Proprietatea de polaritate poate fi interpretată ca:
• polaritate celulară - în direcție apico-bazală • polaritate tisulară - în direcție longitudinală Procesul de polaritate este dclanșat de semnale externe, din matricea extracelulară. Cand vorbim de polaritate celulei epiteliale, ne gândim la existența unor domenii membranare. În mod obișnuit, se descriu: • un domeniu apical - corespunde membranei apicale: în raport cu mediul extern • un domeniu latero-bazal - corespunde membranelor bazala și laterala: în raport cu matricea extracelulară: o membrana bazală este în raport cu membrana bazală o cele două membrane laterale interacționează cu celulele vecine Între aceste două domenii membranare există un complex joncțional apical, care marchează limita dintre ele. Din domeniul apical se extinde un subdomeniu, reprezentat de cilul primar. Acest subdomeniu al membranei apicale este întâlnit la majoritatea celulelor epitatiale și are o compozitie proteica si lipidică unică, fiind diferit de restul membranei apicale și deținând un rol esențial în procesul de semnalizare celulară. Examinarea domeniului apical evidențiază specializări membranare, vizibile și la MO: • micorvilii - formează platoul striat în cadrul unor epitelii unistratificiate cilindrice • stereocili • cili vibratili • plăci membranare apicale - la urotelii Domeniul bazal este orientat către o membrană bazală și interacționează cu molecule din matricea conjunctivă adiacentă. Realizarea polarității celulare este un proces complex, incomplet elucidat. Se știe că sunt mai multe etape incluse în programul de polaritate epitelial: 1) Recrutarea unor complexe proteice de polaritate 2) Formarea unor contacte celulare 3) Interacțiunea dintre complexele proteice și joncțiuni 4) Generarea domeniilor apical și latero-bazal 5) Redistribuția organitelor celulare și a componentelor din citoschelet
1) Recrutarea unor complexe proteice de polaritate
• complexele proteice de polaritate sunt considerate elementele cheie care declanșeaza acest proces • sunt conservate pe scala filogenetică, fiind prezente și la mamifere • inițial au fost identificate și descrise la: o Caenorhabditis elegans o Drosophila melanogaster • 3 complexe - grup de mai multe proteine, bine caracterizate: a) Crumbs b) Par c) Scribble a) Complexul Crunbs • localizat în citoplasma apicală - cortexul celular apical • implicat in formarea domeniului apical • dacă există o supraexpresie a complexului, domeniul apical se extinde foarte mult și nu se mai formează domeniul latero-bazal b) Complexul proteic Par • localizat tot în cortexul apical - în dreptul unei joncțiuni strânse, zonula occludens • implicat în formarea frontierei dintre domeniul apical și cel latero-bazal c) Complexul proteic Scribble • localizat în cortexul latero-bazal • implicat în formarea domeniului latero-bazal Fara cele 3 complexe nu se pot genera domeniile membranare! Cu exceptia unei proteinei transmembranare Crunbs din complexul Crunbs, toate celelalte proteine din complexe sunt proteine citoplasmatice, interactionand cu proteine transmembranare adiacente. 2) Formarea unor contacte celulare Cand este initiat procesul de polaritate celulara, primul pas il reprezinta organizarea unui grup de celule epiteliale nepolare intr-un strat celular. Pentru organizarea in strat celular, sunt necesare stabilirea contactelor celulare: • celula-celula • celula-matrice extracelulara Initierea acestor contacte este realizata prin formarea complexului jonctional apical, reprezentat de: • zonula occludens - situată superior • zonula adherens - situată inferior Pentru a realiza aceste contacte si a realiza complexul jonctinal, celulele adiacente trebuie sa interactioneze intre ele. Contactele primordiale sunt asemănătoare unei joncțiuni în spot și sunt realizate prin interactiunea cu proeminente ale celulei invecnate. Ulterior aceasta jonctiune, pe seama componentelor din