Adaugarea fluorului in compozitia materialelor dentare de

restaurare influenteaza formarea biofilmului oral?

Andrei Ionescua, Eugenio Brambillaa, Sebastian Hahnelb,∗

a DEPARTMENT of BIOMEDICAL, SurGICAL AND DENTAL Sciences, University of MILAN, ITALY

b Poliklinik für ZAHNÄRZTLIChe Prothetik und Werkstoffkunde, Leipzig University, Leipzig,

GERMANy

Abstract

Obiective. Investigarea influenței reîncărcării materialelor de restaurare dentare cu fluor în

formarea biofilmului. Metode. Specimenele produse dintr-un ciment ionomer de sticlă cu
vâscozitate ridicată (HVGIC), un ciment ionomer din sticlă modificat cu rășină (RMGIC) și un
compozit pe bază de rășină (RBC) au fost alocate aleatoriu incubării în salivă artificială fie
pentru o săptămână (AS-1) ), timp de cinci săptămâni (AS-5), timp de cinci săptămâni, inclusiv
perierea de două ori pe zi cu pastă de dinți NaF de 1450 ppm (perie AS-5), sau expunerea o
singură dată la 5000 ppm NaF după cinci săptămâni de incubare (AS-5 -exp). S-a utilizat ca
referință smalțul uman. A fost determinată rugozitatea suprafeței și eliberarea de fluor din
epruvete; Formarea biofilmului a fost simulată folosind modele microbiologice mono- sau
multispecie și analizată folosind o abordare bazată pe MTT și microscopie confocală cu scanare
laser. Rezultate. Formarea biofilmelor monospecie a fost redusă semnificativ pe HVGIC în
comparație cu RMGIC și RBC. De asemenea, a fost redus la HVGIC și emailat după tratamentul
cu fluor în grupurile AS-5-brush și AS-5-exp în comparație cu AS-5. Aceste efecte s-au
manifestat în special după 24 de ore și mai puțin pronunțate după 48 de ore de formare de
biofilm. În modelul microbiologic multispecie, observații similare au fost identificate pentru
HVGIC, în timp ce pentru smalț s-a observat o reducere semnificativă a formării biofilmului în
grupele AS-5-brush și AS-5-exp. Nu a fost identificat niciun efect semnificativ al tratamentelor
cu fluor pentru RMGIC și RBC, indiferent de modelul microbiologic aplicat. SEMNIFICAŢIE.
Aceste date indică faptul că formarea biofilmului pe suprafețele unui ciment ionomer de sticlă și
smalt poate fi influențată în mod relevant de tratamentul cu fluor. Smaltul poate servi drept
rezervor de fluor, care necesită reîncărcare periodică.
Cuvinte cheie: biofilm, bioreactor, compozit pe bază de rășină, fluor, ciment ionomer de sticlă,

Streptococ

1. Introducere

Indiferent de materialul de restaurare folosit, caria secundară este încă unul dintre cele mai frecvente
motive de eșec pentru restaurările dentare. Este strâns legat de prezența biofilmelor cariogene pe
suprafața unei restaurări dentare [1]. O parte relevantă a cercetării stomatologice contemporane se
referă la dezvoltarea și analiza materialelor de restaurare cu susceptibilitate scăzută la aderarea
microorganismelor cariogene; care are ca scop îmbunătățirea ratelor de supraviețuire a restaurărilor
dentare. Cimenturile cu ionomer de sticlă (GIC) aderă micromecanic și chimic la țesuturile dinților și
eliberează fluorură și alți ioni precum sodiu, fosfat și silicat [2–5]. În timp ce GIC-urile au fost inițial
folosite ca materiale de restaurare provizorii, GIC-urile moderne cu vâscozitate înaltă pot fi de asemenea
folosite pentru fabricarea restaurărilor permanente. Datorită proprietăților chimice, GIC-urile
interacționează atât cu țesuturile naturale ale dinților, cât și cu biofilmul de pe suprafața lor, motiv
pentru care pot fi considerate materiale bioactive. În ceea ce privește influența fluorului eliberate din
materialele de restaurare asupra formării de biofilm pe suprafața lor, GIC-urile prezintă un efect de
explozie de fluor, ceea ce presupune că eliberarea de fluor din aceste materiale este inițial ridicată și
scade rapid cu timpul [6]. Acest fenomen sugerează că materialele de restaurare pot inițial să dezvolte
inițial și proprietățile biofilmelor pe suprafața lor.

Deși s-a discutat în mod controversat dacă nivelurile de fluor eliberate din GIC sunt prea mici pentru
a avea un impact relevant asupra biofilmelor orale [7], mai multe studii de laborator și clinice au
identificat o formare mai mică de biofilm la suprafață sau în apropierea directă a GIC [8,9]. Un studiu
recent a sugerat o corelație semnificativă între valorile de fluor eliberate din GIC și proprietățile
biochimice și fizice ale biofilmelor Streptococcus MUTANS pe suprafața acestor materiale [10]. Cu toate
acestea, investigațiile de la grupurile noastre au indicat că corelația dintre aceste variabile nu este la fel
de simplă, deoarece eliberarea de fluor nu este singurul parametru care modulează formarea biofilmului
S. MUTANS pe aceste materiale. Cu toate acestea, studiile noastre au coroborat impactul fluorului
eliberat din GICs asupra biofilmelor și au indicat că impactul fluorurii asupra formării biofilmului de S.
MUTANS a fost deosebit de pronunțat în primele perioade de formare a biofilmului. Corelațiile cu
proprietățile suprafeței, cum ar fi rugozitatea sau energia fără suprafață, care sunt utilizate în mod
obișnuit pentru a explica formarea biofilmului, au fost slabe [11,12]. Studiile anterioare au evidențiat
faptul că GIC-urile pot fi reîncărcate în mod eficient cu soluții sau pastă de dinți conținând fluor [13,14],
totuși efectul reîncărcării materialelor de restaurare dentare cu fluor pe formarea biofilmului pe
suprafața lor nu are niciodată, la cunoștința autorilor, niciodată a fost adresat. Astfel, obiectivul
prezentului studiu de laborator a fost de a cerceta impactul reîncărcării mai multor materiale dentare de
restaurare cu fluor asupra S. MUTANS și formării biofilmului multispecie. Ipotezele studiului au fost că
(1) reîncărcarea materialelor de restaurare cu fluor scade formarea biofilmului pe suprafața lor și (2)
acest efect depinde de timp, biofilm și material.

