Nanoncapsularea i ncorporarea cinamaldehidei pentru

dezvoltarea unui material de ambalaj alimentar antimicrobian

1. Introducere
Aproximativ o treime din populaia rilor dezvoltate sunt afectate de boli alimentare n
fiecare an (Stringer, 2005). Exist mai mult de 250 de ageni microbiologice, fizice i chimice
responsabili pentru cauzarea bolilor alimentare (Budowle, Schutzer, briza, Keim & Morse,
2010). n 2012, centrul pentru controlul i prevenirea maladiilor (CDC) a estimat c n fiecare an
128.000 oameni au fost spitalizai i 3000 au murit din cauza bolilor alimentare. CDC (2012) a
raportat 31de ageni patogeni cunoscui responsabili pentru o medie de 9,4 milioane de
mbolnviri n fiecare an, care reprezint 20% din totalul mbolnvirilor.
Cele mai multe mbolnviri cauzate de alimente sunt datorate contaminrii care apare n
timpul de produciei, prelucrarii, transportului sau manevrrii. Modul n care produsele
alimentare sunt tratate dup ce au fost contaminat poate face, de asemenea, o diferen n a afla
dac apare sau nu un focar de mbolnvire. Chiar n cazul n care produsele alimentare sunt
depozitate la temperaturi de refrigerare exist nc un risc potential de alterarea i de toxicitatea
al alimentelor datorate microorganismelor, precum Listeria monocytogenes i Yersinia
enterocolitica care se dezvolt chiar i la temperaturi sczute (CDC, 2012).
mbolnvirile datorate alimentelor pot fi prevenite prin utilizarea corect a parametrilor n timpul
prelucrrii i buna manipulare i depozitare a alimentelor procesate. Pentru a proteja produsele
alimentare de alterrile microbiene i pentru a preveni izbucnirea unor focare de mbolnviri o
abordare posibil este aplicarea unor filmuri antimicrobiene pe materialele care vin n contact cu
alimentele sau ncorporarea compuilor antimicrobieni n ambalaje alimentare pentru a ucide sau
inhiba microorganismele contaminante i pentru a asigura sigurana alimentar n timpul
depozitrii, precum i distribuiei (Appendini & Hotchkiss, 2002).
Ambalajele antimicrobiene sunt tot mai testate pentru potenialele aplicaii n
mbuntirea calitii i siguranei alimentare prin inhibarea microorganismelor patogene i
duntoare n produse cu ajutorul compuilor antimicrobieni care sunt eliberai controlat i
treptat n alimente (Han, 2000). Agenii antimicrobieni pot fi aplicai pe ambalaj prin legturi
ionice sau covalente sau prin ncorporare direct n compoziia ambalajului. Compui fenolici
din plante au un rol important n protecia plantelor mpotriva agenilor patogeni i prdtorilor
(Brovo, 1998).Wilkins i Bord (1989) au raportat c peste 1389 plante sunt surse poteniale de
ageni antimicrobieni. Cinamaldehida este o component principal a uleiului esenial de
scorioar, care cuprinde aproximativ 60-75% din totalul compoziiei uleiului (Duke, 2002).
Cinamaldehida este una dintre moleculele de interes pentru dezvoltarea ca i agent antimicrobian
pentru alimente datorit activitii sale demonstrate mpotriva att bacteriilor Gram-pozitive ct
i a celor Gram-negative, inclusiv a organismelor de interes pentru sigurana alimentar (Gomes,
Moreira, & Castell-Perez, 2011; Nostro et al., 2012). Cinamaldehida a fost descoperit ca fiind
inhibitor n dezvoltarea de Clostridium botulinum (Bowles & Miller, 1993), Staphylococcus
aureus (Bowles, sorin & Williams, 1995), Escherichia coli O157: H7 i Salmonella enterica
serovarului Typhimurium (Helander et al., 1998). Lee i Ahn (1998) au descoperit c derivatele
cinamaldehidei din uleiul esential de scortisoara are un grad de inhibare mare asupra bacteriilor
precum Clostridium perfringens i Bacteroides fragilis si inhib ntr-un grad moderat
Bifidobacterium longum i Lactobacillus acidophilus care au fost izolate din fecale umane. A
fost, de asemenea, raportat c cinamaldehida inhib dezvoltarea sintezei enzimelor peretelui
celulei fungice (Bang, Lee, Parcul & Mihai, 2000). Cinamaldehida este nregistrat ca agent
aromatizant de Food and Drug Administration (FDA) i este permis adugarea ei n produsele
alimentare.
Lipozomi sunt vezicule constnd din una sau mai multe membrane bistratificate. Recent
lipozomi au ctigat importan n industria alimentar pentru ncapsulri antimicrobiene,
componeni de arom i enzime (Gortzi, lulu, caliniuc & Tsaknis, 2008). Lipozomi sunt capabili
de a livra diferii agenii n zone bine definite cu eficien mbuntit. Att compuii polari
(Dogra, Li, & Kohli, 2012) ct i cei nepolari pot fi ncapsulai deoarece lipozomi au faze apoase
de peroxidare att polare ct i nepolare (Mozafari, Johnson, Hatziantoniou & Demetzos, 2008).
Gortzi et al. (2008) a raportat c activitatea antimicrobian i antioxidant a crescut la extractele
realizate la Myrtus communis dup ncapsularea n lipozomi. De asemenea, ncapsularea
extractelor n lipozomi produs o activitate antioxidant cu 25% mai mult dect a aceluiai extract