citoschelet, va da nastere jonctiunii de ancorare - zonula adherens. Recrutrea componentelor din jonctiuni si modul in care interacioneaza nu sunt complet cunoscute, dar este acceptat faptul ca initierea contactelor celulare se realizeaza pe seama recrutarii in domeniul apical a unei proteine din familia nectinelor. Odata selectata si livrata la acest nivel, nectina va duce la recrutarea caderinei E si ulterior la recrutarea claudinei. Claudina stă la baza formării joncțiunii stranse Dintre aceste molecue de ancorarea, caderina E este considerata moleculă cheie, care dupa recrutare este responsabilă de formarea complexului joncțional apical și de restructurarea citoscheletului din cortexul celular. Caderina E este o glicoproteina transmembranara si are • domeniu extracelular lung - format din 5 subunitati identice, unite prin regiuni cu afinitate pentru ionii de Ca (caderina E are activitate Ca-dependenta) • segment transmembranar • domeniul citoplasmatic mai scurt - se ancorează la componentele citoscheletului (filamentele de actină) Rolul caderinei in formarea complexului jonctional e demonstrat de fatul ca in timpul embriogenezei, aplicarea de anticorpi anti-caderina E impiedica formarea tesutului epitelial. Fiind o glicopretina de adezivitatea cu activitate Ca-dependenta, daca se indeparteaza ionii de Ca in timpul diviziunii celulare, celulele epiteliale isi pierd contactele, se despart si este impiedicata formarea unor noi contacte celulare. In functie de concentratia ionilor de Ca, domeniul extracelular poate fi • rigid - concentratia este mare, domeniul extracelular interactionand homofil cu domeniul similar dintr-o celula adiacenta • flexibil - concentratia este mica Deasupra joncțiunii de ancorare se formeaza jonctiunea stransa occludens, la formarea ei participand 3 familii de proteine transmambranare • ocludine • claudine • molecule de adezivitate celulara Aceste proteine interactioneaza tot prin domeniile extracelulare, realizand un sigiliu etans, ce inchide spatiul intercelular. Ele se ancoreaza la citoschelet prin proteine de ancorare specifice. Daca molecula de caderina E e molecula ce initiaza formarea complexului jonctional, in stabilirea si mentineara polaritatii celulare, rolul primordial ii revine jonctiunii stranse. Jonctiunea stransa are mai multe roluri • se afla la frontiera dintre domeniile apical si latero-bazal • impiedica difuzia (miscarea) laterala a proteinelor si lipidelor - le mentine lor intr-un anumit domeniu membranar • jonctiune ca un sigiliu, actionand ca o baiera selectiva si controland difuzia moleculelor prin spatiul paracelular • dupa aparitia ei, se creeaza domeniile apical si latero-bazal, cat timp este integra
3) Interacțiunea dintre complexele proteice și joncțiuni
Ideea acceptata cu privire la relatia dintre cele 3 comlexe proteice si complexul jonctional apical este ca odata formate contactele primordiale, sunt recrutate si activate complexele proteice, iar activarea celor 3 complexe proteice asigura livrarea moleculele necesare formarii complexului jonctional apical. Odata format complexul jonctional apical, contacactele celulare sunt consolidate. Astfel, aceste interactiuni asigura consolidarea jonctiunilor din complexul apical. 4) Generarea domeniilor apical și latero-bazal Crearea polaritatii implica si realizarea unei asimetrii biochimice intre cele 2 domenii, o distribuție inegală a proteinelor și a lipidelor membranare, ceea ce determină și funcții diferite ale domeniilor - proces de remodelare a membranei celulare • inainte de crearea polaritatii, proteinele si lipidele membranare sunt distribuite difuz • cand apare polaritatea, se realizeaz o redistributie a componentelor din cele 2 domenii membranare, din fondul comun existent Generarea celor două domenii nu se realizează simultan! • generarea domeniului apical - rapid, fiind suficienta initierea contactelor celulare • crearea domeniului latero-bazal - mai lent, impunand contacte celulare extinse
