Inginerie Genetica

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT
CAPITOLUL II
Tehnologia ADN recombinant se referă la metodologia obţinerii moleculelor de ADN

recombinant, adică de realizare "in vitro" a unor molecule de ADN noi prin îmbinarea de
fragmente provenite fie din genomul unor specii biologice diferite, fie de la aceeaşi specie.
Imbinarea respectivelor fragmente se realizează într-o ordine diferită de cea naturală, astfel
încât elementele genetice utilizate capătă o structură aparte, conferind organismului în care
sunt introduse proprietăţi noi pe care nu le-ar dobândi pe cale naturală.
Aşa cum s-a prezentat anterior (fig.1), pentru a obţine moleculele de ADN
recombinant este necesar să se parcurgă mai multe etape care pot fi sintetizate astfel:
1. izolarea genelor naturale sau sinteza chimică a unor molecule de ADN ce codifică
proteinele dorite;
2. selecţia unui vehicul sau vector adecvat care să transporte genele respective şi apt să
se replice autonom în celula receptoare;
3. inserţia genelor străine în structura genetică a moleculei vector şi obţinerea unei
himere moleculare;
4. introducerea acesteia într-o gazdă specifică şi transformarea ei;
5. asigurarea condiţiilor care permit exprimarea informaţiei străine în celula
acceptoare;
6. selectarea celulelor modificate genetic din populaţia celulară rezultată prin
multiplicare;
7. evidenţierea produsului genei în celulele modificate sau în mediul de cultură al
acestora şi purificarea lui pentru a fi folosit în scopurile pentru care s-au realizat tehnicile
respective.
35
2.1. Etapele de lucru pentru obţinerea şi selecţia moleculelor recombinate de ADN
Scopul experimentelor de inginerie genetică este acela al obţinerii moleculelor de

ADN prelucrate “in vitro” astfel încât ele să conţină genele de interes şi să poată fi transferate
în gazde corespunzătoare. Etapele de lucru ce au ca rezultat obţinerea acestor molecule
presupun elaborarea unor metode de izolare şi purificare a acizilor nucleici, a utilizării unor
enzime specifice şi selectarea unor vectori de clonare adecvaţi.
2.1.1. Izolarea şi purificarea acizilor nucleici
Realizarea experimentelor de clonare a genelor presupune ca etapă de bază purificarea

unor diferite tipuri de molecule de acizi nucleici: ADN celular total (din celule vegetale,
animale, bacteriene sau din levuri), ADN plasmidial, ADN viral sau ARN. In funcţie de tipul
de molecule de acizi nucleici şi de organismul de origine au fost elaborate numeroase metode
de izolare şi purificare. Indiferent de metoda utilizată este necesară parcurgerea mai multor
etape: obţinerea (cultivarea) materialului biologic; liza celulelor pentru eliberarea acizilor
nucleici; îndepărtarea componentelor celulare nedorite (resturi celulare, proteine etc);
purificarea acizilor nucleici de interes; concentrarea acizilor nucleici obţinuţi anterior.
2.1.1.1. Izolarea ADN total
Pentru izolarea ADN total se utilizează fie fragmente de ţesuturi (vegetale sau
animale), culturi celulare sau suspensii celulare. Indiferent de tipul de celule utilizate în
experimente este necesară liza acestora, proces realizat prin metode variate (liza chimică în
prezenţa unor soluţii alcaline şi/sau a unor detergenţi; liza enzimatică cu ajutorul unor enzime
specifice; liza produsă prin procedee fizice: ultrasonicare, îngheţarea celulelor în azot lichid,
metode mecanice etc). Protejarea de acţiunea nucleazelor endogene a ADN liberat prin
spargerea celulelor se realizează, de regulă, prin folosirea unor soluţii tampon ce conţin
EDTA (reactiv ce leagă ionii de magneziu făcându-i inaccesibili DN-azelor, ai căror cofactori
sunt). De asemenea, după îndepărtarea prin centrifugare a resturilor celulare, soluţia apoasă
obţinută este supusă unor tratamente suplimentare ce au drept scop degradarea ARN (prin
adăugarea RN-azei) sau a proteinelor contaminante (prin folosirea unor proteaze sau prin
extracţie cu fenol). ADN este apoi recuperat prin precipitare cu etanol (2-2,5 volume), în
36
prezenţa unor cationi monovalenţi (de exemplu, ioni de sodiu în concentraţie de 0,3M) şi apoi
prin centrifugare. Deseori, ADN obţinut este redizolvat în tampon, proces urmat de o nouă
rundă de deproteinizare, ceea ce asigură o puritate mai bună preparatului. Dacă este însă
necesar un grad foarte ridicat de puritate, soluţia de ADN este supusă ultracentrifugării (în
gradient de clorură de cesiu).
2.1.1.2. Izolarea ADN plasmidial
Pentru purificarea ADN plasmidial au fost elaborate numeroase metode dar utilizarea
uneia sau a alteia depinde de scopul urmărit: evidenţierea prezenţei plasmidelor în celulele
bacteriene sau purificarea plasmidelor şi utilizarea lor în diferite experimente (transformarea
genetică, clivare cu enzime de restricţie, clonări de gene etc). Toate metodele elaborate până
în prezent pentru izolarea plasmidelor bacteriene implică trei etape de bază: cultivarea
bacteriilor; depunerea şi liza celulară; purificarea ADN plasmidial (Mazza, 1986).
Posibilitatea de a izola selectiv ADN plasmidial şi de a îndepărta ADN cromosomal se
datorează unor diferenţe importante dintre cele două tipuri de molecule. Astfel, ADN
cromosomal este reprezentat de molecule de dimensiuni mari, legate de membrana plasmatică, el
rămânând fixat de resturile celulare rezultate după spargerea celulelor. Având dimensiuni mari,
moleculele de ADN cromosomal sunt linearizate şi fragmentate în cursul procesului de extracţie,
în timp ce ADN plasmidial este obţinut, în cea mai mare parte, sub forma unor molecule
circulare închise covalent (CIC). De asemenea, cele două tipuri de molecule se comportă diferit
în prezenţa unor detergenţi (SDS) sau la concentraţii mari de săruri.
Expunerea la temperaturi ridicate sau tratarea cu soluţii cu pH puternic alcalin (12,0 -
12,4) determină ruperea legăturilor de hidrogen dintre cele două catene ale moleculelor de ADN,
ducând la denaturarea acestora. Datorită conformaţiei moleculare speciale (CIC), catenele de
ADN plasmidial denaturat se menţin alăturate, astfel că după răcire, respectiv neutralizare, aceste
molecule redobândesc configuraţia iniţială. In schimb, ADN cromosomal rămâne în stare
denaturată fiind eliminat în cea mai mare parte după centrifugare. Moleculele ce contaminează
soluţia de ADN (ARN sau proteine) sunt eliminate prin tratamente similare celor menţionate
pentru ADN total, iar recuperarea ADN plasmidial se face tot prin centrifugare după precipitarea
cu alcooli (alcool izopropilic sau alcool etilic). Pentru o purificare înaltă a ADN plasmidial se
poate utiliza ultracentrifugarea în gradient în clorură de cesiu, metodă ce permite separarea nu
37
numai a tipurilor diferite de molecule ci şi a moleculelor de ADN plasmidial cu conformaţii

moleculare diferite (fig.20).
proteine
ADN linearizat sau crestat

(conformaţia CD)
ADN de tip CIC
Sediment
reprezentat de
molecule de
ARN
Fig.20. Separarea moleculelor de ADN prin ultracentrifugare
2.1.1.3. Izolarea ADN viral
Pentru obţinerea ADN viral este necesar mai întâi să se obţină celulele ce reprezintă
gazda specifică a virusului de interes. De cele mai multe ori, multiplicarea virală este însoţită
de liza celulelor gazdă (aşa cum este cazul bacteriofagilor litici), astfel încât particulele virale
sunt obţinute din lizatul celular prin precipitare (de exemplu, prin precipitare cu
polietilenglicol) urmată de centrifugare. Îndepărtarea capsidei virale se realizează prin
tratament cu fenol sau prin folosirea unor proteaze. ADN viral este recuperat, după
precipitare, prin centrifugare sau ultracentrifugare în gradient de CsCl.
2.1.1.4. Izolarea moleculelor de ARN
In anumite tipuri de experimente în care izolarea genelor direct din moleculele de

ADN nu este posibilă, pentru fragmentelor de interes este necesară utilizarea unor molecule
de ARN care sunt apoi convertite, prin reverstranscriere, la molecule de ADN
corespunzătoare. Izolarea moleculelor de ARN este relativ complicată de faptul că RN-aza
endogenă este capabilă să degradeze cea mai mare parte a ARN celular. Inactivarea acestei
enzime termostabile şi rezistente la acţiunea EDTA sau a detergenţilor este realizată prin
folosirea unui inhibitor specific: dietilpirocarbonat.
De regulă, metodele de izolare ale ARN permit obţinerea de ARN total. Pentru
purificarea unui anumit tip de ARN se folosesc metode specifice ce ţin cont de anumite
38
particularităţi ale moleculelor de interes. Spre exemplu, pentru obţinerea ARNm se ţine cont
de faptul că acest tip de ARN, izolat din celule eucariote, prezintă la capătul 3’ o “coadă”
monocatenară poliA.
Pornind de la această caracteristică, pentru purificarea ARNm se utilizează metoda
cromatografiei de afinitate pe o coloană cromatografică ce conţine o umplutură specifică la
care sunt legate “resturi” de poliT sau poliU. Secvenţele poliT sau poliU interacţionează
specific, pe bază de complementaritate, cu coada poliA a ARNm, legând moleculele
respective. Eluarea moleculelor de interes se realizează cu ajutorul unor soluţii tampon
specifice, iar apoi ARNm este concentrat prin precipitare cu etanol şi recuperat prin
centrifugare.
2.1.1.5. Determinarea purităţii şi concentraţiei de acizi nucleici
Utilizarea acizilor nucleici în diferite experimente este condiţionată de un anumit grad

de puritate şi o cantitate corespunzătoare. Concentraţia de acizi nucleici din diferite probe se
poate determina pe baza absorbţiei radiaţiilor ultraviolete, ştiut fiind faptul că absorbanţa
radiaţiilor UV cu lungimea de undă de 260nm este direct proporţională cu cantitatea de ADN
din soluţie. Determinările efectuate asupra unor probe cunoscute (în cuve cu grosimea de 1
cm) au stabilit că valoarea 1,00 a absorbanţei la 260 nm corespunde unei concentraţii de 50
µ g/ml ADN dublu catenar sau 40μg/ml ARN. Variaţia absorbţiei în ultraviolet a soluţiilor de
ADN permite studiul denaturării acestuia. Odată cu trecerea de la forma dublu catenară la
forma monocatenară, absorbţia soluţiilor de ADN creşte cu până la 40% (efect hipercromic),
variaţie care depinde de procentul bazelor G-C.
Pe baza proprietăţilor de absorbţie a soluţiilor de acizi nucleici, se poate evalua
puritatea acestora. Acizii nucleici au un spectru de absorbţie între 250 – 320 nm. O extincţie,
la 320 nm, mai mare cu câteva procente decât cea corespunzătoare lungimii de undă de 260
nm, indică prezenţa altor tipuri de molecule în soluţie.
În cazul acizilor nucleici izolaţi de la E. coli o astfel de contaminare este foarte rară
dar pentru preparatele obţinute de la alte organisme, absorbţia la 320 nm poate fi cu până la
10% mai ridicată decât la 260 nm. Pentru determinarea tipului de molecule cu care proba este
contaminată se citesc extincţiile soluţiilor la două lungimi de undă diferite: 260 nm –
lungimea de undă la care acizii nucleici au absorbţia maximă şi 280 nm – lungimea de undă la
care proteinele au absorbţia maximă.
39
Rezultatele obţinute până în prezent au permis stabilirea unor, aşa numite, criterii de
puritate:
- o valoare a raportului A260 / A280 între 1,65 şi 1,85 indică o puritate ridicată a soluţiei
de acizi nucleici, dacă procentul bazelor G – C este unul obişnuit;
- valori mai mari de 1,85 ar indica prezenţa în soluţie a unei cantităţi mari de ARN;
- valori sub 1,65 indică o contaminare cu proteine sau fenol a probei analizate.
De asemenea, înainte de utilizarea probelor de ADN în experimente de inginerie
genetică este necesar să existe, în plus, informaţii legate de conformaţia moleculară a ADN;
dacă ADN plasmidial este contaminat cu ADN cromosomal sau dacă ADN cromosomal este
puternic fragmentat. Dacă puritatea probei de ADN de interes se poate stabili
spectrofotometric, celelalte informaţii se pot obţine prin utilizarea altor tehnici, cum sunt cele
electroforetice.
Metoda standard de separare şi identificare a moleculelor de ADN izolate dintr-un
anumit organism este electroforeza în gel de agaroză. Principiul general al metodei constă în
faptul că, la pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcină negativă şi, prin urmare, dacă
sunt plasaţi într-un câmp electric, ei vor migra spre anod (+).
Atunci când dimensiunea fragmentelor de ADN este foarte mică (sub 1000 pb), pentru
separarea electroforetică se preferă gelul de poliacrilamidă, a cărui concentraţie este aleasă în
funcţie de mărimea moleculelor. Indiferent de tipul de gel utilizat pentru separarea
moleculelor de ADN, pentru ca acestea să poată fi vizualizate, este necesar ca mai întâi ele să
fie colorate. Colorarea se realizează cu bromură de etidiu iar vizualizarea benzilor de ADN se
face prin expunerea gelului la radiaţii UV (pe un transluminator), ele prezentând o
fluorescenţă roz (fig.21). Metoda electroforezei în gel de agaroză permite stabilirea
dimensiunilor moleculelor de ADN precum şi conformaţia moleculară a acestora.
2.1.2. Metode de izolare a fragmentelor de ADN utile pentru clonare
Tehnicile care urmăresc manipularea directă a ADN prin clonare moleculară se

desfăşoară în etape succesive, una dintre acestea fiind obţinerea genelor de interes. Aceasta se
poate realiza fie prin izolarea genelor naturale, fie prin sinteza chimică a unor molecule de
ADN ce codifică proteinele dorite. În prezent, prin aceste tehnici se poate realiza prelucrarea
şi transferul unor secvenţe relativ mici, de dimensiuni cuprinse între 1.000-20.000 pb.
40
Godeurile unde sunt

introduse probele
49,0 kb
21,8 kb
7,53 kb
5,93 kb+ 5,54 kb ADN, conformaţia CD

4,80 kb
ADN linearizat
3,41 kb
ADN parţial relaxat
ADN, conformaţia
CIC
Fig.21. Separarea electroforetică a unor molecule de ADN (după Boffey, 1983)
Reuşita experimentelor în urma intervenţiilor prin diverse procedee este condiţionată

de prezenţa integrală a genei dorite şi a unei cât mai mici cantităţi de ADN “contaminant”,
inutil pentru buna funcţionare a genei de interes. Obţinerea fragmentelor de ADN ce servesc
pentru clonare se poate realiza pe mai multe căi: sinteza chimică a genei; sinteza enzimatică a
ADN dublu catenar complementar (ADNc); izolarea genelor din ADN natural cu ajutorul
enzimelor de restricţie; izolarea şi amplificarea genelor prin tehnologia PCR.
Metodele prezentate mai sus presupun utilizarea unei game variate de enzime, cum ar
fi: enzimele de restricţie (endonucleaze de restricţie), metilazele, ADN polimeraze dependente
de ADN, reverstranscriptaza, fosfataza alcalină, ligaza, polinucleotid kinaza, nucleazele (DN-
aze, RN-aze).
2.1.2.1. Obţinerea ADN de interes prin utilizarea endonucleazelor de restricţie
Enzimele restricţie cunoscute şi sub numele de endonucleaze de restricţie sunt

produse de către bacterii şi sunt răspunzătoare de fenomenul de degradare a moleculelor de
ADN străin ce pătrund în interiorul celulelor bacteriene. Aceste enzime, după "recunoaşterea"
unei secvenţe nucleotidice specifice, hidrolizează moleculele de ADN dublu catenar.
Hidroliza ADN se realizează prin clivarea a două legături fosfodiesterice, situate câte una pe
fiecare catenă a moleculei de ADN, determinând formarea unui număr limitat de fragmente
per moleculă. În celulele producătoare, endonucleazele de restricţie fac parte integrantă dintr-
un sistem de restricţie şi modificare, alcătuit dintr-o restrictază şi o enzimă de modificare.
"Modificarea", realizată în special prin metilare, protejează ADN propriu faţă de acţiunea
41
restrictazelor specifice, în timp ce ADN străin, pătruns în celulă, fiind lipsit de o modificare
adecvată, este sensibil la distrugerea cu endonucleaze de restricţie (Nathans şi Smith 1975;
Old şi Primrose 1980; Zarnea 1986).
Sistemele de restricţie şi modificare au fost descoperite prin efectul lor asupra
bacteriofagilor ce infectează celulele bacteriene. Astfel, s-a observat că particulele fagice ce
au fost eliberate prin liza celulelor bacteriene aparţinând unei anumite tulpini determină
infectarea eficientă a altor bacterii aparţinând aceleiaşi tulpini deoarece acestea au acelaşi tip
de modificare ca şi gazda iniţială. In cazul în care respectivele particule fagice infectează
bacterii aparţinând altor tulpini, numărul de plaje de liză (dovada eficienţei infecţiei cu
bacteriofagi virulenţi) este foarte mic sau chiar nu se produc plaje de liză deoarece ADN fagic
infectant a fost atacat şi distrus în cea mai mare parte de către enzimele de restricţie ale noii
gazde. Faptul că totuşi, în anumite situaţii apar plaje de liză, dovedeşte că sistemul de
restricţie nu este absolut. Există astfel posibilitatea ca ADN exogen să scape fenomenului de
restricţie fie datorită unor mutaţii spontane apărute la nivelul situsurilor ţintă pentru enzimele
de restricţie, fie acţiunii ineficiente a acestora. Mai mult, particulele fagice din noile plaje de
liză sunt capabile să infecteze eficient noua tulpină bacteriană, dar nu şi cea de origine.
Aceasta dovedeşte că ADN din aceste particule fagice a suferit tipul de modificare specific
noii gazde şi nu mai este recunoscut de gazda de origine.
In 1968, Arber şi Linn au demonstrat activitatea restrictazică a enzimei Eco B,
produsă de o tulpină de E.coli, iar Meselson şi Yuan (1968) au purificat o enzimă cu acţiune
similară sintetizată de tulpina E.coli K. Aceste enzime au fost capabile de a degrada ADN
izolat din alte surse dar nu şi pe cel al tulpinii producătoare, ele “tăind” ADN în mod
întâmplător, la nivelul unor situsuri localizate departe de situsul de recunoaştere.
In 1970, Smith, Wilcox şi Kelly au reuşit purificarea şi caracterizarea unei alte enzime
de restricţie, Hind II, enzimă care “taie” macromolecula de ADN la nivelul situsului de
recunoaştere. Această enzimă a fost apoi utilizată de Dana şi Nathans (1971) pentru clivarea
genomului circular al virusului SV40 reuşind obţinerea a 11 fragmente distincte. Acest
experiment a însemnat realizarea primei hărţi de restricţie.
Trăsătura de bază a unui sistem de restricţie şi modificare este aceea că tulpina
bacteriană prezintă o activitate de metilare a ADN propriu cu aceeaşi specificitate de secvenţă
ca şi activitatea restrictazică. Metilaza adaugă grupări metil la resturile de adenină sau
citozină de la nivelul situsurilor ţintă ale enzimei de restricţie corespunzătoare, ceea ce
42
conferă respectivelor molecule de ADN rezistenţă la acţiunea restrictazei (protejează ADN

propriu de “autodigestia” pe care ar produce-o enzima de restricţie sintetizată).
Toate endonucleazele de restricţie recunosc scurte secvenţe de nucleotide de la nivelul
macromoleculelor de ADN, secvenţe ce reprezintă situsurile de recunoaştere şi legare.
Legarea este urmată de clivarea legăturilor fosfodiesterice fie la nivelul situsului de
recunoaştere fie la depărtare de acesta, în funcţie de enzimă.
ADN genomic al bacteriei ce produce o anumită enzimă de restricţie este metilat la
nivelul situsurilor ţintă, astfel încât devine imun la acţiunea enzimei de restricţie
corespunzătoare. ADN este metilat pe ambele catene însă, în cursul procesului de replicare,
moleculele fiice conţin doar una dintre catene metilată (cea matriţă); se poate spune în acest
fel că ele sunt hemimetilate. In acest moment întră în acţiune enzimele ce catalizează procesul
de metilare şi introduc grupări metil la nivelul bazelor azotate corespunzătoare. Atunci când
în celulă pătrunde însă o moleculă de ADN străin, care nu prezintă modelul de metilare al
respectivei gazde, el este rapid recunoscut de enzimele de restricţie şi degradat.
In cazul ADN al tulpinilor de E.coli s-a evidenţiat faptul că acesta conţine mici
cantităţi de 6-metiladenină şi 5-metilcitozină. Aceste baze azotate sunt generate prin acţiunea
a trei tipuri diferite de metilaze care au fost încadrate în trei sisteme de modificare specifice:
- sistemul hsd care acţionează pentru a genera un model specific de metilare a adeninei
(sau uneori a citozinei);
- sistemul dam care este capabil să deosebească noile catene de ADN replicate prin
metilarea adeninei. El este implicat în controlul procesului de replicare, în marcarea catenelor
de ADN în vederea reparării sau influenţează activitatea altor elemente cromosomale la
E.coli;
- sistemul dcm care metilează citozina dar al cărui mecanism de acţiune nu este
cunoscut.
Au fost identificate bacterii ce prezintă mutaţii la nivelul sistemelor de metilare, ele
fiind incapabile de metilare dar capabile de supravieţuire; aceasta dovedeşte că totuşi
metilarea nu este un eveniment esenţial pentru supravieţuirea bacteriilor.
Sistemele enzimatice de restricţie/modificare au fost împărţite în trei categorii: tipul I,
tipul II şi tipul III. Diferenţa principală dintre cele trei categorii este aceea că sistemele
enzimatice de tipul II conţin enzime diferite ce realizează metilarea, respectiv restricţia, în
timp ce sistemele de tip I şi II grupează enzime ce prezintă atât proprietăţi de metilare cât şi
de restricţie. Enzimele ce alcătuiesc aceste sisteme au 2-3 subunităţi heterologe cu proprietăţi
43
funcţionale distincte. Sistemele enzimatice de tip I şi II sunt mai puţin cunoscute şi mai puţin
folosite în practică deşi sunt interesante din punct de vedere biologic.
Sistemul de tip II include o serie de enzime de restricţie foarte bine cunoscute, ele
fiind utilizate în numeroase experimente de biologie moleculară. Au mai fost descrise şi alte
tipuri de enzime de restricţie care acţionează asupra ADN doar dacă acesta este metilat.
Acesta este cazul enzimei de restricţie Dpn I produsă de unele tulpini de Streptococcus
pneumoniae: ea clivează situsul de recunoaştere GATC doar dacă acesta este metilat. Din
contră, enzima DpnII, produsă de alte tulpini de streptococi, îşi exercită acţiunea doar asupra
situsurilor de recunoaştere GATC nemetilate.
In ceea ce priveşte nomenclatura enzimelor de restricţie, a fost propus un model
original, ce combină denumirea speciei şi a tulpinii de la care s-a izolat enzima (abreviere) şi
numărul de enzime pe care aceasta le produce (cifre romane). De exemplu, tulpina
Escherichia coli R produce mai multe enzime de restricţie notate Eco RI, Eco RII, Eco RV, în
timp ce Bacillus globigii sintetizează două enzime de restricţie, Bgl I şi Bgl II (tabelul 2).
Tabelul 2. Caracteristicile unor enzime de restricţie
Tulpina bacteriană Denumirea Situs de recunoaştere

