CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metod de analiz care se bazeaz pe

separarea n zone spaiale distinct a componenilor unui amestec la trecerea
acestuia printr-un mediu n care componenii se deplaseaz cu viteze diferite.
Termenul de cromatografie provine de la cuvntul grecesc chroma care
nseamn culoare.

n cromatografie se disting dou faze: faza staionar (faza fix)

i faza mobil (eluentul). Faza staionar este reprezentat de materialul prin
care circul proba i care asigur separarea componenilor din amestec iar
faza mobil este fluidul (lichid sau gazos) care transport proba la suprafaa
fazei staionare.

Clasificarea metodelor cromatografice

Dup mecanismul de separare, metodele cromatografice pot fi

mprite astfel: cromatografie de adsorbie, cromatografie de partiie,
cromatografie de schimb ionic, cromatografie de excludere molecular i
cromatografie de afinitate. Dac se ine seama de starea de agregare a celor
dou faze, metodele cromatografiece sunt clasificate n: metode
cromatografice de tip solid-lichid, lichid-lichid, lichid-gaz.

Cromatografia de adsorbie se bazeaz pe adsorbia difereniat

a componenilor unui amestec pe un suport adsorbant i deplasarea acestora,
sub aciunea fazei mobile, cu viteze invers proporionale cu tria forelor de
adsorbie. ntre suportul adsorbant i substanele care se deplaseaz peste
faza staionar se stabilesc interacii intermoleculare de tipul: dipol-dipol,
van der Waals, legturi de hydrogen care conduc la o adsorbie fizic,
reversibil. n cazul n care s-ar forma legturi chimice, procesul s-ar numi
chemoasorbie; deoarece chemoasorbia este un process ireversibil nu
prezint interes pentru cromatografie.

Cromatografia de partiie are ca punct de referin coeficienii

de repartiie diferii ai componenilor unui amestec ntre dou faze
nemiscibile sau parial miscibile: apa sau alt solvent polar (faza staionar)
sau un solvent organic (faza mobil)

Coeficienii de repartiie sunt dependeni de structura chimic i

de solubilitatea substanelor n cele dou faze, substanele de analizat
dizolvndu-se preferenial n faza staionar i faza mobil. Componentul cu
solubilitate mai mare n faza mobil va avea o vitez de deplasare
superioar, comparative cu componentul cu solubilitate mai mare n faza
staionar care se va deplasa cu o vitez sczut.

Cromatografia de schimb ionic utilizeaz ca faz staionar

schimbtorii de ioni. Schimbtorii de ioni sunt substane de natur organic
sau anorganic care au proprietatea de a schimba un ion propriu cu un alt ion
din mediul lichid cu care se afl n contact.

Cromatografia de excludere molecular numit i gel filtrare,

utilizeaz ca faz staionar anumite substane cu structur tridimensional
(dextran, poliacrilamid) care prezint proprietatea ca n contact cu apa sau
cu soluii saline s se imbibe rapid, formnd geluri de diferite poroziti.
 Aceast metod permite separarea componenilor unui amestec
lichid pe baza diferenelor de mrime molecular. Sub aciunea fazei mobile
( eluentul) moleculele cu dimensiuni mari vor fi excluse de structura gelului
i se vor deplasa o dat cu eluentul; moleculele cu dimensiuni mici vor
penetra gelul ptrunznd n lichidul din interiorul porilor avnd o vitez de
deplasare prin coloan invers proporional cu dimensiunea pe care o
prezint.

Cromatografia de afinitate reperzint o tehnic de separare

aproteinelor, acizilor nucleic, hormonilor, celulelor, pe baza proprietilor lor
de legare specific, prin fore necovalente, de moleculele complementare
numite ligand. n cadrul acestei metode cromatografice faza staionar este
constituit de o matrice polimeric poroas (dextran, agaroz,
poliacrilamid) de care se leag covalent ligandul.

Ligandul are proprietatea de recunoate i lega reversibil i

selectiv, dintr-un amestec multicomponent, numai componentul care prezint
o structur complementar cu a sa.

Cromatografia de gaze este foarte utilizat deoarece poate fi

aplicat oricrui amestec de componente lichide cu temperature joase de
fierbere.

CROMATOGRAFIA N STRAT SUBIRE A FOSFOLIPIDELOR

Cromatografia n strat subire (CSS) este o tehnic

cromatografic de importan major, simpl i expeditiv, utilizat n
analiza calitativ.
 Stratificarea adsorbantului const n depunerea unui strat de
adsorbant (silicagel, oxid de aluminiu etc.) de aproximativ 250 grosime pe
o plac inert de sticl, aluminiu sau pe filme rigide de plastic de dimensiuni
variabile.