5) Redistribuția organitelor celulare și a componentelor din citoschelet
Asimetria proteica Fondul comun proteic: • proteinele transmembranare preexistente, dinainte de redistributie • proteine citoplasmatice In functie de tipul de proteina, ea este sortata si transportata catre un anumit domeniu membranar. Sortarea se face: • reteaua trans Golgi - pentru proteinele sintetizate • compartiment endozomal specializat, cu endozomi apicali sau bazali și endozomi de reciclare - pentru proteinele reciclate Proteina este sintetizată, sortata in rețeaua trans Golgi si: • la domeniul apical - ajunge doar pe calea endozomului • la domeniul latero - bazal - ajunge atat direct, cât si pe calea endozomului In cazul proteinelor transmembranare care vor fi redistribuite din domeniul apical sau latero-bazal, acestea vor fi internalizate sub forma de endozomi. Sortrea are loc in compartimentul endozomal și in functie de ce se stabileste la acest nivel, proteinele pot fi: • reciclate - se reintorc in domeniul din care provin • trasnsportate catre domeniul opus - transcitoza • transportate catre alte zone: o liziomi - degradrae o transportate retrograd la reteaua trans Golgi Asimetria lipdica In cazul asimetriei fosfolipidelor de pe fata citosolica a membranei celulare, crcuciali sunt fosfatidilinozitolfosfatii, recrutati preferential: • PIP2 - doar la nvelul domeniului apical • PIP3 - doar in domeniul laero-bazal La recrutarea preferentiala participa enzimele implicate in formarea lor, enzime care sunt livrate astfel: • fosfataze e localizata apical • kinaza e localizata latero-bazal Intre cele 2 molecule exista interconversiune: • PIP3 sub actiunea unei fosfataze devine PIP2 • PIP 2 sub actiunea unei kinaze devine PIP 3 Selectia enzimelor este determinata de complexele proteice de polaritate • fosfataza este rerutata in domeniul apical de o componenta din complexul Par si localizarea e intarita de caderina E • localizarea kinazei este asiguarat de o proteina din complexul Scribble, alaturi de o molecula din matricea extracelulara - laminina Componenta membranară Membrana apicală (functia de Membrana laterobazală absorbtie, secretie si transport) 1. PROTEIN-ENZIME Enzime hidrolitice Na+ /K+ ATP-aza (proteină marker) 2. PROTEINE DE Transportori de glucoză si Canale și pompe ionice TRANSPORT ŞI CANALE aminoacizi IONICE Aquaporine 3. PROTEINE DE Domeniu lateral - caderine ADEZIVITATE Domeniu bazal - integrine 4. RECEPTORI Receptori pentru insulină, parathormon, factor HORMONALI de creştere epidermal 5. COLESTEROL crescut scăzut
6. SFINGOLIPIDELE crescut scăzut
(sfingomielină) 7. FOSFATIDILCOLINĂ scăzut crescut
8.FOSFATIDILINOZITOL scăzut crescut
Si sfingolipidele sunt implicate in polaritate si in recrutarea proteinleor din domeniul apical. La nivelul domeniului apical exista domenii membranare - plute lipidice. Acestea sunt formate din glicosfingolipide si colesterol. Sunt situsuri care atrag anumite proteine in domeniul apical si pe care le oligomerizeaza. In distributia proteinelor si lipidelor catre un anumit domeniu membranar, exista un semnal de sortare. Semnalele sunt continute de proteinele transmembranare - comportament diferit intre zona apicala si cea bazala: • pentru domeniul apical o semnalele de sortare pot fi localizate oriunde la nivelul unei molecule proteice transmembranare - cioplasmatic/ transmembranar/ extracelular o de aici rezulta diversitatea mare a semnalelor de sortare • pentru domeniul latero-bazal, semnalele de sortare sunt numai in domeniul citoplasmaic al proteinei transmambranare Mai exista si o redistributie a elementelor din citoschelet • microfilamentele de actina • micortubuli In organizare intervin cele 3 complexe proteice de polaritate - unde apare actina, apar si complexele proteice. La nivelul filamentelor de actina se observa o distributie in zona