein\, colesterol) din amestecuri.
De exemplu, o gen\ izolat\ de la o bacterie a fost introdus\ `n genomul cartofului [i a determinat
sinteza enzimei ce condi]ioneaz\ formarea ciclodextrinelor `n tuberculi. Evident, aceast\ tentativ\
reu[it\ atest\ viabilitatea conceptului [i deschide calea spre alte `ncerc\ri de a produce, cu ajutorul
plantelor, moleculare cu mare valoare ad\ugat\, derivate din amidon.~n cadrul unui alt proiect, a fost
ob]inut\ sfecla de zah\r transgenic\ ce produce fructan, un `ndulcitor necaloric: O alt\ cale de a
spori dulcea]a fructelor const\ `n a face plantele s\ sintetizeze proteine naturale dulci, cum sunt
monelina [i taumatina-proteine prezente `n fructele unor specii de plante tropicale. Gena pentru
monelin\ a fost transferat\ la tomate [i salat\, iar gena care codific\ precursorul taumatinei - la cartof
[i castravete. Pe aceast\ cale devine posibil\ [i reducerea cantit\]ilor de zaharuri ad\ugate `n unele
preparate alimentare. Un alt `ndulcitor proteic performant este brazeina care este de 500 pn\ la 2000
de ori mai dulce dect zah\rul. Societ\]ile ProdiGene [i NeKtar Worldwide preconizeaz\ s\ transfere
gena care `l codific\ la porumb.
8.5. Orezul cu bobul galben
Una dintre cele mai remarcabile realiz\ri apar]ine Institutului Federal de Tehnologie din
Zurich. Este vorba de un soi de orez cu bobul galben care, ca urmare a modific\rii genetice, con]ine,
`n semin]e, vitamina A [i fier. Desigur, aceast\ realizare este extrem de interesant\ mai ales pentru
popula]ia s\rac\, malnutrit\. Se [tie c\ beta-carotenul este un pigment necesar pentru fotosintez\,
sintetizat `n ]esuturile verzi ale tuturor plantelor, deci [i ale orezului, dar nu [i `n ]esuturile
nefotosintetizatoare, cum sunt cele ale semin]elor. Pe de alt\ parte, se estimeaz\ c\, `n `ntreaga lume,
peste 124 de milioane de copii sunt deficien]i `n vitamina A. Printr-un aport de vitamina A `n diet\ s-ar
preveni, anual, moartea a 1,3 - 2,5 milioane de vrst\ prescolar\. Orezul galben auriu sintetizeaz\
betacaroten [i `n semin]e, deoarece `n genomul s\u sunt incluse patru gene care codific\ enzimele
cheie ale biosintezei acestui pigment, izolate de la Narcissus [i Erwinia. O alt\ problem\ acut\ de
nutri]ie este deficitul de fier `n organism, care afecteaz\ 30% din popula]ia globului. Solu]ia: `n acela[i
orez, a fost introdus\ [i o gen\, izolat\ de la soia, care codific\ feritina - o protein\ ce stocheaz\ fierul.
Func]ionarea acestei gene, pus\ sub controlul unui promotor cu expresie s\mn]\ specific\, a f\cut
s\ creasc\ de trei ori nivelul fierului `n bobul de orez.
8.6. Modificari aduse plantelor textile
Bumbacul r\mne cazul cel mai interesant `n privin]a aplica]iilor ingineriei genetice. ~n afara
soiurilor rezistente la insecte [i erbicide (obiectiv impus de faptul c\ aproximativ 40% din cantitatea
total\ de pesticide consumate se aplic\ la aceast\ specie), cultivate deja pe suprafe]e mari `n Statele
Unite ale Americii, dar [i `n China, Africa de Sud [i India, sunt `n curs de ob]inere:- linii care
sintetizeaz\ melanin\, pentru culoarea neagr\, `n lumenul fibrei, prin expresia unor transgene sub
controlul unor promotori fibr\ specifici - linii care sintetizeaz\, tot `n lumenul fibrei, un miez de
material plastic.Scopurile finale ale acestor transform\ri sunt evidente: renun]area la opera]iunea de
colorare a fibrelor, costisitoare [i poluant\, [i ameliorarea propriet\]ilor termice.