n form pur.
Doar un numr foarte limitat de studii au cercetat aplicarea ncapsulrii liposomilor
antimicrobieni naturali n ambalajele alimentare. Mekkerdchoo, Patipasena i
Borompichaichartkul (2009) au raportat activitatea antimicrobian a unui film de pectin n care
erau ncapsulai liposomi de ulei de cel de usturoi, ulei de usturoi i extrase de rodii.
Ei au demonstrat creterea activitii antibacteriene a filmului de pectina care coninea
compui antimicrobieni ncapsulai n comparaie cu filmul de pectin care coninea compui
antimicrobieni extrai dar fr a fi ncapsulai. n general, fosfolipidele precum lecitina i
membranele fosfolipidelor gsite n globulele grsimii din lapte sunt folosite pentru a face
lipozomi pentru ncapsularea deferiilor compui funcionali cum ar fi calmantele i suplimentele
alimentare.
n acest studiu lipozomi PDAeNHS (polidiacetilen-hidroxisuccinimida) au fost folosii
pentru a ngloba cinnamaldehyde.
PDA ofer avantajul c se transform fr ajutor n lipozomi care apoi pot fi imobilizai
pe suprafeele care ajung n contact cu alimentele (Jung, Kim, Parcul & Soh, 2010). Lipozomii
PDA-NHS, de asemenea, pot fi imobilizai pe suprafete care conin amine modificate i utilizate
pentru a face suprafee antimicrobiene care ajung n contact cu alimentele.
Literatura de specialitate sugereaz c suprafeele antimicrobiene ale ambalajelor sunt
create fie prin amestecarea direct a substanelor antimicrobiene n rini polimerice, fie prin
imobilizarea substanelor antimicrobiene cu ajutorul sudurii ionice sau covalente pe suprafeele
de contact, precum sticla sau polimerii (Appendini & Hotchkiss, 2002). Exemple de substane
antimicrobiene care au fost imobilizate prin legturi ionice sau covalente includ imobilizarea
clorurii de benzoil (Weng, Chen, & Chen, 1997) i benomil (Halek & Garg, 1988) pe filmul
ionomeric i imobilizarea alcoolului lizozimei polivinilice i a nailonului 6,6 rinic (Appendini
& Hotchkiss, 1997).
Lipozomii PDA au fost imobilizai pe tobogane de sticl modificate cu amine pentru
detectarea mercurului (Lee, Jun, & Kim, 2009). Imobilizarea liposomilor antimicrobieni
ncapsulai ofer mai multe avantaje cum ar fi o activitate antimicrobian crescut i protecia
agenilor antimicrobieni mpotriva degradrii.
Imobilizarea substanelor antimicrobiene prin legturi ionice sau covalente la un polimer
necesit grupri funcionale att pe componenta antimicrobien ct i pe suprafaa polimeric.
Cteva studii au fost efectuate asupra conservanilor aprobai de FDA pe suprafeele polimerice
cu legtur ionic sau covalent pentru dezvoltarea ambalajelor alimentare antimicrobiene. n
plus, molecule care leag compusul antimicrobian pe suprafata polimeric de cuplare crete
disponibilitatea i interaciunea dintre partea activ de agent antimicrobian i microorganisme
(Appendini & Hotchkiss, 2002).
Scopul acestui studiu a fost de a testa fezabilitatea folosirii cinamaldehidei ca un agent
antimicrobian natural n suprafeele active ale ambalajelor. Obiectivele specifice au fost de a
compara proprietile antibacteriene ale cinamaldehidei libere i nanoncapsulate n soluie, a
suprafeei polilactice acide (PLA) pe care a fost aplicat cinamaldehida, i sticl i a suprafeei
PLA acoperite cu cinamaldehida nanolipozomic.
2. Metode i materiale folosite
Cinamaldehida a fost procurat de la Indofine chemicals (Hillsborough, NJ). acid
pentacosadinoic (PCDA), cu o puritatea mai mare de 95% i dimyristoylphosphatidylcholine
(DMPC) au fost procurate de la GFS chemicals (Powell, OH), i Avanti Lipids (Alabaster,
Alabama), respectiv N-hidroxisuccinamida (NHS) i toate celelalte substane chimice utilizate n
studiile noastre au fost achiziionate de la Fisher Scientific . Toi solvenii organici pentru sinteza
i purificarea au fost achiziionate de la Fisher Scientific i utilizate fr alte procedee de
purificare. Apa utilizat la prepararea lipozomilor a fost purificat i deionizat folosind
procedurile standard.
Sinteza de PDA-NHS (schema 1): la o soluie de PCDA (0,50 g, 1.35 mmol) n 10 mL de
clorur de metilen uscat CH2Cl2, NHS (0.174 g, 1,5 mmol) i clorhidrat de-(3-
dimetilaminoprolil)-3-etilcarbodimid 1 (0.299 g, 1.55 mmol) au fost adugate la temperatura
camerei (a se vedea mai sus). Solutia a fost agitat la temperatura camerei timp de 2 ore, iar
solventul s-a evaporat la presiune redus. Residuul a fost extras cu eter etilic si ap de trei ori.
Filmul organic a fost deshidratat cu MgSO4 0.5 h, i filtrate iar solventul a fost eliminat prin
evaporare rotativ pentru a da 0,45 g (> 90%) de PDAeNHS alb solid cu 1H NMR (300 MHz,
DMSO), d (ppm): 0.893 (t, 3H), 1.268 (m, 26H), 1.512 (m, 4H), 1.754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H),
2.365 (m, 1H), 2.610 (m, 1H), 2.842 (s, 2H).


