MUTAȚIILE GENOMICE

Dintre tipurile de mutații stabilite în funcție de unitatea de material genetic

afectat, respectiv mutațiile genice, mutațiile cromozomiale și mutațiile genomice,
ultimele sunt cel mai ușor de identificat, ele implicând creșterea sau descreșterea
numărului de cromozomi din celulele somatice sau sexuale. În general, variațiile
numerice ale cromozomilor sunt denumite cu termenul poliploidie.
Termenul de poliploidie a fost folosit pentru prima dată de W INKLER (1916) pentru
a desemna organismele care prezentau un număr multiplicat de genomuri. Considerată
ca o mutaţie de genom, poliploidia se datoreşte unei schimbări a numărului de bază de
cromozomi (x).
În funcție de originea genomurilor, organismele poliploide se clasifică
în autopoliploide și alopoliploide.
Termenul de autopoliploidie desemnează organismele poliploide cu genomuri
omoloage, la care locii sunt ocupați cu alele identice. Organismele autopoliploide apar
spontan sau artificial prin multiplicarea propriului număr de bază de cromozomi.
Termenul de alopoliploidie definește acele organisme poliploide ale căror
genomuri sunt diferite genetic, locii prezentând alele diferite. Organismelor alopoliploide
rezultă prin hibridarea între două sau mai multe specii sau genuri, precedată sau
urmată de dublarea numărului de seturi de cromozomi, ceea ce explică diferența
genetică dintre genomuri.
Când modificarea numărului de cromozomi este consecința adăugării unuia sau
mai multor seturi întregi de cromozomi (un set de cromozomi reprezintă totalitatea
cromozomilor dintr-un complement haploid), fenomenul poartă denumirea de euploidie.
Poliploizii care au un număr par de seturi de cromozomi (4n, 6n, 8n etc.) sunt denumiți
artioploizi, iar cei cu număr impar de seturi (3n, 5n, 7n, 9n etc.) poartă denumirea
de perisoploizi.
Nondisjuncţia cromozomilor în meioză are ca rezultat după prima diviziune
apariţia unei celule haploide cu un cromozom suplimentar şi a celeilalte celule haploide
cu un cromozom în minus. Celulele sexuale care iau naştere vor produce astfel
în procesul fecundării zigoţi cu 2n+1 şi 2n-1 cromozomi, deci cu alte caractere şi cu altă
repartiţie la descendenţi decât în cazul normal. Când modificarea numărului de
cromozomi este rezultatul pierderii sau prezenței în plus a unuia sau mai multor
cromozomi, fenomenul poartă denumirea de aneuploidie (polisomie, heteroploidie).
În timp ce aneuploidia este însoțită de o creștere sau micșorare a cantității
de material genetic, fenomenul de pseudoaneuploidie constă într-o variație a
numărului de cromozomi ca rezultat al fisionării și/sau fuzionării cromozomilor din
genomul de origine. Întrucât acest proces are loc cel mai adesea în regiunea
centromerică, numărul de cromozomi (2n) variază, în timp ce numărul fundamental de
brațe cromozomiale (NF) rămâne constant.
Indiferent de unitatea de material genetic care este modificată, mutațiile sunt
fenomene naturale a căror frecvență poate crește semnificativ, ca urmare a intervenției
omului. Comparativ cu animalele, poliploidia este mult mai frecventă la plante, fiind
semnificativ în acest sens procentul de peste 50% dintre angiosperme, cunoscute ca
fiind poliploide.
 Frecvența sporită a plantelor poliploide poate fi explicată prin faptul că, în
general, plantele sunt organisme hermafrodite sau bisexuale, la care cromozomii
sexului nu dețin un rol important în creștere și dezvoltare, iar creșterea numărului de
cromozomi este favorabilă atunci când este asociată cu o creștere a variabilității
fenotipice și amplifică anumite caractere. La animale, poliploidia perturbă balanța dintre
cromozomii sexului și autozomi, creșterea numărului de heterozomi influențând negativ
dezvoltarea sexuală a indivizilor poliploizi. Prin urmare, poliploidia este limitată la
animalele hermafrodite, precum râmele și lipitorile, și la animalele cu reproducere
partenogenetică (descendenții se dezvoltă din ouă nefecundate), precum creveții,
afidele sau șopârlele.
De asemenea, la plante poate fi depășită relativ ușor problema sterilității
(apărută ca o consecință a poliploidiei) prin metode de reproducere asexuată (butășire
sau marcotaj). Atât la plante, cât și la animale, există posibilitatea culturilor in vitro de
celule și țesuturi poliploide, care permit regenerarea de organisme (principiul
totipotenței) cu număr modificat de genomuri sau cromozomi.