2. Materiale și metode
2.1Pregătirea exemplarului

Probele standardizate au fost preparate dintr-un GIC cu vâscozitate ridicată (HVGIC), un GIC modificat
cu rășină (RMGIC) și un compozit pe bază de rășină convențional (RBC) (tabelul 1). Pentru prepararea
unui singur eșantion, o cantitate standardizată din fiecare material a fost introdusă într-o matriță din
oțel fabricată la comandă, cu un diametru de 6,0 mm și o înălțime de 2,0 mm, acoperită cu o bandă de
acetat de celuloză (Mylar®) și condensată împotriva unei farfurie de sticlă până la întărire. Probele
RMGIC și RBC au fost tratate ușor in contact direct timp de 40 de secunde folosind o unitate de întărire a
luminii de mână (SDI Radii plus, SDI, Bayswater, Australia; 1500 mW / cm2).

Dintii umani anteriori care au fost extrasi din motive clinice au fost obtinuti de la Unitatea de
chirurgie orala de la Departamentul de Stiinte Biomedicale, Chirurgicale si Dentare (Milano, Italia),
imediat inghetate dupa extractie si decongelate inainte de utilizare. Plăcile rotunde de smalț cu un
diametru de 6,0 mm și o grosime de 2,0 mm au fost tăiate de pe suprafețele labiale folosind un burd cu
diamant de trefină răcit cu apă (INDIAM, Carrara, Italia) și au fost apoi depozitate în salivă artificială.

Toate eșantioanele au fost supuse unui protocol standardizat de lustruire, inclusiv lustruirea cu hârtie
de șlefuire de 1000/4000 granule (Buehler, Lake Bluff, IL, SUA) într-o mașină de lustruit (Motopol 8;
Buehler, Düsseldorf, Germania) și au fost sub - depozitate în condiții de rezistență la lumină în salivă
artificială timp de o săptămână la 37 ± 1 ° C înainte de prelucrarea ulterioară; această procedură a
permis maturizarea cimentului și efectele potențiale minimalizate ale unei explozii de fluor inițial și
scurgerea reziduurilor de monomeri pe proceduri microbiologice. Saliva artificială a simulat compoziția
medie de electroliți a salivei umane întregi și a fost preparată de la 0,1 L de 150 mM KHCO3, 0,1 L de 100
mM NaCl, 0,1 L de 25 mM K2HPO4, 0,1 L de 24 mM Na2HPO4, 0,1 L de 15 mM CaCl2, 0,1 L de 1,5 mM
MgCl2 și 0,006 L acid citric de 25 mM. Volumul a fost de până la 1 L și pH-ul a fost ajustat la 7,0 prin
pipetarea soluțiilor de NaOH 4 M sau HCl 4 M sub agitare viguroasă [15].

Toate eprubetele au fost apoi curățate folosind apă distilată și vârfuri de perie aplicatoare (3 M ESPE,
Seefeld, G).

2.2 Design de studiu

Probele au fost alocate aleatoriu la patru grupuri cu protocoale de tratament diferite (a se vedea Fig.
1). Saliva artificială din grupele AS-5, AS-5-brush și AS-5-exp a fost schimbată de două ori pe zi pentru a
simula un efect de îmbătrânire prelungită și o spălare continuă de fluor. Ulterior, eșantioanele au fost
transmise către analiza suprafeței și simularea de biofilm.
 2.3Caracteristicile suprafeței

2.3.1 Rugozitatea suprafetei

Rugozitatea suprafeței de la vârf la vale (Ra) a fost determinată pe cinci exemplare alese aleatoriu
pentru fiecare material și grup de tratament utilizând un dispozitiv profilometric de măsurare a
suprafeței de contact (Surtronic 3+, Taylor-Hobson, Leicester, Marea Britanie). O distanță de 1,75 mm a
fost măsurată pe trei linii alese aleatoriu scanează perpendicular pe canelurile de șlefuire așteptate
folosind un vârf de diamant standard (raza vârfului 2 µm, unghiul de vârf 90 °) și un nivel de tăiere de
0,25.

2.3.2 Scanare microscopie electronică si spectroscopie X-rAy cu dispersie electronică (SEM-EDS)

Analizele SEM-EDS au fost efectuate pe cinci exemplare pentru fiecare grup folosind un microscop
electronic de scanare pe tablă (TM4000Plus; Hitachi, Schaumburg, IL, SUA) echipat cu o sondă EDS (Q75,
Bruker, Berlin, Germania). Probele uscate au fost montate pe tije folosind bandă conductivă și au fost
analizate fără acoperire prin pulverizare, folosind atât un detector secundar de electroni (SE), cât și o
tensiune de accelerație de 5 kV în sarcină de suprafață

Table 1 – Materials used in the current study.

Name Type Abbreviation Manufacturer Composition

Ionostar plus high-viscosity glass HVGIC F – Al - Si glass; polyacrylic acid,

ionomer cement tartaric acid
Resin-modified glass VOCO,
Cuxhaven, F – Al - Si glass; polyacrylic acid,
Ionolux RMGIC Germany resin

ionomer cement monomers

GrandioSo Resin-based RBC Resin: Bis-GMA, Bis-EMA,

composite TEGDMA,

camphorquinone, butylated

hydroxytoluene.
 Filler: glass ceramic filler with an
average

particle size of 1 micrometer;

functionalized silicon dioxide

nanoparticles with a size of 20

−40 nm;

pigments (iron oxide, titanium

dioxide)

Human Enamel N/A

enamel

Fig. 1 - Diagrama de flux a proiectului de studiu.

