UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CRAIOVA Domeniul: Medicin

TEZ DE DOCTORAT CARCINOMUL MAMAR DUCTAL INVAZIV CORELAII ALE FACTORILOR PROGNOSTICI CLINICO-PATOLOGICI CU IMUNOEXPRESIA RECEPTORILOR HORMONALI I A ONCOPROTEINEI Her2/neu

REZUMAT

Conducator tiinific Prof. Univ. Dr. Cristiana Simionescu Doctorand Felicia Recreanu

CRAIOVA, 2011

CUPRINS
Introducere......................................................................................................................4

STADIUL CUNOATERII Capitolul I. Consideraii epidemiologice i factori de risc n cancerul mamar I.1. Epidemiologia cancerului mamar....................................................................... 7 I.2. Factori de risc asociai cancerului mamar......................................................... 8

Capitolul II. Carcinogeneza mamar II.1. Date actuale n acarcinogeneza mamar........................................................... 15 II.2. Rolul estrogenilor n carcinogeneza mamar................................................... 22

Capitolul III. Factori prognostici n cancerul mamar.............................................. 31

Capitolul IV. Sisteme de clasificare a carcinoamelor mamare IV.1. Clasificarea histologic a tumorilor mamare.................................................. 40 IV.2. Clasificarea molecular a carcinoaleor mamare............................................. 44

CONTRIBUTII PERSONALE Scopul tezei i obiectivele urmrite............................................................................ 47

Capitolul V. Material i metode V.1. Materialul cercetat.............................................................................................. 49 V.2. Metode utilizate n cercetare............................................................................... 50

Capitolul VI. Rezultate VI.A. Rezultatele studiului clinico-morfologic.......................................................... 60 VI.B. Rezultatele studiului imunohistochimic........................................................... 77 VI.B1. Evaluarea expresiei receptorilor hormonali (ER;PR) i corelaia lor cu parametrii clinico-morfologici................................................................................... 78 VI.B2. Evaluarea statusului Her2/neu i corelaia cu parametrii clinicomorfologici................................................................................................................... 85 2

VI.B3.Evaluarea comparativ a receptorilor hormonali, Her2/neu i a parametrilor clinico-mofologici......................................................................... 89 VI.B4. Evaluarea indicelui de proliferare Ki67 i corelaia cu factorii de prognostic clinico-morfologici............................................................... 98

Capitolul VII. Discuii VII.A. Analiza rezultatelor studiului morfo-clinic............................................... VII.B. Analiza rezultatelor studiului imunohistochimic..................................... VII.B1. Analiza receptorilor pentru estrogen i progesteron............................. VII.B2. Analiza statusului oncoproteinei Her2/neu............................................. VII.B3. Analiza comparativ pentru receptorii hormonali i Her2/neu........... VII.B4. Analiza capacitii proliferative a tumorilor mamare i aportul Ki67 la diferenierea subtipurilor moleculare....................................... 146 103 120 121 132 138

Capitolul VIII. Concluzii......................................................................................... 149

Bibliografie selectiv................................................................................................ 154 Lucrri personale din domeniul tezei..................................................................... 187

INTRODUCERE
Cancerul mamar este cea mai frecvent tumor malign ntlnit la femei, cu

mortalitate i morbiditate n continu cretere, chiar dac ultimii ani au nregistrat progrese remarcabile n stabilirea diagnosticului i n conduita terapeutic. n ultimele decenii a existat o preocupare continu n sensul depistrii precoce a cancerului mamar i a dezvoltrii unor modaliti eficiente de tratament care s duc la un declin al deceselor prin cancer mamar i la o mbuntire a calitii vieii n cazul femeilor care lupt cu aceast boal. Alturi de diagnosticul histopatologic convenional care gradeaz tumorile mamare maligne i le clasific n subtipuri microscopice, un progres semnificativ n evaluarea prognostic a acestor paciente a fost nregistrat odat cu investigarea unor markeri

imunohistochimici implicai n carcinogeneza tumoral. Statusul receptorilor hormonali i expresia Her2/neu au un impact direct asupra terapiei i se coreleaz semnificativ cu subtipurile histopatologice ale carcinomului mamar. Alturi de aportul adus n nelegerea evoluiei biologice a acestei boli, studierea imunohistochimic a markerilor biologici are i avantajul impactului imediat n strategia terapeutic, prezena receptorilor hormonali asigurnd selectarea pacientelor care vor

beneficia de terapie hormonal iar statusul oncoproteinei Her2 fiind corelat cu predicia rspunsului la terapia cu trastuzumab, acest anticorp devenind o opiune terapeutic important pentru pacientele cu cancer mamar care prezint supraexpresia genei Her2/neu.

ROLUL ESTROGENILOR N CARCINOGENEZA MAMAR

Numeroase studii analizeaz relaia dintre expunerea la estrogen i riscul dezvoltrii cancerului mamar, mecanismele implicate i urmrile clinice ale acestei expuneri - asocierea ntre riscul cancerului mamar i nivelele serice persistent crescute ale estrogenului fiind constant ntlnit. Plecnd de la estrogen, mecanismul carcinogenezei include metabolismul estrogenului ctre metabolii genotoxici, mutageni cu rol n stimularea creterii tisulare. mpreun, aceste mecanisme cauzeaz iniierea, promoia i progresia carcinogenezei. O serie de factori de risc de natur endocrin sunt constant asociai cu riscul crescut al cancerului mamar n rndul femeilor n postmenopauz.[187] Unul din aceti factori este obezitatea, ca urmare a producerii de estrogen n cantitate mare prin activarea aromatazei n esutul adipos de la nivelul glandei mamare. Alturi de nivelele serice crescute ale estrogenilor endogeni, se constituie n factori de risc i nivelele serice mai mari dect normalul ale androstendiolului i testosteronului, androgeni care pot fi convertii direct prin aromataz n estron estrogeni i respectiv n estradiol. Nivele urinare crescute ale estrogenilor i androgenilor sunt de asemenea asociate cu risc crescut de cancer mamar la femeile n postmenopauz.[129] Nivelul seric crescut al progesteronului nu asociaz risc crescut la femeile n postmenopauz, ns pare a fi invers asociat cu cancerul mamar la femeile n premenopauz.[87,115] Toate aceste observaii susin ipoteza c expunerea excesiv i cumulativ la estrogeni endogeni pe parcursul vieii contribuie i poate fi factor cauzal al cancerului mamar. Studii efectuate pe roztoare au demonstrat rolul carcinogenetic al estrogenilor i metaboliilor acestora asupra anumitor esuturi, inclusiv glanda mamar.[187,176] Sunt descrise 2 ci patogenice, diferite dar complementare, ambele implicate n carcinogeneza estrogen-indus, n iniierea, promovarea sau progresia cancerului mamar. Prima cale este reprezentat de calea metaboliilor de estrogen iar a doua cale patogenic a carcinogenezei estrogen-induse este reprezentat de semnalizarea receptor de estrogen-mediat. Cele 2 ci se pot intrica prin faptul c metaboliii de catecol estrogen pot fi implicai n controlul cilor de expresie genic i/sau semnalizare prin intermediul receptorilor de estrogen. Mecanismele prin care estrogenii contribuie n fiecare faz a procesului carcinogenetic sunt complexe. Studiile sugereaz participarea metaboliilor genotoxici de estrogen i semnalelor genomice i nongenomice estrogen receptor-mediate care afecteaz proliferarea celular i apoptoza n 5

