Universitatea de Medicină și Farmacie “Iuliu Hațieganu’’ Cluj-Napoca

Facultatea de Medicină

LUCRARE DE LICENȚĂ

Diabetul Zaharat și Stresul Oxidativ

Îndrumător:
Conf. Dr. Tiberiu Nistor

Absolvent:
Dabala Victor-Horea 2020

1
Cuprins

CAPITOLUL 1. PARTEA GENERALĂ........................................................................................3

 1. Diabetul Zaharat..................................................................................................................3
1.1. Aspecte generale.............................................................................................................3
1.2. Clasificare.........................................................................................................................5
1.3. Diabetul Zaharat de Tip 1................................................................................................6
1.4. Diabetul Zaharat de Tip 2................................................................................................9
1.5. Diabetul gestațional.......................................................................................................13
1.6. Tipuri specifice de diabet..............................................................................................13 2.
Stresul Oxidativ..................................................................................................................14 2.1.
Introducere.....................................................................................................................14 2.2.
Asocieri între stresul oxidativ, diabetul zaharat și procesul inflamator..................16 2.3.
Apărarea antioxidantă...................................................................................................20
2.4. Dualitatea radicalilor liberi............................................................................................22 2.5.
Sisteme de apărare împotriva radicalilor liberi...........................................................24 2.5.1.
Sisteme enzimatice de apărare............................................................................24 2.5.2.
Sisteme non-enzimatice de apărare....................................................................29

CAPITOLUL 2. PARTEA PRACTICĂ........................................................................................31

3. Contribuții Personale........................................................................................................31
3.1. Ipoteza de lucru.............................................................................................................31
3.2. Materiale și Metode.......................................................................................................32
3.2.1. Material clinic…….…………….………………………………………….……………32 3.2.2.
Analiza statistică..................................................................................................32 3.2.3.
Metode de lucru……………….………………………….………………….……...…33 3.3.
Rezultate.......................................................................................................................57 3.3.1.
Analiza datelor demografice ale grupurilor.......................................................57 3.3.2. Analiza
datelor biochimice obținute în studiul grupurilor...............................58 3.4.
Discuții..........................................................................................................................67
3.5. Concluzii.......................................................................................................................69 4.
Bibliografie.....…………...…….………………………………………………………….….…70

2
Capitolul 1. Partea generală

1. Diabetul Zaharat
1.1. Aspecte generale

Diabetul zaharat este o patologie cronică sistemică debilitantă heterogenă, caracterizată ca și

un complex de boli metabolice, în cadrul căruia mecanismele fiziopatologice principale sunt
afectarea secreției insulinice a celulelor pancreatice de tip B și limitarea efectelor hormonului
hipoglicemiant, rezultatul acestor modificări fiind instalarea hiperglicemiei cronice precum și
scăderea toleranței celulelor la glucoză. Procesele respective sunt caracteristice ambelor tipuri
majore - diabetul de tip 1 (DZT1) și diabetul de tip 2 (DZT2). În funcție de etiologia bolii, între
factorii ce contribuie la apariția hiperglicemiei se regăsesc scăderea secreției de insulină,
rezistența celulară la glucoză cu scăderea utilizării acesteia precum și producția excesivă a
glucozei. Datorită unor determinanți precum industrializarea, obezitatea, sedentarismul și
creșterea demografică, cu preponderență în cadrul țărilor dezvoltate sau în curs de dezvoltare,
prevalența și incidența diabetului sunt în continuă creștere, în special în rândul populației
vârstnice, aproximativ 400 de milioane de persoane fiind afectate în prezent, cu o creștere de
350 de milioane din anul 1985 până in 2013 - predicția Federației Internaționale a Diabetului
fiind de aproximativ 600 de milioane de cazuri până in anul 2035. Astăzi, OMS și FID atrag
atenția asupra asocierilor multiple între obezitate și diabet, termenul de „diabezitate” fiind tot mai
frecvent folosit pentru a descrie această afecțiune cu creștere exponențială la nivel global. Se
observă un impact major și asupra factorului economic, costurile fiind de patru ori mai ridicate
pentru populația diabetică comparativ cu persoanele sănătoase ( aproximativ 548 de miliarde de
$ fiind cheltuiți la nivelul anului 2013 pentru îngrijirile și tratamentele pacienților). Diabetul este
de asemenea o cauză majoră de morbiditate si mortalitate, fiind considerat ca subraportat în
legătură cu numărul total de decese. Riscul general de mortalitate în rândul persoanelor cu
diabet este cel puțin dublu față de riscul indivizilor fără diabet (1, 2, 3, 4, 5, 6).

Bolile cardiovasculare sunt principala cauză de deces și dizabilitate în rândul diabeticilor,

incidența bolilor cardiovasculare fiind de trei până la patru ori mai mare decât la persoanele
non-diabetice. Într-un studiu multinațional, 50% dintre persoanele cu diabet zaharat au decedat
datorită bolilor cardiovasculare, cu o dublare a riscului de insuficiență cardiacă la pacienții de

3
sex masculin și o creștere de cinci ori la cel feminin. De asemenea, diabetul determină
creșterea incidenței bolilor coronariene și dezvoltarea leziunilor aterosclerotice la vârste tinere,
acestea din urmă implicând o afectare multivasculară, inclusiv a segmentelor coronariene
distale. Diabetul poate provoca modificări patologice distincte la nivelul miocardului, condiție
denumită „cardiomiopatie diabetică” (DMC). Hipertensiunea arterială este frecvent întâlnită atât
în diabetul de tip 1 cât și în tipul 2. Complicațiile vasculare sunt de asemenea o problemă
importantă în diabet și duc la deteriorarea funcțională suplimentară a mai multor organe,
provocând complicații micro și macroangiopatice. Disfuncția endotelială și dispariția echilibrului
între factorii vasodilatatori și cei vasoconstrictori sunt în mare parte asociate în cadrul afectării
vasculare la pacienții cu DZT2. În combinație cu fluxul sanguin redus, neuropatia la nivelul
membrelor inferioare crește șansele apariției ulcerațiilor piciorului, riscul de infecții și eventuala
necesitate de amputație a membrelor, afectând 30% până la 50% din pacienții cu diabet. Un
procent din orbirea globală este atribuit retinopatiei diabetice, datorită afectării cronice a vasele
retiniene. Nefropatia diabetică, o altă complicație microvasculară importantă, determină un risc
de nouă mai mare la pacienții cu diabet de evoluție spre insuficiență renală, cu necesitatea
asigurării dializei și a transplantului renal în stadiul terminal. În ceea ce privește complicațiile din
spectrul acut ale pacienților cu DZ, cele mai frecvente sunt reprezentate de cetoacidoza
diabetică și instalarea comei hiperglicemice hiperosmolare. Conform unor numeroase studii,
suferința pacienților diabetici este puternic accentuată datorită stresului oxidativ cronic, în
special din cauza hiperglicemiei. Stresul oxidativ poate iniția modificări patologice la nivelul
sistemului cardiovascular, cum ar fi alterarea funcționalității endoteliale, hipertrofie și fibroză
cardiacă și apariția disfuncției contractile ventriculare. (1, 4, 7-10)
Există numeroși factori care pot influența sau determina aparița acestei patologii. Obezitatea și
lipsa activității fizice regulate au fost incriminate în apariția rezistenței celulare la insulină, care la
rândul ei precede instalarea DZT2 și este constant însoțită de factori de risc cardiovasculari
precum hipertensiunea, statusul procoagulant sau dislipidemia. Alimentația joacă de asemenea
un rol important, în special consumul crescut de hidrați de carbon, datorită influențării asupra
nivelurilor postprandiale de glucoză. S-a constatat rolul susceptiblității genetice în instalarea
mecanismelor fiziopatologice (în special în DZT2), aceasta fiind strâns legată de scăderea
toleranței tisulare la glucoză. (1, 4)

4
1.2. Clasificare

Clasificarea modernă a diabetului zaharat se realizează pe baza proceselor fiziopatologice care

au ca rezultat instalarea hiperglicemiei, în contrast cu alte criterii utlizate în trecut precum vârsta
de debut sau tipul medicației utilizate.

În afara celor două mari categorii ale patologiei, și anume diabetul zaharat de tip 1 si diabetul
zaharat de tip 2, există anumite forme specifice precum diabetul gestațional sau diferite
disfuncții ce pot determina apariția diabetului, considerate parte a noii clasificări:
- Defecte genetice ale acțiunii insulinei sau ale dezvoltării și funcționării celulelor B ale
pancreasului

- Patologii ale pancreasului exocrin – pancreatită, neoplasm pancreatic

- Diabet indus de medicație - glucocorticoizi, agoniști beta adrenergici

- Diabet indus datorită unor infecții

- Forme rare de diabet imunomediat sau diferite sindroame genetice

Multe dintre formele de diabet datorate acestor patologii sunt asemănătoare cu DZT1 sau
DZT2, dar nu sunt precedate de o alterare inițială în metabolismul glucozei (fig. 1), ce indică
apariția procesului patologic și evoluția lui, precum în cele două forme principale. (4)

Fig.1. Procesul de utilizare fiziologică a glucozei.

https://www.kindredhealthcare.com/resources (12)

5
1.3. Diabetul Zaharat de Tip 1

Introducere

Diabetul zaharat de tip 1 este rezultatul unei interacțiuni complexe între factori genetici,
imunologici și de mediu, fiind caracterizat prin apariția unei depleții sau a unei epuizări aproape
totale a depozitelor de insulină (fig 2). Procesul este datorat unor fenomene autoimune
declanșate de un stimul extern specific (ex. diferite infecții), în urma căruia are loc distrugerea
celulelor beta ale pancreasului. Deși autoimunitatea este factorul primar incriminat în
fiziopatologie, acțiunea directă asupra celulelor beta nu poate fi obiectivată la toți pacienții
diagnosticați cu DZT1, o parte neprezentând markerii imunologici specifici procesului.
Predispoziția genetică joacă un rol extrem de important, deoarece în lipsa acesteia, stimulul
declanșator al fenomenelor autoimune nu ar determina efectul de distrugere celulară
pancreatică. Manifestările specifice DZT1 sunt evidente în momentul în care aproximativ 70-
80% din celule au fost distruse, procent la care cele rămase sunt insuficiente în a menține
homeostazia glucozei în parametrii normali. Rata de distrugere a celulelor variază individual, în
unele cazuri trecerea spre diabet fiind brutală, in timp ce în altele acesta se instalează lent, fiind
raportate situații în care la pacienți diagnosticați cu DZT1 au fost identificate celule de tip beta
cu activitate secretorie păstrată pentru o perioadă îndelungată de timp (obiectivare prin
nivelurile serice de peptip C). Evenimentele ce marchează trecerea propriu-zisă spre diabetul
clinic manifest sunt frecvent asociate unor perioade în care necesarul de insulină este crescut,
precum infecțiile sau instalarea pubertății. Caracteristic unor pacienți cu acest tip de diabet este
prezența la scurt timp de la instalarea simptomelor a unei perioade de minime modificări în
metabolismul glucidic, în cadrul căreia aceștia își pot controla cu ușurință nivelurile de glucoză,
necesitând cantități reduse de insulină, sau foarte rar, lipsa totală a terapiei. Această perioadă
este însă temporară, depleția depozitelor insulinice fiind etapa imediat următoare. (4)

Epidemiologie

Diabetul zaharat de tip 1 nu este specific unei anumite grupe de vârstă, putând să se instaleze
în orice perioadă a vieții, fiind mai frecvent înainte de 30 de ani. Aproximativ 5-10% din pacienții
ce dezvoltă patologia după această vârstă sunt diagnosticați cu tipul 1. Incidența acestei forme
de diabet crește anual cu aproximativ 3-4%, zonele cu cele mai multe cazuri raportate fiind
Europa de Nord si SUA, la polul opus fiind localizate statele din zona Oceanului Pacific. (4)

6
Rolul factorilor genetici

La baza susceptibilității genetice a pacienților de a dezvolta DZT1 stau multiple gene, cea mai
importantă dintre acestea fiind localizată la nivelul regiunii HLA (Antigen Leucocitar Uman) din
cadrul cromozomului 6. Regiunea respectivă prezintă diferite gene ce contribuie la definirea
Complexului Major de Histocompatibilitate, cu rol în inițierea răspunsului imun. Polimorfismele
genetice de la nivelul regiunii HLA sunt responsabile de aproximativ jumătate din riscul genetic
total de a dezvolta DZT1. Haplotipurile specifice în această patologie sunt HLA DR3 și/sau HLA
DR4, dar corelația între aceste entități predispozante de haplotip și apariția bolii este
considerată redusă. În schimb, s-a semnalat absența unor haplotipuri protective (ex. DQA1*
0102) la pacienții cu patologia respectivă. Alte regiuni ce contribuie la susceptibilitatea genetică
prin apariția polimorfismelor se regăsesc la nivelul genei CTLA-4, gena receptorului interleukinei
2 și regiunea promoter din cadrul genei insulinei. Riscul genetic de apariție al bolii la alți membrii
ai familiei este relativ mic, majoritatea pacienților neprezentând o rudă de gradul 1 cu patologia
respectivă. (4)

Fiziopatologie

Fig. 2 - Fiziopatologia diabetului zaharat tip 1: Secreție insuficientă de insulină

https://www.kindredhealthcare.com/resources (12)

Deși alte tipuri de celule de la nivelul pancreasului ( alpha - producătoare de glucagon, delta –
producătoare de somatostatină sau celulele PP ce secretă polipeptidul pancreatic ) sunt într-un
procent crescut similare din puncte de vedere funcțional sau embriologic cu celulele beta și

7
exprimă multe dintre aceleași proteine, acestea nu sunt afectate de procesul de distrucție
autoimun specific celor din urmă. Caracteristic insulelor pancreatice este prezența unui infiltrat
inflamator limfocitar moderat, entitate denumită insulită. După distrucția celulelor beta, se
observă regresia procesului respectiv, având loc instalarea atrofiei pancreatice progresive. În
urma efectuării unor studii asupra implicației autoimunității în DZ de tip I (atât pe animale cât și
umane), au fost identificate următoarele anomalii ale sistemului imun: Prezența anticorpilor
îndreptați împotriva insulelor pancreatice, cu activarea limfocitelor la nivelul acestora, precum și
în ganglionii limfatici peripancreatici și în cadrul circulației sistemice; proliferarea limfocitelor T
de la acest nivel în momentul stimulării prin proteine insulare specifice; eliberarea de citokine
care întrețin procesul inflamator (insulită). Celule beta sunt particular sensibile la efectul unor
anumite citokine, precum factorul de necroză tisulară alfa (TNF a), interferonul y și interleukina 1
(IL-1). Alte procese ce caracterizează afectarea celulelor beta sunt formarea metaboliților
oxidului nitric, apoptoza și toxicitatea datorată limfocitelor CD8, toate acestea fiind elemente
principale ce mediază distrucția insulară pancreatică. Tentativele de stopare a avansării
procesului autoimun au fost fără succes până în prezent. (4)

Moleculele considerate ținte ale autoimunității sunt insulina, decarboxilaza acidului glutamic (cu
rol în biosinteza neurotransmițătorului GABA - acidul gama-aminobutiric), ICA-512/IA-2
(autoantigen homolog cu tirozin fosfatazele de tip proteine receptor) precum și un transportor al
moleculei de zinc, ZnT-8. Acești autoantigeni nu au specificitate pentru celulele beta, existând
multiple teorii care explică modul în care are loc distrugerea selectivă a celulelor respective, cea
mai cunoscută fiind existența unei singure ținte moleculare inițiale a procesului autoimun, care
pe măsură ce se extinde la restul insulelor pancreatice va determina apariția unor autoantigeni
de ordin secund. (4, 5, 6).

