OBINEREA I FUZIUNEA PROTOPLATILOR

Definiie:
Protoplatii sunt structuri celulare vegetale, sferice, izolate prin eliminarea enzimatic a
peretelui celular pectocelulozic. n alctuirea unui protoplast se regsesc: plasmalema,
citoplasma, nucleul, vacuola i organitele citoplasmatice cloroplaste i mitocondrii.

Proprieti ale protoplatilor:

- i pstreaz potenialul de regenerare a peretelui celular
- i pstreaz capacitatea de cretere i diviziune
- pot fi izolai dintr-o gam larg de esuturi i organe vegetale tinere
- pot fuziona
Obinerea protoplatilor
Principiul metodei const n disocierea celulelor i degradarea peretelui celular,
concomitent cu deshidratarea parial a citoplasmei, protoplatii fiind recuperai prin centrifugare
i splare.
Peretele celular la plante este alctuit dintr-o membran plasmatic (plasmalema) i o
membran scheletic, ultima fiind alctuit din celuloz i pectin. La celulele izolate, peretele
celular reprezint o barier n circulaia substanelor, astfel c acesta trebuie degradat, lucru
posibil pe cale mecanic (centrifugare) sau pe cale enzimatic (soluii cu pectinaze i
celulaze).

Etapele unei culturi de protoplati:

1.Stabilirea surselor de material biologic, eventual sterilizarea lor
2. Pregtirea materialului biologic pentru izolarea protoplatilor
3. Izolarea protoplatilor
4. Cultura de protoplati
1. Stabilirea surselor de material biologic. Materialul biologic vegetal folosit pentru
izolarea protoplatilor poate fi reprezentat de: frunze tinere, apexuri, rdcini, fructe, coleoptile,
nodurile rdcinilor, esuturi embrionare meristematice, cotiledoane, embrioni, microspori,
petale de flori, suspensii celulare embriogene.
Cele mai utilizate sunt: mezofilul foliar, culturile de calus sau de celule in vitro i
suspensiile celulare.
2. Pregtirea materialului biologic. Cu excepia suspensiilor celulare, materialul
biologic se sterilizeaz, se spal i se scarific cu scalpelul, apoi se introduce ntr-o soluie
hipertonic (ex. metanol) pentru realizarea plasmolizei (pierderea apei pe principiul osmozei
duce la ndeprtarea plasmalemei de peretele celular). Celulele plasmolizate capt aspect sferic,
pereii celulari pectocelulozici rmnnd intaci (Fig.1.,2.).

Fig.1. Celule de Elodea n timpul plasmolizei (Armstrong W.P., 2001)

1
 Fig.2. Celule de Elodea nainte i dup plasmoliza n soluie de NaCl 10%
(Armstrong W.P., 2001)
A. Peretele celular pectocelulozic
B. Protoplast (coninut celular deshidratat parial, concentrat n centrul celulei)
C. Spaiul dintre protoplast i peretele celular
3. Izolarea protoplatilor se realizeaz cu ajutorul unor soluii enzimatice, la ntuneric
i la cca. 25oC, care distrug pereii celulari (pectinaza determin disocierea celulelor i celulaza
determin degradarea peretelui celular). La speciile la care nu se pot izola protoplati din
mezofilul foliar, se folosesc suspensii celulare embriogene rezultate prin cultivarea in vitro a
meristemelor apicale, cu sau fr celule doic (celule din aceeai specie sau alte specii,
introduse n mediul de cultur, care favorizeaz reconstituirea pereilor celulari). Soluiile cu
protoplati se decanteaz i se filtreaz.
4. Cultura de protoplati se realizeaz pe mediu lichid sau solid (Fig.3.), cnd se divid,
rezultnd un microcalus din care se pot diferenia structuri embrionare globulare, respectiv
embrioni somatici (Fig.4., 5.). Prin transferarea embrionilor pe mediu agarizat, se pot dezvolta
plante identice cu plantele iniiale. Prin aclimatizarea acestora i transferul n cmp, rezult
culturi asemntoare celor obinute prin metodele tradiionale de nmulire.

