BIOCOMPATIBILITATE

LP 2
Scopul testelor de biocompatibilitate
Scopul testelor de biocompatibilitate este de a determina capacitatea de
utilizare a unui dispozitiv pentru uz uman, i pentru a vedea dac utilizarea
dispozitivului respectiv poate sau nu avea un potenial efect fiziologic
nedorit.
Conform Organizaiei Internaionale de Standarde: scopul principal al ISO
10993 este de a proteja oamenii de poteniale riscuri biologice ce pot
provenii de la utilizarea dispozitivelor medicale.
procesul de determinare a biocompatibilitii
unui dispozitiv medical
1. achiziionarea de date
cu privire la materialele
din care sunt realizate
dispozitivele medicale
2. evaluare prin teste in
vitro (de cele mai multe
ori se realizeaz doar pe
anumite pri componente
ale unui dispozitiv
medicale, i nu pe ntreg
dispozitivul medical),
3. confirmare din partea
studiilor realizate in vivo
care vor fi realizate pe
ntreg dispozitivul.
http://www.pacificbiolabs.com
Pregatirea probelor

CULTURI DE CELULE ANIMALE SI UMANE
Tehnica cultivarii celulelor - proces complex in care celulele cresc in afara
tesutului (in vitro) in conditii de laborator strict controlate: asepsie,
sterilitate,
temperatura, gaze si presiune optimizate.

Exista culturi de celule umane, din animale, plante, fungi si microbi, incluzand
- virusuri, bacterii si protista (grupa diversa de microorganisme eucariote)..


Limite:
este necesara o expertiza speciala,
poate avea loc contaminarea
chimica,
biologica,
cross-contaminare,
echipamente si reactivi scumpi,
plastice de unica folosinta

Introducere

Introducere
Avantaje:
diminueaza sacrificarea animalelor,
permite optimizarea cresterii in conditiile controlului mediului extracelular,

Dezavantaje:
dispar interactiile cu mediul in vivo, poate avea loc productia :
proteine nedorite datorita de-diferentierii celulelor

Scopul:
tehnologie indispensabila,
studiul reglarii proliferarii celulare, diferentierii
si formarii unor produsi in conditii controlate, disecarea cailor de semnalizare
care regleaza expresia genica


Termeni
Generatie (numarul de/timpul de): numarul de dedublari pe care le
sufera o populatie celulara/ timpul in care o celula parentala se divide in 2
celule fiice
Proliferare: cresterea numarului de celule de acelasi tip
Celula nediferentiata: celula imatura, primitiva, ce nu a dobandit o structura si o functie
speciala
Diferentiere: proces prin care dintr-o celula generica se dezvolta un tip celular specific ca
raspuns la semnale specifice
De-diferentiere: proces celular in care o celula diferentiata pierde forma si functia ei
speciala si revine la un stadiu de dezvoltare anterior

Cultura de organ: cultivarea unui tesut nativ pentru a retine
majoritatea caracteristicilor histologice in vivo

Cultura histolitica: cultivarea celulelor in vederea reagregarii lor pentru a
forma o structura similara unui tesut

Cultura organotipica: recombinarea unor tipuri celulare diferite pentru a
forma un tesut mai bine definit sau un organ

In secolul 19, fiziologul englez Sydney Ringer a preparat solutii saline ce
contin cloruri de Na, K, Ca si Mg ce mentin in stare viabila cordul unui animal
izolat din corp.

In 1885 Wilhelm Roux a indeparat o portiune din placa medulara a unui
embrion de pui de gaina si a mentinut-o in stare viabila cateva zile intr-o solutie
salina calda punand bazele culturii de tesut.

Ross Granville Harrison care a lucrat la Johns Hopkins Medical School si apoi
la Yale University a publicat rezultatele experimentelor lui din anii 1907- 1910
punand bazele metodologiei culturii de tesuturi.

Tehnicile culturii celulare au avansat semnificativ in anii 1940 - 1950 pentru a
suporta cercetarile de virologie. Virusurile crescute in culturi de celule permit
fabricarea de vaccinuri. Polio-vaccinul injectabil - primul vaccin produs in masa
utilizand tehnicile culturii celulare (1952).

Acest vaccin a stimulat cercetarile lui John Franklin Enders, Thomas Huckle
Weller si Frederick Chapman Robbins care au primit premiul Nobel (1954)
pentru dezvoltarea unor metode de crestere a virusurilor in culturi de celule renale
de maimuta.
ISTORIC
Izolarea celulelor
Celulele pot fi izolate din tesuturi pentru a se obtine culturi ex vivo prin mai multe
metode.

