UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR

CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE AGRICULTUR
Sisteme de procesare i controlul calitii produselor alimentare
nvmnt la distan

DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC A
CLOROFILEI A I B DIN FRUNZA
DE SPINACIA OLERACEA(Spanac)

Masterand : Pop Laura - Andreea

Cluj-Napoca
2011
 C UPRINS

1. CLASA DE COMPUI.........................................................................................3
1.1. Definiie......................................................................................................3
1.2. Rolul clorofilei...........................................................................................3
1.3. Structuta chimic........................................................................................3
1.4. Proprietiel pigmenilor asimilatori......................................................... 4
2. SPANACUL SPINACIA OLERACEA............................................................ 5
2.1. Caracteristici generale................................................................................5
2.2. Tipuri de spanac..........................................................................................6
2.3. Componentele spanacului...........................................................................6
2.4. Rezistena spanacului.................................................................................7
3. METODE DE ANALIZ......................................................................................7
3.1. Metoda spectrofotometric.........................................................................7
3.2. Metoda cromatografic...............................................................................9
4. METODA SPECTROFOTOMETRIC.............................................................10
5. MATERIALELE NECESARE I APARATURA UTILIZAT..........................11
6. METODA DCE LUCRU.....................................................................................11
7. INTERPRETAREA REZULTATELOR............................................................ 12
8. BIBLIOGRAFIE............................................................................................... 13

2
 DETERMINAREA SPECTROFOTOMETRIC A
CLOROFILEI A I B

1. CLASA DE COMPUI

1.1 Definiie

Clorofila (n limba greac cloros nsemnnd verde) este un pigment de culoare verde, esenial n
procesul de fotosintez, prin intermediul acesteia avnd loc transformarea energiei luminoase n
energie.
Clorofila este una dintre substanele fundamentale din natur, care prin prezena sa n celulele
plantelor i algelor, la nivelul cloroplastelor, asigur baza energetic i respiratorie aproape tuturor
celorlalte organisme de pe Terra. Graie clorofilei, plantele verzi sunt organisme autotrofe, iar
fotosinteza este cel mai important proces biochimic de pe Pmnt.

1.2 Rolul clorofilei

n frunze clorofila se gsete legat de o protein, plastina cu care formeaz o cromoproteid,

denumit cloropastin, cu o mare stabilitate comparativ cu clorofila pur. Clorofila se afl n
membrana tilacoidelor din cloroplaste unde se pare c formeaz fotosisteme (denumite fotosistemul
I i II, respectiv P680 i P700 dup lungimea de und absorbit) mpreun cu pigmenii. n cadrul
acestor fotosisteme clorofila se pare c ndeplinete 2 funcii:
Absorbia luminii
Transferul energiei ctre cuplul clorofilei din centrul reactiv al fotosistemului. Lumina
absorbit de ctre clorofil determin eliminarea unui electron cu un potenial energetic
foarte mare, electron care n final va reveni la clorofil dar cu un potenial energetic mult
mai mic. In cadrul acestei reacii clorofila joac rol de catalizator, molecula de clorofil
oxidat, revenind din nou la forma iniial prin (re)captarea unui electron.
1.3 Structura chimic

Are la baz inelul porfirinic, acelasi care st i la baza hemului, ns ca ion central este magneziul.

3
 Pigmenii care se gsesc n cloroplaste difer n ceea ce privete compoziia chimic. n
plantele verzi exist: clorofila, n agele roii: ficoeritrina, n algele albastre: ficocianina i n unele
bacterii: bacterioclorofila. Clorofila este alcatuit din 4 nuclee pirolice care formeaz nucleul
porfirinic, care are la centru un atom de magneziu. De nucleul porfirinic se leag fitolul, care este
alcoolul unei hidrocarburi superioare. Dintre clorofile cele mai rspndite sunt clorofila a i
clorofila b.

