Universitatea de Stat de Medicină și Farmacie Nicolae Testemițanu

Disciplina de microbiologie și imunologie

Microbiologia și diagnosticul de
laborator al infecțiilor de flux
sangvin

Elaborat de:
Vasiliu Anastasia
Bassarab Anisia
Bîrca Valeria
Gamureac Daniela
Garabajiu Irina
CUPRINS INTRODUCERE, EPIDEMIOLOGIE

MICROORGANISMELE VIZATE

PRELEVAREA, TRANSPORTAREA,
PĂSTRAREA HEMOCULTURII

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

RAPORTAREA
Introducere
 SEPSIS
Sepsisul este prezenţa SIRS cauzat de infecţie.
SIRS – sindromul de răspuns sistemic inflamator – descrie răspunsul timpuriu al
organismului la leziuni care pot fi de origine infecţioasă sau neinfecţioasă.
SIRS se atestă când sunt prezente, cel puţin, două criterii dintre următoarele:
• temperatura corpului: <36°C sau >38°C;
• ritmul cardiac: >90 bătăi pe minut;
• hiperventilaţie: frecvenţă respiratorie >20 respiraţii pe minut;
• numărul de leucocite >12,0x109 /L, <4,0x109 /L sau >10 % forme imature
 SEPSIS
Sepsisul sever este definit ca sepsis, asociat cu disfuncţii organice, hipoperfuzie sau
hipotensiune. Disfuncţii de organ:
• Hipoxemie arterială: PaO2 / Fi O2 < 300
• Oligurie acută: debit urinar < 0,5 ml/kg/h pentru cel puţin 2 ore
• Creatinină: >177 µmoli/L
• Anomalii ale coagulării: INR > 1.5, aPTT > 60 s
• Trombocitopenie: TR <100x109 /L
• Hiperbilirubinemie: >34 µmoli/L
Şocul septic este definit ca persistenţa hipotensiunii arteriale, induse de sepsis, în
pofida resuscitării volemice adecvate.
Sepsisul neonatal este definit ca SIRS, diagnosticat clinic, cauzat de infecţia care
apare în primele patru săptămâni de viaţă.
Definiții
Hemocultura
Hemocultura reprezintă însămânţarea şi
incubarea unei probe de sânge, întrun
mediu de cultură adecvat, care urmăreşte
izolarea şi identificarea bacteriilor
sau fungilor antrenaţi de fluxul sangvin
în anumite condiţii patologice
Bacteriemie tranzitorie
Prezenţa tranzitorie a bacteriilor sau a
fungilor în sânge pentru o perioadă
de câteva minute(extracție
dentară,bronhoscopie,cateterism,etc)
Bacteriemie intermitentă
O infecţie tranzitorie recurentă şi este
asociată cu abcesele nedrenate,
intraabdominale.
Bacteriemie continuă
Bacteriemia continuă apare în evoluţia
unor boli infecţioase ciclice, ca: febrele
enterice, leptospiroze etc., în infecţii
endovasculare:endocarditele,
anevrisme infectate, tromboflebite.
Pseudobacteriemie
Pseudobacteriemia apare atunci când
tulpinile izolate din sânge provin din
afara sistemului sangvin al pacientului.
Contaminarea probelor de sânge poate să
aibă loc la toate etapele: atât la colectarea
probei de sânge, cât şi la procesarea în
laborator
Epidemiologie

Sepsisul reprezintă afectează între 47 și 50 milioane de oameni și cel puţin 11 milioane mor în fiecare an, implicând un
deces la fiecare 2,8 secunde.
Odată ce au supravieţuit mulţi pacienţi suferă de consecinţele sepsisului pentru tot restul vieţii.

15-50% 20%

1.În funcţie de ţară, mortalitatea variază între 15 și mai mult

de 50%.
2.Din toate decesele din întreaga lume 20% sunt asociate
sepsisului.
Factorii de
Vârsta (vârstnicii,
risc mai 01 copiii sub 1 an)

frecvent
întâlniți 02 Imunosupresia

sunt:
Bolile cronice
03 preexistente

Infecții cu germeni
04 patogeni rezistenți la
antibiotice
Microorganismele
vizate
Microorganismele des implicate
Infecţiile fluxului sangvin la pacienţii imunocompetenţi

În comunitate În spital La copii

Escherichia coli + + +
Streptococcus pneumoniae + + +
Staphylococcus aureus + + +
Neisseria meningitidis + +
Streptococi beta-hemolitici +

Pseudomonas aeruginosa +

Enterococcus Your Text Here +

Microorganisme anaerobe +

Fungi +
E.coli

01 Este cel mai frecvent izolat la pacienții adulți cu bacteriemie.

Un focar localizat al infecției cu E. coli a fost considerat a fi sursa

02 sau focarul primar al bacteriemiei..