Din tesuturile moi se pot obtine culturi celulare prin doua metode:
digestie enzimatica
si tehnica explantului.

In prima metoda celulele pot fi eliberate din tesuturile moi prin digestia ECM cu
enzime: colagenaza, tripsina sau pronaza.

In a doua metoda, piese de tesut sunt plasate in mediul de crestere, cand celulele ies
din tesut si cresc in mediul de cultura.
Tehnica explantului
Un numar mare de tipuri celulare, plasate intr-un vas de cultura si
intr-un mediu adecvat, adera la peretii interiori ai vasului creand o
cultura de celule aderente.

Majoritatea celulelor derivate din tesuturi solide sunt aderente si
cresc in culturi bi-dimensionale (in monostrat).
Culturi de celule aderente sau in suspensie
Culturi celulare in suspensie culturile derivate din sange (ex.
limfocitele) cresc in suspensie multe celule canceroase -linii
celulare ( accesibile comercial) - adaptate sa creasca in
pentru a se obtine suspensie concentratii mai mari de celule. -
culturile de celule de insecte necesita agitare pentru
omogenizarea mediului

Caracteristici

O cultura primara reprezinta o populatie heterogena de celule;
in conditiile concrete de cultivare unele celule vor muri,
altele vor creste lent,
iar altele vor creste rapid constituind tipul dominant de celule.

In timp, celulele vor creste pana cand vor umple suprafata disponibila
(stare de confluenta) cand apare inhibitia de contact. In acel moment incepe
pasarea culturii prin care se va realiza purificarea celulelor din cultura.

Celulele culturilor primare au o viata limitata (exceptie culturi de celule derivate
de la tumori). Dupa un numar de dedublari a populatiei celulare (limita
Hayflick), celulele sufera un proces de senescenta, diviziunea inceteaza, iar
celulele mai ramin vii o perioada de timp.

Exista celule (macrofagele si neuronii) care nu se divid in vitro si pot exista
numai ca niste culturi primare

Culturile de celule izolate direct dintr-un tesut
Cultura primara

Celulele sunt mentinute in cultura intr-un incubator care pastreaza constanta
temperatura, umiditatea, amestecul gazos (comun, 37
o
C, 5% CO
2
, celule
mamaliene).

Conditiile de cultivare variaza mult de la un tip celular la altul, in functie de fenotipul
exprimat.

Celulele sunt mentinute in stare viabila intr-un mediu de crestere a carui compozitie
variaza cu tipul celular. De regula un mediu de crestere contine substante
nutritive, glucoza, factori de crestere, un anumit pH. Cea mai comuna sursa de factori
de crestere este serul fetal de vitel.

Celulele cresc in recipiente speciale, sterilizate: flascuri, placi Petri, placi multi-well de
diferite dimensiuni si volume.

Plating density PD (nr celule/volum mediu cultura) joaca un rol critic in evolutia
culturii.

Fenotip orice caracteristica observabila la un organism (morfologica, biochimica...)
Factor de crestere o substanta naturala capabila de a stimula cresterea, proliferarea si
diferentierea celulara (de regula un hormon)

Mentinerea celulelor in cultura
Celulele aderente necesita o suprafata pe care sa se ancoreze in vitro (sticla,
plastic, metale).

Recipientele de sticla slide-uri, tuburi, flascuri, usor de spalat si sterilizat,
permit observarea microscopica a culturii; sticla fabricata de
aluminoborosilicat (Pyrex) este preferata sticlei obisnuite care elibereaza ioni
alcalini in mediu.
Recipientele de plastic (polistiren,
polietilena, policarbonat policlorura de
vinil, teflon, etc) nu sunt autoclavabile
(unica folosinta).
In scopul imbunatatirii performantelor in atasarea
celulara, formarea unor suprafete biomimetice,
suprafetele interne ale flascurilor de cultura au fost
acoperite cu proteine : componente ale ECM (colagen,
laminina si fibronectina), mucopolizaharide (heparin sulfat,
hialuronat, condroitin sulfat) sau polimeri sintetici bazici ca
poli-D-lizina
Suporturi cu suprafete biomimetice

10/23/2012 10/23/2012
Mediul de cultura si schimbarea lui
Sute de medii de cultura . . .
Ex.
Mediul bazal EMEM (Eagle's minimal essential medium) este un mediu pentru
multe tipuri celulare
Mediul DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium) contine
aminoacizi (in special glutamina), vitamine, glucoza, sisteme tampon pH, indicator de
pH (Phenol red), etc permite cresterea multor tipuri de celule conjunctive, poate
fi suplimentat specific cu hormoni, factori de crestere (ser) viata limitata, filtrat
steril, diluat steril firme producatoare de medii de cultura.