enzimei şi clivare
Anabaena variabilis Ava I CCGGAG
Bacillus amyloliquefaciens Bam HI GGATCC
Bacillus globigii Bgl II AGATCT
Escherichia coli Eco RI GAATTC
Haemophilus aegyptius Hae III GGCC
H. haemolyticus Hha I GCGC
H.parainfluenzae Hpa II CCGG
H.influenzae Rd Hind III AAGCTT
Moraxella bovis Mbo I GATC
Providencia stuartii Pst I CTGCAG
Serratia marcescens Sma I CCCGGG
Streptomyces stanford Sst I GAGCTC
Thermus aquaticus Taq I TCGA
Xanthomonas malvacearum Xma I CCCGGG
Relativ recent (Jacquier şi Dujon, 1985; Macreadie şi colab., 1985) au evidenţiat faptul
că anumite gene mitocondriale, cloroplastice sau chiar nucleare de la unele organisme
eucariote conţin introni ce codifică nucleaze specifice. Aceste nucleaze determină clivări
44
dublu-catenare ale ADN, la nivelul unor situsuri specifice, într-un mod similar acţiunii
enzimelor de restricţie produse de bacterii. Spre deosebire de acestea însă, secvenţele de
recunoaştere nu sunt protejate prin metilare ci ele, se pare că sunt implicate în eliminarea
intronilor din anumite gene, generând gene alele fără introni.
Endonucleazele eucariote recunosc secvenţe mai lungi de nucleotide, formate din 10-
12 perechi de baze, astfel că ele ar putea fi utilizate în experimentele în care se doreşte
obţinerea unor fragmente de ADN de dimensiuni mai mari (ca în cazul “construirii” băncilor
genomice).
Una dintre caracteristicile enzimelor de restricţie este aceea că ele recunosc anumite
secvenţe de nucleotide (situsul de recunoaştere) şi clivează în mod specific legăturile
fosfodiesterice dintre anumite nucleotide (situsul de clivare), situsurile fiind plasate pe ambele
catene ale ADN. In cazul multor enzime de restricţie, situsul de recunoaştere coincide cu cel
de clivare (mai ales la enzimele de restricţie de tip II), fiind format dintr-un număr limitat de
nucleotide (4, 5, 6, 7 sau 8 perechi de nucleotide), cu structură de palindrom. De exemplu,
enzima Eco RI recunoaşte o secvenţă specifică formată din 6 nucleotide, GAATTC. Uneori,
palindromul este întrerupt de o serie de 1 până la 9 nucleotide nespecifice. De exemplu,
enzima de restricţie Sfi I recunoaşte secvenţa GGCCNNNNNGGCC, unde N poate fi orice
bază azotată.
Deseori, situsul de recunoaştere al unei enzime de restricţie nu coincide cu cel de
clivare, acesta din urmă fiind localizat la o anumită depărtare de situsul de recunoaştere, spre
capătul 5’ sau 3’. Un exemplu de acest tip este enzima Mbo II care recunoaşte situsul
GAAGA, dar locul de clivare este situat la o distanţă de 8 nucleotide de la capătul 3’ al
situsului de recunoaştere pe o catenă şi la o distanţă de 7 nucleotide spre capătul 5’ pe cealaltă
catenă.
Numărul şi mărimea fragmentelor de ADN generate prin acţiunea enzimelor de
restricţie depinde de frecvenţa apariţiei situsurilor de recunoaştere la nivelul ADN supus
clivării. Presupunând că, în medie, conţinutul în G+C al ADN ar fi 50%, aceasta ar însemna
că un situs de restricţie format din patru nucleotide s-ar regăsi la nivelul acelui ADN la fiecare
256 perechi de baze (44). Dacă situsul de restricţie este format din şase nucleotide, el s-ar
regăsi la fiecare 4096 perechi de baze (46), în timp ce un situs de restricţie format din opt
nucleotide ar putea apărea la fiecare 65.536 perechi de baze (48). In funcţie de enzima de
restricţie utilizată şi de scopul urmărit în experiment, ADN poate fi scindat în fragmente de
dimensiuni mici (ca în cazul experimentelor de amprentare genetică = „DNA fingerprinting”)
45
sau mai mari, mai ales atunci când sunt folosite enzime al căror situs de recunoaştere este
format din 8 nucleotide (ca în cazul experimentelor de clonare a unor fragmente genomice sau
în cele de cartare genetică).
Un alt aspect de care se ţine seama atunci când se alege o enzimă de restricţie pentru
un anumit tip de experiment este acela al tipului de extremităţi pe care le generează enzima
după clivarea macromoleculei de ADN. Se cunoaşte faptul că enzimele de restricţie ce
recunosc secvenţe de tip palindrom rup legăturile fosfodiesterice la nivelul acestor secvenţe,
generând fie extremităţi monocatenare complementare 3’ sau 5’ (atunci când clivarea se face
decalat în raport cu axul de simetrie al secvenţei palindromice), fie extremităţi drepte (atunci
când clivarea se face în aceeaşi poziţie pe ambele catene ale ADN). In cazul fragmentelor de
restricţie cu extremităţi monocatenare, ele se pot reasocia pe baza complementarităţii, între ele
stabilindu-se legături de hidrogen; legarea este mai stabilă atunci când extremităţile respective
conţin mai multe baze azotate de tip GC.
Pentru testarea acţiunii enzimelor de restricţie se pot utiliza diferite tipuri de ADN la
care se cunoaşte numărul de situsuri de recunoaştere (stabilit prin studii anterioare). Dintre
acestea, cele mai utilizate molecule de ADN provin de la bacteriofagul λ, de la adenovirusul
Ad2, bacteriofagul Φ X174, plasmida pUC18 sau pBR322 (tabelul 3).
Tabelul 3. Acţiunea unor enzime de restricţie pe diferite tipuri de molecule de ADN

Enzima Situs de Număr de situsuri
recunoaştere şi λ Ad2 Φ X174 pUC18 pBR322
clivare
Bam HI G↓GATCC 5 3 0 1 1
Bgl II A↓GATCT 6 11 0 0 0
Dpn I GmeA↓TC 116 87 0 15 22
Eco RI G↓AATTC 5 5 0 1 1
Eco RV GAT↓ATC 21 9 0 0 1
Hind III A↓AGCTT 7 12 0 1 1
Hinf I G↓ANTC 148 72 21 6 10
Mbo I ↓GATC 116 87 0 15 22
Pst I CTGCA↓G 28 30 1 1 1
Pvu I CGAT↓CG 3 7 0 2 1
Sma I CCC↓GGG 3 12 0 1 0
Taq I T↓CGA 121 50 10 4 7
↓ = indică locul clivării; N = reprezintă orice nucleotidă; Gme = indică starea metilată a bazei
respective
46
Izolarea genelor din ADN genomic cu ajutorul enzimelor de restricţie constituie cea
mai simplă metodă de obţinere a unor fragmente de ADN ce pot conţine gena dorită. Metoda
constă în fragmentarea specifică a genomului unui organism cu ajutorul enzimelor de
restricţie, urmată de selecţia şi purificarea fragmentului dorit.
Fragmentarea a ADN cu ajutorul endonucleazelor de restricţie se bazează pe
proprietatea acestor enzime de a cliva moleculele de ADN la nivelul situsului de recunoaştere,
aşa cum este cazul endonucleazelor de tipul II. Acestea clivează ADN dublu catenar prin
ruperea a două legături fosfodiesterice, câte una pe fiecare catenă, producând fie extremităţi
drepte fie extremităţi decalate (ce determină prelungiri monocatenare lungi de 3, 4 sau 5 baze,
în funcţie de enzima folosită)(Cornea şi colab., 1998).
Cele mai multe situsuri de recunoaştere ale enzimelor de restricţie sunt palindromice,
astfel că prelungirile monocatenare formate de o anumită enzimă la extremităţile moleculei de
ADN sunt complementare, coezive ("lipicioase"), fapt care asigură legarea lor eficientă, pe
bază de complementaritate, indiferent de provenienţa moleculelor de ADN.
Cu toate avantajele sale, metoda se poate aplica numai dacă genomul organismului de
la care se doreşte izolarea unei gene se poate purifica, dacă i se cunoaşte harta genetică sau, şi
mai bine, harta sa de restricţie. Condiţia esenţială este ca enzima de restricţie folosită să
cliveze gena, astfel încât funcţia acesteia să rămână nealterată.
Atunci când nu există informaţii asupra localizării genelor, clivarea se face la
întâmplare, iar informaţiile obţinute sunt prelucrate astfel încât să permită stabilirea ordinii
situsurilor de restricţie şi apoi a identificării prezenţei genei (genelor) de interes la nivelul
fragmentelor selectate. Trebuie precizat faptul că examinarea exclusivă a mărimii
fragmentelor de restricţie nu oferă informaţii asupra localizării situsurilor de recunoaştere.
Pentru determinarea poziţiei situsurilor la nivelul moleculei de ADN analizate se aplică teste
suplimentare (fig.22).
Etapele unor asemenea teste sunt următoarele:
• ADN de interes este clivat mai întâi cu o anumită enzimă de restricţie, de exemplu, Pst
I, obţinându-se mai multe fragmente de restricţie de dimensiuni diferite
• Fragmentele obţinute cu prima enzimă sunt supune acţiunii unei alte enzime de
restricţie, de exemplu, Hind III, rezultând fragmente de dimensiuni mai mici
• Experimentul se reia prin inversarea ordinii de acţiune a celor două enzime de
restricţie, mai întâi Hind III şi apoi Pst I.
47
În final se compară dimensiunea fragmentelor finale şi se stabileşte ordinea situsurilor

de restricţie pentru Pst I şi Hind III.
Fig.22. Stabilirea localizării

situsurilor de restricţie la
nivelul unui fragment de ADN.
A. Fragmentul originar de 6,6
kb este clivat separat cu
enzimele Hind III şi PstI, iar
fragmentele obţinute sunt
digerate cu cealaltă enzimă de
restricţie.
B. Pe baza dimensiunii
fragmentelor obţinute prin
simpla şi dubla clivare s-a
stabilit ordinea situsurilor de
restricţie (după Snyder şi
Champness, 1997).
O altă metodă de stabilire a hărţii fizice este aceea a realizării unei „biblioteci” de
fragmente de restricţie de ADN provenit de la organismul analizat. După clivarea ADN cu o
enzimă de restricţie, fragmentele rezultate sunt introduse într-un vector de clonare şi apoi într-
o gazdă caracteristice, obţinându-se un număr mare de clone. Clonele sunt apoi analizate prin
folosirea hibridizării moleculare („Southern-blot hybridization”). Astfel, după separarea
electroforetică a fragmentelor de restricţie, acestea sunt denaturate iar ADN monocatenar este
transferat pe o membrană de nitroceluloză. Fragmentele respective sunt supuse apoi
interacţiunii cu o probă de ADN marcată radioactiv, determinându-se în acest fel care dintre
fragmentele de restricţie se suprapun unele cu altele. Odată ce clonele au fost identificate şi
ordonate, situsurile de restricţie sunt determinate la nivelul fiecărui fragment conform metodei
prezentate anterior, după care rezultatele obţinute pentru fiecare fragment în parte sunt
alăturate obţinându-se în acest fel cartarea întregii molecule de ADN supuse analizei.
48
Uşurinţa cu care genele de interes pot fi izolate depinde de localizarea lor pe

cromosomi. Pe baza efectelor lor fenotipice, a organizării la nivelul cromosomilor şi a
gradului de dificultate al izolării lor, genele de la procariote pot fi clasificate în mai multe
categorii:
• gene simple care codifică enzime monomere, ARNt, ARNr. Aceste gene sunt cel mai
uşor de izolat;
• gene complexe pentru proteine multimere, constituite din subunităţi diferite care,
deseori, nu sunt localizate grupat pe cromosomi;
• operoni pentru diferite căi metabolice;
• regloni sau minioperoni dispersaţi pe cromosom, având rol în controlul funcţiilor de
biosinteză;
• reglonii multipli, cum sunt cei ce controlează sinteza antibioticelor din precursori ai
mai multor căi metabolice diferite (Vătafu, 1995).
Pentru a stabili localizarea anumitor gene la nivelul unei molecule de ADN, deci pe o
hartă fizică, pot fi utilizate diferite metode, una dintre ele presupunând localizarea anumitor
mutaţii luând ca referinţă situsuri de restricţie cunoscute.
Organismele aparţinând unei anumite specii conţin aceleaşi gene, ordonate la fel la
nivelul hărţii genetice, dar între indivizi există unele diferenţe la nivelul secvenţei de
nucleotide din ADN. Aceste diferenţe asigură polimorfismul individual. Polimorfismul
genetic a fost utilizat din cele mai vechi timpuri, la început în mod empiric, pentru
ameliorarea organismelor: prin încrucişarea a doi indivizi diferiţi aparţinând aceleiaşi specii s-
au obţinut organisme noi, cu performanţe îmbunătăţite.
Deoarece diferitele forme ale unei gene se datorează variaţiilor în secvenţa de
nucleotide ce le alcătuieşte, poziţia situsurilor de restricţie pentru anumite enzime poate varia,
fenomenul putând fi evidenţiat electroforetic după migrarea fragmentele de ADN obţinute
prin clivarea cu o enzimă de restricţie. Tehnica a primit denumirea de RFLP („restriction
fragment lenght polymorphism”), ea fiind cuplată, de obicei, cu tehnica Southern blot pentru
caracterizarea unei regiuni de ADN (prin utilizarea unei probe de ADN specifică regiunii de
analizat)(fig.23)
La eucariote, unde harta genetică este departe de a fi cunoscută, apar dificultăţi
suplimentare în ceea ce priveşte obţinerea genelor prin metoda descrisă. In acest caz, deoarece
nu există informaţii suficiente asupra localizării genei de interes, prin utilizarea enzimelor de
49
restricţie pentru clivarea ADN genomic, se obţine o populaţie heterogenă (ca dimensiuni) de
fragmente de restricţie.
50
Fig.23. Reprezentarea schematică a etapelor tehnicii RFLP, aplicate în scopul identificării localizării
unei gene la nivelul unui fragment de restricţie, pe două probe de ADN (1 şi 2) (după Bougaize şi
colab.,2000)
Clonarea ulterioară a tuturor acestor fragmente (separate pe baza dimensiunii lor) în

vectori de clonare specifici şi apoi introducerea lor în E.coli permite obţinerea, aşa numitelor
"bănci genomice" ("biblioteci de gene"). Numărul de clone recombinate de E.coli ce trebuie
analizate pentru a găsi fragmentul ce conţine gena dorită (în funcţie de dimensiunea sa) este
dată de ecuaţia:
N = ln(1-p)/ln(1-x/y)
unde
N = numărul de clone ce trebuie analizate pentru a obţine secvenţa dorită cu o
probabilitate de 95% sau 99%
p = probabilitatea de obţinere a genei de interes (de obicei se alege 99%)
x = dimensiunea în kb a secvenţei integrate
y = dimensiunea în kb a genomului haploid al organismului analizat
ln = logaritm natural
Pentru analiza genomului celulelor eucariote se preferă folosirea unor enzime de
restricţie ce recunosc secvenţe mai lungi de nucleotide, astfel încât fragmentele rezultate să
aibă dimensiuni mai mari. Ulterior, clonarea acestora se face în vectori speciali, ce permit
inserarea unor secvenţe de dimensiuni mai mari, după care, selecţia genei de interes se poate
realiza prin diferite metode. O astfel de tehnică a fost folosită de Maxam şi colab.(1977)
pentru izolarea genei ce codifică sinteza ARNr 5S de la drojdii.
Tehnologia ADN recombinant presupune combinarea unor fragmente de ADN de
origini diferite astfel încât să se obţină o moleculă nouă, ce codifică funcţii specifice. Aşa cum
s-a precizat deja, fragmentele de ADN sunt obţinute, de obicei, cu ajutorul enzimelor de
restricţie care generează extremităţi monocatenare complementare. Deseori se pot folosi
fragmente de ADN obţinute prin utilizarea a două tipuri de enzime de restricţie, cu condiţia ca
cele două enzime să fie „compatibile”, adică să formeze acelaşi tip de extremităţi
monocatenare. De exemplu, în această categorie intră enzimele Bam HI, Bgl II, Sau 3A şi Bcl
I care formează extremităţi monocatenare de tip GATC.
51
Există şi enzime de restricţie (Hpa I, Eco RV, Sma I) care, prin acţiunea asupra ADN
ţintă, formează extremităţi drepte (extremităţi „oarbe” = „blunt ends”). Avantajul unor
asemenea extremităţi este că indiferent de enzima folosită, extremităţile formate sunt
compatibile putând fi utilizate pentru legare şi formarea moleculelor de ADN recombinant.
Eficienţa legării fragmentelor cu extremităţi drepte este însă cu mult mai mică decât cea
înregistrată prin folosirea fragmentelor cu extremităţi monocatenare complementare. Totuşi,
în anumite experimente este necesară legarea unor fragmente cu extremităţi necompatibile,
situaţie în care acestea sunt convertite la extremităţi drepte. Aceasta se realizează fie prin
îndepărtarea extremităţilor monocatenare în urma tratamentului cu nucleaza S1, fie prin
sinteza unei catene complementare utilizându-se ADN-polimeraza I (fragmentul Klenow).
2.1.2.2. Obţinerea ADN de interes prin utilizarea ADN polimerazelor
ADN polimerazele sunt enzimele necesare pentru sinteza ADN în timpul replicării
cromosomale sau a procesului reparator. ADN polimerazele catalizează formarea de legături
fosfodiesterice între nucleotidele de la capătul 3’OH al catenelor de ADN şi grupul α fosfat de
la nivelul dNTP libere, cu liberarea unei molecule de pirofosfat:
ADN polimeraza
(dNMP) n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
cationi bivalenţi (Mg2+)
Caracteristic acestor enzime este faptul că, pentru a acţiona, ele au nevoie de o
secvenţă de tip primer care să prezinte capătul 3’OH liber, alungirea catenei de ADN
realizându-se în direcţia 5’ → 3’ prin utilizarea unei alte catene de ADN drept matriţă. In
absenţa primerului, sinteza de ADN nu este posibilă.
Unele ADN polimeraze (cum este ADN polimeraza I produsă de E.coli) manifestă nu
numai activitate polimerazică ci şi exonucleazică în sensul 5’ → 3’ şi/sau 3’ → 5’ (eliminarea
pe rând a nucleotidelor fie de la capătul 3’ fie 5’). Activitatea exonucleazică în sensul 3’ → 5’
este asociată in vivo cu rolul reparator al polimerazei respective: recunoaşterea şi apoi
eliminarea nucleotidei incorect adăugată (necomplementară). Deseori însă, datorită activităţii
exonucleazice 5'→ 3' a ADN polimerazei I, apar probleme ce ţin de degradarea capătului 5' al
primerilor şi eliminarea grupărilor 5' fosfat de la capetele fragmentelor de ADN utilizate că
52
substrat pentru ligare. De aceea, activitatea exonucleazică 5'→ 3' poate fi eliminată prin
tratament proteolitic, obţinându-se un fragment de dimensiuni mari, numit fragment Klenow,
capabil de activitate ADN polimerazică şi exonucleazică 3'→ 5'.
2.1.2.2.1. ADN polimeraze termostabile şi tehnologia PCR
Elaborarea şi apoi perfecţionarea tehnologiei PCR (“Polymerase Chain Reaction”)

