Amino Acizi

Denumire Abreviere Formula structurii lineare ====================================================== Alanina Arginina Asparagina Acid aspartic Cisteina Glutamina Acid glutamic Glicina Histidina Isoleucina Leucine Lizina Metionina Fenilalanina Prolina Serina Treonina Triptofan Tirozina Valine Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val CH3-CH(NH2)-COOH HN=C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH HS-CH2-CH(NH2)-COOH H2N-CO-(CH2)2-CH(NH2)-COOH HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH NH2-CH2-COOH NH-CH=N-CH=C-CH2-CH(NH2)-COOH |__________| CH3-CH2-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH (CH3)2-CH-CH2-CH(NH2)-COOH H2N-(CH2)4-CH(NH2)-COOH CH3-S-(CH2)2-CH(NH2)-COOH Ph-CH2-CH(NH2)-COOH NH-(CH2)3-CH-COOH |_________| HO-CH2-CH(NH2)-COOH CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH Ph-NH-CH=C-CH2-CH(NH2)-COOH |_______| HO-p-Ph-CH2-CH(NH2)-COOH (CH3)2-CH-CH(NH2)-COOH

DENUMIRE AMINOACID STRUCTURA (la pH neutru)

Grupari R nepolare (hidrofobice)
Glicina (Gly)

Alanina (Ala)

Valina (Val)

Leucina (Leu)

Isoleucina (Ile)

Prolina (Pro)

Metionina (Met)

Fenilalanina (Phe)

Triptofan (Trp)

Grupari R polare (hidrofile)

Serina (Ser)

Treonina (Thr)

Tirozina (Tyr)

Cisteina (Cys)

Asparagina (Asn)

Glutamina (Gln)

Grupari R incarcate negativ

Acid aspartic (Asp)

Acid glutamic (Glu)

Grupari R incarcate pozitiv

Lizina (Lys)

Arginina (Arg)

Histidina (His)

Catena laterala

SISTEME DE CLASIFICARE A AMINOACIZILOR Exist mai multe sisteme de clasificare a aminoacizilor proteici, majoritatea bazndu-se pe structura i proprietile radicalilor R, care substituie -atomul de carbon. A) n funcie de comportamentul n mediul apos, aminoacizii proteici pot fi clasificai astfel: 1) aminoacizi cu grupri R nepolare: Ala, Val, Leu, Ile, Met, Pro, Phe, Trp 2) aminoacizi cu grupri R polare, dar nencrcate electric: Gly, Ser, Thr, Asn, Gln, Tyr, Cys 3) aminoacizi cu grupri R polare, dar ncrcate electric la pH fiziologic - ncrcare pozitiv: Lys, His, Arg - ncrcare negativ: Asp, Glu. A1) Aminoacizii din aceast clas sunt mai puin solubili n ap dect cei cu grupri R polare. Comportamentul cel mai slab hidrofob l are Ala, aceasta fiind considerat la grania cu aminoacizii cu grupare R polar, dar nencrcat electric. Pro difer de toi ceilali aminoacizi, fiind un -iminoacid. Gly este clasificat uneori ca aminoacid cu grupare R nepolare, iar alteori ca aminoacid cu grupri R polare, dar nencrcate electric. Clasificarea n prima categorie este justificat de faptul c n acest caz R= H, un singur atom de hidrogen neputnd s influeneze gradul ridicat de polaritate al gruprilor NH2 i -COOH. A2) Aceti aminoacizi sunt relativ mai solubili n ap dect cei cu grupare R nepolar. Radicalii lor conin grupri funcionale polare neutre care pot forma legturi de hidrogen cu apa. Polaritatea Ser, Thr i Tyr se datoreaz gruprii lor hidroxil, cea a Asn i Gln gruprii amid, iar cea a Cys gruprii SH (sulfhidril). A3) - toi aminoacizii bazici n care gruparea R prezint sarcini net pozitive la pH 7 au 6 atomi de carbon (Lys-grupare amino n poziia ; Arg-grupare guanidin; His-grupare imidazol). - aminoacizii acizi ce prezint o a doua grupare COOH ionizat complet.

Clasificarea aminoacizilor n funcie de polaritate B) n funcie de structura chimic: - aminoacizi alifatici (cu grupri R alifatice): Gly, Ala, Val, Leu, Ile; - aminoacizi alifatici (non-aromatici) cu grupri OH: Ser, Thr; - aminoacizi cu grupri ce conin S (aminoacizi cu S): Cys, Met; - aminoacizi acizi i amidele lor: Asp, Asn, Glu, Gln; - aminoacizi bazici: Arg, Lys, His; - aminoacizi cu inele aromatice: Phe, Tyr, Trp; - iminoacizi: Pro. C) n funcie de structura lanului hidrocarbonat i a numrului de grupri amino i carboxil: - aminoacizi aciclici (alifatici) monoaminomonocarboxilici (Gly, Ala, Ser, Cys, Met, Thr, Val, Ile, Leu)
9

- aminoacizi ciclici

monoaminodicarboxilici Asp, Glu, Gln, Asn diaminomonocarboxilici Lys, Arg aromatici: Phe, Tyr heterociclici: Trp, His, Pro