In cazul culturilor aderente, mediul trebuie schimbat: indeparat direct prin
aspirare si inlocuit cu mediu proaspat


Culturile celulare sunt
inspectate zilnic la un microscop
in contrast de faza la care este
adaptat un aparat de fotografiat


10/23/2012
Curba de crestere a celulelor in cultura.
1. Faza lag - prima faza a cresterii dupa
insamantarea celulelor, de crestere
lenta cand celulele se adapteaza la mediul
de cultura.

2. Faza log (logaritmica) in care celulele
prolifereaza exponential si consuma
substantele nutritive din mediul de crestere.

3. Faza platou (stationara) componentele
nutritive au fost epuizate sau celulele au
ocupat toata suprafata accesibila (strat
monocelular) celulele intra in ultima faza,
cand proliferarea este redusa sau
inceteaza

Variatia densitatii celulare cu timpul cultivarii are un aspect semi-logaritmic.
10/23/2012
Manipularea culturilor de celule
Deoarece celulele continua sa se divida in cultura, ele
cresc si umplu toata suprafata (volumul) accesibila
(celulele ajung la confluenta)

In cursul acestui proces au loc:
- diminuarea nivelului substantelor nutritive din mediu (scade
pH mediului, indicator de pH):
contactele celula-celula stopeaza ciclul celular inhibitie de
contact; pot apare procese de diferentiere, senescenta
acumularea de celule apoptotice/ necrotice.
Printre cele mai comune manipulari: schimbarea
mediului, pasarea celulelor si transfectia lor toate
realizate in conditii sterile, pentru a evita contaminarea

Pentru realizarea conditiilor sterile: Introducerea de
antibiotice (penicilina, streptomicina) si antifungice
(amphotericin B) in mediul de cultura



-
monostratconfluenta

Hota cu flux laminar
Pasarea celulelor
Subcultivarea celulelordin cultura primara permite celulelor sa traiasca in cultura
pentru perioade mai lungi de timp, evitandu-se senescenta
Exemplu: Pasajul incepe cu un flasc care
contine un volum de 12 ml mediu care
contine celule la 80-90 % confluenta (sunt
aderate pe peretele bazal al flascului.
Celulele sunt desprinse de pe peretele
flascului de regula prin tratament cu un
amestec tripsina-EDTA
Suspensia celulara este repartizata in volume egale in alte 3 flascuri de cultura/placi Petri si
se aduce la volumul de 12 ml cu mediu proaspat.

Cele trei flascuri noi sunt plasate in incubatorul de celule (37
o
C, 80 % umiditate, 5 % CO
2
) si
incubate pana cand celulele ajung din nou la confluenta
Cultura secundara
o cultura care deriva dintr-o cultura primara, ce a
suferit cel putin un pasaj

Majoritatea celulelor din culturi secundare se divid de un
numar finit de ori, dupa care mor.
Pe masura ce purificarea tipului celular determinant, dar apar si modificari morfologice
si functionale caretrebuie sa fie monitorizate pentru succesul unui experiment de
inginerie tisulara .

Senescenta celulara este caracterizata in primul rand prin scaderea capacitatii
proliferative a celulelor.
Ex. culturile de fibroblaste din derma umana .
Dupa un numar limitat de diviziuni celulare ( 30- 50 cicluri, daca celulele sunt
izolate din pielea unui adult tanar) scade treptat viteza cresterii si proliferarii
celulare .
Activitatea chemotactica a fibro- blastelor scade progresiv dupa pasajul 25.
Culturile de fibroblaste destinate vinde- carii ulcerelor venoase nu dau randamente
bune daca sunt folosite la pasaje prea mari (> 5).
Celulele canceroase (si celulele transformate):
cresc mai usor si intr-un mediu mai simplu decat celulele normale;
nu prezinta inhibitie de contact; odata ce suprafata discului este acoperita,
cel ul el e conti nua sa se di vi de si sa formeze structuri multistratificate;
prolifereaza nedefinit (nemuritoare).