39

8.7 Alte tipuri de modificari

Pentru ameliorarea calit\]ii `mbr\c\min]ii, `n plantele furajere se introduc gene care codific\
proteine cu sulf. Proteine menite s\ amelioreze calitatea lnii oilor.Plantele ornamentale modificate
genetic pe pia]\ `nc\ din 1996: o garoaf\ mov- MoondustTM- ob]inut\ prin introducerea genelor ce
codific\ pigmen]ii corespunz\tori `ntr-un soi cu flori albe, precum [i o garoaf\ care poate fi p\strat\
t\iat\, `n vaz\, timp relativ `ndelungat. De altfel pia]a este inundat\ de plante ornamentale cu culoarea
florilor modificat\.Un interes aparte prezint\ plantele modificate genetic pentru a fi folosite ca
instrumente de bioremediere, adic\ de decontaminare a terenurilor poluate natural sau contaminate
ca urmare a unor activit\]i ale omului. Iat\ numai cteva exemple de asemenea plante: plopul galben,
care posed\ dou\ gene bacteriene ce-i permit s\ converteasc\ mercurul ionic [i metilmercurul `n
mercur volatil; mu[tarul cu toleran]\ sporit\ la cadmiu; tutunul care posed\ enzime ce degradeaz\
hidrocarburile poluante; arborii care supraexprim\ nitratreductoza, eliminnd oxizii de azot ce se
acumuleaz\ `n marile aglomer\ri urbane.
Alte proiecte interesante pentru industrie:- plante transgenice de plop, eucalipt [.a. produc\toare de
biomas\ pentru ob]inerea etanolului;- plante transgenice cu lignina modificat\ pentru fabricarea
hrtiei;- plante de rapi]\ modificate pentru a produce un material plastic biodegradabil (polimerul
respectiv a fost exprimat [i `n lumenul fibrelor de bumbac).

9. A TREIA GENERATIE DE PLANTE TRANSGENICECea de a treia generatie include

plante modificate genetic in vederea producerii unor molecule utile pentru industrie, medicin sau
stiin
Produse primare
Anticorpi (imunoglobuline)
- Enzime (cosmetic, terapeutic, industrie,diagnostic)
- Proteine structurale (peptide, hormoni)
- Vaccinuri
- Medicamente
Produse secundare

Bioplastic
- Vitamine
- Metaboliti secundari (fenoli, taninuri, amidonuri, arome, alcaloizi)
- Fibre

Realizari
Salata care vaccineaz contra hepatitei B.
Cartoful care imunizeaz impotriva holerei.
Rapita care produce de doua ori mai multa vitamina E.

10. RISCURILE FOLOSIRII OMG PENTRU MEDIU

Ingineria genetica si produsele sale au aparut numai in ultimii 25-30 de ani. De aceea, este aproape
imposibil de evaluat impactul potential al speciilor trangenice asupra mediului. Totusi, pornind de la
observatiile efectuate in situatii similare cu specii naturale, oamenii de stiinta au sugerat urmatoarele
efecte:
1. Crearea de noi daunatori: o planta de cultura care a fost modificata prin inginerie genetica
pentru a fi toleranta fata de saruri ar putea scapa (evada) din lanul de cultura, ar putea invada estuarele,
sufocand vegetatia naturala a acestui habitat.
2. Amplificarea problemelor cu daunatorii deja existenti: plantele de cultura sunt capabile de a
transfera gene la distante de kilometri la specii inrudite, prin polenizarea mediata de vant sau insecte,
40