Prezentarea aminoacizilor standard Glicina(Gly)- este aminoacid cu cea mai simpl structur i este singurul care nu prezint activitate optic. Datorit faptului c radicalul R este un atom de hidrogen, Gly are capacitatea unic de a se acomoda n regiunile nalt pliate ale catenelor polipeptidice. Dei se gsete att n regnul vegetal, ct i n cel animal, Gly nu se ntlnete n structurile tuturor proteinelor. Gly se gsete n stare liber n seminele unor plante. Organismul animal sintetizeaz Gly i o utilizeaz n procesele de dezintoxicare, prin combinarea sa cu produi toxici (acid benzoic, acid nicotinic). Alanina(Ala)- este o component de baz a proteinelor, fiind nelipsit din toate proteinele animale i vegetale. Catena lateral este de tip alifatic i de natur hidrofob. Este un aminoacid chimic nereactiv i are un rol important n stabilirea, precum i n meninerea, structurii tridimensionale a proteinelor datorit tendinei de a evita apa (hidrofobicitate). n stare liber, Ala a fost identificat n diverse alge i n frunzele de tutun. n bacteria Lactobacillus arabinarus a fost identificat prezena D-Ala. Valina (Val)- are catena lateral alifatic i hidrofob. Se gsete n cantiti mici n numeroase proteine vegetale i animale, cu excepia proteinelor din seminele de in, care sunt bazate pe Val. Leucina (Leu)- se gsete n structura tuturor proteinelor studiate, predominnd n proteinele vegetale (zeina i edestina). Bogat n leucin este globina din hemoglobin ( din totalul de aminoacizi este reprezentat de Leu). Izoleucina (Ile)- conine n molecul 2 atomi de carbon asimetrici i se poate prezenta sub forma a 4 izomeri: L i D-izoleucin, alturi de L i Daloizoleucina Metionina (Met)- are un tioeter n catena lateral. Atomul de S, prin electronii si neparticipani poate stabili legturi cu atomii metalelor sau poate

10

reaciona cu alte grupri electrofile. Metionina este prezent n gelatin i n keratine. Are rol de metilant (donor de grupare CH3) n procesele metabolice. Prolina (Pro)- difer marcant de restul aminoacizilor, fiind un iminoacid. Are o structur ciclic i este doar moderat polar. Gruparea iminic a Pro este meninut ntr-o conformaie rigid, care reduce flexibilitatea structural a regiunilor polipeptidice care conin Pro. Rigiditatea se datoreaz faptului c atomul de N nu poate participa la formarea de puni de hidrogen. Pro introduce constrngeri conformaionale, determinnd modificarea brusc a direciei catenei polipeptidice. Se gsete n aproape toate proteinele vegetale i animale, predominnd n prolaminele din cereale. Fenilalanina (Phe)- prezint n structur o grupare fenil. n structura proteinelor i n mediu apos, acest aminoacid este orientat spre interiorul moleculei, evitnd contactul cu apa, stabilindu-se ntre mai multe molecule de Phe interacii Van der Waals. Se gsete n majoritatea proteinelor. Phe reprezint substana de plecare n biogeneza hormonilor tirodieni. Triptofanul (Trp)- are n structur o grupare indol, prezint o nalt hidrofobicitate. Este larg rspndit n compoziia proteinelor i are un rol important n metabolism, fiind strns legat de formarea vitaminei PP i a coenzimelor nucleotidice. Serina (Ser)- conine o grupare hidroxil care ntr-un micromediu special reprezint situsul catalitic activ al multor enzime, avnd rolul unui catalizator nucleofil i putnd ioniza. Se gsete n proteinele din mtase (de ex. sericin), n fibrin, cazein. Adesea se gsete n aceste proteine sub form de esteri fosforici. n stare liber, se gsete n seminele germinate. Treonina (Thr)- prezint n structur o grupare hidroxil, dar nu particip la alctuirea structurii situsului catalitic activ al enzimelor. Thr se gsete n cantiti mai mari n lactoblobulin, edestin i n proteinele din cereale, soia, cartofi, alge marine. Avnd 2 atomi de carbon asimetrici, se prezint sub forma a 4 izomeri optici (2 treonine i 2 alo-treonine). Asparagina (Asn)- amida acidului aspartic. Catenele laterale nalt polarizate se gsesc n contact cu mediul apos, ntr-o poziie extern a catenei polipeptidice pliate. Glutamina(Gln)- amida acidului glutamic

11

Tirozina(Tyr)- are n structur o grupare fenilic. Gruparea ei hidroxil are un caracter slab acid, ca i al fenolului, putnd forma legturi de hidrogen i este o grupare funcional important a unor enzime, gsindu-se n situsul catalitic activ al acestora. Tyr este unul dintre cei mai rspndii aminoacizi naturali. Se caracterizeaz prin slab solubilitate n ap. Tyr are o deosebit nsemntate n organismele animale prin faptul c poate forma adrelin, tiroxin i tiramin. Cisteina(Cys)- are n structur o grupare sulfhidril. Deoarece atomii de carbon i sulf au aproximativ aceeai electronegativitate, legtura C-S practic nu este polar. Din aceleai considerente, legtura S-H este nepolarizat. ns atomul de S este polarizabil datorit electronilor din orbitalii exteriori, ce pot fi influenai de cmpurile electrice ale altor molecule i ioni polari. Ca rezultat, gruparea SH din Cys este reactiv chimic. Atomul de hidrogen din gruparea SH poate forma puni de hidrogen cu atomi de O i N ai altor grupri. Gruprile SHa 2 molecule de cistein pot fi oxidate cu formarea unei disulfuri, numit cistin.

CH2-SS- CH2 CH-NH2 COOH CH-NH2 COOH

Punile -S-S- au o mare importan n structura proteinelor, putnd lega dou catene polipeptidice separate sau putnd nreela aceeai caten polipeptidic, formnd legturi covalente ntre pri ale aceleiai molecule proteice. Aceast punte disulfuric confer stabilitate i rigiditate structurii unei proteine. Cistina se gsete, mai ales, n scleroproteinele esuturilor animale (unghii, pr, piele etc.), precum i n unele proteine de origine vegetal (cartofi, orz). Cisteina se regsete printre produii finali ai hidrolizei proteinelor i se ntlnete n regnul animal i vegetal (n proteinele din piele; edentina din cnep). Lizina(Lys)- are o a doua grupare amino primar n poziia , pe catena lateral alifatic. La pH = 7, Lys este o baz puternic. Se gsete n toate proteinele, ndeosebi n proteinele din lapii petilor. Prin decarboxilare, pe