Schema 1. Procedura reaciei de sintez pentru PDA-NHS


2.1. Pregtirea culturii de test (E. Coli i Bacillus Cereus)
Culturile de baz de E. coli W1485 au fost obinute de la Dr. David P. Clark, Departamentul
de Microbiologie la Southern Illinois University n Carbondale, Illinois. B. cereus ATCC 14579
a fost obinut din colectia culturilor de la Departamentul de Microbiologie la Southern Illinois
University n Carbondale, Illinois. Celula la o colonie de W1485 E. coli sau B. cereus cultivate
pe medii de cretere din soia i agar (TSA) au fost transferate pe medii de cretere cu sup de
soia (TSB) ntr-un balon conic de 125 ml, de 50 ml i incubate la 37 C cu agitare la 150 rpm
pentru 12 h.Mediile de cretere au fost preparate conform instruciunilor productorului (Difco
Laboratories, Detroit, MI). n urma creterii, celulele au fost recoltate prin centrifugare
(Beckman J2-M1, Schaumburg, IL, Statele Unite ale Americii) la 5500 g timp de 10 min la 4 C
iar lichidul din mediu a fost aruncat. Celulele recoltate au fost introduse n 50 ml de soluie
tampon de fosfat salin, pH 7.0 (PBS). Diluiile (pana la 108) s-au fcut i 0,1 ml din cele 3 diluii
(104, 106, 108) a fost aplicate pe plci TSA pentru a determina numrul de celule.
2.2. Determinarea activitatii cinamaldehidei antimicrobiene n soluie
Activitatea antimicrobian a cinamaldehidei libere n soluie a fost determinat prin metoda
de test flaconul prin agitare (Joerger, Visioli, Urian & Joerger, 2009). Cinamaldehida a fost
adugat n flacoane conice (125 ml) coninnd 50 ml de PBS steril pentru a atinge concentraii
de 60, 120, 180 si 240 mg/ml. Celulele resuspendate au fost apoi adugate la o densitate de
aproximativ 107 UFC/ml n mediul de testare. Au fost efectuate controale pe baloanele ce
conineau organisme de testare n 50 ml PBS fr cinamaldehid.
Flacoane coninnd probele culturii i de control au fost incubate ntr-un shaker de baie de
ap rotativ (New Brunswick Scientific Edison, NJ, Statele Unite ale Americii) la 37 C.Numrul
de celule viabile a fost stabilit periodic ca i colonii formate din uniti (CFU) prin tehnica
rspndirii pe plac folosind TSA i s-au incubat pentru 18-24 h la 35 C. Numrul de celule
pierdute a fost realizat prin calcularea diferenei dintre controlul i tratatele efectuate pe
eantioane exprimat n log10 UFC/ml.
2.3. ncapsularea polifenolilor n lipozomi
PDA (3.7 mg), PDA-NHS (3,0 mg) i compuii cu DMPC (6,6 mg) au fost dizolvai n
cloroform ntr-un balon cu fund rotund. Solventul a fost apoi evaporat prin evaporare rotativ
complet pentru a produce un film subire de monomeri. Filmul a fost hidratat cu o soluie de
cinamaldehid n ap (50 ml) pentru a face o solutie liposomic de concentraie dorit de
cinamaldehid. Suspensia rezultant a fost bombardat sonic folosind o sond sonic (VCX 500,
Vibra-cell, Newtown, CT) la 76 C pentru 15 minute. Soluia a fost apoi trecut printr-un filtru
de 0,45 mm de nailon pentru a elimina agregate lipidelor i rcit la 4 C peste noapte pentru a
favoriza producerea de monomeri.
Soluia rezultat a fost optic clar. n acest stadiu, cinamaldehida a fost ncapsulat n