a determinat găsirea unor noi ADN polimeraze cu acţiune mai eficientă şi, eventual
termorezistente.
Tehnica PCR utilizează unele trăsături fundamentale ale replicării ADN: ADN-
polimeraza foloseşte ca matriţă ADN monocatenar pentru a determina sinteza unei catene noi,
complementară. Metoda permite amplificarea "in vitro" a unei secvenţe de ADN, de
aproximativ 10kb, de până la 106 ori; ea poate fi aplicată şi pentru amplificarea ARN dar,
pentru aceasta, mai întâi, se sintetizează o moleculă de ADNc şi apoi aceasta este multiplicată.
Pentru a realiza amplificarea unei anumite secvenţe de ADN este necesar să fie
cunoscute două mici secvenţe de ADN, care flanchează regiunea dorită. Aceste secvenţe sunt
apoi utilizate ca bază pentru sinteza chimică a doi primeri oligonucleotidici de aproximativ 20
baze, care sunt complementari cu regiunile corespunzătoare de pe ambele catene ale genei de
interes (fig.24).
Matriţa de ADN monocatenar este obţinută prin încălzirea unei soluţii de ADN dublu
catenar la o temperatură apropiată celei de fierbere şi apoi răcire bruscă, astfel încât cele două
catene complementare rămân despărţite (denaturate). La acest ADN denaturat se adaugă un
primer specific, necesar pentru iniţierea reacţiei de polimerizare catalizată de ADN-
polimerază, precum şi nucleotide.
În tehnica de multiplicare "in vitro", ambele catene ale unui fragment de ADN pot
servi ca matriţă pentru sinteza catenelor complementare, cu condiţia adăugării unor primeri
oligonucleotidici pentru fiecare dintre cele două catene. După un ciclu de replicare, amestecul
este încălzit pentru a se desface catenele nou sintetizate de cele vechi şi ciclul este reluat
(Benedetto, 1993). În acest fel, numărul de molecule de ADN nou sintetizate creşte în
progresie geometrică după fiecare ciclu de replicare, estimându-se că, spre exemplu, după 32
cicluri de replicare se pot obţine 1.073.741.824 molecule de ADN dublu catenar, pornind de
la o unică moleculă iniţială.
53
O etapă critică a acestei tehnici este alegerea primerilor specifici, dar utilizarea lor nu
mai face necesară izolarea prin alte metode a secvenţei dorite de ADN dintr-o populaţie
heterogenă de molecule de ADN. Cantitatea de ADN necesară ca material de start a reacţiei
este foarte mică, sub 1 μg de ADN genomic total, dar se poate amplifica o secvenţă de ADN
pornind chiar de la o singură moleculă.
5’….CTGACACAACTGTGTTCACTAGCAA…………….AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG…3’
3’….GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTT…………..…TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC….5’
încălzire (denaturare)
3’….GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTT………………TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC….5
adăugarea unor secvenţe

complementare (primeri)
3’ CCACTTGCACCTACTTCAACC 5’
5’ACACAACTGTGTTCACTAGG 3’
3’….GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTT……………TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC….5’
începerea sintezei de ADN

pornind de la capătul 3’ al primerilor
3’ TTCCACTTGCACCTACTTCAACC 5’
5’ACACAACTGTGTTCACTAGCAA 3’
3’….GACTGTGTTGACACAAGTGATCCTT………………TTCCACTTGCACCTACTTCAACCAC….5
Fig.24. Reprezentarea schematică a primerilor utilizaţi pentru amplificarea genei pentru β -globină
(după Watson şi colab., 1992). Secvenţele de 20 nucleotide marcate sunt folosite ca primeri pentru ca
ADN-polimeraza să-şi poată exercita funcţia de sinteză.
Prima etapă a procesului de amplificare presupune încălzirea soluţiei de ADN la 94oC,

timp de 5 minute, pentru a rupe legăturile de hidrogen, în aşa fel încât ambele catene
complementare separate să poată servi ca matriţă pentru ADN-polimerază. La acest ADN se
adaugă primerii oligonucleotidici ce vor fi folosiţi drept amorsă pentru ADN-polimerază, ca şi
amestecul celor patru dezoxiribonucleotide. Temperatura este apoi scăzută la 30-65 oC pentru
a asigura prinderea primerilor la secvenţele complementare din catena de ADN
54
corespunzătoare. Continuarea experimentului depinde de valoarea temperaturii la care se

desfăşoară acest eveniment (fig.25).
Următoarea etapă constă în creşterea temperaturii la 72oC; această temperatură se
menţine timp de 2-5 minute, pentru a se realiza procesul de polimerizare a ADN. Din nou,
temperatura este crescută la 94oC pentru 20 secunde, pentru ca noile catene sintetizate să se
desfacă de cele vechi, după care procesul se reia pentru 30-60 cicluri de sinteză.
Fig.25. Schema realizării reacţiei de polimerizare

în lanţ (PCR)(după Cornea şi colab., 1998)
1 – separarea catenelor originare şi adăugarea
primerilor (P1 şi P2);
2 – sinteza catenelor complementare pornind de
la primerii P1 şi P2;
3 – separarea celor două catene şi adăugarea unor
noi cantităţi de primeri;
4 – nouă rundă de sinteză a ADN;
5 – separarea catenelor şi adăugarea de noi
primeri;
6 – nouă rundă de sinteză, ciclurile putându-se
repeta.
Săgeata indică sensul sintezei ADN.
În fazele de început ale elaborării tehnicii PCR era necesar să se adauge, după fiecare
ciclu de sinteză, cantităţi noi de ADN polimerază, deoarece polimeraza de E.coli, fiind
termosensibilă, era denaturată în momentul creşterii temperaturii.
Cercetările realizate pentru optimizarea procesului de polimerizare, în sensul găsirii şi
utilizării unor ADN polimeraze capabile să reziste la variaţiile mari de temperatură pe care le
presupune tehnica menţionată au condus la izolarea şi caracterizarea Taq polimerazei. Aceasta
este o ADN polimerază termostabilă, ce acţionează eficient la temperaturi de 75-80oC.
Enzima a fost izolată de la o bacterie termofilă (Thermus aquaticus). Ca orice ADN
polimerază, ea nu poate iniţia "de novo" sinteza de ADN, ci necesită pentru acţiune prezenţa
unei secvenţe de nucleotide care să funcţioneze ca primer. O acţiune similară are şi enzima
55
Pfu polimeraza izolată de la o altă bacterie termofilă, Pyrococcus furiosus, ea manifestând în

plus şi o activitate exonucleazică 3’→ 5’, ceea ce îi măreşte fidelitatea. Utilizarea unei
asemenea enzime pentru sinteza ADN asigură o fidelitate de 12 ori mai mare decât cea
obţinută prin folosirea Taq polimerazei. Studierea bacteriilor din genul Thermus a permis
izolarea de la specia T.thermophilus a cinci ADN polimeraze termostabile, dintre care două s-
au dovedit eficiente în tehnologia PCR.
De asemenea, în ultimii ani au fost obţinute ADN polimeraze înalt termostabile prin
modificarea controlată a genelor ce codifică asemenea enzime la bacterii termofile cum sunt
Thermus thermophilus, Thermotoga maritima sau Thermococcus litoralis (Newton şi
Graham, 1997). Spre exemplu, ADN polimeraza recombinată notată Tth, obţinută prin
clonarea în E.coli a unei gene modificate ce codifică una dintre ADN polimerazele de la
T.thermophilus, s-a dovedit extrem de eficientă în sinteza ADN în anumite condiţii: adăugarea
ionilor de magneziu şi chelarea cationilor de mangan. Dacă însă ionii de mangan sunt
prezenţi, la temperaturi de aproximativ 70oC, enzima recombinată Tth manifestă activitate de
reverstranscriere, ceea ce permite utilizarea acestei enzime în experimentele de amplificare a
ADN pornind de la molecule matriţă de ARN (molecule bogate în secvenţe G-C sau care
prezintă structuri secundare).
Utilizarea Tth polimerazei pentru ARN-PCR prezintă unele avantaje faţă de procedeul
convenţional în care sunt folosite două enzime distincte (mai întâi se foloseşte o
reverstranscripază, care asigură sinteza unor molecule de ADNc, iar apoi se utilizează o
polimerază termostabilă pentru amplificarea fragmentului dorit). Avantajele constau în faptul
că se utilizează o singură enzimă ce manifestă, în funcţie de condiţiile de reacţie, fie activitate
reverstranscriptazică fie de ADN polimerază.
În privinţa surselor de ADN ce pot fi multiplicate prin PCR există mai multe
posibilităţi de obţinere a acestora. In primul rând, poate fi utilizat ADNc obţinut prin
reverstranscrierea ARNm şi introdus într-un vector de clonare, metoda numindu-se în acest
caz revers-PCR (RT-PCR). Condiţia ca reacţia de polimerizare să se desfăşoare este existenţa
primerilor oligonucleotidici complementari pentru anumite secvenţe din vector (de obicei,
secvenţele ce flanchează situsurile de clonare). În această situaţie se pot studia mai multe
tipuri de fragmente de ADN clonate într-un anumit vector, la nivelul situsului corespunzător
(cu secvenţa cunoscută). Metoda poate fi aplicată şi pentru identificarea secvenţelor de ADN
ai căror primeri nu sunt stabiliţi: selecţia fragmentelor obţinute prin clonare şi apoi
56
amplificare se face cu ajutorul unor metode variate (de exemplu, Southern blotting). Ulterior,
acest ADN poate servi pentru subclonare în diverse gazde sau se poate realiza secvenţierea sa.
Pornind de la această aplicaţie iniţială, metoda PCR a căpătat o largă utilizare în
diverse domenii ale biologiei moleculare. Astfel, prin intermediul ei se poate stabili existenţa
unor boli ereditare la nou-născuţi, de exemplu a fenilcetonuriei. Tot cu ajutorul tehnicii PCR
se pot amplifica secvenţe specifice din genom, cum este cazul secvenţelor Alu din genomul
uman (regiuni ce conţin aproximativ 106 copii ale unei secvenţe de 300 pb, dispersate în întreg
genomul uman). De asemenea, se poate determina eficienţa tratamentului unor tipuri de
cancer cu citostatice sau radiaţii, testul PCR permiţând să se stabilească dacă celulele maligne
au fost sau nu distruse.
O altă utilizare este legată de determinarea sexului fătului înainte de naştere, prin
utilizarea unor celule fetale. În acest caz se folosesc primeri pentru anumite secvenţe de ADN,
conţinute doar de cromosomul Y. Asemenea analize s-au făcut, în special la familii cu risc
mare de a avea urmaşi cu boli genetice X linkate.
Tehnica PCR este utilizată şi pentru studii moleculare asupra înrudirii filogenetice a
unor specii. Prin acurateţe şi sensibilitate, metoda a putut fi folosită chiar şi pentru
multiplicarea unor probe de ADN aparţinând unor organisme care au dispărut, pornind de la
resturi fosilizate ale acestora (tabelul 4).
Tabelul 4. Aplicarea tehnicii PCR pentru analiza unor probe de ADN străvechi (după Newton
şi Graham, 1997)
Originea probei Gena amplificată Mărimea Vârsta probei

de ADN ampliconului (pb) (ani)
Lupul marsupial ADNmt (cyt b) 116 ~100
ADNmt (ARNr 12S) 94
Oase umane ADNmt (NADH dehidrogenaza) 205 300-5500
Creier uman ADNmt (cyt b2) 471 7000
Mamut siberian ADNmt (cyt b) 375 47.000
Frunze fosile de Gene cloroplastice (rbc L) 820 17-20.000.000
magnolie
Viespi fosilizate ARNr 18S 555, 195 sau 597 30.000.000
în chihlimbar
Termite ADNmt (ARNr 16S) 150 30.000.000
fosilizate în ADN nuclear (ARNr 18S) 225
chihlimbar
In ultimii ani, tehnica PCR a servit ca punct de start pentru dezvoltarea unor tehnici
speciale de caracterizare a fragmentelor de ADN: tehnica RAPD („randomic amplified
polymorphic DNA”=„amplificare randomizată a ADN polimorfic”), AFLP („amplified
57
fragment lenght polymorphisms” = polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate”),

stabilirea microsateliţilor (secvenţe de TG sau CA repetate de 10-60 ori) sau VNTR („variable
number tandem repeats” = numărul variabil al repetiţiilor în tandem”). Dintre aceste metode,
cea mai mare utilizare o au tehnicile RAPD şi AFLP.
Tehnica RAPD presupune utilizarea unor secvenţe scurte de nucleotide (de
aproximativ 10 nucleotide) drept primeri arbitrari pentru amplificarea unor fragmente de
ADN faţă de care manifestă complementaritate, chiar dacă nu perfectă.
Metoda este utilizată frecvent în experimentele de amprentare genetică deoarece este
rapidă, necesită cantităţi scăzute de material şi este simplă din punct de vedere tehnic. Cu
toate acestea, deoarece complementaritatea primerilor nu este întotdeauna perfectă cu
fragmentele amplificate, metoda nu este aplicată în situaţiile în care este necesară o acurateţe
ridicată, aşa cum este cazul testelor de paternitate sau analizele de pedigree.
In schimb, metoda este utilizată pentru caracterizarea tulpinilor bacteriene aparţinând
aceluiaşi serotip sau pentru studiile de ameliorare a plantelor (la căpşun, grâu, ovăz, orz, soia,
tomate, cartof sau porumb), prin folosirea unor seturi de primeri arbitrari. Astfel, acelaşi
primer folosit pentru amplificarea unor fragmente de ADN provenite de la linii înrudite de
plante poate determina apariţia unui profil electroforetic diferit, ceea ce poate ilustra, de
exemplu, existenţa unor mutaţii la unele linii consangvine (fig.26).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Fig.26. Profilul electroforetic al fragmentelor de ADN de la diferite soiri de viţă-de vie, amplificate
prin utilizarea primerului GTGATCGCAG (tehnica RAPD)(după Mutulescu, 2002)
M.-ADNmarker (1 Kb); 1.- Profilul soiului Feteasca neagra; 2.- Profilul soiului Feteasca alba;3.-
Profilul soiului Feteasca regala; 4.- Profilul soiului Grasa de Cotnari; 5.- Profilul soiului Furmint; 6.-
Profilul soiului Coarna alba; 7.- Profilul soiului Coarna neagra; 8.- Profilul soiului Petit Sauvignon; 9.-
Profilul soiului Gros Sauvignon;
Tehnica AFLP se bazează pe amplificarea selectivă a unor fragmente de restricţie

provenite prin clivarea ADN genomic cu o anumită enzimă de restricţie. Astfel, după clivarea
ADN de analizat cu una sau două endonucleaze, la fragmentele rezultate, se adaugă adaptori
58
specifici, complementari cu extremităţile monocatenare generate de enzime. Se refac, în acest

fel, la extremităţile fragmentelor, situsurile de recunoaştere pentru enzimele folosite (fig.27).
Amplificarea se realizează prin utilizarea a 1-2 categorii de primeri a căror secvenţă de
nucleotide corespunde situsurilor de recunoaştere pentru enzimele de restricţie folosite (fig
27). Ca urmare, doar primerii complementari cu extremitatea 3’ a fragmentului de restricţie
vor realiza amplificarea, rezultând o populaţie de fragmente amplificate. Din această populaţie
de fragmente amplificate, prin utilizarea unor primeri cu o mai mare specificitate (conţin atât
nucleotidele corespunzătoare situsului de restricţie cât şi un număr de alte nucleotide, alese de
experimentator) sunt apoi selectate o serie de fragmente care pot avea valoare de markeri
moleculari. De remarcat că, în acest caz, primerii utilizaţi pot fi marcaţi radioactiv la
extremitatea 5’, prin folosirea unei polinucleotid kinaze şi a [γ-33P] ATP, iar după separarea
electroforetică în gel de poliacrilamidă 6% (care permite evidenţierea şi a fragmentelor foarte
mici), fragmentele amplificate sunt identificate prin autoradiografie.
Fig.27. Comparare a profilului

electroforetic al fragmentelor de
ADN genomic de la două tipuri
de albine, africane şi europene,
obţinute prin aplicarea tehnicii
AFLP (după Suazo şi Hall,
1999)
2.1.2.2.2. ADN-polimeraze dependente de ARN
Tipurile de ADN polimeraze menţionate mai sus utilizează drept matriţă o altă
moleculă de ADN (sunt dependente de ADN). Spre deosebire de acestea,
reverstranscriptazele realizează sinteza de ADN pornind de la o matriţă ARN (sunt ADN
polimeraze dependente de ARN), obţinându-se molecule de ADNc (complementar). Reacţia
de polimerizare depinde de existenţa celor patru deoxiribonucleotide trifosforilate în
59
concentraţie mare pentru a obţine un ADN complementar cu lungime mare. Omiterea unui
dNTP din amestecul de reacţie duce la oprirea polimerizării.
Obţinerea şi clonarea directă a ADN genomic mai ales la eucariote este tehnic mai
dificilă şi, în consecinţă, s-a recurs la o tehnică indirectă de sinteză a genei sub forma de ADN
complementar, pornind de la ARNm corespunzător. Tehnica a fost denumită
reverstranscriere şi se bazează pe utilizarea unei enzime specifice, reverstranscriptază, de
origine virală.
In acest scop, ARNm este izolat din celulele ţesutului în care gena dorită se exprimă la
maximum. În anumite condiţii fiziologice favorabile, un anumit tip de ARNm poate
reprezenta între 0,1 şi 10% din cantitatea de ARNm celular total. În alte cazuri el este prezent
în cantităţi foarte mici. Izolarea ARNm şi identificarea tipului dorit presupune anumite
dificultăţi. În general, alegerea unui anumit tip de ARNm se poate face prin determinarea
capacităţii de a controla sinteza unei proteine specifice în sisteme acelulare sau prin hibridare
cu oligonucleotide sintetice.
Deoarece la eucariote ARNm matur prezintă la capătul 3' OH o extremitate lungă de
până la 150 nucleotide = capăt poliadenilat, pentru a se iniţia sinteza ADN complementar se
foloseşte o secvenţă sintetică oligo dT, lungă de aproximativ 10 nucleotide (resturi de timină),
care va fi cuplată cu extremitatea poliadenilată. Această secvenţă constituie de fapt primerul
de la care va începe polimerizarea nucleotidelor de către reverstranscriptază (fig.28).
Fig.28. Reprezentarea schematică a

etapelor procesului de sinteză a ADNc
prin procesul de reverstranscriere
60
Toate variantele de clonare a ADN complementar dublu catenar pornesc de la sinteza

unei copii ADN pe matriţa de ARNm cu ajutorul reverstrancriptazei. Această copie
monocatenară de ADN este convertită la forma dublu catenară cu ajutorul unei ADN-
polimeraze "normale", după ce mai întâi se îndepărtează ARNm matriţă prin tratament cu
RN-aza H (enzimă ce degradează în mod specific ARN din duplexul ARN-ADN). ADN
complementar monocatenar obţinut prin reverstranscriere are la capătul 3' o buclă în "ac de
păr", formată prin interacţiunea intramoleculară a bazelor componente. Pornind de la acest
capăt, se iniţiază sinteza catenei complementare (bucla funcţionând ca "primer"), cu ajutorul
unei ADN polimeraze.
După încheierea sintezei catenei complementare (legată covalent de catena matriţă) se
elimină bucla monocatenară prin folosirea unei nucleaze (nucleaza S1).
Deseori nu este posibil să se separe un anumit tip de ARNm, în aceste situaţii fiind
preferată varianta obţinerii bibliotecilor de ADN complementar; pornind de la ARNm total,
izolat din anumite tipuri de celule. Obţinerea bibliotecii complete sau parţiale de molecule de
ADNc de la un anumit organism se face prin convertirea întregii populaţii de ARNm, sau doar
a unei porţiuni din ea, în ADN complementar (ADNc).
Moleculele de ADNc prezintă importanţă pentru clonarea genelor dar, în acelaşi timp,
reprezintă şi o sursă pentru obţinerea unor probe în vederea hibridizării, folosite ulterior
pentru purificarea de ARNm specific.
Pentru a alege celulele în care gena de interes s-a integrat, este necesar să se analizeze
un număr foarte mare de clone recombinate. Teoretic, numărul de colonii ce trebuie analizate
poate fi calculat pe baza următoarei ecuaţii:
N = ln(1-p)/(1-n)
unde
N = numărul de clone de trebuie analizate
p = probabilitatea de izolare a clonei dorite (de obicei 0,95 sau 0,99)
n = proporţia reprezentată de ARNm corespunzător genei de interes din totalul
populaţiei de ARNm
ln = logaritm natural.
61
Spre exemplu, pentru a identifica o clonă ce conţine ADNc de interes, ştiind că n =