esutul mamar. Modul n care aceste 2 ci contribuie la carcinogeneza estrogen mediat i felul n care polimorfismul genic i factorii de mediu modific desfurarea acestor ci, necesit studii suplimentare. Cunoaterea rolului central al estrogenilor n cancerul mamar a dus la dezvoltarea de noi modaliti de prevenie i terapie care blocheaz funcionarea receptorilor i reduc nivelurile de estrogeni endogeni prin inhibarea sintezei. Dezvoltarea unor strategii suplimentare pe baza inhibrii metabolismului estrogenului, inactivarea quininelor reactive i inhibarea specific a cilor de semnalizare a receptorilor estrogenici membranari vor conduce la dezvoltarea unor noi modaliti terapeutice.

MOTIVAIA I SCOPUL STUDIULUI

n studiul efectuat am urmrit evaluarea parametrilor clinico-morfologici care au caracterizat lotul de studiu precum i expresia receptorilor hormonali (ER i PR) i a Her2/neu, prin ncadrarea lor n grupuri cu imunofenotip specific ce au fost raportate la clasificarea molecular. Cazurile au fost analizate i sub aspectul capacitii proliferative, cuantificat prin indicele de proliferare Ki67 i raportarea lui la parametrii clinicomorfologici luai n studiu. Pentru realizarea scopului propus, am urmrit urmtoarele obiective specifice: Stabilirea lotului de studiu cu nscrierea principalilor parametrii clinico-morfologici ntr-o baz electronic de date. Evaluarea celor mai importani factori de prognostic evaluai histopatologic. Stabilirea lotului de studiu imunohistochimic i analiza expresiei receptorilor hormonali, a oncoproteinei Her2/neu i a indicelui de proliferare Ki67, urmate de corelarea acestora cu parametrii clinico-morfologici luai n studiu. ncadrarea cazurilor n clasificarea molecular i raportarea claselor moleculare la parametrii clinico-morfologici analizai. Analiza statistic care a permis identificarea corelaiilor statistic semnificative ntre parametrii morfologici i imunohistochimici reprezentativi pentru cancerul mamar. Corelarea rezultatele furnizate de studiul histopatologic cu cele obinute prin studiul imunohistochimic, evideniind astfel complementaritatea acestor tehnici dar i importana practic a fiecreia dintre ele.

MATERIAL I METODE

A. MATERIALUL STUDIAT Lotul studiat a inclus un numr de 380 de carcinoame mamare ductal invazive tip NOS diagnosticate n intervalul 2005-2009, n cadrul Serviciului de Anatomie Patologic al Spitalului Clinic Universitar de Urgen Craiova, materialul biologic fiind reprezentat de parenchim mamar i coninutul axilei, provenit de la paciente internate n clinicile de ginecologie i chirurgie ale aceluiai spital.

B. METODE UTLIZATE Piesele au fost prelucrate prin metoda clasic de includere la parafin i colorare cu Hemalaum-Eozin, realizndu-se de asemenea i coloraia Giemsa care a permis evaluarea cu acuratee a metastazelor ganglionare. Analiza histopatologic s-a realizat pe un lot de 380 de carcimoame mamare ductal invazive tip NOS confirmate microscopic i a urmrit urmtoarele aspecte: dimensiunile tumorale, gradul de difereniere, leziuni preinvazive asociate, invazii perineurale i intravasculare, statusul ganglionilor limfatici, existena metastazelor la distan, ncadrarea cazurilor n clasificarea pTNM i n stadii de evoluie. Analiza imonohistochimic s-a realizat pe un lot de 75 de cazuri selectate, criteriile de excludere utilizate fiind reprezentate de existena zonelor de necroz i/sau a ulceraiilor extensive la nivel tumoral. S-a utilizat metoda de lucru indirect n doi timpi, folosind tehnica EnVision de amplificare polimeric. n acest studiu am utilizat urmtorii anticorpi, redai n tabelul 1. Anticorpul Her 2 ER PR Ki67 Clona policlonal 1D5 PgR 636 MIB-1 Diluia 1:250 1:50 1:50 1:10 Pretratament 5 cicli MW n tampon citrat Timp de incubare 30 min TA

5 cicli MW n tampon EDTA 1 or la 370C 5 cicli MW n tampon EDTA 1 or la 370C 5 cicli MW ]n tampon citrat 30 min TA

Tabel nr.1. Panel de anticorpi utilizai

Analiza statistic a utilizat coeficieni de corelaie (Pearson) i teste de comparaie a mediilor (testul t Student). Pentru aprecierea dependenei dintre doi factori de clasificare au fost realizate tabele de inciden care au fost interpretate cu ajutorul testului Chi ptrat.

REZULTATE

VI.A. REZULTATELE STUDIULUI CLINICO-MORFOLOGIC

Urmrind distribuia cazuisticii pe ani calendaristici, am observat o cretere progresiv a incidenei cancerului mamar, de la 57 de cazuri n 2005 la 95 de cazuri n 2009.(tabel nr.2) Anul Nr. cazuri Procente% 2005 57 15 2006 68 17,8 2007 76 20 2008 84 22 2009 95 25

Tabel nr.2. Distribuia cazurilor pe ani calendaristici n ceea ce privete distribuia pe sexe a cazurilor studiate, majoritatea tumorilor a fost diagnosticat la sexul feminin, un singur caz din lotul de studiu fiind ntlnit la sexul masculin. Incidena maxim a cazurilor am constatat-o la pacientele cu vrsta ntre 50 i 60 de ani, interval n care s-au plasat 133 de cazuri (35%), urmate de cele cu vrste cuprinse n inervalul 61-70 de ani, unde am nregistrat 106 de cazuri (28%).Incidene sczute am ntlnit sub 30 i peste 80 de ani.(tabel nr.3) Vrsta Nr. cazuri Procente% 20-30 4 1 31-40 12 3,2 41-50 49 13 51-60 133 35 61-70 106 28 71-80 65 17,2 >81 11 2,6