12

parcursul proceselor de putrefacie (sub aciunea bacteriilor) trece n diamina corespunztoare, cadaverina. Arginina(Arg)- are o grupare guanidino ncrcat pozitiv i este cel mai bazic aminoacid. Este prezent n compoziia tuturor proteinelor, cu precdere n cele mai simple din clasa protaminelor. Histidina(His)- are o grupare imidazol. Este singurul aminoacid cu o caten lateral ionizabil cu pka aproape de neutralitate. n multe reacii catalizate enzimatic, un rest de His faciliteaz reacia servind ca donor/acceptor de protoni. Este foarte rspndit n proteinele vegetale i animale, cu deosebire n sturin (12,9%) i n globulina hemoglobinei. Sub aciunea unor enzime trece, prin decarboxilare, n histamin. Acidul aspartic(Asp)- alturi de acidul glutamic, pot stabili ntre ei sau cu ali compui ionici interacii ionice, iar cu moleculele de ap - puni de hidrogen i interacii ion-dipol. n structura proteinelor, resturile acestor aminoacizi ionizai sunt orientate spre exteriorul conformaiei proteice. Asp este foarte rspndit n lumea vegetal, mai ales sub form de Asn. Acidul glutamic(Glu)- se gsete sub form de Gln, mult rspndit n proteinele vegetale (semine de cereale i drojdie). Are un rol important n metabolism. Se gsete n natur i sub forma D (n proteinele tumorilor canceroase) fiind cel mai rspndit aminoacid din seria D.

Aminoacizi proteici rari Din hidrolizatele de colagen, principala protein a esutului conjunctiv sau separat4-hidroxi-prolina i 5-hidroxi-lizina.
H N HO

COOH

4-hidroxi-prolina

13

6 5 4 3 2 1 NH2-CH2-CH-CH2-CH2-CH-COOH OH NH2 5-hidroxi-lizina n elastin, proteina fibroas gsit n majoritatea esuturilor conjunctive, se afl dezmozina i izodezmozina, care au o structur neobinuit, formndu-se n urma unor oxidri i condensri la care particip 4 resturi de lizin, introducndu-se n molecula elastinei o serie de legturi ncruciate. Dezmozina
H2N CH N (CH2)4 H2N HOOC (CH2) CH H2N COOH CH (CH2)4 N COOH

+
(CH2)4 CH

NH2 COOH

Izodezmozina

H2N CH

COOH

N (CH2)4 H2N HOOC CH (CH2)4 N

NH2 (CH2)4 (CH2)4 CH CH NH2 COOH COOH

14

Din hidrolizatele unor proteine moleculare s-au separat: 3-metil-histidina i

-N-metil-lizina. 3-metil-histidina
CH 3 N N C 2 H C H N 2 H C O O H

NH-(CH2)4-CH-COOH CH3 NH2

-N-metil-lizina

n hidrolizatele unor enzime de la procariote i eucariote a fost identificat seleno-cisteina (de ex. n hidrolizatul celor 2 formiat dehidrogenaze ale E. coli). NH2-CH-COOH CH2-Se-H Stereochimia aminoacizilor Stereoizomerii sunt izomeri ce difer numai prin aranjamentul spaial tridimensional al atomilor. Ei au aceeai formul molecular i aceleai legturi ntre atomi, numai c acestea sunt diferit aranjate n spaiu. Enantiomerii sunt o form de stereoizomeri, respectiv o pereche de stereoizomeri ce sunt chirali (asimetrici). O molecul chiral nu este superpozabil peste imaginea ei n oglind, astfel nct imaginea din oglind reprezint o alt molecul. n chimia organic, n general, originea comun a enantiomerilor este atomul de carbon tetraedric legat de 4 grupri diferite. Dac oricare 2 grupri

15

legate la atomul de carbon sunt identice, atunci i imaginea n oglind este aceeai. Stereoizomerii aminoacizilor n cazul tuturor aminoacizilor standard, cu excepia Gly, atomul de carbon este legat la 4 grupri diferite: - o grupare carboxil; - o grupare amino; - o grupare R (n cazul Gly R=H); - un atom de H. Existena a 4 substitueni diferii la atomul C i determin acestuia structura unui centru de asimetrie sau centru chiral, iar aminoacizilor le confer activitate optic, adic capacitatea de a roti planul luminii polarizate. Activitatea optic este o caracteristic a substanelor ce conin atomi de carbon hibridizai sp3 (simetrie tetraedric). Datorit aranjamentului tetraedric al orbitalilor n jurul atomului C, cele 4 grupri diferite pot ocupa 2 tipuri de aranjri spaiale, care sunt imagini n oglind una pentru cealalt (imagini nesuperpozabile), respectiv o pereche de enantiomeri. Activitatea optic, cuantificat prin rotaia planului luminii polarizate la trecerea prin soluia substanei respective, a fost msurat mult nainte ca structura tridimensional a moleculelor s poat fi determinat prin metode ca raze X, cromatografie, RMN. Determinarea experimental a activitii optice a evideniat posibilitatea ca soluiile de aminoacizi s roteasc planul luminii polarizate spre dreapta (d) sau spre stnga (l). Din punct de vedere istoric, notaiile d i l au fost utilizate iniial pentru desemnarea activitii optice a aminoacizilior astfel: - molecule dextrogire (d) sau prefix (+) n cazul n care rotesc planul luminii polarizate n sensul acelor de ceasornic cnd se privete dinspre sursa de lumin; - molecule levogire (l) sau prefix (-) n cazul n care rotesc planul luminii polarizate n sensul invers acelor de ceasornic. O msur cantitativ a activitii optice a unei molecule este rotaia specific: [] 25D = rotaia determinat (grade) / lc l = lungimea drumului optic parcurs de lumin; c = concentraia soluiei, n g/100 ml; 250C = temperatura la care s-a realizat determinarea; D = linia D a spectrului sodiului (589,3mm) = lumina monocromatic a polarimetrului