lipozomi n timpul asamblrii n dublu strat. Suspensia de lipozomii rezultat a fost apoi
ndeprtat pentru a elimina cinamaldehidele nencapsulate.
O membran Spectra/Por Biotech Cellulose Ester (CE) (MWCO: 100.000) a fost nmuiat n
ap deionizat timp de 15 min. Aceast membran a fost folosit pentru dializa cinamaldehidei
libere la suspendarea lipozomilor. Soluia a fost transferat ntr-o membrana de dializa si apa a
fost schimbat dup 2, 8, 14, 24, i 36 h. Lipozomi au fost colectai ntr-un flacon i acoperii cu
folie de aluminiu. n cele din urm, lipozomi au fost polimerizai cu o lamp de iradiere UV care
emite la 254 nm pentru circa 2-5 minute folosind o surs de stilou Ray (UVGL-58, Minerallight,
Upland, CA) surs UV (4,5 mW/cm2) n aer. O curb standard de serie cu concentraii de
cinamaldehide n etanol a fost pregtit pentru a stabili relaia dintre concentraia i absorbie la
285 nm. Concentraia de cinamaldehid n soluia de lipozomi a fost estimat spectrofotometric
utiliznd curba standard.
2.4. Determinarea activitii antimicrobiene a lipozomilor n soluie
Activitatea antibacterian a lipozomilor cinamaldehidici ncapsulai a fost determinat prin
metoda flaconului agitat (Joerger et al., 2009). Doi ml de lipozomi cinamaldehidici ncapsulai a
fost adugat ntr-un balon conic steril care coninea 23 ml de PBS. O suspensie celular a fost
adugat n fiecare vas pentru la o densitatea celular iniial de aproximativ 105 UFC / ml.
Flacoanele au fost incubate ntr-un shaker cu baie de ap rotativ la 36 C pentru 48 h. Bacteriile
viabile din vase au fost numrate la intervale de timp diferite prin placare pe pri n diluii serial
pe mediu TSA i incubate pe o perioada de 18-24 h la 35 C. Densitatea celulelor bacteriene a
fost exprimate n uniti de log10 UFC/ml.
2.5. Imobilizarea lipozomilor cinamaldehidici ncapsulai pe diapozitive de sticl
Lamele de sticl microscopice standard de 7,5 mm 2.5 mm au fost utilizate pentru
imobilizare lipozomilor. Pentru a elimina toi contaminanii, diapozitivele de sticl au fost
curate de sonificare n aceton timp de 10 minute, uscat sub argon pentru 5 min i tratate cu
soluie Piranha proaspt preparat (70% H2SO4:30% H2O2), pentru 30 min. Diapozotivele au
fost apoi cltite cu cantiti mari de ap distilat i uscate sub vid. Silanizarea s-a efectuat prin
scufundarea diapozitivelor de sticl n soluie de aminosilan 4%, 1% acid acetic i etanol de
95%. n timpul silanizrii, containerul a fost amestecat la temperatura camerei. Diapozitivele de
sticl au fost apoi curate cu etanol pentru aproximativ 10 minute i apoi au fost uscate la 110 C
peste noapte i aduse napoi la temperatura camerei (Kamisetty et al., 2006). Diapozitivele au
fost apoi nmuiate n suspensia lipozomilor de cinamaldehida ncapsulai timp de 1 or i apoi
splai cu apa distilat pentru a elimina cinamaldehida liber i uscate sub vid peste noapte.
Diapozitivele au fost apoi pastrate n mediu steril uscat pn la utilizare. Figura 1 arat o
diagram a procesului de imobilizare a cinamaldehidei ncapsulate pe o lamel de sticl.