Tabel nr.3. Repartiia cazuisticii pe grupe de vrst

n funcie de dimensiunea tumoral, cele mai numeroase cazuri s-au ncadrat n intervalul 2-5 cm, categoria T2, care a nregistrat un numr de 163 de cazuri,urmat de categoria T1 cu un numr de 138 de cazuri. (tabel nr.4)

Categoria pT Nr. Cazuri Procente%

T1 <2 cm 138 36,3

T2 2-5 cm 163 42,9

T3 >5 cm 23 6

T4 56 14,8

Tabel nr.4. Repartiia cazuisticii n funcie de dimensiunea tumoral.

n studiul nostru cele mai numeroase au fost cazurile slab difereniate, G3, cu un numr de 296 de cazuri, urmate de cele moderat difereniate, G2 , cu un numr de 72 de cazuri, iar cea mai slab reprezentare au avut-o cazurile bine difereniate, G1, cu doar 12 cazuri (tabel nr.5). Grad de difereniere Nr. cazuri Procente% NOS G1 12 3 NOS G2 72 19 NOS G3 296 78

Tabel nr.5 Gradele de difereniere ale carcinom ductal invaziv - NOS

1A

1B

1C Fig. nr. 1A.Carcinom mamar ductal invaziv G1, ObX100, col HE, Fig. nr. 1B Carcinom mamar ductal invaziv G2, ObX100, col HE, Fig. nr. 1C Carcinom mamar ductal invaziv G3, ObX100

10

Excizia ganglionilor limfatici a fost realizat pentru 327 de pacieni, pentru care am realizat ncadrarea n categoriile pN (tabel nr.6). Categoria pN Nr cazuri Procente% pN0 86 26,3 pN1 60 18,3 pN2 65 19,9 pN3 91 27,8 pNx 25 7,7

Tabel nr.6. Distribuia cazurilor n funcie de statusul ganglionilor limfatici

Fig nr. 2 Metastaza masiv de carcinom ductal invaziv G3, col HE, Ob x100. n 56 de cazuri am ntlnit invazia tegumentului prin proliferare tumoral i extensie n limfaticele dermice sau ulceraii (fig. nr.3). 113 cazuri (29,7%) au asociat invazie vascular (fig nr.4) iar 118 cazuri (31%) au prezentat invazie perineural (fig.5)

Fig. nr. 3 Invazie tegumentara, col HE, Obx100

Fig. nr. 4 Emboli vasculari, col HE, Obx100

11

Fig. nr. 5 Invazie perineurala, col HE, Obx100

In cazuistica studiat, 21 cazuri au prezentat metastaze la distan n momentul diagnosticului, din care 3 au fost metastaze pulmonare, 10 au fost metastaze osoase, 4 cazuri au avut determinri secundare ovariene (fig nr 6), 3 cazuri au avut metastaze hepatice i 1 caz metastaze cerebrale.

Fig nr.6. Metastaza ovarian de carcinom mamar ductal invaziv G2, col HE, Ob X100 Pe baza categoriilor T,N,M, gruparea cazurilor pe stadii de evoluie a condus la urmtoarele rezultate(tabel nr.7): Stadiul tumoral Nr cazuri Procente% I 54 16,9 II 79 24,9 III 165 51,7 IV 21 6,5

Tabel nr.7 Distribuia cazurilor n funcie de stadiul tumoral

Analiza statistic (chi ptrat) a indicat o asociere ntre:vrst i stadiul tumoral (p<0,001),dimensiunile tumorale i stadiul tumoral (p<0,001), statusul ganglionilor limfatici 12

i dimensiunile tumorale (p<0,001) i stadiul tumoral (p<0,001), gradul tumoral i invazia vascular (p<0,05), dimensiunile tumorale i invazia vascular (p<0,001), perineural (p<0,001) i la nivelul tegumentului (p<0,001) precum i ntre stadiul bolii i prezena metastazelor la distan (p<0,001).

VI B. REZULTATELE STUDIULUI IMUNOHISTOCHIMIC VI.B1. EVALUAREA EXPRESIEI RECEPTORILOR HORMONALI (ER,PR) SI CORELATIA LOR CU PARAMETRII CLINICO-MORFOLOGICI Am analizat imunomarcajul la receptorii hormonali (ER i PR), care au permis obinerea a 4 imunofenotipuri pe care ulterior le-am raportat la parametrii clinicomorfologici, unii cu valoare prognostic recunoscut. n lotul analizat, 55 de cazuri ( 73,3%) au fost ER+ i 20 de cazuri (26,7%) au fost ER-. 62,6% din cazuri (47 de cazuri) au fost PR+ i 37,4% din cazuri (28 de cazuri) au fost PR-.(tabel nr.8) ER+ Nr. cazuri Procente% 55 73,3% ER20 26,7% PR+ 47 62,6 PR28 37,4

Tabel nr 8 Distribuia cazuisticii n funcie de imunomarcajul la ER i PR Pentru cele dou serii de date am folosit coeficientul lui Pearson obinnd urmtoarea distribuie a datelor (fig nr.7 )
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60 80 100 ER/PR Linear (ER/PR) y = 0,6122x + 9,5553 R2 = 0,4369

Fig nr.7 Distribuie liniar pozitiv ntre valorile ER i PR, index Pearson 0,66

13

Realiznd ncadrarea celor 75 de cazuri n 4 imunofenotipuri n funcie de receptorii hormonali, am obinut urmtoarele incidene:(tabel nr.9) Imunofenotip ER+PR+ ER+PRER-PR+ ER-PRNr. cazuri 44 11 3 17 Procente% 58,6 14,6 4 22,8

Tabel nr.9. Distribuia cazurilor n funcie de imunofenotipul receptorilor hormonali Analiznd corelaiile imunofenotipurilor cu grupele de vrst, am constatat c subgrupele caracterizate de prezenta receptorilor de estrogen s-au asociat n procent de 72,7% cu vrstele de peste 50 de ani, imunofenotipul ER-PR+ a fost ntlnit numai la paciente cu vrste ntre 40-60 de ani, iar imunofenotipul ER-PR- a fost asociat cu vrstele de peste 50 de ani n 74,6% din cazuri (Fig nr 8).