1000 (deci ARNm de la care s-a pornit pentru sinteza genei este relativ rar în celulele utilizate
pentru purificare), este necesar să se analizeze 5000 de clone recombinate. În cazul celulelor
mamaliene ce pot conţine aproximativ 20.000 tipuri diferite de ARNm, pentru a identifica o
anumită secvenţă ADNc trebuie analizate 106 clone.
În prezent există două forme comerciale ale enzimei reverstranscriptază: una ce
provine de la virusul mieloblastozei aviare (din culturi celulare infectate cu acest virus), iar
alta a fost izolată din celule de E.coli (tulpini modificate genetic), ce conţin clonată gena
corespunzătoare de la virusul leucemiei murine.
Enzima aviană este alcătuită din două catene polipeptidice care prezintă atât activitate
polimerazică, cât şi o puternică activitate de RN-ază H. Enzima murină este alcătuită dintr-o
singură catenă polipeptidică cu puternică activitate polimerazică şi o mai slabă activitate de
RN-ază H. Această slabă activitate RN-azică este considerată ca avantaj atunci când se
doreşte sinteza de ADNc, pornind de la molecule lungi de ARNm.
Procesul începe prin adăugarea la amestecul de reacţie a unor oligonucleotide dT care
se leagă, prin complementaritate la capătul 3' al ARNm (la nivelul secvenţei poliA). Se
constituie astfel secvenţa primer necesară ADN polimerazei pentru a-şi începe acţiunea.
Hibrizi ARN-ADN obţinuţi sunt supuşi acţiunii RN-azei (de tip RN-aza H) a
reverstranscriptazei: aceasta începe să degradeze matriţa de ARN, eliberând catena de ADNc.
Ulterior, prin folosirea unei ADN-polimeraze corespunzătoare (ADN-polimeraza I) se
sintetizează catena complementară a ADNc, obţinându-se o moleculă de ADN dublu-catenară
ce poate fi inserată într-un vector adecvat.
2.1.2.2.3. Terminal-transferaza
Un tip special de ADN polimerază este terminal transferaza (TT) care adaugă
mononucleotide la capătul 3’ OH liber al ADN monocatenar, ADN dublu catenar sau chiar al
ARN, acţiunea enzimatică nefiind dependentă de existenţa unei matriţe ADN. Terminal
transferaza este folosită în practică pentru adăugarea de extremităţi homopolimere, de obicei
la nivelul unor fragmente de ADN sau, în anumite situaţii, pentru adăugarea unei singure
nucleotide modificate de tipul dideoxinucleotidelor (in cazul experimentelor de secvenţiere).
Activitatea enzimatică este condiţionată de prezenţa în amestecul de reacţie a ionilor de Co2+
62
(preferaţi în cazul în care se doreşte adăugarea purinelor) sau Mg2+ (preferaţi pentru adăugarea
pirimidinelor)(Cornea şi colab., 1998).
2.1.2.3. Obţinerea ADN de interes prin sinteză chimică
Sinteza moleculelor mari de ADN pe cale pur chimică prezintă serie de dificultăţi care
apar, în principal, la asamblarea nucleotidelor pentru obţinerea catenelor polinucleotidice
lungi. Aceste dificultăţi au determinat ca sinteza totală a unei gene să nu fie realizată numai
prin metodele chimiei organice. În aceste cazuri se combină metodele chimice care permit
doar sinteza unor oligonucleotide cu o secvenţă dorită, cu metodele biochimice ce asigură
legarea oligonucleotidelor între ele. Strategia adoptată pentru sinteza chimică a unor gene a
implicat realizarea a două etape fundamentale, şi anume:
• sinteza chimică a unor segmente oligodeoxinucleotidice cu lungimea medie de 8-12
unităţi;
• legarea „cap-coadă” a segmentelor respective, într-o ordine identică celei din gena
naturală, cu ajutorul ADN-ligazei;
Prima sinteză chimică a unei gene, cea care codifică sinteza ARNt pentru alanină,
efectuată de Khorana şi colab. (1970), a fost considerată, pe drept cuvânt, ca marcând debutul
ingineriei genelor ca domeniu de activitate.
Sinteza s-a făcut sub forma unor mici fragmente oligonucleotidice, pornind de la
fosfodiesteri. Condensarea succesivă a blocurilor oligonucleotidice a determinat formarea
unor secvenţe mai mari de oligonucleotide. În timpul reacţiilor de condensare are loc blocarea
selectivă a grupărilor funcţionale ale nucleotidelor cu grupări chimice protectoare şi păstrarea
liberă numai a acelor grupări care intră în reacţie în momentul dorit. Randamentul de obţinere
a fragmentelor de ADN scade pe măsură ce lungimea catenei creşte, astfel că produşii finali
se obţin în cantităţi mici. Fiecare etapă de condensare este controlată şi însoţită de purificarea
produsului obţinut. Segmentele obţinute în acest mod sunt monocatenare, fiind apoi
fosforilate la capătul 5' cu ajutorul kinazei de fag T4 după care se face legarea ordonată a
segmentelor obţinute cu ajutorul ligazei.
63
Itakura şi colab. (1970) au realizat o altă metodă, mai rapidă, pentru sinteza de ADN.
Aceasta presupune parcurgerea mai multor etape:
• sinteza unor trimeri cu secvenţa bazelor prestabilită;
• cuplarea trimerilor între ei pentru obţinerea de oligonucleotide cu secvenţa bazelor
dorită;
• legarea oligonucleotidelor între ele cu ajutorul ADN-ligazei, pentru a obţine genele de
interes.
În prezent există adevărate "maşini de fabricat gene" care, asistate de un
microprocesor, sunt capabile să sintetizeze ADN monocatenar pe baza unei secvenţe date
(introdusă în computer), lungă de aproximativ 40 nucleotide, asigurând legarea unei
nucleotide la fiecare 30 minute. Sinteza chimică a ADN are o serie de avantaje:
• permite producerea de gene funcţionale, chiar dacă nu se cunoaşte secvenţa bazelor
din ADN natural. Sinteza se realizează pe baza secvenţei de aminoacizi din proteina
dorită, care este mai uşor de determinat. Deoarece prezenţa intronilor blochează
exprimarea unei gene de tip eucariot în E.coli, sinteza chimică, ca de altfel şi ADNc
sintetizat pe baza ARNm matur, furnizează o versiune scurtată a genei respective (ce
conţine doar secvenţe exonice), funcţională în E.coli;
• deoarece bacteriile şi celulele animale tind să utilizeze anumiţi codoni în mod
preferenţial pentru un anumit aminoacid, în sinteza chimică pot fi utilizaţi codonii cei
mai potriviţi pentru gazda în care se doreşte exprimarea genei;
• în cursul sintezei chimice pot fi introduse substituiri de aminoacizi care modifică
avantajos proprietăţile biologice ale proteinelor codificate de gena sintetică.
In prezent, prin sinteză chimică s-au obţinut unele gene de dimensiuni mai mici (de
exemplu, secvenţele codificatoare ale insulinei umane) şi, de asemenea, se obţin primerii
necesari proceselor de sinteză enzimatică a genelor (prin reverstranscriere, prin tehnologia
PCR sau prin folosirea altei ADN polimeraze).
2.1.2.4. Alte enzime utilizate în tehnologia ADN recombinant
Pentru obţinerea moleculelor de ADN recombinant este necesară utilizarea unor

enzime ce catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice dintre extremităţile 3' OH şi 5' P ale
fragmentelor de ADN participante la realizarea respectivelor molecule hibride. Aceste enzime
au fost denumite ADN-ligaze.
64
Studiul ligazelor a început în urma observaţiilor experimentale efectuate asupra

proceselor de recombinare, procese în care au loc ruperi şi apoi reuniri ale moleculelor de
ADN, ca şi prin constatarea faptului că, în procesul de infectare a E.coli cu bacteriofagul λ ,
ADN fagic pătruns în celula bacteriană trece din forma lineară într-o formă circulară.
Aceste fapte au sugerat existenţa în celulele bacteriene a unor mecanisme de legare
enzimatică a moleculelor lineare de ADN. In anul 1967 a avut loc descoperirea enzimelor
implicate în procesele amintite mai sus atât în celulele de E.coli infectate cu bacteriofagul T4
cât şi în cele neinfectate. Identificarea acestor enzime a coincis cu ipoteza enunţată de
Okazaki privind mecanismul de replicare segmentară a ADN, prin fragmente scurte care sunt
unite ulterior într-o catenă continuă. Prin aceasta s-a definit şi rolul major al ADN-ligazelor ca
parte integrantă a mecanismelor de replicare a ADN.
După descoperirea ligazelor din E.coli neinfectate cu bacteriofagi, activităţi similare
acestei ligaze au fost observate şi într-o mare varietate de ţesuturi provenite de la organisme
eucariote (în splina şi măduva osoasă de iepure, în microsporocitele de crin că şi în celulele
infectate cu virusul sarcomului Rous, în mieloame murine etc.). Aceste date demonstrează
existenţa ADN ligazelor la toate organismele vii, ele fiind esenţiale pentru replicarea
materialului genetic şi pentru menţinerea integrităţii sale.
Pentru a se putea realiza legarea fragmentelor de ADN, este necesar că în amestecul de
reacţie să existe o serie de elemente:
• cofactorii specifici ai ligazei (NAD pentru ligaza de E.coli şi ATP pentru ligaza de fag
T4)
• ioni de magneziu, în concentraţie optimă de 10mM
• ditiotreitol; în absenţa sa activitatea enzimei se reduce la 25% (fig.28). Înlocuirea
ditiotreitolului cu β -mercaptoetanol duce, de asemenea, la scăderea cu 60% a
activităţii enzimei.
In experimentele de inginerie genetică este preferată ADN-ligaza de fag T4, datorită
proprietăţilor sale. Pentru obţinerea sa se porneşte de la o cultură bacteriană de E.coli B,
infectată cu bacteriofagul T4, din care apoi se separă enzima activă.
Pentru îmbunătăţirea randamentului de obţinere a enzimei a fost creat în mod artificial
un bacteriofag λ în care a fost inclusă gena 34 provenită de la fagul T4 (gena răspunzătoare
de sinteza ligazei). Cu acest bacteriofag a fost lizogenizată o tulpină de E.coli. Pentru
obţinerea ligazei se face inducţia fagului cu ajutorul temperaturii (42oC) şi apoi se procedează
la purificarea enzimei. Cu ajutorul acestei metode cantitatea de enzimă obţinută pornind de la
65
acelaşi volum de cultură bacteriană este de 500 ori mai mare. Ligaza de fag T4 este capabilă
de a lega atât fragmentele de ADN cu extremităţi coezive cât şi fragmente cu extremităţi
drepte (fig.29).
Testarea activităţii enzimatice în procesul de purificare se realizează prin mai multe
procedee dintre care, cel mai rapid presupune reconvertirea ADN plasmidial linearizat la
forma circulară. Cele două forme, circulară şi lineară migrează diferit în gel de agaroză şi, în
consecinţă, se poate recunoaşte şi activitatea ligazei.
a) legarea fragmentelor de ADN cu extremităţi coezive
5’ … pApCpG-OH pGpApTpCpCpGpT … 3’
3’ … TpGpCpCpTpApGp OH-GpCpAp …5’
ATP Mg2+ ↓
5’ … pApCpGpGpApTpCpCpGpT … 3’
3’ … TpGpCpCpTpApGpGpCpAp …5’
b) legarea fragmentelor de ADN cu capete drepte
5’ … pApCpGpG-OH pApTpCpCpGpT … 3’
3’ … TpGpCpCp OH-TpApGpGpCpAp …5’
ATP Mg2+
5’ … pApCpGpGpApTpCpCpGpT … 3’
3’ … TpGpCpCpTpApGpGpCpAp …5’
Fig.29. Modalităţile de acţiune ale ADN ligazei de fag T4
Fosfataza alcalină este o enzimă care catalizează îndepărtarea grupării fosfat de la

capătul 5' al ADN sau ARN, ceea ce determină defosforilarea fragmentelor respective.
Enzima poate fi de origine bacteriană sau poate fi izolată din intestin de viţel.
Fosfataza alcalină bacteriană este mai activă decât cea eucariotă; este termostabilă şi
rezistă la acţiunea unor detergenţi. Pentru blocarea reacţiei de defosforilare, acţiunea enzimei
este inhibată prin diferite metode: tratament cu proteinază K, folosirea EDTA sau încălzirea la
75oC.
Cel mai adesea, fosfataza alcalină este utilizată pentru îndepărtarea grupării fosfat de
la capătul 5' al ADN, în scopul prevenirii autocircularizării plasmidelor sau „autolegarea”
66
fragmentelor obţinute prin acţiunea unor enzime de restricţie care generează capete coezive
(fig.30).
Atunci când plasmidele linearizate defosforilate sunt utilizate pentru clonare (pentru
introducerea la nivelul lor a unor fragmente de ADN şi apoi tratare cu ligaza) ele sunt supuse
unor tratamente specifice care inhibă acţiunea fosfatazei alcaline.
Fig.30. Reprezentarea schematică a utilizării fosfatazei alcaline în experimentele de clonare

moleculară
Polinucleotid-kinaza de fag T4 este utilizată pentru transferul unui grup fosfat de la

ATP la capătul 5' al ADN sau ARN, ea având o acţiune inversă fosfatazei alcaline. Datorită
acestei acţiuni, enzima poate fi utilizată pentru marcarea radioactivă a capetelor 5' ale ADN în
experimentele de secvenţiere prin metoda Maxam şi Gilbert sau pentru analiză cu nucleaza S1
67
şi pentru fosforilarea linkerilor sintetici sau a altor fragmente de ADN la care lipsesc grupările
5' fosfat necesare pentru legare.
Nucleaza S1 este o enzimă izolată din Aspergillus oryzae, care determină degradarea
ADN sau ARN monocatenar generând mono- sau oligonucleotide 5’ fosfat. De regulă, ADN
sau ARN dublu-catenar precum şi hibrizii ADN-ARN prezintă rezistenţă la acţiunea acestei
enzime. Cu toate acestea, acizii nucleici dublu-catenari sunt digeraţi complet în prezenţa unor
cantităţi mari de nuclează S1.
Utilizarea în experimente a unor cantităţi moderate de enzimă determină clivarea
acizilor nucleici dublu-catenari doar la nivelul unor crestături, generând fragmente de
dimensiuni mari. Această enzimă poate fi utilizată pentru: analizarea structurii hibrizilor
ADN–ARN; pentru îndepărtarea cozilor monocatenare de la nivelul fragmentelor de ADN
determinând formarea de extremităţi drepte; pentru crestarea buclei de tip “ac de păr” formată
în cursul procesului de reverstranscriere.
2.1.3. Vectori de clonare
Un vector de clonare reprezintă o moleculă de ADN în care este integrat fragmentul de

ADN de interes obţinându-se molecule recombinate. Acestea sunt apoi introduse într-o gazdă
specifică pentru exprimarea informaţiei genetice noi.
Pentru a putea fi utilizat în experimentele de clonare, un vector trebuie să
îndeplinească mai multe condiţii:
• să prezinte markeri genetici selectabili (cum ar, fi rezistenţa la antibiotice);
• să aibă mai multe situsuri unice de clivare cu enzime de restricţie, la nivelul
unor regiuni neesenţiale ale vectorului;
• să i se cunoască secvenţa de nucleotide;
• să prezinte siguranţă în folosire (să aibă o transmisibilitate redusă în prezenţa
unor plasmide conjugative, iar replicarea să fie sensibilă la temperatura
corpului mamiferelor);
• să aibă o greutate moleculară mică şi să prezinte cât mai multe copii per celulă
(eventual să fie amplificabil prin tratament cu cloramfenicol);
• să fie uşor de purificat, să permită obţinerea unor cantităţi mari, suficiente
pentru experimentele de clonare.
68
Cercetările efectuate până în prezent asupra particularităţilor vectorilor de clonare au

determinat completarea caracteristicilor deja menţionate cu altele noi pe care ar trebui să le
îndeplinească vectorii ideali:
• să prezinte dimensiuni din ce în ce mai reduse dar să permită clonarea unor
fragmente mari de ADN heterolog;
• să conţină un număr crescut de situsuri unice de restricţie grupate la nivelul
unei regiuni specifice numită situs multiplu de clonare ("multiple cloning
site");
• să conţină secvenţe specifice de ADN ce permit selecţia rapidă a clonelor
recombinate (selecţie directă pe medii specifice sau selecţie prin teste
histochimice);
• să prezinte secvenţe care să asigure generarea de molecule monocatenare
necesare tehnicilor de secvenţiere sau pentru construirea de sonde de ADN;
• să conţină secvenţe specifice de tip promotori, terminatori, activatori
(enhanceri) ce asigură transcrierea "in vitro" a ADN clonat.
Cei mai cunoscuţi şi mai utilizaţi vectori de clonare sunt cei derivaţi de la plasmidele
bacteriene. Deşi multe dintre plasmidele naturale îndeplinesc o parte dintre caracteristicile
unui vector ideal, s-a preferat prelucrarea lor "in vitro", în sensul eliminării sau adăugării
anumitor secvenţe, care să permită obţinerea unei eficienţe mari în experimentele de clonare
de gene. În acest fel, Boyer şi colab. au "construit" în laborator o plasmidă hibridă, pornind de
la trei plasmide naturale: pSC101, pMB1 (derivat de la ColE1) şi RSF2124. Această
plasmidă, denumită pBR322, a reprezentat, pentru mult timp, vectorul cel mai frecvent utilizat
în clonarea de gene în E.coli.
Perfecţionarea tehnicilor de prelucrare „in vitro” a materialului genetic a permis
înlocuirea acestui vector (şi a derivaţilor săi) cu vectori noi, care asigură exprimarea mai
eficientă a genelor clonate (de exemplu, vectorii de exprimare). Dintre particularităţile
plasmidei pBR322 menţionăm:
• are dimensiuni mici, conţinând 4362pb (2,9 MDa);
• prezintă o replicare relaxată, având un număr mare de copii/celulă (conţine
secvenţa ori de la plasmida ColE1);
• este amplificabilă prin tratament cu cloramfenicol;
• este uşor de purificat;
69
• conţine doi markeri genetici de selecţie: gena de rezistenţă la tetraciclină

(derivată de la plasmida pSC101) şi gena de rezistenţă la ampicilină (derivată
din plasmida RSF2124);
• are mai multe situsuri unice de restricţie pentru diferite enzime de restricţie:
EcoRI, Bam HI, Pst I, Hind III, Sal I etc;
• permite clonarea inserţională deoarece conţine situsuri unice de restricţie în
genele marker: Bam HI în gena de rezistenţă la tetraciclină şi Pst I în gena de
rezistenţă la ampicilină (fig.31).
Majoritatea vectorilor de clonare obţinuţi până în prezent sunt specifici pentru E.coli
dar, pentru că în experimentele de clonare sunt utilizate gazde foarte variate, au fost construiţi
vectori specifici pentru acestea, ei fiind prezentaţi într-un capitol următor. Vom prezenta în
continuare principalele tipuri de vectori de clonare pentru E.coli.
Fig.31. Harta genetică a plasmidei

pBR322
Ampr = gena de rezistenţă la
ampicilină; Tetr =gena de
rezistenţă la tetraciclină; ori =
originea replicării plasmidei
În general, pentru clonarea de gene în celulele de E.coli se pot folosi mai multe tipuri
de vectori care, în funcţie de structură şi mod de funcţionare, pot fi: vectori plasmidiali,
vectori virali şi vectori hibrizi. La rândul lor, vectorii hibrizi pot fi fagimide (cu structură
hibridă, de plasmidă şi de fag filamentos) sau cosmide (cu structură hibridă, de genom de fag
λ şi de plasmidă). Pe lângă aceste categorii corespunzătoare originii lor, vectori de clonare
mai pot fi clasificaţi şi în funcţie de alte criterii (Stoica, 1997):
1. în funcţie de posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN clonate:
• vectori de clonare (permit doar clonarea unei anumite secvenţe de
ADN, nu şi analiza exprimării sale, deoarece nu conţin secvenţe
promotor)
70
• vectori de exprimare (au în structura lor secvenţe promotor, astfel că

permit, inclusiv exprimarea fragmentului de ADN clonat, determinând,
în anumite situaţii, obţinerea de proteine de fuziune)
2. în funcţie de tehnica folosită pentru clonarea fragmentului de ADN de interes:
• vectori de clonare inserţională (ADN de interes este introdus la nivelul
unui situs unic de restricţie din vector)
• vector de clonare prin înlocuire (ADN străin înlocuieşte un fragment
din vector, după fragmentarea acestuia cu două enzime de restricţie).
3. în funcţie de spectrul de gazde (posibilitatea replicării şi menţinerii stabile a
vectorului):
• vectori congenerici (pot fi folosiţi doar la organisme aparţinând
aceluiaşi gen taxonomic)
• vectori de tip "shuttle" (naveta) (se replică şi se menţin stabil în două
gazde microbiene diferite).
Un grup modern de vectori plasmidiali este reprezentat de vectorii de tip pUC (pUC
18, pUC19).
Aceşti vectori au fost construiţi între anii 1982-1985 de către grupul de cercetători
conduşi de Messing, denumirea vectorilor reprezentând locul unde aceştia au fost obţinuţi
(plasmid of University of California). Ei sunt derivaţi de la pBR322, prin includerea genei
lacZ' (partea din gena pentru β -galactozidază ce codifică secvenţa NH2-terminală a proteinei
= peptidul α ce conţine primii 145 de aminoacizi din cei 1023 câţi are fiecare dintre catenele
tetramerului β -galactozidaza) şi a unei secvenţe sintetice (polilinker de 54 perechi de baze)
ce conţine situsuri unice de recunoaştere pentru mai multe enzime de restricţie (13 enzime de
restricţie)(fig.32).
71
Fig.32.Reprezentarea schematică
a vectorilor de tip pUC (pUC 18
şi pUC 19)
Prezenţa fragmentului din gena lacZ permite complementaţie intraalelică de tip α cu

o altă formă defectivă a genei lacZ' (ce codifică regiunea COOH-terminală a β -
galactozidazei – formei respective de peptid îi lipsesc aminoacizii din poziţiile 11-41 existenţi
în β -galactozidază) dintr-o gazdă bacteriană adecvată (fig.33).
În urma procesului de complementaţie genică, tulpina defectivă dar purtătoare a
vectorului nerecombinat este capabilă să refacă integral enzima β-galactozidaza.
Vector de clonare Bacteria mutantă care nu produce β-galactozidază

H2N COOH
x
1 145 41 1023
Bacterie transformată capabilă să sintetizeze β-galactozidază
Fig.33. Reprezentarea schematică a procesului de complementaţie genică
Sub acţiunea IPTG (inductor al genei lacZ), o asemenea tulpină este capabilă să
degradeze analogul lactozei, X-gal (substrat cromogen), coloniile formate fiind albastre. De
asemenea, prezenţa acestei gene permite selectarea clonelor recombinate (a celor care conţin
plasmide în care a fost integrat un fragment de ADN străin, la nivelul polilinkerului): aceste
colonii manifestă rezistenţă la ampicilină şi sunt albe, în timp ce coloniile nerecombinate sunt
albastre (în prezenţa X-gal şi a inductorului specific = IPTG).
72
2.1.3.1. Vectori derivaţi de la fagul λ
Aşa cum se cunoaşte, bacteriofagul λ are un genom reprezentat de o moleculă lineară

de ADN dublu catenar, ce conţine 48502 perechi de baze. La capetele acestei molecule lineare
se găsesc secvenţe specifice, complementare (coezive) de 12 nucleotide (situsul cos), care
permit circularizarea ADN fagic în celulele bacteriene infectate (tulpini de E.coli).
În forma sa naturală, fagul λ poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvenţe de
ADN din genomul gazdei în care s-a multiplicat (după ce a parcurs ciclul lizogen),
dimensiunea acestora fiind limitată de capsida fagică. De asemenea, numărul mare de situsuri
de recunoaştere pentru enzime de restricţie, plasate la nivelul unor regiuni esenţiale pentru
evoluţia litică a fagului limitează utilizarea sa ca vector de clonare. Cu toate acestea,
pornindu-se de la genomul fagului λ , prin prelucrări "in vitro" au fost construiţi o serie de
vectori de clonare, încadraţi în două categorii: vectori de înlocuire şi vectori de inserţie.
Pentru a se putea obţine asemenea vectori, genomul fagului λ a fost modificat: au
fost eliminate situsurile de restricţie din zonele esenţiale, iar prin folosirea oligonucleotidelor
sintetice, situsurile de restricţie au fost plasate în poziţiile cele mai favorabile pentru clonare.
Mai mult, ştiind că regiunea centrală a genomului viral (aproximativ o treime din genom) nu
este esenţială pentru evoluţia litică, ea poate fi ori eliminată complet, ori înlocuită cu ADN de
interes.
Vectorii de înlocuire (substituţie) se caracterizează prin faptul că ADN heterolog