Fig.1 Imobilizarea lipozomilor pe un diapozitiv de sticl. A. Suprafaa de activare, B.
Silanizarea, C. Imobilizarea



2.6. Imobilizarea lipozomilor cinamaldehidei ncapsulate pe suprafa cu film de acid
polilactic
Rina acidului polilactic (PLA) (NatureWorks LLC, Minnetonka, MN), 0,8 g, a fost
adugat la 10 ml de cloroform iar amestecul a fost agitat cu un amestector magnetic pn cnd
polimerul a fost dizolvat complet. Soluia a fost transferat pe un vas petri Teflon cu diametrul
de 50 mm dup care s-a adugat cloroform care s-a evaporat la temperatura camerei sub o ni
chimic pentru 12 h. Filmul a fost scos din vasul petri i uscat n contunuare sub presiune redus
n exsicator pentru alte 24 h (Jin & Zhang, 2008). Filmul a fost cufundat ntr-o soluie de alcool
cu ap (1:1, v/v) timp de 2 ore pentru a elimina uleiul,a fost splat cu o cantitate abundent de
ap deionizat i uscat sub vid pentru 5 h. Filmul a fost ulterior scufundat n soluia distilat de
hexandiaminepropanol 1,6 (0.06 g/ml) la 50 C timp de 10 min i apoi cltite cu ap deionizat
pentru 24 ore la temperatura camerei pentru a elimina 1,6-hexandiamina liber i uscat la
presiune redus (Zhu, Gao, Liu, el, & Shen, 2004). Filmul aminolizat PLA a fost apoi scufundat
n lipozomi care conineau cinamaldehid timp de 1 h la temperatura camerei i apoi cltit cu ap
deionizat pentru a elimina cinamaldehida liber. Filmul a fost apoi uscat sub vid peste noapte i
pastrat ntr-un vas petri steril ntr-un exicator pn la utilizare.
2.7. ncorporarea cinamaldehidei pe filmul PLA
Rina PLA , 0.80 g i cinamaldehida, 0.02 g, au fost adugate la 10 ml de cloroform iar
amestecul a fost amestecat cu un amestector magnetic pn se dizolv PLA. Soluia a fost
mutat ntr-un vas petri Teflon iar cloroformul a fost evaporat la temperatura camerei sub o ni
chimic pentru 12 h. Filmul a fost separat de vast fiind uscat n continuare peste noapte sub vid.
Filmul rezultat a fost apoi pstrat ntr-un vas petri steril ntr-un exicator pn la utilizare.
2.8. Determinarea activitii microbiene a diapozitivelor de sticl i a filmului PLA
Determinarile activitii antibacteriene de pe diapozitivele de sticl acoperite cu lipozomi
cinamaldehidici, filmul PLA (50 mm diametru) coninnd cinamaldehid i lobozomi
cinamaldehidici imobilizai pe filmul PLA (50 mm diametru) au fost efectuate n vase conice
sterile de 125ml coninnd 50 ml de PBS. Suspensiile de celule de E. coli W1485 sau B. cereus
ATCC 14579 s-au adugat la o densitate celular iniial de aproximativ 105 UFC / ml.
Flacoanele s-au incubat ntr-o baie de ap rotativ la 150 rpm la 36 C pentru 48 h. Bacteriile
viabile au fost numrate la diferite intervale de timp prin metoda placrii de pri de diluii serial
pe mediu TSA iar perioada de incubaie a fost de 18-24 h la 35 C.