unele dintre aceste specii putand fi buruieni cunoscute. Astfel, genele straine de la plantele de cultura
cu caractere inginerizate, cum ar fi toleranta la erbicide sau uscaciune, ar putea fi transferate la
buruieni, facandu-le si mai greu de controlat.
3. Afectarea speciilor nevizate, non-tinta: virusurile, microorganismele sau plantele modificate
genetic pentru a omora insectele daunatoare ar putea afecta si insectele utile. In experimentele de
laborator, bacteriile modificate pentru a converti reziduurile vegetale cum ar fi frunzele in alcool, cu
scopul utilizarii acestuia ca si combustibil, au determinat reducerea populatiilor de ciuperci (fungi)
benefice. In unele cazuri, au fost omorate si ierburile din zone invecinate prin otravire cu alcool.
4. Reducerea biodiversitatii prin inlocuirea speciilor native: plantele de cultura MG care au un
avantaj de supravietuire ar putea evada din campurile de cultura, ar putea invada alte ecosisteme si ar
putea inlocui alte specii. Aceasta pierdere a biodiversitatii ar putea diminua sever abilitatea
ecosistemelor sau speciilor de a raspunde cu succes la stessuri neasteptate, cum ar fi uscaciunea sau
bolile.
11. RISCURILE ASUPRA SANATATII

Principalele griji referitoare la siguranta alimentelor care contin derivate OMG se concentreaza
asupra urmatoarelor aspecte:
1. Testele analitice existente si bazele de date continand substantele toxice naturale sau nutrientii
prezenti in alimentele conventionale nu sunt adecvate pentru a testa modificarile neintentionate ale
derivatelor OMG;
2. Ingineria genetica poate afecta in mare masura toxinele, alergenii sau nutrientii din alimente;
3. Alergiile asociate alimentelor pot fi exacerbate prin inginerie genetica;
4. Folosirea genelor marker care confera rezistenta la antibiotice in unele alimente OMG ridica
probleme de sanatate.