înlocuieşte un fragment neesenţial din vector, după ce acesta a fost tratat cu două enzime de
restricţie ale căror situsuri de acţiune flanchează respectiva regiune virală.
Asemenea vectori permit clonarea unor fragmente de ADN de 9-23 kb, fiind folosiţi,
de obicei, pentru obţinerea bibliotecilor de gene (colecţie de vectori recombinaţi ce conţin
fragmente de restricţie de ADN genomic de la o anumită specie). Din această categorie fac
parte vectorii de tip λ Charon şi λ EMBL.
Vectorii λ Charon sunt vectori care permit doar clonarea unui anumit fragment de
ADN străin, nu şi exprimarea sa. Aceşti vectori au fost obţinuţi prin introducerea unor
modificări importante la nivelul genomului fagului λ : deleţii la nivelul regiunii de imunitate;
mutaţii la nivelul genei cI (vectorul nu poate fi menţinut în stare lizogenă); deleţia genelor
necesare ataşării şi integrării; mutaţii la nivelul genelor pentru proteinele capsidale A şi B, etc.
73
Vectorii de acest tip (Charon 4A, Charon 40) prezintă două grupe de situsuri de clonare
(MCS) la capetele unei regiuni neesenţiale a ADN viral, astfel că aceasta poate fi înlocuită de
ADN străin.
Pentru a se realiza clonarea, atât vectorul cât şi ADN străin sunt trataţi cu o aceeaşi
endonuclează de restricţie (al cărei situs se regăseşte la nivelul MCS din vector); fragmentele
rezultate se amestecă şi se tratează cu ligază, obţinându-se vectorul recombinat. După introdu-
cerea vectorului recombinat într-o gazdă corespunzătoare (E.coli recA-) se realizează selecţia
fagilor recombinaţi din plajele de liză, produse la nivelul tulpinii bacteriene sensibile, ei fiind
analizaţi ulterior pentru determinarea caracteristicilor fragmentului de ADN clonat.
Vectorii λ EMBL sunt tot vectori de clonare prin înlocuire, la care regiunea
neesenţială a genomului viral este flancată de două situsuri de policlonare (MCS). La nivelul
regiunii neesenţiale se găsesc genele red şi gam implicate în recombinare (prezintă deci
fenotip Spi+, ceea ce înseamnă că în gazde lizogene pentru fagul P2 asemenea vectori nu se
pot dezvolta, deci nu produc plaje de liză)(fig.34).
Genele de interes ce sunt clonate la nivelul unor asemenea vectori înlocuiesc regiunea
virală neesenţială, fără a afecta funcţionarea vectorului. Selecţia vectorilor recombinaţi se
realizează în gazde specifice, lizogene pentru fagul P2, prin apariţia plajelor de liză
(eliminarea genelor red şi gam determină apariţia fenotipului Spi-, deci formarea de plaje de
liză).
Fig.34. Reprezentarea schematică a vectorului λ EMBL 4: A-R = gene ale bacteriofagului λ; red, gam
= gene fagice; trp = genă ce codifică sinteza triprofanului; MCS = situs de policlonare ce conţine
secvenţele de recunoaştere pentru enzimele de restricţie EcoRI, BamHI şi SalI.
Vectorii de inserţie se caracterizează prin faptul că ADN de interes este clonat la

nivelul unui situs unic de restricţie, localizat la nivelul unei gene neesenţiale pentru evoluţia
litică a fagului. Din această categorie fac parte vectorii de tip λ gt şi cei de tip λ ZAP.
74
Vectorii λ gt sunt vectori de clonare şi exprimare, ce permit introducerea unor

fragmente mici de ADN străin (de până la 6kb). Din aceasta categorie menţionăm vectorii
λ gt 10 şi λ gt 11. În cazul vectorului λ gt 10, situsul unic de restricţie (EcoRI) la nivelul
căruia se poate clona ADN de interes se găseşte la nivelul regiunii de imunitate. În acest fel,
vectorii nerecombinaţi sunt cI+, deci sunt capabili de a lizogeniza în gazdele corespunzătoare;
vectorii recombinaţi au fenotip cI-, incapabili de lizogenie, ei producând plaje de liză
caracteristice.
Vectorul λ gt 11 permite atât clonarea unui fragment de ADN heterolog (de până la
7,2kb) cât şi exprimarea acestuia sub forma unei proteine de fuziune cu β -galactozidaza,
deoarece situsul unic de restricţie, EcoRI, în care se integrează ADN de interes se află
localizat la nivelul genei lacZ. În acest fel, vectorii λ gt 11 recombinaţi determină fenotipul
de tip Lac- (nu mai are loc complementaţia genetică în gazdele corespunzătoare)(fig.35).
Fig.35. Reprezentarea schematică a vectorului λ gt 11
Vectorii de tip λ ZAP sunt vectori de inserţie complecşi. Ei conţin, la nivelul regiunii
centrale neesenţiale, în locul genelor virale, vectorul pBluescript SK (M13-)(fig.36). La
nivelul genei lacZ' din pBluescript, în situsul multiplu de clonare, se poate introduce ADN de
interes (până la 10kb). Asemenea vectori pot fi utilizaţi pentru experimente de secvenţializare
a ADN şi ARN; pentru obţinerea de sonde ARN cu ajutorul promotorilor T3 şi T7 ce
flanchează ADN clonat; pentru obţinerea de proteine de fuziune cu β -galactozidaza.
Fig. 36. Reprezentarea schematică a unui vector de tip λ ZAP: A-R = gene fagice; MCS = situs de
policlonare; I, T = secvenţe semnal pentru iniţierea/terminarea exciziei fagimidului pBluescript, sub
formă de monocatene +
2.1.3.2.Vectorii hibrizi de tip cosmide
75
Aceşti vectori reprezintă plasmide modificate, ce conţin secvenţa cos de la fagul λ

necesară împachetării ADN în particulele fagice. De asemenea, cosmidele prezintă originea
replicării de la plasmida ColE1 şi un marker de selecţie (de obicei, gena de rezistenţă la
ampicilină). În acest fel, cosmidele se pot replica şi menţine ca plasmide (permiţând selecţia
coloniilor purtătoare pe mediu ce conţine antibioticul corespunzător) sau, în condiţii specifice,
datorită prezenţei situsului cos, ele se pot împacheta în particule fagice, fiind propagate prin
transducţie sau transfecţie (transformarea celulelor sensibile cu ADN izolat din particule
fagice recombinate). Asemenea vectori permit clonarea la nivelul lor a unor fragmente mari
de ADN străin (de până la 45 kb), favorizând în acest fel propagarea unor gene eucariote
întregi. Deoarece în cosmide se pot insera fragmente mai mari de ADN, comparativ cu
vectorii derivaţi de la fagul λ , ele sunt preferate în experimentele de realizare a băncilor
genomice la eucariote.
O categorie specială de cosmide sunt cele de tip Charomid. Acestea, pe lângă
elementele specifice ale unei cosmide (secvenţa cos, originea replicării, o genă marker),
conţin o secvenţă spaţiatoare, formată din 1-23 copii repetate în tandem ale unui fragment de
2kb derivat din pBR322, flancată de două situsuri de restricţie pentru endonucleaza AvaI.
Datorită prezenţei secvenţei spaţiatoare, vectorii Charomid trebuie menţinuţi în gazde recA-
(incapabile de recombinare). Prin transferul lor în gazde recA+ se realizează destabilizarea

regiunii spaţiatoare şi apariţia unor molecule Charomid cu dimensiuni variate, în funcţie de
numărul de copii ale secvenţei de 2kb (de la 0 la 23 copii). Variaţia dimensiunii secvenţei
spaţiatoare determină dimensiunea fragmentului de ADN ce poate fi clonat într-un asemenea
vector: micşorarea dimensiunii secvenţei spaţiatoare este însoţită de posibilitatea introducerii
unui fragment mai mare de ADN de interes. Vectorul recombinat rezultat este împachetat în
particule fagice λ (2-45 kb), prin folosirea unor fagi ajutători. Vectorii de tip Charomid sunt
mult utilizaţi în experimentele de obţinere a băncilor genomice pentru ADN de origine
mamaliană.
2.1.2.3. Vectorii hibrizi de tip fagimide
Fagimidele sau plasmidofagii reprezintă o categorie specială de vectori, ce combină

caracteristicile vectorilor de tip plasmidiali cu cele ale fagilor filamentoşi.
Fagimidele, în cea mai simplificată formă, conţin:
76
• originea replicării de la plasmida ColE1 (asigură menţinerea vectorului în

forma plasmidială);
• genă marker de selecţie (rezistenţă la antibiotice, sinteză de β-galactozidază
etc);
• copie a unei secvenţe dintr-un fag filamentos (de obicei M13 sau f1), ce
conţine informaţia genetică pentru replicarea ADN viral şi pentru morfogeneza
particulelor fagice.
Datorită acestor caracteristici, fagimidele pot fi propagate şi menţinute stabil în forma
plasmidială într-o tulpină bacteriană cultivată în condiţii normale de mediu (pe mediu selectiv
ce conţine antibioticul corespunzător). Atunci când celulele gazdă sunt infectate cu un fag
filamentos ajutător ("helper"), sunt activate funcţiile virale, iar ADN este împachetat în
particule fagice (ca ADN monocatenar circular). ADN monocatenar purificat din asemenea
particule poate fi utilizat pentru procesele de secvenţiere a fragmentelor de ADN clonate sau
pentru obţinerea de sonde moleculare (de ADN monocatenar). ADN heterolog poate fi
integrat într-un asemenea vector, la nivelul unui MCS localizat la nivelul unei gene ce permite
rapida selecţie a vectorilor recombinaţi.
Dintre cele mai cunoscute şi utilizate fagimide menţionăm pUC118/pUC119 şi
pBluescript. Primul grup de fagimide derivă din plasmidele pUC18, respectiv pUC19, şi
conţin: originea replicării din ColE1; originea replicării fagului filamentos M13; gena lacI ce
codifică represorul Lac I al operonului lac; gena lacZ' (gena lacZ mutantă, ce codifică
peptidul α ), precedată de secvenţele promotor şi operator proprii; un situs MCS localizat la
nivelul genei lacZ'. Clonarea ADN de interes se face la nivelul MCS determinând blocarea
sintezei de peptid α. În felul acesta, selecţia clonelor recombinate se va face pe baza testelor
histochimice (colonii albe/albastre pe mediu cu X-gal, în prezenţa IPTG).
Vectorii de tip pBluescript sunt vectori multifuncţionali, construiţi pentru a simplifica
clonarea moleculară şi analiza genetică (fig.37).
77
Fig.37. Reprezentarea schematică a vectorului pBluescript SK+/-. Apr = gena de rezistenţă la

ampicilină; ori = originea replicării plasmidei (derivat de la ColE1); lac Z’= gena pentru sinteza β -
galactozidazei; lac I= gena reglatoare a operonului lac; ori f1 (+) = originea replicării ca fag
filamentos; MCS = situs multiplu de clonare; T3 şi T7 = promotori specifici derivaţi de la fagii T3 şi
T7.
Comparativ cu celelalte tipuri de vectori, fagimidele pBluescript oferă unele avantaje

în procesul de clonare:
• clonare la nivelul unui MCS (polilinker), ce conţine 20 situsuri diferite de
restricţie (SacI, Bst XI, Not I, Eag I, Xba I, Spe I, Bam HI, Sma I, Pst I, Eco
RI, Eco RV, Hind III, Cla I, Sal I, Acc I, Hinc II, Xho I, Apa I, Dra II, Kpn I.
Regiunea este încadrată de promotorii fagici T3 şi T7, iar întreaga secvenţă
este flancată de câte un situs pentru endonucleaza de restricţie Bss H II (situs
foarte rar în genomuri), cu ajutorul căreia poate fi, deci, excizată;
• selecţia rapidă a clonelor recombinate (teste histochimice: pe mediu cu X-gal
şi IPTG coloniile recombinate sunt albe)
• transcrierea eficientă ”in vitro” a ADN heterolog, mediată de promotorii T3 şi
T7. Cei doi promotori se găsesc în orientare inversă unul faţă de celălalt şi, ca
urmare, ADN heterolog clonat poate fi transcris de pe oricare dintre cele două
catene, în funcţie de orientarea pe care o are în molecula de vector recombinat
şi de activarea specifică a unuia sau altuia dintre promotorii fagici;
78
• obţinerea de monocatene de ADN datorită existenţei secvenţelor de origine

virală (fag filamentos). Pentru a obţine ADN monocatenar, tulpina bacteriană
în care se află vectorul recombinat este infectat cu un fag M13 defectiv ce
conţine gena II mutantă. Produsul acestei gene virale va acţiona preferenţial
asupra secvenţei ori-f1 din fagimid, declanşând replicarea ADN pe modelul
fagilor filamentoşi. În funcţie de orientarea regiunii de origine a replicării
virale, ADN monocatenar rezultat va conţine catena sens sau cea antisens a
genei lac Z’. Pentru a putea infecta gazda bacteriană cu un fag filamentos (cu
M13) este necesar ca tulpina bacteriană să fie de tip Hfr, astfel încât să prezinte
pili de sex la suprafaţa peretelui celular. Procesul de infectare a unei bacterii de
către un fag filamentos presupune, ca primă etapă, ataşarea fagilor la nivelul
pililor de sex.
• obţinerea de proteine de fuziune formate din proteina codificată de ADN
heterolog şi β -galactozidaza), ceea ce asigură obţinerea unor cantităţi
importante de proteine de interes.
2.1.3.4. Vectorii de exprimare
Scopurile foarte variate ale experimentelor de inginerie genetică au determinat o

permanentă perfecţionare a vectorilor utilizaţi, astfel încât aceştia să asigure succesul clonării
în gazdele corespunzătoare.
Grupul vectorilor de exprimare este foarte heterogen, ei permiţând fie obţinerea
ARNm pentru gena de clonată, fie sinteza polipeptidului codificat de aceasta. Vectorii de
acest tip conţin situsuri de clonare plasate sub controlul unor promotori puternici, sau la
capătul unei secvenţe semnal. In acest fel, în urma clonării se obţine o genă hibridă formată
din gena de interes fuzionată cu o genă marker. Proteina de fuziune rezultată poate fi apoi
transportată în citoplasmă, facilitându-se în acest fel purificarea sa.
Unii vectori plasmidiali de exprimare poartă promotori derivaţi de la bacteriofagii T3,
T7 şi/sau SP6 alături de situsul multiplu de clonare (MCS). ADN inserat la nivelul MCS poate
fi transcris ”in vitro” atunci ADN plasmidial recombinat linearizat este incubat cu ARN
polimeraza corespunzătoare şi cu precursorii de ribonucleotide. ARNm sintetizat poate fi sens
(dacă gena a fost clonată şi citită în sensul corect) sau antisens (dacă gena a fost clonată în
poziţie inversă celei normale). Din acest punct de vedere, fagimida pBluescript poate fi
79
considerată că fiind un vector de exprimare deoarece situsul multiplu de clonare prezintă la un

capăt promotorul T3 şi la celălalt promotorul T7 (fig.37). În acest fel, gena clonată la nivelul
MCS poate fi transcrisă prin folosirea alternativă drept matriţă a ambelor catene de ADN, în
funcţie de tipul de ARN polimerază utilizată în reacţia de transcriere. Moleculele de ARN
sintetizate în acest mod pot reprezenta probe pentru hibridizare sau pot fi traduse la proteinele
corespunzătoare în sisteme acelulare.
De asemenea, atunci când se doreşte exprimarea unei gene ce nu conţine nici o
secvenţă recunoscută de echipamentul enzimatic procariot, clonarea ei se face în aşa fel încât
să conducă la obţinerea unei proteine de fuziune. Proteinele de fuziune sunt obţinute prin
unirea a două secvenţe cu cadru de citire deschis (“open reading frame”), astfel încât produsul
rezultat în urma traducerii acestei secvenţe de ADN să conţină secvenţe de aminoacizi
derivate de la ambele gene. Promotorul, situsul de legare la ribosomi şi regiunea amino-
terminală sunt reprezentate de secvenţe ale vectorului, ceea ce asigură transcrierea şi
traducerea eficientă a produsului de fuziune. Producerea unor asemenea proteine de fuziune
conduce la exprimarea unor fragmente scurte de gene şi, consecutiv, la separarea domeniilor
funcţionale din interiorul unor proteine complexe. Dintre genele folosite pentru obţinerea
proteinelor de fuziune menţionăm: lac Z, gst (pentru glutation S-transferaza), gfp (pentru
“green fluorescence protein”, genă izolată de la meduza Aequorea victoria), gena pentru
proteina A de la Staphylococcus aureus etc.
În cazul vectorilor de clonare ce conţin gena lac Z, la nivelul capătului 3’ al acesteia
(deci în regiunea ce codifică extremitatea COOH a proteinei β -galactozidaza) s-a introdus o
secvenţă oligonucleotidică sintetică (polilinker) ce conţine situsul de recunoaştere al mai
multor enzime de restricţie (secvenţa MCS). De asemenea, unii vectori ce conţin această genă
mai prezintă la nivelul MCS un situs Nco I (CCATGG) ce cuprinde codonul ATG, de iniţiere
a genelor eucariote. În acest fel, genele clonate la nivelul MCS sunt exprimate ca proteine de
fuziune cu β-galactozidaza, ceea ce le asigură protecţie faţă de acţiunea proteazelor gazdei şi
identificare rapidă (pe baza activităţii enzimei β-galactozidaza).
Un vector utilizat foarte frecvent pentru clonarea de gene în E.coli şi obţinerea de
proteine de fuziune este pGEX 4T1 (fig.38).
80
Fig.38. Reprezentarea schematică a

plasmidei pGEX 4T-1
Acesta face parte dintr-o familie de vectori de tip GEX, diferenţele dintre ei fiind
datorate fie situsurilor unice de restricţie de la nivelul MCS, fie situsului de recunoaştere
pentru o protează specifică (pentru factorul Xa sau pentru trombină) plasat în faţa MCS.
Aşa cum se observă în fig.38, vectorul pGEX 4T-1 conţine elementele genetice
necesare funcţionării în E.coli: originea replicării de la pBR322, gena de rezistenţă la
ampicilină (Apr), gena lacI ce controlează, prin represorul codificat, transcrierea genelor
plasate sub controlul promotorului inductibil tac şi a operatorului lac. Gena gst ce codifică
enzima glutation S-transferaza a fost izolată de la Schistosoma japonicum şi clonată sub
controlul unor elemente genetice ce-i asigură o exprimare foarte eficientă. La extremitatea 3' a
acestei gene se află regiunea MCS, la începutul căreia a fost introdusă o secvenţă
caracteristică, ce codifică o succesiune de patru aminoacizi, reprezentând situsul de
recunoaştere pentru o protează (factorul Xa, trombină = Tr sau o protează recombinată, în
funcţie de varianta de vector) ce asigură separarea produsului de interes de proteina GST
(codificată de vector). Clonarea la nivelul MCS a unei gene de interes determină sinteza unei
proteine de fuziune (GST + proteina codificată de gena clonată). Această proteină de fuziune
poate fi detectată prin tehnici imunologice (interacţiune specifică cu anticorpi anti-GST) sau
prin tehnici biochimice (incubarea proteinei de fuziune cu un substrat cromogen = 1-cloro-
2,4- dinitrobenzen, care sub acţiunea GST este convertit la un compus de culoare galbenă ce
poate fi detectat şi măsurat colorimetric).
Purificarea proteinei se realizează prin cromatografie de afinitate, prin trecerea
lizatului celular pe o coloană de Sefaroza 4G, pe care s-a imobilizat glutation. Eluarea
proteinei de fuziune se face în condiţii nedenaturante, utilizând glutation redus care asigură
menţinerea funcţiilor proteinei de interes şi caracterul antigenic al acesteia. După purificare,
proteina de fuziune este tratată cu proteaza corespunzătoare (în exemplul dat este vorba
81
despre trombină) care clivează situsul de recunoaştere şi separă cele două proteine: GST şi
proteina de interes.
In ultimii ani sistemul menţionat a fost perfecţionat, în sensul purificării proteinei de
interes într-o singură etapă: după legarea proteinei de fuziune de interes la coloana
cromatografică are loc incubarea sa, peste noapte, cu proteaza specifică (ea însăşi proteină de
fuziune cu gena pentru GST), iar a doua zi, eluatul obţinut este trecut pe o a doua coloană (ce
conţine glutation imobilizat), legată de prima, care asigură legarea proteazei, a proteinelor de
fuziune neclivate şi proteina GST liberă. In schimb, proteina de interes nu este reţinută, ea
fiind recuperată în fracţiunile corespunzătoare (Sigrell, 2002). Un asemenea protocol a permis
obţinerea unor cantităţi importante de proteine de interes: de exemplu, se pot obţine 10 mg de
proteină umană de legare a calciului (hipocalcin), a cărei genă a fost clonată într-un vector
pGEX şi exprimată în E.coli.
2.1.4. Modalităţi de obţinere a moleculelor de ADN recombinant
Clonarea moleculară reprezintă procesul de construire a unor molecule de ADN

hibride (himere) prin inserţie de informaţie genetică străină într-un vector (vehicul) adecvat,
capabil să se replice independent. Hibridul molecular respectiv este utilizat pentru a
transforma celulele bacteriilor receptoare (gazda obişnuită a experimentelor de clonare).
Pentru integrarea fragmentelor de ADN străin în vector se pot folosi mai multe variante
experimentale, ce presupun sau nu prelucrarea "in vitro" a fragmentului de ADN dorit, după
care se realizează legarea covalentă a acestor fragmente cu ajutorul ADN-ligazelor.
Pentru obţinerea moleculelor de ADN hibride au fost imaginate mai multe procedee
dintre care, cele mai importante vor fi descrise în continuare.
1. Modalitatea cea mai simplă de incorporare este aceea care utilizează fragmentele
obţinute cu ajutorul enzimelor de restricţie de tipul II, care clivează ADN la
situsuri specifice palindromice, producând capete monocatenare complementare.
Astfel, utilizând aceeaşi enzimă de restricţie atât pentru clivarea ADN exogen cât şi a
vectorului de clonare, se pot obţine molecule hibride indiferent de provenienţa ADN de
interes, datorită extremităţilor monocatenare complementare identice. Unirea iniţială a
segmentelor de restricţie se face pe bază de complementaritate, prin formarea legăturilor de
hidrogen la nivelul capetelor monocatenare, după care amestecul se tratează cu ligază, de
obicei de fag T4, care reuneşte covalent moleculele respective (fig.39).
82
De notat că, transformarea bacteriilor gazdă se poate face direct cu amestec de

fragmente de restricţie fără a utiliza ligaza de fag T4, refacerea legăturilor fosfodiesterice
fiind produsă de ligaza endogenă, specifică celulei transformate. În acest sistem de ligare "in
vivo" a moleculelor, proporţia de celule transformate ce conţin molecule hibride este, de
aproximativ 1000 ori, mai mică comparativ cu sistemul care utilizează ligarea "in vitro".
Eficienţa de obţinere a moleculelor hibride poate fi mărită prin tratarea cu fosfatază
alcalină a vectorului linearizat. Acest tratament determină îndepărtarea grupărilor 5' P
terminale de la nivelul vectorului linearizat, prevenindu-se recircularizarea şi formarea
dimerilor plasmidiali. În acest caz, circularizarea vectorului se produce numai prin inserţia
ADN exogen netratat cu fosfatază alcalină, care va furniza capătul 5' fosfat necesar ligazei, la
nivelul fiecărei legături. Cu toate acestea, la fiecare joncţiune rămâne câte o catenă nelegată,
refacerea legăturilor fosfodiesterice fiind realizată în final de sistemele specifice (reparatorii)
ale gazdei.
Fig.39. Realizarea moleculelor de