Clorofila a are o grupare metilic, n timp ce clorofila b are o grupare aldehidic. Raportul
dintre clorofila a i b este 3/1 i poate crete n cazul plantelor heliofile, iubitoare de lumin.
Pigmenii carotenoizi sunt reprezentai de carotin i xantofil. Carotina este alcatuit dintr-un lan
de carboni cu legaturi dublu conjugate, care are la capete cate un ciclu iononic. Carotenii pot
absorbi radiaiile luminoase din zona albastr a spectrului
(400-600nm) i energia absorbit o pot transfera pigmenilor
clorofilieni. n acelai timp au i rol de fotoprotecie, n
absena carotenilor plantele sufer leziuni determinate de
procesul de fotooxidare.

Se observ cele 4 cicluri pirolice, legate ntre ele prin puni

metilenice:

Magneziul leag coordinativ 2 atomi de N datorit

electronilor neparticipani.

1.4 Proprietile pigmentilor asimilatori

Proprietile pigmenilor asimilatori sunt urmtoarele:

Absorb energia luminoas, care este utilizat n faza de lumina a fotosintezei;
4
 Sunt solubili n solveni organici;
Culoarea: - clorofila a verde albstrui;
- clorofila b verde glbui;
- carotina portocaliu;
- xantofila - galben;
Flurescena clorofilei;
Fotooxidarea;
Saponificarea.

Reacia cu acizii minerali-magneziul este nlocuit cu hidrogenul rezultnd feofitina.

2 SPANACUL SPINACIA OLERACEA

2.1 Caracteristici generale

Spanacul (Spinacia oleracea) este o plant legumicol anual, erbacee, care formeaz un sistem
radicular puternic i o rozet de frunze mari, de lungime de la 2 pn la 30 cm i cu limea
cuprins ntre 1 i 15 cm., crnoase, netede sau ondulate, de culoare verde, care reprezint partea
comestibil. Tulpina florifer este nalt de 60-80 cm, goal n interior i ramificat, cu flori
unisexuat dioice, cu polenizare alogam i entomofil. Plantele masculine sunt mai puin viguroase,
formeaz frunze puine i nfloresc mai devreme, iar florile, cu diametrul 3-4 mm, de culoare galben
verzui, sunt grupate n inflorescente. Plantele femeieti sunt viguroase, formeaz frunze mari,
crnoase, n numr mai mare, iar florile se gsesc la subsuoara frunzelor, grupate mai multe la un
loc. Fructul la spanac este rotund sau coluros, de culoare cenuiu-verzuie i i pstreaz facultatea
germinativ timp de 4-5 ani.

5
 2.2 Tipuri de spanac

,,Matador" - soi semitimpuriu (40-50 de zile), cu rozeta de frunze compact i semierect,

frunza este neted de culoare verde-nchis.
,,Matares" - soi semitimpuriu (40-50 de zile, cu frunze de culoare verde-nchis, cu suprafaa
neted sau puin gofrat, rotunjite la vrf, i rozeta semierect.
,,Smarald" - soi trziu (50-55 de zile), foarte precoce, cu frunze de culoare verde-nchis,
lanceolate i rozeta semierect.

2.3 Componentele spanacului

Componentele spanacului considerate la 100 de grame spanac proaspt sunt:

Component Cantitate

Calorii (coninut energetic) 20 kcal/85kJ

Ap 92,7%
Albumin 2,5 g

Hidrai de carbon 1,6 g

Grsimi 0,4 g

Acid oxalic 0,8 g

Carotinoid 0,7 mg

Vitamina B1 0,1 mg

Vitamina B2 0,2 mg

Acid nicotinic (Vitamina B3) 0,6 mg

Vitamina B6 0,2 mg

Vitamina C 40-150 mg

Vitamina E 2,5 mg

Fier 3-4 mg

6
Potasiu 0,45 g

Calciu 130 mg

Cupru 0,1 mg

Magneziu 23 mg

Sodiu 65 mg

Fosfor 45 mg

Zinc 0,22 g

2.4 Rezistena spanacului

Spanacul este rezistent la temperaturi sczute, astfel c se cultiv toamna i se recolteaz

primvara. Seminele germineaz la 3 - 4C i pot rmne n sol peste iarn fr s-i piard
viabilitatea. n faza de rozet, poate rezista la temperaturi de -10C, dac solul este acoperit cu
zpad. Pentru cretere, are nevoie de 14 - 15C, iar temperatura prea ridicat determin emiterea
tijei florale.