41

12. MARKERI MOLECULARI

12.1. Generaliti
Markerii moleculari (DNA markers) pun n eviden diferenele dintre secvenele de
nucleotide din ADN (acid dezoxiribonucleic) extras din indivizi diferii. Spre deosebire de markerii
morfologici, aceste diferene nu sunt neaprat vizibile n fenotip. O singur nucleotid diferit, dintr-o
gen sau chiar din ADN repetitiv, poate determina formarea sau dispariia unui marker molecular.
Prezint marele avantaj c sunt mult mai numeroi dect cei morfologici i nu perturbeaz fiziologia
organismului.
Utilizarea markerilor moleculari, prin analiza genomurilor, a determinat creterea
spectaculoas a eficienei activitilor de ameliorare att la plante ct i la animale, precum i
deschiderea unor multiple aplicaii practice ca: identificarea indivizilor, realizarea hrilor genetice
(care faciliteaz, n mod indirect, activitatea de selecie), clonarea unor gene importante, realizarea
unor studii de filogenie, stabilirea similaritii genetice dintre indivizi etc. Pentru procesul de
conservare a germoplasmei, determinarea gradului de nrudire dintre indivizi permite reducerea
accentuat a cheltuielilor cu pstrarea, evitndu-se dublurile.
Noiunea de amprent genetic (DNA fingerprinting) a fost introdus de cercettorul
britanic Alec Jeffreys n anul 1984, acesta fcnd aluzie la utilizarea tradiional a amprentelor ca
metod de identificare a indivizilor. Astfel, pe cnd amprentele clasice analizeaz aspecte fenotipice,
amprentele genetice analizeaz informaia genetic.
Utilizate corect, testele bazate pe analiza ADN pot evidenia cu mare precizie identitatea
unui individ. Tot ceea ce se cere pentru realizarea unei amprente genetice este o proba de esut din
care s se poat extrage o cantitate infim de ADN: fragmente din frunze tinere, cotiledoane, embrion,
semine, meristeme de cretere etc.
Pe baza amprentelor genetice pot fi obinute i informaii referitoare la similaritatea
genetic dintre diferite genotipuri.
Cunosintele referitoare la diversitatea germoplasmei folosit ca material iniial n
ameliorare au un impact semnificativ n mbuntirea activitii de ameliorare. Aceste informaii pot fi
utile n stabilirea celor mai bune combinaii hibride, n caracterizarea diferitelor linii, n activitatea de
protejare o unor varieti vegetale. Pe lng datele ce pot fi obinute prin studierea pedigree-ului, a
comportrii n combinaii hibride sau a caracteristicilor biometrice pot fi utilizai i markerii
moleculari pentru realizarea acestui scop. De altfel, analiza polimorfismelor ADN se dovedete a fi o
foarte puternic prghie pentru stabilirea similaritii genetice.
12.2. Metode bazate pe markeri genetici
Metode care se bazeaz pe markeri moleculari (marker systems) sunt: RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphisms), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified
Fragment Length Polymorphisms), metoda minisateliilor sau VNTR (Variable Number Tandem
Repeats), metoda microsateliilor sau SSR (Simple Sequence Repeats) etcVor fi prezentate succint
RFLP (ca metod de baz pn acum civa ani), RAPD, AFLP i SSR (ca metode care sunt folosite i
de ctre Laboratorul de Markeri moleculari ai USAMV Iai n determinarea similaritii genetice
dintre diferite cultivare).
12.2.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) a fost utilizat ncepnd cu
anii 70. Nu este o metoda bazat pe PCR (Polimerase Chain Reaction).
La momentul actual nu mai reprezint principala metod utilizat pentru stabilirea
similaritii genetice dintre diferite genotipuri. Prezint dezavantajul c necesit cantiti relativ mari
de ADN, are un cost relativ ridicat, se realizeaz n laboratoare de dimensiuni mari, cu echipament
specializat, i se preteaz n mic msur la automatizare.
Principiul metodei este urmtorul:
- enzimele de restricie fragmenteaz ADN. Fiecare enzim de restricie recunoate o
secven specific i caracteristic de nucleotide. O singur modificare a unei nucleotide poate crea sau
distruge un loc de restricie. Astfel, modificndu-se locurile de restricie, se modific i numrul i/sau
lungimea fragmentelor de ADN rezultate.

42

Genomul plantelor conine ntre 108 i 1010 nucleotide. n mod curent, se obin pn la un
milion de fragmente cu ajutorul enzimelor de restricie uzuale. n momentul actual exist mai mult de
300 de enzime de restricie.
Cteva din cele mai utilizate enzime de restricie, bacteriile n care au fost identificate i
locul de aciune a acestora sunt prezentate n tabel.
- Fragmentele rezultate n urma aciunii enzimei sunt supuse electroforezei ntr-un gel de
agaroz. Are loc astfel o migrare difereniat a acestor fragmente, n funcie de greutatea molecular
(numrul de nucleotide) a acestora.
-Dup separarea fragmentelor n gel, acestea sunt transferate pe o membran de nylon
(nitroceluloz) procedeu denumit Southern transfer.
-Pentru a putea marca o parte din fragmente se procedeaz la hibridizarea (Southern
hybridisation) acestora cu sonde de ADN marcate radioactiv. Acestea se vor ataa de fragmentele
complementare i permit vizualizarea lor (prin impresionarea unui film Roentgen). Se poate obine
astfel o amprent genetic a ADN luat n studiu sau este posibil identificarea unor markeri moleculari
ce pot fi corelai cu o anumit caracteristic a individului analizat.