2.9. Caracterizarea suprafeei imobilizat cu lipozomi
Probele pentru microscopul atomic (AFM) au fost pregtite prin aplicarea soluiei
lipozomilor pe suprafaa din sticl, urmat de uscare sub vid peste noapte. Topologia lipozomilor
de pe suprafeele de sticl a fost monitorizat folosind un AFM (Veeco, Topometrix TMX1010).
Msurtoarea AFM a fost efectuat prin apsare pe o TopoMetrix Explorer utiliznd un vrf de
siliciu dopat cu stibiu. Cea mai mare suprafa de scanare a fost de 80x80 mm, iar cea mai mare
rezoluie din instrument a fost de 0.2 nm.
2.10. Analiza statistic
Cinamaldehida a fost studiat la 4 nivele diferite de concentraie (60 mg/ml, 120 mg/ml, 180
mg/ml, 240 mg/ml) mpotriva fiecare bacterie i anume E. coli W1485 i B. cereus.
Experimentele de control (n PBS fr cinamaldehid), de asemenea, au fost efectuate pentru
fiecare bacterie separat. Densitatea celulei bacteriene (UFC/ml) a fost obinut din trei replici
efectuate pe zile separate i rezultate au fost convertite n log10 UFC / ml. Diferena dintre log10
UFC/ml de control i log10 UFC/ml de mediu cu cinamaldehid au fost calculate ca reducere de
UFC/ml log10. Reducia rezultate log10 UFC/ml a fost comparat prin analiza varianiei
(ANOVA) i Tukey's HSD (cu diferen semnificativ vizibil) test utiliznd software-ul SAS
9.2.
3. Rezultate i dezbateri
3.1. Activitatea antibacterian a cinamaldehidei libere n soluie
Figurile 2 i 3 arat activitatea antibacterian a cinamaldehidei mpotriva E. coli W1485 i B.
cereus ATCC 14579. Concentraiei de cinamaldehid n acest studiu au fost sub solubilitatea
apoas de cinamaldehid de mai jos: 1100 mg/mL (20 C) (CAS DatabaseNo.14371-10-9). n
comparaie cu E. coli, B. cereus demonstrat extrema sensibilitate la cinamaldehid.
Cinamaldehida a redus B. cereus de la 6.2 log10 UFC/ml la un nivel nedetectabil, n termen de 4
h la 240 mg / ml. Cinamaldehida a artat 3.56 log10 UFC/ml reducerea celulelor E. coli W1485
la sfritul perioadei de incubare (48 h) la 240 mg/ml concentraie. Analiza statistic a reducerii
la log10 UFC/ml de E. coli a artat c reducerea medie la fiecare nivel de cinamaldehid a fost
semnificativ diferit dup 48 h. Rezult c reducerea de log10 UFC/ml de E. coli de nivel de 60 i
120 mg/ml de cinamaldehid nu au fost n mod semnificativ diferite (P 0.21) la 4 h de incubaie.
nseamn c reducerea UFC/ml log10 B. cereus de la nivelul de 180 si 240 mg/ml de
cinamaldehid nu au fost diferite n mod semnificativ (P 1.0) la toate punctele de timp. Media
log10 UFC/ml de reduceri de B. cereus de fiecare nivel de cinamaldehid nu a fost semnificativ
diferit dup 32 h. Acest rezultat susine un studiu anterior care demonstreaz c bacteriilor
pozitive Gram sunt mai sensibile la cinamaldehid comparativ cu bacterii Gram negative, n
cazul n care valorile MIC de cinamaldehide pentru B. cereus i E. coli au fost 3.12 and12.5 ml /
ml respectiv (Sanla-ela, Jangchud, Chonhenchob & Suppakul, 2006). Extrema sensibilitate a B.
cereus la cinamaldehid poate fi din cauza diferenelor dintre membranele pereilor celulari
exteriori ai Gram negativ i cei ai bacteriilor Gram positive. Bacteriile Gram negative au o
membran exterioar hidrofil si enzime degradante i detoxifiante n spaiul periplasmic
(Beveridge, 1999), n timp ce bacteriile Gram pozitive nu au o membran exterioar sau spaiu
periplasmic care s conin enzime protectore (Shan, Cai, Brooks & Corke, 2007).