Metode de inducere și identificare a poliploidiei la plante

Inducerea experimentală a mutațiilor, cu precădere a poliploidiei la plante are

ca scop generarea și creșterea variabilității genetice, extrem de utilă în selecționarea
unor varietăți și soiuri valoroase din punct de vedere economic.
În prezent, este bine cunoscut faptul că poliploidia este indusă cu succes
la anumite tipuri de plante, respectiv:
- plantele cu un număr mic de cromozomi;
- plantele alogame (gr. allos = străin, diferit) la care polenizarea se realizează
cu polen străin;
- plantele cultivate pentru organele lor vegetative (rădăcină, tulpină, frunze,
flori), precum: sfecla, secara, lucerna, trifoiul, cartoful, ceapa, etc.

Metode de inducere artificială a poliploidiei la plante

Metodele de provocare artificială a autopoliploidiei la plante se clasifică în

funcție de natura agenților poliploidizanți în metode fizice, chimice și biologice.
Metodele fizice sunt:
1. Metoda centrifugării, elaborată de KOSTOFF (1937), constă în centrifugarea
plantelor în faza embrionară cu o viteză suficient de mare pentru ca în celulele
meristematice aflate în diviziune să se producă distrugerea fusului nuclear, ceea ce
împiedică migrarea cromozomilor la polii celulei și determină includerea lor într-un
nucleu de restituție (cu număr dublu de cromozomi).
2. Metoda șocurilor de temperatură constă în expunerea embrionilor (în cursul
primelor mitoze după fecundare) la temperaturi scăzute sau ridicate (42-450C).
3. Metoda iradierii se bazează pe efectul negativ al radiațiilor asupra organizării
și funcționării fusului de diviziune, și în consecință pe imposibilitatea deplasării
cromozomilor spre polii fusului nuclear, formându-se astfel nucleul de restituție cu
număr dublu de cromozomi.
 Se observă că, indiferent de tipul agentului fizic cu care se acționează asupra
celulelor embrionare principiul de acțiune al metodelor fizice este același, respectiv
inhibarea sau distrugerea fusului de diviziune, urmată de blocarea cromozomilor
în metafază și includerea lor într-un nucleul de restituție tetraploid.
Metodele biologice cele mai utilizate pentru a provoca dublarea sau creșterea
numărului de genomuri proprii la plante sunt:
1. Metoda poliembrioniei constă în selecția embrionilor poliploizi din semințele
plantelor superioare. Atunci când într-o sămânță se găsesc doi sau mai mulți embrioni
(embrioni gemeni) unii dintre ei sunt poliploizi, în special triploizi. Embrionii gemeni,
prezenți cu o frecvență variabilă în semințele plantelor superioare, sunt caracterizați
de o capacitate scăzută de germinare astfel încât, metoda poliembrioniei se poate
dovedi utilă pentru selecția de plante poliploide atunci când se apelează la recuperarea
embrionilor prin germinarea lor pe mediu de cultură in vitro (embriocultură).
2. Metoda regenerației, elaborată de W INKLER (1916), constă în selecția
lăstarilor poliploizi, cel mai adesea tetraploizi, care regenerează din celulele calusului
format la zona de sutură dintre altoi și portaltoi. Metoda poate fi aplicată atât plantelor
care se propagă prin altoire (pomi fructiferi, vița de vie, trandafiri etc.), cât și celor cu
înmulțire generativă. De altfel, s-a raportat că metoda a fost folosită cu succes pentru
selecția de poliploizi la genurile Solanum și Nicotiana.
3. Metoda fuzionării protoplaștilor constă în contopirea celulelor vegetale lipsite
de peretele pecto-celulozic sub acțiunea unor agenți inductori, precum polietilenglicolul
(PEG) sau impulsurile electrice de frecvență scăzută (2-20 Mhz), intensitate ridicată
(0,5-5,0 kV/cm) și durată foarte scurtă. Metoda poate fi folosită pentru obținerea
de autopoliploizi la speciile vegetale care prezintă următoarele caracteristici:
- au un randament ridicat de izolare enzimatică a protoplaștilor;