35 30 25 20 15 10 5 0 <50 ani >50 ani ER+PR+ 8 7 6 5 4 3 2 1 0 <50 ani >50 ani

ER+PR-

2 1.5 1 0.5 0
20 - 40 ani 41 - 50 ani 51 - 60 ani >61 ani

14 12 10 8
ER-PR+

6 4 2 0 <50 ani >50 ani

ER-PR-

Fig, nr. 8 Corelaiile imunofenotipurilor cu grupele de vrst 14

Din punct de vedere statistic, aceast corelatie a fost nesemnificativ, p>0,05. Raportnd imunofenotipurile la dimensiunile tumorale, am constatat c subgrupurile care exprim receptori de estrogen au fost asociate cu dimensiuni tumorale mici T1-T2 (95,4% ER+PR+ i 72,7% ER+PR-). Imunofenotipul ER-PR+ a fost asociat numai cu dimensiuni mari T2-T3, iar imunofenotipul ER-PR- a fost ntlnit n 82,3% din cazuri la tumori T2-T3.Distribuia imunofenotipurilor pentru ER n funcie de dimensiunea tumoral a fost nalt semnificativ (p<0,01), iar distribuia imunofenotipurilor pentru PR n funcie de dimensiunea tumoral a fost semnificativ (p<0,05). n ceea ce privete gradul de difereniere tumoral, calculat n funcie de scorul Bloom Richardson, l-am corelat cu cele 4 imunofenotipuri realizate n urma analizei receptorilor hormonali (tabel nr.10). ER-PR/ Gradul tumoral G1 G2 G3 EP+PR+ 5 24 15 ER+PR1 1 9 ER-PR+ 0 0 3 ER-PR1 3 13

Tabel nr.10. Distribuia imunofenotipurilor pentru receptorii hormonali n funcie de gradul tumoral

Imunofenotipul ER+PR+ au fost ntlnite n tumori cu toate gradele de difereniere, un numr de 29 de cazuri (65,9%) au corespuns tumorilor G1 i G2 (fig nr 10).

Fig. nr.10A. Carcinom ductal invaziv G1, imunomarcaj ER+, Ob x100

Fig. nr. 10B Carcinom ductal invaziv G1, imunomarcaj PR+, Ob x100.

15

Un numr de 15 cazuri (34%) ER+PR+ au aparinut gradului de difereniere G3. (fig nr 11).

Fig. nr. 11A Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj ER+, Ob x100

Fig. nr. 11B Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj PR+, Ob x100

90% din cazurile ER+PR- au fost asociate cu tumori moderat i slab difereniate (fig. nr. 12) .

Fig nr.12A Carcinom ductal invaziv G3, Imunomarcaj ER+, Ob X100

Fig. nr.12B Carcinom ductal invaziv G3, Imunomarcaj PR-, control intern+, Ob X100

Imunofenotipul care a nregistrat cea mai mic inciden, ER-PR+ s-a asociat cu tumorile slab difereniate G3 (100%) (fig.13).

Fig. nr. 13A Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj ER-, control intern +, Obx100 16

Fig. nr. 13B Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj PR+, Obx100

Cazurile cu dublu imunomarcaj negativ s-au asociat cu tumorile slab difereniate G3 n procent de 76,4% (fig nr.14).

Fig. nr. 14A Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj ER-, control intern +,Ob X100

Fig. nr. 14B Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj PR-, control intern +,Ob X100

Analiza statistic a imunofenotipurilor pentru receptori hormonali n funcie de gradul de difereniere a artat o corelaie nalt semnificativ (p < 0.01).

VI.B2. EVALUAREA STATUSULUI Her2/neu SI CORELATIA CU PARAMETRII CLINICO-MORFOLOGICI

n urma studierii statusului oncoproteinei Her2/neu am obinut 61 de cazuri cu imunomarcaj negativ de scor 0 i 1+, 3 cazuri cu imunomarcaj negativ de scor 2+ i 11 cazuri Her2/neu pozitive de scor 3+.(Tabel nr.11) Her2/neu scor 0 Nr cazuri Procente% 53 70,6 Her2/neu Scor 1+ 8 10,6 Her2/neu Scor 2+ 3 4 Her2/neu Scor 3+ 11 14,8

Tabel nr.11. Distribuia cazuisticii n funcie de statusul Her2/neu

Raportat la grupele de vrst, 83,6% din cazurile Her2/neu de scor 0,1+ au fost ntlnite dupa 50 ani, cazurile Her2/neu de scor 2+ s-au situat ntre 30-50 de ani, iar 90% din cazurile Her2/neu de scor 3+ au fost diagnosticate sub 60 de ani. Corelaia dintre statusul Her2/neu i grupele de vrst a fost nalt semnificativ statistic ( p<0,001).

17

Imunomarcajul Her2/neu negativ de scor 0 i 1+ a fost preponderent n cazul tumorilor T1-T2 (85,2%). Cazurile Her2/neu pozitive de scor 3+ au aparinut tumorilor T2T3 (72,7%). Corelaia a fost nesemnificativ statistic ntre Her2/neu i dimensiunea tumoral (p>0,05). Raportat la gradul tumoral, 72,7% din cazurile Her2/neu scor 3+ sunt asociate cu tumor de grad 3 (fig. nr.15), toate cazurile bine difereniate G1 au fost Her2/neu scor 0 si 1+ (fig nr.16), 85,7% din tumorile G2, au fost Her2/neu scor 0 si 1+. Corelatia statistic ntre statusul Her2/neu i gradul tumoral a fost nalt semnificativ (p<0,01). (Tabel nr.12) HER-2 negativ Grad tumoral Nr. G1 G2 G3 3 22 28 0 % 4 29,3 37,3 Nr. 4 2 2 1+ % 5,4 2,6 2,6 Nr. 0 1 2 HER-2 echivoc 2+ % 0 1,4 2,7 Nr. 0 3 8 HER-2 pozitiv 3+ % 0 4 10,7

Tabel nr.12 Statusul Her2/neu n funcie de gradul tumoral

Fig.nr 15. Carcinom ductal invaziv G3, imunomarcaj Her2/neu pozitiv scor 3+

Fig.nr 16. Carcinom ductal invaziv G1, imunomarcaj Her2/neu negativ scor 0

Toate cazurile Her2/neu scor 3+ au prezentat metastaze ganglionare, 45,3% din cazurile Her2/neu scor 0 i 1+ au asociat metastaze ganglionare (corelatie statistic semnificativ p<0,05). Relaiile dintre expresia RH i Her2/neu au artat c imunomarcajul Her2/neu negativ de scor 0 i 1+ este ntlnit mai frecvent n cazurile n care ambii receptori hormonali sunt

18

pozitivi (88,5% pentru fenotipul ER+PR+). Imunomarcajul Her2/neu pozitiv de scor 3+ este corelat cu cazurile cu RH negativi (29,5% pentru ER-PR-).(tabel nr.13)

HER-2 negativ Imunofenotip ER+PR+ ER+PRER-PR+ ER-PRTotal Nr. 35 8 2 8 53 0 % 79,5 72,4 66 47 1+ Nr. % 4 9 1 9,2 0 3 17,5 8

