BIOLOGIE

CELULARĂ
NOȚIUNI GENERALE
RESURSE DIDACTICE ALE CATEDREI (1)
RESURSE DIDACTICE ALE CATEDREI (2)
 CUM DEFINIM BIOLOGIA CELULARĂ?

• Este știința care se ocupă cu studiul

structurii și funcțiilor celulare
 CUM DEFINIM CELULA?

• Celula reprezintă unitatea structurală și funcțională a materiei

vii și are următoarele caracteristici definitorii:
• Stocarea informației genetice sub formă de ADN
• Transmiterea caracterelor ereditare unei noi celule fiice prin
diviziune
• Capacitate de autocontrol și adaptabilitate în vederea
supraviețuirii

• http://www.nature.com/scitable/topic/cell-biology-13906536
 TIPURI CELULARE

• În funcție de localizarea materialului genetic în celulă, se clasifică în 2

categorii majore:
• Procariote – organisme unicelulare lipsite de nucleu și alte organite
delimitate de endomembrane; reprezentate de bacterii
(eubacterii) și Archaea
• Eucariote – organisme uni- sau multicelulare care au nucleu și
organite delimitate de endomembrane; reprezentate de protiste,
fungi, plante, animale
• Sunt diferite prin morfologie, mecanisme genetice, diversitatea
organitelor și funcțiile îndeplinite
 VIAȚA UNEI CELULE

• O celulă ia naștere prin diviziune celulară din altă celulă

• În cursul vieții sale, o celulă își formează propriile organite
pentru a-și putea îndeplini funcțiile (devine specializată);
diferențierea unei celule în forma ei adultă este influențată de
alte celule prin semnalizare (comunicare) celulară
• Fiziologic, o celulă moare în urma unui proces celular programat
(apoptoza)
 CELULE STEM VS. CELULE DIFERENȚIATE

• Unele celule rămân în organismul adult în stadiul de celule

nediferențiate – celule stem
• Caracteristici ale celulelor stem:
• Capacitate de autoreînnoire (parcurg numeroase cicluri de diviziune
celulară, fără a-și pierde statutul nediferențiat, deoarece se divid
asimetric – în urma diviziunii rezultă o celulă identică cu cea inițială,
cu proprietăți stem și o celulă care va porni pe calea diferențierii)
• Multipotență – abilitatea de a se diferenția în mai multe tipuri
celulare specializate (diferențiate)
 CELULA EUCARIOTĂ

• Cele trei componente majore ale celulei eucariote sunt:

• Membrana celulară
• Citoplasma = citosol + organite
• Nucleul
• Organitul – element intracelular, caracterizat printr-o organizare moleculară
complexă și specifică, determinând morfologii și funcții specifice
• Organitele se clasifică în:
• Delimitate de endomembrană – nucleu, reticul endoplasmic, aparat Golgi,
lizozom, peroxizom, mitocondrie
• Nedelimitate de endomembrană – ribozomi, citoschelet, proteazom
 CELULA
EUCARIOTĂ
 CÂT DE MARE E O CELULĂ?

• Dimensiunea medie a unei celule eucariote este 20-30 µm

• Cea mai mare celulă este ovocitul – poate atinge 200 µm
• Eritrocitul are 7-8 µm

Ochiul uman poate observa structuri până la 0,1 mm

 CUM STUDIEM CELULA?

• Metode imagistice – pot fi observate celule vii sau fixate, detalii

morfologice ale acestora, localizări ale anumitor componente celulare

• Metode biochimice/de biologie moleculară – permit studierea

componentelor biochimice izolate din celule: proteine, glucide, lipide,
acizi nucleici; oferă informații despre funcțiile celulare în care sunt
implicate componentele biochimice individuale
 REZUMAT

• Celula – unitatea de bază, structurală și funcțională a tuturor organismelor vii

• În funcție de localizarea materialului genetic în celulă – celule procariote și celule
eucariote
• Celula eucariotă este înconjurată de o membrană celulară, are nucleu și citoplasmă;
prezintă organite delimitate și organite nedelimitate de endomembrane
• Celulele se pot studia – vii sau moarte (fixate) – cu ajutorul metodelor imagistice și
prin metode biochimice/moleculare
INTRODUCERE ÎN CERCETAREA
BIOMEDICALĂ
 ÎN ACEASTĂ LUCRARE PRACTICĂ VOM ÎNVĂȚA:

• Care sunt tipurile de activități de cercetare?

• Care sunt cerinţele minime ale unui experiment de cercetare?

• Cum putem prezenta rezultatele unui experiment?

• Reguli de editare a unei prezentări

 CERCETAREA ȘTIINȚIFICĂ
• În știință, activitatea de cercetare poate fi încadrată în două categorii:
• Cercetare fundamentală – studiază un anumit subiect în scopul descoperirii
și acumulării de cunoştinţe noi
• Cercetare aplicată – studiază un anumit subiect în scopul rezolvării unei
probleme
• Ambele tipuri de activități de cercetare pot studia același subiect, ceea ce le
diferențiază este scopul final; ex. dacă un cercetător studiază mecanismele
celulare de la nivelul mitocondriei pentru a înțelege mai bine cum
funcționează mitocondria, aceasta este cercetare fundamentală; dar dacă
studiile sunt făcute în scopul descoperirii unui tratament pentru o boală
mitocondrială, aceasta este cercetare aplicată
 ABORDAREA EXPERIMENTALĂ ÎN CERCETARE

• Elaborăm o ipoteză

• Alegem un model experimental

• Alegem metoda/metodele potrivită/e

• Interpretăm rezultatele

• Comunicăm rezultatele
 ELABORAREA IPOTEZEI
• Găsim o întrebare științifică la care vrem să răspundem; fiecare experiment
trebuie să ofere răspuns unei întrebări științifice
• Primul pas este documentarea – cea mai mare bază de lucrări științifice din
domeniul medical: Pubmed → https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
• Există două tipuri principale de articole științifice:
• Articol de cercetare – prezintă rezultatele originale ale cercetării unei echipe
pe un anumit subiect
• Articol review – face o sinteză a datelor din literatură existente în acel
moment pe o anumită temă științifică, deci sumarizează informațiile din mai
multe articole de cercetare sau chiar din alte articole review, dacă tema
propusă este mai vastă
 ALEGEREA MODELULUI EXPERIMENTAL
• În cercetarea biomedicală, se lucrează cu următoarele modele:
• Culturi celulare – celule de același tip, izolate din organism și crescute în
laborator, în medii speciale, în incubatoare de cultură
• Animale de laborator – sunt folosite diferite animale considerate model pentru o
anumită clasă (ex. pești, amfibieni, etc.), pornind de la nevertebrate, până la
vertebratele cele mai evoluate
• Probe biologice – obținute de la pacienți: biopsii, sânge, urină, lacrimi, etc.
• De obicei, în cercetare (mai ales în cea aplicată – de ex. testarea unui potențial
tratament), este urmată succesiunea:
culturi celulare → modele animale → pacienți
• Orice model experimental trebuie să includă minim un control și o probă de testat;
există mai multe tipuri de controale pentru un experiment:
• Control pozitiv – sigur există variabila pe care o căutăm
• Control negativ – sigur nu există variabila pe care o căutăm
 ALEGEREA METODELOR EXPERIMENTALE
• La o întrebare științifică se poate răspunde prin mai multe metode – se alege cea mai
simplă metodă pentru care există dotări disponibile în laborator
• Orice laborator de cercetare are la dispoziție diferite instrumente, materiale
consumabile și echipamente pentru efectuarea experimentelor
• Controlul temperaturii probelor
• Celulele supraviețuiesc la 37°c și îți încetinesc activitățile enzimatice la 4°C
• Celulele și țesuturile pot fi stocate la temperaturi de -20°C, -80°C (în congelatoare) până la -196°C în
azot lichid
• Dacă preluăm o probă de la un pacient, ea trebuie stocată cât mai repede la rece sau fixată (detalii în
LP3)
• Controlul contaminării
• Bacteriene – se lucrează în condiții aseptice
• Biochimice – contaminare cu keratina (proteină abundentă din piele) sau ADN-ul cercetătorului (din
păr, piele, sânge, etc.); pentru evitarea acesteia, se lucrează cu mănuși chirurgicale
RESEARCH STARTER PACK
 INTERPRETAREA REZULTATELOR
• Avem nevoie de cel puțin o repetare a experimentului pentru
confirmarea rezultatului
• Avem nevoie de cel puțin trei determinări pentru a face o analiză
statistică
• Determinările trebuie făcute de fiecare dată în aceleași condiții
• Rezultatele sunt prezentate sub formă de imagini, grafice,
scheme, tabele
 COMUNICAREA REZULTATELOR
• Se face sub formă de:
• Prezentări la manifestări științifice
• Postere
• Prezentări orale
• Publicare de articole științifice
• Structura unei prezentări de rezultate respectă următorul format:
• Introducere – câteva informații pe scurt despre ce se cunoaște în domeniu; de obicei,
ultima frază descrie scopul lucrării – ce nu se știe în domeniu și își propune lucrarea să
abordeze
• Materiale și metode
• Rezultate
• Concluzii
 REGULI DE EDITARE A UNEI PREZENTĂRI
• Se respectă regula generală a oricărei compoziții literare: titlu, introducere, corpul
lucrării, concluzii
• Titlul trebuie să fie concis și sugestiv pentru conținut
• De regulă, fiecare slide are un titlu
• Slide-urile trebuie să conțină maxim 3-6 informații prezentate concis (ideal, nu mai mult
de 5-6 cuvinte/bullet point); prezentările care servesc drept suport de studiu, ca
aceasta, nu se conformează acelorași reguli ca prezentările orale, în fața unui public
• Imaginile trebuie să aibă legendă și sursă, dacă sunt preluate și nu originale
• Concluziile nu trebuie să introducă elemente noi, care nu au fost menționate în restul
prezentării
 REZUMAT

• Cercetarea fundamentală este primul pas către cercetarea aplicată și apoi cea clinică
• Un experiment de cercetare fundamentală răspunde unei întrebări științifice
folosind modele experimentale, controale și metode specifice
• Prezentarea rezultatelor respectă o schemă generală formată din: introducere, scop,
materiale și metode, rezultate, concluzii
• Nu copiați munca altora! Orice referire la rezultatele sau ideile altor autori trebuie
citată
MICROSCOPIA OPTICĂ
 OBIECTIVELE LUCRĂRII PRACTICE

• Să înțelegem de ce avem nevoie de microscopul optic pentru studiul celulei

• Să aflăm care sunt limitările microscopului optic și cerințele minime necesare pentru
a putea vizualiza un preparat