- au un potențial ridicat de regenerare de plante din calusurile care se formează
din protoplaști;
- protoplaștii obținuți sunt caracterizați de o viabilitate ridicată;
- protoplaștii prezintă o capacitate nealterată de refacere a peretelui celular
după fuzionarea lor.
4. Metoda culturilor in vitro de celule și țesuturi vegetale a fost sugerată ca o
cale eficientă pentru generarea de poliploizi încă din anul 1966, de către M URASHIGE
și NAKANO. Metoda constă în selecția formelor poliploide regenerate direct sau indirect
din celule și țesuturi somatice cultivate in vitro pe medii nutritive suplimentate cu
hormoni și regulatori de creștere. Frecvența celulelor poliploide crește considerabil în
cultura de calus de lungă durată, menținută prin subcultura calusului. Factorii care pot
determina instabilitatea genomului celular in vitro și generarea poliploidiei sunt
numeroși și probabil, în majoritatea cazurilor, acționează sinergic. Totuși, unii dintre
regulatorii de creștere, precum auxinele 2,4-D (acid-2,4-diclorofenoxiacetic) și ANA
(acid α-naftilacetic), utilizați pentru suplimentarea mediului de cultură sunt indicați
frecvent ca fiind responsabili de apariția plantelor poliploide.
Metodele chimice de inducere a autopoliploidiei au fost clasificate de către
SIMONET și GUINOCHET (1939), în funcție de modul de acțiune al substanțelor chimice
în două grupe:
- metode chimice care presupun utilizarea substanțelor cu acțiune
statmocinetică (inhibă formarea fusului nuclear în timpul diviziunii celulare și blochează
cromozomii în metafază). Cele mai cunoscute substanțe chimice cu efect statmocinetic
sunt: colchicina, α-monobromnaftalena, α-monoclornaftalena, α-monoiodnaftalena,
feniluretanul.
- metode chimice care se bazează pe utilizarea substanțelor care interferează
negativ cu formarea membranei nucleare (despărțitoare), deși clivarea cromozomilor
și deci, dublarea numărului lor au avut loc. Printre cele mai cunoscute substanțe care
inhibă formarea membranei nucleare se numără: monoclorbenzenul,
ortodiclorbenzenul, metadiclorbenzenul, paradiclorbenzenul, ortoclortoluenul și
metaclortoluenul.
Dintre toate tipurile de metode de inducere artificială a poliploidiei metodele
fizice sunt considerate cele mai eficiente în generarea de autopoliploizi.

Efectul statmocinetic al colchicinei

Colchicina este un alcaloid extras din organele vegetative ale brândușei de
toamnă (Colchicum autumnale), în special din bulbi, unde este prezent într-o
concentrație de 0,5%. În cantități mai mici, acest alcaloid se găsește și în alte specii
înrudite cu Colchicum, precum Androcymbium gramineum (în bulbi este prezent într-o
concentrație de 0,29%).
Colchicina (C22H25NO6) este o substanță albă, foarte solubilă în apă, fotolabilă
și termolabilă. Pentru că se degradează rapid sub influența luminii și temperaturii,
se recomandă păstrarea colchicinei la temperaturi scăzute și la întuneric (la frigider,
în sticle brune, închise ermetic). Pentru inducerea poliploidiei la plante, se lucrează
numai cu soluții proaspete.
Efectul statmocinetic al colchicinei a fost descoperit de B LAKESLEE și AVERY
în anul 1937 și constă în inhibarea formării microtubulilor fusului de diviziune sau
distrugerea fusului nuclear.
Deci, colchicina este un toxic al fusului de diviziune acționând asupra
proteinelor componente (tubuline) ale microtubulilor, mai exact un mol de colchicină
leagă un mol de tubulină. Această legătură specifică dintre colchicină și tubulină
determină dezorganizarea microtubulilor și, în consecință, nu se mai formează fusul de
diviziune.
Ca urmare a acțiunii colchicinei, în absența fusului nuclear, desfășurarea
diviziunii celulare se modifică în mod caracteristic, primind denumirea după caz de C-
mitoză, respectiv C-meioză.