Markeri Imunologici

Autoanticorpii orientați împotriva celulelor insulare pancreatice sunt compuși care pot fi utilizați
ca markeri ai evaluării procesului autoimun. Aceștia sunt de asemenea folosiți și pentru
stabilirea diagnosticului de DZT1 precum și pentru identificarea pacienților non-diabetici cu risc
în dezvoltarea patologiei respective. În ceea ce privește prezența autoanticorpilor în funcție de
tipul de diabet zaharat, aceștia sunt identificați la majoritatea pacienților cu DZT1 cu debut
recent (>85%), un procent redus la cei cu DZ T2 (5-10%) și ocazional la pacientele cu DZG
(<5%). În combinație cu testul pentru toleranță la glucoză (prin administrare de glucoză intra-

8
venos) aceștia au o capacitate de predicție de >50% a riscului instalării DZT1 în decurs de 5
ani. (4)

Factorii de mediu

Numeroși factori de mediu au fost luați în considerare în ceea ce privește posibilitatea

declanșării componentei autoimune, precum virusuri (Enterovirusuri, dar și virusul Coxsackie și
al rubeolei), proteinele din laptele bovinelor, derivații de nitrozuree și recent, microbiomul uman,
fără a fi stabilită o legătură certă între elemente, datorită faptului că expunerea poate precede
debutul DZ cu câțiva ani. (4)

Prevenția DZ T1

O serie de trialuri pe modele animale au avut succes în prevenirea instalării acestui tip de DZ,
dar cu lipsa apariției unui precedent favorabil pentru cazurile de pacienți umani. Un astfel de
trial, Diabetes Prevention Trial-Type 1, a subliniat faptul că administrarea insulinei (per os sau
IV) la pacienții cu risc crescut de dezvoltare a DZT1 nu a determinat stoparea instalării
patologiei. (4)

1.4. Diabetul Zaharat de Tip 2

Introducere

Entitate cu o prevalență mult mai mare decat cea a diabetului de tip 1, DZT2 are la bază două
procese primordiale în apariția sa: secreția anormală și rezistența celulară la insulină.
Majoritatea studiilor efectuate au demonstrat că rezistența la insulină precede etapa
modificărilor secretorii ale hormonului hipoglicemiant, dar acest tip de diabet zaharat începe să
se instaleze doar când această fază de secreție inadecvată este atinsă. DZT2 este o patologie
multifactorială, susceptibilitatea genetică fiind asociată cu factori de mediu precum nutriția,
activitatea fizică efectuată și gradul de țesut adipos prezent, un rol confirmat avându-l și
condițiile mediului intrauterin și greutatea la naștere (4)

9
Epidemiologie

DZT2 și starea predecesoare a acestuia, scăderea toleranței la glucoză (Prediabet), au o

incidență crescută în cadrul anumitor insule din Pacific (în contrast cu DZT1), dar și în Orientul
Mijlociu, India și SUA. În ceea ce privește grupurile etnice, debutul său a fost observat la o
vârstă mult mai înaintată la albii non-hispanici comparativ cu restul populațiilor (ex. amerindienii
sau locuitorii nativi din Alaska). Mai mult, în timp ce rezistența la insulină este mai pronunțată în
țările din Asia de Est, în partea de sud a continentului disfuncția celulelor beta este mai
frecventă. Popoarele din regiunile incriminate dezvoltă tipul 2 mai precoce și la un IMC (indice
de masă corporală) mai scăzut în raport cu pacienții din alte zone geografice. (4)

Rolul factorilor genetici

Componenta genetică joacă de asemenea un rol important în ceea ce privește fiziopatologia

DZT2. Riscul ca un pacient cu ambii părinți cu această patologie de a dezvolta tipul 2 este de
aproape 40%. În cazul gemenilor monozigoți, posibilitatea ca amândoi să dezvolte DZT2 este
cuprinsă între 70-90%. Rezistența la insulină (demonstrată prin reducerea utilizării acesteia la
nivelul musculaturii scheletale) este prezentă și la rudele de gradul întâi ale un pacient care a
dezvoltat patologia. Genele care determină predispoziția nu sunt complet cunoscute, fiind
identificate numeroase exemple care contribuie fiecare într-un procent redus la instalarea bolii
( peste 70, cea mai importantă fiind gena ce determină transcripția factorului 7-like, asociată
inclusiv cu alterarea toleranței la glucoză). În ceea ce privește polimorfismele genetice specifice
DZT2, acestea se regăsesc la nivelul unor gene ce codifică structuri de tipul calpainei 10,
canalelor de potasiu cu rectificare internă sau unor transportori ai moleculei de zinc. Deși s-au
efectuat numeroase cercetări asupra componentei genetice, nu este posibilă la momentul actual
predicția instalării DZT2. (4,19)

Fizipatologie

Procesele patologice caracteristice sunt secreția anormală de insulină, rezistența la insulină,

producerea excesivă de glucoză la nivelul ficatului și alterarea metabolismului lipidic.
Obezitatea, în special cea centrală sau viscerală, este prezentă la mai mult de 80% din pacienții
ce prezintă tipul 2 de diabet. Referitor la toleranța la glucoză, aceasta este normală sau aproape
normală în fazele incipiente, în contrast cu instalarea rezistenței celulare la insulină. Acest
mecanism compensatoriu este explicat prin creșterea sintezei de insulină, cu apariția
hiperinsulinemiei. Pe măsură ce rezistența la hormonul respectiv progresează, celulele nu vor

10
putea să mențină o perioadă îndelungată această stare, rezultatul acestui dezechilibru fiind
scăderea toleranței la glucoză, decelabilă prin creșterea nivelelor postprandiale ale moleculei.
Diabetul zaharat propriu zis se instalează în momentul în care reducerea progresivă a producției
de insulină se asociază cu secreția crescută de glucoză la nivel hepatic, etapa finală fiind
reprezentată de insuficiența celulelor beta datorită hiperfuncției prelungite.
 Fig.3 - Fiziopatologia tipului 2 de diabet zaharat: Insulinorezistenta

Insulin Resistance and Type 2 Diabetes,Roy Taylor,diabetesjournalsorg,2012(13).

La baza fenomenului de rezistență la insulină se regăsește acțiunea comună a factorilor

genetici alături de obezitatea caracteristică din DZT2 (fig. 3). Este alterată astfel utilizarea
glucozei de către țesuturile țintă (în special ficatul, musculatura scheletică și țesutul adipos). La
nivel muscular (țesut afectat înaintea ficatului), principala modificare se produce în cadrul
utilizării non-oxidative a glucozei, cu alterarea formării glicogenului și scăderii depozitelor
acestuia, fenomen observat și la nivel hepatic, unde gluconeogeneza accentuată, neinfluențată
de hiperinsulinemie, însoțește această anomalie. Caracteristic, se observă acumularea de lipide
la nivelul fibrelor musculare striate, cu afectarea fosforilării oxidative și producției de ATP,
procese ce se desfășoară la nivelul mitocondriilor. Decelabilă de asemenea la nivelul
musculaturii scheletice ( datorită oxidării anormale a acizilor grași ) este și formarea de specii
reactive de oxigen, precum peroxizii lipidici. (4)

11
Obezitatea din cadrul DZT2, de tip visceral sau central, este apreciată ca și o parte importantă a
întregului proces patologic. Țesutul adipos în exces determină creșterea acizilor grași liberi
circulanți și a altor produși ai adipocitelor, precum leptina, rezistina, IL-6, TNF-alfa sau proteina
4 de legare a retinolului. Anumite adipokine, pe lângă efectele specifice de modificare a greutății
corporale, a apetitului și a consumului general de energie, interferează cu homeostazia
insulinei, favorizând apariția rezistenței celulare la nivelul ficatului și musculaturii striate, precum
și disfuncții ale celulelor beta. Reducerea datorită obezității a nivelelor de adiponectină, care în
mod normal sensibilizează celulele la efectele insulinei, stimulează mai departe rezistența
hepatică la insulină. Efectele sunt vizibile și la nivelul țesutului adipos, fiind intensificată lipoliza
și, în urma acesteia, hepatocitele vor accentua sinteza de lipoproteine de tip VLDL, precum și
de trigliceride, instalându-se progresiv steatoza hepatică. Testele de laborator vor fi afectate, cu
scăderea HDL-ului, amplificarea valorilor LDL-ului și anomalii ale funcției hepatice. Adipokinele
sunt responsabile și de întreținerea unei stări inflamatorii continue, ceea ce explică creșterea
anumitor markeri inflamatori (ex, proteina C reactivă) în DZT2. (4)

În cadrul diabetului zaharat de tip 2, secreția de insulină este inițial amplificată, pentru a
contrabalansa rezistența celulară și a menține glicemia în limite normale. La început, afectarea
este minimă, dar pe măsură ce patologia avansează, funcționalitatea și numărul de celule
scade, fiind sub 50% în momentul debutului diabetului. Nu doar cantitatea, ci și calitatea
hormonului este incriminată, fiind observate nivele crescute de proinsulină în evoluția bolii. Pe
lângă insulină, și alți hormoni pancreatici pot fi parte a procesului fiziopatologic. Spre exemplu,
amilina, secretată de către aceleași celule, formează depozite de amiloid de tip fibrilar, ce se
găsesc la nivel celular la pacienții cu tipul 2. Afectarea homeostaziei glucozei amorsează un
mecanism vicios, în cadrul căruia hiperglicemia cronică determină scăderea capacității secretorii
a insulelor pancreatice (toxicitate glicemică), efect dovedit a fi întreținut și de acizii grași liberi în
exces (lipotoxicitate). (4)

Prevenția DZ T2

Datorită entității ce precede DZT2, și anume scăderea toleranței la glucoză, o serie de

modificări ale stilului de viață, axate pe redresarea obiceiurilor alimentare și introducerea
activității fizice în rutina personală, pot amâna sau chiar preveni debutul patologiei. Un studiu
derulat de către Programul de Prevenire al Diabetului (PPD) asupra un anumit număr de
pacienți, împărțiți în 2 grupuri, pentru care vârsta, sexul sau etnicitatea nu au reprezentat factori
de selecție, a relevat o reducere a instalării DZT2 cu 58%, în cadrul grupului care a implementat

12
modificările respective ale modului de viață, comparativ cu grupul placebo. Tot în cadrul
aceluiași studiu, administrarea de metformin a amânat/prevenit cu doar 31% debutul diabetului
zaharat tip 2, de asemenea în comparație cu placebo. În ceea ce privește prevenția
farmacologică, există anumite controverse, singurul preparat considerat util fiind metforminul,
pentru o categorie restrânsă de pacienți (stadiu de prediabet cu risc crescut de progresie spre
DZT2, IMC >35, vârsta sub 60 de ani, cu istoric familial al patologiei la rudele de gradul I,
precum și pentru gravidele cu diabet gestațional). (4)
1.5. Diabetul Gestațional

Diabetul gestațional reprezintă consecința intoleranței celulare la glucoză ce se instalează în

ultimul trimestru de sarcină. Majoritatea pacientelor revin la nivelurile normale de glucoză în
urma nașterii, dar prezintă un risc suplimentar de a dezvolta diabet zaharat de tip 2 în următorii
10-20 de ani. Datorită incidenței tot mai mari a obezității de la an la an, și incidența diabetului
gestațional este în creștere la nivel mondial. (4).

1.6 Tipuri specifice de diabet

Există o serie de etiologii specifice de diabet, cu determinism monogenic. Una dintre cele mai
reprezentative patologii ale acestui grup este diabetul MODY (Maturity Onset Diabetes of the
Young), a cărui cauză este reprezentată de modificări ale unor factori de transcripție implicați în
dezvoltarea celulelor pancreatice, unele forme având punct de plecare mutații genice cu
codificare la nivelul altor organe (ex. formele MODY 1 și MODY 3, datorate disfuncțiilor unor
factori de transcripție nucleari hepatocitari). Majoritatea formelor au o transmitere autozomal
dominanată. Datorită prezenței de mutații și în cadrul glucokinazei, metabolismul glicemiei
suferă o serie de modificări, ce duc la creșterea cantității de glucoză necesare pentru a stimula
secreția insulinei. Asocierea diabetului MODY cu DZ tipul 2 este rară, fiind observată la mai
puțin de 5% din totalul cazurilor.

O altă formă monogenică este diabetul neonatal (DN) tranzitoriu, cu debut sub 12 luni. Acesta
poate îmbrăca însă două forme, cea de a doua fiind permanentă, cu un determinism multigenic,
genele țintă fiind cele ce codifică insulina și anumite subunități ale canalelor de potasiu ATP
sensibile. Forma permanentă este asemănătoare cu DZT1, este tratată cu insulină și deseori
implică afectare neurologică. O formă specială de DN cu severitate crescută este rezultatul unor
mutații homozigote ale glucokinazei.

13
Anumite defecte genetice în acțiunea insulinei determină o serie de sindroame specifice,
considerate ca forme speciale de DZ: Sindroamele de rezistență la insulină (A și B),
lipodistrofia, sindromul Donohue (numit și leprechaunism) sau sindromul Rabson-Mendenhall
(ultimele două fiind datorate unor anomalii ale receptorilor insulinei). (4, 8, 9)

2. Stresul Oxidativ
2.1. Introducere

Stresul oxidativ reprezintă rezultatul unui dezechilibru produs între echipamentul antioxidant al
organismului (enzime, vitamine, proteine etc.) și factori pro-oxidanți (ex. radiații UV, alcoolul,
substanțele din compoziția fumului de țigară etc.) care acționează asupra acestuia. Termenul de
antioxidant se referă la o serie de compuși specifici ce întârzie sau inhibă semnificativ oxidarea
unui anumit substrat. Organismul are o serie de sisteme de apărare antioxidante eficiente
pentru a reduce concentrația de radicali liberi prezenți, dar natura acestora diferă în funcție de
tipul de celule, țesuturi, localizarea în mediul intracelular sau extracelular sau după activitatea
lor specifică. (11, 13, 15)

Oxigenul, care a apărut pentru prima dată în urmă cu trei miliarde de ani în atmosfera
Pământului, este o moleculă esențială pentru viață. Prin mecanismele redox, oxigenul,
acceptorul final al electronilor, este transformat de lanțul respirator mitocondrial în molecule de
apă. Această reacție reprezintă o sursă de energie prin producția de ATP (Adenozin trifosfat) și,
de asemenea, formarea de 2% până la 3% din speciile reactive de oxigen (SRO), molecule
deosebit de instabile. Astăzi, multiple studii epidemiologice și clinice sugerează puternic
implicarea speciilor reactive de oxigen în geneza și evoluția bolilor cronice, inclusiv în cea a
diabetului zaharat și a complicațiilor sale. (16-20)

În 1954, Gerschman a publicat teoria toxicității oxigenului, datorată formelor parțial reduse ale
moleculei, iar după doi ani Harman propune conceptul de implicare al radicalilor liberi în
procesul de îmbătrânire. În 1969, McCord și Fridovich au descoperit enzima superoxid
dismutază (SOD) oferind dovezi convingătoare despre importanța radicalilor liberi în diverse
patologii. Strict, conceptul de antioxidant este raportat pentru prima dată de Dufraisse și
Moureu, în anii 1920, aceștia descoperind inhibarea polimerizării acroleinei de către

14
hidrochinonă, în cadrul unui mecanism dependent de oxigen. Denumit inițial „antioxigen”,
termenul respectiv a fost înlocuit cu cel anglo-saxon „antioxidant”, preferat față de precedentul.
Numeroase studii sunt în prezent orientate asupra echilibrului delicat în care se regăsesc
radicalii liberi, asigurat de reglarea redox, cu menținerea homeostaziei organismelor vii. (16-20)
 Fig. 4 Balanța antioxidanți-oxidanți (16)

Pe lângă oxidările fiziologice, multiple procese din mediu pot induce formarea radicalilor liberi:
poluanți ai aerului, fumul de țigară, radiațiile UV sau stilul de viață specific țărilor industrializate.
Diferite enzime endogene pot forma de asemenea radicali liberi, la concentrații fiziologice:
NADPH oxidazele, xantin oxidaza, ciclooxigenazele (COXs), lipooxigenazele (LPOs), nitricoxid
sintetazele (NOS), citocromul P450, precum și lanțul respirator mitocondrial. Radicali liberi
includ specii reactive de azot (SRN) și specii reactive de oxigen (SRO). Cel mai important
reprezentant este anionul superoxid (O2.−), care este rapid dezmutat în oxigen și peroxid de
hidrogen (H2O2), prin intermediul superoxid dismutazei (SOD). Catalaza (CAT) transformă
H2O2-ul în apă și oxigen, iar glutation peroxidaza (GPx) reduce atât H2O2 cât și hidroperoxizii
organici (ROOH). Cu toate acestea, în prezența metalelor de tranziție, cum ar fi fierul sau
cuprul, O2 și H2O2 formează radicalul hidroxil (OH) prin reacțiile Fenton și Haber-Weiss, iar prin
ionii de clorură și H2O2, mieloperoxidaza produce acid hipocloros (HOCl). Monoxidul de

15
azot (NO) rezultă din oxigen prin diferite sintetaze ale oxidului nitric (SNO), iar prin reacția cu
anionul superoxid determină un compus numit peroxinitrit (ONOO-), SRN cu un puternic efect
oxidant. Nici un proces enzimatic nu poate degrada peroxinitritul, deși în prezența CO2 acesta
formează anionul nitrat (NO3- ) și dioxidul de azot (NO2). (21-25)

2.2 Asocieri între stresul oxidativ, diabetul zaharat și procesul inflamator

Implicații enzimatice
În diabet, modificarea primelor situri din membrana mitocondrială duce la activarea complexului
II (reductaza succinat-coenzima Q, complex enzimatic cu potențial oxidativ crescut), ce
contribuie la formarea de O2 excesiv prin pierderea electronilor. Oxidazele NADPH (parte a
familiei de enzime Nox) sunt implicate în fiziopatologia diferitelor boli, reprezentând sursa
principală a producției induse de glucoză de SRO, confirmând aceaste enzime ca mediatori ai
complicațiilor diabetice. Recent, Brandes și colab. au descris mecanisme moleculare de activare
a oxizdazelor Nox și au susținut implicațiile lor în apariția hiperglicemiei și a hiperinsulinemiei.
Xantin oxidaza este o altă enzimă implicată în fiziopatologia DZ și a complicațiilor vasculare,
fapt demonstrat prin tratamentul cu Allopurinol, inhibitor al XO, medicament ce reduce nivelul
lipidelor oxidate din plasmă și îmbunătățește fluxul sanguin la pacienții cu DZT2. De asemenea,
glucoza în sine (precum și metaboliții săi), în prezența ionilor de fier și cupru, reacționează cu
peroxidul de hidrogen pentru a forma radicalul hidroxil în timpul autooxidării, proces descris de
catre Wolff și Dean în 1987. (23-25)

Stresul oxidativ este astfel un dezechilibru care favorizează prooxidanţii / defavorizează

antioxidanţii, amorsând un potențial efect distructiv (conform lui H. Sies). Un posibil mecanism
de acţiune patogenetică în cadrul diabetului zaharat este reprezentat de formarea radicalilor
liberi în celule ( prin reacţiile Fenton – Haber-Weiss), care întreţin astfel stresul oxidativ.
Radicalii liberi ar interveni în dereglarea mecanismelor celulare prin distrugerea unor
macromolecule precum ADN-ul, anumite proteine dar şi membrana celulară. Anumite modificări
specifice DZ activează ioni metalici, precum Fe2+, parte a celor două reacții incriminate (Fe
poate fi transformat şi pe calea altor reductanţi, ca GSH, ascorbatul, hidrochinonele).