Fig.2. Activitatea antibacterian a cinamaldehidei mpotriva E. Coli W1485.

3.2. Activitatea bacterian a nanolipozomilor cinamaldehidici ncapsulai
Imaginea AFM aa cum se arat n figura 4 este tipic lipozomilor care conin
cinamaldehid. Graficul AFM din imaginea la 5 spoturi (Fig. 4 (b)) a artat c diametrul
lipozomilor formai au fost ntr-o gama de 100-400 nm. Activitatea antibacterian activitatea a
cinamaldehidei ncapsulate n lipozomi PDA-NHS mpotriva E. coli i B. cereus este indicat n
figurile 5 i respectiv 6. ncapsularea cinamaldehidei n lipozomi PDA-NHS a cauzat reducerea
rapid de E. coli si B. cereus 4.03 i 3.2 log10 UFC/ml n 4 h i la un nivel nedetectabil, n
termen de 8 ore de incubare n PBS la 37 C la concentraie de 864 ng/ml. Concentraia de
cinamaldehid ncapsulat n lipozomii aflai n suspensie msurat spectrofotometric a fost de
10,8 mg/ml.
Cnd lipozomi au fost adugai n mediul de testare, concentraia de cinamaldehid a fost
de 864 ng/ml. Astfel nanoncapsularea cinamaldehidei a mbuntit activitatea antibacterien
pentru c n comparaie cu soluia de cinamaldehid liber,o concentraie mult mai mic a fost
cerut de lipozomi pentru a reduce acelai numr sau mai mare de CFUs. Creterea n activitatea
antibacterian a cinamaldehidei dup ncapsulare ar putea fi cauzat de interaciunea lipozomilor
cu membrana bacterian. Dublustratul liposomelor a fuzionat cu membrana celulei bacteriene i
a eliberat cinamaldehida direct n interiorul celulei (Yang et al., 2009).


Fig.3 Activitatea antibacterian a cinamaldehidei mpotriva B. Cereus ATCC 14579





Fig.4. Imagine AMF a lipozomilor cinamaldehidici ncapsulai




Fig.5. Activitatea bacterian a cinamaldehidei ncapsulate mpotriva E. coli




Fig.6. Activitatea bacterian a cinamaldehidei ncapsulate mpotriva B. cereus

3.3. Activitatea antibacterian a cinamaldehidei nanoncapsulate imobilizat pe
suprafee din sticl
Activitatea antibacterien a diapozitivelor de sticl coninnd lipozomi cinamaldehidici
ncapsulai mpotriva E. coli i B. cereus este prezentata n figurile 7 i 8. n comparaie cu proba
de control fr cinamaldehid, reducerea de 2.56 log10 UFC/ml la de E. coli i 1.59 log10
UFC/ml la B. cereus a celulelor viabile a avut loc n termen de 48 de ore. n timpul primelor 4 h,
numrul de celule viabile B. cereus a sczut rapid aproximativ 1 log10 UFC/ml n balonul de
control, posibil datorit efectelor antibacteriene ale gruparilor aminice libere de pe slide-uri de
sticla. Cu toate acestea, numarul de bacterii viabile din flacoanele cu diapozitive care conineau
lipozomi cu cinamaldehid a sczut cu aproximativ 3 uniti. Dupa 8 ore de incubare rata
inocuitii a ncetinit, probabil din cauza germinrii. Sporii au fost observai la microscop dup 8
ore de incubare n proba de controlul.