Studiul C-mitozei
Desfășurarea diviziunii celulare mitotice sub influența colchicinei poartă
denumirea de C-mitoză (colchimitoză, statmocineză). În funcție de specie, de
intensitatea (concentrația soluției de colchicină) și de durata tratamentului, fusul
nuclear este influențat într-o măsură variată, astfel:
1. formarea fusului de diviziune este blocată total și se formează un nucleu
de restituție – fenomen denumit statmocineză;
2. formarea fusului de diviziune este blocată parțial – fenomen denumit
merostatmocineză;
3. fusul celular este orientat neregulat – fenomen denumit tropocineză.
 Sub acțiunea colchicinei se pot produce uneori și aberații cromozomiale de
ordin structural, cu precădere deleții.
C-mitoza se desfășoară parcurgând fazele caracteristice, denumite C-profază,
C-metafază, C-anafază și C-telofază, fiecare cu particularitățile determinate de absența
fusului de diviziune sau de inactivarea acestuia sub acțiunea colchicinei.
În C-profaza mitozei nu apar modificări semnificative ale modului de
desfășurare, doar că în jurul cromozomilor nu se formează o zonă clară caracteristică
profazei normale, iar contractarea cromozomilor poate fi mai puternică spre sfârșitul C-
profazei;
În C-metafaza mitozei ca urmare a inhibării fusului celular cromozomii nu mai
migrează în placă ecuatorială, ci se dispersează în masa celulei. Cromozomii sunt
puternic contractați și prin urmare sunt scurți și groși cu cromatidele surori unite la
nivelul centromerului, dar distanțate în partea distală a brațelor. Din această cauză,
în C-metafază cromozomii au forma literei X (cross-shaped). Faza în care cromozomii
au forma literei X poartă denumirea de pseudometafază (metafază falsă).
În pseudometafază, colchicina inhibă formarea fusului celular, dar și diviziunea
centromerilor, ceea ce determină prelungirea acestei faze până la o durată de câteva
ore. În felul acesta, crește frecvența celulelor aflate în metafază, fenomen cunoscut
sub denumirea de acumulare de metafaze. Intensitatea acumulării de metafaze poate
fi cuantificată prin determinarea indicelui mitotic metafazic.
În C-anafaza mitozei are loc clivarea longitudinală a fiecărui centromer
și separarea cromatidelor surori (cromozomi monocromatidici). În absența fusului
celular, după diviziunea întârziată și desincronizată a cromozomilor, cromatidele rămân
mult timp alăturate, dispuse paralel, sub forma unei “perechi de schiuri”. Această fază
mai poartă denumirea de pseudoanafază.
În C-telofază se formează nucleul de restituție care înglobează toți cromozomii
monocromatidici, prezenți astfel în număr dublu față de celula diploidă sușă. Dacă
influența colchicinei durează doar un ciclu celular, la sfârșitul acestuia se formează
nuclei de restituție tetraploizi (2n=4x), respectiv celule tetraploide. Atunci când acțiunea
colchicinei se prelungește pe mai multe cicluri celulare, nucleii de restituție pot conține
8 seturi haploide de cromozomi, celulele devenind octoploide (2n=8x) sau 16 seturi
haploide de cromozomi, celulele fiind hexadecaploide (2n=16x).
Este important de menționat că efectul colchicinei este reversibil. Prin spălarea
țesutului colchicinizat în apă de robinet, după 24 ore începe să se formeze din nou
fusul de diviziune (la celulele care au început diviziunea). După anihilarea efectului
colchicinei, în procesul de trecere de la C-mitoză la o diviziune mitotică normală, pot
avea loc diviziuni multipolare, adică se pot forma mai mult de două grupe de
cromozomi monocromatidici, fiecare grupă fiind inclusă într-un nucleu care va avea un
număr redus de cromozomi, deci mai puțin de n cromozomi (DORDEA și colab., 2003).