• Să învățăm să recunoaștem tipul de microscopie folosit pentru obținerea unei

imagini

• Să începem să identificăm structuri celulare și tisulare cu ajutorul colorațiilor

 DE CE FOLOSIM MICROSCOPUL?
• Ochiul uman este un sistem optic, cu lentile (cornee, cristalin) și un detector
(retina)
• Performanța unui sistem optic poate fi măsurată prin două caracteristici:
• Putere de mărire – de câte ori mărește imaginea unui obiect
• Rezoluție – distanța minimă la care două puncte distincte pot fi văzute separat
• Limita de rezoluție a ochiului uman este 100 μm; dimensiunea celulelor este
sub această limită de rezoluție; studierea lor este posibilă utilizând tehnici de
microscopie
• Microscopia – tehnică de examinare a obiectelor mici cu instrumente care să
depășească, prin rezoluție și putere de mărire, posibilitățile ochiului uman
DIMENSIUNI RELATIVE ȘI INSTRUMENTE DE DETECȚIE
Ochiul uman

Microscopul optic

Microscopul electronic

Țesuturi Organite

Celule Molecule
Celule animale

Bacterii

Virus

Proteine globulare

Atom
Celule vegetale

Ribozom

Moleculă mică
 MICROSCOPUL OPTIC (MO)

• Folosește o sursă de lumină artificială care

trece prin obiectul examinat, apoi străbate
un sistem de lentile optice (obiectiv, ocular)
pentru a obține imaginea mărită a
respectivului obiect
• Imaginea rezultată va fi mărită, răsturnată
și virtuală, la infinit (nu necesită efort de Obiect
acomodare)

http://symposcium.com/wp-content/uploads/2013/06/light-microscope.png
 COMPONENTELE
MICROSCOPULUI OPTIC
1 – oculare
2 – revolver (pentru schimbarea obiectivului)
3 – obiectiv
4 – macroviză (pentru focalizarea grosieră a
imaginii)
5 – microviză (pentru focalizarea fină a imaginii)
6 – măsuța microscopului (port-lamă)
7 – sursa de lumină
8 – condensor cu diafragmă (condesarea și
modularea intensității luminii în planul focal)
9 – dispozitiv de deplasare a lamei
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/3a/Optical_microscope_nikon_alphaphot.jpg
 PUTEREA DE MĂRIRE A MO
Puterea de mărire a microscopului =
puterea de mărire a ocularului X puterea de mărire a obiectivului
(oc – 10 × ob – 100 = mărire de 1.000 de ori a obiectului analizat)
*puterea de mărire maximă în MO ~ 2.000 x (ocular cu putere de mărire 20× obiectiv cu putere de mărire 100)

Puteri de mărire şi denumirile obiectivelor:

• 4× – lupă – localizarea secțiunii/celulelor pe lamă
• 10× – obiectiv de orientare
• 20 x / 40× – obiectiv de diagnostic histologic
• 60×/100× – obiectiv de diagnostic citologic
 PUTEREA DE MĂRIRE A MO

Ob. 4x Ob. 100x

Oc. 10x
Ob. 10x

Ob. 20x
 REZOLUȚIA MO

Rezoluția microscopului optic

depinde de: Microscopie optică
• Lungimea de undă a luminii folosite
pentru examinare
• Caracteristicile optice ale obiectivului
utilizat
• Indicele de refracție al mediului dintre
preparat și obiectiv
http://www2.optics.rochester.edu/workgroups/novotny/snom.html

Rezoluţia MO ~ 0,2 µm*

*Această barieră a fost depășită în ultimii ani de microscoapele de super rezoluție
 REZOLUȚIA MO

rezoluție scăzută rezoluție rezoluție

acceptabilă bună

Rezoluția MO ~ 0,2 µm
 OBSERVAREA STRUCTURILOR BIOLOGICE LA MO
• Se pot examina celule vii sau moarte (fixate)
• Chiar dacă mărim suficient și avem și o rezoluție bună a sistemului optic,
celulele și țesuturile umane nu au un contrast bun între componentele lor,
pentru a le putea studia în stare nativă
• Căutându-se metode de creștere a contrastului, s-au obținut diverse tipuri de
microscoape

Contrast scăzut Contrast puternic

 TIPURI DE MICROSCOAPE OPTICE

• Microscopul cu câmp luminos

• Microscopul cu contrast de fază
• Microscopul cu fluorescență

câmp luminos contrast de fază imunofluorescență

Celule în cultură
 MICROSCOPUL CU CÂMP LUMINOS

• Preparatele sunt fixate și colorate, pentru a mări contrastul dintre

componentele celulare/tisulare
• În funcție de legarea colorantului/coloranților pe diferite componente
tisulare sau organite celulare, se obține o imagine mono-/policromă
• Culoarea unui colorant derivă din faptul că acesta absoarbe toate lungimile
de undă, cu excepția celei care îi dă culoarea (l). Lumina cu lungimea de
undă care nu este absorbită va străbate preparatul și va ajunge la ochiul
observatorului.
 MICROSCOPUL CU CÂMP LUMINOS

Preparate permanente http://www.histologyguide.com/slidebox/slidebox.html

 MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZĂ

• Este folosit pentru examinarea celulelor și organismelor mici vii,

fără fixare și colorare
• Microscopul folosește un principiu de construcție care crește
micile diferențe de refracție existente între zone diferite ale
celulei. Această diferență este perceptibilă de ochiul uman,
apărând un contrast vizibil între diferite zone
MICROSCOPUL CU CONTRAST DE FAZĂ
• Microscopul cu • Microscopul cu
câmp luminos contrast de fază
lumină transmisă
(neabsorbită)
undele defazate de
structurile celulare,
combinate, generează
secțiune/ contrast
celule
colorate

celule ne-
colorate unde în
aceeși
fază

lumină incidentă (albă) lumină incidentă (albă)

Alberts B &Co. Molecular biology of the cell. GS. 6th ed. 2015
 MICROSCOPUL CU FLUORESCENȚĂ
• Se folosește pentru examinarea celulelor vii sau fixate, în care diferite
componente celulare/tisulare sunt marcate cu fluorocromi/fluorofori
(substanțe fluorescente)
• Fluorocromii absorb lumină de o anumită lungime de undă (excitație)
și emit apoi lumină la o lungime de undă superioară (emisie)
• Lumina de excitație poate proveni de la un laser (monocrom) sau de la
o lampă (policromă) cu un filtru care lasă să treacă doar o anumită
lungime de undă
• Preparatele de fluorescență se studiază în întuneric, pentru a se
detecta mai ușor emisia luminoasă
MICROSCOPUL CU FLUORESCENȚĂ

Excitație Emisie http://condensatoarefizica.blogspot.com/2011/01/spectrul-electromagnetic.html

 MICROSCOPUL CU FLUORESCENȚĂ

Albastru: ADN; roșu: filamente intermediare Albastru: ADN; verde: filamente intermediare
 ETAPELE OBȚINERII PREPARATULUI
MICROSCOPIC PERMANENT

• Pregătirea unui preparat permanent pentru microscopie

optică implică etapele de mai jos:
• Recoltare
• Fixare
• Includere
• Secționare
• Colorare
• Montare și etichetare
John James Hunter, 1858-after 1911
http://microscopist.net/
 RECOLTAREA

• Biopsie – prelevare de țesut viu

• poate fi folosită și pentru inițierea de culturi celulare (metodă de menținere a celulelor în viață într-un
mediu artificial – „in vitro”)

• Necropsie – prelevare de țesut postmortem

• NB: Mediul de recoltare trebuie adaptat tehnicii utilizate:

• Fixator (conservă materialul biologic și raportul dintre
componente) pentru preparate permanente
• Mediu de cultură, tampon fosfat salin pentru studiul celulelor vii
 RECOLTAREA

• În timpul intervenției chirurgicale (intraoperator)

• Piesele excizionale se recoltează în fixator
• Se trimit în întregime laboratorului de anatomie patologică
• Se menționează datele de identificare ale pacientului și piesei
• Din probele inițiale, anatomopatologul va decide care sunt zonele
de interes și le va decupa (1 x 1 cm)
 RECOLTAREA

• Alte surse de material biologic

• Fragmente de țesut recoltate în urma procedurilor endoscopice
• Puncție – biopsie cu ace groase
• Puncție aspirativă cu ac subțire
• Excizie din piele
 FIXAREA
• Metodă de păstrare a arhitecturii țesuturilor și celulelor în afara
organismului și de prevenire a descompunerii, putrefacției sau
autolizei tisulare
• Fixarea asigură conservarea rapidă, dar omoară celulele – inițierea de
culturi celulare nu mai este posibilă după această etapă
• Fixare:
• Fizică – prin înghețare
• Chimică – cu formaldehidă sau alți fixatori
• Aldehidele și agenții oxidanți (OsO4) acționează prin formarea de
legături covalente cu grupările funcționale ale macromoleculor din
celule/țesuturi
 INCLUDEREA

• Includerea încorporează materialul biologic recoltat (fragment de

organ/țesut) într-o materie solidă, potrivită pentru secționare în
felii cât mai subțiri, care pot fi examinate la microscop
• La MO, includerea se face în parafină. Aceasta este o substanță
anhidră, de aceea includerea presupune mai multe etape:
• deshidratare (în soluții succesive de alcool de concentrații crescânde: 50-
100% care extrag apa),
• introducerea unor solvenți organici (xilen, toluen) în care parafina este
miscibilă
 INCLUDEREA

Piesă
biopsie

https://www.leicabiosystems.com/pathologyleaders/an-introduction-to-specimen-preparation/
 SECȚIONAREA

• Blocul în care a fost inclus materialul biologic recoltat este

secționat în felii subțiri cu ajutorul unui dispozitiv special, numit
microtom
• Se obțin secțiuni de 5-10 µm, suficient de subțiri cât să permită
luminii să treacă prin ele, pentru a ajunge la sistemul de lentile al
microscopului și apoi la ochiul observatorului
 SECȚIONAREA

Microtom

Piesă
biopsie
Histology: a text and atlas: with correlated cell and molecular biology. Ross MH, https://www.leicabiosystems.com/pathologyleaders/an-introduction-to-specimen-preparation/
Pawlina W. 6th ed. 2011
 SECȚIONAREA

Microtom

Piesă
biopsie
Secţiune necolorată la microscop
https://www.leicabiosystems.com/pathologyleaders/an-introduction-to-specimen-preparation/
https://fankhauserblog.wordpress.com/1993/09/25/cells-the-functional-units-of-organisms/
CREȘTEREA CONTRASTULUI PRIN COLORARE