în modul de reducere a încărcării la suprafață, pentru a furniza informații de la un strat superficial de

500 nm și un detector de electroni retras (BE) și o tensiune de accelerație de 15 KV în condiții normale

de vid. Ultimele condiții au fost, de asemenea, utilizate pentru analizele EDS. Trei câmpuri selectate
aleatoriu au fost achiziționate pentru fiecare specimen în modul SE (300 ×, 5000 ×), în modul BE (300 ×,
5000 ×), și cu sonda EDS la 300x în modul cadru complet folosind un timp de achiziție de 150 s.
Distribuția elementară la suprafață a fost obținută în modul hartă (2000 × –10.000 ×) folosind un timp de
achiziție de 600 s. Datele EDS au redat compoziția elementară a stratului superficial al specimenului
analizat (-1,5,5 µm).
2.4 Proceduri microbiologice

2.4.1 PREPARAREA SALIVEI

Saliva integrală a fost colectată de la cinci voluntari sănătoși, în conformitate cu un protocol publicat
anterior [16]. Voluntarii și-au dat consimțământul informat să participe și să se abțină de la igiena orală
timp de 24 de ore, nu au avut boală dentară activă și nu au avut antibioterapie timp de cel puțin 3 luni
înainte de experimente. Pentru colectarea salivei s-au folosit eprubete refrigerate. Pentru simularea
formării de pelicule salivare, saliva de la diverși donatori a fost reunită, încălzită la 60 ° C timp de 30 min
și centrifugată (12.000 × g, 4 ° C, 15 min).

Supernatantul a fost transferat în tuburi sterile, păstrat la −20 ◦C și decongelat la 37 ° C timp de 1 oră
înainte de experimente. Pentru a furniza un inocul pentru modelul microbiologic multispecie, saliva a
fost colectată și colectată în mod analog de la cei cinci donatori, dar a fost imediat folosită pentru a
inocula bioreactorul.

2.4.2. BACTERII

S. MUTANS ATCC 35668 a fost cultivat în conformitate cu un protocol publicat anterior [17]. Pe scurt,
plăcile de agar inoculate cu Mitis, Salivarius Bacitracina au fost incubate într-un mediu de 5% CO2
completat la 37 ° C timp de 48 de ore. Un total de 1% în greutate zaharoză a fost adăugată la o suspensie
pură a microorganismului în Brain Heart Infusion obținută din aceste plăci după incubarea peste noapte
într-un mediu de 5% CO2 suplimentat la 37 ° C. Celulele S. MUTANS au fost recoltate prin centrifugare
(2200 × g, 19 ° C, 5 min), spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și resuspendate.
Suspensia a fost supusă ulterior energiei ultrasonice de joasă intensitate (modelul Sonifier B-150;
Branson, Danbury, CT, SUA; care funcționează la o putere de 7-W timp de 30 de secunde) pentru a
dispersa lanțurile bacteriene. Suspensia a fost apoi ajustată la o valoare de 1,0 pe scala McFarland,
corespunzând unei concentrații microbiene de aproximativ 6,0 × 108 celule / mL.

2.4.3. Formarea biofilmului

Un total de 30 de exemplare pentru fiecare material și grup (AS-1, AS-5, AS-5-perie, AS-5-exp) au fost
alocate aleatoriu la trei modele microbiologice diferite (n = 10 pentru fiecare material și grup. , un model
rotund / microbiologic), incluzând un model microbiologic monospețial cu S. MUTANS și fie 24 h sau 48
h de incubare, fie un model microbiologic multispecie care utilizează salivă întreagă și 48 h de incubație.

Pentru simularea formării de biofilm, a fost utilizată o modificare a unui reactor de scurgere prin
picurare disponibil în comerț (DFR 110; Bio- Surface Technologies, Bozeman, MT, SUA). Proiectarea
modificată a permis plasarea eprubetelor personalizate pe fundul celulelor de curgere și imersarea
completă a suprafețelor epruvetei în mediul curgător din jur [18]. Exemplarele au fost distribuite
aleatoriu pe opt tăvi de teflon, care au fixat specimenul strâns și și-au expus suprafețele la mediul
înconjurător; tăvile erau montate cu presă pe partea de jos a fiecărei celule de curgere a reactorului.
Toate tăvile care conțin speciile și eprubetele au fost sterilizate înainte de experimente folosind un
chimioxid cu tehnologia plasmatică cu peroxid de hidrogen (Sterrad; ASP, Irvine, CA, SUA). Au fost
evitate deteriorarea provocată de căldură a eprubetelor prin limitarea temperaturii maxime la 45 ° C.
Întregul reactor a fost asamblat în interiorul unei hote sterile și transferat într-un termostat pentru a
funcționa la o temperatură standardizată de 37 ° C.

Pentru simularea formării de pelicule salivare, suprafețele epruvetelor din fiecare celulă de curgere au
fost expuse la salivă sterilă dezghețată timp de 24 de ore. Simularea formării de biofilm monospecie a
fost inițiată prin inocularea a 10 ml suspensie de S. MUTANS în fiecare celulă a primelor două
bioreactoare. Pentru simularea formării de biofilm cu mai multe specii, 10 mL de salivă întreagă umană
reunită au fost imediat inoculate în fiecare celulă a celui de-al treilea bioreactor. După 4 ore de incubare
în condiții statice pentru a permite aderența și colonizarea inițială a suprafețelor, a fost utilizată o
pompă peristaltică controlată pe computer multicanal (RP-1; Rainin, Emeryville, CA, SUA) pentru a
asigura un flux constant de bulion de nutrienți prin toate celulele de curgere pentru timpul de incubație
specificat. Bulionul de nutrienți sterili a fost îmbogățit cu 10,0 g / L zaharoză și a constat în 2,5 g / L
mucină (tip II, porcin gastric), 2,0 g / L peptonă bacteriologică, 2,0 g / L triptonă, 1,0 g / L extract de
drojdie, 0,35 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 0,2 g / L CaCl2, 0,1 g / L clorhidrat de cisteină, 0,001 g / L hemin și
0,0002 g / L vita- min K1. Debitul a fost stabilit la 9,6 ml / h [17].