Fenton O2.- + Fe3+ O2 + Fe2+

H2O2 + Fe2+ OH- + .OH + Fe3+

Haber-Weiss O2.- + H2O2 OH- + O2 + .OH

16
În mod fiziologic, aceste transformări sunt limitate de enzime de epurare ale SRO. precum
superoxid dismutaza, catalaza și glutationperoxidaza sau de către substanţe antioxidante non
enzimatice (glutation, chelatori de fier, vitamina E, vitamina C, ceruloplasmina). (26-28)

Implicații în dezvoltarea complicațiilor DZ

Este cunoscută astfel influența stresului oxidativ în ceea ce privește dezvoltarea complicațiilor
diabetului la nivelul anumitor structuri ale organismului. Producerea de peroxid de hidrogen de
către celulele mesangiale și procesul de peroxidare lipidică, precum și activarea protein kinazei
C (PKC) și a protein kinazei mitogen activate (MAP) duc la apariția de leziuni la nivel renal.
Acumularea de produși finali de glicare avansată (AGE - asociați cu apariția stresului oxidativ) și
activarea factorului transcripțional NF – kB, în retină și la nivel microvascular, determină
asocierea cu retinopatia diabetică, precum și cu apariția cataractei. AGE-urile inhibă de
asemenea regenerarea axonală, determină creșterea ratei leziunilor ADN-ului și stimulează
activarea căilor PKC, NF – kB și a TGF (factorul de creștere transformat), cu implicații în
neuropatia diabetică. Hemoglobina glicozilată HbA1c, un biomarker al expunerii glicemice
generale, este cel mai cunoscut parametru în legătură cu stresul oxidativ (rezultat în urma
glicării hemoglobinei). Creșterea variabilității Hb1Ac indică riscul crescut de complicații
microvasculare în DZT1 și riscul de nefropatie și boli cardiovasculare în DZT2. (26-28)

În afara stresului oxidativ, inflamația se evidențiază ca un proces determinant în dezvoltarea

complicațiilor diabetice. Este dificil de înțeles impactul acestor factori unul fără celălalt, deoarece
există numeroase interpuneri între inflamație și stresul oxidativ și invers. Numeroase studii au
expus prezența stresului oxidativ cronic la pacienții cu diabet zaharat, în special datorită
hiperglicemiei prelungite. Hiperglicemia determină o creștere a nivelului proteinelor pro
inflamatorii și a citokinelor secretate de macrofage (IL-6, IL-8, MCP-1), generând astfel
inflamație atât locală cât și sistemică. Producția crescută de TNF-alfa este asociată pe scară
largă cu rezistența la insulină, obezitate și reactivitatea vasculară anormală. [2, 25-26, 28-31].

Abilitatea antioxidanţilor de a proteja ADN-ul uman de distrugerea oxidativă are implicaţii și

pentru unele tipuri de cancer, (ex. Leucemia) considerând că distrugerea ADN-ului prin efectele
radicalilor liberi este procesul iniţial în majoritatea cancerelor umane. În afara patologiei
oncologice, distrucția produsă prin SRO la nivelul SNC este o altă componentă semnificativă a
afectării stării de sănătate şi a apariţiei unei varietăţi de boli cronice, degenerative, imune etc. În

17
modele experimentale pe animale ale acestor condiţii patologice, scavengerii (substanţe cu
potenţial antioxidant) s-au dovedit a fi foarte eficace în încetinirea evoluţiei şi reducerea
severităţii acestora. (31-33)

Rolul stresului oxidativ în ateroscleroză

Stresul oxidativ (SO) este considerat în prezent un inițiator și un promotor al lezării celulei
endoteliale. Radicalii liberi implicați în acest proces au o importanță majoră în oxidarea
lipoproteinelor și în placa aterosclerotică. Celule endoteliale, celule musculare netede si
macrofagele sunt surse de radicali liberi și participă la procesul aterogen. Endoteliul vascular
este bogat in xantină (o sursă importantă de anion superoxid fiind generată prin metabolizarea
xantinei sub acțiunea xantin oxidazei).
 Fig.5. Rolul endoteliului în homeostazia vasculară (32).

Într-o arteră sănătoasă, factorii vasodilatatori cum ar fi oxidul nitric (NO), factorul hiperpolarizant derivat de
endoteliu (FHDE) și prostaciclina (PGI2) joacă un rol cheie în homeostazie. Într-o arteră afectată, ei scad în
favoarea unor compuși precum factorul de contractare derivat din endoteliu (FCDE), prostaglandina (PGH2),
endotelina-1 (ET-1) și tromboxanul A2 (TXA2) în prezența stresului oxidativ și a anionilor superoxid (O2.).
AA: acid arahidonic, eSNO: sintetaza oxidului nitric endotelială, sGC: guanil ciclaza solubilă; AC: adenilat
ciclază; K+: potasiu.

Activarea lanțului metabolic al acidului arahidonic în prezența SO și a anionului superoxid

contribuie la disfuncția endoteliului lezat (Fig. 5). Factorii de risc pentru ateroscleroză
(hiperlipoproteinemia, hipertensiunea arterială, fumatul, diabetul zaharat, obezitatea)
favorizează constituirea unei zone de stres la nivelul endoteliului. Atât hiperlipemia, cât și

18
hipertensiunea arterială au efecte aditive, agravând aterosleroza prin alterarea statusului redox
din peretele vascular (27, 31-34).

Leziunea aterosclerotică este dependentă de interacțiunea dintre celulele endoteliale și LDL

(lipoproteinele cu densitate joasă din circulație). Oxidarea LDL este o reacție guvernată de
radicali liberi cu o înaltă toxicitate. Produșii citotoxici rezultați prin peroxidarea lipidelor
reprezintă un factor iritativ constant pentru endoteliu și contribuie la dezvoltarea unei cascade
de evenimente ce determină lezarea endoteliului, agregarea trombocitelor, eliberarea factorilor
de creștere stimulatori ai proliferarii celulelor musculare netede, acumularea celulelor
inflamatorii și dezechilibre ale metabolismului eicosanoizilor. Produșii finali ai peroxidării lipidelor
sunt aldehide citotoxice, hidrocarburi gazoase precum și malondialdehida. Unele aldehide
rezultate din peroxidare declanșează eliberarea de IL-1. Produșii de degradare pot difuza de la
locul de formare si pot determina apariția edemului celular, creșterea permeabilității vasculare și
eliberarea de factori chemotactici pentru polimorfonucleare. De asemenea, alterează activitatea
fosfolipazei A2, favorizând cascadei acidului arachidonic, cu formarea consecutivă de
prostaglandină si endoperoxizi (33-36)
Astfel, stresul oxidativ, inflamația și alterarea metabolismului lipidic interacționează complex în
procesul de aterogeneză, cu efecte agravante în diabetul zaharat (Fig. 6).

Fig.6. O schemă
simplificată a conexiunilor fiziopatologice dintre diabetului zaharat și ateroscleroză (36).
Dislipidemia, hiperglicemia și rezistența la insulină au ca rezultat un spectru de modificări fiziopatologice,
precum formarea lipoproteinelor cu densitate joasă (LDL), a produșilor finali de glicare avansată (PGA) și
activarea semnalizării proinflamatorii, ce afectează diferite tipuri de celule din peretele arterial, cu dezvoltarea
leziunii aterosclerotice.

19
2.3 Apărarea antioxidantă

Prima linie de apărare împotriva radicalilor liberi grupează sistemele enzimatice ale superoxid
dismutazei (SOD), catalazei (CAT) și cel al glutation peroxidazei (GPx) (Fig. 7), alături de
micronutrienți de tipul cuprului, zincului sau seleniului, cu rol de cofactori. Sunt trei izoforme
pentru SOD descrise la mamifere: 1) SOD-ul de mangan (MnSOD), localizată în mitocondrii, 2)
SOD-ul de cupru (Cu) și zinc (Zn), forma intracelulară, în citoplasmă și mitocondrii, dar și forma
extracelulară, care este localizată în spațiile interstițiale ale țesuturilor și în fluidele extracelulare,
repreztând majoritatea activității SOD în plasmă, limfă și lichid sinovial și 3) SOD-ul de fier (Fe).
GPx este prezentă în lichidul extracelular (plasmă), în citoplasmă și pe membranele celulelor,
formând un cuplu cu glutation reductaza (GR), furnizând astfel glutationul (GSH). CAT este
prezentă în esență în peroxizomi și în eritrocite. [37-39]
A doua linie de apărare implică antioxidanți non-enzimatici, precum nutrienții naturali, asigurați
de hrană, cu efecte de spălare (captarea electronilor liberi și formarea de entități stabile), efecte
stimulatoare asupra enzimelor antioxidante endogene sau ambele tipuri. Principalele molecule
sunt GSH-ul, vitamina E (forma cea mai activă fiind α-tocoferolul), vitamina C (acidul L
ascorbic), vitamina A (carotenoizi), dar și acizii grași polinesaturați sau flavonoizii exogeni
(quercetină, rutină, resveratrol etc.), care pot întări apărarea antioxidantă a organismului. Un
exemplu notabil este efectul protectiv al concentrației crescute de GSH împotriva dezvoltării
complicațiilor diabetice sau unor tipuri de malignități. Celulele beta ale pancreasului sunt
deosebit de sensibile la SRO, deoarece au o concentrație scăzută a enzimelor antioxidante
precum CAT, SOD și GPx, și un nivel mai scăzut de GSH. Echilibrul dintre radicalii liberi și
sistemele de apărare ale antioxidanților este crucial pentru menținerea homeostaziei; dacă
echilibrul este rupt în favoarea entităților prooxidante, apare stresul oxidativ patologic. (22, 40-
41)

20

Fig.7. - Apărarea antioxidantă - complicații. PGA: produși finali de glicare avansată; COX: ciclooxigenaza;
H2O2: peroxid de hidrogen; LOX: lipoxigenaza; NO: oxid nitric; SON: Sintetaza oxidului nitric; Oxidaza NADPH:
nicotinamidă adenină dinucleotid oxidază; MDA: malondialdehidă (lipoperoxidare); SOD: superoxida
dismutaza; GPx: glutationperoxidază; GSH: Glutation; O2.-: anion superoxid; ONOO.- : peroxinitrit; OH.- :
radical hidroxil; 8-OHdG: 8-hidroxi-2-deoxiguanozină (distrucții ale ADN).
2.4 Dualitatea radicalilor liberi

ROS și RNS (speciile reactive de oxigen / nitrogen) sunt recunoscute pentru rolul lor dublu,
având unele implicații pozitive pentru sistemele vii. Un fapt cunoscut este capacitatea celulelor
de a genera endogen și constitutiv specii reactive de oxigen.

Roluri fiziologice

În condițiile homeostaziei organismului, efectele benefice ale radicalilor liberi apar la concentrații
mici sau moderate și implică roluri precum reglarea semnalelor celulare implicate în proliferarea
și aderența celulară, apoptoză, răspunsul inflamator precum și reglarea anumitor factori de
transcripție. Speciile reactive de oxigen, în concentrație scăzută, sunt generate atunci când
celulele sunt stimulate de diverse citokine, factori de creștere sau hormoni. SRO pot avea astfel
un rol de mesageri secundari, asemănător căii protein kinazei mitogen activată (MAPK).
Aceasta implică activarea factorilor de transcripție nucleară și controlul expresiei genelor
protectoare care asigură repararea ADN-ului deteriorat, intensificarea funcțiilor sistemului
imunitar, stoparea proliferării celulelor lezate, inducerea apoptozei sau roluri în adeziunea
celulară. Într-un mediu inflamator, neutrofilele activate și macrofagele produc o cantitate mare
de SRO prin NADPH oxidaze și mieloperoxidază. Această „explozie oxidativă” joacă un rol

21
cheie în apărarea împotriva agenților patogeni din mediu. Prin urmare, nivelurile moderate ale
SRO joacă roluri importante în reglarea autofagiei și apoptozei, controlând astfel supraviețuirea
celulară. SRO generate în timpul precondiționării ischemice (alternarea unor perioade scurte de
ischemie și reperfuzie) conferă protecție cardiacă prin reducerea necrozei miocardice și
severității aritmiilor, îmbunătățind recuperarea funcțională atunci când există riscul unei
perioade mai lungi de ischemie. Acest mecanism este foarte complex și implică diferite
molecule declanșatoare, mediatori și mai multe căi ale mesagerilor secundari, fiind un proces de
adaptare fiziologic înnăscut împotriva afectării ischemice potențial letale .Oxidul nitric (NO)
stimulează guanil ciclaza solubilă, ceea ce duce la relaxarea mușchiului neted vascular și
inducerea relaxării endoteliului ( descoperit în 1980 de Furchgott și Zawadzki). SRO joacă de
asemenea un rol important în activarea mecanotransducției la nivelul musculaturii scheletale cât
și în contracția și relaxarea cardiacă. SRO intervin în calea de semnalizare a insulinei, cu
legarea moleculelor acestora de hormonul hipoglicemiant ( H2O2 induce tipic efecte metabolice
ale insulinei, precum creșterea absorbției de glucoză în adipocite și mușchi, este implicată în
modularea funcției endoteliale vasculare, stimulează translocarea GLUT4 și sinteza lipidelor la
nivelul adipocitelor). Cu toate acestea, nivelurile SRO sunt determinanți majori ai echilibrului în
ceea ce privește sensibilitatea la insulină, datorită intensificării semnalizării căii intracelulare
PI3K / Akt / mTOR. [19, 21, 22, 41, 42, 44-47]

Roluri patologice

Cu siguranță necesară în multiple procese fiziologice, producția excesivă de SRO determină

deteriorarea diferiților compuși biologici (oxidarea ADN, proteine, lipide și carbohidrați) prin
leziuni produse direct, precum și leziuni secundare datorate caracterului citotoxic și mutagen al
metaboliților eliberați, în special în timpul oxidării lipidelor. De asemenea, organismul poate
reacționa împotriva acestor compuși anormali prin producerea de autoanticorpi, care pot fi astfel
responsabili de a treia modalitate de afectare.

22

Fig. 6. Impactul ROS asupra ADN-ului, proteinelor, lipidelor, glucozei și vaselor sanguine.

ADN-ul fiind molecula în cadrul căreia se regăsește memoria tuturor compozițiilor vii biochimice,
este foarte sensibil la agresiunea radicalilor liberi, putând fi astfel generate cel puțin cinci clase
principale de daune oxidative mediate de către radicalul hidroxil (OH). Leziunile sunt
reprezentate de producția de baze oxidate, situri abazice, aducții intra-catenare, rupturi catenare
și formarea de punți ADN-proteine. În plus, anumite specii de SRN, cum ar fi peroxinitriții și
oxidul nitric, sunt și ele implicate în afectarea ADN-ului. Cea mai intens studiată leziune ADN
este formarea de 8-OH-G (8-hidroxiguanozina), aceste modificări fiind printre primele etape ale
carcinogenezei (nefiind o coincidență caracterul agenților cancerigeni de generatori potenți de
radicali liberi - radiații UV și ionizante, fumul de țigară, alcoolul, fibre de azbest, metale
cancerigene, hidrocarburi policiclice etc.) (Fig. 6). (48)
Compușii carbonreactivi (CCR), cum ar fi malondialdehida (MDA) și 4-hidroxinonenalul (2-
HNE), sunt formați endogen în timpul peroxidării lipidelor și glicoxidării carbohidraților. Aceștia
reacționează cu proteinele celulare pentru a forma PPLA (produși de peroxidare avansată ai
lipidelor) și PGA (produși de glicare avansată), care induc disfuncții proteice (pierderea
activității, sensibilitate crescută la proteaze) și deteriorarea răspunsurilor celulare - în special în

23
procesele inflamatorii și apoptoză. Lipidele, în principal acizii grași polinesaturați, sunt ținta
principală a agresiunii OH, formând radicalul dien conjugat.
Derivații respectivi sunt adesea hidrofobi și vor duce la apariția unor grupuri de celule
endoteliale grevate de multiple anormalități. Astfel, CCR, MDA, 4-HNE sau LDL oxidate au fost
găsiți în cantități crescute în cadrul fiziopatologiei carcinogenezei în diferite afecțiuni
cardiovasculare, cum ar fi ateroscleroza, sindromul metabolic, diabetul și complicațiile sale,
obezitatea și rezistența la insulină și în boli inflamatorii cronice, precum lupusul eritematos
sistemic, astmul bronșic, anumite afecțiuni inflamatorii cronice ale plămânilor și alergii
respiratorii, dar și în patologii degenerative (21, 49-51).