Studiul C-meiozei

Acționând în aceeași manieră asupra celulelor mamă ale gameților, colchicina

induce modificări și în procesul de formare a celulelor sexuale, care poartă denumirea
de C-meioză și se desfășoară parcurgând fazele caracteristice, respectiv C-meioză I
și C-meioză II, care se deosebesc semnificativ de fazele normale ale meiozei, ca
urmare a inhibării fusului de diviziune.
Modificările sunt evidente încă din C-profaza I a diviziunii reducționale,
pe parcursul căreia cromozomii, puternic contractați, nu se asociază sub formă
de bivalenți, ci rămân în majoritate sub formă de univalenți. Spre sfârșitul acestei faze
nu se formează fusul de diviziune, iar cromozomii univalenți dispersează în masa
celulară.
În C-metafaza I, cromozomi ating condensarea maximă, dar rămân dispersați
în celulă (nu formează placa metafazică).
În C-anafaza I, dacă s-au format câțiva bivalenți, are loc separarea acestora.
Cromozomii univalenți rezultați se dispun paralel. În absența fusului de diviziune
cromozomii nu migrează către poli.
În C-telofaza I nu se formează diada, toți cromozomii univalenți fiind cuprinși
într-un nucleu de restituție care va avea un număr dublu de cromozomi (2x).
Din celulele cu nucleu de restituție diploid care parcurg diviziunea meiotică II
(homotipică) rezultă două celule (gameți) cu același număr neredus de cromozomi.
Deci, la sfârșitul C-meiozei nu se formează patru gameți haploizi, ci doi gameți diploizi.

APLICAȚIE

Materialul biologic: se utilizează rădăcinuțe de ceapă (Allium cepa) sau bob

(Vicia faba), care se obțin prin germinarea bulbilor sau semințelor, în condiții de
laborator.

Tehnica de lucru:
Când rădăcinuțele ating o lungime de 5-8 mm se supun unui tratament
cu colchicină 0,2%, timp de 2, 4 și 6 ore.
Din meristemele radiculare tratate se efectuează preparate squash (după
tehnica cunoscută), colorate cu soluție carmin-acetică sau orcein-acetică. Preparatele
se examinează la microscop pentru identificarea potențialelor aberații cromozomiale
structurale sau numerice induse sub acțiunea agentului mutagen chimic.
Fazele C-mitozei sunt analizate și se determină indicele mitotic. După
preparatele examinate la microscop se realizează desene pentru fiecare fază a C-
mitozei și se notează observațiile în fișele de lucru.

Examinarea preparatelor microscopice

În preparatele microscopice realizate din țesuturi meristematice supuse

tratamentului cu colchicină se vor observa faze aberante ale diviziunii celulare (Fig.
32):
- metafaze stelare, în care cromozomii sunt orientați într-un aster la centrul
celulei (nu formează placa metafazică);
- metafaze multipolare, în care cromozomii prezintă mai multe centre
de orientare
 - metafaze cu cromozomi retardatari (întârziați), în care unul sau mai mulți
cromozomi sunt localizați izolat de restul cromozomilor;
- anafaze multipolare
- anafaze cu punți cromatidice (migrări parțiale ale cromozomilor către poli)
și cromozomi retardatari
- telofaze cu cromozomi retardatari sau cromozomi care formează
micronuclei.

Figura 32. Faze aberante ale diviziunii mitotice. A, B, C – anafaze cu punți

cromatidice; D, E - metafaze multipolare; F – anafaze multipolare (după Gisselsson și
colab., 2002).