Nu este pretenios fa de lumin, iar calitatea frunzelor este mai bun la intensiti moderate
ale luminii. n sol are nevoie de ap n cantitate optim, pe toat perioada de vegetaie, din pricina
ritmului intens de cretere i a frunziului bogat, care pierde prin transpiraie cantiti destul de
mari. n lipsa apei, rozetele de frunze sunt mici i mbtrnesc repede. Spanacul se cultiva pe soluri
bine pregtite, mijlocii sau uoare, fertile, bogate n humus, drenate, cu mare capacitate de reinere a
apei i bine expuse la soare.

3 METODE DE ANALIZ

3.1 Metoda spectrofotometric

Primele metode spectrofotometrice de determinare a clorofilei au fost determinate n urm cu 40

de ani de ctre cei ca Strickland & Parsons (1968) i Lorenzen (1967), metode care sunt folosite
i n ziua de azi.

7
 Spectrofotometria msoar instrumental lumina transmis de o soluie colorat lucrnd cu o
surs de lumin monocromatic. Lumina incident este filtrat prin filtre optice, avnd un spectru
mai ngust (utiliznd monocromatoare). Astfel este posibil fixarea mai precis a lungimii de und
la care se lucreaz. Utiliznd aceast metod se poate trasa un spectru de absorbie, adic o curb,
obinut prin msurarea semnalului n funcie de lungimea de und a radiaiei incidente.
Schematic, prile componente ale unui spectrofotometru de absorbie este redat n figura de mai
jos.

n literatura de specialitate uneori se folosete pentru metoda spectrofotometric i denumirea de

metod colorimetric (sau chiar spectrocolorimetric), ceea ce uneori poate crea confuzii. n
domeniul UV, ochiul omenesc nepercepnd lumina, se utilizeaz doar spectrofotometria.
Spectrofotometrul este un aparat spectral conceput pentru a msura extincia sau transmisia
radiaiilor optice de diferite lungimi de und prin diverse probe.
La modul cel mai general, un spectrofotometru este alctuit dintr-o sursa de radiaii, o fant de
intrare reglabil care modific fluxul de lumin care vine de la surs, un element dispersiv (prisma
sau reea dar mai des se foloete o reea), mai multe oglinzi care asigur direcionarea fasciculului
de lumin, departament probelor i elementul de masur (un fotodetector i un amplificator).
Adaugnd diverse accesorii, spectrometrele pot efectua i alte tipuri de msuratori cum ar fi cele
de reflexie difuza, de fluorescenta etc. Alte accesorii permit automatizarea diferitelor operatii cum
ar fi baleierea repetitiva, schimbarea automata a probelor, citirea extinctiilor cu un computer etc.