Preparat necolorat Preparat colorat

https://fankhauserblog.wordpress.com/1993/09/25/cells-the-functional-units-of-organisms/
 COLORAREA

• Etapă prin care se urmărește creșterea

contrastului între diferite componente
celulare / tisulare prin capacitatea
macromoleculelor din structura celulelor/
țesuturilor de a lega diferențiat coloranți

• Coloranții sunt de obicei acizi sau baze

• Coloranții acizi se leagă de un substrat acidofil (cu afinitate pentru o substanță
acidă; deci substratul va fi de natură bazică – are sarcini pozitive)
• Coloranții bazici se leagă de un substrat bazofil (cu afinitate pentru o
substanță bazică; deci substratul va fi de natură acidă – are sarcini negative)
 COLORAȚIA HEMALAUN-EOZINĂ (HE)

• Este cea mai frecvent utilizată colorație histologică; oferă informații

despre organizarea tisulară și morfologia celulelor, dar nu evidențiază
componente biochimice specifice
• Hemalaunul este un colorant bazic, deci se va lega de un substrat
bazofil, de natură acidă – ex. acizi nucleici; nucleul celular va fi colorat
în violet, datorită legării hemalaunului de ADN;
• Eozina este un colorant acid, deci se va lega de un substrat acidofil, de
natură bazică; citoplasma conține o proporție mare de proteine bazice
(au resturi de aminoacizi cu grupări funcționale bazice – ex. Lys), deci se
va colora de regulă în roz-roșu, prin legarea eozinei la aceste proteine
 COLORAȚIA HE – OBSERVAȚII

• În cărțile/publicațiile în limba engleză, veți întâlni denumirea „colorație

hematoxilină-eozină”; aceasta denotă aceeași colorație și este folosită
aceeași abreviere (HE sau H&E);
• hematoxilina este precursorul care trece printr-o serie de reacții chimice în urma
cărora rezultă hemalaunul
• N.B. acid≠acidofil, bazic≠bazofil
 COLORAȚIA HE – COLORANȚII

Hemalaun Eozină
 HEMALAUN - EOZINA

Celule epiteliale Corpi meuronali Celule musculare netede

din tubii renali si cellule satelite intestin

Histology: a text and atlas: with correlated cell and molecular biology /Michael H. Ross, Wojciech Pawlina. 6th ed. 2011
 COLORAȚIA HE
Nucleu bazofil Citoplasmă acidofilă Nucleu bazofil Citoplasmă acidofilă

Celule reticulare (de formă stelată) şi celule sangvine Celule musculare striate scheletice
 MONTAREA

Lamă

• Presupune acoperirea secțiunii

colorate cu mediu de montare și
apoi aplicarea lamelei de sticlă

Lamelă
 REZUMAT
• Un microscop optic este caracterizat prin putere de mărire și
putere de rezoluție
• Un preparat microscopic permanent este obținut printr-o
succesiune de etape: fixare, includere, secționare și colorare
• Colorarea unui preparat de MO crește contrastul dintre
componentele celulare.
• Structurile pot fi acidofile (cu afinitate pentru coloranți acizi) și
bazofile (cu afinitate pentru coloranți bazici)
 PRACTIC – REGULI DE FOLOSIRE A MO
• Selectați un obiectiv cu putere de mărire mică (4x, 10x)
• Lama se așază pe masa microscopului cu lamela în sus, înspre lentila
obiectivului și, cu ajutorul dispozitivului de deplasare a lamei, se aduce în
câmpul optic porțiunea din lamă care conține preparatul
• Se focalizează imaginea cu ajutorul macrovizei și, ulterior, al microvizei
• Când se dorește examinarea preparatului cu un obiectiv de mărire mai
mare, după schimbarea obiectivului ajustarea focalizării poate fi făcută doar
din microviză, dacă imaginea este clară la examinarea cu obiectivul cu
putere de mărire mai mică
• La obiectivul 40x și cele superioare, focalizarea nu se face niciodată cu
macroviza, pentru a nu risca spargerea lamelei și deteriorarea preparatului
MICROSCOPIA ELECTRONICĂ
 OBIECTIVELE LUCRĂRII PRACTICE
• Înțelegerea principiului de funcționare a microscopului electronic
şi cum ne ajută în studiul celulei

• Recunoaşterea unei imagini obţinute prin microscopie electronică

• Întelegerea principalelor diferenţe faţă de microscopul optic

• Descrierea tipurilor de microscoape electronice, precum şi a altor

tipuri de tehnici, înrudite cu microscopia, care permit obţinerea de
detalii până la nivel atomic
 Ochiul uman
0,1 mm OCHIUL UMAN
detectează lungimi
https://www.diag2tec.com/plasmos/
de undă între~ 400-
800 nm.
REZOLUȚIE

MO
0,2 μm
10 µm Microscopul optic
poate detecta o
lungime de unda de
200 nm.

2 µm Microscopul
electronic poate
ajunge la o
ME
rezolutie de 2pm
0,002 nm 10 nm
https://www.fei.com/image-gallery/80S-Ribosome/
 MICROSCOPUL ELECTRONIC

Folosește un fascicul de electroni în locul unui fascicul de lumină.

Studiul celulelor cu ajutorul ME a permis, în anii 1950-1970,
identificarea organizării celulelor și a organitelor celulare

Poate fi caracterizat folosindu-se aceiași parametri ca și pentru MO:

• Puterea de mărire → aproximativ 1.000.000 x
• Rezoluție ∼ 0,002 nm (variabilă dependentă de tensiunea de
accelerare a electronilor, de viteză acestora)
MICROSCOPUL ELECTRONIC - PRINCIPIU DE FUNCŢIONARE

• Formarea imaginii în ME depinde de interacțiunea electronilor din

flux cu nucleele și electronii atomilor din preparat (probă)
• Celulele și țesuturile nu au contrast, motiv pentru care se folosesc
pentru pregătirea probei săruri de metale grele, care se leagă
selectiv de diverse molecule (fosfolipide, proteine, etc) pentru a
crește contrastul în preparat
• Cu ajutorul microscopului electronic putem examina structuri
celulare de mici dimensiuni, denumite ultrastructuri (complexe
macromoleculare și organite)
 TRANSMISIE REFRACȚIE REFLEXIE

Interacțiunea
electronilor cu
proba
influențează
comportamentul DIFRACȚIE ABSORBȚIE ÎMPRĂȘTIERE

electronilor
 TIPURI DE MICROSCOAPE ELECTRONICE

• Microscop electronic de transmisie – detectează electronii

transmiși prin probă
• Furnizează detalii de rezoluție înaltă (∼ 0,2 nm)

• Microscop electronic de baleiaj (scanning) – detectează electroni

reflectați de probă
• Furnizează detalii ale suprafeței probei analizate ( ∼ 50 nm)
 PRINCIPIUL DE FUNCȚIONARE AL ME

ME constă dintr-un cilindru vidat în care sunt accelerați electronii

extrași dintr-un filament (de regulă de tungsten) prin aplicarea
unei tensiuni de accelerare de ordinul sutelor de mii de volți. O
serie de lentile opto-electronice focalizează fasciculul de
electroni care trece prin probă și este vizualizat pe un ecran
fluorescent sau este captat de un detector electronic.
MICROSCOPUL ELECTRONIC DE TRANSMISIE

FILAMENT –

Folosește un fascicul de electroni în locul unui

sursă de electroni

LENTILĂ
fascicul de lumină
CONDENSOR
Pentru focalizarea electronilor într-un fascicul
Secțiuni prin celule
pe o grilă (ø 3mm) coerent se folosesc lentile electromagnetice
LENTILĂ amplasate într-o incintă vidată
OBIECTIV

LENTILĂ
PROIECTOR Puterea de mărire și rezoluția sunt dependente
de viteza de accelerare a electronilor în incinta
Ecran fosforescent vidată a ME.
/Detector electronic
 MICROSCOPUL ELECTRONIC DE TRANSMISIE
Fasciculul de electroni, controlat de lentile
electromagnetice, trece printr-o felie foarte subţire
de ţesut
• electronii care trec („transmiși”) sunt proiectați
pe un ecran fluorescent (sau înregistrați de
camere digitale speciale), generând puncte
luminoase
• ultrastructurile celulare care au „respins”
electronii datorită nucleelor de metale grele
legați, vor crea umbre pe ecranul captator
 ETAPELE OBŢINERII PREPARATULUI PENTRU
ME DE TRANSMISIE CLASICĂ

MO
Recoltare (biopsie, necropsie)
Fixare (fizică, chimică)
Includere (parafină)
Secționare (microtom)
Montare (lamă, lamelă)
Colorare (coloranți)
ME
Recoltare (doar biopsie)
Fixare (fizică/chimică)
Includere (răşini epoxidice)
Secționare (ultramicrotom)
Montare (grilă de cupru)
Contrastare (săruri de metale grele)
 RECOLTAREA

• Biopsie – prelevare de țesut viu

• Culturi celulare
 FIXARE

• este obligatorie pentru ME (nu se pot examina celule vii)

• trebuie făcută înainte (în cultura celulară) sau imediat după
recoltarea țesutului prin biopsie
• trebuie făcută foarte rapid după recoltare - orice degradare
la nivel molecular/celular va fi redată de microscop
 FIXAREA

• FIZICĂ – prin înghețare rapidă - vitrificare (azot lichid, la - 190°C)

• CHIMICĂ
• Glutaraldehidă (timp de fixare rapid – 5 secunde, putere de
penetrare scăzută în țesut – 0,5mm)
• Tetraoxid de osmiu (OsO4) – numită postfixare, permite
conservarea fosfolipidelor (vizualizarea membranelor)
• aldehidele și agenții oxidanți (OsO4) acționează prin
formarea de legături covalente cu grupările funcționale ale
macromoleculor din celule/țesuturi
 INCLUDEREA

• Includerea încorporează piesa de țesut într-o materie solidă,

potrivită pentru a obține secțiuni cât mai subțiri (50-100 nm),
care pot fi examinate la microscop (electronii o pot străbate)
• Este precedată de deshidratare pentru a înlocui apa și a permite
materialului de includere, o rășină hidrofobă epoxidică, să
pătrundă în probă

Țesut
 SECȚIONAREA

• Secționarea se realizează cu un aparat special (ultramicrotom)

pentru a obține secțiuni subțiri de 0,04 – 0,1 µm

Piesa de țesut este inclusă în epon Secționarea se face la ultramicrotom Piesele se recoltează pe apa și apoi se montează pe o grilă
 SECȚIONAREA - CONTRASTARE

grilă
 CONTRASTAREA (ME)