HER-2 echivoc 2+ Nr. % 1 2 1 9,2 0 1 6 3

HER-2 pozitiv 3+ Nr. % 4 9,5 1 9,2 1 34 5 29,5 11

Tabel nr.13 Distribuia Her2/neu n funcie de imunofenotipul ER i PR

VI.B3.EVALUAREA COMPARATIVA A RECEPTORILOR HORMONALI, HER2/NEU SI A PARAMETRILOR CLINICO-MORFOLOGICI

Din lotul de studiu, alctuit din 75 de cazuri de carcinom ductal tip NOS, am exclus 3 cazuri (4%), caracterizate de imunomarcaj echivoc Her2/neu scor 2+. Am obinut astfel urmtoarele incidene ale subtipurilor moleculare: subtipul luminal A: 70% din cazuri, subtipul bazal:14,7% din cazuri, subtipul luminal B: 8,3% din cazuri, iar subtipul HER2:7% din cazuri (tabel 14)

Subtip molecular Luminal A Luminal B Her2 Bazal

Nr. cazuri 50 6 5 11

Procente% 70 8,3 7 14,7

Tabel nr.14 Incidena subtipurilor moleculare Analiznd corelaia dintre subtipurile moleculare i grupele de vrst, am constatat c grupele de vrst peste 50 ani s-au asociat cu subtipul luminal A (82%) i bazal (90%).Grupele de vrst situate sub 60 de ani s-au asociat cu subtipurile HER2 (100%) i luminal B (83,6%) (fig nr 17)

19

20 15 10 5 0 21-30 31-40 41-50 51-60

Lum inal B

61-70
Her2 Bazal

71-80

>81

Lum inal A

Fig nr.17 Incidena subtipurilor moleculare n funcie de grupele de vrst Subtipul luminal A a fost asociat n procent de 92% din cazuri cu tumorile cu dimensiuni T1-T2 i n 58% din cazuri cu gradele de difereniere G1-G2.(Fig nr.18)

Fig nr 18 Subtipul molecular luminal A, imunomarcaj A. ER+, B.PR+ C.Her2/neu negativ scor 0. Carcinom ductal invaziv G1, Ob 100X Subtipul Luminal B (fig nr 19) a fost asociat n 83,4% din cazuri cu dimensiuni ncadrate ca T2-T3 i a prezentat numai tumori moderat i slab difereniate, niciun caz nefiindbinediferentiat.

Fig nr 19 Subtipul molecular luminal B, imunomarcaj A. ER+, B.PR+ C.Her2/neu + scor 3+. Carcinom ductal invaziv G3, Ob 100X

20

Subtipul HER2 (fig nr 20) a fost asociat n 80% din cazuri cu tumori slab difereniate G3. 60% din tumorile subtipului molecular HER2 au prezentat dimensiuni tumorale mari T2-T3.

Fig nr 20 Subtipul molecular HER2, imunomarcaj A. ER-,control intern + B.PR,control intern + C.Her2/neu + scor 3+. Carcinom ductal invaziv G3, Ob 100X Subtipul Bazal (fig nr 21) a prezentat n 91% din cazuri grad de difereniere moderat i sczut, fiind asociat n acelai procent cu dimensiunile tumorale mari T2T3.

Fig nr 21 Subtipul molecular Bazal, imunomarcaj A. ER-,control intern + B.PR,control intern + C.Her2/neu - scor 0. Carcinom ductal invaziv G3, Ob 100X

Analiznd statusul ganglionilor limfatici, n lotul nostru toate cazurile aparinnd subtipurilor Luminal B i HER2 au asociat metastaze ganglionare. 56% din cazurile Luminal A au prezentat ganglioni limfatici pozitivi, iar subtipul Bazal a fost asociat cu metastaze ganglionare n 54,6% din cazuri.

21

VI.B4. EVALUAREA INDICELUI DE PROLIFERARE Ki67 SI CORELATIA CU FACTORII CLINICO-MORFOLOGICI

Analiza indicelui de proliferare tumoral arat c 42,6 % din cazuri au fost ncadrate ca tumori cu potenial proliferativ sczut,32 % au fost tumori cu potenial proliferativ intermediar i 25,4 % din cazuri au avut potenial proliferativ nalt. Analiznd relaia dintre Ki67 i vrsta pacientelor, am observat c 90,6% din carcinoamele cu scoruri Ki67 sczute au fost ntlnite la pacientele de peste 50 de ani, n vreme ce scor Ki67 nalt am ntlnit la 60% din pacientele sub 40 de ani. Din punct de vedere statistic aceast corelaie a fost nesemnificativ (p >0,05). Raportnd indexul Ki67 la subtipurile moleculare am obinut urmtoarele date: (tabel nr 15) SUBTIP MOLECULAR LUMINAL A LUMINAL B HER2 BAZAL INDEX Ki67 SCZUT 31 0 0 1 INDEX Ki67 MEDIU 16 2 0 5 INDEX Ki67 NALT 3 4 5 5

Tabel nr 15. Statusul ki67 n relaie cu clasele moleculare Subtipului luminal A a prezentat un indice Ki67 sczut n 62%din cazuri, 66,6% din cazurile luminal B au prezentat indice de proliferare nalt. Tumorile non-luminale prezint valori mult mai mari ale indicelui de proliferare, 100% din cazurile Her2 prezentnd index Ki67 nalt i 90,9% din cele aparinnd subtipului bazal avnd index Ki67 de peste 15%. Raportarea indicelui de proliferare la subtipurile moleculare a fost foarte nalt semnificativ p<0.001.

22

VII. DISCUII

VII.A. ANALIZA REZULTATELOR STUDIULUI MORFO-CLINIC

Carcinomul ductal de tip NOS este cel mai frecvent tip de carcinom mamar invaziv, a crui inciden raportat de diverse studii se situeaz ntre 40% i 75% .[60] Cancerul mamar este o boal multifactorial, alctuit din subtipuri biologic distincte, cu evoluie natural diferit, despre care se tie c prezint un spectru larg de trsturi clinice, patologice i moleculare, cu diferite implicaii prognostice i terapeutice. Datorit heterogenitii bolii exist o preocupare continu n scopul identificrii unor markeri cu rol predictiv asupra prognosticului i rspunsului la tratament. n studiul nostru, creterea dimensiunii tumorale a fost asociat cu creterea numrului de ganglioni limfatici care au prezentat metastaze. Tumorile cu diametru peste 5 cm au asociat metastaze ganglionare n 94% din cazuri iar cele cu dimensiuni de 2 cm sau mai mici au prezentat invazie ganglionar n 54% din cazuri. Aceast asociere arat o corelaie ntre cei doi factori prognostici ducnd la creterea efectului nefavorabil asupra evoluiei subsecvente a bolii. Aceast corelaie, ntre dimensiunea tumoral i numrul ganglionilor limfatici afectai, a fost studiat i de Quiet i colab care au artat c