ADN hibrid prin metoda legării
capetelor coezive produse de o
enzimă de restricţie.
2. O altă metodă utilizată frecvent în experimentele de clonare moleculară este cea a

adăugării de extremităţi homopolimere complementare la secvenţele de ADN de origine
diferită. Această metodă permite inserţia fragmentelor de ADN tăiate drept, fără decalaj (fără
extremităţi monocatenare), produse de anumite enzime de restricţie (Hae III, Hind II), într-un
vector de clonare corespunzător.
83
Este drept că, în cazul unor fragmente diferite de ADN cu capete netede (necoezive),
pentru refacerea legăturilor fosfodiesterice se poate utiliza direct ligaza de fag T4 care are
capacitatea de a uni asemenea molecule, dar eficienţa de legare este scăzută.
Tehnica adăugării de capete homopolimere complementare se bazează pe proprietatea
unei enzime, terminal-deoxinucleotidil transferaza, izolată din timus de viţel, de a extinde
extremităţile 3'OH ale ADN, prin adăugarea progresivă de dezoxiribonucleotide (dNTP).
Enzima poate forma o catenă homopolimeră sau "coadă" cu o lungime definită, la ambele
extremităţi 3'OH ale unui ADN dublu catenar complementar (sintetizat pe baza ARNm). Dacă
asemenea extremităţi complementare se produc şi la capetele unei plasmide linearizate, prin
amestecul lor se pot obţine molecule recombinante, stabile. Formarea acestor molecule
recombinante nu este dependentă de legarea enzimatică a celor două componente (fig.40).
Fig.40. Reprezentarea schematică a utilizării cozilor homopolimere pentru clonare
Folosirea extremităţilor complementare poli dG - poli dC are marele avantaj ca aceşti

hibrizi sunt mai stabili decât cei poli dA - poli dT. Eficienţa în clonare a fragmentelor cu cozi
poli dC - poli dG, lungi de 10-20 nucleotide, este de 10-100 ori mai mare decât atunci când se
folosesc "cozi" poli dA- poli dT, lungi de 50-100 nucleotide, aceasta datorându-se, probabil,
diferenţelor de lungime.
3. O altă metodă, larg utilizată în ultimii ani, este aceea a folosirii moleculelor linker
pentru unirea segmentelor de ADN lipsite de extremităţi coezive, indiferent de modul cum
au fost obţinute. Linkerii, comercializaţi într-o gamă foarte variată de tipuri, sunt
oligonucleotide decamerice cu secvenţe, în general, palindromice, care corespund situsurilor
84
de recunoaştere ale unor enzime de restricţie. După legarea lor la extremităţile moleculelor de
ADN tăiate drept, ele se reunesc cu ajutorul ligazei de fag T4 în structuri bicatenare, cu
secvenţe simetrice, care reconstituie situsul de recunoaştere al unei enzime de restricţie. Prin
adăugarea lor la extremităţile moleculelor de ADN se creează situsuri ţintă pentru acţiunea
enzimelor de restricţie cu care se tratează atât ADN heterolog cât şi molecula vectorului,
apărând astfel extremităţi adezive complementare pentru clonare. Acest lucru permite,
ulterior, reizolarea genei (genelor) din molecula de ADN recombinant prin folosirea
enzimelor de restricţie ce recunosc situsurile marginale (fig.41).
Fig.41. Schema utilizării linkerilor pentru clonare

1 = secvenţă linker decamerică ce conţine situsul de recunoaştere pentru EcoRI; 2 = fragment de ADN
cu capete drepte; 3 = linkeri; fragment de ADN ce prezintă capete coezive rezultate prin clivarea
linkerilor cu EcoRI
O varietate de linkeri o constituie cea care a primit denumirea de linkeri "adaptativi"

(=adaptori). Aceştia sunt secvenţe oligonucleotidice, în general decamere, care permit legarea
a două molecule de ADN prevăzute cu extremităţi adezive (rezultate însă prin acţiunea unor
enzime de restricţie diferite). Ei pot face să fuzioneze două situsuri de restricţie diferite: unul
se leagă la extremitatea 3'OH a unei molecule, iar celălalt la extremitatea 5' P a celeilalte,
reconstituind ambele secvenţe (fig.42). Prezenţa la nivelul adaptorilor a extremităţilor
monocatenare 5’OH împiedică „autorecircularizarea” secvenţelor de interes.
În prezent se produc şi se comercializează linkeri-adaptori sintetici care conţin
secvenţe promotor, operator, situsuri de legare la ribosomi, de iniţiere şi de terminare a
sintezei proteice, flancaţi de ambele părţi de situsuri pentru restrictaze. Este de remarcat că, în
cazul folosirii linkerilor cu situsuri pentru enzime de restricţie, este obligatoriu să se cunoască
85
faptul că molecula de ADN căreia i se adaugă aceşti linkeri nu conţine acel situs de restricţie
în structura sa internă. Un avantaj al metodei în care se utilizează linkerii este şi acela că
eficienţa procesului de transformare cu ADN supus acţiunii ligazei este mult mai mare
comparativ cu cea produsă de ADN numai circularizat (ca în cazul celui obţinut prin metoda
extremităţilor homopolimere complementare).
Fig.42. Schema utilizării linkerilor adaptativi (adaptorilor) pentru clonare

(a) adaptor EcoRI; (b) utilizarea adaptorilor EcoRI care sunt ataşaţi la nivelul capetelor drepte ale
fragmentului de interes, determinând formarea de capete coezive.
4. O modalitate specială de clonare a genelor o reprezintă folosirea ca vectori a

cosmidelor (fig.43).
Fig.43. Reprezentarea schematică a utilizării cosmidelor pentru clonarea genelor

Aşa cum se poate remarca din fig.43, strategia generală de clonare în vectorii de tip
cosmide este următoarea:
86
• se izolează vectorul în forma sa de plasmidă şi se linearizează prin clivare cu o

enzimă de restricţie specifică. Aceeaşi enzimă este folosită pentru obţinerea
fragmentelor de ADN de clonat.
• vectorul linearizat şi fragmentele de ADN genomic se amestecă, se tratează cu
ligază, obţinându-se molecule lineare recombinate de tipul cos-ori-Apr-ADN

heterolog-cos.
• moleculele recombinate sunt supuse unui proces de împachetare "in vitro" prin
tratarea cu un "extract de împachetare" sau cu un fag λ mutant (helper); se
obţin în acest fel particule fagice (λ ) ce conţin cosmida recombinată.
• prin infectarea unei gazde corespunzătoare (E.coli), cosmida se
recircularizează şi funcţionează ca plasmidă. Selecţia clonelor recombinate se
face pe baza rezistenţei la antibiotice conferită de cosmidă.
2.1.5. Metode de introducere a moleculelor de ADN recombinant în celulele gazdă
Menţinerea şi multiplicarea moleculelor de ADN recombinant este condiţionată de

pătrunderea lor într-o gazdă adecvată, în al cărei sistem genetic să se integreze. Principala
metodă utilizată pentru introducerea moleculelor de ADN recombinant într-o celulă gazdă
este transformarea genetică.
Transformarea genetică reprezintă transferul de informaţie genetică, realizat prin
intermediul unei fracţiuni de ADN eliberată dintr-o celulă donor, prin liză celulară şi extracţie
chimică. Fenomenul natural a fost descoperit la bacterii de către Griffith, în 1928. În
principiu, sistemele de transformare bacteriene se împart în două grupe (Lorenz şi
Wackernagel, 1994):
 primul grup cuprinde acele sisteme la care capacitatea celulelor receptoare de a
reacţiona cu ADN transformant este strâns legată de o etapă fiziologică
importantă, în care se realizează starea de "competenţă", Această stare apare în
timpul creşterii celulelor într-un mediu special şi se menţine o perioadă strict
determinată. Sistemele cel mai bine caracterizate din cadrul acestui grup sunt
reprezentate de Bacillus subtilis, Diplococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae.
87
 al doilea grup este reprezentat de acele organisme la care competenţa este

indusă artificial, prin tratamente cu CaCl2 sau RbCl, cel mai bine studiat fiind
fenomenul de transformare de la E.coli. Procesul se realizează prin
permeabilizarea învelişurilor celulare în urma tratării bacteriilor cu CaCl2 70-
100mM, ceea ce suprimă bariera celulară normală faţă de înglobarea ADN.
Mecanismul transformării cu ADN plasmidial este analog cu cel al
transformării genetice cu ADN cromosomal, dar există şi unele diferenţe.
Astfel, atât la E.coli cât şi la B.subtilis, transformarea plasmidială este afectată
de sistemul de restricţie al gazdei (ca şi în cazul transfecţiei fagice). La
B.subtilis, plasmidele de tip oligomer şi nu cele monomere sunt active în
transformare, pe când la E.coli această diferenţiere nu se remarcă.
După pătrunderea lor în celula gazdă (prin fenomenul de transformare), moleculele de
ADN exogen se multiplică datorită sistemului propriu de replicare. Ca urmare a replicării şi
prin amplificare, fiecare moleculă recombinată dă naştere unei clone moleculare, adică unei
populaţii omogene de plasmide sau fagi (în funcţie de tipul de vector utilizat), care propagă un
segment determinat de ADN.
Spre deosebire de celulele natural competente, bacteriile la care competenţa a fost
indusă prin tratament cu ioni de calciu sunt capabile să preia atât ADN monocatenar cât şi
dublu catenar. Aceasta înseamnă că ele pot fi transformate nu numai cu ADN cromosomal
linear ci şi cu ADN plasmidial circular. Aceasta particularitate a celulelor devenite
competente prin tratament „in vitro” este de mare importanţă pentru experimentele de clonare
moleculară sau pentru alte aplicaţii care necesită introducerea în celule a ADN plasmidial sau
fagic. De remarcat faptul că atunci când se doreşte introducerea în celule a ADN viral (sau în
anumite situaţii a ARN viral), procesul este numit transfecţie, rezultatul fiind producerea de
particule virale (fagi progeni) ce determină apariţia de plaje de liză.
O situaţie specială apare în cazul anumitor virusuri la care simpla transfecţie a
bacteriilor cu ADN viral nu conduce la multiplicarea virală. Aceasta se datorează faptului că,
în condiţiile infecţiei normale, odată cu genomul viral, în celulele bacteriene este introdusă şi
o ARN-polimerază virală care asigură transcrierea genelor virale timpurii. In absenţa acestei
ARN-polimeraze de origine virală nu poate avea loc sinteza proteinelor virale necesare
multiplicării fagului, iar în final nu se produc plaje de liză (dovada eficienţei infecţiei virale).
In cazul utilizării pentru transformarea celulelor devenite competente în mod artificial
a ADN cromosomal linear, eficienţa procesului este în general mică deoarece fragmentele de
88
ADN dublu catenar sunt degradate în interiorul celulei acceptoare de către nucleaza Rec
BCD. Această nuclează atacă fragmentele de ADN de la nivelul extremităţilor, în timp ce
plasmidele circulare sau ADN fagic circularizat sunt rezistente la acţiunea enzimei respective.
Pentru a obţine însă o eficienţă crescută a procesului de transformare, drept celule acceptoare
ale ADN exogen se utilizează mutante recBCD- (Snyder şi Champness, 1997).
Experimentele realizate în ultimii ani au evidenţiat faptul că, la numeroase
microorganisme, metoda transformării genetice "clasice" (prin competenţă naturală sau
indusă) nu este posibil de aplicat. De asemenea, tipurile de celule gazdă, acceptoare de ADN
exogen, s-au diversificat, astfel încât şi modalităţile de introducere a genelor de interes în
acestea au trebuit îmbunătăţite. Dintre metodele noi de introducere în celulele gazdă a
moleculelor de ADN recombinat menţionăm: electrotransformarea, microinjectarea,
"bombardarea" celulelor cu particule acoperite cu ADN etc.
Electrotransformarea a fost descoperită pe baza studiilor efectuate asupra celulelor

animale (hematii) supuse acţiunii câmpurilor electrice (Zimmermann, 1981-1986) şi se
bazează pe fenomenul electroporării. Procesul de electroporare constă în inducerea unei
permeabilizări reversibile a celulelor procariote sau eucariote, prin utilizarea unui câmp
electric. Astfel, atunci când o celulă este expusă într-un câmp electric, componentele
membranei devin polarizate iar membrana este traversată de un potenţial electric. Dacă
diferenţa de potenţial depăşeşte o valoare prag, membrana se "rupe" în anumite zone, iar
celula devine permeabilă pentru molecule exogene. Permeabilitatea indusă este reversibilă cu
condiţia ca mărimea sau durata aplicării câmpului electric să nu depăşească o valoare critică
limită, pentru că altfel celula este afectată ireversibil.
Mecanismul electroporării nu este pe deplin cunoscut. S-a stabilit experimental că
diferenţa de potenţial necesară "ruperii" membranei şi formării porilor la eucariote este de
0,2-2kV/cm, porii rezultaţi având un diametru de 10 µ m. La bacterii valoarea câmpului
aplicat este mult mai mare: 2-25kV/cm, el variind în funcţie de specie. Diferenţele apărute
depind de o serie de factori, cum ar fi: compoziţia membranei, temperatura de lucru, durata
aplicării câmpului electric, specia testată.
Electrotransformarea este dependentă de mai mulţi factori, cum ar fi:
• concentraţia ADN transformant (la bacterii eficienţa maximă de
transformare fiind atinsă cu 1-5µ g ADN/ml);
89
• dimensiunea moleculelor de ADN (moleculele mai mici au eficienţă

mai mare de transformare);
• conformaţia moleculară a ADN (ADN supraîncolăcit este mai eficient
decât cel linear).
Primele experimente de electroporare au fost realizate cu celule animale (hematii),
care sunt lipsite de perete celular. Modelul experimental utilizat pentru acestea a fost apoi
aplicat şi celulelor vegetale, levurilor şi bacteriilor, dar numai după ce peretele celular a fost
îndepărtat prin tratament enzimatic (deci după convertirea celulelor la protoplaşti). Cele mai
multe rezultate, promiţătoare de altfel, au fost obţinute la plante şi la bacterii, selectându-se
clone recombinate ce conţin vectori specifici. Cu toate acestea, metoda prezintă unele limitări
ce ţin de:
• sensibilitatea celulelor la tratamentul cu curent electric (a celor lipsite de perete
celular);
• barierele de restricţie ale celulelor receptoare;
• posibila prezenţă în mediul de electroporare a unor nucleaze nespecifice.
O parte dintre aceste probleme au fost rezolvate prin mai multe metode: metilarea
ADN exogen, utilizarea unor molecule de ADN cu funcţii de cărăuş ("carrier DNA");
folosirea unor inhibitori nucleazici, etc.
De asemenea, în ultima vreme în experimentele de electroporare s-au folosit celule
intacte, la care perete celular nu a mai fost îndepărtat. În cazul microorganismelor, au fost
stabilite condiţiile optime de electrotransformare pentru bacteriile Gram negative (E.coli,
Agrobacterium tumefaciens) (Potter, 1991), ca şi pentru anumite specii de drojdii.
Microinjectarea este o metodă relansată în ultimii ani, după ce a fost iniţial utilizată
în experimente în anii ’40, prin folosirea unor micromanipulatoare noi. Primele rezultate
semnificative de transfer de gene prin utilizarea acestei tehnologii au fost obţinute abia prin
anii ‘70, când s-a reuşit transplantarea unor nuclei din celule diferenţiate de amfibieni în
celule ou enucleate. De asemenea, în 1974 s-au obţinut şoareci transformaţi (mozaicaţi) prin
injectarea în celule embrionare a ADN viral de SV40 (Jaenisch şi Mintz, 1974).
Metoda este aplicabilă doar celulelor eucariote, ea putând fi considerată ca o metodă
de rutină în cazul celulelor animale, în scopul obţinerii de animale transgenice. Eficienţa
obţinerii de animale transgenice prin această metodă este de 5-15%, în funcţie de specia
testată; cele mai bune rezultate fiind înregistrate la şoareci şi porci şi mai slabe la vaci şi oi.
90
Dintre descendenţii organismelor transgenice, numai aproximativ jumătate primesc şi exprimă

gena de interes, deoarece exprimarea acesteia depinde de locul unde s-a realizat integrarea în
genomul gazdei şi de eficienţa secvenţelor reglatoare însoţitoare.
În cazul aplicării metodei microinjectării la plante sunt necesare unele adaptări
tehnice, cauzate de particularităţile structurale ale celulelor vegetale (prezenţa peretelui
celular şi a vacuomului)(fig.44).
Fig.44. Reprezentarea schematică a procesului de microinjectare a ADN de interes în celulele vegetale
Cele mai multe rezultate au fost obţinute cu protoplaşti vegetali evacuolaţi, prin
introducerea fie a unor cromosomi de la specii diferite, fie a unor vectori derivaţi de la
plasmida Ti de la Agrobacterium tumefaciens. Tehnica microinjectării la plante permite
obţinerea de clone transgenice din protoplaşti sau himere transgenice din proembrioni derivaţi
din microspori. De remarcat că, prin această metodă doar o celulă primeşte ADN de interes.
Avantajele aplicării acestei metode la plante ar putea fi următoarele:
• cantitatea de ADN introdusă într-o celulă poate fi optimizată;
• se poate decide care celulă va primi ADN;
• introducerea ADN poate fi urmărită la microscop;
• celulele microinjectate pot fi reluate cu uşurinţă, cultivate şi apoi multiplicate pe medii
specifice, din ele regenerându-se organisme întregi, transgenice, obţinându-se în acest
fel clone.
Metoda biolistică constă în "bombardarea" celulelor ţintă cu particule acoperite cu ADN.

Metoda a fost elaborată de Klein şi colab. (1987) fiind aplicată, de obicei, celulelor vegetale
intacte. Principul metodei este următorul: ADN de interes este depus pe suprafaţa unor
particule de tungsten sau aur (cu un diametru de aproximativ 1μm), prin precipitare cu CaCl2,
91
acestea constituind "gloanţele". Particulele astfel pregătite sunt introduse într-un dispozitiv
special, numit "puşcă" (fig.45).
Fig.45. Reprezentarea schematică a dispozitivului utilizat pentru introducerea unor particule "învelite"
cu ADN de interes direct în celula ţintă (după Watson şi colab., 1992)
Particulele cu ADN sunt apoi împinse de macroproiectil, dobândind o viteza mare;

trec prin orificiul de la nivelul dispozitivului de reţinere şi lovesc ţinta. Metoda are o serie de
avantaje şi o aplicabilitate largă în cazul celulelor eucariote:
• este uşor de realizat, cu condiţia existenţei în laborator a dispozitivului specific;
• printr-o singură "lovitură" se poate asigura transferul genelor de interes în mai multe
celule;
• genele aflate la suprafaţa particulelor îşi menţin activitatea biologică;
• celulele ţintă pot fi foarte variate (polen, celule de calus, meristeme), ele putând
supravieţui după "bombardarea" cu microproiectile;
• permite introducerea de gene la nivelul unor organe, atât la suprafaţa lor cât şi în
profunzime;
• metoda depinde doar de parametri fizici ce pot fi optimizaţi în funcţie de materialul
biologic folosit sau de scopul urmărit în experiment.
De remarcat că, prin utilizarea unei asemenea metode se pot introduce gene nu numai
în nucleul celulei ţintă ci chiar şi în organitele celulare (de exemplu, în cloroplaste), ceea ce
înseamnă că se poate asigura o exprimare specifică a ADN transferat.
Alături de metodele descrise mai sus care sunt destul de mult utilizate în laboratoare,
în ultimii ani au mai fost elaborate şi testate şi tehnici noi, neconvenţionale care, deşi
promiţătoare, necesită studii suplimentare pentru optimizare. Printre acestea, poate fi
menţionată metoda electroforetică, elaborată iniţial pentru celulele vegetalr dar putând fi
aplicată şi celulelor animale.
92
In varianta sa originală, metoda electroforetică presupune utilizarea unui sistem