2.4.4. EVALUAREA BIOMASEI VIABILE

După o incubare de 24 de ore sau 48 de ore în modelul microbiologic mono- sau multispecie, biomasa
viabilă aderentă suprafețelor specimenului a fost evaluată cu un test bazat pe MTT [18]. Pe scurt, soluția
de stoc MTT a fost preparată prin dizolvarea a 5 mg / ml 3- (4,5) -dimetiltiiazol-2-il-2,5-difeniltetrazoliu
bromură în PBS steril; Soluția de stoc de metosulfat de fenazină (PMS) a fost preparată prin dizolvarea a
0,3 mg / ml de N-metilfenazinium metil sulfat în PBS steril. Soluțiile au fost stocate la 2 ° C în flacoane
rezistente la lumină până în ziua experimentului, când a fost preparată o soluție proaspătă de măsurare
(FMS) prin diluarea a 1:10 v / v de soluție stoc MTT și 1:10 v / v de soluție stoc PMS în PBS steril. S-a
preparat o soluție de lizare (LS) dizolvând 10% v / v de sulfat de sodiu dodecil și 50% v / v
dimetilformamidă în apă deionizată.

După incubarea de 24 h sau 48 h în modelul microbiologic mono- sau multispecie, s-a oprit fluxul de
bulion de nutrienți, s-au deschis celulele de curgere, iar tăvile care conțin exemplarele au fost
îndepărtate cu grijă și plasate imediat în vasele Petri. cu PBS steril la 37 ° C. Probele au fost îndepărtate
ulterior ușor din tavă, trecute într-o altă farfurie cu PBS steril la 37 ° C pentru a îndepărta celulele
neaderente și, în final, transferate în plăci cu 48 de godeuri. S-au adăugat 300 ul de soluție FMS în
fiecare godeu și plăcile au fost incubate timp de 3 ore la 37 ° C în condiții de izolare a luminii. În timpul
incubării, transportul de electroni pe membrana plasmatică microbiană și, într-o măsură mai mică,
sistemele microbiene redox au transformat sarea galbenă în cristale de forzanan violet insolubile.
Conversia la nivelul membranei celulare a fost facilitată de acceptorul intermediar de electroni (PMS).
Soluția FMS nereacționată a fost îndepărtată ușor și cristalele de forgan au fost dizolvate prin adăugarea
a 300 ul de LS la fiecare godeu. Plăcile au fost depozitate timp de o oră suplimentară în condiții de
rezistență la lumină la temperatura camerei; 100 pL de soluție au fost apoi transferate în godeurile
plăcilor cu 96 de godeuri. Absorbanța soluției a fost măsurată folosind un spec-tropotometru (Genesys
10-S, Thermo Spectronic, Rochester, NY, SUA) la o lungime de undă de 550 nm, iar rezultatele au fost
afișate ca unități de densitate optică (OD).

2.4.5. Microscopie LASER-SCANARE Confocală

Un total de două exemplare pentru fiecare material și grup de tratament au fost îndepărtate ușor din
celulele de curgere, clătite de două ori cu PBS steril, colorate folosind kitul de viabilitate Biofilm
FilmTracerTM LIVE / DEAD® (Invitrogen Ltd., Paisley, Marea Britanie) și analizate folosind confocal
microscopie cu scanare laser (CLSM; Leica TCS SP2, Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). Patru
secțiuni de stivă de imagini selectate aleatoriu au fost înregistrate pentru fiecare specificitate și timp de
incubație. Imaginile confocale au fost obținute folosind un obiectiv uscat (20 ×; NA = 0,7) și digitalizate
folosind Leica Application Suite Advanced Fluorescence Software (LAS-AF, Leica Microsystems) la o
rezoluție de 2048 × 2048 pixeli, cu un factor de zoom de 1,0 și o viteză de scanare de 400 Hz. Au fost
achiziționate trei canale; unul a prezentat o excitație la 405 nm și emisie la 420-470 nm pentru a scăpa
digital autofluorescența potențială. Celelalte două canale au avut o lungime de undă de excitație de 488
nm și emisia a fost dobândită la 500–570 nm (canal verde, bacterii vii) și 610–760 nm (canal roșu,
bacterii moarte). Pentru fiecare secțiune de stivă de imagini, reconstrucțiile de redare 3D au fost
obținute folosind ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, SUA) și Drishti (Ajay Limaye,
Australian National University, CAN, AUS http://sf.anu.edu.au / Vizlab / drishti /).

2.5. Determinarea eliberării de fluor

Eliberarea de fluor din fiecare material a fost determinată înainte de simularea formării biofilmului.
Mediul de stocare a salivei artificiale de la fiecare grup de tratament a fost colectat pe parcursul unei
săptămâni, ceea ce a reprezentat un total total de patru măsurători pentru grupurile AS-5 și AS-5-perie.
Măsurile din grupul AS-1 au produs valori de bază pentru toate grupurile după prima săptămână de
păstrare în saliva artificială.Datorită protocolului de stocare analog în grupul AS-5-exp ca în grupul AS-5,
AS-5-exp nu a fost măsurat separat. Reîncărcarea cu fluor în eșantioane din grupul AS-5-exp a fost
identificată prin analizarea soluțiilor de fluorură de 5000 ppm în urma expunerii la diferite exemplare.
Cantitatea de fluor care a fost absorbită de epruvete a fost calculată pe baza diferenței dintre cantitatea
originală și cea reziduală de fluor din soluție. Cantitatea absorbită de fluor a fost calculată și afișată în
ppm / mm2 din suprafața materialului corespunzător. Această procedură a permis calcularea unei
funcții cinetice privind eliberarea de fluor din HVGIC și RMGIC în saliva artificială înainte și după
tratamentul cu fluor în grupele AS-5-brush și AS-5-exp.