supravieuirea fr boal a fost de 81% n cazul pacientelor cu metastaze la nivelul unui singur ganglion limfatic si formaiuni tumorale cu diametru maxim de 2 cm, fa de 50%,atunci cnd tumora a prezentat un diametru de peste 2 cm. [142] n lotul de studiu, 78% din cazuri au fost slab difereniate. Pentru carcinomul mamar, gradul histologic este semnificativ corelat cu prognosticul, pacientele cu tumori G1 prezentnd o durat de via semnificativ mai mare comparativ cu cele cu tumori G2 sau G3. [59] Gradul histologic i nuclear s-a dovedit un factor de prognostic util pentru stratificarea pacientelor pe stadii de boal, n special n rndul celor fr metastaze la nivelul ganglionilor limfatici axilari.[147] Excizia ganglionilor limfatici a fost practicat pentru327 de paciente, din care 27,8% au fost ncadrate n categoria N3. Muli autori au atribuit statusului ganglionilor limfatici o semnificaie prognostic deosebit, influennd supravieiurea i durata de via lipsit de boal.[46] Invazia ganglionilor limfatici loco-regionali reprezint indicatorul prognostic cel mai fidel i reproductibil pentru cancerul glandei mamare.Un argument n acest sens este

23

reprezentat de faptul c pacienii fr metastaze ganglionare prezint o rat de supravieuire la 10 ani de 75%, fa de 25-30% n cazul celor cu metastaze ganglionare prezente.[170] n studiul nostru invazia vasculara a fost ntlnit n 29,7% din cazuri. Cazurile care au asociat invazie vascular au fost in cea mai mare parte tumori cu grad slab de difereniere, G II i G III. n literatura de specialitate, frecvena invaziei vasculare variaz de la 5% la 50%. [152,147,148,154,181] Unii autori au artat c invazia vascular denot un prognostic prost n cazul pacienilor cu ganglioni limfatici pozitivi ( cu 2 sau mai muli ganlioni afectai) [181] n timp ce alte studii susin c acest aspect are semnificaie prognostic numai n absena metastazelor ganglionare. [20] Invazia perineural a fost ntlnit la 31% din cazurile studiate de noi. Unii autori declin rolul prognostic al invaziei perineurale n cancerul mamar.[121] Ali autori susin incidene mai mici ale invaziei perineurale n cadrul carcinoamelor mamare, sitund-o n jurul valorii de 10% [152] i asociind-o cu tumorile de grad nalt i cu prezena embolilor vasculari, dar nu i atribuie semnificaie prognostic independent. La nivelul lotului de studiu, 21 cazuri au nregistrat metastaze la distan , din care 10 cazuri au prezentat metastaze osoase.Bendre si colab [22] consider c metastazele sunt rspunztoare de 90% din mortalitatea dat de cancerul mamar,iar la examinarea postmortem, 70% din persoanele decedate prin cancer mamar au eviden de metastaze osoase, care n cazul multor pacieni au fost considerate ca o afeciune cronic. [39] Supravieuirea din momentul diagnosticului este variabil n funcie de tipul tumoral, dar prognosticul dup dezvoltarea metastazelor osoase este considerabil mai bun dect dup recurene la nivel visceral.[40] Realiznd o distribuie a cazurilor studiate pe stadii de evoluie, am constatat c cele mai numeroase cazuri s-au plasat n stadii avansate, stadiul III, nregistrnd un numar de 165 de cazuri (51,7%). n urma acestei analize, observm tendina general de adresare la medic n stadii avansate, cu formaiuni tumorale de mari dimensiuni i numr mare de ganglioni limfatici axilari cu metastaze

. VII.B. ANALIZA REZULTATELOR STUDIULUI IMUNOHISTOCHIMIC

Din cele 75 de cazuri analizate IHC,73,3% au fost ER + i 62,6% au fost PR+. , Emad A Rakha public n 2007 rezultatele unui studiu efectuat pe un lot de 1944 de 24

carcinoame mamare invasive , din care 71% au fost tumori cu ER+ i 59% au prezentat PR+.[62] 76,3% din cazurile cu ER+ au fost ntlnite n grupe de vrst de peste 50 de ani. Literatura de specialitate arat c dou treimi din femeile cu vrste sub 50 de ani prezint tumori mamare ER-, n vreme ce aproximativ 80% din tumorile femeilor cu vrste peste 50 de ani sunt ER+. [134, 9] Rezultatele obinute de noi au artat c, n lotul luat n studiu, supraexpresia Her2/neu n cazurile ER- (54,5%) a fost mai mare dect n cazurile ER+ (45,5%). De asemenea, supraexpresia Her2 n cazurile PR- (54,5%) a fost mai mare dect n cazurile PR+ (45,5%). Rezultatele obinute de noi sunt n acord cu majoritatea sudiilor, care arat c prezena receptorilor de estrogen ER i de progesteron PR se coreleaz invers cu supraexpresia Her2/neu.[10,11] Lisa Ryden i colab arat c procentul tumorilor care exprim att

receptori hormonali ct i suprexpresie Her2/neu este situat sub valoarea de 10%.[157] Incidena subtipurilor moleculare obinut in studiul nostru este comparabil cu cele din literatur, n studiul publicat de Lisa Wiechmann i colab, incidena subtipurilor fiind urmtoarea: luminal A, cel mai frecvent , reprezentnd 71% din cazuri, bazal cu 15% din cazuri, luminal B (8% din cazuri) i HER2 (6%). [182] Literatura de specialitate susine corelaia dintre subtipul luminal A i vrstele avansate [1] i prezena subtipului HER2 la paciente cu vrste mai mici comparativ cu cele aparinnd subtipului luminal A.[182] n acelai studiu se arat c subtipul bazal

caracterizeaz grupe de vrst mai mici dect cele ntlnite n subtipul luminal A, spre deosebire de studiul nostru n care cele dou subtipuri au caracterizat grupe de vrst comparabile. Lisa Wiechmann i colab. au artat c pacienii din subgrupurile HER2 i luminal B au prezentat mai frecvent metastaze ganglionare dect cei din subgrupurile luminal A i bazal. Aceti autori au demonstrat c factorii asociai cu prognosticul prost (gradul tumoral nalt, dimensiunile tumorale mari, metastazele ganglionare, invaziile limfovasculare, vrsta tnr) sunt mai frecvent asociai tumorilor care supraexprim Her2/neu. Sorlie i colab 2003 [167] i Carey i colab 2006 [100] au artat c supravieuirea la 10 ani a acestor tumori este de aproximativ 52%, fiind cea mai mic dintre tipurile de tumori moleculare. Subtipul luminal B a prezentat un comportament biologic intermediar ntre subtipurile luminal A i HER2. Subtipul bazal a fost asociat cu un risc sczut de boal multicentric/multifocal i cu o inciden sczut a metastazelor ganglionare. i alte studii [44] susin asocierea sczut a tipului bazal cu metastazele axilare, comparative cu celelalte subtipuri,el fiind asociat mai frecvent cu metastaze cerebrale i pulmonare.Carcinomul bazal- like este mai frecvent la 25