cortexului celular, formand la acet nivel o structura sub forma de retea. Modul prin care se organizeaza filamentele de actina in cele 3 comenii membranare difera: • la nivelul domeniului apical - filamentele de actia participa in, alaturi de membrana celulara, la formarea de microvili • la nivel jonctional - filamentele de actina se ancoreaza la molecule de adezivitate celulara, asigurand formarea si intretinerea contactelor celulare • la nivelul domeniului latero-bazal - filamentele interactioneaza cu proteinele transmembranare (integrina), ancorand aceste proteine la citoischeletul din cotexul celular Microubulii se reorganizeaza prin redistributie • spre doemniul apical - sta la baza formarii cilului primar: o unul dintre centriloi migreaza spre membrana apicala si dupa ce se ataseaza de aceasta se formeaza corpusculul bazal o corpusculul genereaza un inel cu 9 microtubuli periferici - axonema cilului o pe masura ce microtubulii cresc, membrana este indepartata si se creeaza forma de cil primar • spre cortexul celular latero-bazal - au directie apico-bazala, paralela cu domeniul lateral Microtubulii sunt componente polarizate. Capatul minus este orientat catre domeniul apical si actioneaza proteine motoare - dineina si kinezina, ce asigura transport de molecule intracelular). Astfel intervin in traficul de molecule desfasurat in citoplasam unei molecule. Polaritatea celulara va fi urmata de morfogeneza tesutului epitelial Polaritatea celulara este completata de polaritatea tisulara, ce presupune contactele intre celule pentru a forma stratul celular si contactele cu matricea adiacenta, in felul acesta realizandu-se un control asupra comportamentului celulelor epiteliale. In relizarea polaritatii tisulare, un rol major revine interactiuneaii dintre domeniul bazal al celulelor si matricea extracelulara adiacenta - interactiune care se realizeaza intre proteine din domeniul bazal, cele mai multe fiind • integrine • distroglicani Proteinele transmembranare vor interactiona cu molecule din matricea adiacenta, organizand si membrana bazala cu aceasta ocazie. Interactiunile dintre polul bazal si celulele din matrice, alaturi de organizarea unei membrane bazale duc la organizarea unei arhitecturi normale a tesutului epitelial. ORGANIZAREA MEMBRANEI BAZALE Orice epiteliu este ancorat la tesutul conjunctiv adiacent printr-o membrana bazala, observabila uneori la MO. Caracteristicile membranei bazale: • strat al matricei adiacente, in raport cu polul bazal al celulei epiteliale • acelulalra, amorfa, densa • grosime variabila, care difera cu localizarea epiteliului - 50-100 nm, valori obtinute prin MET (microscopie electronica de transmisie), care sunt sub limita de rezolutie a MO Daca se foloseste microscopia de forta atomica, se constata ca este de fapt de 4 ori mai groasa, deoarece preparatul este pregatit pentru MET prin deshidratare si apare contractia componentelor mebranei bazale. Se examineaza la MO doar in cazul epitellilor care vin in raport cu o membrana bazala mai groasa de 100 nm - rare, de exemplu epiteliul care vine in raport cu epiteliul pseudostratificat cilindric ciliat din peretele traheei. Daca vre sa o examinam, o putem face cu coloratie hemalaun-eozina - apare ca o structura acidofila la baza sau in jurul epiteliului. Dar si matricea adiacenta are caracter acidofil, iar delimitarea neta este adeseori greu de realizat. De accea pentr examinare la MO se folosesc metode histochimice, prin care se identifica componenta glucidica din structura membranei bazale. Metodele histochimice ele mai frecvente sunt: • metoda PAS (Periodic acid–Schif) - membrana bazala apare rosie-purpurie • impregnare argentica - membrana bazala apare neagra Si aspecul este variabil, aparand sub forma unor structuri liniare, dar sunt si sitiatii in care are aspect ondulat, in momentul in care vorbim de membrana unor epitelii stratificate de tip pavimentos. In