43

Cteva din cele mai utilizate enzime de restricie, bacteriile n care au fost identificate i locul
de aciune a acestora (dup Ordon F. i Friedt W., 1998)
Enzima de restricie

Bacteria

BamHI

Bacillus ayloliquefaciens

BalI

Brevibacterium albidum

EcoRI
HaeIII
HindIII

Escherichia coli RY 13
Haemophilus aegyptius
Haemophilus influenzae

HpaI

Haemophilus parainfluenzae

PstI

Providencia stuartii 164

SalI

Streptomyces albus G

Secvena

5----3
3----5

GGATCC
CCGAGG
TGGCCA
ACCGGT
GAATTC
CTTAAG
GGCC
CCGG
AAGCTT
TTCGAA
GTTAAC
CAATTG
CTGCAG
GACGTC
GTCGAC
CAGCTG

12.2.2. Metode bazate pe utilizarea PCR

RAPD, AFLP i SSR sunt trei din principalele metode ce utilizeaz PCR, metode folosite
de noi n determinarea diversitii genetice a genotipurilor vegetale.
PCR Polymerase Chain Reaction, reprezint amplificarea exponenial a unui fragment
sau a unor fragmente de ADN utiliznd oligonucleotide, o polimeraz termostabil, cicluri repetate de
denaturare-renaturare a ADN i primeri pentru iniierea i extensia sintezei ADN. PCR permite
amplificarea unei secvene specifice de ADN de milioane (106-109) de ori n numai cteva ore.
Principiul
acestor
metode
este
prezentat
n
figura
urmatoare.

44

Aceast tehnic a fost inventat de Kary Mullis n 1983. Pentru aceast descoperire i-a fost
acordat premiul Nobel pentru Chimie, zece ani mai trziu.
Pentru realizarea unei PCR este nevoie de o cantitate redus de ADN int precum i de o
soluie tamponat care conine n mod obligatoriu urmtoarele elemente:
ADN polimeraz (de exemplu Taq, Pfu);
primeri (care delimiteaz secvena de ADN ce urmeaz a fi amplificat);
dNTPs=dATPs+dTTPs+dCTPs+dGTPs- cele patru deoxinucleotide;
cofactorul MgCl2.
Facultativ se mai adaug n acest amestec i BSA, DMSO sau formamida.
Toate acestea, ADN i soluia, sunt bine amestecate ntr-o minieprubet i apoi supuse
unor cicluri (de replicare). Un ciclu conine etapele:
unul pn la cteva minute la o temperatur de 94-96oC; n aceast etap
ADN se denatureaz, devenind din bicatenar - monocatenar;
unul pn la cteva minute la o temperatur de 50-65oC, cnd primerul
hibridizeaz sau se ataeaz prin legturi de hidrogen pe poriunile de ADN complementare;
unul pn la cteva minute la o temperatur de 72oC; polimeraza intr n
activitate i ncepe formarea catenei complementare, ncepnd cu primerii.
n 30 astfel de cicluri se obin aproximativ un miliard de segmente identice.
Realizarea unei astfel de reacii nu ar fi fost posibil far obinerea a dou elemente
eseniale.
- n primul rnd a fost necesar obinerea de ADN polimeraze termostabile care s nu fie
degradate sau inactivate la temperaturile ridicate necesare denaturrii ADN. Au fost identificate i
izolate din dou microorganisme ce triesc n izvoare fierbini i anume Thermus aquaticus-Taq
polimeraza i Pyrococcus furiosus Pfu polimeraza.
- n al doilea rnd a fost nevoie de conceperea i construirea aparatelor programabile care
s permit meninerea la diferite temperaturi, perioade de timp prestabilite a probelor supuse
amplificrii, aparate numite termociclere.
Consideraii generale asupra PCR:
-metoda este foarte sensibil la contaminare cu ADN strin; o cantitate ct de mic de
ADN provenit de la alt individ poate compromite rezultatul analizei genetice; pentru evitarea
contaminrilor accidentale se iau msuri speciale de lucru (utilizarea pipetelor exclusiv pentru aceaste
metode, folosirea de vrfuri de pipet speciale, minieprubete de unic folosin etc.);
-amplificarea nespecific poate constitui o problem; acesta este posibil datorit faptului
ca polimeraza poate fi activ i la temperaturi joase; evitarea acestui fenomen se face prin realizarea
amestecului de reacie ntr-un timp ct mai scurt i la temperaturi ct mai sczute posibil;
-amplificarea este posibil, foarte adesea, utiliznd primeri (degenerai) care au fost
fabricai pentru alte specii;
-lungimea maxim a segmentelor amplificate este de aproximativ 5000 baze pentru PCR
standard i maximum 35 kb pentru kit-urile Long PCR.
Proiectarea primerilor (primers design):
-au ntre 10 i 25 de baze lungime;
-este necesar s se cunoasc (n funcie de metod) ct mai multe informaii despre
segmentul ADN int;
-coninutul de baze pirimidinice (guanin i citozin) s fie de 40-60% din coninutul total;
-trebuie s aib aproximativ aceeai temperatur de denaturare ca a ADN vizat;
-este de preferat ca la captul 3 s fie guanin sau citozin;
-se evit secvenele repetitive ca i complementaritatea dintre primeri.
Diferite metode bazate pe tehnica PCR au fost dezvoltate i introduse cu succes n
determinarea amprentei genetice a genomurilor plantelor sau n diferite studii de diversitate genetic.