• Este echivalentă colorării pentru MO; este necesară pentru a

putea discrimina diferite componente ale preparatului

• Se face cu săruri de metale grele (citrat de plumb, acetat de uranil,

etc), ale căror nuclee se leagă de anumite componente din
preparat, blocând trecerea electronilor

• Depunerea metalelor grele nu este specifică dar este

reproductibilă astfel încât creșterea contrastului se realizează
consecvent pe anumite structuri
 CONTRASTAREA (ME)

• secțiune necontrastată • secțiune contrastată

IMAGINILE DE
MICROSCOPIE
ELECTRONICĂ APAR
ÎN ALB, NEGRU ŞI
TONURI DE GRI
 INTERPRETAREA IMAGINILOR

• moleculele care leagă mulți

nuclei grei (de osmiu, uraniu,
plumb, fier ș.a.) vor produce
dispersia e- – zone
electronodense (întunecate)
• moleculele care nu leagă
nuclei grei vor permite
trecerea e- – zone
electronoclare
INTERPRETAREA IMAGINILOR
Imagine de MET a
unor celule
(încercuite cu
roșu, la putere de
mărire scăzută
(vezi scara de Cromatină condensată
mărire)

Nucleu
Detaliu al imaginii
precedente
(vezi scara de
mărire).
Insertul roșu este
Cromatină condensată
mărit în imaginea
următoare
Detaliu al unei
zone de Centriol
citoplasmă din
imaginea
precedentă. În
centru se
observă un
centriol
PUTERE MARE DE MĂRIRE
 ME – PUTERE MARE DE MĂRIRE

molecula de ADN

Pas de 2,4 nm al spiralei de ADN - A

Nano Lett., 2012, 12 (12), pp 6453–6458
 CONTRASTARE NEGATIVĂ
Contrastare pozitivă Contrastare negativă

• Contrastarea negativă se folsosește in

special pentru stucturi proteice (perete
celular, filamente, complexe
macromoleculare) peste care se adaugă
un volum foarte mic de soluție de
contrastare care se usucă. Electronii vor
trece prin structurile proteice care nu
leagă soluția de contrastare si vor fi
reflectați acolo unde ea se acumuleaza -
la marginea preparatului
 CONTRASTARE NEGATIVĂ

• Escherichia coli -
imagine MET obținută
prin contrastare
negativă

100 nm

E. coli negatively stained with 1% Uranyl acetate

Courtesy of Alexander Mironov
https://www.fei.com/image-gallery/
Taken by Tecnai microscope
 CONTRASTARE NEGATIVĂ

• Imagine MET obținută

prin contrastare
negativă a
filamentelor de actină

100 nm

Alberts B at al. Molecular biology of the cell / 6th ed. 2015

CONTRASTARE NEGATIVĂ

• Ce tehnică de microscopie
electronică a fost folosită pentru
a obține această imagine?
 CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE

Probele biologice aflate în soluție sunt puse direct pe o grilă și

scufundate în azot sau etan lichid. Se formează astfel o peliculă
de apă vitrificată (fără cristale) care conține proba. Aceste grile
sunt vizualizate în MET cu dispozitive speciale de menținere
constantă a temperaturii la -190⁰C.
Contrastul în aceste probe este scăzut fiind generat doar de
atomii componenți ai probelor biologice. Imaginile sunt
achiziționate automat și prelucrate și analizate cu ajutorul unor
softuri speciale.
Această tehnică a primit premiul Nobel pt Chimie in 2017
 CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE

• Probele biologice sunt

vitrificate direct pe grilă
și vizualizate în condiții
de temperatură scăzută
(-190°C) în MET

https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2017/press-release/
 CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE

ER - galben
cis C - verde
cis V - verde deschis
medial C - magenta
medial V - roz
trans C - albastru
trans V - albastru deschis
TGN - violet
Alte membrane și ribozomi - gri

eLife 2017;6:e32493 DOI: 10.7554/eLife.32493

 MICROSCOPIA ELECTRONICĂ DE BALEIAJ

• Oferă imagini tridimensionale ale

suprafețelor celulelor, țesuturilor, organisme
• Același principiu al interacțiunii unui fascicul REFLECTAȚI

de electroni cu o probă care trebuie (SEM)

acoperită cu un strat subțire metalic (pentru

stabilitate și contrast)
• Imaginea este formată de electronii reflectați
de pe suprafața preparatului și colectați de
un detector
 MICROSCOPIA ELECTRONICĂ DE BALEIAJ
Fire de păr

stereocili
Alberts B at al. Molecular biology of the cell.
6th ed. 2015

Cili și mivrovili
https://microscopy.stanford.edu/
http://www2.optics.rochester.edu/
 MICROSCOPIA ELECTRONICĂ DE BALEIAJ

• Celule nervoase crescute

în cultură
Courtesy of Dr. Mark McClendon , Northwestern University
Taken by Quanta SEM microscope
Magnification: 8,000X
Sample: Embryonic Nerve Cell
Detector: SE
Voltage: 3kV
Vacuum: 2 e-3Pa
Horizontal Field Width: 20um
Working Distance: 6
Spot: 3

https://www.fei.com/image-gallery/
 MICROSCOPIA ELECTRONICĂ DE BALEIAJ
organism microscopic din ape termale acarian colorat digital

https://www. fei.com
 ÎNGHEŢARE - FRACTURARE
• Permite vizualizarea suprafețelor rezultate prin clivajul
anumitor structuri (ex: clivajul membranei celulare)
• Se îngheață celulele
• Se introduc într-o cameră vidată și se lovesc cu un cuțit
• Celulele se fracturează in zonele hidrofobe (unde gheața nu s-a
format)
• Se realizează un mulaj metalic (Au, C) al suprafeței expuse în
urma clivajului – se realizează o replică a suprafeței
• Se examinează această replică metalică la MET
 ÎNGHEŢARE - FRACTURARE

TEHNICĂ REZULTAT

Startul extracelular

proteine Fața internă a stratului extracelular (fața E)

Cuțit

Membrana plasmatică Startul citoplasmatic

Fața externă a stratului citoplasmatic (fața P)

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/c8.7x4.freeze.fracture.jpg
PRINCIPII CONSTRUCTIVE
 COLORARE VS. CONTRASTARE
Colorarea MO Contrastarea ME
• Cu substanţe chimice, de obicei acizi
• Componentele celulare care leagă
sau baze
săruri de metale grele vor bloca
- Coloranţii acizi se leagă de substrat trecerea electronilor, apărând
acidofil (sarcini +) întunecate pe imagini
- Ex. EOZINĂ – un colorant roz, deci
substratul bazic care îl leagă va • Restul componentelor vor fi mai
apărea colorat în roz mult sau mai puţin permeabile
- Coloranţii bazici se leagă de substrat pentru fluxul de electroni, care vor
bazofil (sarcini -) traversa preparatul şi vor ajunge la
- Ex. HEMALAUN – un colorant violet, ecranul de captură, producând un
deci substratul acid care îl leagă va fi zone mai luminoase
colorat violet
 CARE SUNT NIVELURILE DE
DETALIERE ALE UNEI CELULE?
(MICRO ŞI NANO)
• MO oferă detalii despre forma generală a celulelor, nucleu şi câteva detalii
despre organite (folosind metode specifice).
• ME oferă detalii despre organite, membrana celulară sau moleculele
componente (până la nivel atomic)
• Putem “vedea” structura chimica a unei molecule?
- cristalografia cu raze X
- spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară
- microscopul de forță atomică (MFA) - măsoară interacțiunea dintre un
senzor și atomii din preparat
 Metode de vizualizare a (macro)moleculelor
Tehnică Rezultat Interpretare
Cristalografia cu raze X -model de difracție un model de structură terțiară/
cuaternară
(radiație
electromagnetică cu
lungime de undă 0,01-10
https://www.jic.ac.uk/staff
nm) /david-lawson/xtallog/ modelare bioinformatică
summary.htm

Spectroscopia de
rezonanță magnetică spectru de rezonanță
nucleară (radiație al atomilor de C, H sau al
electromagnetică în grupelor funcționale
domeniul undelor radio) https://www.exova.com/sectors/
pharmaceuticals/material-sciences-testing/
nmr-spectroscopy/

Microscopia de forță -”harta” interacțiunilor dintre atomii

moleculelor unei suprafețe și un scanner
atomică
www.creative-biolabs.com/drug-
discovery/therapeutics/atomic-force-
microscopy.htm
Microscopie optica Microscopie electronica
Secțiune de 1µm Secțiune de 100 nm
 MO ME
40x 5000x

www.intechopen.com
 MO ME
Ob. 20x 20.000x

http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html
 REZUMAT
• Pregătirea preparatului pentru MO şi ME (de transmisie) trece prin
etape asemănătoare
• Cu ajutorul MO putem vizualiza structura componentelor din
preparat - organizarea ţesuturilor în fragmentul de organ,
componente tisulare (ce permit identificarea tipului de ţesut), tipuri
celulare
• Cu ajutorul ME putem vizualiza ultrastructura componentelor din
preparat - detalii la nivel celular: organite celulare, organizarea
membranelor
• Există metode care ne permit identificarea atomilor și aranjamentul
lor în structuri terțiare/complexe macromoleculare
Anexa 1 CARACTERISTICĂ MICROSCOPUL MICROSCOPUL ELECTRONIC
OPTIC

Spectrul FOTONI ELECTRONI

electromagnetic
spectrul vizibil electroni
760 nm ÷ 390 nm ~ 0,004 nm

Lentile (sisteme de modulare a sticlă electromagnetice

undelor)

Puterea de rezoluție 0,2 µm (200 nm) 0,002 nm (2pm)

Puterea de mărire maximă x 2.000 x 10.000.000

Imaginea este produsă de o sursă de lumină albă / UV / LASER sursă de electroni

sursă de radiații

Mediul de examinare aer vid

Proiecția imaginii directă indirectă

ochiul uman / film fotografic / ecran fluorescent / film
camere video de înaltă rezoluție /camere video de înaltă
rezoluție

Imagini colorate de cele mai multe ori nu

CARACTERISTICĂ MICROSCOPUL OPTIC MICROSCOPUL
ELECTRONIC

Preparatul celule fixate sau vii doar celule fixate

examinat

Fixarea diverse substanțe Glutaraldehidă

(uzual formaldehidă) OsO4
* *

crio-fixare crio-fixare

Includere parafină / înghețare rășini (plastic) / vitrificare

(consitență)

Grosimea secțiunii ~ 5 µm ~ 50 nm

Obținerea coloranți / fluorocromi metale grele

contrastului

Suport pentru lama de sticlă grilă de cupru

preparat
Anticorpii – instrumente
folosite în investigarea
celulelor
 În lucrarea practică de azi vom învăța

• Ce sunt anticorpii
• Cum sunt utilizați ca terapie biologică
• Ce înseamnă imunomarcare și care este rolul ei
• Care sunt tehnicile de cercetare și cele din
practica medicală care folosesc anticorpi
 Anticorpi : Definiţie
• ANTICORP – O proteină în forma
literei Y, produsă de limfocitele B
ca răspuns la un stimul antigenic
(bacterian, viral sau orice altă
proteină străină), ce Situs de legare a
antigenului
neutralizează antigenul legându-
se specific de el; o
imunoglobulină.