cadrul lor, la jonctiunea epiteliu-tesut conjunctiv, epiteliul conjunctiv formeaza niste papile conjuctive, care detrmina aspectul ondulat. La MET se observa ca are in alcatuire 2 componente: • LAMINA BAZALA • LAMINA RETICULARA - componenta a carei grosime poate sa varieze mult fiind alcatuita din moelcule de colagen tip III, fibrilar, care se dispune in fibre de reticulina ce formeaza o retea Obesevatie legata de terminologie • membrana bazala - ce se vede la MO • lamina bazala- ce se vede la ME LAMINA BAZALA • nu are o structura omogena • alcatuita din alte doua componente o lamina lucida/rara - strat elecronotranparent in vecinatatea imediata a polului bazal o lamina densa - strat electronodens, sub precedentul Lamina rara • intre mebrana plasmatica bazala a velulei epiteliale si stratul electronodens • aici se intalnesc proiectiile domeniilor extracelulare ale proteinelor transmebranare din mebrana plasmatica bazala o integrinele o distroglicanii • prezinta molecule din matricea extracelulara o laminina o entactina Lamina densa • alcatuita din fibre foarte fine de 3-4 nm, organizate sub forma unei retele • filamete fine au in compozitie colagen tip IV, caracteristic oricarei membrane bazale. Colagenul tip IV este un colagen aparte, nefibrilar, avand proprietatea de a se autoasambla intr-o retea care va fi acoperita pe ambele fete de proteoglicanul perlecan, care are ca glicozaminoglican heparansulfatul. Numele provinde de la asemanarea cu un sir de perle. Lanturile de heparan sulfat au prorpietatea de a reine factorii de crestere! Imaginea de la MET a fost obtinuta prin realizarea preparatului cu fixatori chimici, glutaradehida. Cand s-a folosit alta metoda de fixare, inghetarea la temperaturi joase si presiuni mari, a aparut o imagine diferita, in care langa zona polului bazal se observa o structura electronodensa. A disparut zona electronostransparenta si de aceea unii cercetatori considera ca zona electronotransparenta este un artefact de fixator chimic si ca in realitate membranei bazale ii corspune doar lamina densa In anumite focalizari, se observa ca lamina densa pare mai ingrosata si vine in raport de o parte si de o alta cu o parte electronoclara: • se intampla cand doua lamine bazale fuzioneaza - 2 epitelii intre care nu se interpune tesut conjunctiv. • in cadrul unor membrane care ajuta la schimburi gasoazse (membrana respiratorie) sau procese de filtrare (membrana de ultrafiltrare) Schimbul de gaze se realizeaza la nivelul membranei respiratorii, alcatuita din: • peretele alveolei pulmonare • peretele capilarului alveolar Procesul de filtrare reprezinta formarea urinii primare din plasma, prin membrana de ultrafiltrare si cu acumulare in spatiul urinar. Membrana de ultrafiltrare este alcatuita din • peretele capilarului glomeruar • peretele foitei viscerale a capsulei Bowman Intre ele nu se interpune tesut conjunctiv si cele 2 lamine bazale fuzioneaza. Initial s-a considerat ca membana bazala este o structura care apartine numai tesutului epitelial. In realitate, apare si in jurul altor celule care se pot asocia cu tesut conjunctiv: • celulele musculare (indiferent de natura lor) • celule care apartin SNP (populatia de nevroglie) • celule adipoase. Toate aceste exemple sunt celule nepolare, de aceea se foloseste termenul de „lamina externa”, iar termenul de lamina bazala se foloseste doar pentru celulele polare. Compozitia chimica a membranei bazale • ~ 50 de tipuri de molecule proteice, variind de la un epiteliu la altul saa chiar in cadrul aceluiasi tip de epiteliu • 4 molecule proteine sunt constante in compozitia oricarei lamine bazale o laminina - proteina o colagen IV - proteina o entactina- glicoproteina o perlencan - proteoglican In structura laminei bazale exista 2 retele • retea formata din molecule de laminina • retea formata din molecule de colagen IV Retelele sunt interconectate prin intemediul