3.2 Metoda cromatografic

8
 Analiza chimic cromatografic este un domeniu mai recent al analizei instrumentale care
include mai multe metode de separare i totodat de analiz a componenilor amestecului din prob.
n toate variantele, separarea precede analiza i se realizeaz prin repetarea, de un numr mare
de ori, a echilibrului de distribuie ntre dou faze.
Una dintre faze este imobil i poart denumirea de faz staionar (aflat de regul ntr-un tub
numit coloan) iar cealalt - faza mobil - aflat n micare, se deplaseaz prin golurile primei faze.
Separarea se petrece n coloana cromatografic, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobil,
denumit i eluent - scurgndu-se continuu (deci cu vitez constant) prin interstiiile fazei
staionare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componeni ai
amestecului de separat de-a lungul coloanei.
Amestecul supus separrii se introduce sub form de soluie la nceputul coloanei, folosindu-se
un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microsering), i se afl iniial fixat ntr-o zon
ngust de la nceputul coloanei. Splai de eluent, o parte din componenii probei migreaz apoi
prin coloan cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaz interaciunilor fizice specifice, dintre
moleculele probei i faza staionar (desigur, nu orice molecul poate migra pe orice faz
staionar).
Efectul, este numit retenie i aceasta provoac o aa-numit migrare difereniat. Adic
moleculele migreaz n grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelai fel. Aceasta face
posibil sesizarea componenilor, pe rnd, la prsirea coloanei, de ctre un instrument, n grupurile
respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la
mai muli (n mod ideal la oricare) dintre componeni ce ies din coloan i care este plasat n eluent,
imediat dup ieirea din coloan. Acest analizor, denumit detector este capabil s dea un semnal
proporional cu masa sau cu concentraia soluiei de component n faza mobil.
n consecin, dispozitivul, "marcheaz" trecerea fiecreia din substanele ce formeaz iniial
proba, similar cu o fotocelul care nregistreaz trecerea concurenilor la sosire n atletism.
Reprezentarea grafic a semnalului detectorului n funcie de timp poart numele de cromatogram.
S-au imaginat i realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele
n primul rnd prin natura fazei mobile, dar i a celei staionare. Astfel se distinge cromatografia de
lichide (LC) cnd faza mobil este un lichid, cromatografia de gaze (GC) cnd aceasta este un gaz
sau cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobil este un lichid aflat peste temperatura
critic.
n cadrul LC se disting, n funcie de mecanismele de separare:
Cromatografia de adsorbie;
Cromatografia ionic (de schimb ionic;

9
 Cromatografia de excluziune steric;
Cromatografia lichid-lichid (LLC);
Cromatografia pe coloan deschis sau cromatografia planar (PC);
Cromatogafia pe hrtie;
Cromatografia pe strat subire (TLC);
Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC),

Cromatografia pe strat subire de nalt performan (HPTLC) n faza staionar are granulaie
extrem de fin ridicndu-se astfel eficiena separrilor dar i viteza acestora.
Toate acestea se caracterizeaz prin simplitate, accesibilitate i pre de cost cobort, dar totodat
prin performane ceva mai slabe dect cromatografia de lichide pe coloan sub presiune ridicat
(HPLC) varianta modern a LC.

4 METODA ALEAS - SPECTROFOTOMETRIC

Pigmenii asimilatori au capacitatea de a absorbi selectiv radiaiile spectrului solar.

Spectrofotometria este o metod prin care este msurat cantitatea de lumin pe care o prob o
absoarbe la o anumit lungime de und. Cea mai util msur a absorbiei luminii este absorbana
(A). Absorbana este msurat de un instrument denumit spectrofotometru. Instrumentul este format
dintr-o surs de lumin, un dispozitiv de selecie a lungimii de und (o prism), o camer a probei,
un detector de lumin, un nregistrator.
Graficul absorbanei fa de lungimea de und este denumit spectru de absorbie. Pentru
determinarea spectrului de absorbie al fiecrui pigment n parte se utilizeaz un extract de pigmeni
n alcool etilic. Valorile absorbanei sunt citite pentru lungimile de und cuprinse ntre 400 nm i
700 nm.
Analiza chimic cantitativ n spectrofotometria de absorbie se bazeaz pe legea Lambert-Beer.
Se utilizeaz o curb de calibrare (etalonare): A = f(C), trasat pentru probe de concentraii
cunoscute, n aceleai condiii cu cele de analizat, evident lucrndu-se cu aceeai celul i la o
lungime de und ct mai riguros monocromatic. Se alege un domeniu de concentraii, pe care se
pregtesc 5-8 probe cunoscute i, dup trasarea dependenei, grafic sau analitic, se poate trece la
analiza cantitativ.
Domeniul pe care curba de etalonare este perfect liniar nu este foarte larg (de cel mult o decad
de concentraii). De aceea metoda nu poate funciona dect strict pe domeniul pentru care a fost