Bacteriemia este considerată a fi nosocomială dacă a apărut la ≥48

03 ore după internare și nu a fost înainte de internare.

Bacteremia E. coli are o rată a letalității de 5 până la 30% și

04 reprezintă o problemă endemică din ce în ce mai importantă.

Rata deceselor este mai mare în rândul celor al căror sepsis provine
05 din tractul digestiv decât în cazul celor al căror sepsis provine din
tractul urinar.
St.aureus

01 Se plasează pe locul II după E.coli.

Incidența a fost estimată între 10- 30 cazuri la 100.000 persoane, iar

02 mortalitatea spitalicească este ridicată,15 - 40%.

La 8-15% dintre pacienți, răspândirea hematogenă poate duce la

03 complicații secundare: endocardită, osteomielita vertebrală, abcese și
infecții asociate cu implant ale articulațiilor protetice, dispozitivelor
electronice cardiace etc.
04 Rezistența la meticilină al S. aureus a crescut de-a lungul anilor.

05 Rezistența la meticilină a fost găsită ca un predictor independent al

mortalității.
P.aeruginosa
Este cea mai frecventă a septicemiilor grave dobândite în spital, în
01 special în unitățile de terapie intensivă.

Mortalitatea spitalicească este de 20%, și este cea mai mare în rândul

02 pacienților care primesc tratament antimicrobian inițial inadecvat.

Rezistența la antibiotice este o caracteristică comună a tulpinilor de Pa

dobândite în spital. Permeabilitatea scăzută a proteinelor membranei
03 exterioare (OMP), producția de β-lactamaze cromozomiale inductibile
AmpC și sistemele multi-drug de eflux contribuie la rezistența
intrinsecă a acestei specii.

În 2017, Pseudomonas aeruginosa multi drog rezistentă a provocat

04 aproximativ 32.600 de infecții în rândul pacienților internați.
 Cazuri specifice
Asociată cateterizării
Diagnosticul bazat pe:
● izolarea aceluiaşi microorganism din
sânge şi din locul purulent de inserţie
a cateterului
● sepsisul clinic- nu răspunde la terapia
antimicrobiană şi se rezolvă prin
înlăturarea cateterului
Mortalitate: 25%
La femeile însărcinate
● Listeria monocytogenes poate afecta
fătul: infecție sistemică, meningită
neonatală, moarte făt; Sunt
examinate: produsul de concepție,
placenta, tampoanele neonatale.
● meningitidis, Capnocytophaga spp.
Clostridium- complică avortul,
potențial letal.
12,7%
Pacienți imunocompromiși
Cauza sunt microorganismele care fac
parte din flora indigenă. Pacienţii
hipospleni sau aspleni sunt sensibili la
septicemie fulminantă, cauzată de: S.
pneumoniae, H. influenzae, N.
20-50%
 Microorganisme
Bacillus spp., Corynebacterium spp.,
Propionibacterium spp., stafilococi
coagulazo negativi, Aerococcus spp.,
Micrococcus spp.

Evitare
Contaminarea poate fi evitată prin
prelucrarea meticuloasă a pielii şi
respectarea procedurilor aseptice
pentru inoculare şi subcultivare.
Contaminanții Raportare

Culturii Toate rezultatele hemoculturii trebuie

raportate clinicianului, inclusiv şi a
contaminanţilor presupuşi cu
menţiunea respectivă.
 1.
Prezenţa izolatelor identice din
două flacoane ale aceluiaşi set de
hemocultură.