Toate analizele au fost efectuate folosind o micro-metodă de selecție ionică, descrisă anterior [11]. Pe
scurt, o soluție stoc cu o concentrație de fluor de 1000 ppm a fost diluată în mod corespunzător cu salivă
artificială pentru a obține standarde de fluor cu concentrații de fluor cuprinse între 0,0019 și 64 părți pe
milion (ppm). O curbă de calibrare a fost obținută prin măsurarea standardelor de fluorură folosind un
contor digital de pH / mV (SA-720, Orion Research Inc, Boston, MA, SUA). Amestec de acetat de sodiu
20% v / v cu EDTA ca ajustator de rezistență ionică a fost adăugat la fiecare standard înainte de analize.
S-a preparat un standard de referință negativ (fluorură de 0 ppm) adăugând 20% v / v de tampon de
acetat de sodiu cu EDTA la saliva artificială; această soluție a fost folosită și pentru clătirea electrozilor
între măsurători unice.

2.6.Analize statistice

Analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul JMP 10.0 (SAS Institute, Cary, NC, SUA).
Distribuția normală a datelor a fost verificată folosind testul Shapiro – Wilk și omogenitatea variabilelor
a fost verificată folosind testul lui Levene. Mijloacele și erorile standard au fost calculate din datele
brute. Datele privind duritatea suprafeței au fost transformate în jurnal înainte de analiza statistică
pentru a aborda distribuția normală. Analiza bidirecțională a varianței (ANOVA) a fost utilizată pentru a
analiza rugozitatea suprafeței, EDS și datele viabile ale biomasei, considerând „materialul” și
„tratamentul” ca factori fixi. Eliberarea de fluor a fost analizată folosind ANOVA cu trei căi, stabilind
„material”, „tratament” și „punct de timp” ca factori fixi. Testul lui Tukey a fost aplicat pentru analize
post-hoc. Nivelul de semnificație (a) a fost stabilit la 0,05.

3. Rezultate
3.1. Analize de suprafață

Detalii despre rugozitatea suprafeței diferitelor materiale și eprubete sunt afișate în Fig. 2. Au fost
identificate diferențe semnificative între materiale (HVGIC> RMGIC (p = .035), RMGIC = email (p = .113),
email> RBC ( p = .005). Diferitele tratamente nu au influențat rugozitatea RMGIC, în timp ce depozitarea
în saliva artificială a crescut ușor rugozitatea suprafeței HVGIC și RBC și a scăzut rugozitatea suprafeței
smalțului. Periaj cu pastă de dinți în grupul AS- 5 perii au condus la o ușoară scădere a rugozității
suprafeței pentru RBC și HVGIC în comparație cu celelalte grupuri.

HVGIC și RMGIC au apărut foarte asemănătoare în analizele SEM (Fig. 3, AS-1), cu particule ascuțite de
câțiva microni încorporate într-o matrice mai ușoară. RMGIC părea să aibă mai multe particule de
umplutură foarte strânse și mai puține fisuri și bule decât HVGIC. Pentru toate materialele, au fost
identificate canelurile paralele cauzate de procedurile de lustruire. RBC a arătat o suprafață foarte
omogenă, cu particule de umplere care variază de la micro-nano-scară încorporate într-o matrice de
rășină. Structuri prismatice caracteristice au fost identificate pentru smalț în modul electronic retras.

După 5 săptămâni de depozitare (AS-5), au fost identificate mai puține fisuri pe suprafața HVGIC și
RMGIC. Tratamentul cu soluție de fluor puternic concentrată (grup AS-5-exp) nu a produs diferențe
relevante în morfologia suprafețelor. Periajul dinților (peria de grup AS-5) a produs schimbări distincte în
aspectul suprafeței de HVGIC și, în special, RMGIC. Pentru RMGIC, periajul a îndepărtat particulele de
umplutură pe suprafață ceea ce a determinat o expunere a matricei. Pentru suprafețele RBC și email, nu
au fost identificate modificări.

Tabelul 2 indică compoziția suprafeței diferitelor materiale după diferitele tratamente, astfel cum au
fost obținute de EDS. Timpul de stocare s-a corelat cu o scădere semnificativă a nivelului de fluor de
suprafață pentru HVGIC și RMGIC. Tratamentul cu fluorhidrat în grupuri AS-5-brush și AS-5-exp a coincis
cu o creștere semnificativă a fluorurii de suprafață pentru aceste materiale, precum și a smaltului.
Tratamentul în grupul AS-5-exp a produs niveluri mai mari de fluorură de suprafață în HVGIC în
comparație cu valoarea inițială și cu peria AS-5, în timp ce tratamentul în peria AS-5 a produs niveluri
mai mari de fluorură de suprafață în smalț în comparație cu AS-5 -exp. Tratamentul în peria grupului AS-
5 a produs acumulare de titan pe suprafața de HVGIC, RMGIC și smalt.

Deoarece titanul este unul dintre ingredientele pastei de dinți (Tabelul 2), hărțile EDS (Fig. 4) au
dovedit un transfer de titan de la pasta de dinți la suprafața HVGIC, RMGIC și a smalțului după periaj
(grupul AS-5-perie) ; nu a fost identificat niciun titan pe suprafețele RBC.