2.5 Sisteme de apărare împotriva radicalilor liberi

2.5.1 Sisteme de apărare enzimatice

Numeroase mecanisme de apărare celulară împotriva speciilor reactive au fost identificate până
în prezent. Ca și primă categorie regăsim enzimele antioxidante: superoxid dismutazele (tipurile
1, 2 şi 3), catalaza, lactoperoxidaza, glutation peroxidaza dar şi peroxiredoxina. Acestora li se
adaugă un număr mic de molecule antioxidante: acidul ascorbic (vitamina C), tocoferolul
(vitamina E), acidul uric, bilirubina sau glutationul. Dintre ele, glutationul este elementul cel mai
activ şi important, fiind regenerat de glutation reductază şi NADPH. De asemenea, glutationul
poate fi regenerat şi de către acidul lipoic. Când sistemele endogene ale antioxidanţilor eşuează
în restabilirea balanţei redox, are loc scăderea nivelurilor de glutation, cu instalarea stresul
oxidativ. Acidul uric, un antioxidant adesea trecut cu vederea, reprezintă un mijloc semnificativ
de apărare faţă de reacţiile de nitrozare date de peroxinitriți în procesul de hipoxie miocardică.
Nivelul de acid uric seric este și un marker semnificativ al stresului oxidativ.
Sistemul de apărare antioxidantă al organismului cuprinde astfel toate aceste substanțe ce
neutralizează efectele negative ale radicalilor liberi. Elementele conținute sunt la fel de diverse
precum radicalii liberi, această varietate de compuși existând special pentru epurarea
numeroaselor specii radicalice și asigurarea unei protecții cât mai variate. Cu toate progresele
considerabile realizate în observarea şi întelegerea modului în care acționează unele enzime şi
unii componenţi ai apărării antioxidante, complexitatea antioxidanţilor intracelulari face însă
imposibilă explicarea întregului proces de apărare în prezent. (14, 37-39)

24

Fig. nr. 7 Reţeaua de antioxidanţi: SOD= superoxid dismutază; CAT= catalază; GPx= glutation
peroxidază; GR= Glutation reductază; L-Arg= L arginină; L-Cit= L Citrulină; ONOOˉ= peroxinitrit; NO= Oxid
nitric; O2= superoxid; H2O2= Peroxid de hidrogen. (52)

Superoxid dismutaza (SOD)

Superoxid dismutaza amplifică de aproximativ 1000 de ori, prin funcția sa, viteza de dismutare a
superoxidului în peroxid de hidrogen, împiedicând creerea radicalului HO ￣ . Enzima este
localizată în toate celulele ce îndeplinesc condițiile de aerobioză, dar şi în bacteriile anaerobe
sau facultativ aerobe. Iniţial interpretată ca și o formă de depozitare a cuprului (datorită
metalului din situsul catalitic), ulterior, pe baza aceluiași considerent, s-au identificat 3 forme
diferite ale enzimei:

 Fe 2+ –– SOD, caracteristică bacteriilor anaerobe.

 Mn 2+ –– SOD, evidenţiată în mitocondrii.
 Cu 2+, Zn 2+ –– SOD, prezentă în citoplasma celulelor eucariote. (În structura acestei
izoforme, cuprul are rol în cataliza propriu zisă iar zincul în stabilitatea centrului catalitic)

25
Rolul SOD este astfel catalizarea reacţiei de dismutare a anionului superoxid, rezultând
următorii produși de reacție:

 O2•￣ ￣ + O2•￣ ￣ + 2H + O2 + H2O2

Alte funcții ale superoxid dismutazei constau în inhibarea producerii de oxigen singlet, precum şi
a procesului de peroxidare al acizilor graşi polinesaturaţi. Sinteza SOD este reglată în raport cu
anumiți factori, fiind favorizată de concentrația crescută a O2 și represată de excesul ionilor de
Fe. Exceptând rolul enzimei de marker al procesului oxidativ, SOD este în prezent testată și ca
un potenţial agent terapeutic în anumite disfuncții în care stresul oxidativ are o implicație
binestabilită, precum diabetul zaharat, diverse neoplazii, poliartrita reumatoidă, cataracta sau
afecțiuni ischemice.

Glutation peroxidaza (GPx)

Enzima asigură catalizarea degradării hidroxiperoxizilor organici rezultaţi din procesele

metabolice fiziologice, asigurând şi protecţia proteinelor, lipidelor şi acizilor nucleici faţă de
efectele moleculelor oxidante, utilizând ca donator de electroni glutationul sau, în diferite cazuri,
glutaredoxina sau tioredoxina. Glutation peroxidaza este selenium dependentă (atomii de
seleniu de la nivelul situsului activ participînd direct la procesul de reducere a peroxidului), cu
localizare în citosol (în proporție de 70%) şi în mitocondrii (în procent de 30%). GPx este vitală
pentru funcția antioxidantă, în special în cadrul mitocondriilor, datorită absenței catalazei din
cadrul echipamentului enzimatic al acestora. Odată cu îmbătrânirea, dar şi într-o varietate de
afecțiuni precum diabetul zaharat, neoplaziile sau bolile cardiovasculare, nivelele normale de
GPx sunt afectate, cu dereglarea activității enzimei. De asemenea, deficitul de seleniu,
indiferent daca este neînsemnat sau sever, reprezintă o cauza importantă de afectare a funcției
enzimatice.

Glutation peroxidaza catalizează următoarele reacții :

GPx
1) 2GSH + H2O2 → GSSS + 2H2O

2) R-OOH + 2 GSH → R-OH +GSSG + H2O

26
R-OOH = H2O2 sau orice tip de peroxid care rezultă din metabolismul acizilor nucleici, acizilor
graşi polinesaturaţi sau al steroizilor.

Particularitățile GPx în raport cu alte sisteme antioxidante :

 Foloseşte ca și substrat secundar glutationul redus, cel mai mobil compus tiolic, regenerat
facil prin calea pentozo-fosfaților.
 Combină capacităţile antioxidante ale tiolului şi seleniului.
 Descompune peroxidul de hidrogen mai eficient decât catalaza.
 Poate detoxifica orice tip de peroxid de la nivelul mediilor biologice (GPx este o enzimă
care are un potenţial antioxidant mai mare datorită specificităţii înalte de substrat) 
Determină inhibarea lipooxigenazei
 Alături de glutation reductază contribuie la refacerea nivelelor de glutation redus. [6]

Catalaza

Funcția majoră a catalazei constă în conversia peroxidului de hidrogen (descompunerea H2O2

în H2O), utilizându-l de asemenea și pentru oxidarea unor substanțe nocive precum alcoolii,
fenolii, acidul formic sau formaldehida sau alcooli. Enzima este localizată aproape exclusiv în
peroxizomii celulelor, dar și în microzomi și citosol (activitate redusă), nivele crescute fiind
întâlnite în organe precum ficatul și rinichii, dar şi în hematii. Procesul de cataliză este realizat
de fiecare dată când enzima interacționează cu o moleculă de sulf.
Reacția de descompunere a peroxidului de hidrogen :

H2O2 + H2O → O2 +2 H2O

Peroxidul de hidrogen este recunoscut pentru rolul său de oxidant nucleofilic foarte puternic.
Este implicat în inhibarea enzimelor din ciclul Calvin, iar toxicitatea sa este potențată în
prezenţa metalelor de tranziţie (de aproximativ 1000 de ori). Prin prisma acestor caracteristici
ale H2O2, funcțiile catalazei (și ale GPx) sunt vitale pentru funcționarea unui sistem viu.

27
2.5.2 Sisteme de apărare non-enzimatice

Glutationul (GSH)

Polipeptid cu funcţie de coenzimă, glutationul este sintetizat la nivel hepatic din 3 aminoacizi :
glutamină, glicină și cisteină. Organele unde se găsesc concentrații crescute ale enzimei sunt
ficatul (depozitul principal), rinichii, pancreasul, splina și corneea. O serie de molecule contribuie
la menținerea constantă a nivelului celular de glutation, precum seleniul, acidul alfa lipoic sau
vitaminele B2, B6 și C. La rândul său, GSH este răspunzător de asigurarea rolurilor normale ale
vitaminelor C, E şi ale coenzimei Q10 (prin concentrația sa optimă). Forma cea mai activă a
GSH este glutationul redus.

2GSH + H2O2 → GS−SG +2 H2O2

Principalele roluri ale glutationului :

 Antioxidant, fiind unul din cei mai importanți astfel de reprezentanți ai organismului uman,
deficitul de glutation și stresul oxidativ consecutiv fiind implicate în fiziopatologia
proceslor tumorale, a unor importante patologii respiratorii (astm bronșic, BPOC, fibroză
chistică), și a unor afecțiuni neurologice degenerative (boala Parkinson, demența
Alzheimer) și psihice (schizofrenie, ADHD, autism).
 Antitumoral, fiind implicat în scăderea incidenței mutaţiilor ADN-ului determinate de diferiți
agenți cancerigeni.
 De epurare din organism a metalelor grele, a fumului de tigară și a componentelor
acestuia, pesticidelor, coloranţilor alimentari și a concentrațiilor de medicamente în
 exces, modificând și absorbția acestora cu favorizarea eliminării. (41, 46)

Vitamina C (acidul ascorbic)

Sinteza vitaminei C este reprezentativă pentru majoritatea sistemelor vii, de la organisme

unicelulare la cel uman. Efectul antioxidant al vitaminei C are la bază reacția compusului cu
diferiți radicali liberi de tip hidroxil, ce prezintă un număr total impar de electroni, rezultatul fiind
acidul monodehidroascorbic în primă etapă şi acid dehidroascorbic ca și produs final. Formele
respective de acid ascorbic (forme oxidate) sunt relativ stabile şi nu prezintă toxicitate celulară.

28
Organele în care distribuția vitaminei C este crescută sunt glanda suprarenală şi hipofiză, iar
nivele mai reduse fiind prezente în creier, ficat, pancreas sau splină. Acidul ascorbic este un
compus hidrofilic care, în comparaţie cu alți antioxidanţi de aceeași natură, oferă o protecţie mai
însemnată împotriva radicalilor liberi.

Alte roluri ale vitaminei C sunt:

 Rol de transportor al electronilor, compusul fiind implicat în diferite reacţii de hidroxilare:

biosinteza glicogenului și carnitinei, hidroxilarea dopaminei şi a noradrenalinei (sub
acțiunea enzimei β-dopamin hidroxilază)
 Favorizează efectele antioxidante ale vitaminei E
 Intervine în optimă intestinală optima a Fe
 Reduce methemoglobina la hemoglobină
 Inhibă sinteza nitriților în organism

Cantitatea excesivă de acid ascorbic sau interacțiunea cu metale tranziționale poate determina
o modificare a comportamentului vitaminei, aceasta acţionând în situația respectivă ca şi
prooxidant.

Tocoferolul (vitamina E)

Vitamina E este reprezentată prin 4 specii de tocoferoli, având ca și structură de bază tocolul.
Tocolul conţine un nucleu cromanic substituit în poziţia 2 cu un metil și în poziţia 6 cu un hidroxil
precum și un radical saturat ce cuprinde 16 atomi de carbon. Prin metilări în poziţii specifice (5,
7 sau 8), din compusul de bază vor deriva următorii tocoferoli naturali :
  tocoferolul (5, 7, 8 trimetiltocol)
 β tocoferolul (5, 8 dimetiltocol)
 γ tocoferolul (7, 8 dimetiltocol)
 Δ tocoferol (8 metiltocol)

Efectul antioxidant al tocoferolilor este maxim la concentraţii crescute ale oxigenului. Pe baza
acestui fenomen, tocoferolii au tendinţa să se acumuleze în special în cadrul structurilor lipidice
expuse la presiuni ridicate ale O2 (ex. membrana hematiilor sau epiteliul arborelui respirator). O
serie de factori condiționează această acumulare, precum dieta zilnică, cantitatea de seleniu,

29
nivelul de aminoacizi tiolici precum și raportul pro-oxidanți / anti-oxidanți din organismul uman.
(41, 46)

Vitamina A

Datorită rolului în neutralizarea oxigenului singlet, dar și a altor radicali liberi, carotenoizii
reprezintă o parte a categoriei antioxidanţilor, cu implicații în procesul de protecție față de
efectele peroxidării lipidelor (LPO). Principalul reprezentant este β-carotenul, ce determină
inhibarea LPO indusă de către sistemul xantin oxidazei. Funcţia de îndepărtare a radicalilor
liberi reiese din aranjamentul structural al β-carotenilor, moleculele fiind dispusă în lanţuri lungi
cu multiple legături duble, precum și din modificarea culorii acestora în cursul oxidării. Un aspect
special al β-carotenului este rolul dual pe care acesta îl posedă, acționând ca oxidant la presiuni
parţiale crescute ale oxigenului. (19)
 30
Capitolul 2: Partea specială

3. Contribuții Personale

3.1. Ipoteza de lucru

Diabetul zaharat de tip 2 este cunoscut ca o afecțiune metabolică care atinge proporții
epidemice la nivel global. Evidența științifică sugerează existența nivelelor crescute de stres
oxidativ în cadrul DZT2, din cauza unei producții excesive de specii reactive de oxigen (SRO),
precum și a mecanismelor antioxidante deficitare. Stresul oxidativ indus de SRO, la rândul lor
generate de hiperglicemie, contribuie în mod semnificativ la progresia diabetului și a
complicațiilor acestuia. Cu toate acestea, corelația între nivelul glucozei serice și parametrii
stresului oxidativ nu este pe deplin înțeleasă. Literatura de profil semnalează faptul că nivelul
plasmatic crescut al malondialdehidei (MDA) poate fi un marker al deteriorării lipidice
accentuate în diabet. De asemenea, dislipidemia poate contribui la elevarea stresului oxidativ,
crescând semnificativ riscul de afectare cardiovasculară din cadrul DZT2. De asemenea,
deficiența mecanismelor antioxidante reprezintă un factor de risc care poate duce la apariția
complicațiilor DZ.
Prin prisma celor expuse, studiul descris în această teză vizează următoarele aspecte: 1.
Investigarea lipoperoxidării plasmatice ca marker al stresului oxidativ în diabetul zaharat tip
2, în acest sens am determinat nivelul malondialdehidei plasmatice (MDA). 2. Evidențierea
unor corelații între nivelul plasmatic al MDA și nivelul glicemiei, al hemoglobinei glicozilate
(HbA1c), precum și al profilului lipidelor serice (Trigliceride, Colesterol total, Colesterol HDL,
Colesterol LDL, Colesterol VLDL).
3. Identificarea unei corelații între indicatorii de risc ai complicațiilor aterogene ale diabetului
zaharat de tip 2 și nivelul plasmatic al MDA. În sensul acesta s-au calculat indicatori de
risc din cadrul profilulului lipidic (Rapoartele Colesterol total/Colesterol HDL,
Trigliceride/Colesterol HDL, Colesterol LDL/Colesterol HDL, precum și indicele aterogen
al plasmei [IAP]).
4. Analizarea comportamentului sistemului de apărare antioxidant prin dozarea
superoxiddismutazei (SOD) serice, și cercetarea corelației acesteia cu hiperglicemia și
stresul oxidativ.

31
3.2. Material și Metode
3.2.1. Material Clinic

În studiul efectuat au fost recrutați un grup de 48 de pacienți ai unei secții clinice de profil
(29 de bărbați și 19 femei), cu vârsta cuprinsă între 45 și 62 ani, recent diagnosticați cu diabet
zaharat de tip 2 între septembrie 2016 și aprilie 2017.
Includerea acestora în studiu s-a realizat pe baza următoarelor criterii: valoarea
glicemiei peste 125 mg/dl (între 130-205 mg/ dl) și faptul că nu aveau stabilit nici un tratament
pentru hiperglicemie.
Au fost excluși din studiu pacienți cu diabet zaharat și boli coronariene,
cerebrovasculare, afecțiuni endocrine, climax, graviditate, infecții virale sau bacteriene
manifeste, boli renale, tratamente hipolipemiante sau cu suplimente de antioxidanți.
Grupul de control a fost constituit din 48 de adulți sănătoși (31 bărbați și 17 femei) cu
vârsta cuprinsă între 47 și 61 de ani, normotensivi și normoponderali.
A fost obținut un consimțământ informat de la toți participanții, după ce li s-au explicat
detaliile studiului .
Sângele venos a fost recoltat pe EDTA de la toți participanții, dimineața, în condiții
bazale, în absența administrării oricărei terapii.
Nu au fost incluse în studiu persoane cu afecțiuni hepatice, fumători, consumatori de
alcool, hipertensivi sau/și obezi, din cauza efectului derutant al acestora asupra profilului lipidic
și stresului oxidativ.

3.2.2. Analiza statistică

Pentru analiza datelor s-au utilizat:

1) Metode de statistică descriptivă, urmărindu-se indicatori de tendinţă centrală şi de
dispersie: media, deviaţia standard, mediana, intervalul dintre cuartile grafice. 2) Corelaţia
parametrilor a fost determinată prin aprecierea coeficienţilor de corelaţie: al lui Pearson pentru
variabilele cantitative cu o distribuţie normală.
3) Ca metode statistice de calcul au fost utilizate: testul T Student. Pentru a considera
diferenţele semnificative statistic am ales pragul de semnificaţie α cuprins între 1% şi 5%
(valorile p<0,05).

32
Analiza statistică a fost efectuată computerizat cu ajutorul programului informatic SPSS V25,
Windows 10. Pentru statistica descriptivă s-a utilizat programul Micrososft Excel.
3.2.3. Metode de lucru

1. Dozarea glucozei sanguine

Metoda enzimatică cu glucozooxidază și peroxidază

Principiu:
Glucooxidaza (GOD) catalizează reacția glucozei, în prezența oxigenului atmosferic:
Glucoza + O2 + H2O GOD Gluconolactona + H2O2
Apa oxigenată rezultată formează împreună cu aminoantipirina și fenolul, în prezența
peroxidazei (POD) un compus colorat în roșu, a cărui intensitate este direct proporțională cu
concentrația glucozei. Aceasta se măsoară fotometric.
2H2O2 + 4-Aminoantipirină +Fenol POD Chinona (roșie) + 4H2O2

Reactivi:

R1 Tampon fosfat pH=7,4 100 mmol/l

Fenol 0,62 mmol/l
R2 GOD 12000 Ul
POD 660 Ul
4-Aminoantipirina 0,4 mmol/l
R3 Standard glucoză 100 mg/dl (5,56 mmol/l)

Prepararea soluției de lucru:

Se dizolvă enzima din sticluța R2 cu flaconul de tampon R1 ( 250 ml) .Se amestecă ușor, apoi
se toarnă înapoi în R1.
Condiții de lucru:
Lungime de undă 505 sau 546 nm
Temperatura de incubare: 37°C sau temperatura camerei ( 20-25°C)
Tehnica de lucru: se recoltează sânge venos, dimineața, în condiții bazale, pe fluorura de sodiu
ca stabilizator.