2.
Izolarea aceleiaşi specii de
microorganisme din mai multe
Criteriile seturi.

Privind 3.
Evidenţierea creşterii rapide (în 48
Contaminarea de ore) a microorganismelor.
 PRELEVAREA,
TRANSPORTAREA, PĂSTRAREA
HEMOCULTURII
Modul de recoltare a probelor de sânge pentru
hemocultură
Zona de puncţie se
decontaminează larg,
concentric, cu 70% alcool
01 izopropilic, permiţându-i 02
să se usuce.
Sângele trebuie să fie
recoltat într-o seringă
04 sterilă şi apoi să fie
transferat în flaconul de
05
hemocultură.
Se aplică dezinfectantul
principal (recomandat:
clorhexidina în 70% alcool
izopropilic), apoi i se permite
03
să acţioneze.
Flacoanele de
hemocultură trebuie
menţinute în poziţie
verticală atunci când sunt
utilizate.
Vena nu se palpează după
dezinfectarea pielii decât
dacă persoana poartă
mănuşi sterile.
Prelevările trebuie făcute
înaintea tratamentului
antibacterian, în cazurile
când este posibil. Timpul
optim: în timpul crizei
febrile/ cât mai curând
posibil după criza febrilă.
 CANTITATEA NECESARĂ DE SÂNGE
PENTRU HEMOCULTURĂ
Adulţi
01
Volumul de sânge =20 – 30 ml. Un set
conţine un flacon aerob şi unul
anaerob, fiecare trebuie inoculat cu ≈
10 ml sânge. Pentru a optimiza
recuperarea agentului patogen şi a
majora rata de izolare, este recomandat
să se folosească două sau trei seturi
(două flacoane per set) pentru fiecare
episod septic (40–60 ml sânge; 10 ml
per flacon).
Copii şi nou-născuţi
02
Volumul de sânge se recoltează în
funcţie de greutatea pacientului. Se
utilizează des doar un flacon aerob, iar
cel anaerob numai în cazul în care se
suspectează infecţia anaerobă.
Dacă volumul de sânge este
insuficient pentru două flacoane, mai
întâi se inoculează flaconul aerob şi
apoi restul volumului de sânge se
inoculeaza într-un flacon anaerob.
 NUMĂRUL DE PROBE COLECTATE
Adulţi
01
Se colectează două seturi
consecutive, din două locuri
separate de venepuncţie, cât mai
curând posibil după debutul
simptomelor clinice.
Copii şi nou-născuţi
02
Pentru copii se folosesc 1-2 flacoane
aerobe, se recurge la unul aerob şi unul
anaerob, atunci când este relevant din
punct de vedere clinic.

În situaţii urgente, 2/ mai multe seturi de hemocultură pot fi

obţinute secvenţial, într-un interval scurt de timp (minute), după
care terapia empirică poate fi iniţiată. În situaţii mai puţin
urgente, obţinerea seturilor de cultură de sânge poate avea loc pe
parcursul mai multor ore sau şi mai mult.
TRANSPORTAREA ŞI PĂSTRAREA HEMOCULTURILOR
Flacoanele inoculate trebuie să fie
01 incubate cât mai curând posibil, timp
ideal ≤4 ore.
În cazul în care probele nu pot fi
transportate în decurs de 4 ore,flacoanele
de hemoculutură, destinate testării cu
utilizarea sistemelor automatizate, să fie
păstrate la temperatura camerei, deoarece
preincubarea în termostate poate duce la
rezultate fals negative sau la creşterea
timpului de detecţie a rezultatului pozitiv.
Formularul de însoţire a
02 hemoculturilor trebuie să conţină:
● numele şi prenumele;
● vârsta;
● diagnosticul pacientului;
● locul de unde a fost prelevată
proba de sânge;
● tratamentul administrat;
● data şi ora recoltării;
● volumul de sânge colectat.
Probele nu trebuie refrigerate!
Diagnosticul de
laborator
Procesarea Se recomandă raportarea rezultatelor pozitive timp de:

rezultatelor
● ≤ 2 ore de la rezultatul pozitiv la microscopiere (frotiul Gram), testare rapidă
antigen
● ≤ 24 ore de la rezultatul pozitiv la identificarea directă/automată, testarea
sensibilităţii directă/automată,
Este importantă ● 24-48 ore de la rezultatul pozitiv la identificarea prin metoda clasică, testarea
comunicarea între medicul sensibilităţii clasică prin metoda
de laborator şi clinician,
pentru comunicarea
eficientă şi rapidă a
rezultatelor, după fiecare
etapă de lucru
 Metoda Manuală
Are loc incubarea hemoculturii timp de 7 zile, la temperatura de
35-37 ͦ C, însă perioada de incubare poate fi prelungită pentru
identificarea m/o pretenţioase ( Bartonella, Legionella, Brucella,
Nocardia), fungilor dismorfi, în cazul endocarditei sau
tratamentului antimicrobian urmat de pacient
Metoda Automată
Are loc incubarea hemoculturii timp de 5 zile, la
temperatura de 35-37 ͦ C, inclusiv pentru m/o
pretenţioase. Uneori, pentru metoda automată
este suficient de 3-4 zile pentru identificarea
m/o
 Mediile convenționale
Constau dintr-o pereche de flacoane aerobe şi anaerobe

Mediile standart aerobe:

infuzia de creier-inimă, Columbia au bulion tiptic de soia.