10
trasat i, cel mai corect, pe poriunea de la jumtatea dreptei. Se fac mai multe citiri. Cu ct
eroarea la determinarea absorbanei este mai mic cu att eroarea de determinare a concentraiei va
fi mai cobort.
Panta curbei este decisiv n mrimea erorii. Dac aceasta este foarte mic, eroarea la
determinarea concentraiei va crete. De aceea, soluiile foarte colorate duc automat la erori,
datorit aplatizrii curbei la concentraii ridicate i ca urmare coninuturile nu pot fi determinate
exact, recurgndu-se la diluri. Dac diluia este prea mare apare o cretere a erorii tocmai datorit
dilurii, mai precis datorit limitelor determinrilor exacte ale volumelor, lucru ce trebuie avut n
vedere. n concluzie, concentraiile soluiilor msurate trebuie s fie relativ joase.

5 MATERIALELE NECESARE I APARATURA UTILIZAT

Materialele i instrumentele utilizate sunt:

material vegetal;
alcool etilic;
pahar Berzelius;
sticla de ceas;
balana ;
balon cotat de 25 ml ;
specrofotometru

6 METODA DE LUCRU

Metoda de lucru n cazul determinrii spectrofotometrice a clorofilei a i b este urmtoarea:

se cntresc aproximativ 0,5 g de frunz;
se mrunete materialul vegetal ntr-un pahar Berzelius, se acoper cu alcool etilic i apoi
cu sticl de ceas;
se pune la fiert si se supravegheaz pn la decolorarea total a fragmentelor vegetative;
se decanteaz extractul in balonul cotat si se aduce la semn cu alcool etilic;
se efectueaz citiri la spectrofotometru la urmatoarele lungimi de und:
- 665 nm pentru clorofila a
- 649 nm pentru clorofila b

11
 se seteaz intervalul lungimii de und cu butonul din interiorul aparatului iar apoi se seteaz
lungimea de und cu butonul rotativ de pe laterala dreapt a aparatului;
se apas butonul ABS (absorbanta);
ntr-o cuv (eprubet de aparat) se pune solvent i se aduce la zero aparatul prin apsare pe
tasta 100%T/A;
se inlocuiete cuva cu o alt cuv cu extract i se realizeaz citirea;
se trece la alt lungime de und pentru fiecare pigment, efectund paii descrii anterior;
se calculeaz concentraia pigmenilor asimilatori pe baza urmatoarelor formule
(Lichtenthaler, 1987)

13.95 * A665 6.88 * A649

clorofila.a *V * D mg/ g substan proaspt;
d * 1000 * W

24.96 * A649 7.32 * A665

clorofila.b *V * D mg/ g substan proaspt;
d *1000 *W

Unde:
A = absorbana la lungimea de und indicat;
V = volumul total al extractului (ml);
D = coeficientul de diluie;
W = masa iniial a materialului vegetal (g);
D = grosimea cuvei (1 cm);
1000 = factor de conversie g n mg;

7 INTERPRETAREA REZULTATELOR

W= 0.54 g
A665 =1.426

A649 =0.748

Concentraia pigmenilor asimilatori din frunza de Spinacia Oleracea este urmtoarea:

13.95 * 1.426 6.88 * 0.749 19.89 5.15

clorofila .a * 25 * 1 * 25 0.675 mg/ g frunza
1 * 1000 * 0.54 540

12
 24.96 * 0.748 7.32 * 1.426 18.67 10.438
clorofila.b * 25 * 1 * 25 0.381 mg/ g frunza
1 *1000 * 0.54 540

BIBLIOGRAFIE

Horea Iustin Nacu, Lorentz Jantschi, 2006, Chimie Analitic i Instrumental, Ed.
Academic Pres & AcademicDirect, Cluj Napoca;
http://www.scritube.com/biologie/FOTOSINTEZA2151420721.php
http://www.britannica.com/EBchecked/topic/449094/Pelargonium-crispum
http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substante
Clorofila.html
http://ro.wikipedia.org/wiki/Clorofil%C4%83
http://www.infogradina.ro/legume/legume/spanacul/492/

13