45

12.2.2.1 RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) a fost descoperit de Williams i
colaboratorii n anul 1990. Metoda este rapid, relativ ieftin i bine adaptat pentru obinerea unei
amprente genetice neradioactive. Utilizeaz un singur primer (cu un numr mic de nucleotide) ntr-o
reacie de amplificare. S-au semnalat unele probleme legate de reproductibilitatea metodei i existena
unor erori care pot aprea la aplicarea software-lor de evaluare a markerilor.
Principiul acestei metode este prezentat n figura urmatoare.

Un singur primer constituit din aproximativ zece nucleotide va identifica secvene

omoloage n ADN analizat i va determina amplificarea unor diferite regiuni ale genomului cu
lungimea de 200 pn la 2000 kb care se gsesc ntre dou copii complementare ale acestuia. Statistic,
ansa identificrii unei secvene omoloage este de aproximativ de 1/1000000 perechi de baze.
n timpul reaciei PCR vor fi generate un set de de fragmente de diferite mrimi i,
deoarece fragmentele sunt amplificate, va exista suficient ADN pentru a putea fi vizualizat prin
colorare cu etidium bromid. n general, pentru un genom de mrime medie, vor fi generate ntre 5 i 10
fragmente. Pot fi utilizai foarte muli primeri i sunt, practic, un numr nelimitat de RAPDs ntr-un
genom. Fragmentele amplificate de ADN sunt supuse electroforezei ntr-un gel de agaroz, ele
separndu-se n funcie de greutatea molecular. Principiul folosit este cel al vitezei diferite de migrare
a fragmentelor n gel, invers proporional cu greutatea lor molecular. Colorarea se face cu etidium
bromid, iar vizualizarea benzilor de ADN se face prin expunerea gelului ce conine ADN marcat la o
surs de radiaii ultraviolete (un dispozitiv cu un perete de sticl n care sunt lmpile ce emit radiaii
UV). Ca msuri de protecie a muncii se folosesc mnui ce un conin latex i se protejeaz ochii cu
ochelari ce nu permit trecerea radiaiilor UV. Se obin imagini (fotografii) care pot fi scanate sau se
folosesc echipamente ce permit preluarea imaginilor direct in format digital. Imaginile sunt prelucrate
ulterior cu ajutorul unui software specific.
Metoda este utilizat ndeosebi pentru identificarea diversitii genetice i studiilor de
filogenie.

46

12.2.2.2 AFLP
AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) se bazeaz pe utilizarea enzimelor de
restricie urmat de amplificarea fragmentelor rezultate i detectarea polimorfismelor lungimilor
acestor fragmente. Metoda a fost elaborat n compania privat olandez Keygene de Vos i
colaboratorii n anul 1995 (figura).