3.2. Formarea biofilmului

Fig. 5a afișează rezultatele pentru formarea de biofilm monospecie S. MUTANS după 24 de ore. Ambii
factori, material și tratament, au influențat semnificativ formarea biofilmului (p <0,001). Biomasa viabilă
pe HVGIC a crescut ușor după incubația extinsă în saliva artificială (grupul AS-5) în comparație cu
valoarea de bază (grup AS-1); în grupul AS-5-brush și AS-5 exp
a dus la o reducere semnificativă a biomasei viabile în comparație cu grupul de referință AS-1 (p <0,05).
Nu au fost identificate diferențe semnificative în biomasă viabilă pentru RMGIC și RBC, ceea ce indică
faptul că tratamentele din peria AS-5 și AS-5-exp din grup nu au avut niciun efect relevant asupra
formării biofilmelor monospecie pe suprafața acestor materiale. Pentru smalt, ambele grupuri AS-5-
brush și AS-5-exp au arătat o scădere semnificativă a biomasei viabile (p <0.005).

Fig. 5b afișează rezultatele pentru formarea biofilmului monospecie S. MUTANS după 48 de ore. Au
fost identificate mai puține diferențe de biomasă viabilă între materiale și grupuri decât după 24 de ore
și nu s-a observat niciun efect al materialelor care eliberează fluor asupra biomasei viabile. Cu toate
acestea, efectul tratamentului cu fluor în grupurile AS-5-brush și AS-5-exp a fost încă evident. Ambii
factori, material și tratament, au influențat semnificativ biomasa viabilă (p = 0.009 și, respectiv, p =
0.005), deși nu au fost identificate interacțiuni semnificative. Pentru HVGIC și RBC, s-a observat o
biomasă viabilă ușor mai mică decât în cazul smalțului (p <0.05). Ambele tratamente cu fluor (grupuri
AS-5-brush și AS-5-exp) au arătat că biomasa semnificativ mai puțin viabilă a fost identificată în
comparație cu celelalte două grupuri (p <.01).
Table 2 – Surface elemental composition (wt%) of the various materials immediately after polishing procedures (T = 0) and after the different
treatment protocols as identified by energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS). Data identified for O, Na, Mg, and K are not displayed.
Different letters indicate statistically significant differences between groups (Tukey test, p < 0.05).

C F Al Si P Ba Sr Ca Ti Inorg.

T=0 20.97 c,d, 7.13 a, 8.22 a 8.00 c, 1.44 f,g, 0.00 e 8.97 b,c, 0.00 e 0.00 b 34.82 d,e
(1.26) e (0.21) b (0.30) (0.63) d (0.07) h,i (0.00) (0.90) d (0.00) (0.00) (1.88)

AS-1 20.22 b,c, 5.15 c 8.44 a 8.76 c 1.44 f,g, 0.00 e 9.17 a,b,1.69 c,d0.00 b 34.11 d,e,
(0.35) d,e, (0.10) (0.07) (0.06) (0.03) h,i (0.00) (0.15) c,d (0.16) ,e (0.00) (0.02) f
f

HVGIC AS-5 18.98 c,d, 3.93 c 8.22 a 7.12 d, 3.70 d,e 0.00 e 9.95 a,b,4.61 c,d0.00 b 34.10 d,e,
(2.30) e,f, (0.30) (0.37) (0.79) e (1.49) (0.00) (0.05) c (1.58) (0.00) (0.06) f
g

AS-5- 18.17 c,d, 5.84 b, 8.25 a 9.14 c 1.91 e,f, 0.00 e 8.24 c,d 2.89 c,d0.27 a, 34.49 d,e,
brush (0.24) e,f, (1.02) c (0.21) (0.28) (0.24) g,h (0.00) (0.01) (0.77) ,e (0.05) b (0.74) f
g

AS-5- 19.68 c,d, 8.30 a 8.00 a 7.37 d, 2.48 d,e 0.00 e 9.28 b,c, 4.87 c 0.00 b 36.59 c,d,
exp (1.69) e,f (1.28) (0.36) (0.54) e (0.54) ,f (0.00) (0.24) d (1.49) (0.00) (0.94) e

T=0 28.40 a,b 5.62 b, 7.76 a 8.13 c, 2.05 e,f, 0.00 e 9.77 a,b,0.30 e 0.00 b 34.13 e,f
(0.77) (0.51) c (0.17) (0.23) d (0.16) g (0.00) (1.07) c (0.15) (0.00) (1.51)

AS-1 25.64 a,b, 5.82 b, 8.01 a 7.97 c, 2.37 d,e 0.00 e 10.14 a,b,0.49 e 0.00 b 35.27 c,d,
(0.41) c,d (0.07) c (0.07) (0.09) d (0.05) ,f,g (0.00) (0.14) c (0.08) (0.00) (0.35) e,f

RMGIC AS-5 23.35 b,c, 5.36 b, 7.55 a, 7.11 d, 4.01 d 0.00 e 10.81 a,b 1.64 c,d0.00 b 36.09 c,d,
(0.51) d,e (0.22) c (0.23) b (0.21) e (0.18) (0.00) (0.08) (0.68) ,e (0.00) (0.42) e

AS-5- 32.43 a 4.62 c 6.25 b 6.50 e 2.44 d,e 0.00 e 7.97 d 2.33 c,d0.58 a 28.59 f
brush (8.93) (1.30) (1.17) (0.62) (0.68) ,f (0.00) (1.36) (1.05) ,e (0.62) (2.22)

AS-5- 26.57 a,b, 7.16 a, 7.68 a 7.36 d, 2.68 d,e 0.00 e 10.92 a 1.80 d, 0.00 b 36.92 c,d,
exp (1.12) c (0.66) b (0.32) (0.43) e (0.14) ,f (0.00) (0.29) (0.53) e (0.00) (0.53) e