cazurile n premenopauz, fiind asociat cu tumori de grad nalt, cu arhitectur solid, index mitotic crescut, infiltrat inflamator masiv, necroz, risc crescut de metastaze cerebrale i pulmonare, rat crescut de recuren, inciden crescut a deceselor specifice, independent de ststusul limfonodal i mrimea tumorii.[95] n iulie 2010, Reiki Nishimura i colab au publicat un studiu ale crui rezultate arat c aproximativ 60% din tumorile de tip luminal A au prezentat activitate proliferativ sczut (Ki67<20%), n vreme ce peste jumtate din tumorile de tip bazal-like au avut indice de proliferare nalt ( Ki67> 50%).Acelai studiu arat o corelare a indicelui Ki67 crescut cu vrsta tnr, tumorile cu dimensiuni mari, metastazele ganglionare, gradul nuclear i statusul IHC ER/PR-, Her2/neu+. [146] n cazul subtipului luminal B, 66,6% din cazuri au prezentat indice Ki67 nalt. Maggie CU i colab recomand Ki67 ca fiind un biomarker optim pentru identificarea subtipului luminal B. Dei identificarea profilului genic rmne cea mai senzitiv metod, studiul efectuat de acest colectiv n 2009 arat c markerul Ki67 poate fi adugat la panelul standard ER, PR i HER2/neu pentru identificarea tumorilor luminal B. [106]

26

VIII CONCLUZII Distribuia pe ani calendaristici a indicat o inciden n cretere de la 57 cazuri n 2005 la 95 de cazuri n 2007. Cele mai numeroase cazuri (35%) au fost diagnosticate n intervalul de vrst 51- 60 de ani, vrsta prezentnd o corelaie foarte nalt semnificativ(p<0,01) cu stadiul bolii i semnificativ (p<0,05) cu gradul de difereniere tumoral. 42,9% din cazuri au fost ncadrate n categoria T2. 78% din cazuri au fost slab difereniate G3, gradul de difereniere fiind corelat cu vrsta pacientelor (p<0,05). Excizia ganglionilor limfatici a fost realizat pentru 327 de paciente, din care 27,8% au fost N3- cazuri corelate cu grad de difereniere sczut, dimensiuni tumorale peste 2 cm i invazie vascular (corelatie semnificativa, p<0,05). Gradul tumoral a prezentat o corelaie foarte nalt semnificativ cu statusul ganglionilor limfatici (p<0,001). 14,8% din cazuri au asociat invazia tegumentului, 29,7% din cazuri au prezentat invazie vascular i 31% invazie perineural. 21 de cazuri au prezentat metastaze la distan, corelate statistic cu dimensiunea tumoral i stadiul bolii. Cel mai frecvent a fost stadiul III (51%), fa de stadiul I (16,9%). Stadiul bolii a prezentat o corelaie foarte nalt semnificativ cu vrsta, dimensiunea tumoral,cu prezena metastazelor i cu invaziile vascular, perineural i la nivelul tegumentului( p<0,001). Studiul IHC efectuat pentru 75 de pacieni a evideniat pozitivitate nalt pentru RH (73,3% din cazuri fiind ER+ i 62,6% fiind PR+). Imunofenotipurile pentru receptori hormonali au indicat cea mai mare inciden pentru imunofenotipul ER+PR+ (58,6%) i cea mai mic pentru ER-PR+ (4%). Analiza statusului Her2/neu a indicat 14,8% din cazuri Her2/neu pozitive de scor 3+ i 81,3% HER2/neu negative de scor 0,1+; 4% au prezentat imunomarcaj echivoc de scor2+. Cazurile Her2/neu de scor 3+ au fost corelate cu vrstele sub 40 de ani (corelaie nalt semnificativ p<0,001), cu tumorile cu dimensiuni mari T2-T3, grad sczut de diferentiere i cu prezena metastazelor ganglionare (p<0,001).

27

 Cazuri Her2/neu de scor 0,1+ au fost corelate cu vrstele peste 70 de ani (97,8%) p<0,001,cu tumorile T1-T2 (85,2%).Toate cazurile bine difereniate au prezentat imunomarcaj Her2/neu negativ. Realiznd ncadrarea cazurilor n clasificarea molecular am obinut urmtoarele incidene: luminal A 70%, bazal 14,7%, luminal B 8,3% i HER2 7%. Subtipul luminal A (70%) s-a asociat statistic cu cu vrstele de peste 60 de ani i cu tumorile cu dimensiuni mici T1-T2 (p<0,05); 58% din tumori au prezentat grad de difereniere G1-G2 i n 56% din cazuri au fost prezente metastaze ganglionare. Tumorile ncadrate n acest subtip molecular au prezentat n cea mai mare parte indice de proliferare sczut (62%), numai 6% din cazuri prezentnd indice de proliferare nalt. Subtipul luminal B (8,3%) s-a asociat statistic cu vrstele situate sub 60 de ani i cu tumorile cu dimensiuni ncadrate ca T2-T3 (p<0,05). Toate cazurile au prezentat grad de difereniere G2-G3 i s-au asociat cu metastaze ganglionare. 66% din cazurile acestui subtip au avut indice de proliferare nalt i 34% indice de proliferare moderat, niciun caz neavnd activitate proliferativ sczut. Subtipul HER2 (7%) s-a asociat statistic cu vrstele situate sub 60 de ani i cu dimensiunile tumorale mari T2-T3 (p<0,05). 80% din tumori au fost slab difereniate G3 iar metastaze ganglionare au fost gsite la toate cazurile. De asemenea, a fost caracterizat de tumori cu indice de proliferare nalt (100% din cazuri). Subtipul bazal (14,7%) s-a asociat statistic cu vrstele de peste 50 de ani i cu tumorile cu dimensiuni mari T2-T3 (p<0,05). 91% din cazuri au prezentat grad de difereniere G2-G3 iar metastazele ganglionare au fost prezente n 54,6% din cazuri. 90,9% din cazuri au avut indice de proliferare Ki67>15. Indicele de proliferare a fost corelat cu varsta pacientilor (p<0,01) si gradul tumoral (p<0,001).

