Tehnica PCR

Reactia de polimerizare in lant PCR (polimerase chain reaction) are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a ADN.

Tehnica consta

in generarea rapida a unor copii

multiple a unei secvente nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes sau un patogen specific.

 Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special, iar amestecul de reactie trebuie sa contina urmatoarele elemente: - ADN sau ARN tinta: extras din proba in cursul etapei de prelucrare - O enzima care faciliteaza sinteza lantului complementar de acid nucleic (ADN polimeraza Taq pentru o tinta ADN sau RTth ADN polimeraza pentru o tinta ARN)

- Cofactori enzimatici: Mg2+ si/sau Mn2+

- Primeri (P1 si P2): sunt secvente scurte de20-30 nucleotide; ei servesc ca punct de plecare pentru sinteza lantului complementar cu ajutorul ADN polimerazei, marcand inceputul si sfarsitul regiunii care trebuie sa fie amplificata;

- Deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP): folosite pentru sinteza noii catene ADN prin atasarea lor la capatul primerilor;

- Amperaza: enzima care promoveaza amplificarea selectiva a tintei si distrugerea produsilor de contaminare din cursul reactiilor de amplificare anterioare

Reactia PCR se desfasoara in 3 etape:

1.Denaturarea 2. Hibridizarea primerilor 3. Elongatia

DENATURAREA ADN-ULUI 94-98 C, timp de 20-30 de secunde ADN-ul dublu catenar este desfasurat in doua lanturi complementare, de care se vor lega apoi primerii La sfarsitul acestei etape in mediul de reactie vor fi prezente doua lanturi ADN monocatenare

HIBRIDIZAREA PRIMERILOR Se scade temperatura la 50-65 C, timp de 2040 de secunde Primerii sunt in exces in mediul de reactie Se vor atasa complementar la capetele 3 ale celor 2 catene

ELONGATIA Temperatura depinde de ADN-polimeraza (de obicei 72C) ADN-polimeraza:

Se leaga de lantul hibrid Citeste secvena lantului ADN-tinta Alungeste primerii prin adaugarea de dNTP, pe baza regulii complementaritatii

Procesul global de amplificare este divizat in 3 faze:

- Exponentiala: la fiecare ciclu se dubleaza cantitatea de amplicon ADN; - Lineara: pe masura ce componentele reactiei sunt consumate, se produce o incetinire a reactiei iar produsii PCR incep sa se degradeze; - Platou (end-point): reactia este stopata, nu se mai formeaza alti produsi de amplificare, iar daca faza se prelungeste mult produsii PCR vor suferi o degradare importanta.