Procedeul de lucru
Se pipetează în eprubete:

33
Martor Standard Probă
Reactiv cromogen 1ml 1ml 1ml Standard - 10µl - Proba - - 10 µl
După realizarea amestecurilor în fiecare din cele 3 eprubete. acestea se introduc la incubare la
37°C ( sau la temperatura camerei): după trecerea a 15 minute (sau 30 min la temperatura
camerei) permitem soluțiilor să finalizeze reacția. Apoi se citește densitatea optică (DO) a
probei și a standardului față de martor.

Calcul DO probă x Concentrația standard = mg/dl

DO Standard

unde concentrația standard =100 mg/dl (sau 5,56mmol/l)

Semnificație:
1. În general, sub vârsta de 40-45 de ani, glicemia care depășește constant valorile se
consideră a fi indicatoare a unui DZ.
2. Peste 45 de ani, glicemia care depășește valorile normale cu 10% trebuie repetată,
eventual se va efectua testul toleranței la glucoză pe cale orală (TTGO) pentru
confirmarea diagnosticului de DZ.
3. O glicemie bazală normală nu exclude DZ.
4. Valorile glicemiei determinate prin metoda GOD-POD trebuie interpretate în felul următor:
- valori normale a jeun >70 mg/dl și <110 mg/dl
- valorile a jeun constante >110 mg/dl și <130-140 mg/dl pot susține diagnosticul de DZ,
în această situație fiind necesară efectuarea TTGO.

2. Dozarea trigliceridelor serice

Principiu:

Trigliceridele formează glicerol și acizi grași în prezența lipoprotein-lipazei; glicerolul format sub
influența glicerol-kinazei (GK) trece în glicerol-3-fosfat, care în prezența oxigenului, sub acțiunea
glicerol-fosfat oxidazei (GPO) formează dihidroxiacetonfosfat și apă oxigenată. În

34
continuare, în prezența peroxidazei (POD), apa oxigenată formată se cuplează oxidativ cu 4-
clorfenol și 4-aminofenazona, formând un compus colorat în roșu, a cărui intensitate este direct
proporțională cu concentrația trigliceridelor:
Trigliceride + 3H2O lipaza Glicerol +3R-COOH
Glicerol+ATP GK Glicerol-3-fosfat +ADP
Glicerol-3-fosfat + O2 GPO Dihidroxinacetonfosfat + H2O
 H2O2+ 4-Aminofenazona +4-Clorfenol POD 4-(p-benzochinon-monoimino)-fenazona
(compus colorat în roșu) +2H2O + HCl Reactivi:

Conținut Prepararea soluțiilor de reactivi

Flacon 1 Tampon 5x100 ml Conținutul flaconului 1 se introduce în
flaconul 1a pentru
Flacon 1a a dizolva liofilizatul în tampon Liofilizat la 5 x100 ml
(Enzime/4-aminofenazonă)

Concentrațiile în soluția de reactivi:

ATP: >0,3mmol/l
4-aminofenazona: >0,35mmol/l
Glicerol-fosfat oxidaza: >2,5 U/ml
Glicerol kinaza: >0,2 U/ml
4-clorfenol: 3,5 mmol/l

Condiții de lucru:
Lungimea de undă: 546 nm sau 500 nm
Temperatura de incubare: 20-25°C (temperatura camerei) sau 37°C
Tehnica de lucru:
Se pipetează în eprubete:
Martor Probă
Ser sau plasmă - 0,02 ml Soluția de reactiv 2,00 ml 2,00 ml

35
Se agită conținutul eprubetelor și se incubează proba și martorul 10 minute la 20-25°C
(temperatura camerei) sau 5 minute la 37°C.
Se citește densitatea optică (DO) sau extincția (E) a probei față de martor în decurs de 60 de
minute ( la 37°C în 30 minute) = E probă
Metoda de calcul a concentrației (C) trigliceridelor în probă:
Lungimea de undă C(mmol/l) C(mg/dl) 546 nm 11,9 x E probă 1000 x E probă
500 nm 8,66 x E probă 760 x E probă
Dacă se folosește un standard, concentrația (C) trigliceridelor se va calcula astfel:
C (mmol/l) = 2,29 x E probă/E standard
C(mg0dl) = 200 x E probă/E standard

Interpretarea valorilor :
50-150 mg/dl - valori normale
150-200 mg/dl - interval limită
>200 mg/dl - valori crescute

Semnificație medicală:
Valori crescute ale trigliceridelor se întâlnesc în hipertrigliceridemii familiale, diabet zaharat de
tip 2, obezitate, sindrom metabolic, consum de alcool în exces, patologii endocrine, sindrom
nefrotic, boli autoimune, consum de betablocante, corticosteroizi, etc.

3. Dozarea colesterolului seric

Principiu:
Colesterolul esterificat în prezența colesterol-esterazei (CE) trece în colesterol și acizi grași; cu
oxigenul, în prezența colesterol oxidazei (CO), colesterolul trece în A4-coleston și apă
oxigenată; în prezența peroxidazei (POD), apa oxigenată realizează o cuplare oxidativă cu
fenolul și 4-aminofenazona, realizând un compus de culoare roșie, a cărui intensitate este direct
proporțională cu concentrația colesterolului.

Esteri ai colesterolului + H2O CE Colesterol + R-COOH

Colesterol + O2 CO Δ⁴-coleston + H2O2

36
2H2O2 +4-Aminofenazona + Fenol POD 4-(p-benzochinon-monoimino)-fenazona + 4H2O
(compus colorat în roșu)

Reactivi:

Conținut Prepararea soluțiilor de reactivi Flacon 1 10 Se dizolvă conținutul unui flacon 1

adăugand 100 ml apă distilată (soluția
Reactiv colesterol
Concentrațiile în soluția de reactiv:
Tampon Tris: 100 mmol/l (pH-7,7)
Mg2+: 50 mmol/l
4-aminofenazona: 1mmol/l
Colat de sodiu: 10 mmol/l
Fenol: 4mol/l
3,4-diclorfenol: 4mmol/l
Eter poliglicol al alcoolului gras: 0,3%
Colesterol esteraza: ≥ 0,4 U/ml Colesterol
oxidaza : ≥ 0,25 U/ml Peroxidaza: ≥ 0,2
U/ml
Condiții de lucru:
Tehnica de lucru:
de reactiv este gata de utilizare după
10 minute)

Martor Probă
Ser sau plasmă - 0,02 ml Soluția de reactiv 2,00 ml 2,00ml

37
Se agită conținutul eprubetelor și se incubează proba și martorul 10 minute la 20-25°C
(temperatura camerei) sau 5 minute la 37°C.
Se citește densitatea optică (DO) sau extincția (E) a probei față de martor la interval de 60 de
minute = E probă

Metoda de calcul a concentrației (C) colesterolului în probă:

Lungimea de undă Mg/dl Mmol/l 546nm C=853 x E probă C=22,1 x E probă 500
nm C=575 x E probă C=14,9 x E probă

Colesterolul plasmatic crescut se corelează în mod obișnuit cu hipertrigliceridemia. Factorii

dislipidemici, împreună cu diabetul, obezitatea, hipertensiunea arterială (HTA), hiperuricemia,
hiperfibrinemia și posibil alte tulburări metabolice se încadrează în sindromul metabolic (sau
sindromul X-metabolic).

Interpretarea valorilor obținute pentru colesterolul seric se face în felul următor:

150-200 mg/dl – valori normale
200-250 mg/dl – interval limită
>250 mg/dl –valori crescute

4. Dozarea Colesterolului din lipoproteine cu densitate ridicată (HDL)

Principiu:
Această metodă ce se folosește pentru cuantificarea colesterolului în lipoproteinele cu
densitate mare (HDL) este un test enzimatic omogen în care precipitarea diferențiată și
sedimentarea restului de lipoproteine și de chilomicroni este evitată. (53-54) Procedura constă în
doua etape:

În prima etapă colesterolul din lipoproteine (altul decât HDL-ul) este descompus de
acțiunea simultană a colesterol esterazei (CE) și colesterol oxidazei (CO), la un pH de 7.0
având ca produși finali colestenonul și peroxidul de hidrogen, ultimul fiind descompus mai
departe prin cataliză in apă și oxigen.
În a doua etapă, surfactantul, care acționează specific asupra HDL-ului, se adaugă la
reacția produsului final din prima etapă, acesta fiind compus din resturi de colesterol cuantificat

38
de o reacție de tip Trinder în care derivatul de anilină, HDAOS*, și 4-aminoantipirina (4-AA) (ca
agent de legatură) sunt condensați de către H2O2 în prezența peroxidazei (POD), formând
astfel quinonimină de culoare roșie, proporțională cu concentrația de colesterol HDL prezent în
probă.
*N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina.

Constituenți și Compozit:

R1 Reactiv enzimă. Soluție tampon GOOD 100 mmol/L - pH 7.0, MgCl 2 18 mmol/L, CE 800
U/L, CO 500 U/L, catalază 100 KU/L, HDAOS 0.7 mmol/L.
CAL POD/4-AA reactiv. POD 4 KU/L, 4-AA 4 mmol/L, N3Na <0.1%, surfactanți specifici < 1.5 %
(v/v).
R2 Apo-A1 / Apo-B / HDL Calibrator. Optativ REF 1972005.

Conservare și Stabilitate
Se păstrează la 2-8°C.
Reactivii sunt stabili până la data expirării înscrisă pe etichetă daca contaminarea este evitată
dupa deschiderea flacoanelor.

Probe
Ser, EDTA sau plasmă heparinizată obținută de la pacient dupa ce nu a mâncat pe perioada
nopții. Se separă de hematii într-un interval de 3 ore de la puncția venoasă. Probele pot fi
păstrate la 4-8°C timp de 2 săptămani sau la -20°C timp de 3 luni.
Prepararea Reactivului
Reactivii R1 și R2 sunt pregătiți pentru a fi folosiți. Stabilitatea reactivilor în analizor este de o
lună (la 2-12°C).
Calibrator. Se reconstituie o eprubetă adaugand un 1.0 mL de apă distilată. Se agită ușor și se
lasă timp de 5 minute înainte de folosință. Materialul reconstituit este stabil timp de 7 zile la 2-
8°C sau timp de 1 lună la -20°C. Materialul este îndepărtat dacă devine tulbure sau dacă sunt
prezente semne de contaminare bacteriană.
Calibratorul a fost preparat din ser uman negativ la HbsAg, HCV si nereactiv la anticorpii HIV.

Interferențe

39
Testul nu este afectat de hemoglobină (>500 mg/dL), bilirubină (>30 mg/dL) si lipide (>5g/dL).

Materiale de lucru
Fotometru sau spectrofotometru cu un compartiment de citire, termostatat setat la 37°C, cu
citire la 600±1 nm.
Ceas de laborator.
Cuvete cu drum optic de 1 cm.
Pipete pentru măsurarea reactivilor și a probelor.

Metoda de lucru
1. Se aduc reactivii și probele la temperatura camerei.
2. Se pipetează în tuburile test:
Cuvete Blanc Probă Calibrator R1 300 μL 300 μL 300 μL Proba - 4 μL -
CAL - - 4 μL
H2O 4 μL - -
3. Se amestecă și se incubează 5 minute la 37°C.
4. Se adaugă:
R2 100 μL 100 μL 100 μL

5. Se amestecă din nou.

6. Se citește la 37°C (dupa 30 secunde) absorbanța probei (A 1S) și a calibratorului (A 1C) la
600 nm față de reactivul blanc, după 3 minute citindu-se a doua oară absorbanța probei (A 2S)
și a calibratorului (A 2C).

Metoda de calcul
A 2S – A 1S x C Calibrator = mg/dL HDL colesterol
A 2C – A 1C

Valori de referință
Valori clinice ale HDL folosite în diagnosticarea grupurilor de risc.

40
Colesterol din lipoproteine cu densitate ridicată Risc Bărbați >55 mg/dL (> 1.42
mmol/L) Scăzut 35-55 mg/dL (0.90-1.42 mmol/L) Moderat
<40 mg/dL (<1.04 mmol/L) Ridicat
Femei >65 mg/dL (>1.68 mmol/L) Scăzut 45-65 mg/dL (1.16-1.68 mmol/L)
Moderat
<45 mg/dL (<1.16 mmol/L) Ridicat
Semnificația medicală:
Nivelul de colesterol HDL scăzut este un indicator de afecțiune coronariană. HDL-ul este utilizat
în estimarea riscului de apariție al afecțiunilor coronariene într-un interval de 10 ani, și are ca și
cauze: nivelul crescut de trigliceride, supraponderabilitatea și obezitatea, activitatea fizică
redusă și DZT2. Alte cauze sunt reprezentate de fumat, consumarea unor cantități foarte mari
de carbohidrați (> 60% de calorii) și anumite medicamente (progestative).

5. Determinarea Colesterolului LDL

LDL sunt lipoproteinele ce conţin cea mai mare cantitate de colesterol (60-70% din colesterolul
seric total). LDL rezultă în principal din degradarea VLDL, transportorul major al trigliceridelor.
Deoarece LDL au un timp de înjumătăţire mai mare (3-4 zile) decât precursorul său VLDL, este
mai prevalent în circulaţie decât acesta.
Acizii graşi liberi circulanţi formează în ficat trigliceride, ce sunt mai departe cuplate cu
apoproteine şi colesterol, urmând a fi exportate în sânge ca VLDL.
LDL colesterolul este implicat în transportul colesterolului către ţesuturi, în principal în sistemul
arterial, ceea ce explică incidenţa crescută a aterosclerozei şi a bolii coronariene la pacienţii cu
niveluri serice crescute ale lipoproteinelor în cauză. Determinarea LDL este specifică pentru
estimarea riscului cardiovascular şi stabilirea terapiei.
În condiţii fiziologice, raportul LDL-colesterol / HDL-colesterol are valoarea de 2.9 la femei şi 3.3
la bărbăţi. Riscul apariției bolilor coronariene creşte semnificativ dacă valoarea acestui raport
este >3.5 la femei >3.8 la bărbaţi.
Sunt utilizate două metode pentru determinarea LDL (55-56):

a. Metoda directă enzimatică colorimetrică

Această metodă automată se bazează pe solubilizarea micelară selectivă a LDL-colesterolului,
(utilizând un detergent neionic) şi a interacţiunii dintre un compus de natură zaharidică şi

41
lipoproteine (VLDL şi chilomicroni). Atunci când un detergent este inclus în metoda enzimatică
de determinare a colesterolului (ce include colesterol esteraza, colesterol oxidaza și reacţii de
cuplare), reactivităţile relative ale colesterolului din fracţiunile de lipoproteine cresc într-o
anumită ordine: HDL < chilomicroni < VLDL < LDL. În prezenţa ionilor de Mg2+, compusul
zaharidic determină o reducere marcată a reacţiei enzimatice de măsurare a colesterolului in
VLDL şi chilomicroni. Astfel, utilizarea combinată a unui compus zaharidic şi a unui detergent
neionic facilitează determinarea selectivă a LDL în ser.
Metoda respectivă a fost standardizată faţă de metoda de beta-cuantificare a LDL-colesterolului
(ultracentrifugare combinată cu precipitare) considerată gold-standard. Aceasta îndeplineşte
cerinţele NCEP (National Cholesterol Education Program) de a avea o eroare analitică totală ≤
12%.

b. Metoda indirectă
LDL-colesterolul este determinat din valoarea colesterolului total, a trigliceridelor şi a HDL
colesterolului conform formulei lui Friedewald:
LDL-colesterol = Colesterol total – (HDL-colesterol) – (VLDL-colesterol)
VLDL-colesterol = trigliceride (TG) /5
Formula nu se aplică în cazul unor valori ale trigliceridelor >400 mg/dL; în aceste situaţii se
recomandă dozarea apolipoproteinelor A1 şi B sau determinarea directă a LDL-colesterolului
pentru cuantificarea riscului de apariţie al bolilor cardiovasculare

Valori de referinţă
Adulți:
Optim <100 mg/dl
Optim la limită 100-129 mg/dl
Borderline crescut 130-159 mg/dl
Crescut 160-189 mg/dl
Foarte crescut ≥190 mg/dl
Copii şi adolescenţi (12-18 ani):
Optim <110 mg/dl
Borderline crescut 110-129 mg/dl
Crescut ≥ 130 mg/dl
Factor de conversie: mg/dL x 0.026= mmol/L
mmol/L x 38.66= mg/dL.

42
Interpretarea rezultatelor

Creşteri: hipercolesterolemie familială (tip II a), hiperlipoproteinemiile II-b şi III, dieta bogată în
colesterol şi grăsimi saturate, hipotiroidism, sindrom nefrotic, diabet zaharat. Scăderi:
hipo/abetalipoproteinemie, hipertiroidism, anemii cronice, afecţiuni hepatice, condiții de stres
acut, boli inflamatorii articulare.

5. Calculul unor indicatori de risc ai aterosclerozei din profilul lipidic:

Anumite studii recente din literatura de specialitate evidențiază rolul predictiv al riscului aterogen
la diabetici al unor indicatori specifici. Aceștia se pot calcula din profilul lipidic (57-58): a.
Colesterol non HDL (non HDL-C) = Colesterol total (CT) - Colesterol HDL (C-HDL) b.
Trigliceride (TG) / Colesterol HDL (HDL-C),
c. Colesterol total (CT) / Colesterol HDL (HDL-C)
d. LDL / HDL-C și non-HDL-C / HDL-C:
e. Indicele aterogen (IA) a fost calculat ca logaritmul raportului concentrațiilor molare de TG
și HDL-Colesterol (HDL-C): [IA = log (TG / HDL-C)].