N.B. Antigen – orice proteină sau

peptidă non-self capabilă să
stimuleze producerea de anticorpi
 Terminologie

Antigen în cercetare înseamnă o proteină de interes

pe care o identificăm cu ajutorul anticorpilor
specifici

Atât antigenul cât și anticorpul pot fi proteine, dar

provenind de la specii diferite

De ex: O proteină umană este antigenică (poate să

genereze un răspuns imun) pentru altă specie (de
ex: şoarece)
Anticorpi : structura generală
Situs de legare a
antigenului

1
1. Regiunea Fab
4 2. Regiunea Fc
3. Lanţ greu
4. Lanţ uşor
3

2
 Anticorpii în cercetarea biomedicală

• În cercetare, exploatăm afinitatea mare a

anticorpilor pentru substratul specific (de obicei,
dar nu exclusiv, o proteină), pentru a identifica
prezenţa unei anumite molecule (ex. un receptor
celular, o proteină virală) într-un produs biologic.

Doar o parte a proteinei (numită EPITOP) este

responsabilă (și necesară) pentru generarea de
anticorpi
Anticorpii în cercetarea biomedicală

Purificarea proteinelor umane (vezi metode în lp 10)

a permis generarea de anticorpi specifici pentru
proteina respectivă, prin injectarea ei la un animal
de laborator.

Anticorpii cu cea mai mare specificitate de substrat

și cel mai bun răspuns biologic sunt cei
”monoclonali” și sunt folosiți și în practica medicală
ca terapii biologice
 Anticorpii în clinică

Terapiile biologice cu anticorpi monoclonali folosesc

anticorpi numiți ”umanizați” (humanized
monoclonal antibodies):
• Fab provine de la șoareci/șobolani de laborator,
în care s-a injectat proteina țintă
• Fc este cât mai asemănător structurilor primară,
secundară și terțiară ale anticorpilor umani,
pentru a preveni generarea de răspuns imun al
pacientului împotriva terapiei
 Anticorpii în clinică
Medicamentele moleculare care sunt anticorpi
monoclonali se termină in ”-mab” (monoclonal antibody)
(de ex: adalimumab, bevacizumab ș.a.)
- Patologiile adresate cel mai frecvent prin astfel de
terapii sunt:
- inflamatorii cronice (artită reumatoidă, boală
Crohn)
- ținta: proteine de reacție inflamatorie (de ex:
TNFα)
- onocologie - proteine țintă: receptori prin a căror
blocare se întrerupe un semnal de proliferare
 Anticorpii în biologia celulară

Pentru a genera o terapie moleculară este nevoie

de 10-15 ani de testări în cercetarea pre-clinică:
modele in vitro și in vivo (modele animale) (Lp12).

Biologia celulară folosește frecvent anticorpi

pentru:
• identificarea prezenței unei proteine
• studii de localizare celulară/tisulară
• (semi)cuantificare
 Metode de biologie celulară pe bază de
anticorpi
• Microscopie (imunohistochimie – IHC,
imunofluorescenţă, imunoelectronomicroscopie)

• Citometrie în flux și sortarea populaţiilor celulare

(FACS – fluorescence-activated cell sorting, MACS –
magnetic-activated cell sorting)

• Metode de cercetare și diagnostic (IHC, determinarea

grupelor de sânge – ABO, teste ELISA – enzyme-linked
immunosorbent assay, western blot)
 Imunomarcarea

Ca și cu alte metode studiate până acum, se pune

problema vizualizării rezultatului.

Pentru a vizualiza legarea antigenului de anticorp

trebuie ca:
1- anticorpul să fie legat de un marcaj vizualizabil
(colorat, fluorescent) = imunomarcare
2- să existe o cantitate suficientă de perechi
antigen-anticorp care să genereze un semnal vizibil
 Imunomarcarea

• Include toate tehnicile ce utilizează anticorpi

marcați pentru localizarea antigenelor
corespondente
• În preparate tisulare
• Criosecţiuni
• Secţiuni incluse în parafină
• În culturi celulare
• În alte probe biologice (ex. sânge periferic)
 Imunomarcarea

• Imunomarcarea în microscopia optică (în funcţie de

marcaj)

• Imunohistochimie

• Imunofluorescenţă

• Imunomarcarea în microscopia electronică

• Imunoelectronomicroscopie
 Principiul metodei

• Interacţiuni specifice între antigen (Ag) şi anticorp (Ac)

• Ac sunt cuplaţi cu un sistem de detecţie:

- Enzimă ce acţionează asupra unui substrat ce va fi
transformat în compus colorat
(IMUNOHISTOCHIMIE); vizualizare în microscopia
optică
- Molecule fluorescente vizualizate la microscopul de
fluorescenţă (IMUNOFLUORESCENŢĂ).
Imunohistochimie

ENZIMĂ SUBSTRAT

http://www.ihcworld.com/products/ihc-detection-system/Chromogen.htm
BCIP/NBT

DAB+ kit
 Imunohistochimia în practica medicală

Este una din principalele metode ale diagnosticului

anatomopatologic.

Utilitate:
- diagnostic (identificarea tipului de tumoră în
funcție de anumiți markeri/proteine)
- identificarea originii unei tumori în funcție de tipul
de proteină din filamente intermediare
- determinarea agresivității unei tumori, prin
detecția unor proteine implicate în diviziune
celulară
 Comparație între o secțiune HE și o imunohistochimie
pentru Ki67 - marker de proliferare celulară

Roychowdhury, M. Ki67. PathologyOutlines.com website.

http://www.pathologyoutlines.com/topic/stainski67.html.
 Imunofluorescenţa

• Foloseşte anticorpi marcaţi cu fluorocromi

Fluorocrom (fluorofor) – o moleculă capabilă de a

emite fluorescenţă; când este excitată de lumină
cu o anumită lungime de undă, va emite o radiaţie
electromagnetică cu o lungime de undă mai mare,
în spectrul vizibil
 Spectrul electromagnetic

Energie (eV)

3,1 eV 1,77 eV
 Spectrul electromagnetic

• Radiația electromagnetică este purtătoare de

energie. Această energie crește cu frecvența și
este invers proporțională cu lungimea de undă.
Lumina vizibilă corespunde fotonilor cu energie
cuprinsă între 1,77 eV (corespunzătoare la λ=700
nm) și 3,1 eV (λ=400 nm). Razele X, care sunt
nocive în cantitate mare, ajung la aproape 2500
eV, iar razele gamma, care sunt letale, la aprox
8 000 000 eV (8MeV)
 Tipuri de microscopie de fluorescență

Microscop cu Microscop de
câmp larg Microscop confocal superrezoluție

d*= 250 nm d= 200 nm d= 50 nm

*d – cea mai mică distanţă la care două puncte pot fi observate distincte şi nu suprapuse;
este invers proporţională cu rezoluţia unui sistem optic
Exemple de imagini de microscopie de fluorescență-
același anticorp, aceeași cultură celulară

M. cu camp larg M. confocal

Desmină
SMA - smooth muscle actin
 Imunoelectronomicroscopie

- Tehnică utilă în detecţia şi localizarea foarte precisă

a proteinelor în diferite compartimente celulare,
datorită puterii de mărire şi rezoluţiei înalte

- Foloseşte anticorpi adsorbiţi pe particule de aur (5-

30 nm) sau conjugate cu enzime
Granule de secreţie
ce conţin prolactină
 Folosirea anticorpilor în metode de
diagnostic
• ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay
(anticorpul utilizat este conjugat cu o enzimă)

• pentru detectarea proteinelor (ex. biomarkeri

pentru cancer, hormoni)

• pentru detectarea unui răspuns imun (ex.

detecţia anticorpilor împotriva unui anumit virus)
 ELISA - Principiu

Este o reacție Ag-Ac marcat enzimatic, în care

cantitatea de Ag se poate cuantifica prin
intensitatea culorii generate din reacția enzimatică.

triplicate
de probe

control
negativ
 Blotarea (Western blot) - Principiu
• Metoda prin care se identifică o proteină de o
anumită masă moleculară, separată prin SDS
PAGE dintr-un amestec, folosind un anticorp
specific.

29
 Western blot
semnal absent:
proteina nu se
sintetizează
sau este atât de puțină
încât e sub limita de
detecție

proteină
supraexprimată, care
se poate
semicuantifica prin
raportarea intensității Control pozitiv
semanlului la cel al
actinei corespondente
 Determinarea grupelor
de sânge ABO
• Eritrocitele au pe suprafaţa lor antigene pentru
grupele de sânge (A, B, AB dacă ambele antigene
sunt prezente, 0 dacă niciun antigen nu este
prezent)

• Legarea de anticorpi specifici va duce la

hemaglutinare şi hemoliză
 Hemaglutinare la determinarea
grupelor de sânge ABO
Anti-A Anti-B Anti-A şi B

Grupa 0

Grupa A

Grupa B
www.safetransfusionmanual.org
 Imunofenotiparea

Identificarea unui tip celular pe baza unei proteine/

unui set de proteine specifice
- de regulă, aceste proteine sunt membranare
(expuse la suprafaţa celulei şi uşor accesibile
anticorpilor specifici, pentru identificare)

Această metodă este utilă pentru identificarea acelor

tipuri celulare care nu au un fenotip morfologic
distinct (de ex: celulele stem, tipuri limfocitare)
 Imunofenotipare limfocitară

Incubarea sângelui cu anticorpi marcați cu

fluorocromi, care au ca țintă proteine specifice
de pe suprafața limfocitelor.
- unele dintre aceste proteine sunt notate cu
indicativul CD (cluster of differentiation): CD4,
CD8 s.a.m.d.

Aplicaţie clinică:
evaluarea numerică și procentuală a principalelor
subseturi limfocitare - T, B şi NK.
 Imunofenotiparea prin citometrie în flux
(CF)
• CF măsoară şi ulterior analizează anumite
proprietăţi fizice şi chimice ale unor celule pe
măsură ce acestea trec individual, în flux, prin
dreptul unui fascicul laser.