T=0 13.62 f,g, 0.00 e 3.44 c 24.35 a 0.00 i 14.02 a 0.00 e 0.09 e 0.00 b 41.81 c
(0.51) h,i (0.00) (0.08) (0.33) (0.00) (0.46) (0.00) (0.06) (0.00) (0.77)
 AS-1 13.99 e,f, 0.07 e 3.69 c 23.94 a, 0.02 h,i 13.20 b 0.00 e 0.16 e 0.00 b 40.91 c,d,
(0.68) g,h, (0.03) (0.06) (0.66) b (0.02) (0.05) (0.00) (0.07) (0.00) (0.71) e
i

RBC AS-5 14.77 e,f, 0.18 e 3.59 c 22.51 b 0.29 g,h 11.79 d 0.00 e 0.51 e 0.00 b 38.49 c,d,
(0.56) g,h, (0.00) (0.06) (0.09) (0.31) ,i (0.72) (0.00) (0.41) (0.00) (0.25) e
i

AS-5- 14.15 e,f, 0.11 e 3.70 c 23.89 a, 0.03 h,i 13.16 b 0.00 e 0.15 e 0.03 b 41.00 c,d,
brush (0.18) g,h, (0.00) (0.02) (0.19) b (0.04) (0.19) (0.00) (0.03) (0.03) (0.07) e
i

AS-5- 14.97 e,f, 0.57 d, 3.61 c 23.71(0 a, 0.03 i 12.45(0 c 0.00 e 0.31 e 0.00 b 40.38 c,d
exp (0.22) g,h (0.05) e (0.03) .16) b (0.02) .24) (0.00) (0.09) (0.00) (0.23)

T=0 7.01 i 0.02 e 0.08 d 0.20 f 14.76 a 0.00 e 0.00 e 35.40 a 0.00 b 50.46 a,b
(0.78) (0.02) (0.04) (0.19) (0.66) (0.00) (0.00) (0.79) (0.00) (1.23)

AS-1 11.69 f,g, 0.06 e 0.06 d 0.10 f 12.29 b,c 0.00 e 0.00 e 30.24 b 0.00 b 43.24 b,c
(0.83) h,i (0.01) (0.01) (0.02) (0.95) (0.00) (0.00) (2.21) (0.00) (3.27)

Enamel AS-5 17.11 d,e, 0.01 e 0.09 d 0.30 f 11.00 c 0.00 e 0.00 e 27.19 b 0.00 b 39.52 c,d,
(0.99) f,g (0.01) (0.06) (0.01) (1.62) (0.00) (0.00) (3.23) (0.00) (5.53) e

AS-5- 7.55 h,i 0.89 d 0.08 d 0.38 f 14.05 a,b 0.00 e 0.00 e 34.88 a 0.26 a, 51.09 a
brush (1.07) (0.10) (0.06) (0.18) (0.99) (0.00) (0.00) (1.64) (0.27) b (2.71)

AS-5- 10.29 g,h, 0.36 e 0.05 d 0.23 f 14.03 a,b 0.00 e 0.00 e 34.25 a 0.00 b 49.47 a,b
exp (1.76) i (0.08) (0.03) (0.11) (0.19) (0.00) (0.00) (1.29) (0.00) (1.52)

Toothp 31.29 0.30 0.02 7.15 0.00 () 0.00 0.00 0.00 1.52 10.05
aste (4.45) (0.29) (0.13) (1.18) (0.00) (0.00) (0.00) (1.61) (1.72)
 Fig. 2 - Rugozitatea suprafeței diferitelor materiale după diferitele protocoale de tratament. Litere diferite indică
diferențe semnificative statistic între grupuri (testul Tukey, p <0,05).

Analizele CLSM efectuate pentru biofilme S. MUTANS după 48 de ore (Fig. 6) au indicat că atât
materialul cât și tratamentul au afectat viabilitatea și morfologia biofilmelor. După o săptămână de
stocare (grup AS-1), suprafețele RMGIC, RBC și email au afișat un biofilm complex cu mai multe straturi,
cu un raport foarte mare de celule viabile. Suprafețele HVGIC au afișat un biofilm mai subțire, cu un
raport mai mare de celule moarte, în special în apropierea suprafeței. După 5 săptămâni de păstrare
(grup AS-5), nu au fost identificate diferențe relevante în biofilmele pentru RMGIC, RBC și epruvete în
comparație cu grupul AS-1, în timp ce biofilmele de pe suprafața HVGIC au prezentat un raport mai mic
de celule moarte .

Periajul cu pasta de dinți conținând fluor (peria de grup AS-5) nu a produs nicio modificare a creșterii
biofilmelor pe RBC, în timp ce pentru RMGIC a fost identificată o reducere a biomasei aderente; cu toate
acestea, nu a fost observat niciun efect asupra viabilității sale. Pentru smalț, au fost identificate structuri
de biofilm mai puțin dense cu un raport mai mare de celule moarte, iar HVGIC a afișat biofilme cu cel
mai mare raport de celule moarte. Tratamentul cu soluție de fluor puternic concentrată (grupa AS-5-
exp) a avut un efect similar asupra biofilmelor dezvoltate pe HVGIC ca în peria AS-5. Biofilmurile formate
pe RMGIC și smalțul au arătat un raport mai mare de celule moarte în grupul AS-5-exp decât în grupul
AS-5-brush, în timp ce nu s-au identificat diferențe relevante între biofilme pe suprafețele RBC din toate
grupurile.

Rezultatele după simularea formării de biofilm în modelul multispecie sunt afișate în Fig. 5c. Atât
materialul, cât și tratamentul au influențat semnificativ biomasa viabilă (p <0,001). Nu s-au identificat
diferențe semnificative de biomasă viabilă între grupurile de tratament pentru materialele de restaurare
HVGIC, RMGIC și RBC, ceea ce indică faptul că tratamentul cu fluorescentă nu a avut efect asupra
biomasei viabile de pe suprafața acestor materiale în modelul de biofilm multispecie. Biomasa viabilă pe
email a fost semnificativ mai scăzută după tratament în conformitate cu protocoalele grupului AS-5-
brush și AS-5-exp (p <0.005).