3.4. Activitatea antibacterian a filmului PLA acoperit cu cinamaldehid i
cinamaldehid nanoncapsulat
Activitatea antibacterian a PLA film acoperite cu cinamaldehid este prezentat n figurile 9
i 10. Fa de probele de controlul (doar dezvoltarea microorganismelor fr filmul PLA)
reduceri viabile de 2.01 log10 UFC/ml pentru E. coli i de 4.81 log10 UFC / ml la B. cereus au
avut loc n termen de 48 de ore de incubare. Astfel proprietati antibacteriene ale cinamaldehidei
au fost reinute n filmul PLA. B. cereus a fost de 100 de ori mai predispus la cinamaldehid n
filmul PLA dect E. coli. Acest lucru a fost de concordan cu efectul antibacterian al
cinamaldehidei n soluie (figurile 2 i 3). Dup cum sa discutat n seciunea 3.1, celulele Gram
pozitive B. cereus au fost mai susceptibile la cinamaldehid din cauza lipsei membranei
exterioare sau a spaiului periplasmic care conine enzime protector. Filmele PLA imobilizate cu
lipozomi cinamaldehidici ncapsulai nu arata nici activitatea antibacterian mpotriva E. coli
W1485 i B. cereus celulele vegetativ (date nu sunt aratate) n comparaie cu filmele de PLA
care nu sunt acoperite cu cinamaldehid ncapsulat. Poate fi din cauza densitaii gruprilor
aminice (mai puin w1.6 10 7 mol/cm2) de pe filmele PLA dup tratament aminic (Zhu et al.,
2004), rezultnd un numr insuficient de lipozomi imobilizai pe suprafea filmului PLA.
Determinri suplimentare cu densitate mbuntit a gruprilor aminice pe suprafata PLA ar
putea mbunti activitatea antimicrobian a filmelor PLA.


Fig.7. Activitatea antimicrobian a diapozitivelor din sticl ce conin lipozomi
ncapsulai cinamaldehidici imobilizai mpotriva E. Coli W1845



Fig.8. Activitatea antimicrobian a diapozitivelor din sticl ce conin lipozomi
ncapsulai cinamaldehidici imobilizai mpotriva B. Cereus


Fig.9. Activitatea antibacterian a filmelor PLA turnate cu cinamaldehid mpotriva E.
Coli W1485


Fig.10. Activitatea antibacterian a filmelor PLA turnate cu cinamaldehid mpotriva
B. Cereus

4. Concluzii
Cinamaldehida a fost descoperit pentru a fi un agent antimicrobian eficient mpotriva E. coli
W1485 i B. cereus ATCC 14579 n soluii tampon. Efectul antimicrobian al cinamaldehidei a
fost mbuntit de ncapsulare n nanolipozomi. Nanoncapsularea cinamaldehidei a artat un
efect antimicrobian semnificativ cnd a fost aplicat pe suprafeele de sticl, dar acesta nu
prezint nici un efect antimicrobian cnd este aplicat pe suprafeele filmelor PLA. Cu toate
acestea, filmele PLA turnate cu cinamaldehid au artat un efect antimicribian semnificativ.
Acest studiu a demonstrat posibilitatea de a dezvolta suprafee antimicrobiene de sticl acoperite
cu cinamaldehid nanoncapsulat pentru ambalarea activ a alimentelor lichide. Cu toate
acestea, continuarea studiilor este necesar pentru a testa efectul cinamaldehidei n sistemele de
alimentare diferite nainte de utilizarea ei ca agent antimicrobian activ n ambalajele PLA.