• Avantajul principal al CF: capacitatea de

analiză a unui număr relativ mare de
parametri (20) pentru un număr mare/foarte
mare de particule (106), într-un timp relativ
scurt (zeci de secunde – minute).
 CF - Principiul de funcționare

La trecerea prin dreptul razei laser, lumina este dispersată de

particule în toate direcțiile în funcție de indicele de refracție, de
mărimea și complexitatea celulei
dispersie laterală ( side scatter =SS, SSC)

rază de
excitație

dispersie anterioară (forward scatter=FS, FSC)

Dispersia luminii – trombocite, limfocite
Dispersia luminii – monocite, granulocite
 Mărimea aproximativă a celulelor (micrometri)

Dimensiunile sunt date cu titlu informativ, gama în care variază poate fi mai mare.
Eritrocitele (eliminate în mod uzual prin hemoliză) prezintă o distribuție mare
pe FSC datorită formei de lentile biconcave, care conduce la o diversitate mare
a secțiunilor de la nivelul punctului de interogare (intersecția cu raza laser).
Fenotiparea celulară folosind citometria în
flux
Dacă nu se poate
apela la marcarea
fluorescentă, simpla
trecere a celulelor
prin analizor poate
indica principalele
populații celulare
sangvine, pe baza
dimensiunilor și
granularității lor
 Markeri de suprafață folosiți în
fenotiparea limfocitară

Limfocite Limfocite B Limfocite T Limfocite T Limfocite NK

T helper/inducer supresor/citotoxic

CD3+ CD3-CD19+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD3-(CD16+)

CD56+CD8-/low

CD - cluster of differentiation= proteine exprimate pe

suprafața celulelor, caracteristice unei anumite
populații
 Utilizarea anticorpilor în sortarea
populaţiilor celulare
• Prezenţa antigenelor specifice pe suprafaţa
populaţiilor celulare permite separarea lor dintr-
un amestec de celule (ex. obținerea unei culturi
celulare pure sau izolarea celulelor stem
hematopoietice din sângele ombilical)

• Fluorescence-activated cell sorting (FACS)

• Magnetic-activated cell sorting (MACS)
Fluorescence-activated cell sorting

Laser

- +
- +

Celule fără Celule

fluorescenţă fluorescente
Magnetic-activated cell sorting
Nanoparticule magnetice
 Rezumat

• Interacţiunea Ag-Ac are un grad înalt de specificitate

• Ac sunt utili în identificarea proteinelor

(extra)celulare, separarea populaţiilor celulare

• Ac sunt folosiţi în cercetare ca unelte de diagnostic

şi în clinică drept terapie biologică

• Metodele de detecţie folosesc cel mai frecvent

fluorocromi sau reacţii enzimatice de culoare
 Metode de biologie moleculară
Metode de studiu al acizilor nucleici
 Metode de biologie moleculară
- Sunt metode de manipulare și studiu ale principalelor
categoriilor de molecule care compun o celulă: acizi nucleici,
proteine, lipide.
Presupun distrugerea (lizarea) celulelor studiate și separarea
moleculelor de interes în vederea studierii lor.
 Metode de biologie moleculară
Materialul biologic de pornire:
- Celule provenind de la pacient (sanguine, din biopsii, raclaje,
aspirate)
- Ser, plasmă, lichid cefalorahidian, lacrimi, urină, alte produse
biologice
- Fragmente de organ/tumori
- Culturi celulare, mediu de cultură provenit din culturi
(supernatant)
 Metode de biologie moleculară
În funcție de molecula de interes, materialul biologic
trebuie prelevat și stocat în soluții speciale, de aceea
este recomandată prelevarea probei în recipiente
furnizate de laboratorul care va lucra probele!
 Clasificarea metodelor de biologie
celulară
În funcţie de tipul de rezultat
• Metode calitative: evidenţiază prezenţa unei molecule într-o probă
(ţesut, cultură celulară)
• Metode semi-cantitative: exprimă rezultatele ca valori relative
raportate la un control
• Metode cantitative: pot cuantifica nivelul unei molecule într-un
amestec/produs biologic (ser); rezultatul este raportat in μg/ml,
ng/ml samdv
 Clasificarea metodelor de biologie
celulară
În funcţie de momentul înregistrării rezultatului:
• Metode statice: studiul unui parametru se face la momente
discrete de timp (t0, t+1h etc) si de obicei implică oprirea
procesului studiat pentru observarea rezultatului (stop-cadru)
• Metode în timp real: studiul unui parametru la momente
succesive de timp, pe acelaşi sistem de studiu (de exemplu, în
aceeaşi cultură celulară)
• Oferă informaţii legate de dinamica unui proces (durata reală,
dar şi momentul de maximă activare, maxim efect etc)
Principiile de funcţionare ale metodelor de
biologie moleculară
• Toate metodele se bazează pe interacţiuni specifice, ca de
exemplu:
• Legarea specifică a nucleotidelor (A-T/U, C-G) (hibridizare)
• Enzimă - substrat
• Antigen - anticorp

Dar pentru că ele au loc la nivel molecular, ne sunt utile doar

dacă pot fi vizualizate cu un microscop/detectori/camere sau
transformate în date cuantificabile cu ajutorul unor softuri
Reacție de culoare Fluorescență
 Principiile de funcţionare ale metodelor
de biologie moleculară
• Vizualizarea rezultatelor dintre interacţiunile
unor molecule necesită atingerea unui prag
minim de rezoluţie – suficiente molecule trebuie
să fie implicate în proces, pentru ca schimbarea
pe care o produce interacţiunea lor (frecvent una
de culoare sau intensitate de fluorescenţă) să fie
vizibilă
 Vizualizarea rezultatelor
In fluorescenţă nu vedem o moleculă de fluorocrom, ci multe
molecule la un loc, care ating o anumită intensitate a
luminozităţii, perceptibilă de ochiul uman
• uneori apelăm la amplificarea (multiplicarea) moleculei ţintă
• putem depăşi această limitare anatomică folosind detectori
de luminiscenţă, care să transforme intensitatea semnalului
într-un semnal grafic
Reprezentarea grafică a creşterii intensităţii
unor semnale de fluorescenţă în timp
 Metode de biologie moleculară

• Majoritatea metodelor necesită liza (distrugerea)

celulelor şi extragerea moleculelor de interes
(proteine, acizi nucleici)

- Uneori se doreşte păstrarea intactă a organitelor

- celula se poate sparge și separa pe fracțiuni cu
densități diferite - fracționare celulară
 Caracteristicile unui test
Sensibilitate - acuratețea cu care un test poate detecta un
parametru - de ex. 97% sensibilitate a unui test diagnostic = 97 de
pacienți diagnosticați din 100 de bolnavi

Specificitate - acuratețea cu care un test poate detecta cazurile

negative - de exemplu, 67% specificitate înseamnă că din 100 de
persoane sănătoase 67 vor fi diagnosticate corect, iar 33 vor fi fals
pozitive
Noţiuni de bază în biologia acizilor nucleici
• Molecula de ADN eukariotic este un dublu helix format din două
catene complementare de nucleotide (numite primă şi
complementară); cea de-a doua catenă poate fi generată în
laborator prin revers-sinteză pe baza primeia, folosită ca matrice.
• De exemplu, pentru o catenă primă formată din 4
nucleotide(ACTG), secvenţa catenei reverse este CAGT.
 Noţiuni de bază în biologia acizilor nucleici
Catena primă • Citirea începe de la
capătul 3’ al catenei prime
şi de la capătul 5’ al
Catena complementară
catenei complementare,
denumite astfel în funcție
de poziția grupării hidroxil
din zaharid care este
liberă la capătul catenei

Molecular Biology of the Cell, Alberts et al. 5 th ed

 Noţiuni de bază în biologia acizilor nucleici
Dogma centrală a biologiei celulare
ADN

Transcriere

ADNcomplementar
reverstranscriere
ARNm

Traducere Polipeptid

https://www.khanacademy.org/science/biology/gene-expression-central-dogma/transcription-of-dna-into-rna/a/overview-of-transcription
 Principiul de functionare al metodelor de
studiul al acizilor nucleici
Metodele de biologie moleculară se bazează în marea lor
majoritate pe tendința normală a secvențelor complementare de
a se lega una de cealaltă
= hibridizarea fragmentelor pereche ( de ex: ACTG la CAGT).

Aceasta presupune că adaugarea unor fragmente ACTG marcate

cu fluorocromi într-un amestec de fragmente de ADN, va duce la
legarea lor de toate secvențele complementare CAGT
 Principiul de functionare al metodelor de
studiul al acizilor nucleici
În funcție de informația oferită, aceste metode sunt
de mai multe tipuri:
- Care detectează in sistemul de lucru/pacient o
secvența deja cunoscută (de exemplu o mutație)
- Care determină o secvență de nucleotide
necunoscută anterior
- Care determină o modificare la nivel cromozomial
 Metode de biologie celulară în studiul
acizilor nucleici
Putem studia:
Modificări ale materialului genetic propriu
- Polimorfisme genice, Mutatii punctiforme: secventiere, PCR,
array
- Deleții, translocații, amplificări genice: PCR, electroforeza, FISH
- Deleții, translocații ale unor segmente cromozomiale: CGH
- Putem identifica secventa de nucleotide a unor fragmente de
ADN/ARN - secvențiere
- Expresia genică - nivelul de ARNm : qPCR, array
 Metode de biologie celulară în studiul
acizilor nucleici
• Prezența unor organisme străine și tipul acestora ( virusuri,
bacterii, inclusiv detectarea unor tulpini patogene)- PCR

• ADN fetal izolat din sângele matern -PCR

• ADN liber, circulant -PCR

Reacţie de amplificare în lanţ sau PCR
(POLYMERASE CHAIN REACTION)
• Metodă folosită pentru obţinerea unui număr de copii ale unei
gene, suficient de mare cât să lege un număr de molecule
fluorescente de marcaj

• Secvența genei trebuie cunoscută dinainte pentru a putea folosi

PCR, deoarece reacția de multiplicare este inițiată de primeri -
oligonucleotide sintetizate pe comandă, de la caz la caz,
adaugate în mediul de reacție

21
 PCR
https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo

• Vizualizarea rezultatului PCR se face prin electroforeză

 PCR – Aplicaţii practice
• Identificarea unei mutaţii, folosind primeri specifici,
complementari cu secvenţa mutată
• Identificarea unei alele modificate prin deleţii, adiţii
• Detectarea de ADN viral/bacterian pentru:
• Diagnosticul unei infecţii
• Evaluarea eficacităţii unei terapii
 Rezultatul reacției de PCR
- Cantitativ: nr de copii ale genei detectate
- De ex: pentru detecția unor virusuri,
rezultatul se traduce în nr copii virale/ml
sange -încărcătură virală