O enzim (de exemplu PstI) taie ADN n fragmente cu dimensiuni mari (rare cutter) iar o
alta (frequent cutter) va produce fragmente de dimensiuni mici (de exemplu MseI) cu o medie a
lungimii de 256 bp. Utilizarea numai a enzimelor ce genereaz fragmente scurte ar determina apariia
unui numr mult prea mare de fragmente pentru elecroforeza n gel. Ulterior, o secven de ADN
specific este legat la unul din capetele fragmentelor de ADN i o alta la captul cellalt. Aceste
secvene, mpreun cu locurile de restricie adiacente, servesc ca loc de ataare pentru primerii PCR.
Primerii sunt n aa fel sintetizai pentru a putea identifica secvenele adugate.
Vor fi amplificate numai acele fragmente care provin din secionarea ADN cu ambele
tipuri de enzime (rare i frequent cutter).
Sunt necesare mai multe etape de realizare (prezentate n amnunt n AFLP, Metoda de
lucru), dup care, n final, fragmentele de ADN astfel obinute sunt supuse electroforezei n aparate
complexe care vizualizeaz migraia acestora (n funcie de lungimea - greutatea molecular a
acestora) cu ajutorul unui sau mai multor fascicole laser. Imaginea obinut astfel poate fi salvat ca un
fiier (tipul acestuia este n funcie de software-ul utilizat) i prelucrat ulterior cu programe dedicate
acestui scop.
Metoda prezint numeroase avantaje fa de celelalte dou metode prezentate anterior fapt
pentru care devine din ce n ce mai utilizat. Reprezint, practic, o combinaie dintre metodele care
utilizeaz enzime de restricie (RFLP) i cele bazate pe PCR (RAPD). Dei, iniial, s-a numit AFLP
pentru a rima cu RFLP, s-a dovedit ulterior c metoda presupune mai ales detectarea prezenei sau
absenei fragmentelor de restricie i mai puin a diferenelor dintre lungimile lor.
Principalul avantaj al metodei este reprezentat de numrul mare de markeri ADN generai
rapid i ntr-o manier reproductibil.
De obicei, pot fi observate ntre 50 i 100 benzi pentru fiecare linie ceea ce permite
elaborarea unor hri genetice cu o densitate mare i ntr-un timp relativ scurt. De asemenea, la speciile
cu un genom mare i cu o rat redus a polimorfismelor cum ar fi orzul poate ajuta la realizarea
unei hri genetice mult mai complexe.
47

Faptul c permite identificarea mai multor puncte n care s-au produs mutaii a fost din
motivele pentru este preferata n defavoarea RFLP. Nu este lipsit de interes nici faptul c nu necesit
neaprat informaii anterioare privind structura ADN. La ora actual, metoda este utilizat pe scar
larg la identificarea markerilor genetici legai de diferite gene ce determin rezistena la ageni
fitopatogeni sau la stabilirea diversitii genetice dintre diferii indivizi sau cultivare.
Dintre dezavantaje menionm faptul c metoda este dificil de realizat tehnic, este destul de
greoaie i este costisitoare
12.2.2.3 SSR
SSR (Simple Sequence Repeat) sau microsateliii sunt secvente repetitive scurte de perechi
de nucleotide (1-5), prezente n genomul tuturor eucariotelor. Metoda permite identificarea de
diferene intre indivizi la nivelul unui singur locus, cu o deosebit precizie.
Principiul acestei metode este prezentat n figura urmatoare.

Markerii SSR se deosebesc de cei RAPD prin aceea ca la amplificarea ADN se utilizeaza
primeri specifici, la care se cunoate structura i banda care este amplificat. Aceti primeri se
marcheaz radioactiv (mai rar) sau fluorescent i este posibil s se fac amplificarea simultan cu mai
multi primeri (multiplex). De asemenea, programul de amplificare este diferit, temperatura de ataare
variind n funcie de structura fiecrui primer. Prin utilizarea echipamentelor moderne (secveniator
automat), metoda poate fi foarte uor de aplicat dar este costisitoare.