Medii standard anaerobe şi microaerofile:

mediul tioglicolat
În cazul bacteriilor pretenţioase se adaugă suplimente:
hemină, vitamina K1, L-cisteină.

În cazul bacteriilor pretenţioase se adaugă suplimente:

hemină, vitamina K1, L-cisteină

Unele flacoane din comerţ întrunesc toate criteriile de mai

sus,pentru identificarea complexă a bacteriilor aerobe şi
anaerobe şi a fungilor.
Medii bifazice
● Avantaje: recuperări mai bune a bacteriilor
aerobe, anaerobe şi a fungilor şi reducerii
timpului de detectare prin recuperarea
coloniilor izolate
● Dezavantaje: probabilitatea mai mare de
contaminare şi rate scăzute de recuperare a
bacteriilor anaerobe
⮚ Flacon care conţine atât agar, cât şi bulion
⮚ S-au dovedit a fi eficiente şi pentru recuperarea
micetelor şi a bacteriilor din sânge
⮚ Sunt disponibile medii comerciale, care constau
dintr-un flacon ce conţine bulion şi un cilindru
ataşabil, acoperit cu un mediu pe bază de agar pe
ambele părţi.
⮚ Flacoanele sunt disponibile într-o varietate de
combinaţii ale mediilor şi volume pentru a fi
utilizate la pacienţii pediatrici sau la adulţi şi pentru
testarea unei game de microorganisme atât aerobe,
cât şi anaerobe.
 Liză-centrifugare
01
O metodă în care se realizează liza celulelor
sanguine, urmată de separararea
microorganismelor de componentele sângelui, prin
centrifugare şi prin însămânţarea sedimentului pe
medii de cultură solide.
02
Performanţa metodei de liză-centrifugare
este echivalentă cu cea a mediilor bifazice,
datorită obţinerii coloniilor izolate şi ratei
majorate de recuperare a fungilor
filamentoşi şi a micetelor levuriforme.
Identificarea fungilor

Se utilizează: flacoane cu bulion, flacoane bifazice şi flacoane de liză-

01 centrifugare.

Fungii dimorfi şi filamentoşi pot fi recuperaţi doar în flacoanele bifazice

02 şi de liză-centrifugare.

Mediile bifazice: necesită o incubare mai îndelungată a hemoculturilor, timp de

03 4 săptămâni, este necesară o agitare frecventă şi domoală a flacoanelor în
primele 24 ore de incubare

Flacoanele de liză-centrifugare: sedimentul se inoculează pe mai multe medii

04 agarizate şi se incubează la diferite regimuri de temperatură (27-30°C şi 35-37°C)
Testarea
Automatizată
Se bazează pe detectarea
creşterii nivelului de CO2,
produs rezultat în urma
metabolizării active a
microorganismelor.
Presupun utilizarea unor flacoane cu medii
01 speciale: aerobe şi anaerobe; cu sau fără
aditivi, concepute pentru îmbunătăţirea
recuperării microorganismelor de la pacienţii
supuşi terapiei antimicrobiene.
Flacoanele sunt dotate, în partea inferioară,
02 cu senzor care este separat de mediul lichid
printr-o membrană selectiv permeabilă
pentru CO2 , provocând schimbarea culorii
senzorului, detectată fie colorimetric sau
fluorometric.
Datele sunt colectate şi transferate pe
03 un computer. Sporirea semnificativă
de CO2 este semnalată vizual/sonor şi
astfel flacoanele pot fi extrase din
sistem pentru efectuarea frotiului şi a
subculturii.
04 Unele flacoane conţin răşini de
inactivare ale antibioticelor şi alte
materiale adsorbante, inclusiv
cărbune, pentru a inactiva efectul
antimicrobienelor.
Procesarea Metoda manuală
Necesită o examinare vizuală zilnică
sau de două ori pe zi.

Flacoanelor
Pozitivarea rezultatului
Un depozit flocular deasupra stratului de sânge; turbiditate
uniformă sau imediat sub suprafaţa mediului; hemoliză;
coagularea bulionului; o peliculă la suprafaţă; producţie de gaz;
granule albe/colonii la suprafaţă sau în adâncul stratului de
sânge schimbarea culorii sângelui.