- Calitativ: detectarea unei deleții/adiții - pentru

vizualizarea rezultatului se face electroforeză
 Electroforeza
• Metodă de separare a unor molecule dintr-un amestec, într-un
câmp electric

• Sarcina electrică a acizilor nucleici este (-), iar separarea lor se face
în funcţie dimensiunea fragmentului analizat, dată practic de
numărul de perechi de baze care îl formează (bp sau kilo bp – kbp)

• Vizualizarea se face prin adăugarea unei substanțe fluorescente

care se leagă de ADN dublu catenar
 Electroforeza acizilor nucleici
Creşte nr de perechi

Standard
de baze
Exemplu: diagnosticul unei mutații la
pacienţi cu policitemia vera
 qPCR (quantitative PCR)
- Metodă de măsurare a expresiei genice, adică a unui
anumit ARNm dintr-o probă
- Ilustrează gradul de activare a genei pe baza căreia
se sintetizează ARNm

Principiu: este un PCR precedat de o etapă preliminară

de reverstranscriere a ARN în ADNcomplementar
(ADNc) pe baza căruia va avea loc ulterior amplificarea

28
Proba al cărui semnal de fluorescenţa apare primul,
are cea mai mare cantitate de ARNm la iniţierea reacţiei

A 2a probă ca abundenţă

Nr de cicluri de amplificare necesare obţinerii unei cantităţi suficente

de probă fluorescentă
 Microarrays
• Techică folosită pentru studierea multor
gene la un loc (sute), toate provenind
din acelaşi specimen

• Folosită atât pentru studiul genelor

(ADN) cât şi a transcriptelor lor (ARNm)
 Microarrays
https://www.youtube.com/watch?v=yzBVOCwRanI

Microarray – înșiruire ordonată

 Microarrays

Utilitate:
• Detectarea unor mutaţii deja
caracterizate, în probele de la un lot de
pacienți, de exemplu - pe cip sunt
înşiruite secvenţe oligonucleotidice cu
diverse mutaţii ale genei de interes
 Secvenţierea genică

Metodă de identificare a secvenţei de nucleotide într-

o genă sau fragment de ADN
- Utilă în identificarea mutaţiilor noi, necunoscute
anterior
- Metoda actuală se numeşte “Next generation
sequencing” - NGS
- Prima metodă de secvențiere – metoda Sanger
 Secvenţierea genică

• Principiu: adăugarea de nucleotide

marcate cu fluorocromi (fiecare
nucleotidă A, T, C, G cu fluorocromul ei)
şi sintetizarea catenei complementare pe
baza unei secvenţe necunoscute.
Succesiunea culorilor fluorocromilor în
ADNul dc va oferi secvenţa iniţială
 Interacţiunea specifică a nucleotidelor

• Pentru vizualizare, se marchează nucleotidele cu fluorocromi și se

adaugă în mediul de reacție
•A- se leagă de T
•T se leagă de A
•C se leagă de G
•G- se leagă de C
 Interacţiunea specifică a nucleotidelor

• ? ? ? ? ? ?
Nucleotide marcate fluorescent
 Hibridizarea in situ
• Metodă prin care se detectează localizarea unei gene/secvenţe
ADN pe cromozomi

• Principiu:
• Se folosesc sonde (secvenţe scurte de ADN complementare
unei părţi din secvenţa ţintă) marcate fluorescent
Se folosește pentru diagnosticul unor modificări deja cunoscute
din literatură ca fiind asociate unor boli
 FISH pe cromozomi in metafaza cu
sonde fluorescente specifice de locus
- Un marcaj fluorescent verde de
cromozom (în acest caz, cz 22)
- Un marcaj roșu pentru secvenţa
de interes
Distribuţie normală presupune:
- Prezenţa a două marcaje de
interes
(pentru fiecare alelă) asociate
sondei specifice cromozomului pe
 Transfecţii și infecții
• Introducerea în celulă de material genetic folosind plasmide
bacteriene, respectiv virusuri
• Folosite în practica medicală pentru producerea proteinelor
recombinante utilizate în terapiile biologice (insulina,
eritropoietina) sau pentru terapii genice (cu ajutorul virusurilor)
• culturi bacteriene sunt transfectate cu plasmide conținând
gena proteinei de interes, iar bacteriile vor produce proteina
umană cu propriul aparat de sinteză și o vor elibera în mediu,
de unde va fi purificată ulterior
 Terapia genică
• Metodă de introducere a unor gene într-un organism, pentru
corectarea unui defect (o deleție sau suplimentarea unei gene
inactive)
• Folosește drept curier de livrare a genei virusuri care pătrund în
celulă și se inserează în genom
• Cel mai frecvent folosit este AAV - adeno-associated virus

Este încă la nivel experimental, deoarece nu se poate controla

locul de inserție al virusului în genom și distribuția lui la nivel
tisular (practic ajunge în tot organismul, nu doar în țesutul bolnav)
https://learn.genetics.utah.edu/content/genetherapy/success/
 Editarea genică

• Metodă prin care se poate modifica o secvenţă ADN din genomul

celulei: eliminarea unei secvenţe, adăugarea alteia sau modificarea
punctiformă a unei secvenţe
• Principiu:
O enzimă, (Cas9) capabilă să taie ADN dc, va fi direcționată cu
ajutorul unei secvenţe complementare, către gena de interes.
Odată legată, ea va exciza gena de interes.
Celula va folosi propriile mecanisme şi enzime să repare defectul
(capetele libere care rezultă din tăiere)
 Secvenţa ARN ghid
DNAza cas9
ADN ţintă

Deschiderea Acţiunea DNAzei

dublului helix

Crearea
unor capete
libere
 Editarea genică
• Metode de exploatare:
• Folosind două enzime, care taie ambele capete ale secvenţei
de ADN de interes, vom mima o deleţie
• Putem să taiem lanţul dublu catenar pentru a insera o genă de
interes
• Avantaj faţă de transfecții și terapie genică virală: controlul
asupra zonei de inserare a noii gene
Aplicaţii în terapia genică, în special pentru acele patologii
caracterizate de deleţii
Metode de biologie moleculară
Metode de studiu al proteinelor
 În lucrarea practică de azi vom învăța

• Noțiuni de bază referitoare la structura și

funcționarea proteinelor
• Să corelăm informațiile oferite de analiza genelor
cu impactul asupra proteinelor codificate de
acestea în contextul funcției lor biologice,
celulare
• Care sunt câteva dinte metodele de studiu al
proteinelor și ce fel de informații ne oferă ele
Metode de biologie moleculară pentru studiul
celulei
Reprezintă metode de cercetare fundamentală, care
investighează comportamentul celular în relaţie cu
expresia sau activarea uneia sau mai multor molecule
 Noțiuni de bază în biologia proteinelor

• Celula se bazează în mare măsură pe proteine

pentru:
• efectuarea unor acțiuni (de ex: diviziune -
proteine de ciclu celular, migrare, trafic
intracelular - proteine motor)
• comunicare (de ex: receptori)
• metabolism (de ex: enzime).
 Fenotipul celular în relație cu fenotipul
proteic
Fenotipul morfologic celular, pe care îl putem studia
la microscop, este o consecință a specializării
celulei.
Această specializare este susținută de fenotipul
proteic -combinația specifică de proteine produse
de o celulă.
de ex: platoul striat de la polul apical al enterocitelor (celulelor
din mucoasa intestinului subțire) este o adaptare morfologică
(formarea de microvili) menită să acomodeze cât mai multe
proteine transmembranare transportor pentru nutrienți
(aminoacizi, monozaharide)
 Corelație genotip-fenotip proteic

Toate celulele unui organism au, teoretic, același

material genetic, provenit de la ovocitul fecundat.

Conform dogmei biologiei celulare, informația

genetică este exprimată în ARNm care este tradus în
proteine.

Acest flux de informație poate fi pornit sau oprit

pentru o anumită genă, într-un anumit moment al
vieții celulei, prin împachetarea cromatinei sau
interferențe ARN
 Corelație genotip-fenotip proteic

Într-un organism multicelular, unele celule au o

anumită combinație de gene active, spre deosebire
de altele, de unde și specializările lor diferite
 Corelații genă-proteină

• Unele dintre modificările constatate în cazul

studierii proteinelor au la bază mutații genetice.

• Există și mutații genetice fără impact asupra

expresiei/funcției proteinei pe care o codifică

• Se poate ca atât mutația, cât și proteina

modificată să nu influențeze efectul biologic

Pentru a putea transfera în clinică un rezultat de

cercetare, trebuie urmărit efectul biologic!
 Noțiuni de bază în biologia proteinelor

• Proteinele sunt lanțuri de aminoacizi, organizați

structural pe mai multe planuri: primar, secundar,
terțiar, cuaternar
• primar: ordinea aminoacizilor în lanţul polipeptidic
• secundar: lanțuri α și pliuri β
• terțiar: mai multe structuri secundare sunt
conectate spațial în motive structurale, unite prin
regiuni de tranziție
• cuaternar: mai multe structuri terțiare sunt
asamblate in di-tri-...n-meri, eventual cu grupări
prostetice adapate funcței proteinei
 Noțiuni de bază în biologia proteinelor

Exemple de domenii și motive ale structurii terțiare:

buzunarul enzimatic motiv de legare de ADN
(factori de transcriere)

Controlul
transcrierii

secvenţa de
legare de ADN
Front. Bioeng. Biotechnol., 13 October 2015 | Garland Publishing Inc.
https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00161
 Noțiuni de bază în biologia proteinelor
Buzunarul enzimatic (în centrul imaginii )are o zonă de acomodare a
substratului și o zonă catalitică, în imediata vecinătate

Primul domeniu implicat în formarea

buzunarului enzimatic este format din
mai multe alfa elice, unite prin lanțuri
oligopeptidice nestructurate

Al doilea domeniu este format din mai

multe alfa elice, care înconjură o
structură de betapliu; în mijloc se
observă domeniul catalitic, ilustrat cu
https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00161
ajutorul unor sfere colorate
 Aplicații clinice

Captoprilul a fost primul medicament obținut pe

baza informațiilor oferite,între altele și de structura
3D a unei enzime (enzima de conversie a
angiotensinei).