entactinei si a perlecanului. Cand se constituie lamina bazala, cele 4 componente majore vor trebuie sa interactioneze intre ele si cu membrana ceulei epiteliale a domeniului bazal. Laminina 1 (laminina clasica) • exista mai multe izoforme, iar aspectul moleculei este de cruce/ buchet cu 3 flori • are aspectul unui heterotrimer - 3 lanturi polipeptidice o alfa - cel mai lung o beta o gama • fiecare lant are cate o regiue spiralizata si aceste regiuni contribuie la formarea zonei triplu helix • exista doemniile o amino termiale - molecule de laminina interactioneaza intre ele si formeaza polimerul de laminina si reteaua de laminina Este nevoie de o anumita concentratie pentru formarea retelei! o carboxiterminale -nglobulare, se ancoreaza la membrana plasmatica a celulei epiteliale, avand situsuri de legare pentru integrine si distroglicani Colagenul tip IV • heterotrimer format din 3 lanuri polipeptidice alfa, care se spiralizeaza, formand un triplu helix • exista mai multe izofrome de colegan IV si de lanturi alfa • fiecare lant alfa (monomer de colagen IV) are 3 segmente: o domeniu amino terminal scurt - domeniu 7S (dupa constanta de sedimentare) o domeniul helicoidal - cel mai lung o domeniu carboxi-terminal - globulos NC1 • fiecare monomer vine in raport cu alti 2 monormeri si prin spiralizare domeniilor helicoidale vor forma molecula de colagen IV (protomerul de colagen) • domeniile globuloase interactioneaza si fomeaza trimerul NC1 • protomerii interactioneaza 2 cate 2 prin domeniile NC1 si se formeaza un hexamer NC1, rezultand dimerul colagen IV • 4 dimeri intearctioneaza prin domeniile scurte 7S si vor forma tetramerul de colagen IV • tertramerii se leaga cap la cap si formeaza reteaua (suprastructura) de colagen IV Aceste evenimente au loc spontan si sunt controlate de proteaze. De aici si capacitatea de autoasamblare in retea a colagenului IV! Laminina si colagenul IV sunt secretate de celule conjunctive din matricea adiacenta tesutului epitelial. Ele vor difuza in vecinatatea epiteliului si organizeaza retelele. Primul pas in organizarea laminei bazale este interactiunea dintre domeniul globulos al lamininei si proteinele din domeniul bazal al celulelor epiteliale. Astfel se concentreaza local o cantitate mai mare de molecule de laminina si acestea pot polimeriza, formand polimerul de laminina. Celelalte componente majore se ataseaza la laminina. Entactina leaga cele 2 retele de colagen IV si laminina, iar perlecanul mediaza legarea entactinei la laminina. ROLURILE MEMRANEI BAZALE • necesara in embriogeneza pentru formarea tesutului epitelial • asigura arhitectura normala a tesutului epiteial adult - elementul de suport pentru epiteliu • interpundandu-se intre epiteliu si tesutul conjunciv adiacenta, asigura si o compartimentalzare • contribuie la o polaritate tisuara • desi actioneaa ca un element de compartimentalizare, nu exista o bariera intre epiteliu si tesut conjunctiv - bariera cu permeabilitate selectiva, permitand schimburi bidirectionale • rezervor de factori de crestere, prin interemediul carora este conrolat proceseul de cerstere si proliferarea celulara • interine din procesul de diferentiere, proliferare si migrare a celulelor epiteliale - functii de control posibile datorita semnalelor pe care celula le primeste din tesutul conjunctiv adiacent (moleculele din matricea conjunctiva interactioneaza cu receptorii celulei epiteliale). Implicatii in metastazarea cancerului, deoarece majoritatea metaplaziilor sunt de origine epiteliala. Intereseaza momentul in care se pune diagnosticul: o forma incipienta - tumora incapsulata o faza de metastazare Migrarea are loc in momentul in care membrana bazala nu mai este integra. Cauzele pierderii integritatii pot fi: o modificare de compozitie chimica - nu mai functioneaza ca o mebrana selectiva o modificare datorata actiunii unor proteaze - fac sa apara fragmentari, creeaza brese