Unele microorganisme pot creşte fără a produce modificări vizibile ale mediului
(pneumococii, Neisseria spp, Brucella spp, Francisella spp, H. influenzae,
Legionella spp, P.aeruginosa şi Candida)- se recomandă efectuarea subculturilor
oarbe de rutină pe agar, ciocolată, după 18–24 ore de incubare.
Procesarea flacoanelor

Nu se recomandă
efectuarea
subculturilor
terminale din
Sisteme automate flacoanele negative,
monitorizează flacoanele la expirarea timpului
aerobe şi anaerobe la de incubare (5 zile).
intervale regulate de timp
 Procesarea flacoanelor pozitive
Pacienţilor în stare critică se realizează o testare rapidă a sensibilităţii la antimicrobiene,
direct din flaconul de hemocultură detectat pozitiv, conform standardului EUCAST:

01 02 03 04 Metoda este validată

pentru: E.coli, Kl.
pneumoniae, Ps.
Inoculare directă a Nu se centrifughează Plăcile se Interpretarea rezultatelor aeruginosa, St. aureus,
mediilor MH, şi nu se fac diluţii ale incubează timp de sensibilităţii se Str. pneumoniae,
MH-F cu 100-150 inoculului – se 4, 6 şi 8 ore efectuează după Enterococcus faecalis şi
µl de conţinut al inoculează direct pe identificarea Enterococcus faecium,
flaconului pozitiv mediu microorganismului prin Ac. baumannii
de hemocultură metode rapide
Procesarea flacoanelor negative

Metoda automată: din flacoanele negative, de

regulă, nu se efectuează subculturi, decât doar
pentru anumiţi pacienţi, la insistenţa medicului
clinician.
Metoda manuală: din toate flacoanele aerobe
negative, după 24-48 ore, se efectuează subculturi,
ulterior cele care nu au fost confirmate ca pozitive
vor fi reincubate şi monitorizat.
Microscopia

01 Se agită uşor flaconul, prin inversare.

Se prelucrează septul flaconului de hemocultură cu

02
dezinfectantul corespunzător şi se lasă să se usuce.

Cu un ac de ventilaţie sau o pipetă Pasteur sterilă se aplică

03
câteva picături de bulion pe o lamă de microscop.

Cu ajutorul unei anse sterile se etalează cultura pentru a

04 realiza un frotiu subţire după Gram.
Raportarea
PUNCTELE CRITICE ÎN PROCESUL DE INVESTIGARE A HEMOCULTURII
În procesul de investigare a hemoculturii, la fiecare etapă
este posibil a identifica punctele critice, care pot influenţa
TAT–ul (turnaround times).TAT se poate referi la timpul
din momentul recoltării probei de sânge până la raportarea
rezultatului hemoculturii și există TAT de laborator, care
se referă la momentul de la primirea probei în laborator
până la raportarea rezultatelor.
 Timpul de la recoltarea până la primirea probei în
1 laborator – Timp de transport (TT).

2 Timpul de la primirea până la încărcarea probei în

sistemul automatizat/incubare.

Timpul de la încărcarea până la înregistrarea pozitivă

3 a probei – Timp de detectare (TTD).

Timpul de la semnalizarea pozitivă a probei până la

4 identificarea agentului microbian şi rezultatele testării
sensibilităţii la antimicrobiene.

Timpul de la disponibilitatea rezultatelor identificării şi a

5
sensibilităţii la antimicrobiene până la raportarea
rezultatului final.

Fiecare etapă a procesării hemoculturii depinde de mai mulţi factori externi, inclusiv de transport, infrastructură,
stabilirea priorităţilor şi timpul de testare de către personalul de laborator, raportarea în timp util a rezultatelor
identificării/sensibilităţii la antimicrobiene a agenţilor microbieni izolaţi (excepţie fiind TTD).
Scăderea TAT-ului contribuie la obţinerea
rezultatelor rapide şi la îmbunătăţirea
managementului pacientului.

Raportarea la timp a rezultatelor hemoculturii

permite ajustarea tratamentului antimicrobian
empiric şi îmbunătăţirea *stewardship-ului
antimicrobian.
FEREASTRA TERAPEUTICĂ
Pentru fiecare pacient există o perioadă de timp, în care acesta
poate fi tratat cu succes, considerată drept „fereastră terapeutică”.

Durata ferestrei terapeutice variază şi poate fi scurtă sau indefinit

de lungă, în funcţie de microorganismul şi de pacientul implicat.
Prin urmare, abordarea optimă presupune prescrierea precoce a
antibioticelor cu spectru larg, urmată de raportarea la timp a
rezultatelor investigaţiilor microbiologice clinicianului şi
ajustarea terapiei antimicrobiene.