16

Configuraia absolut a gruprilor (aranjamentul spaial) din jurul unui centru asimetric a fost stabilit n 1891 de Emil Fischer, convenional n raport cu gliceraldehida. Astfel, simbolurile D i L au fost asociate cu configuraia absolut a unei substane de referin, aleas n mod arbitrar dar ceea ce trebuie subliniat este faptul c este vorba de desemnarea corect a configuraiei absolute a formelor dextro i levo ale gliceraldehidei. (Gliceraldehida este structur cu 3 atomi de carbon avnd un atom de carbon chiral central, ceea ce determin existena celor 2 enantiomeri D i L, n funcie de activitatea lor optic determinat de planul luminii polarizate ce trece prin soluia unuia dintre cei 2 stereoizomeri). Stereoizomerii (+) i (-) ai gliceraldehidei au fost notai D, respectiv L. Prin convenia Fischer-Rosanoff, pentru toi compuii chirali, stereoizomerii care au o configuraie asemntoare L-gliceraldehidei sunt denumii L i stereoizomerii asemntori D-gliceraldehidei sunt denumii D. Activitatea optic este specificat prin folosirea notaiilor (+) i (-). n cazul aminoacizilor, convenia D- i L- se definete prin raportarea structurii lor la structura D- i L- gliceraldehidei n urmtorul mod:

17

- atomul de C asimetric (C) al unui -aminoacid este aliniat cu atomul de C asimetric (C2) al gliceraldehidei. - gruprile chimice similare din cele 2 structuri sunt orientate n mod similar; astfel gruparea COOH a aminoacidului este aliniat paralel cu gruparea aldehidic (-CHO) a gliceraldehidei, gruparea -NH2 a aminoacidului este aliniat paralel cu gruparea hidroxil (-OH) ce se leag de atomul de carbon al gliceraldehidei. - gruprile variabile ale aminoacidului, respectiv radicalii R, sunt aliniai cu gruparea metanol (-CH2-OH) a gliceraldehidei. n aceast configuraie, gruparea -NH2 a oricrui L-aminoacid este localizat n partea stng i din punct de vedere spaial deasupra C, ntocmai cu gruparea OH legat de carbonul secundar (asimetric) al L-gliceraldehidei. n mod similar, se procedeaz n cazul D-aminoacizilor.

18

n concluzie, L-aminoacizii vor avea gruparea amino pe aceeai parte ca gruparea OH a L-gliceraldehidei, respectiv gruparea amino n partea stng. Daminoacizi se afl n acelai raport cu D-gliceraldehida, deci gruparea amino n partea dreapt. Metod mnemotehnic de identificare a izomerilor L- i D- prin legea CORN CORN este acronimul pentru COOH (gruparea carboxilic din structura principal a aminoacidului), -R (lanul secundar) i NH2 (azotul din gruparea amino a aminoacidului). Legea CORN permite determinarea prin tehnic mnemotic a izomerului optic al aminoacidului n funcie de ordinea n care se gsesc cele trei grupri ce dau numele acronimului CORN. Se procedeaz n felul urmtor: - se ia ca referin legtura H-C din structura aminoacidului; - privind de-a lungul legturii H-C se reface acronimul CORN, micnd privirea de la gruparea COOH, la R i apoi la amino; - dac acronimul CORN se realizeaz prin micarea privirii n sensul acelor de ceasornic, atunci moleculele sunt n forma izomerului D; - dac acronimul se realizeaz n sens invers izomer L.

19

Pe lng izomerii D- i L-, exist i izomerul meso. Dac formele D- i Lse afl ntr-un raport ca un obiect cu imaginea lui n oglind, forma meso are un plan de simetrie intern care d natere unei compensaii intramoleculare ce conduce la pierderea activitii optice. Izomerul meso nu exist n natur. Forma meso indic aminoacizii i derivaii lor care, dei conin grupri chirale, sunt achirali. Un amestec echimolar de compui D i L este un amestec racemic i este desemnat prin prefix DL sau prin prefix rac- sau prin prefix [+/-]. La fel ca i izoformele gliceraldehidei, aminoacizii sunt optic activi. n general, soluiile pure ale oricrui aminoacid standard vor roti planul luminii, la fel ca stereoizomerii gliceraldehidei. Totui, nu toi L-aminoacizii sunt levogiri, iar direcia de rotaie a luminii corespunztoare unui anumit aminoacid depinde de structura sa particular ntr-un mod greu previzibil. Cu alte cuvinte, unii aminoacizi sunt levogiri n timp ce alii sunt dextrogiri din complicate considerente structurale. n concluzie, aminoacizii standard sunt L-aminoacizii indiferent de proprietile lor optice particulare, structur bazat pe omologia lor structural cu L- i D-gliceraldehida. O molecul poate avea, ns, mai multe centre asimetrice. Pentru astfel de molecule, termenii de stereoizomerie i izomerie optic se refer la moleculele cu configuraii diferite la cel puin unul dintre centrele lor chirale. Deoarece fiecare centru asimetric dintr-o molecul chiral poate avea 2 configuraii posibile, o molecul cu n centre chirale poate avea 2n stereoizomeri diferii i 2n-1 perechi de enantiomeri Pentru moleculele cu mai mult dect un centru asimetric se recomand folosirea conveniei CAHN, INGOLD i PRELOG, introdus n 1956, n care cele 4 grupri substituente ale unui centru chiral sunt considerate printr-o schem