6. Determinarea cantitativă a hemoglobinei glicozilate ((HbA1c) din sângele uman

Utilizare
Determinarea HbA1c este cel mai frecvent efectuată pentru evaluarea controlului glicemic în
diabetul zaharat. Nivelurile HbA1c oferă o privire de ansamblu asupra glicemiei în ultimele 4-8
săptămâni, o valoare a HbA1c indicând un control glicemic mai slab. Pe toată durata de viață a
eritrocitelor, HbA1c este formată continuu prin adăugarea moleculelor de glucoză la capătul N
terminal al lanțului beta de hemoglobină. Acest proces non-enzimatic reflectă astfel expunerea
medie a hemoglobinei la glucoză într-un interval temporal prelung. Un studiu clasic arată
creșterea HbA1c la subiecții diabetici de 2-3 ori peste nivelurile găsite la persoanele normale.
Valorile HbA1c nu sunt influențate de variațiile zilnice ale glucozei și nici de exercițiile zilnice sau
de aportul recent de alimente. Datorită faptului că valorile HbA1c scad la un nivel normal la
pacienții cu DZ controlat, se recomandă utilizarea hemoglobinei A1c drept indicator al
controlului metabolic al patologiei.

43
HbA1c reprezintă fracțiunea hemoglobinei care se separă prima dată în timpul cromatografiei
pe coloană cu rășini schimbătoare de cationi.

Principiu

Această metodă utilizează interacțiunea antigen-anticorp pentru a determina direct HbA1c în

sângele integral. Hemoglobina totală și HbA1c au aceeași rată de absorbție nespecifică a
particulelor de latex (R1). Când se adaugă anticorpul monoclonal anti-uman HbA1c de șoarece
(R2), se formează complexul de anticorpi HbA1c – anti-human HbA1. Aglutinarea se formează
atunci când anticorpul policlonal de capră IgG anti-șoarece interacționează cu anticorpul
monoclonal. Cantitatea de aglutinat este proporțională cu cantitatea de HbA1c din probă și este
măsurată ca absorbție. Valoarea HbA1c este obținută dintr-o curbă de calibrare prin
turbidimetrie latex.

Reactivi
R1: latex 0,13%, tampon, stabilizator.
R2 (când este combinat): anticorp monoclonal de șoarece-anti-HbA1c uman 0,05 mg / ml,
anticorp de capră policlonal anti IgG de șoarece 0,08 mg / dl, tampon, stabilizatori.
Reactiv de hemoliză: apă și stabilizatori.

Depozitare reactivi
Păstrăm toți reactivii refrigerați la 2-8 ° C.

Colectarea și pregătirea eșantioanelor

Pregătirea specială a pacientului nu este necesară.
Nu sunt necesari aditivi speciali sau conservanți, în afară de anticoagulante.
Se colectează sânge venos cu EDTA folosind tehnica aseptică.
Toate eșantioanele umane trebuie considerate potențial periculoase.
Prin urmare, precauțiile universale trebuie utilizate în manipularea eprubetelor (mănuși,
echipament de laborator, evitarea producției de aerosoli etc.).
Pentru a determina HbA1c, trebuie pregătit un hemolizat pentru fiecare probă: 1. Pipetarea unui
ml de reactiv lizare în tuburi etichetate (Control sau Probă pacient). 2. Pipetarea a 200 μl de
sânge al pacienților bine omogenizat în fiecare tub. 3. Incubați 5 minute la temperatura camerei
(după amestecare) până la observarea lizării complete. Lizatul este stabil 10 zile la 2-8ºC.

44
Depozitare și stabilitate
1. Toți reactivii sunt stabili până la data de expirare înscrisă pe etichete.
2. R1 și R2 sunt stabili cel puțin o lună după deschiderea depozitată la 2-8 °C. 3. Hemoglobina
A1c în sângele întreg colectat cu EDTA este stabilă timp de o săptămână la 2- 8°C.

Interferenţe
Rezultatele pot fi inconsistente la pacienții care au următoarele condiții: dependență de opiacee,
intoxicație cu plumb, alcoolism, ingerarea unor doze mari de aspirină.

Materiale necesare
1. Pipete pentru distribuirea a 20 μl și 1 ml și tuburi de testare pentru a conține 1,02 ml.
2. Set calibrator HbA1c, set de control hemoliză pentru kit de 120 ml.
3. Baie termostatată la 37ºC. - Spectrofotometru sau fotometru termostat la 37ºC cu filtru de 600
± 20 nm.

Calibrarea
Blank: Se face blankul de reactiv cu apă distilată.
Calibratori: Se folosesc 4 nivele de calibrator HbA1c. Pentru calibratorul cu valoarea 0 se
folosește o solutie de NaCl 9 g/l.

Procedura preliminară
Se preîncălzesc reactivul și fotometrul (suportul cuvetei) la 37ºC.

Procedura analitică
1. Folosind apa distilată, se aduce aparatul la absorbanța zero la 600 nm
2. Se pipetează într-o cuvetă:
Suspensie de latex (R1) 0.7 ml

3. Se incubează 3-5 minute la 37ºC.

4. Se pipetează:
Proba / Calibrator / Apa (Blank) 20 μl

5. Se incubează 5 minute la 37ºC.

6. Se pipetează:

45
Anticorp (R2) 0.250 ml

7. Se amestecă bine și se incubează la 37ºC pentru 5 minute. La sfarșitul acestui interval, se

citește absorbanța (A) la 600 nm.

Calcule / Rezultate
Rezultatele HbA1c sunt determinate folosind curba de calibrare pregătită. Se calculează
diferența absorbanțelor: (A Probă – A Blank) pentru fiecare punct al curbei de calibrare și treceți
pe hârtie milimetrică valorile obținute, față de concentrația HbA1c a fiecărui calibrator.
Concentratia HbA1c a probelor necunoscute este calculată prin interpolarea valorii (A Probă – A
Blank) pe curba de calibrare.

Interval de referință (% HbA1c):

<6,5 normal
6,5 - 7,5 crescut
>7,5 mare (se recomandă măsuri)

Valori recomandate: mai puțin de 6% pentru un non-diabetic, mai puțin de 7% pentru controlul
glicemic al unei persoane cu diabet zaharat. Există un interval de 3-4 săptămâni înainte ca
HbA1c să reflecte modificările nivelului glicemiei. (59-60)

8. Determinarea malondialdehidei (MDA) în ser uman

Semnificația metodei
Organismul produce radicali liberi ai oxigenului prin sistemele enzimatic și non-enzimatic,
ducând astfel la peroxidarea lipidelor cu formarea de lipoperoxizi, cum ar fi anumite aldehide
(MDA), compuși ceto, hidroxil, carbonil, etc. Radicalii liberi ai oxigenului pot cauza deteriorări
atât prin peroxidare, cât și prin produși de descompunere ai lipidelor (hidroperoxid). Detectarea
conținutului de MDA poate reflecta nivelul peroxidării lipidelor din celule și reflectă indirect
nivelul de deteriorare celulară.

46
Principiu:
Evaluarea cantitativă a nivelului de malondialdehidă (MDA) ca marker al peroxidării lipidice se
bazează pe reacția dintre MDA și acidul tiobarbituric (TBA), care produce un aduct MDA-TBA2
(compus colorat în roșu), cu un vârf maxim de absorbție la 532 nm:
Compoziția kitului reactiv:

Tampon de liză MDA 25 ml

Soluție de acid fosfotungstic 12,5 ml
BHT (100X) 1ml (roșu purpuriu)
TBA 4 flacoane
MDA standard (4,17M) 100 ml (galben)

Depozitare și manipulare:
Se depozitează la -20 C, ferit de lumină.
Se lasă toate componentele să se încălzească la temperatura camerei înainte de utilizare. Se
centrifughează scurt flacoanele înainte de deschidere.

Reconstituirea reactivului:
Se ia un flacon de TBA și se adaugă 7,5 ml acid acetic glacial și se amestecă. Se transferă
suspensia într-un alt tub și se adaugă H2O distilată la un volum final de 25 ml. Se amestecă
bine pentru a se dizolva. A se păstra la 4 ° C. Stabilitatea este asigurată timp de 1 săptămână.

Procedura:
Pregătire pacient – preferabil à jeun.
Specimen recoltat – sânge venos.
Recipient de recoltare – vacutainer ce conține EDTA ca anticoagulant.

47
Pentru probele de plasmă, se amestecă 10 μl cu 500 μl de 42 mM H2SO4 într-un tub de
microcentrifugă. Se adaugă 125 μl de soluție de acid fosfatungstic și se centrifughează. Se
incubează la temperatura camerei timp de 5 minute, apoi se centrifughează timp de 3 minute, la
13.000 x g. Se colectează peletele și se resuspendă pe gheață cu 100 μl H2O dublu distilată
(dd) (cu 2 µl BHT). Se reglează volumul final la 200 µl cu H2O dd.
Curba standard MDA:
Se diluează 10 µl din standardul MDA cu 407 µl dd H2O pentru a pregăti o soluție de 0,1
MMDA, apoi se diluează 20 µl din soluția MDA de 0,1 M cu 980 µl de dd H2O dd pentru a
pregăti un standard MDA de 2 mM.
Pentru analiza colorimetrică, se adaugă 0, 2, 4, 6, 8, 10 µl din standardul MDA de 2 mM în
tuburi de microcentrifugă separate și se reglează volumul la 200 μl cu H2O dd pentru a genera
0, 4, 8, 12, 16 și 20 nmol standard.
Pentru analiza fluorometrică, se diluează standardul MDA de 2 mM 10 ori (10 μl + 90 µl H2O
dd), apoi se adaugă 0, 2, 4, 6, 8, 10 µl din MDA Standard 0,2 mM în tuburi de microcentrifugă
separate și se reglează volumul la 200 μl cu H2O dd pentru a genera 0, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 și 2,0
nmol Standard.

Procedura analitică:
Se adaugă 600 μl de reactiv TBA în fiecare flacon care conține etalon și probă.
Se incubează la 95°C timp de 60 min.
Se răcește la temperatura camerei într-o baie de gheață timp de 10 min.
Se pipetează 200 µl într-o placă cu 96 de godeuri pentru analiză.
Ocazional, probele pot avea o turbiditate ce poate fi eliminată prin filtrare). TBA
poate reacționa cu alți compuși în eșantioane producând alți compuși colorați.
Acestea nu ar trebui să interfereze în general cu cuantificarea aductului TBA-MDA.

Măsurare:
Pentru analiza colorimetrică, se citește absorbanța la 532 nm.
Pentru analiza fluorometrică, se citesc supernatanții (Ex / Em = 532/553 nm).

48
Calcul:
Se face diagrama curbei standard MDA și se determină cantitatea de MDA în proba testată în
nmoli prin interpolare din curba standard. Se corectează valorile eșantionului pentru orice alte
diluări efectuate în timpul pregătirii eșantionului.
unde:
A: cantitatea probei standard din curba standard (în nmoli)
ml: volumul original de plasma (ser) utilizat

4: factor de corecție la utilizarea a 200 µl din 800 µl mix de reactivi

D: factor de diluție

Valori de referință – 0.36-1.24 µmol/l

Semnificație:

Peroxidarea lipidică este un mecanism major de apariție al leziunilor celulare și presupune

oxidarea acizilor grași polinesaturați cu formarea de specii reactive și produși toxici. Într-o celulă
în care se acumulează radicalii liberi, acizii grași, care în mod normal ar fi supuși β-oxidării în
mitocondrii, vor urma calea peroxidării lipidice, rezultând ca produs final malondialdehida
(MDA). Deși MDA poate fi inactivată de aldehid-dehidrogenaze, producția sa este accelerată de

49
stresul oxidativ și, atunci când concentrațiile ating niveluri critice, malondialdehida poate scăpa
procesului de detoxifiere. MDA este un compus toxic implicat în procesele de mutageneză la
persoanele vârstnice, carcinogeneză, nefropatie diabetică sau în leziuni determinate de radiații
Unele studii au raportat un nivel seric crescut de MDA și în boli parazitare. (61-62)

9. Determinarea superoxid dismutazei (SOD) serice

Superoxid dismutazele (SODs) sunt metaloenzime ce catalizează dismutarea anionului

superoxid la oxigen molecular și peroxid de hidrogen, formând o parte crucială a mecanismului
de apărare antioxidant celular:
2O2- • + 2H + SOD H2O2 + O2
Trei tipuri de SOD-uri au fost caracterizate în funcție de metalul conținut: cupru / zinc (Cu / Zn),
mangan (Mn) și fier (Fe). SOD este distribuită pe scară largă atât la plante, cât și la animale.
Apare în concentrații mari la nivelul creierului, ficatului, inimii, eritrocitelor și rinichilor. Cantitatea
de SOD prezentă în mediile celulare și extracelulare este esențială pentru prevenirea bolilor
legate de stresul oxidativ (63-64).

Principiu
Metoda colorimetrică utilizează o sare WST-1 de tetrazoliu care produce coloranți de formazan
solubili în apă la reducerea cu anionul superoxid. Rata de reducere a WST-1 este legată liniar
de activitatea de inhibare a xantin oxidazei (XO) de către SOD. SOD catalizează dismutarea
anionului superoxid în peroxid de hidrogen și oxigen molecular, determinând scăderea reducerii
WST-1. Această activitate de inhibare a SOD se măsoară prin metoda colorimetrică la DO
(densitatea optică) de 450 nm.
Xantină 2O2 WST-1
O2

XO

H2O2 2O2- WST1 Formazan

Acid uric
SOD

O2+H2O2

50
Materiale furnizate
Item Cantitate Depozitare Soluție WST 1 mL +4°C
Soluție enzimă SOD 20 μL +4°C
Tampon SOD Test 20 mL +4°C
Tampon SOD Diluție 10 mL +4°C

Materiale necesare
 PBS sau 150 mM KCl (dacă se utilizează probe de țesut)
 Omogenizator de abandon (dacă se utilizează probe de țesut)
  Cititor de plăci capabil să măsoare absorbția la 450 nm
 Placă cu 96 de godeuri: plăci cu fund plat clar pentru test colorimetric  0.1M Tris / HCL,
pH 7,4 care conține 0,5% Triton X-100, 5 mM β-ME, 0,1mg / ml PMSF (dacă se utilizează
probe de țesut)
 Opțional: standard uman SOD - care se utilizează pentru curba standard

Pregătirea reactivilor
Flacoanele sunt centrifugate scurt, cu viteză mică înainte de deschidere.

Soluție WST:
 Se diluează soluția WST de 1 ml cu 19 ml de soluție tampon SOD.
 Eșantionarea se face astfel încât să existe o cantitate suficientă pentru a efectua numărul
dorit de analize.

SOD soluție enzimatică:

 Soluția de enzimă este centrifugată timp de 5 secunde și amestecată prin pipetare,
deoarece aceasta are 2 straturi. Se diluează 15 µl cu 2,5 ml SOD de diluție.

Probele de sânge și plasmă:

1. Sângele este colectat folosind citrat sau EDTA.
2. Centrifugarea se realizează la 1.000 x g timp de 10 minute la +4° C.
3. Stratul de plasmă este transferat într-un tub nou, fără a deranja stratul tampon. Plasma
poate fi păstrată la -80 ° C până la analize suplimentare.
4. Stratul tampon este îndepărtat din peleta de celule roșii.

51
5. Eritrocitele sunt resuspendate în 5 x volume de apă distilată la rece
6. Se centrifughează la 10.000 x g timp de 10 minute (pentru a granula membrana
eritrocitului).
7. Supernatantul este depozitat la -80 ° C până când este gata de analiză. 8. Plasma
poate fi diluată de 3-10 ori iar lizatul de celule roșii de 100 de ori înainte de analiza
SOD.

Procedura
Godeurile de reacție realizate:
Blank 1 = 20 µL H2O dd
Blank 2 = 20 μL
Blank 3 = 20 µL H2O dd
Sonde de probă = 20 µL
Componente Probă (μl) Blank 1 (μl) Blank 2 (μl) Blank 3 (μl) Soluție Probă 20 0 20 0
ddH2O 0 20 0 20
Soluție de lucru WST 200 200 200 200
Enzimă Soluție de lucru 20 20 0 0
Tampon dilutie 0 0 20 20

1. Se adaugă 200 μl de soluție de lucru WST în fiecare godeu.

2. Se adaugă 20 μl de tampon de diluare la Blank-urile 2 și 3.
3. Se adaugă 20 μl de soluție de lucru enzimatic la fiecare probă și Blank 1.
4. Se amestecă și se incubează la 37° C timp de 20 de minute.
5. Se măsoară ieșirea (la DO 450 nm) pe un cititor cu placă.