3.3. Eliberarea de fluor

Eliberarea de fluor a fost semnificativ mai mare de la HVGIC decât de la RMGIC; nicio eliberare de fluor
nu a fost observată de la RBC, precum și smalț (Fig. 7a). A fost identificată o explozie de fluor relevantă
pentru HVGIC și RMGIC; pentru RMGIC, eliberarea de fluor s-a apropiat de un platou după o perioadă de
trei săptămâni. Tratamentul cu pastă de dinți în peria de grup AS-5 corelat cu o eliberare semnificativ
mai mare de fluor din HVGIC și RMGIC. Au fost observate efecte de interacțiune semnificative între cei
doi factori, ceea ce indică faptul că eliberarea de fluor depindea atât de material cât și de tratament.

Tratamentul cu fluorhidrat în grupuri AS-5-brush și AS-5-exp a redus semnificativ scăderea eliberării

de fluor din materialele bioactive. Pentru email, s-a observat o eliberare semnificativă și constantă de
fluor în urma tratamentului cu pastă de dinți în peria de grup AS-5. Expunerea la o soluție cu
concentrație mare de fluor în grupul AS-5-exp a dus la un aport mare de fluor de HVGIC și smalț (Fig. 7b).
Pentru grupurile de perii AS-1, AS-5 și AS-5, conținutul ridicat de fluoruri este corelat cu eliberarea mare
de fluor. Corelația este dată de jurnalul ecuației (degajare de fluorură (ppb / mm2)) = −0.505 + 1.048 *
Conținut de fluorură (%), p = 0.744.
 Fig. 3 - Analiza microscopică electronică de scanare (SEM) a suprafeței diferitelor materiale. Un câmp microscopic
reprezentativ dobândit în modul de electroni retras (BE), cu o tensiune de accelerație de 15 kV și o mărire de 300
× pentru fiecare material și pentru fiecare grup de tratament. RMGIC a prezentat caracteristici intermediare ale
suprafeței între materialele HVGIC și RBC. Atât pentru HVGIC cât și RMGIC se pot identifica fisuri și bule
încorporate în timpul procedurii de amestecare. Datorită matricei de rășină, RMGIC a prezentat mai puține fisuri și
bule decât HVGIC. Pentru a afișa mai bine schimbările de suprafață rezultate în urma procedurii de periere, a fost
achiziționat un set suplimentar de imagini în modul electron (SE) secundar, cu o tensiune de accelerație de 5 kV și
o mărire de 300 ×. Ca în grupurile AS-1, AS-5 și AS-5-exp, au fost identificate doar mici diferențe de morfologie de
suprafață pentru toate materialele, imaginile reprezentative ale fiecărui material din grupul de tratament AS-1 au
fost comparate cu peria AS-5. Periajul a afectat în mod relevant suprafața RMGIC și, într-o măsură mai mică, a
HVGIC. Periajul a provocat o abraziune a particulelor de umplutură și, în special pentru RMGIC, a produs o
suprafață formată în principal din matrice. Materialele RBC și email au prezentat suprafețe foarte omogene care
nu au fost modificate de diferitele tratamente.

4. Discutie
Studiul curentului a emis ipoteza că (1) reîncărcarea materialelor de restaurare cu fluor scade formarea
biofilmului pe suprafața lor și (2) efectul depinde de timp, biofilm și material. Rezultatele sugerează
acceptarea primei ipoteze de cercetare, deoarece pentru unele materiale de restaurare a fost identificat
un impact semnificativ al tratamentului cu fluor asupra formării biofilmului. A doua ipoteză de cercetare
poate fi, de asemenea, acceptată, deoarece efectul tratamentului cu fluor a arătat o dependență
relevantă de timp, de material și de modelul microbiologic folosit pentru simularea formării biofilmului.
Deși se depun eforturi noi în noile dezvoltări, nu există în prezent materiale de restaurare directe care să
garanteze înlocuirea cu succes a țesuturilor dinților naturali pentru întreaga viață a pacientului. În timp
ce RBC nanohidratele prezintă mai multe proprietăți favorabile, cum ar fi manevrarea ușoară, precum și
mecanica și estetica avantajoasă, aceste materiale au și unele puncte slabe, inclusiv degradarea
interfeței adezive prin factori endogeni și exogeni. Mai mult decât atât, RBC-urile nu prezintă o
capacitate de tamponare așa cum o fac țesuturile dinților naturale [19], ceea ce promovează formarea
de biofilme cariogene pe suprafața lor. În schimb, GIC-urile sunt materiale bioactive, deoarece
eliberează ioni activi biologic, cum ar fi fluide, sodiu, fosfat și silicat în țesuturile înconjurătoare și pot
absorbi și ioni din salivă. Eliberarea ionilor din GIC produce un strat bogat în ioni în țesuturile dintelui
adiacente, care este foarte rezistent la atacul acid [4]. Mai mult, s-a demonstrat că eliberarea de ioni din
GIC este semnificativ crescută în mediile acide [20], iar un efect tampon al GIC-urilor a fost dovedit [21].
Drept urmare, s-a demonstrat că aceste materiale pot împiedica demineralizarea țesuturilor naturale
dinte adiacente [22,23] și formarea de biofilm cariogen [24]. Cu toate acestea, eliberarea de fluor
urmează un model cinetic special, incluzând o fază inițială cu o eliberare foarte mare (adică efect de
explozie), care este urmată de eliberarea mai mică și constantă a fluorurii cu timpul. S-a raportat că
eliberarea de fluor din materii de restaurare este un proces complex, incluzând difuzarea apei în
material, dizolvarea sau schimbul de fluor în solid, precum și difuzarea fluorurii din material [25 ]. În
general, în studiul de față, a fost identificată o corelație logaritmică între conținutul de suprafață de fluor
și eliberare. Pentru GICs, explozia inițială de fluor a fost explicată prin eliberarea de fluorură legată slab