20

de prioritate specific pe baza numrului atomic al atomului legat direct de atomul de carbon asimetric, respectiv descreterea numrului atomic. Acest sistem utilizeaz simbolurile R (rectus-dreapta) i S (sinisterstnga). Configuraiile R i S sunt desemnate astfel: - pornind de la legtura cu substituentul ce are cea mai mic prioritate (cel mai mare numr atomic), configuraia R se regsete cnd ceilali 3 substitueni sunt aranjai (n ordine descresctoare) n sensul acelor de ceasornic; - forma S corespunde formei moleculare cnd substituenii sunt aranjai n sensul invers acelor de ceasornic. Cteva din regulile de determinare ale configuraiei R/S: Grupuri prioritare: SH>OH>NH2>COOH>CHO>CH2OH>C6H5>CH3>H Grupri mai mari sunt aranjate (ordonate) n funcie de punctele lor de divergen (respectiv de atomii ce i deosebesc), de ex: CH2-CH2-OH, deoarece numrul atomic al S>numrul atomic al O. Dac definirea stereochimiei izomerilor L i D este ntr-o anumit msur intuitiv, bazndu-se pe similitudinile dintre gruprile chimice a 2 tipuri de molecule, acest sistem (conversia R-S) este mai riguroas i este recomandat pentru analiza detaliat a stereochimiei. Conform acestei convenii, D-gliceraldehida poate fi descris ca Rgliceraldehid, iar L-gliceraldehida ca S-gliceraldehid. n consecin, configuraia L pe care o posed aminoacizii chirali din proteine, corespund aproape ntotdeauna formei S din sistemul R/S, deoarece n cazul majoritii aminoacizilor, ordinea prioritilor gruprilor din jurul C2 este: NH+3, COO-, R, H. n cazul sistemului R/S, modificarea unui singur substituent poate modifica ordinea, respectiv desemnarea izomerului. Acest lucru se ntmpl n cazul L-cisteinei i L-cistinei, cnd gruparea R precede COOH deoarece numrul atomic al sulfului ataat la C3 este mai mare dect cel al oxigenului ataat la C. Din aceast cauz, Cys i Cys-Cys fac excepie de la regula general a aminoacizilor standard, care sunt de tip 2S, aceti 2 aminoacizi fiind de tip 2R. L cisteina Glicina

21

Treonina i izoleucina au cte 2 centre chirale i deci 22= 4 stereoizomeri posibili, avnd i la C3 un carbon asimetric. Configuraia absolut a Thr din proteinele normale, respectiv a L-Thr, este

L treonina

L - izoleucina

2S, 3R, iar a enantiomerului (compusul corespunztor imaginii n oglind) este D-Thr (2R, 3S). n cazul Thr, perechile L i D de enantiomeri sunt diastereoizomeri cu Lalo i D-alo Thr. Formele D i L pe de o parte i formele D-alo i L-alo pe de alt parte se gsesc n aceeai relaie cu un obiect i imaginea lui n oglind. Diastereoizomerul cu configuraia 2S, 3S se numete L aloThr, iar cel cu configuraia 2R, 3R se numete D-aloThr. n cazul Ile, configuraia normal a L-Ile este 2S, 3S. n contrast cu cazul perechilor de enantiomeri, diastereoizomerii se deosebesc prin unii parametrii fizico-chimici: puncte de topire, spectre, reactivitate chimic. Importana enantiomerilor Toi -aminoacizii obinui prin hidroliza proteinelor au configuraia stereochimic L, dar nu toi L-aminoacizii sunt levogiri. De ex., n hidrolizatele proteice se regsesc L (+)-Ala, L (+)-Val, L (+)-Ile, dar L (-)-Leu, L (-)-Phe, L (-)-Ser. n cele mai multe cazuri, enantiomerii au proprieti fizice i chimice identice. Totui, diferenele dintre cei 2 enantiomeri pot avea un impact imens, n

22

special n cazul sistemelor biologice, deoarece multe molecule biologice importante sunt chirale. Cum toi aminoacizii naturali exist ntr-una sau alta din formele de enantiomeri, prin extensie, toate proteinele i enzimele sunt de asemenea chirale. Distincia dintre cei 2 enantiomeri este de multe ori critic din punct de vedere a supravieuirii organismului, nct exist unele microorganisme care utilizeaz D-aminoacizi pentru sinteza unor peptide ce sunt toxice pentru alte organisme. Astfel, D-aminoacizii sunt importani n structurile multor antibiotice, de tipul bacitracinei, gramicidinei, actinomicinelor. Rinichii animalelor au capacitatea de a distruge D-aminoacizii, eliminnd orice posibilitate de sintez a unor peptide toxice. D-aminoacizii sunt legai de 2 probleme biologice majore: cancerul i senescena: - s-a pus n eviden c proteinele tumorale conin D-aminoacizi; - s-a emis ipoteza c meninerea gradului de puritate a izomerilor optici este n corelaie cu vrsta i vitalitatea organismului animal.

Proprietile fizice ale aminoacizilor Aminoacizii care se ntlnesc n structura proteinelor native au fost izolai sub form de substane incolore, cristalizate, stabile n stare solid i la temperatura mediului ambiant (250C). Aminoacizii sunt substane solubile n ap, ns gradul de solubilitate este diferit de la un aminoacid la altul. Solubilitatea cea mai mic n ap o are cisteina i tirozina, iar cea mai mare-prolina i oxiprolina. Prolina este singurul aminoacid cu o solubilitate bun n alcool (aproximativ 1,6g la 100ml, la temperatura de 200C), n timp ce restul aminoacizilor se dizolv foarte greu n alcool. Clorhidraii i diclorhidraii aminoacizilor sunt mult mai solubili n ap dect aminoacizii corespunztori n stare liber; majoritatea clorhidrailor sunt solubili i n etanol. Srurile de sodiu ale aminoacizilor sunt, de asemenea, mai uor solubile n ap dect aminoacizii liberi din care provin. n soluii slab alcaline sau acide, toi aminoacizii sunt uor solubili. Cu toate acestea, dup o anumit perioad de timp unii aminoacizi sunt oxidai (triptofanul, cisteina i altele) sau se descompun parial (serina, treonina, etc.).