48

13. Biocombustibili
13.1 Clasificarea biocombustibililor
Prima generatie (din amidon, zahar sau seminte )
Biodiesel din rapita, soia, floarea soarelui , cocotier, ulei reciclat etc.
Etanol din seminte : porumb, grau, secara, orz, etc.
din organe vegetative: trestie, sfecla de zahar, sfecla, cartof etc.
A doua generatie (din lignina si celuloza: productie secundara, ierburi, specii lemnoase
etc.)
Carburanti biologici (Etanol prin hidroliza enzimatica)
Combustibili termochimici (ex. prin gazeificare)
GPL
Metanol, gazolina
Diferiti alcooli
Diesel verde

13.2. Prima generatie de biocombustibili

Utilizarea speciilor ce produc amidon sau zaharuri creaza limitari prin :
 Competitia pentru hrana
 Cultivarele actuale au fost optimizate pentru hrana si nu pentru obtinerea de biocombustibili
 Randamentul conversiei in biocombustibil este mic

Au o contributie modesta la cantitatea de energie generata actual si la reducerea gazelor
cu efect de sera (cu exceptia trestiei de zahar)

Pot fi amestecate cu carburantii actuali fara modificari majore ale infrastructurii

Experienta deosebita in domeniu ( Brazilia si SUA)

Cost relativ ridicat (exceptand etanolul produs in Brazilia) ca urmare a preturilor mari ale
materiilor prime


13.3. A doua generatie de biocombustibili

 Obtinuta din lignina si celuloza
 Biomasa este de regula necomestibila
 Un procent mai mare din masa plantei este convertit in energie
 Pot fi utilizate specii care sa fie ameliorate in aceasta directie
 Se obtin prin doua procedee principale :
 prin conversie biologica
 prin conversie termo-chimica
 Combustibilii obtinuti pot fi amestecati cu cei conventionali in majoritatea cazurilor
 Beneficii in domeniul energiei si al mediului mult superioare celor din prima generatie datorita
utilizarii unei cantitati mult mai mari de biomasa pe unitatea de suprafata

13.4. Specii ce pot constitui materie prima pentru obtinerea de biocarburanti

Porumb siloz
Topinambur
Iarba de Sudan
Miscanthus
Floarea soarelui
Sorg
Sfecla de zahar
Rapita, trestie de zahar, porumb boabe, grau secara, triticale etc
49

Rolul biotehnologiilor
Biotehnologia nu este o sursa de energie dar poate
furniza procedee pentru obtinerea acesteia
Permit ameliorarea speciilor
in ideea de a optimiza
obtinerea de biocarburanti
(cresterea productivitatii,
a calitatii, a rezistentei
la stresuri )

Pot fi utilizate pentru

a facilita conversia biomasei
in biocombustibili

Probleme legate
de biodiversitate

Acceptate de consumatori

Bibliografie selectiva:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Badea Elena Marcela, 2003 Plantele transgenice n cultur, Bucureti.

Banu C. i colab., 2000 Biotehnologii n industria alimentar. Ed. Tehnic, Bucureti.
Beceanu B., 1994 Tehnologia produselor horticole, vol I. Centrul de multiplicare U:S.A.M.V., Iai.
Bourgeois C.M., Larpent J.P., 1989 Microbiologie alimentaire, vol. I-II. Edit. Lavoisier, Paris.
Danson M. J., Hough D. W., 1998 Les enzymes de l` extreme. Biofutur.
Fellet P., 1998 Aliments et industries alimentaires. Versailles, INRA Editions.
Simioniuc DP, 2009 Biotehnologii, Ed. Ion Ionescu de la Brad Iasi
50