Fuziunea protoplatilor
Procesul de fuziune a protoplatilor const n parcurgerea a 2 faze:
A. Contactul membranar n cmp de curent electric alternativ
B. Fuziunea n cmp de curent electric continuu (electrofuziune)
n mediul cu protoplati se introduc electrozi sterilizai n prealabil, la bornele crora se
aplic o tensiune alternativ de mare frecven pentru alinierea protoplatilor, apoi ocuri
electrice de curent continuu, pentru realizarea fuziunii acestora (Fig. 4.B.). Pot rezulta fuziuni
binare (cte 2) sau multifiziuni (mai mult de 2 protoplati fuzionai), ntreg procesul fiind urmrit
la microscopul optic.
Dup ce rmn cteva ore pe mediul de cultur, protoplatii fuzionai se separ i se trec
pe medii de cultur n vase Petri.
Deoarece pot avea loc diferite tipuri de fuziuni (binare sau multifuziuni) ntre protoplati
aparinnd unei singure sau mai multor forme de material biologic vegetal (specii, genuri sau
familii diferite), prin combinarea genomurilor din nuclee, precum i prin combinarea
cloroplastelor i mitocondriilor, pot rezulta:
- protoplati de acelai tip, rezultatul fiind creterea gradului de ploidie a celulelor;
- protoplati diferii (heteroprotoplati), ce includ ntr-o msur mai mare sau mai mic
genomurile parentale de provenine nuclear, mitocondrial i cloroplastic,
2
 rezultatul constnd n obinerea de recombinri noi ale caracterelor condiionate
nuclear sau citoplasmatic (CIBRIZI).

Fig.3. Diferite tehnici de cultur a protoplatilor (Matsumoto i Oka, 1998, citat de

Haicour R, Assani A., Matsumoto K, Guedira A., Banana improvement, FAO
Corporate Document Repository, www.fao.org/docrep/007)

3
 A. B.
Fig.4.A.Protoplati la bananier (Musa sp.) B. sub aciunea curentului electric alternativ

A. B
Fig.5. Embrioni somatici (A. globulari, B. torpila) din culturi de protoplati la bananier

Utilizarea protoplatilor:
- regenerarea de plante sau organogeneza din calusuri originare din protoplati la numeroase
specii cultivate;
- obinerea de organisme cu grad de ploidie mrit (autopoliploizi, alopoliploizi, amfiploizi);
- obinerea de hibrizi somatici (CIBRIZI) ntre specii la care hibridarea clasic nu poate avea loc
(Fig. 6.) datorit fie sterilitii formelor parentale (ex. cartof), fie gradului de nrudire mai
ndeprtat ntre genitori (genuri sau familii diferite);
- mbuntirea unor caractere (vigoarea) i nsuiri ale pl. (rezistena la agenii patogeni,
precocitatea, calitatea i aspectul recoltei);
- obinerea de organisme cu noi recombinri ale caracterelor(condiionate de informaia genetic
din nucleu, cloroplaste i mitocondrii);
- posibilitatea aplicrii altor metode ale biotehnologiilor vegetale asupra culturilor de protoplati
(ex. obinerea organismelor modificate genetic OMG).

4
 Genitor
A B
Genitor
somatic
somatic
EXPLANT
Fragmente de
CALUS
frunz\
MEDIU DE SELECTIE
Izolare Izolare
Selec]ii de linii Tratament Tratament
protoplasti protopla[ti
celulare mutante enzimatic enzimatic
(MARKERI)

SUSPENSIE P.E.G.
Agregare

Fuziune

HOMOCARIONI HETEROCARIONI Protopla[ti

nefuziona]i
PLATING

COLONII CELULARE

MEDII DE SELECTIE
Selectia clonilor pe baza
MARKERILOR

MEDII DE
REGENERARE
Regenerarea
Identificarea [i selec]ia hibrizilor somatici

Fig. 6. Schema hibridarii somatice prin fuziunea

protoplastilor (Creu A, Simioniuc D., 2003)