23

Aceste transformri se ntlnesc i n cazul hidrolizei acide sau alcaline a proteinelor cnd aceti aminoacizi sufer modificri chimice sau sunt racemizai. De remarcat faptul c triptofanul pur n soluii acide este stabil, n timp ce n amestecuri sau n hidrolizatele proteice se oxideaz. Aminoacizii sunt substane cu caracter amfoter datorit prezenei concomitente n molecul a unei grupri funcionale acide (-COOH) i a unei grupri funcionale bazice (-NH2). De aceea, moleculele de aminoacizi au structura unor amfioni bipolari de forma: R
+

H3N-CH-COOExistena ionului bipolar explic utilizarea aminoacizilor pentru prepararea soluiilor tampon: R H3N-CH-COO + (Cl ) + H3O Acid Baz tare tare
+

R + H3N-CH-COOH + H2O + (Cl-) Acid slab Baz slab

R + H3N-CH-COO- + (Na+) + OHAcid tare Baz tare

R H2N-CH-COO- + H2O + (Na+) Baz slab Acid slab

Dac la soluia aminoacizilor se adaug un acid tare, de ex. HCl, protonii si sunt consumai dnd natere unui acid slab, iar dac se adaug o baz tare, de ex. NaOH, ionii hidroxil sunt consumai concomitent cu formarea unei baze slabe. n acest mod, pH-ul soluiei nu variaz apreciabil, aminoacizii ndeplinindu-i rolul de soluie tampon. Proprietile acido-bazice Aminoacizii au cel puin 2 grupri ionizabile. Astfel, gruparea acid ionizeaz conform ecuaiei: HA A- + H+

24

descris de ka =[ A-] [ H+]/ [ HA ](1) Logaritmnd ecuaia se obine: log ka= log [H+] + log [A-] /[HA] (2) Rescriind ecuaia 2: pH = pka + log [A-]/[HA]ec. HendersonHasselbalch ce stabilete o corelaie ntre pH soluiei unui acid, constanta sa de aciditate ka i raportul concentraiei bazei sale conjugate i a acidului n condiii de echilibru. Gruparea carboxil din poziia a acizilor monoaminomonocarboxilici este un acid mai puternic dect gruparea COOH a acizilor alifatici corespunztori, datorit gruprii amino din poziia i sarcinii sale pozitive, care produce un puternic efect de cmp, crescndastfel tendina hidrogenului carboxilic de a discocia ca proton (efect IS). Gruparea amino din poziia a acizilor monoaminomonocarboxilici este o baz mai slab (sau un acid mai tare) dect gruparea amino a aminelor alifatice corespunztoare. Toi aminoacizii monoaminomonocarboxilici (mNH2mCOOH) cu radicali R nencrcai au valori pk1 i pk2 aproape identice. Nici unul dintre aminoacizi mNH2mCOOH nu au capacitate de tamponare n jurul pH-ului fiziologic, ntre pH 6 i pH 8. El prezenta capacitate de tamponare la pH apropiat de valorile pk, ntre pH 1,3-3, i 8,6-10,6. Singurul aminoacid cu putere de tamponare semnificativ ntre pH 6 i 8 este histidina. Gruparea -carboxil a acidului aspartic i -carboxil a acidului glutamic, dei complet ionizate la pH 7, au valori pka considerabil mai mari dect valorile pka ale gruprilor -COOH i aproape egale cu cele ale acizilor carboxilici simpli. Gruparea tiol a cisteinei i gruparea p-hidroxil a tirozinei sunt foarte slab acide. La pH 7, prima este ionizat n proporie de aproximativ 8%, iar a doua de 0,01%. Gruparea -amino a lizinei i gruparea guanidinice a argininei sunt puternic bazice; aceste grupri cedeaz protoni numai la valori foarte ridicate ale pH-ului. La pH 7 aceti aminoacizi prezint o sarcin net pozitiv. Proprietile spectrale ale aminoacizilor Nici unul dintre cei 20 aminoacizi standard nu prezint absorbie n vizibil. Trei aminoacizi: Tyr, Trp i ntr-o msur mai mic Phe absorb n UV. Cys-Cys prezint o absorbie slab la 240 nm datorit punilor disulfurice. Toi aminoacizii absorb n UV ndeprtat (220nm).

25

Valoarea pH-ului soluiei aminoacizilor are un efect major asupra maximului de absorbie, de aceea dozrile spectrofotometrice se realizeaz n soluii alcaline. Punctele de intersecie ale curbelor de absorbie sunt la 257nm i 294nm. La aceste puncte, valorile extinciei sunt proporionale cu coninutul total de Tyr i Trp. La 280nm, concentraia celor 2 aminoacizi poate fi calculat dup formula lui GOLWIN i MORTON: E280= y EM1+ (x-y) EM2 unde x = moli totali/l y = moli Tyr/l (x-y) = moli Trp/l EM1 i EM2 = extinciile molare ale Tyr i Trp n soluie alcalin (0,1N la 280nm). ntruct majoritatea proteinelor conin resturi de Tyr, determinarea DO280nm a unei soluii proteice reprezint o metod de determinare a concentraiei proteice.

Proprietile chimice ale aminoacizilor Reaciile caracteristice ale aminoacizilor sunt cele ale gruprilor funcionale prezente n structura general a aminoacizilor, i anume gruprile COOH, -NH2 i R din lanurile laterale. De aceea, proprietile chimice ale aminoacizilor sunt comune, n general, i sunt utilizate n chimia proteinelor pentru: - identificarea i analiza aminoacizilor din extracte, hidrolizate i lichide biologice; - identificarea secvenei de aminoacizi n moleculele proteice, - identificarea resturilor de aminoacizi specifici proteinelor native, care sunt eseniali pentru funcia biologic; - identificarea resturilor de aminoacizi din molecula proteic n vederea producerii de modificri ale activitii biologice sau ale altor proprieti ale proteinei. A) Reacii ale gruprii carboxil Gruprile COOH din structura aminoacizilor reacioneaz cu metale, oxizi metalici, hidroxizi etc.