• O clasă de enzime intens studiate în prezent,

datorită implicării lor în cancer sunt kinazele -
enzime caracterizate prin prezența unui buzunar
în care leagă ATP-ul pentru a-l folosi la fosforilarea
(adăugarea unei grupări fosfat) substratului
 Aplicații clinice

• Blocarea acestui buzunar cu o moleculă sintetică

de dimensiuni foarte mici stă la baza unei noi
categorii de medicamente administrate în
diverse tipuri de cancere - inhibitori de kinaze
• de ex: vemurafenib pentru melanomul malign
 Noțiuni de bază în biologia proteinelor
Motivul bazic de legare de ADN ”elice-buclă-elice” are mai multe
regiuni structurate pe alfa elice: regiunea de dimerizare (mov) și
regiunea de legare de ADN (verde), formată predominant din
aminoacizi bazici

buclă

helix

https://www.nature.com/scitable/content/common-dna-binding-motifs-109024850
 Noțiuni de bază în biologia proteinelor

• Efectele biologice induse de proteine au la bază:

• modificări ale structurii terțiare/cuaternare (de ex: flectarea
capului miozinei în contracția musculară,
închiderea/deschiderea unui canal ionic sau a unui buzunar
enzimatic, cu expunerea lui pentru substrat

• relocalizarea proteinei (de ex: translocarea GLUT din sistemul

endozomal la membrana celulară sub acțiunea semnalizării
insulinei)

• mici modificări posttranslaționale tranzitorii

• adăugare de grupări funcționale: fosfat (fosforilări), metil
(metilări), acetil (acetilări)
 Studiul proteinelor în biologia celulară

Deoarece proteinele sunt responsabile de foarte multe

efecte biologice, ne interesează dacă:
• o proteină este prezentă/exprimată într-o
celulă/produs biologic (metode calitative)
• o proteină este supra/subexprimată față de normal
în condiții patologice (metode semi-/ cantitative)
• o proteină este activată în anumite condiții
• o proteină este localizată într-un anumit
compartiment celular, eventual co-localizată cu alte
proteine
 Metode de studiu al proteinelor

• Metode de separare și purificare

• Metode de caracterizare a structurilor (primare,
terțiare, cuaternare)
• Metode de identificare
• bazate pe caracteristici fizico-chimice (masă, sarcină
electrică)
• bazate pe anticorpi (mai multe detalii în Lp 11 -
Metode bazate pe anticorpi)
• Metode de studiu al efectului biologic (discutate în
Lp 12 - Studiul celulelor vii, modele animale)
 Metode de studiu al proteinelor

Aceste metode pot fi folosite pentru:

• izolarea/caracterizarea/identificarea/(semi)cuanti-
ficarea unei singure proteine (single protein
analysis)
• detectarea/(semi)cuantificarea unui set de proteine
(multiplexare, array)
• analiza compoziției proteice a unui produs biologic
(proteomică)
 Metode de studiu al proteinelor
Materia primă de lucru:
• soluţie de proteine (=lizate proteice), extrase din
celule cu detergenţi (pentru a asigura şi extracţia
proteinelor membranare),
• produse biologice

! Proteinele membranare, spre deosebire de cele

citosolice, au domenii hidrofobe care interacționează
cu bistratul lipidic al membranei. Prin urmare,
solubilitatea lor în soluții apoase e scăzută
 Principii generale în studiul proteinelor
• Pentru a identifica, vizualiza și cuantifica proteinele
de interes ne bazăm pe:
• proprietăți fizico-chimice (sarcină electrică,
capacitate de ionizare, punct izoelectric - pH -ul la
care o proteină are număr egal de sarcini electrice
pozitive și negative)
• interacțiuni specifice (enzimă-substrat, antigen-
anticorp)

! Proteinele sau fragmente peptidice umane sunt imunogene pentru

alte specii - pot genera anticorpi dacă sunt injectate la animale de
laborator
 Metode de separare

• Electroforeza
• Cromatografia

Aplicații:
• separarea unor compuși dintr-un amestec pe baza
diferitelor caracteristici fizico-chimice (greutate,
sarcină electrică, solubilitate în solvenți)
• purificare pentru identificare viitoare
Cromatografia este o metodă frecvent folosită de (bio)chimiști. Noi
vom discuta în continuare doar despre tipuri de electroforeze
 Metode de separare - Electroforezele

Principiu - separarea, într-un gel cu ochiuri de diverse

mărimi sau în fază fluidă, folosind un câmp electric, a
proteinelor dintr-un amestec, pe baza proprietăților lor
fizico-chimice :
• greutate moleculară - electroforeza SDS-PAGE
(sodium dodecilsulfat în gel de poliacrilamidă),
• sarcini electrice - izofocusare (în gradient de pH),
electroforeza capilară (în fază lichidă)
 Electroforeza SDS-PAGE

https://www.youtube.com/watch?v=eaETFKXtNRA
Vizualizarea rezultatului electroforezei SDS-PAGE
prin colorarea nespecifică a proteinelor
MW
standard Fiecare linie albastră
(kDa) reprezintă proteine oprite
din migrare acolo unde nu
au mai putut trece,
104 datorită mărimii lor, de
83 ochiurile gelului de
poliacrilamidă. Se poate
estima greutatea
49
moleculară a proteinei
respective prin raportare
37 la un standard - un
29 amestec de proteine cu
20 greutate cunoscută (prima
banda din stânga)
 Comparație electroforeză ADN/proteine
1, 6 - standard de mărime
2-5 - un produs de amplificare PCR
https://bioprep.community.uaf.edu/the-basics-of-gel-
electrophoresis/
1,8- - standard de greutate moleculară
2,3 - o proteină purificată
4,5 - amestec de proteine de pește
6,7 -lizat de E. coli
http://www.bio-rad.com/en-uk/product/coomassie-
stains?ID=2ef88af8-1ca6-44ef-9702-3ebcfe0ad35b
 Metode de caracterizare

Structurile terțiare și cuaternare ale proteinelor sunt

responsabile de funcția biologică.
Dincolo de structura primară (identificabilă prin
secvențiere proteică) interesează:
● identificarea organizării tridimensionale a
proteinei: cristalografia cu raze X, crio-
electronomicroscopia (crioEM)
● modificările de structura 3D care apar la activarea
proteinei/formarea de complexe (crioEM, AFM)
 Cristalografia cu raze X

Principiu:
Metodă prin care modelul de împrăștiere a razelor X la
trecerea printr-o proteină cristalizată este folosit
pentru stabilirea aranjamentului tridimensional al
atomilor
Rezultatul primar este transformat cu ajutorul unor
softuri speciale într-un model de structură terțiară

Cristalizarea se face în soluție, deci metoda este

aplicabilă doar proteinelor hidrosolubile (citosolice)
Modelul unei proteine obţinut prin
cristalografie cu raze X

www.dynamicdevices.com
 Crioelectronomicroscopia

Principiu: metodă de microscopie electronică de

transmisie în care fluxul de electroni străbate o probă
necontrastată, înghețată foarte rapid la temperaturi
foarte joase (în azot lichid)

Se achiziționează imagini cu un număr mare de particule individuale

din probă (proteine purificate/virusuri) care sunt apoi suprapuse cu
ajutorul unui software pentru reducerea zgomotului de fundal si
creșterea contrastului. Pe baza imaginii îmbunătățite se poate
genera o reconstrucție 3D – model molecular.
 Exemplu de imagine obținută prin crioEM

Imagine a unor
complexe proteice
purificate, dintre care
unele sunt surprinse
frontal (imagini
circulare) iar altele
lateral (imagini
dreptunghiulare)

http://life.nthu.edu.tw/~labcjw/BioPhyChem/EM/bbsem.htm
 Crioelectronomicroscopia

• Aplicații: permite analiza structurii native a unor

proteine, care sunt prea mari pentru a fi
cristalizate eficient
• În plus față de de cristalografie, crioEM poate fi
utilizată pentru proteine membranare, complexe
proteice

https://www.youtube.com/watch?time_continue=8
7&v=m8QNXbW1ySI
 Metode de identificare

Produsele biologice sunt, de regulă, amestecuri de

proteine în diverse concentrații.
• unele proteine sunt abundente (de ex: albumina
în plasmă) și ușor de detectat prin diverse
metode
• unele sunt extrem de puțin exprimate sau chiar
nedetectabile, dar această situație se poate
schimba în condiții patologice (de ex: producerea
de anticorpi specifici în infecții)- alegerea
metodei depinde de contextul biologic
 Metode de identificare

• bazate pe anticorpi (western blot, multiplexarea,

array)
• bazate pe proprietăți fizice (masă și sarcină
electrică) - spectrometria de masă

Aceste metode au, de regulă și o componentă de

cuantificare, prin care se poate aprecia abundența
proteinei identificate în amestecul inițial
 Spectrometria de masă

Principiu: transformarea ionilor din fază lichidă →

ioni în fază gazoasă, accelerarea si separarea
acestora funcție de raportul masă/sarcină electrică,
detecția și înregistrarea spectrului

Este tehnologia de bază în proteomică, deoarece

permite identificarea unui număr foarte mare de
peptide/proteine dintr-un singur produs biologic
 Un exemplu de rezultat de spectrometrie
de masă

m/z

Vârfurile reprezintă peptide caracterizate printr-o combinaţie unică masă/sarcină

 Câteva domenii de aplicație ale
spectometriei de masă
Clinic: profil proteic, analiza hemoglobinei, testare
toxicologică pentru depistarea unor droguri sau
intoxicaţie cu metale

Biotehnologia:
• caracterizarea purității unui compus - spectrul ar
trebui să indice prezența unui singur vârf de detecție
• evaluarea stabilității în timp a unui produs - o proteină
recombinantă instabilă sau care suferă proteoliză va
genera în timp un spectru cu mai multe vârfuri, de
masă mai mică
 Metode de cuantificare (măsurare)

• absolute - măsurate în unități ale SI

• relative - raportate la un control intern

Principii:
- reacție de culoare, măsurată prin
spectrofotometrie și raportată la o curbă
standard
- măsurarea intensității fluorescenței, raportată la
un control
 Metode de cuantificare

În celulă există proteine constitutive, produse în

mod constant, fără a avea nevoie de semnale
externe, utile celulei pentru procese de bază,
derulate în condiții normale (constitutive)
• de ex: enzime ale metabolismului glucidic,
proteine ale citoscheletului (actina)

Aceste proteine pot fi folosite drept control al unei

determinări sau drept referință pentru metode
semicantitative
 Rezumat

• Celulele pot fi identificate atât pe baza fenotipului

morfologic, cât şi a celui proteic
• Funcţia proteinelor depinde de structurile terţiare
şi cuaternare
• Metodele de studiu al proteinelor permit
separarea, purificarea, caracterizarea,
identificarea lor dintr-un amestec, precum şi
studiul efectului lor biologic
• Terapiile moleculare se adresează în special
blocării activării unor proteine (enzime, receptori)