28

BIBLIOGRAFIE SELECTIV

[1] Adedayo A. Onitilo,MD, MSCR, FACP, Jessica M Engel, MSN, FNP-BC, Robert T Greenlee, PhD and Bickol N Mukesh, PhD. Breast Cancer Subtypes Based on ER/PR and Her2 ExpressionComparasion of Clinicopathologic Features and Survival. Clinical Medicine and Research Vol. 7, Number 1/2, 4-13, 2009 [9] Anderson WF, Chatterjee N, Ershler WB, Brawley OW. Estrogen receptor breast cancer phenotype in the surveillance, epidemiologzand result database. Breast Cancer Res Treat. 2002. 76,26-36 [10] Ariga R, Zarif A, Korasick J, Reddy V, Siziopikou K, Gattuso P. Correlation of her-2/neu gene amplification with other prognostic and predictive factors in female breast carcinoma Breast J. 2005 Jul-Aug;11(4):278-80) [11] Almasri NM, Hamad M, Immunohistochemical evaluation of human epidermal growth

factor receptor 2 and estrogen and progesteron receptors in breast carcinoma in Jordan. Breast Cancer Res gene amplification 2005, 7:R598-R604 [20] Bell JR, Friedell GH, Goldenberg IS. Pprognostic significance of pathologic findings in

human breast carcinoma. Surg Gynecol Obstet 1969; 129:258-262 [22] Bendre M, Gaddy D, Nicholas RW, Suva Lj,Breast cancer metastasis to bone:it is not all

about PTHrP Clinical Orthopaedics and related research 415 2003 S39-S45 [39] Coleman RE, 2006.Clinical Features of metastatic bone disease and risck of sckeletal morbidity. Clinical Cancer Research 12 6243s-6249s [40] Coleman si Rubens, 1987 The clinical course of bone metastases from breast cancer.British Journal of Cancer 55 61-66). [44] Crabb SJ; Cheang MC, Leung S et al. Basal breast cancer molecular subtype for lower incidence of axillary lymph node metastases in breast cancer. Clin Breast Cancer. 2008:8::249- 56 [46] Cserni G. 2000. Axillary staging of breast cancer and the sentinel node J Clin Pathol, 53:733741 [59] Eloston CW, Ellie IO, 1991: Pathological prognostic factors in breast cancer. The value of histological grade in breast cancer.:experience from a large study with long-term follow-up. Histopahology 19(5):403-10) [60] Elston CW, Ellis IO,1998. Classification of malignanat breast diseases.In: The Breast

Systemic Pathology. CW Elston ana IO Ellis (3rd edition). Churchill Livingstone. Edinburg, pp 239247 29

[62] Rakha EA, EL-Sayed ME, Green AR, et al., Biologic and clinical characteristics of breast cancer with single hormone receptor-positive phenpthype, J Clin Oncol, 2007, 25(30):4772-4778 [87] Kaaks R, Berrino F, Key T, et al. Serum sex steroids in premenopausal women and breast cancer risk within the European Prospective Investigation into Cancer and Nutrition (EPIC). J Natl Cancer Inst 2005;97:755-765. [95] Lazr E, A Dema, S Tban, Leziuni intraepiteliale i borderline n patologie, Ed Eurobit, Timioara, 2008, pag 128-156 [100] Lisa A Carey, Charles M Perou, chad A Livasy, Lynn G Dressler, David Cowan, et colab.Breast Cancer Subtypes and survival in the Carolina Breast Cancer Study. JAMA 2006, 295:2492-2502 [115] Micheli A, Muti P, Secreto G, et al. Endogenous sex hormones and subsequent breast cancer in premenopausal women. Int J Cancer 2004;112:312-318 [121] N Duraker, Z. Caynak, K. Turkoz. Perineural invasion has no prognostic value in patients with invasive breast carcinoma, The breast vol 15, Issue 5, Oct 2006, pag 629-634). [129] Onland-Moret NC, Kaaks R, Van Noord PA, et al. Urinary endogenous sex hormone levels and the risk of postmenopausal breast cancer. Br J Cancer 2003;88:1394-1399 [134] Payne SJL,Bowen RL, Jones JL, Wells CA. Predictive markers in breastr cancer- the present. Histhopathology 52, 82-90, 2008 [142] Quiet CA, Ferguson DJ, Weichselbaum RR, et al. Natural history of node-positive breast cancer: the curability of small cancers with a limited number of positive nodes. J Clin Oncol 1996;14:31053111 [146] Reiki Nishimura, Tomofumi Osako, Yasuhiro Okumura et al, Ki67 as a prognostic marker according with breast cancer subtype and a predictor of recurrence time in primary breast cancer. Experimenthal and Therapeutic medicine 1: 747-754, 2010 [147] Rosen P, Saigo PE, Braun DW Jr, et al. Predictors of recurrence in stage I (T1N0M0) breast carcinoma.Ann Surg 1981, 193:15-25. [148] Rosen P, Saigo PE, Braun DW Jr, et al. Prognosis in stage II (T1N1M0) breast cancer. Ann Surg 1981; 194:576-584 [152] Rosen PP. Rosen Breast pathology, 3rd Edition, 2009, Lippincott Williams et Wilkins. P358-404 [154] Roses DF, Bell DA, Flotte TJ et al. Pathologic predictors of recurrence in stage 1 (T1N0M0) breast cancer. Am J Cli Pathol 1982;78:817-820.

30

[157] Ryden L, Landberg G, Stal O et al. HER2 status in hormone receptor positive premenopausal primary breast cancer adds prognostic, but not tamoxifen treatment predictive, information. Breast Cancer Res Treat. 2008, 109:351-357 [167] Sorlie B, Tibshirani R, Parker J, Hastie T et al. Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets, Proc Natl Acad Sci USA, 2003, Jul 8, 100(14):8418-23. Epub 2003 Jun 26 [170] Stolnicu Simona, Imre Egyed Zs, Janos Jung, Cicerone Postelnicu 2000.Factori prognostici i predictivi n cancerul mamar n Compendiul de Patologie Mamar, Casa de Editur Mureul, TG Mure, 171 [176] Turan VK, Sanchez RI, Li JJ, et al. The effects of steroidal estrogens in ACI rat mammary carcinogenesis: 17beta-estradiol, 2-hydroxyestradiol, 4-hydroxyestradiol, 16alpha-

hydroxyestradiol, and 4-hydroxyestrone. J Endocrinol 2004;183:91-99 [181] Weigand RA, Isenberg WM, Russo J et al. Blood vessel invasion and axillary lymph node involvement as a prognostic indicators for human breast cancer. Cancer 1982;50:962-996 [182] Wiechmann Lisa,MD, Michelle Sampson, BS, Michelle Stempel, MPH, et al. Presenting Features of Breast Cancer Differ by Molecular Subtype. Ann Surg Oncol DOI 10.1245/10434009-0606-2.11 July 2009 [187] Yager JD, Davidson NE.2006. Estrogen Carcinogenesis in breast cancer.New Engl J Med 354 (3):270-82

31