26

Din punct de vedere biochimic, o reacie important este cea de decarboxilare a aminoacizilor cu formare de amine. In vivo, reacia are loc sub aciunea enzimelor specifice, decarboxilaze, care sunt piridoxal-5-fosfat dependente. De exemplu, prin decarboxilarea histidinei se obine histamina, care este implicat n reaciile alergice. Histamina este un agent vasodilatator, crete permeabilitatea vaselor sanguine provocnd pierderea proteinelor din plasm n spaiul extracelular, crete viteza btilor inimii, scade presiunea arterial. Forma acut a acestor simptome se numete oc histaminic. O alt reacie a gruprilor carboxil din structura aminoacizilor care prezint importan practic n biochimie este reacia de esterificare, ce este folosit pentru protejarea gruprilor carboxil n cazul sintezei peptidelor. Esterii metil-, etil-, benzil-, p-nitrobenzil- i t-butil ai aminoacizilor sunt cei mai frecvent utilizai n sinteza peptidelor. B) Reacii ale gruprii amino Datorit prezenei n molecula aminoacizilor a gruprii NH2, acetia pot reaciona cu acidul azotos (HNO2) cu formare de azot molecular i a hidroxiacidului corespunztor: NH2 OH R-CH-COOH + HONO R-CH-COOH + N2 + H2O Aceast reacie st la baza metodei van Slyke de determinare a azotului aminic al aminoacizilor prin msurarea volumului de azot degajat n timpul reaciei. Clorurile acide acileaz gruparea amino a aminoacizilor, astfel clorura de benzoil reacioneaz cu glicina formnd acidul hipuric, forma de excreie a acidului benzoic. C6H5-CO-Cl + NH2-CH2-COOH + NaOHC6H5-CO-NH-CH2-COOH + NaCl + H2O Metilarea aminoacizilor conduce la betaine, care sunt ageni de metilare n reaciile biochimice: + CH2-COO + 3CH3I + 3NaOH(CH3)3N-CH2-COO- + 3NaI + 3H2O + NH3

27

Aminoacizii reacioneaz cu dioxidul de carbon. Aceast reacie se regsete n cazul funciei hemoglobinei de transport a acestui gaz de la esuturile periferice la plmni.
NaOH

R-CH-COO Na + CO2 NH2

R-CH-COO-Na+

NH-COO-Na+ derivat carbamino Gruprile -amino ale aminoacizilor reacioneaz reversibil cu aldehidele, formnd compui numii baze Schiff, care apar ca intermediari ai unor reacii enzimatice n cazul n care substratul este un compus carbonilic, iar enzima are n centrul catalitic activ un rest de lizin. Baza Schiff poate fi redus n prezena LiBH4, formndu-se un produs separabil, ceea ce n cazul particular al compusuui intermediar dintre substrat i enzim permite separarea complexului E-S. R-CH=O + R-CH-NH2 R-CH-N=CH-R +H2O COOH COOH

C) Reacii ale gruprilor R Gruprile R ale aminoacizilor conin, de asemenea, radicali reactivi care pot participa la diferite tipuri de reacii. De exemplu, cisteina poate reaciona cu sruri ale metalelor grele (Ag, Pb sau Hg). Din reacia Cys cu clorura mercuric se formeaz un mercaptan (cloromercuri-cisteina). NH2-CH-COOH + HgCl2 NH2-CH-COOH +HCl CH2-SH CH2-S-HgCl

28

Reacii de identificare a aminoacizilor Reacii generale de identificare a aminoacizilor a) Reacia cu acidul azotos (metoda van Slyke) (vezi Reacii ale gruprii amino) Obs. n cazul glicinei (un aminoacid alifatic) se constat o puternic eliberare de azot gazos n cazul tirozinei (un aminoacid aromatic) se formeaz, ntr-o prim etap, o sare de diazoniu, care prin nclzire se descompune n azot i acid p-hidroxifenilen beta lactic. b) Reacia cu ninhidrina este cea mai comun reacie de detecie i de dozare cantitativ a unui aminoacid. Ninhidrina (tricetohidrinden hidrat) este un puternic agent oxidant, care reacioneaz cu toi -aminoacizii i determin dezaminarea oxidativ a acestora, reacie nsoit de eliberarea de NH3, CO2 i de formarea aldehidei corespunztoare i a formei reduse a ninhidrinei. Reacia are loc n domeniu de pH 4-8 i se formeaz compui colorai n albastru-violet (purpura lui Ruhemann). Excepie, fac iminoacizii- prolina i hidroxiprolina care n urma reaciei cu ninhidrina formeaz o serie de compui colorai n galben. n timpul reaciei: - are loc dezaminarea i decarboxilarea aminoacizilor, sub aciunea oxidant a ninhidrinei, nsoit de eliberarea de CO2 i NH3; aminoacidul trece prin strile intermediare de acid -iminic i de acid -cetonic (grupare carbonil la C).

COOH H-C-NH2 R
-2H+

COOH C=NH R
NH3

COOH C=O R
CO2

R C=O H

29

- concomitent, ninhidrina este redus; ninhidrina redus condenseaz cu un al doilea mol de ninhidrin i reacioneaz cu amoniacul eliberat pe parcursul reaciei de dezaminare a aminoacidului, formnd o substan purpurie ce are absorbia maxim la 570nm. Prolina formeaz un compus galben cu maxim de absorbie la 440nm.
O OH OH O ninhidrina H+

O H OH O ninhidrina redusa -H2O

OHH OH O a doua molecula de ninhidrina

O HO O O

NH3 -H2O

O N

OH

produs de condensare (hidrindantina)

purpura lui Ruhemann

4) Reacia cu prolina
O OH OH O ninhidrina prolina

H N

COOH O-

CO2

compus galben

30

Reacia aminoacizilor cu ninhidrina este foarte sensibil i este frecvent utilizat pentru identificarea aminoacizilor. Deoarece absorbia este proporional cu cantitatea de aminoacid prezent n prob, aceast reacie furnizeaz o metod colorimetric de dozare cantitativ a aminoacizilor. Reacii specifice de identificare a aminoacizilor Denumire Reactani Reacia Millon HgNO3 cu urme de HNO2 Reacia xantoHNO3 conc. la fierbere proteic Reacia Hopkins-Cole Denumire Reacia Erlich Reacia Sakaguchi Reacia cu nitroprusiat de sodiu Na2Fe(CN)5NO Reacia Sullivan Reacia Pauly Reacia FolinCioclteu Reacia Ellman acid glioxilic n H2SO4 conc. Reactani p-dimetilaminobenzaldehid n HCl conc. -naftol i NaClO nitroprusiat de Na n NH3 diluat 1,3-naftochinon-4-sulfonat de sodiu i hidrosulfit de sodiu acid sulfanilic diazotat, n mediu alcalin acid fosfomolibdotungstic acid 5,5-ditio-bis-2-nitro benzoic Aminoacid Tyr Tyr Trp Phe Trp Aminoacid Trp Arg Cys Culoare rou galben purpuriu Culoare albastru rou rou