special în care embrionul vegetal este plasat între doi electrozi, într-o cameră electroforetică
speciala (Songstad şi colab., 1995). Catodul este conectat cu o pipetă subţire ce conţine ADN
inclus într-o cantitate mică de agar (sau agaroză). Pipeta atinge embrionul vegetal, la nivelul
meristemului apical. De asemenea, embrionul este atins la extremitatea bazală de o a doua
pipetă, ce conţine tampon specific, ea fiind conectată cu anodul. Electroforeza se realizează
timp de o oră, la un curent de 0,1mA şi 2-10V/cm, sensul de migrare fiind de la catod la anod.
Evidenţierea prezenţei genei de interes (a exprimării sale tranzitorii) la nivelul
embrionului se realizează după electroforeză, prin utilizarea unor probe de ADN marcat (de
obicei, prin hibridizare "in situ"). Eficienţa metodei este influenţată de anumiţi factori fizici
asociaţi cu ţesutul vegetal, precum şi de factori chimici cum ar fi: valoarea pH, cationii
divalenţi, compoziţia tamponului de electroforeză.
Pe lângă această metodă de transfer direct de gene au mai fost raportate şi altele:
• transformarea polenului sau introducerea ADN în sacii polinici;
• macroinjectarea, care constă în introducerea ADN la nivelul unor ţesuturi
conducătoare de la baza meristemului floral imatur de secară;
• utilizarea microlaserului pentru a produce "găuri" în peretele celular şi
membrana plasmatică prin care să poată pătrundă moleculele de ADN.
Toate aceste tehnici au fost aplicate sporadic, rezultatele fiind discutabile.
Moleculele de ADN recombinant purtătoare de informaţie genetică nouă vor asigura
proprietăţi noi celulelor receptoare, indiferent de metoda utilizată pentru introducerea ADN de
interes în celulele gazdă. Aceste noi proprietăţi se transmit descendenţilor, putându-se
menţine stabil la lungul generaţiilor, oferindu-se astfel posibilitatea multiplicării, după
dorinţă, a noii informaţii genetice.
2.1.6. Selecţia şi analiza clonelor recombinate
Una dintre etapele esenţiale ale tehnologiei ADN recombinant este reprezentată de
detectarea şi selecţia celulelor gazdă transformate, adică a celor ce conţin fragmentul de ADN
dorit. Această etapă este foarte dificil de realizat dar absolut necesară, mai ales în cadrul
experienţelor de tip "shotgun" prin care se clonează o populaţie mare de fragmente heterogene
(a unor fragmente de ADN genomic sau a ADNc). Selecţia clonelor ce conţin vectorul
recombinat se face pe mediu selectiv ce conţine un antibiotic sau prin metode histochimice
93
(exemplu testul Xgal). Rezultă astfel o colecţie de fragmente de ADN genomic, propagate de
obicei într-o bacterie (E.coli), ceea ce constituie o "bancă" sau "bibliotecă" de gene. De
remarcat însă că, această bancă de gene conţine o gamă foarte variată de clone, astfel că se
pune problema selecţiei acelor celule, respectiv colonii, care conţin ADN de interes.
2.1.6.1. Selecţia clonelor recombinate şi a genelor de interes
Selectarea clonelor recombinate şi, prin urmare, a genelor de interes se poate realiza
prin utilizarea unor metode variate care au fost grupate în trei categorii principale: metode
microbiologice, genetice şi imunochimice, ele presupunând:
• utilizarea unor "sonde" de ADN sau ARN complementare secvenţei de interes;
• selectarea produsului genei clonate prin folosirea anticorpilor anti-proteina
respectivă;
• utilizarea unor teste de evidenţiere a activităţii proteinei de interes;
• amplificarea prin PCR a secvenţei clonate şi analiza ei prin subclonare;
• determinarea secvenţei de nucleotide sau modificarea acesteia prin mutageneza
la situs-specific etc.
2.1.6.1.1. Metode microbiologice
Aceste metode sunt dintre cele mai simple deoarece se bazează pe evidenţierea
indirectă a ADN recombinant prin detectarea prezenţei unui marker genetic, cum ar fi
dobândirea sau pierderea rezistenţei la un anumit antibiotic. Se mai poate utiliza şi apariţia
unei noi proprietăţi ce este codificată de gena străină, inserată în vector sau a unei necesităţi
nutritive.
Dobândirea capacităţii de a sintetiza o anumită enzimă sau prezenţa produşilor ei de
metabolism se poate face prin teste simple, ce vizează modificarea culorii unui indicator
specific (teste histochimice). Această proprietate presupune, de exemplu, integrarea într-un
vector a genei lacZ ce conţine un situs multiplu de clonare; clonarea genei de interes la nivelul
acestui situs duce la dispariţia culorii caracteristice (albastre) a coloniilor bacteriene apărute
pe mediul de cultură ce conţine substratul specific (Xgal). Aceasta este situaţia vectorilor de
clonare din categoria plasmidelor pUC (pUC18, pUC19), dar şi a unor fagimide (pBluescript),
sistemul permiţând diferenţierea coloniilor purtătoare de plasmide recombinate de cele
94
nerecombinate, pe baza modificării culorii lor după cultivarea pe mediu de cultură ce conţine
substratul X-gal şi a inductorului, IPTG.
În cazul în care scopul experimentelor este obţinerea unei bănci de gene, este necesară
o cale mai rapidă pentru selecţia bacteriilor ce conţin vectori recombinanţi. Pentru a evita
manipularea a mii de colonii în scopul detectării celor recombinate, au fost realizaţi vectori ce
permit selecţia directă a clonelor respective.
Aşa este vectorul pUN121, derivat din pBR322, la care gena pentru rezistenţă la
tetraciclină a fost clonată sub controlul promotorului PR, izolat din genomul bacteriofagului
λ . De asemenea, vectorul conţine gena cI, al cărei produs reglează activitatea promotorului
viral. In acest mod, transcrierea pornind de la promotorul PR este represată de produsul genei
reglatoare cI. Prin urmare, celulele ce poartă un asemenea vector vor fi sensibile la tetraciclină
şi rezistente numai la ampicilină. La rândul ei, gena cI conţine o secvenţă MCS, la nivelul
căreia se găsesc situsuri unice de recunoaştere pentru enzimele de restricţie Eco RI, Hind III,
Bcl I şi Sma I. Clonarea la nivelul MCS a unui fragment de ADN exogen determină
inactivarea inserţională a genei cI, ceea are ca efect activarea promotorului PR. În acest mod,
celulele care conţin plasmide recombinate vor deveni rezistente şi la tetraciclină, ele putând fi
rapid selectate prin simpla cultivare pe mediu cu tetraciclină.
2.1.6.1.2. Metode imunochimice
Pentru identificarea şi izolarea celulelor care conţin vectori cu ADNc de origine

eucariotă se poate folosi capacitatea acestora de a determina sinteza în E.coli a unor molecule
proteice funcţionale. Pentru a simplifica evidenţierea acestora se folosesc anticorpi specifici
proteinelor de interes, marcaţi de obicei radioactiv. Identificarea şi analiza produsului
sintetizat de clonele recombinate este deosebit de importantă, deoarece numai pe baza lor se
poate stabili succesul sau insuccesul experimentului.
De asemenea, pentru a demonstra existenţa într-o anumită probă a produsului unei
gene de interes se poate folosi şi una dintre variantele testului ELISA (“Enzyme Linked
Immunosorbent Assay”), al cărui principiu este asemănător celui ce foloseşte anticorpi
marcaţi radioactiv (test RIA), numai că se utilizează marcarea biochimică în locul celei
radioactive (fig.46).
95
Fig.46. Reprezentarea schematică a detectării

produşilor de interes (sintetizaţi de clonele
recombinate) prin utilizarea metodei imunochimice
În principiu, acest test utilizează imobilizarea antigenului (sau substanţa pe care vrem
să o detectăm) pe un suport solid, după care se cuplează cu anticorpul specific. Dacă antigenul
este solubil, atunci se imobilizează anticorpii corespunzători şi se tratează cu antigenul. După
spălarea complexului format (pentru îndepărtarea anticorpilor nelegaţi, sau a antigenului, în
cazul celei de-a doua variante), se adaugă un al doilea tip de anticorpi, ce recunosc anticorpii
anteriori. Ei sunt cuplaţi cu o enzimă (fosfatază alcalină, peroxidază) a cărei activitate poate fi
uşor evidenţiată prin teste spectrofotopmetrice. In final, după îndepărtarea anti-anticorpilor
nelegaţi, se determină activitatea enzimei cuplate folosindu-se un substrat specific (de obicei
cromogen). Spre exemplu, folosirea în experiment a conjugatului anti-anticorp - fosfatază
alcalină determină transformarea substratului cromogen β -nitrofenolfosfat (incolor) în β -
nitrofenol, compus de culoare galbenă, intensitatea culorii fiind evaluată colorimetric.
2.1.6.1.3. Metode genetice
Acestea permit detectarea cu mare sensibilitate şi eficienţă a genelor incorporate în

vectorii de clonare. Se utilizează teste de hibridare în care identificarea coloniilor bacteriene
sau a plajelor de liză ce poartă genele dorite se face cu ajutorul "sondelor" moleculare.
Coloniile sau plajele de liză supuse analizei sunt reluate pe filtre de nitroceluloză sau
membrane de nylon şi apoi incubate cu proba de ADN sau ARN (sau cu anticorpi specifici)
(fig.47).
Atunci când secvenţa genei clonate este cunoscută, se utilizează probe specifice sau
foarte înrudite. Sondele moleculare marcate cu 32P sunt folosite ca "undiţă" moleculară pentru
a identifica acele colonii care poartă ADN corespunzător, complementar, de care rămân legate
96
şi sunt evidenţiate prin autoradiografie. ARNm se leagă specific de gena corespunzătoare,

chiar dacă aceasta este "ascunsă" printre alte sute sau mii de gene.
Fig.47. Selecţia clonelor recombinate (plaje de liză) prin utilizarea "sondelor" moleculare
A – placa cu plajele de liză ce vor fi analizate; B – filtru de nitroceluloză; C – filtrul de nitroceluloză
pe care s-au adsorbit fagii din plajele de liză; D - soluţie ce conţine sonda de ADN marcat cu 32P. 1 –
acoperirea plăcii iniţiale (ce conţine plajele de liză de interes) cu filtrul de nitroceluloză; 2 –
îndepărtarea proteinelor fagice şi legarea ADN fagic la filtru; 2’ – adăugarea soluţiei cu sonda
marcată; 3 – cuplarea sondei ADN la nivelul zonelor de complementaritate din ADN fagic legat de
filtru; 4 – expunerea filtrului cu hibrizii ADN-ADN la radiaţii X (autoradiografie); 5 – developarea
filmului, compararea cu placa originară, alegerea plajelor recombinate şi purificarea moleculelor de
interes.
Deoarece purificarea unui anumit tip de ARNm este dificilă şi niciodată perfectă, se
recurge la obţinerea unui ADN complementar faţă de el, care apoi se leagă de gena de interes
la fel de specific ca şi ARNm. Tehnicile din această categorie folosesc molecule de ARNm
marcate radioactiv sau fragmente de ADNc, lungi de 14 - 18 nucleotide, cu secvenţa identică
sau foarte apropiată de unele regiuni ale ADN căutat.
Pentru identificarea coloniilor bacteriene care poartă o plasmidă cu ADNc specific se
aplică o folie de nitroceluloză pe suprafaţa mediului de cultură, în aşa fel încât atunci când
aceasta este ridicată, o parte dintre celulele din fiecare colonie sunt reluate pe filtru, iar altele
rămân pe placă. Aranjarea coloniilor pe placă şi pe filtru este identică. Filtrul de nitroceluloză
este tratat cu soluţii ce determină liza celulară, apoi cu NaOH pentru denaturarea ADN iar în
97
final, după uscarea filtrelor, se aplică ADNc marcat. Moleculele marcate hibridizează cu
secvenţele omoloage din structura plasmidei recombinate, fapt evidenţiat prin autoradiografie.
De multe ori însă, nu se cunoaşte nimic despre secvenţa de nucleotide a genei, astfel
că proba de ADN folosită este reprezentată de o secvenţă oligonucleotidică sintetică (obţinută
"in vitro" pe baza secvenţei de aminoacizi a proteinei de interes).
Secvenţele nucleotidice de interes pot fi identificate prin hibridizare, după separarea
electroforetică (în gel de agaroză) a fragmentelor de ADN rezultate, de obicei, prin clivare cu
enzime de restricţie (fig.48).
Fig.48. Reprezentarea schematică a etapelor implicate în detectarea unei gene de interes (de exemplu,
a genei pentru β -globină (adaptare după Mathew, 1983)
Tehnica, elaborată în 1975 de către Southern, presupune mai multe etape de lucru:
• purificarea moleculelor de ADN;
• migrarea electroforetică;
• transferul fragmentelor de ADN pe filtre de nitroceluloză;
• hibridizare, în condiţii speciale, cu proba de ADN marcată (32P);
• autoradiografia, ce presupune expunerea membranelor de nitroceluloză marcate la un
film sensibil la radiaţii X, timp de mai multe zile, urmată de developare şi fotografiere.
Metoda Southern este laborioasă şi foloseşte probe de ADN sau ARNm marcate
radioactiv, dar rezultatele sunt precise (fig.49) .
98
Fig.49. Detectarea unor secvenţe de ADN de interes (de exemplu, gena pentru β -globina umană) prin
utilizarea metodei Southern (după Mathew, 1983).
A = separarea electroforetică a ADN clivat cu enzime de restricţie; B = autoradiografia fragmentelor
separate electroforetic prin utilizarea unei probe de ADN marcat.
Există şi variante ale metodei descrise de Southern, care permit identificarea, după
separare electroforetică, a unor molecule de ARN sau a unor proteine. Astfel, metoda
Northern constă în identificarea moleculelor de ARN de interes, dintr-un amestec supus
separării electroforetice; în acest caz, sonda moleculară este un fragment de ADN,
complementar cu ARN căutat. In schimb, metoda Western se referă la identificarea unor
proteine de interes (de exemplu, a celor recombinate sau a celor doficiate de genele clonate).
După separarea proteinelor prin electroforeză în gel de poliacrilamidă, ele sunt reluate pe
filtre de nitroceluloză, iar evidenţierea se face cu ajutorul anticorpilor specifici.
În ultimii ani, au fost puse la punct metode de identificare "in situ" a secvenţelor de
ADN dorite, prin marcare neradioactivă sau radioactivă.
Tehnicile de hibridizare "in situ" permit detectarea unor secvenţe specifice de ADN
direct în cromosomi, în celule sau pe secţiuni de ţesuturi variate. Combinată cu tehnici de
imunocitochimie, hibridizarea "in situ" permite obţinerea de informaţii asupra localizării
celulare şi a funcţiei genei (la nivel de ADN, ARNm şi proteine).
Datorită condiţiilor speciale pe care le necesită folosirea probelor marcate radioactiv,
efortul cercetătorilor s-a îndreptat spre găsirea unor modalităţi de marcare neradioactivă a
"sondelor" moleculare. În prezent există două categorii de metode de hibridizare
neradioactivă: metoda directă şi metoda indirectă.
Metoda directă presupune ca molecula de ADN marcată să se lege direct la probele
de acizi nucleici de studiat, iar hibrizii formaţi să fie vizualizaţi imediat la microscop. Spre
exemplu, marcarea terminală cu fluorocromi a unor probe de ARN (prin utilizarea unor
99
nucleotide marcate ce sunt incorporate într-o moleculă de ARN) şi introducerea lor în celulele
ţintă va permite, ulterior identificarea celulară a hibrizilor fluorescenţi.
Metoda indirectă presupune ca proba ce conţine molecula marcată să fie detectabilă
prin citochimie de afinitate. In acest fel, moleculele marcate trebuie să fie accesibile
anticorpilor. Pentru atinge acestui scop au fost elaborate mai multe sisteme, dintre care două
sunt mai mult utilizate: sistemul biotină-streptavidină şi sistemul de detectare cu
digoxigenină. În cazul folosirii digoxigeninei (steroid izolat de la speciile Digitalis lanata sau
D.purpurea), aceasta este legată la uridin-trifosfat (UTP), la nivelul carbonului din poziţia 5 a
nucleului pirimidinic prin intermediul unui "braţ" spaţiator format din 11 atomi de carbon.
Nucleotidele astfel marcate sunt apoi incorporate enzimatic într-o probă de acizi
nucleici, ele fiind acceptate ca substrat atât de ADN polimeraze (ADN-polimeraza de la
E.coli, ADN-polimeraza de fag T4, reverstranscriptaza, Taq-polimeraza) şi terminal-
transferază, cât şi de ARN-polimerază. Amestecul de marcare neradioactivă conţine, pe lângă
una dintre enzimele menţionate mai sus, cele patru nucleotide nemarcate (dATP, dCTP, dTTP
şi dGTP), UTP-marcat cu digoxigenină, un tampon corespunzător (Tris-HCl, pH 7,5), ioni de
magneziu, ditiotreitol şi albumină serică bovină. Incorporarea nucleotidei marcate se
realizează la fiecare a 20-a sau 25-a nucleotidă (înlocuind dTTP al cărei analog este), la
temperatura de 20oC.
Detectarea probelor hibride (ADN de interes + proba marcată cu digoxigenină) se
realizează cu anticorpi anti-digoxigenină, conjugaţi cu o enzimă (fosfataza alcalină,
peroxidază) sau cu un colorant fluorescent (fluoresceină sau rodamină). În cazul utilizării
anticorpilor anti-digoxigenină conjugaţi cu fosfataza alcalină sau peroxidază, identificarea
hibrizilor se face prin folosirea unor substraturi cromogene: în prezenţa enzimei are loc
modificarea culorii substratului, detectarea realizându-se colorimetric sau histochimic. Atunci
când se folosesc anticorpi anti-digoxigenina conjugaţi cu fluorocromi, identificarea se face
după iluminare specifică, prin microscopie cu fluorescenţă, fluorimetrie (fluorescenţă galbenă,
roşie sau albastră, în funcţie de markerul utilizat).
Atunci când se preferă marcarea cu biotină (substanţă ce face parte din grupul
vitaminelor B, numindu-se şi vitamina H), etapele de lucru sunt asemănătoare celor descrise
mai sus, pentru digoxigenină. Detectarea se poate face fie cu anticorpi anti-biotină, fie cu
streptavidină (sau avidină). Aceasta substanţă, izolată fie de la anumite tulpini bacteriene
(Streptomyces avermectilis produce streptavidină), fie din albuş de ou (avidina), este preferată
100
pentru detectarea hibrizilor marcaţi. Recent, gama de nucleotide biotinilate s-a lărgit la
adenozin şi citidin-trifosfaţi, nucleotidele marcate fiind analogi ai celor naturale.
2.1.6.2. Analiza secvenţelor de ADN clonate
După clonare şi selecţia clonelor recombinate, fragmentul sau fragmentele de ADN de

interes pot fi analizate prin mai multe metode. Pe de o parte, se pot utiliza diverse enzime de
restricţie pentru clivarea ADN clonat, după care fragmentele obţinute sunt analizate prin
electroforeză în gel de agaroză. De asemenea, gena de interes poate fi amplificată prin
utilizarea tehnologiei PCR, subclonată într-un vector specific şi introdusă într-o gazdă nouă,
sau gena poate fi modificată prin mutageneză "in vitro" iar funcţiile sale (modificate) sunt
studiate ulterior.
2.1.6.2.1.Determinarea secvenţei de nucleotide a fragmentului de ADN de interes
În multe experimente de tehnologia ADN recombinant este necesar ca, în final, să se

stabilească secvenţa de nucleotide din diferite fragmente de ADN, fie chiar a întregului
genom al unui organism. Pentru aceasta au fost elaborate mai multe metode de secvenţiere,
toate presupunând însă etape de lucru laborioase şi posibilitatea tehnică a separării
electroforetice a fragmentelor rezultate (deci aparatură specială de electroforeză).
Primul organism viu la care s-a determinat secvenţa de nucleotide a fost Haemophilus
influenzae, anterior obţinându-se notabile doar în cazul genomurilor unor virusuri (tabelul 5).
Pîână în prezent a fost determinată secvenţa de nucleotide de la peste 800 categorii de
genomuri, dintre care majoritatea sunt virusuri (599), 20 bacteriofagi, 205 plasmide, 185
organite, 38 genomuri procariote dintre care 8 sunt arhebacterii, 30 aparţin eubacteriilor, iar
patru sunt eucariote. Trebuie însă precizat faptul că, deseori, descifrare „completă” înseamnă
de fapt determinarea a aproape întregii secvenţe de nucleotide, aşa cum este cazul genomului
uman, a cărui descifrare aproape completă (94%) a fost comunicată în februarie 2001 (Harry,
2001).
La lista prezentată în tabelul 5 se adaugă, din 2001, secvenţierea genomului de 130Mb
al speciei Arabidopsis thaliana, iar din aprilie 2002 cea a genomului de orez (Oryza sativa
ssp.japonica)(Goff şi colab., 2002).
101
Tabelul 5. Organisme la care s-a determinat secvenţa de nucleotide din ADN genomic (după
Melcher, 2000)
Organismul Mărimea genomului Anul determinării

secvenţializat secvenţei
Φ x174 5,4 kb 1977
SV40 5,8 kb 1979
CaMV 8 kb 1980
VMT 6,3 kb 1982
Bacteriofagul λ 48,5 kb 1982
Virusul vaccinei 192 kb 1990
Citomegalovirus 229 kb 1991
Haemophilus influenzae 1,9 Mb 1995
Mycoplasma genitalium 0,58 Mb 1995
Methanococcus jannaschi 1,66 Mb 1996
Escherichia coli 4,3 Mb 1997
Saccharomyces cerevisiae 13 Mb 1996
Caenorhabditis elegans 100 Mb 1998
Drosophila melanogaster 170 Mb 2000
Homo sapies 3000 Mb 2001
Pentru obţinerea secvenţelor oligonucleotidice din ADN supus analizei pot fi utilizate
două metode: metoda propusă de Sanger (1975) sau metoda descrisă de Maxam şi Gilbert
(1980).
Metoda Sanger presupune folosirea ADN monocatenar pentru stabilirea secvenţei de
nucleotide. Acesta poate fi obţinut fie prin denaturarea ADN dublu catenar (izolat printr-o
metodă specifică), fie prin clonarea fragmentelor de interes în vectori de tip fagimide şi apoi
stabilirea condiţiilor de producere a ADN monocatenar (prin inducerea multiplicării ca fag
filamentos a vectorului). Indiferent de metoda folosită pentru obţinere, ADN monocatenar
este folosit ca matriţă pentru acţiunea ADN polimerazei I de la E.coli, la amestec fiind
32
adăugate toate cele patru dezoxiribonucleotide (dintre care una marcată radioactiv cu P)
precum şi o scurtă secvenţă complementară sintetizată “in vitro”, ce va fi folosită drept
primer. Primerul se ataşează specific la regiunea de omologie, de la nivelul său începând
sinteza enzimatică a unor secvenţe de 15-300 nucleotide.
În cadrul acestei metode există două variante de lucru: metoda "plus” şi metoda
„minus", ambele metode prezentând primele etape comune (fig.50).
ADN polimeraza este utilizată mai întâi pentru a asigura sinteza unei catene
complementare catenei matriţă, ea conţinând însă dNTP marcate. Deoarece sinteza nu este
sincronizată se vor obţine oligonucleotide de diferite lungimi.
102
Catena de ADN utilizată ca matriţă3'---------G-C-T-C-G-C-A-T-----5'
Primer 5'---3'
ADN polimeraza + amestec de dNTP (dintre care
una marcată cu 32P)
3'---------G-C-T-C-G-C-A-T-----5'
5'---------C-G-A-G-C-G-T-A
5'---------C-G-A-G-C-G-T copii complementare marcate
5'---------C-G-A-G-C-G
5'---------C-G-A-G-C
5'---------C-G-A-G
5'---------C-G-A
5'---------C-G
5'---------C
Sistemul "minus" Sistemul "plus"