Analiza datelor
Probele care produc semnale mai mari decât ale celor mai mari standarde trebuie diluate în
continuare în tampon adecvat și reanalizate, apoi înmulțită concentrația găsită cu factorul de
diluare adecvat.
Calcularea activității SOD (rata de inhibiție %) folosind ecuația următoare: Activitatea SOD
(rata de inhibiție %) = (A Blank1 – A Blank 3) – (A Probă – A Blank 2) X 100 (A Blank 1 – A
Blank 3) A = absorbanța

52
Valori de referinta – 1200-1800 U/g Hb

9. Indicatori antropometrici
Indicatorii antropometrici cei mai studiați și utilizați în definirea obezității și modalitatea de calcul
a acestora sunt redați mai jos:

1. Formula lui Broca*: înălțimea (I) în cm -100 = greutatea recomandată

2. Indicele de Masă Corporală (IMC) sau Body Mass Index (BMI):
Greutate (G) în kg / Înălțime (m2)
Obezitate > 25 la femei și >21 la bărbați
3. Formula Lorentz **
Bărbați: Greutatea ideală (kg)= Înălțimea (cm) - 100 - [Înălțimea (cm) – 150)] /4
Femei: Greutatea ideală (kg)= Înălțimea (cm) - 100 - [(Înălțimea (cm) – 150)] /2,5
4. Formula MLI (Metropolitan Life Insurance) **
Bărbați: G ideală (kg) = 50 + 0,75 (Înălțimea în cm - 150) + (vârsta -20) /4
Femei: Formula pentru bărbați se înmulțește cu 0,9
5.Raportul talie / șold (T/S) ***
Circumferința taliei (cm) / circumferința șoldului (cm)
Normal <0,9 la bărbați și <0,8 la femei
Obezitate abdominală T/S >0,9
* Indice util pentru înălțimile medii (155-175 cm), la extreme fiind inaplicabil.
** Formulele țin cont de sex și vârstă.
*** Indicator pentru definirea tipului obezității (android sau ginoid).

53
3.3. Rezultate

3.3.1. Analiza datelor demografice ale grupurilor

La grupul cu diabet zaharat tip 2 media de vârstă a fost de 53,24 ani. Proporția bărbaților în
grup reprezintă 60,42% (29/48), iar a femeilor 39,58% (19/48). La grupul de control, media de
vârstă a fost de 52,14 ani. Proporția masculină în acest grup a fost de 64,68% (31/48), iar cea
feminină de 35,32 % (17/48).
Valorile descrise sunt redate grafic în tabel 1/ figura1 și tabel 2/ figura 2.

Tabel 1
Grup Număr Vârsta medie (ani) Deviația standard DZT2 48 53,24 6,865 Control 48
52,14 6,78
 Fig.1.Media de vârstă (ani) pe grupuri

Tabel 2
Grup Bărbați Femei Total DZT2 29 19 48 Control 31 17 48 Total 60 36 96

54

Fig.2. Repartiția pe sexe în grupul control și cel cu DZ tip 2

3.3.2. Analiza datelor biochimice obținute în studiul grupurilor Datele

parametrilor studiați analizate statistic sunt redate în tabelul de mai jos:

Tabel 3
Variabile Grup diabetic (48) IMC (kg/m2) 24,92±0,29 (23-26) CT (mg/dl) 180,87±4,97 (161,5-
Media±SD Glicemie (mg/dl) 167,31±5,9 (130- 253,2)
Vârsta 53,24±6,865 (45-62) 251) HDL (mg/dl) 47,5±2,42 (35,2-51,5)
HbA1c % 9,73±2,41 (6,8-16,1) LDL (mg/dl) 89,22±4,82 (79,3-99,1)
Grup control (48) Media±SD 175,32±4,64 0,000**
52,14±6,78 (189,4-238,4) 49,31±1,45
(47-61) (44,2-57,3) 0,01*
23,36±0,41 84,24±5,07
(20-24) (69,1-88,4) 0,29
Semnificație statistică (p) 0,14
97,12±9,3
(78-125) 0,56
0,22
5,84±1,2
(3,2-6,4) 0,59

VLDL (mg/dl) 32,14±3,1 (27,2-37,12) Tabel 3 - Semnificația parametrilor: 0,31
Non-HDL (mg/dl) 120,14±4,68
(109,61-139,22)
TG (mg/dl) 178,23±9,88 (126-254)
TG/HDL 3,80±0,29 (2,8-4,1)
CT/HDL 3,75±0,21 (3,13-3,98)
LDL/HDL 1,88±0,13 (1,023-1,97)
Non HDL/HDL 2,53±0,11 (1,79-2,66)
IA 0,17±0,02 (0,08-0,22)
MDA (µmol/l) 3,52±0,11 (1,8-5,8)
SOD (U/gHb) 798±112 (745-1212)
55
25,23±1,02 (20,3-31,45)
111,21±4,84 (98,7-120,1)
0,01*
135,09±5,76 (66- 142)
2,74±0,16 (2,35-2,99) 3,55±,14
0,0058** 0,08
(2,79-3,78) 1,71±0,11
(0,98-1,85) 2,25±0,10 (2,04-2,49)
0,57
0,075±0,03 (0,032-0,091) 0,91±0,08
(0,33-1,25) 1368±143
0,09
(950-1452)
0,01*
0,023* 0,000** 0,000**

IMC=indice de masă corporală; HbA1c=hemoglobină glicată; CT-colesterol total; HDL-colesterol HDL; LDL-
colesterol HDL; VLDL-colesterol VLDL; non HDL-colesterol non-HDL; TG-trigliceride; TG/HDL-raport
trigliceride/colesterol HDL; CT/HDL-raport colesterol total/colesterol HDL; LDL/HDL-raport colesterol
LDL/colesterol HDL; non HDL/HDL-raport colesterol non HDL/colesterol HDL; IA-indice aterogenic; MDA
malondialdehida serică; SOD-superoxid dismutaza serică.

Rezultate la aplicarea testului t-Student :

*diferență semnificativă în raport cu grupul de control (p<0,05) pentru următorii parametrii: HBA1c, VLDL, TG,
IA
**diferență înalt semnificativă (p<0,01), pentru parametri următori: Glicemie, TG/HDL, MDA, SOD

Din tabelul 3 deprindem faptul că la grupul cu DZ tip 2:

-Colesterolul total, colesterolul HDL, colesterolul LDL, colesterolul non HDL nu au valori
crescute semnificativ statistic la testul t student.

56
-Hemoglobina glicată, colesterolul VLDL, trigiceridele și indicele aterogen au semnificație
statistică semnificativă (p<0,05).
-Nivelul glicemiei, raportul molar trigliceride /colesterol HDL, malondialdehida și
superoxiddismutaza au valori înalt semnificativ statistic față de grupul de control (p<0,01).

În continuare, rezultatele obținute sunt redate grafic prin statistică descriptivă. S-a evidențiat
astfel o valoare medie a glicemiei a jeun de 167,31 ±59 mg/dl la grupul cu DZT2 și de 97,12
±9,3 mg/dl la cel de control (p<0,05). (Fig. 3)

Fig. 3.Valorile glicemiei la lotul diabetic și lotul de control sunt semnificative statistic
(p<0,05) Media±SD

Valoarea HbA1c înregistrată a fost semnificativ mai mare la grupul diabetic (9,73±2,41) față de
grupul de control format din subiecți sănătoși (5,84±1,2) (p<0,01) (Fig. 4). S-a identificat o relație
semnificativă statistic între concentrația de HbA1c și glicemie, atât la grupul cu DZT2 cât și la
cel de control (P <0,05).
Pe lângă această constatare, s-a găsit o corelație Pearson pozitivă semnificativă statistic între
HbA1c și valoarea colesterolului LDL (r=0,271, p<0,0001) la grupul cu DZT2, față de grupul de
control unde această corelație nu a fost găsită (r=0,075, p=0,518).
 57

Fig.4. Valorile serice ale HbA1c la diabetici și grupul de control

sunt semnificative statistic (p<0,05) Media±SD

În ceea ce privește IMC, nu a existat o diferență semnificativă între grupuri. Pacienții cu DZT2
au avut un nivel semnificativ ridicat de trigliceride (TG) (p<0.05). Valoarea colesterolui VLDL
(p<0.05) a fost de asemenea mărită la grupul diabetic. Pentru colesterolul total, colesterolul LDL
și colesterolul HDL nu a existat nici o schimbare semnificativă în comparație cu grupul control
(Fig. 5).

Fig.5. Valorile lipidelor serice la grupul DZ și martor: CT-colesterol total; HDL-colesterol HDL; LDL
colesterol HDL; VLDL-colesterol VLDL; non HDL-colesterol non-HDL; TG-trigliceride. Valorile sunt
semnificative statistic (p<0,05) pentru TG și VLDL; Media±SD

58
Calcularea nivelului unor factori lipidici cu risc aterogen, de exemplu TG / HDL (p<0.01) și a
indicelui aterogen (IA) (p<0.05) s-a dovedit a fi semnificativ crescută la pacienții diabetici
comparativ cu grupul control (Fig. 6).

Fig.6. Nivelul factorilor calculați din profilul lipidic (rapoarte molare și indice aterogenic) la lotul diabetic
comparativ cu cel martor; TG/HDL-raport trigliceride/colesterol HDL; CT/HDL-raport colesterol total/ colesterol
HDL; LDL/HDL-raport colesterol LDL/colesterol HDL; non HDL/HDL-raport colesterol non HDL/ colesterol
HDL; IA-indice aterogenic; date exprimate ca medie±SD
*diferență semnificativă în raport cu grupul de control (p<0,05) pentru IA-indice aterogenic.
**diferență înalt semnificativă (p<0,01) pentru TG/HDL
Valori nesemnificative statistic: CT/HDL, LDL/HDL, non HDL/HDL.

Fig. 7. Nivelul malondialdehidei serice (MDA) la lotul cu DZT2 față de lotul martor.
**diferență înalt semnificativă statistic (p<0,01)

59
S-a înregistrat de asemenea o creștere semnificativă a nivelului de malondialdehidă (MDA)
 plasmatică în grupul DZT2 comparativ cu grupul de control (p<0,01). (Fig. 7)

În tabelul 4 sunt redate corelațiile bivariate Pearson între malondialdehidă ca marker al

lipoperoxidării și, implicit, al stresului oxidativ și diferite variabile studiate, respectiv glicemie,
lipide și factorii lipidici de risc aterogen:

Tabel 4
Parametru MDA cu parametrii Valoarea r Corelație parțială Valoarea r
Glucoza serică 0,71** MDA cu glucoza serică
MDA cu lipide Corelație parțială Valoarea r
Corelația Pearson

CT -0,27 NS -0,14 NS 0,38** HDL -0,19 NS -0,18 NS 0,35** LDL -0,31* -0,22 NS 0,31*
VLDL -0,16 NS 0,39** 0,33* NonHDL 0,37** -0,13 NS 0,36** TG 0,38** 0,41** 0,35**
TG/HDL 0,42** 0,43** 0,31** CT/HDL 0,03 NS 0,02 NS 0,37** LDL/HDL -0,25 NS -0,22 NS
0,35** nonHDL/HDL 0,02 NS 0,03 0,38** IA 0,41** 0,37** 0,35**

CT-colesterol total; HDL-colesterol HDL; LDL-colesterol LDL; VLDL-colesterol VLDL; non HDL-colesterol non
HDL; TG-trigliceride; TG/HDL-raport trigliceride/colesterol HDL; CT/HDl-raport colesterol total/colesterol HDL;
LDL/HDL-raport colesterol LDL/colesterol HDL; non HDL/HDL-raport colesterol non HDL/colesterol HDL; IA-
indice aterogenic; MDA-malondialdehida serică; r-coeficient de corelație; p (two tailed significance- test cu două
cozi) *p<0,05, **p<0,01; NS-nesemnificativ statistic

Nivelul seric al malondialdehidei s-a corelat pozitiv cu cel al glucozei serice, colesterolului non
HDL, trigliceridelor și cu indicele aterogen. Analiza corelațiilor parțiale evidențiază o corelație
pozitivă a MDA cu TG, TG/HDL, VLDL și IA. Corelația negativă semnificativă statistic a MDA cu
LDL a fost anulată după analiza corelațiilor parțiale. Corelația pozitivă cu nivelul glicemiei s-a

60
păstrat și după analiza corelațiilor parțiale. În figura 8 este redată corelația Pearson dintre MDA
și glucoza serică la grupul diabetic.
 Fig. 8. Corelația pozitivă între malondialdehidă (MDA) și glicemie la lotul cu DZ tip 2 .
**diferență înalt semnificativă (p<0,01) față de lotul de control.

Fig. 9. Activitatea serică a superoxid dismutazei (SOD), mult scăzută la grupul diabetic
comparativ cu cel de control.
**diferență înalt semnificativă statistic (p<0,01)
Activitatea superoxid dismutazei serice (SOD) a fost găsită semnificativ scăzută la lotul diabetic,
comparativ cu lotul martor (p<0,01) (Fig. 9).

61
Fig. 10a. Corelație nesemnificativă statistic între glicemie și activitatea SOD la grupul de control

Fig. 10b. Corelație negativă puternic semnificativă între glicemie și activitatea SOD la grupul cu DZ tip 2

În figurile 10a și 10b se reflectă grafic corelațiile Pearson între activitatea serică a superoxid
dismutazei (SOD) și glicemie la cele două grupuri. Observăm o corelație negativă puternic
semnificativă statistic la grupul diabetic între activitatea plasmatică a SOD și valoarea glicemiei,
sugerând astfel depleția antioxidanților în DZ tip 2. La grupul de control corelația între cei doi
parametrii nu e semnificativă statistic.

62
3.4 Discuții
În studiul de față am urmărit evaluarea unor parametri ai stresului oxidativ (SO), la pacienți cu
diabet zaharat de tip 2 (DZT2) recent diagnosticat și relația acestora cu nivelul glicemiei, al
hemoglobinei glicozilate, precum și al profilului lipidelor serice. Am urmărit de asemenea o
eventuală corelație între anumiți indicatori de risc aterogen din profilul lipidic și malondialdehida
serică (MDA), precum și modificările activității antioxidante plasmatice.
Rezultatele studiului relevă o creștere semnificativă a nivelului de MDA, markerul principal al
peroxidării lipidelor și al stresului oxidativ, la grupul de pacienți cu diabet zaharat tip 2 recent
diagnosticați comparativ cu cei din grupul de control. Dozarea superoxid dismutazei (SOD)
plasmatice a evidențiat o scădere a activității antioxidante, probabil prin depleție, la grupul cu
DZT2. Astfel, am găsit o corelație negativă puternic semnificativă statistic cu nivelul glicemiei la
acest grup. În acord cu constatările noastre, există observații științifice similare (65, 66).
Nivelul seric al MDA s-a corelat pozitiv cu cel al glicemiei la acest grup, indicând asocierea
hiperglicemiei cu stresul oxidativ. Se pare că o concentrație mai mare de glucoză poate duce la
generarea excesului de radicali liberi. Unii cercetători au observat faptul că hiperglicemia
cronică poate influența generarea radicalilor liberi, ceea ce poate duce în cele din urmă la o
peroxidare lipidică crescută și la epuizarea antioxidanților și, prin urmare, accentuarea stresului
oxidativ la subiecții diabetici. (67)
Cercetarea noastră evidențiază un nivel de peroxidare lipidică semnificativă, niveluri
mai ridicate semnificativ statistic ale unor lipide (TG și VLDL) și a unor factori de risc ai lipidelor
(cum ar fi TG / HDL-C și IA) care pot indica modificări aterogene. Nivelul crescut al trigliceridelor
serice poate duce în opinia unor cercetători, la creșterea producției de colesterol LDL și la
reducerea transportului HDL al colesterolului înapoi la ficat. Rapoartele molare ale unor factori
lipidici (de ex. TG/HDL) ar putea fi markeri mai buni ai procesului de ateroscleroză decât
parametrii lipidici individuali (68, 69). În studiul nostru indicele aterogen (IA) a fost semnificativ
statistic crescut la grupul diabetic comparativ cu cel de control. Aceste constatări sunt în
concordanță cu alte observații științifice, sugerând faptul că acesta poate fi un indicator al
riscului de aterogeneză la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 nou depistat (70, 71).
Rezultatele au mai evidențiat un nivel seric crescut al hemoglobinei glicate (HbA1c) la pacienții
diabetici, semnificativ statistic față de grupul martor. Pe de altă parte a fost observată o corelație
pozitivă semnificativă statistic între HbA1c și LDL. Conform acestei constatări, HbA1c

63
ar putea fi utilizată ca un biomarker al prezicerii profilului lipidic seric la pacienții diabetici și, prin
urmare, al riscului crescut de complicații cardiovasculare.
SO cronic la diabetici poate fi legat de metabolismul excesului de glucoză și de acizi grași
prezenți în starea hiperglicemică. Hiperlipidemia este foarte frecventă în DZT2, iar peroxidarea
lipidelor crește proporțional cu aceasta (72, 73). În studiul de față, au existat corelații
semnificativ statistice pozitive ale glicemiei, lipidelor și factorilor de risc lipidici cu MDA, indicând
coexistența factorilor de risc aterogen și a stresului oxidativ.
Observația privind corelația negativă între MDA și LDL sugerează un exces de peroxidare
lipidică al LDL și, așadar, creșterea MDA. Am anulat statistic efectul hiperglicemiei asupra
asocierilor semnificative dintre variabilele MDA și cele lipidice. Astfel, hiperglicemia poate juca
un rol semnificativ în creșterea stresului oxidativ prin oxidabilitatea crescută a LDL. În studiul
nostru semnificația corelației pozitive a MDA cu nivelul glicemiei a fost păstrată chiar și după
anularea efectului parametrilor lipidici. Analiza acestor corelații sugerează de asemenea că
hiperglicemia este profund implicată în SO la diabetici, ceea ce duce la creșterea peroxidării
lipidelor, care este asociată în principal cu nivelul glicemiei. Din aceste observații reiese că
hiperglicemia în DZ de tip 2 are ca și rezultate o peroxidare lipidică crescută precum și valori
ridicate ale MDA plasmatic, care pot fi responsabile și de un nivel mai crescut al riscului de
afectare cardiovasculară.