Cys His Tyr Tyr Cys

rou rou albastru

31

Metode de determinare cantitativ a aminoacizilor Metode microbiologice Multe microorganisme cresc i se dezvolt pe medii ce includ cantiti adecvate de aminoacizi, vitamine, sruri, baze purinice i pirimidinice. Multe bacterii cresc cu o vitez sczut cnd unul dintre aminoacizii eseniali este prezent n cantiti mai mici dect cea optim. Pornind de la aceast constatare experimental, se poate determina cantitativ un aminoacid n urmtorul mod: - I experien: se realizeaz un studiu al variaiei vitezei de cretere a unei bacterii n funcie de diferite cantiti cunoscute din aminoacidul ce urmeaz a fi determinat; - II experien: se determin viteza de cretere a bacteriei n medii n care s-au introdus cantiti variabile dintr-un amestec de aminoacizi ce conin i aminoacidul ce urmeaz a fi determinat; - calcularea rezultatelor: prin compararea vitezelor de cretere n cele 2 tipuri de experiene se poate calcula cantitatea de aminoacid din amestec. Viteza de cretere a unei bacterii n mediu lichid poate fi determinat prin msurarea creterii turbiditii suspensiei celulare n mediul de cultur sau prin determinarea concentraiei unui produs al metabolismului ei. Metode enzimatice Cele mai precise i sensibile metode de dozare a aminoacizilor utilizeaz enzime ce caracterizez transformarea unui singur aminoacid (chiar a unui singur stereoizomer al acestuia), cum ar fi decarboxilazele i dezaminazele.
decarboxilazaza

R-CH-COOH NH2 aminoacid

R-CH2-NH2 + CO2 amin

dezaminaz

R-CH-COOH + A + H2O NH2

R-C=O + NH3 + AH2 COOH cetoacid

32

Metode cromatografice Metoda cromatografic este o metod fizico-chimic de separare a unor amestecuri lichide sau gazoase n zone separate spaial i se bazeaz pe diferena funciilor de repartiie a substanelor ntre 2 faze: lichid-lichid, lichid-gel, gazlichid la suprafaa unei faze solide. Repartiia ntre 2 faze se repet n mod continuu n diferitele puncte ale fazei staionare prin care curge amestecul ce trebuie separat. n cazul aminoacizilor se folosesc 2 tipuri de cromatografii: cromatografia pe hrtie i cromatografia n strat subire. Cele 2 metode cromatografice sunt similare att din punct de vedere al principiului metodei, ct i din punct de vedere experimental, diferena constnd n natura fazei staionare (suportul) care n primul caz este hrtia cromatografic (de obicei hrtie Whatmann 1,2,3), iar n cel de-al doilea caz este un oxid de siliciu (de obicei, Silicagel). Dup direcia de migrare se deosebesc mai multe tipuri de cromatografie: - ascendent: cnd solventul migreaz de jos n sus; - descendent: cnd direcia de migrare a solventului este de sus n jos; - radial i sferic: cnd se utilizeaz rondele de hrtie sau sfere compacte ale acesteia. Dup numrul de migrri ale solventului: - cromatografie unidimensional - cromatografie bidimensional (solventul migreaz n dou direcii diferite i perpendiculare una pe alta). Etape ale cromatografiei 1. obinerea amestecului de aminoacizi (de exemplu prin extracii de material vegetal sau din ser) 2. aplicarea probelor (0,2-0,4mg protein) 3. irigarea hrtiei sau plcii cromatografice cu un amestec de solveni, care reprezint faza mobil 4. uscarea cromatogramelor 5. revelare cu o soluie de ninhidrin 0,2-0,3% n alcool 960 prin pulverizare. 6. uscare 7. determinare calitativ: spoturile colorate ce apar corespund diverilor aminoacizi din amestecul de analizat. Identificarea aminoacizilor se face prin determinarea valorii Rf (factor de retenie)

33

Rf = distana parcurs de o component a amestecului/distana parcurs de frontul solventului Pentru un compus, valoarea Rf reprezint n condiii bine standardizate o constant caracteristic prin care se poate identifica un anumit aminoacid prin determinarea experimental a valorii Rf i compararea acesteia cu valorile din tabele sau prin comparare cu un standard sau etalon al aminoacidului pur respectiv, ce a fost tratat n mod similar cu amestecul de analizat. Deoarece unii aminoacizi au n anumite amestecuri de solveni valori Rf foarte apropiate, separarea lor necesit realizarea unei cromatograme bidimensionale, folosind succesiv 2 solveni de irigare diferii, astfel alei nct unul din cei 2 compui s aib valori Rf diferite n unul din solveni. 8. determinarea cantitativ se face prin eluia petelor (spoturilor) i anume: pe hrtia cromatografic se depunde fiecare prob n dublu exemplar, iar dup irigare se developeaz numai una, obinndu-se spoturi corespunztoare aminoacizilor. Probele nedevelopate se identific prin comparaie cu nivelul spoturilor colorate, se taie i se elueaz n eprubete cu ap distilat, la temperatura camerei timp de 15 minute. Probele se trateaz cu CdCl2. Eluia se mai poate realiza i dup developarea cu ninhidrin.

34