(polimerizare în (polimerizare în
absenţa G, de ex.) prezenţa G, de ex.)
3'---------G-C-T-C-G-C-A-T-----5' 3'---------G-C-T-C-G-C-A-T-----5'
5'---------C-G-A-G-C-G-T-A----3' 5'---------C-G-A-G-C-G
5'---------C-G-A-G-C-G-T-A 5'---------C-G-A-G-C-G
5'---------C-G-A-G-C-G-T-A 5'---------C-G-A-G-C-G
5'---------C-G-A-G-C 5'---------C-G-A-G
5'---------C-G-A-G-C 5'---------C-G-A-G
5---------C-G-A 5'---------C-G
5'---------C-G-A 5'---------C-G
5'---------C
Fig.50. Determinarea secvenţei de nucleotide a unui fragment de ADN prin utilizarea metodei "plus-
minus" (după Gaastra şi Oudega, 1983)
În metoda "minus", după îndepărtarea nucleotidelor neutilizate, amestecul de

oligonucleotide cuplate cu matriţa este reincubat cu ADN polimeraza, dar în absenţa uneia
dintre cele patru dNTP.
103
Sinteza se desfăşoară până când, în catena ce se sintetizează, ar trebui inclusă

nucleotida lipsă. În acest fel, sinteza se va termina, la toate secvenţele nucleotidice din
amestec, la capătul 3' al acestora, la nivelul nucleotidei ce precede nucleotida absentă.
Deoarece în experimente se realizează patru variante diferite (de fiecare dată
omiţându-se câte o nucleotidă), se poate obţine un set complet de oligonucleotide ce respectă
principiul descris mai sus. Noile catene sintetizate sunt apoi separate de matriţă lor şi supuse
electroforezei în gel de poliacrilamidă, în prezenţa unei concentraţii foarte mari de uree (8M),
în final detectarea fragmentelor oligonucleotidice monocatenare făcându-se prin
autoradiografie.
În cazul metodei "plus", amestecul de oligonucleotide marcate, obţinute în prima
etapă, este supus acţiunii ADN polimerazei de fag T4 care, datorită activităţii sale
exonucleazice în sensul 3'-5', degradează ADN dublu catenar, începând cu capătul 3'. În plus,
în amestecul de reacţie este introdusă o anumită dNTP, astfel că acţiunea exonucleazică se
opreşte la nivelul nucleotidei care este prezentă în amestecul de incubare (fig.50).
În privinţa variantei cu dideoxinucleotide (Gaastra şi Oudega, 1983), principiul
metodei este următorul: se creează condiţiile sintezei unei catene complementare matriţei de
ADN (a cărei secvenţă se doreşte a fi cunoscută), prin utilizarea unei ADN polimeraze I
Klenow (lipsită de activitate exonucleazică 5'→3').
Sinteza este iniţiată de un primer complementar cu o secvenţă specifică de la capătul 3'
al matriţei şi continuată în prezenţa celor patru dNTP, dintre care una este marcată cu 32P.
Încheierea sintezei ADN complementar este determinată de adăugarea la amestecul de reacţie
a unor analogi ai dNTP, aşa cum sunt analogii de tip 2'-3'-dideoxy (ddNTP): ddATP, ddCTP,
ddTTP, ddGTP, sau cei de tip β-D-arabinofuranosil) (fig. 51).
Analogii ddNTP nu mai conţin grupări hidroxil la nivelul atomilor de carbon din
poziţiile 2' şi 3' ale pentozei. În acest fel, deoarece pentru alungirea catenei noi de ADN este
necesară adăugarea de nucleotide la nivelul capătului 3'-OH, aceasta este blocată în prezenţa
ddNTP corespunzător (fig.51). După încheierea sintezei în toate cele patru variante de ddNTP
adăugat, se obţin oligonucleotide cu dimensiuni diferite (deoarece sinteza nu este
sincronizată) care, după ce au fost supuse acţiunii unei enzime de restricţie pentru a îndepărta
primerul, sunt denaturate prin încălzire în prezenţa formamidei. ADN monocatenar obţinut
este supus electroforezei şi apoi detectării prin autoradiografie.
104
Catena de ADN utilizată ca matriţă3'---------G-C-T-C-G-C-A-T-----5'

Primer 5-…….. 3'
ADN-polimeraza + amestec de dNTP (dintre care una

marcată)
+ddGTP +ddATP +ddTTP +ddCTP
5' C-G-A-G-C-ddG 5' C-G-A-G-C-G-T-ddA 5' C-G-A-G-C-G-ddT 5' C-G-A-G-ddC

5' C-G-A-ddG 5' C-G-ddA 5' ddC
5’C-ddG
Fig.51. Determinarea secvenţei de nucleotide a unui fragment de ADN prin utilizarea metodei
dideoxinucleotidelor (după Gaastra şi Oudega, 1983).
Metoda Maxam şi Gilbert presupune utilizarea unui anumit segment de ADN

monocatenar care este mai întâi este tratat cu fosfatază alcalină pentru a elimina radicalul 5’
32 32
fosfat, apoi se adaugă ATP, marcat cu P, şi polinucleotid-kinază care ataşează P la
nucleotida de la capătul 5'. Probele marcate astfel obţinute sunt supuse unor tratamente care
asigură clivarea specifică a secvenţei de ADN, la nivelul unor situsuri cunoscute (sunt „rupte”
legăturile fosfodiesterice dintre două nucleotide, dintre una este cunoscută) (fig.52).
Fig.52. Reprezentarea schematică a metodei de secvenţializare elaborată de Maxam şi Gilbert (1977)

105
Există diferite modalităţi de tratament ale probei de interes care asigură realizarea mai
multor variante de clivare:
clivarea guaninei presupune ca ADN de studiat să fie tratat, fie cu dimetilsulfat ce determină
metilarea guaninei în poziţia 7 şi a adeninei în poziţia 3, fie, mai rară, cu agenţi chimici care
distrug guanina. Urmează apoi supunerea moleculei de ADN metilat la acţiunea piperidinei
care determină ruperea legăturilor fosfodiesterice alături de poziţia ocupată de guanină;
• clivarea guaninei-adeninei presupune tratarea ADN metilat cu dimetilsulfat cu
piridin-formiat. Aceasta face ca tratarea ulterioară cu piperidină să determine
clivarea legăturilor fosfodiesterice ori de câte ori în segmentul de ADN apare
A sau G;
• clivarea timinei-citozinei presupune ca ADN de interes să fie mai întâi supus
acţiunii hidrazinei care interacţionează specific cu timina şi citozina, iar apoi,
amestecul obţinut, este tratat cu piperidină care clivează legăturile
fosfodiesterice din secvenţa de ADN ori de câte ori apar nucleotidele de tip
dTTP sau dCTP;
• clivarea citozinei se realizează în aceleaşi condiţii ca şi cele descrise mai sus,
cu excepţia faptului că prima reacţie, cea cu hidrazină, se face în prezenţa NaCl
5M care inhibă acţiunea acesteia la nivelul timinei. În acest fel, tratarea probei
de ADN cu piperidină determină clivarea legăturilor fosfodiesterice doar la
nivelul citozinei (fig.53).
Fig.53. Evidenţierea comparativă a

autoradiografiilor unor geluri de
secvenţiere obţinute prin tehnica
Sanger (gelul din stânga – secvenţa
de nucleotide a genei pentru o lipază
de la şobolan) sau prin tehnica
Maxam şi Gilbert (gelul din dreapta
– secvenţa de nucleotide a
genomului virusului hepatitei B)
(după Etienne şi Clauser, 2001).
106
În prezent au fost elaborate sisteme automatizate de determinare a secvenţei de

nucleotide a genelor şi de analiză computerizată a acesteia. Cunoscând secvenţa de nucleotide
dintr-o genă se poate deduce foarte simplu secvenţa de aminoacizi din proteina codificată. De
asemenea, perfecţionarea vectorilor de clonare şi a metodelor de amplificare genică prin PCR
au permis o mai bună analiză a genelor clonate. Spre exemplu, vectorii derivaţi de la fagul
M13 asigură clonarea genei de interes la nivelul unui situs multiplu de clonare aflat în gena
lacZ, în apropierea unei secvenţe "primer universal" ("universal sequencing primer" = USP),
iar după multiplicarea sa sub formă monocatenară (prin activarea funcţiilor fagului
filamentos), gena poate fi folosită pentru secvenţiere (fig.54.).
Fig.54.Utilizarea vectorului M13sup18 pentru clonarea şi apoi secvenţierea genei de interes.

1 – clivarea vectorului de clonare cu EcoRI; 2 – integrarea ADNc la nivelul vectorului linearizat
(integrarea se poate face în ambele orientări); 3 – transformarea celulelor competente de E.coli şi
cultivarea pe mediu cu Xgal; 4 – plaje albe recombinate; 5 – plaje albastre nerecombinate; 6 –
cultivarea fagilor recombinaţi şi utilizarea ADN monocatenar pentru secvenţializare. USP = secvenţa
primer universală (“universal primer sequence”); L = polilinker ce conţine situsul de recunoaştere
pentru EcoRI; P = promotorul genei lac Z’.
107
După tratarea vectorului linearizat cu o enzimă de restricţie cu fragmentul de ADN de

interes şi adăugarea la acest amestec a ligazei, are loc transformarea celulelor de E.coli.
Selecţia se face pe plăci cu X-gal, după inducerea cu IPTG, obţinându-se "spoturi albastre",
corespunzătoare celulelor de E.colilizate ce conţineau vectorul nerecombinat, respectiv
"spoturi" albe, reprezentate de celulele bacteriene recombinate lizate (transformate cu vector
recombinat). Particulele fagice recombinate sunt apoi izolate din plajele de liză
corespunzătoare, din ele fiind extras apoi ADN monocatenar ce poate fi utilizat drept matriţă
pentru secvenţiere, folosindu-se drept primer o secvenţă oligonucleotidică sintetică,
complementară USP din vector.
In experimente similare se pot utiliza şi fagimidele care permit multiplicarea genei
clonate fie în cadrul plasmidei fie, după adăugarea unui fag ajutător, sub formă de
monocatene, ceea ce face ca protocolul de secvenţiere să fie mai simplu.
Au mai fost elaborate şi alte metode de obţinere a ADN a cărui secvenţă se doreşte a fi
determinată, cum ar fi tehnica PCR-asimetrică ("asymmetric PCR")(Innis şi colab., 1990).
Spre deosebire de tehnica PCR "clasică" în urma căreia se obţin fragmente de ADN dublu
catenar, varianta sa "asimetrică" presupune utilizarea unor cantităţi diferite din cei doi primeri
necesari amplificării secvenţei dorite (în raport de 1/100) astfel că, reacţia de sinteză a
fragmentelor de ADN dublucatenar se opreşte în momentul în care unul dintre primer nu mai
este accesibil. Din acest moment, sinteza continuă folosindu-se un singur primer, obţinându-
se doar una dintre cele două catene ale fragmentului de interes. ADN monocatenar sintetizat
prin aceasta metodă este suficient din punct de vedere cantitativ pentru a fi supus secvenţierii
(de obicei prin utilizarea metodei Sanger, cu dideoxinucleotide).
2.1.6.2.2. Mutageneza "in vitro"
Aşa cum se cunoaşte, mutageneza poate fi definită ca fiind procesul de modificare a

structurii ADN (sau a ARN, în cazul ribovirusurilor), care nu este consecinţa recombinării
genetice. Cele mai multe mutaţii au consecinţe fenotipice evidente dar, în anumite situaţii,
efectele nu sunt vizibile, mutaţiile fiind "tăcute" ("silenţioase").
Mutageneza "în vitro" poate fi utilizată pentru modificarea controlată a secvenţei de
nucleotide a unei gene, urmată de introducerea acesteia într-o gazdă corespunzătoare şi apoi
studierea funcţiilor acesteia. În acest caz, cercetările experimentale pornesc de la secvenţa
genei şi apoi se examinează funcţia acesteia, deci invers faţă de experimentele "clasice" (când
108
se porneşte de la proteină şi se „caută” gena codificatoare). Din acest motiv, acest tip de
abordare permisă de tehnologia ADN recombinant a primit denumirea de "genetică inversă"
("reverse genetics").
Strategia generală pentru experimentele de mutageneză "in vitro" este următoarea:
ADN de interes introdus într-un vector de clonare adecvat este supus unui anumit tip de
mutageneză şi apoi este transferat într-o gazdă corespunzătoare (de obicei E.coli). Se obţin în
acest caz diferite organisme recombinate ce permit studierea funcţiilor modificate (sau nu) ale
ADN de interes.
Modificarea secvenţei de nucleotide se poate face la întâmplare, prin mutageneză
"clasică" cu agenţi mutageni obişnuiţi (fizici sau chimici), sau prin inducerea unor greşeli de
incorporare a nucleotidelor cu ajutorul unor enzime (cum ar fi, reverstranscriptaza produsă de
virusul mieloblastozei aviare). Consecinţele acestor tratamente pot fi de tipul deleţiilor,
adiţiilor, substituţiilor, inversiilor etc. În ultimii ani au fost elaborate metode de mutageneză la
situs-specific care asigură modificarea controlată (prin adiţii, deleţii sau substituţii de
nucleotide) a unei anumite secvenţe de ADN.
Un exemplu de mutageneză la situs-specific este cel al utilizării secvenţelor de
recunoaştere pentru anumite enzime de restricţie: la nivelul acestora se pot produce, în mod
controlat, deleţii sau adiţii de nucleotide, modificându-le. Spre exemplu, enzima EcoRI
recunoaşte secvenţa GAATTC, determinând în urma clivării apariţia unor capete
monocatenare complementare. Dacă, la nivelul extremităţilor monocatenare sunt adăugate
nucleotidele complementare (sub acţiunea ADN polimerazei şi a dNTP corespunzătoare),
astfel încât să se refacă structura dublu-catenară, se obţin fragmente cu capete drepte ce pot fi
reunite cu ajutorul ADN-ligazei. In acest fel sunt „create” molecule de ADN reasamblate, de
dimensiuni mai mari decât cele de origine (prin inserarea a 4 nucleotide la nivelul fiecărui
situs EcoRI iniţial). Aceasta are ca rezultat pierderea secvenţelor de recunoaştere pentru
EcoRI, iar consecinţa la nivelul genelor este modificarea cadrului de citire al mesajului
genetic. În mod similar, prin tratarea cu nucleaza S1 a secvenţelor lineare de ADN obţinute cu
EcoRI, are loc eliminarea extremităţilor monocatenare complementare. Consecinţa finală
(după legarea fragmentelor rezultate) este eliminarea din ADN iniţial a unor secvenţe scurte
de nucleotide (câte patru nucleotide de la nivelul fiecărui situs EcoRI) şi, deci, modificarea
cadrului de citire a mesajului genetic.
109
De asemenea, mutageneza la situs-specific se poate realiza prin diferite metode care

depind de utilizarea de oligonucleotide sintetice pentru inducerea unui anumit tip de
modificare a secvenţei de nucleotide ţintă.
În principiu, mutageneza la situs-specific prin folosirea oligonucleotidelor sintetice se
realizează în mai multe etape:
• introducerea ADN dublu-catenar în E.coli şi selecţia clonelor normale şi a celor
mutante (fig.55 );
Fig.55.Schemă generală a mutagenezei situs-specifică prin utilizarea oligonucleotidelor
• secvenţa de ADN de interes (ce va fi supusă mutagenezei) este clonată într-un vector
capabil să producă ADN monocatenar (vectori de tip fagimide);
• se induce obţinerea de ADN monocatenar prin activarea funcţiilor fagice;
• se alege o secvenţă de oligonucleotide sintetizată "în vitro" (de exemplu un primer
mutant), capabilă să recunoască o zonă omoloagă din ADN ţintă;
110
• amestecarea ADN ţintă cu oligonucleotidele sintetice mutante şi crearea condiţiilor de

sinteză a catenei complementare (prin adăugarea de ADN polimerază, dNTP şi ADN-
ligază);
O altă variantă de mutageneză "in vitro" este aceea a introducerii la nivelul unei
molecule de ADN de analizat a unor linkeri. Inserţia linkerilor se face după ce ADN de
interes a fost tratat cu DN-aza I (care taie ADN dublu-catenar în mod randomic, generând
molecule lineare). Legarea ulterioară a ADN linearizat cu linkerii respectivi determină
obţinerea mai multor tipuri de molecule de ADN modificate, ele fiind analizate după
introducerea şi multiplicarea în E.coli (fig.56).
Fig.56. Reprezentarea schematică a mutagenezei „in vitro” prin inserţia unui linker.
111
Mutageneza "in vitro" are numeroase aplicaţii, între care sunt de menţionat
următoarele:
• permite caracterizarea unor regiuni ale ADN care controlează exprimarea unei gene;
• a inaugurat domeniul "ingineriei proteice" care presupune realizarea unor modificări
în produsul natural al unor gene astfel ca acesta să-şi îndeplinească rolul cât mai bine
(stabilitate termică ridicată; sporirea activităţii specifice; creşterea rezistenţei la
acţiunea unor inhibitori etc), ceea ce poate avea o semnificaţie biotehnologică
deosebită.
112

Inginerie Genetica

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Inginerie Genetica

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Tehnologia ADN recombinant se referă la metodologia obţinerii moleculelor de ADN

2.1. Etapele de lucru pentru obţinerea şi selecţia moleculelor recombinate de ADN

Scopul experimentelor de inginerie genetică este acela al obţinerii moleculelor de

2.1.1. Izolarea şi purificarea acizilor nucleici

Realizarea experimentelor de clonare a genelor presupune ca etapă de bază purificarea

2.1.1.1. Izolarea ADN total

2.1.1.2. Izolarea ADN plasmidial

numai a tipurilor diferite de molecule ci şi a moleculelor de ADN plasmidial cu conformaţii

ADN linearizat sau crestat

2.1.1.3. Izolarea ADN viral

2.1.1.4. Izolarea moleculelor de ARN

In anumite tipuri de experimente în care izolarea genelor direct din moleculele de

2.1.1.5. Determinarea purităţii şi concentraţiei de acizi nucleici

Utilizarea acizilor nucleici în diferite experimente este condiţionată de un anumit grad

2.1.2. Metode de izolare a fragmentelor de ADN utile pentru clonare

Tehnicile care urmăresc manipularea directă a ADN prin clonare moleculară se

Godeurile unde sunt

5,93 kb+ 5,54 kb ADN, conformaţia CD

Fig.21. Separarea electroforetică a unor molecule de ADN (după Boffey, 1983)

Reuşita experimentelor în urma intervenţiilor prin diverse procedee este condiţionată

2.1.2.1. Obţinerea ADN de interes prin utilizarea endonucleazelor de restricţie

Enzimele restricţie cunoscute şi sub numele de endonucleaze de restricţie sunt

conferă respectivelor molecule de ADN rezistenţă la acţiunea restrictazei (protejează ADN

Tabelul 2. Caracteristicile unor enzime de restricţie

Tulpina bacteriană Denumirea Situs de recunoaştere

Tabelul 3. Acţiunea unor enzime de restricţie pe diferite tipuri de molecule de ADN

În final se compară dimensiunea fragmentelor finale şi se stabileşte ordinea situsurilor

Fig.22. Stabilirea localizării

Uşurinţa cu care genele de interes pot fi izolate depinde de localizarea lor pe

Clonarea ulterioară a tuturor acestor fragmente (separate pe baza dimensiunii lor) în

2.1.2.2. Obţinerea ADN de interes prin utilizarea ADN polimerazelor

2.1.2.2.1. ADN polimeraze termostabile şi tehnologia PCR

Elaborarea şi apoi perfecţionarea tehnologiei PCR (“Polymerase Chain Reaction”)

adăugarea unor secvenţe

începerea sintezei de ADN

Prima etapă a procesului de amplificare presupune încălzirea soluţiei de ADN la 94oC,

corespunzătoare. Continuarea experimentului depinde de valoarea temperaturii la care se

Fig.25. Schema realizării reacţiei de polimerizare

Pfu polimeraza izolată de la o altă bacterie termofilă, Pyrococcus furiosus, ea manifestând în

Originea probei Gena amplificată Mărimea Vârsta probei

fragment lenght polymorphisms” = polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate”),

Tehnica AFLP se bazează pe amplificarea selectivă a unor fragmente de restricţie

specifici, complementari cu extremităţile monocatenare generate de enzime. Se refac, în acest

Fig.27. Comparare a profilului

2.1.2.2.2. ADN-polimeraze dependente de ARN

Fig.28. Reprezentarea schematică a

Toate variantele de clonare a ADN complementar dublu catenar pornesc de la sinteza

Spre exemplu, pentru a identifica o clonă ce conţine ADNc de interes, ştiind că n =

2.1.2.3. Obţinerea ADN de interes prin sinteză chimică

2.1.2.4. Alte enzime utilizate în tehnologia ADN recombinant

Pentru obţinerea moleculelor de ADN recombinant este necesară utilizarea unor

Studiul ligazelor a început în urma observaţiilor experimentale efectuate asupra

b) legarea fragmentelor de ADN cu capete drepte

Fig.29. Modalităţile de acţiune ale ADN ligazei de fag T4

Fosfataza alcalină este o enzimă care catalizează îndepărtarea grupării fosfat de la

Fig.30. Reprezentarea schematică a utilizării fosfatazei alcaline în experimentele de clonare

Polinucleotid-kinaza de fag T4 este utilizată pentru transferul unui grup fosfat de la

2.1.3. Vectori de clonare

Un vector de clonare reprezintă o moleculă de ADN în care este integrat fragmentul de

Cercetările efectuate până în prezent asupra particularităţilor vectorilor de clonare au

• conţine doi markeri genetici de selecţie: gena de rezistenţă la tetraciclină