64
3.5. Concluzii

1. Cercetarea noastră evidențiază o creștere semnificativă a nivelului de malondialdehidă

serică (MDA) la grupul cu diabet zaharat de tip 2 (DZT2). Astfel se sugerează că în
 DZT2 hiperglicemia se asociază cu generarea unui exces de radicali liberi, ceea ce
poate duce la o peroxidare lipidică crescută și, consecutiv, la accentuarea stresului
oxidativ (SO).
2. În studiul nostru, grupul cu DZ de tip 2 cu indice de masă corporală în limite normale, a
prezentat niveluri mai ridicate semnificativ statistic ale unor lipide precum trigliceridele
(TG) și colesterolul VLDL (VLDL) și a unor factori de risc lipidici cum ar fi trigliceride
/colesterol HDL (TG / HDL-C) și indicele aterogen (IA). Rapoartele molare ale unor
factori lipidici, precum și IA ar putea fi indicatori al riscului de aterogeneză la pacienții cu
diabet zaharat de tip 2 nou depistat.
3. Rezultatele au mai evidențiat un nivel seric crescut al hemoglobinei glicate (HbA1c) la
pacienții diabetici, semnificativ statistic față de grupul de control, dar și o corelație
pozitivă semnificativă a acesteia cu colesterolul LDL. Astfel, HbA1c poate fi utilizată ca
un biomarker al prezicerii profilului lipidic seric la pacienții diabetici și, prin urmare, al
riscului crescut de complicații cardiovasculare.
4. În studiul de față, au existat corelații semnificativ statistice pozitive ale glicemiei, lipidelor
și factorilor de risc lipidici cu MDA, indicând coexistența factorilor de risc aterogen și a
stresului oxidativ. Astfel, în DZT2, hiperglicemia are ca rezultat o peroxidare lipidică
crescută precum și valori ridicate ale MDA plasmatice, care pot fi corelate cu un risc
crescut pentru afectare coronariană.
5. Nivelul superoxid dismutazei (SOD) plasmatice la grupul cu DZT2 a înregistrat în studiul
nostru o scădere semnificativ statistică, probabil prin depleție, indicând astfel o activitate
antioxidantă dezechilibrată, în favoarea unui SO crescut. Din acest motiv se poate lua în
considerare tratamentul cu antioxidanți în managementul bolii și al complicațiilor la
pacienții recent diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2.

65
4. Bibliografie

1. Brahm Kumar Tiwari, Kanti Bhooshan Pandey, A. B. Abidi, Syed Ibrahim Rizvi. Markers of Oxidative
Stress during Diabetes Mellitus. Journal of Biomarkers. 2013; https://doi.org/10.1155 /2013/378790
2. P. Goycheva, V. Gadjeva, B. Popov Oxidative Stress And Its Complications In Diabetes Mellitus.Trakia
Journal of Sciences, Vol. 4, No.1, 2006, pp 1-8,
 ,
3. Sumaira Z Hasnain, Johannes B Prins Michael A McGuckin. Oxidative and endoplasmic reticulum
stress in β-cell dysfunction in diabetes. Journal of Molecular Endocrinology 2016 Feb;56 (2):R33-54.
doi: 10.1530/JME-15-0232. Epub 2015 Nov 17.
4. Dennis L. Kasper, Anthony S. Fauci, Stephen Hauser, Dan Longo, J. Larry Jameson, Joseph Loscalzo
Endocrinology and Metabolism.Section 3, Diabetes Mellitus. Harrison's.Principles of Internal
Medicine,19th Edition, 2015, 2399-2449.
5. IDF Diabetes Atlas, 7th ed.; IDF: Brussels, Belgium, 2015,http://www.idf.org/ 6. M Solimena, R Dirkx, Jr,
J M Hermel, S Pleasic-Williams, J A Shapiro, L Caron, D U Rabin ICA 512, an autoantigen of type I
diabetes, is an intrinsic membrane protein of neurosecretory granules.European Molecular Biology
Organization Journal.; 1996, May, 15(9): 2102–2114. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 8641276
7. https://en.wikipedia.org/wiki/Donohue_syndrome
8. https://prezi.com/mv8ojrztmfil/rabson-mendenhall-syndrome/
9. Orasanu, G.; Plutzky, J. The pathologic continuum of diabetic vascular disease. J. Am. Coll. Cardiol.
2009, 53 (Suppl. S5), S35–S42.
10. Valko, M.; Leibfritz, D.; Moncol, J.; Cronin, M.T.; Mazur, M.; Telser, J. Free radicals and antioxidants in
normal physiological functions and human disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2007, 39, 44–84.
11. https://www.kindredhealthcare.com/resources/blog-kindred-continuum/2013/11/07/
pathophysiology-of-diabetes-mellitus
12. Roy Taylor, Insulin Resistance and Type 2 Diabetes. American Diabetes Association,
DiabetesJournalsOrg .2012 Apr; 61(4): 778-779. https://doi.org/10.2337/db12-0073 13. Halliwell, B.;
Gutteridge, J.M. Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: An overview.Methods
Enzymol. 1990, 186, 1–85.
14. Evans, P.; Halliwell, B. Micronutrients: Oxidant/antioxidant status. Br. J. Nutr. 2001, 85 (Suppl. 2), S67–
S74.
15. Sies, H. Role of reactive oxygen species in biological processes. Klini. Wochenschr. 1991, 69, 965–
968.
16. Rolfe, D.F.; Brown, G.C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in
mammals. Physiol. Rev. 1997, 77, 731–758.
17. Koppenol,W.H. The Haber-Weiss cycle–70 years later. Redox Rep. 2001, 6, 229–234.

66
18. Nolan, C.J.; Damm, P.; Prentki, M. Type 2 diabetes across generations: From pathophysiology to
prevention and management. Lancet 2011, 378, 169–181.
19. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol. Rev. 2002, 82, 47– 95.
20. Yubero-Serrano, E.M.; Delgado-Lista, J.; Pena-Orihuela, P.; Perez-Martinez, P.; Fuentes, F.; Marin, C.;
Tunez, I.;Tinahones, F.J.; Perez-Jimenez, F.; Roche, H.M.; et al. Oxidative stress is associated with
the number of components of metabolic syndrome: LIPGENE study. Exp. Mol. Med. 2013, 45, e28.
21. Valko, M.; Rhodes, C.J.; Moncol, J.; Izakovic, M.; Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in
oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biol. Interact. 2006, 160, 1–40. 22. Pietta, P.G. Flavonoids as
antioxidants. J. Nat. Prod. 2000, 63, 1035–1042. 23. Ducrocq, C.; Servy, C.; Cudic, M.; Blanchard, E.B.
Intervention by nitric oxide, NO, and its oxide derivatives particularly in mammals. Can. J. Physiol.
Pharmacol. 2001, 79, 95–102. 24. Selemidis, S.; Sobey, C.G.; Wingler, K.; Schmidt, H.H.; Drummond,
G.R. NADPH oxidases in the vasculature: Molecular features, roles in disease and pharmacological
inhibition. Pharmacol. Ther. 2008, 120, 254–291.
25. Giacco, F.; Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circ. Res. 2010, 107, 1058–
1070.
26. Wellen, K.E.; Hotamisligil, G.S. Inflammation, stress, and diabetes. J. Clin. Investig. 2005, 115, 1111–
1119.
27. Touyz, R.M. Molecular and cellular mechanisms in vascular injury in hypertension: Role of angiotensin
II.Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2005, 14, 125–131.
28. .Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 2001, 414,
813–820.
29. Derosa, G.; Fogari, E.; D'Angelo, A.; Bianchi, L.; Bonaventura, A.; Romano, D.; Maffioli, P.
Adipocytokine levels in obese and non-obese subjects: An observational study. Inflammation 2013, 36,
914–920.
30. Zhang, L.; Wheatley, C.M.; Richards, S.M.; Barrett, E.J.; Clark, M.G.; Rattigan, S. TNF-alpha acutely
inhibits vascular effects of physiological but not high insulin or contraction. Am. J. Physiol. Endocrinol.
Metab. 2003,285, E654–E660.
31. Moriwaki, Y.; Inokuchi, T.; Yamamoto, A.; Ka, T.; Tsutsumi, Z.; Takahashi, S.; Yamamoto, T. Effect of
TNF-alpha inhibition on urinary albumin excretion in experimental diabetic rats. Acta Diabetol. 2007,
44,215–218.
32. Griendling, K.K.; FitzGerald, G.A. Oxidative stress and cardiovascular injury: Part II: Animal and human
studies. Circulation 2003, 108, 2034–2040.
33. Cai, H.; Harrison, D.G. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: The role of oxidant stress.
Circ. Res. 2000, 87, 840–844.

67
34. Lankin VZ, Lisina MO, Arzamastseva NE, Konovalova GG, Nedosugova LV, Kaminnyi AI, Tikhaze AK,
Ageev FT, Kukharchuk VV, Belenkov YN. Oxidative stress in atherosclerosis and diabetes. Bull Exp
Biol Med. 2005 Jul;140 (1):41-3.
35. Cecilia C. Low Wang, MD; Connie N. Hess, MD, MHS; William R. Hiatt, MD; Allison B. Goldfine, MD.
Clinical Update: Cardiovascular Disease in Diabetes Mellitus. Atherosclerotic Cardiovascular Disease
and Heart Failure in Type 2 Diabetes Mellitus – Mechanisms, Management, and Clinical
Considerations Circulation. 2016; 133:2459–2502. DOI: 10.1161/ CIRCULATIONAHA. 116.022194.
36. Anastasia Poznyak, Andrey V. Grechko , Paolo Poggio , Veronika A. Myasoedova , Valentina
Alfieri ,Alexander N. Orekhov, The Diabetes Mellitus–Atherosclerosis Connection:The Role of Lipid and
Glucose Metabolism and Chronic Inflammation, International Journal of Molecular Sciences March
2020, pp1-13.
37. Fukai, T.; Ushio-Fukai, M. Superoxide dismutases: Role in redox signaling, vascular function, and
diseases.Antioxid. Redox Signal. 2011, 15, 1583–1606.
38. Alfonso-Prieto, M.; Biarnes, X.; Vidossich, P.; Rovira, C. The molecular mechanism of the catalase
reaction.J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 11751–11761.
39. Prabhakar, R.; Vreven, T.; Morokuma, K.; Musaev, D.G. Elucidation of the mechanism of selenoprotein
 glutathione peroxidase (GPx)-catalyzed hydrogen peroxide reduction by two glutathione molecules:A
density functional study. Biochemistry 2005, 44, 11864–11871.
40. Yamagishi, S.; Maeda, S.; Matsui, T.; Ueda, S.; Fukami, K.; Okuda, S. Role of advanced glycation end
Products (AGEs) and oxidative stress in vascular complications in diabetes. Biochimica et Biophysica
Acta 2012, 820,663–671.
41. Evans, P.; Halliwell, B. Micronutrients: Oxidant/antioxidant status. Br. J. Nutr. 2001, 85 (Suppl. 2), S67–
S74.
42. Tiganis, T. Reactive oxygen species and insulin resistance: The good, the bad and the ugly.Trends
Pharmacol. Sci. 2011, 32, 82–89.
43. Thannickal, V.J.; Fanburg, B.L. Reactive oxygen species in cell signaling. Am. J. Physiol. Lung Cell.
Mol. Physiol.2000, 279, L1005–L1028.
44. Sun, Y.; Oberley, L.W. Redox regulation of transcriptional activators. Free Rad. Biol. Med. 1996, 21,
335–348.
45. Keisari, Y.; Braun, L.; Flescher, E. The oxidative burst and related phenomena in mouse macrophages
elicited by different sterile inflammatory stimuli. Immunobiology 1983, 165, 78–89. 46. Scherz-Shouval, R.;
Elazar, Z. Regulation of autophagy by ROS: Physiology and pathology.Trends Biochem. Sci. 2011, 36, 30–
38.]
47. Loh, K.; Deng, H.; Fukushima, A.; Cai, X.; Boivin, B.; Galic, S.; Bruce, C.; Shields, B.J.; Skiba, B.;
Ooms, L.M.;et al. Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab. 2009, 10, 260–272.

68
48. Cadet, J.; Bellon, S.; Berger, M.; Bourdat, A.G.; Douki, T.; Duarte, V.; Frelon, S.; Gasparutto, D.;
Muller, E.;Ravanat, J.L.; et al. Recent aspects of oxidative DNA damage: Guanine lesions,
measurement and substrate specificity of DNA repair glycosylases. Biol. Chem. 2002, 383, 933– 943.
49. Valko, M.; Rhodes, C.J.; Moncol, J.; Izakovic, M.; Mazur, M. Free radicals, metals and antioxidants in
oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biol. Interact. 2006, 160, 1–40. 50. Dalle-Donne, I.; Giustarini,
D.; Colombo, R.; Rossi, R.; Milzani, A. Protein carbonylation in human diseases.Trends Mol. Med. 2003, 9,
169–176.
51. Fraley, A.E.; Tsimikas, S. Clinical applications of circulating oxidized low-density lipoprotein biomarkers
in cardiovascular disease. Curr. Opin. Lipidol. 2006, 17, 502–509. 52. Vertuani S, Angusti A, Manfredini S.
The antioxidants and pro-antioxidants network: an overview. Curr Pharm Des. 2004;10(14):1677-94.
53. Sachiko Izawa. J.Med. and Pharm. Sci. 1997,37 : 1325,.
54. SPECIAL REPORT. Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education
Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Cholesterol in
Adults (Adult Treatment Panel III). JAMA. 2001,285 :2486
55. Frances Fischbach. Chemistry Studies. In A Manual of Laboratory and Diagnostic Tests. Lippincott
Williams &Wilkins, USA, 8 ed., 2009, 452-455.
56. Valeriu Atanasiu. Maria Mohora. Compuşi lipidici. În Biochimie Medicala, Ed. Niculescu, 2004, 223.
57. M. S. Khazaal, “Atherogenic index of plasma as a parameter in predicting cardiovascular risk in males
compared to the conventional dyslipidemic indices,” Karbala Journal of Medicine, vol. 6, 2013, pp.
1506–1531,.
58. M. Dobiásová, Z. Urbanová, and M. Samánek, “Relations between particle size of HDL and LDL
lipoproteins and cholesterol esterification rate,” Physiological Research, vol. 54, 2005,.pp. 159– 165,
59. Tietz, N.W., Textbook of Clinical Chemistry, Philadelphia, W.B. Saunders Company, 1999,p.794- 795.
60. Ceriello, A., et al, Diabetologia 22, 1982,p. 379.
61. Janero, D.R. Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid
peroxidation and peroxidative tissue injury, Free Rad. Biol. Med. 1990, 9:515-540; 62. Jentzsch, A. M.,
et.al., Improved Analysis of Malondialdehyde in Human Body Fluids, Free Rad. Biol. Med 1996, 20:251-
256;
63. Genova Diagnostics. Test Catalog. Oxidative Stress Analysis. www.genovadiagnostics.com, Ref Type:
Internet Communication.
64. Seguí J, Gironella M, Sans M, Granell S, Gil F, Gimeno M, Coronel P, Piqué JM, Panés J. Superoxide
dismutase ameliorates TNBS-induced colitis by reducing oxidative stress, adhesion

69
molecule expression, and leukocyte recruitment into the inflamed intestine. In J. Leukoc. Biol.
2004.,76(3): 537–44.
65. Pasaoglu H, Sancak B, Bukan N. Lipid peroxidation and resistance to oxidation in patients with type 2
diabetes mellitus. Tohoku J Exp Med. 2004; 203:211–8.
66. 31. Srivatsan R, Das S, Gadde R, Kumar KM, Taduri S, Rao N, Ramesh Baharani A, Shah K,
Kamireddy SC, Priyatham G, Balakumaran TA, Seshadri S, Kamath A, Rao A. Antioxidants and lipid
peroxidation status in diabetic patients with and without complications. Arch Iranian Med. 2009;12:121–
127.
67. 24. Whiting PH, Kalansooriya A, Holbrook I, Haddad F, Jennings PE. The relationship between chronic
glycaemic control and oxidative stress in type 2 diabetes mellitus. Br J Biomed Sci. 2008;65:71–4.
68. Fatima A, Jammal H, Anwar SS, Nadia W. Characterization of lipid parameters in diabetes and non-
diabetic atherosclerotic patients. J Geriatr Cardiol. 2015;12:37- 43.
69. Garg N, Agrawal YB, Gupta SA. Study of lipid profile levels in diabetics and nondiabetics taking
TC/HDL ratio and LDL/HDL ratio into consideration. J Indian Assoc Clin Med. 2014;15(3-4):192- 95.
70. Dobiasova M. Atherogenic Index of Plasma [Log (Triglycerides/HDL-C Cholesterol)]: Theoretical and
Practical Implications. Clin Chem. 2004;50:1113–5.
71. Rao BR, Parineetha PB, Raman VV. Study on Correlations Between Glycated Haemoglobin, Lipid Profi
les and Blood Glucose Levels in Type 2 Diabetics Living at Moderate High Altitude. International
Medical journal Malaysia. 2010;9:39–44.
72. Vinod Mahato R, Gyawali P, Raut PP, Regmi P, Singh KP, Pandeya DR, Gyawali P. Association
between glycaemic control and serum lipid profile in type 2 diabetic patients:Glycated haemoglobin as
a dual biomarker. Biomedical Research. 2011; 22: 375-380.
73. Moriel P, Plavnik FL, Zanella MT, Bertolami MC, Abdalla DS. Lipid peroxidation and antioxidants in
hyperlipidemia and hypertension. Biol Res. 2000;33:105–12.
70