Pentru prepararea stratului adsorbant se realizeaz o suspensie

apoas format din adsorbant care se depune uniform pe placa
cromatografic.

Dup evaporarea apei, pe plac rmne un strat subire de

suport. Deoarece centrii de adsorbie au capacitatea de a reine puternic
moleculele de ap este necesar ca dup uscare s se efectueze activarea
suportului prin nclzire la o anumit temperatur. Procesul de activare
(ndeprtarea apei) trebuie reglat i controlat deoarece temperature i timpul
de uscare nainte de utilizare determin numrul de poziii active, tipul
cromatografiei (de adsorbie sau de partiie) i n concluzie eficacitatea
separrii.

O temperatur de uscare prea nalt i un timp de uscare prea

ndelungat pot genera transformri chimice, care vor determina modificarea
proprietilor adsorbante.

Aplicarea probelor se efectueaz n spoturi discrete cu ajutorul

capilarelor sau a micropipetelor n volume cuprinse ntre 1 i 100L.

Pentru o separare cu un grad nalt de rezoluie este necesar ca

spoturile aplicate s fie ct mai mici i mai bine definite. Pentru aceasta,
proba este dizolvat ntr-un solvent volatile. Dac probele sunt foarte diluate
aplicarea probei este repetat, pn la depunerea cantitii dorite, aplicarea
fiind efectuat cu mult grij astfel nct s se obin un spot mic i bine
definit.

Developarea (irigarea) se efectueaz dup aplicarea i uscarea

spoturilor; placa cromatografic este introdus ntr-o camer de developare
(tank cromatografic), sub un unghi de aproximativ 45, care conine un strat
de 0,5-1,0 cm de solvent n care se imerseaz un capt al plcii, efectundu-
se o irigare de tip ascendant.

Pentru realizarea unei separri corespunztoare atmosfera din

camera de developare trebuie s fie saturat cu faza mobil. Pentru a asigura
condiiile de saturaie, interiorul camerelor se tapeteaz cu hrtie de filtru
umectat n solventul de developare. Pentru ca developarea s fie
reproductibil este necesar meninerea acelorai valori de temperatur,
concentraie i timp de nclzire i developare, grosimea adsorbantului,
ntruct orice modificare a gradului de saturaie va influena gradul de
adsorbie.

Vizualizarea (revelarea) fraciilor separate se poate efectua prin

pulverizarea cromatogramei cu un reactive de culoare sau prin iluminarea
cromatogramei cu o lamp cu lumin ultraviolet.

Evaluarea calitativ (identificarea spoturilor) se efectueaz prin

compararea vitezei de migrare a spoturilor corespunztoare fraciunilor
separate cu cele corespunztoare culorii spoturilor.

Cea mai frecvent metod de identificarea const n compararea

valorilor Rf ale spoturilor corespunztoare fraciunilor separate cu valorile Rf
ale standardelor. Valoarea Rf este o mrime care reflect deplasarea
compusului urmrit comparativ cu cea a solventului ( faza mobil).
 Rf Distana de la punctul de start pn n centrul spotului

Distana parcurs de solvent din punctul de start

CROMATOGRAFIA PE HRTIE

Cromatografia pe hrtie utilizeaz ca support pentru separarea

componenilor unui amestec o hrtie de filtru special, fabricat din puf de
bumbac care conine 2000- 3600 de resturi de -glucoz, cu un numr mare
de legturi de hidrogen ntre catenele poliglucidice.

Mecanismul separrii componenilor se bazeaz pe coeficienii

de repartiie diferii ai acestora ntre dou faze nemiscibile sau parial
miscibile: faza staionar reprezentat de lichidul polar care mbib hrtia de
filtru i faza mobil reprezentat de solventul organic care se deplaseaz de-
a lungul porilor hrtiei de filtru.

Componenii cu solubilitate mai mare n faza staionar se vor

deplasa cu vitez sczut, n timp ce componenii cu solubilitate mai mare n
solventul organic vor prezenta o vitez de migrare mai mare.

n funcie de direcia de deplasare a solventului i

componenilor pe hrtia de filtru se disting urmtoarele tipuri de
cromatografie pe hrtie:

Cromatografia ascendent- deplasarea se face de jos n sus;

Cromatografia descendent- deplasarea se efectueaz de sus n

jos;
 Cromatografia circular- deplasarea se efectueaz din centrul
hrtiei spre exterior (radial).

Tipuri de cromatografie pe hrtie

cromatografie cromatografie
cromatografie

ascendent descendent circular