Ex. Celulele HeLa cea mai veche linie celulara, separata in 1951 dintr-o tumora
canceroasa (carcinom cervical) a colului uterin, de la o femeie Henrietta Lacks de 31 ani,
utilizata si astazi in toate tarile lumii.
Culturi de celule canceroase
Celulele HeLa sunt aderente si nu prezinta
inhibitie de contact
introducere deliberata a acizilor nucleici (DNA si RNA) in celule, in scopul
exprimarii unei proteine de interes tehnica presupune deschiderea temporara a unor
pori in membrana celulelor prin diferite metode, pentru asimilarea materialului
genetic.

Un organism transgenic modficat cu materialul genetic al altei specii, modificarea
este transmisa generatiilor viitoare
Transfectia
-o tehnica este si lipofectia care utilizeaza lipozomi
ce poarta DNA, fuzioneaza cu membrana
celulelor i permite
transformarea celulei.

Aplicatii: biosinteza unor anumite proteine (ex.
productia de insulina), strategii de terapie
genica, generarea de organisme transgenice,
etc.
Culturile celulare pot fi finite sau continuui.
O cultura celulara finita este capabila de un numar limitat de dublari ale populatiei dupa care
proliferarea celulara inceteaza.

O cultura celulara continua are celule capabile de un numar nelimitat de dublari ale
populatiei, deci este o cultura de celule imortalizate.

Liniile celulare formeaza culturi celulare continuui, care nu prezinta inhibitia de contact,
prolifereaza nedefinit si devin imortalizate, se formeaza din culturi primare prin procedee
complicate.

Unele specii, ca rozatoarele dau nastere usor unor linii celulare, in timp ce altele dau
nastere greu (tesuturile umane) sau deloc (tesuturile aviane) unor linii celulare.
liniile celulare umane sunt controversate din punct de vedere bioetic, este necesar acordul
pacientilor de la care se recolteaza piese din corpul lor pentru cercetari stiintifice
Linii celulare
DSMZ realizeaza urmatoarele activitati:
achizitia de linii celulare
controlul identitatii si calitatii
expansiunea celulelor
caracterizarea celulelor
conservarea prin congelare in azot lichid
stocarea celulelor in vials
colectarea datelor relevante in banci de date
distributia liniilor celulare la cerere
cercetari

Firme producatoare de linii celulare stabilizate
American Type Culture Collection (ATCC),
European Collection of Cell Cultures (ECACC),
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) etc
Culturile 2-D pot fi insamantate pe/ in suporturi 3-D poroase si pot forma culturi 3-D.
Ex.hidrogelurile sunt geluri sintetice 3-D ce pot fi utilizate in culturi 3-D pentru a mima
structura ECM, cu aplicatii deosebite in ingineria tisulara..


Culturile celulare aderente, primare si secundare, sunt culturi bi- dimensionale
care cresc intr-un monostrat de celule.
Culturi celulare 2-D si 3-D
Prevenirea contaminarii
Contaminare chimica (medii, ser) cu ioni metalici, endotoxine; impuritati din gazele
incubatoarelor cu CO
2
, reziduri (germicide, pesticide) de la dezinfectarea echipamentelor,
detergenti de la spalarea sticlariei, etc
Contaminarea biologica: bacterii, fungi, drojdii. Mycoplasma
Preventietehnici aseptice , facilitati de
spalare si sterilizare , arii sterile,
antibiotice , apa sterila , etc personal
instruit si autorizat
Sterile work area

Facilitati de sterilizare
Sistem de purificare a
apei si de obtinere a
apei ultrapure Millie-Q
Distilare, osmoza inversa, nanofiltrare

Crioconservarea culturilor celulare
Camera frigorifica Deep-freezer
Congelate pentru stocare in faza de crestere in mediu + dimetilsulfoxid
Cross contaminarea co-prezenta unui alt tip celular, problema
deosebite pentru acuratetea cercetarii in fdomeniu

Problema a fost detectata la liniile celulare utilizate curent in studii de
screening a unor medicamente.

Companiile trebuie sa prezinte la livrare buletine de analiza a cross-
contaminarii. In momentul de fata ATCC utilizeaza tehnica short tandem
repeat (STR) DNA fingerprinting pentru autentificarea liniilor celulare.

Mai mult, verificarea unei linii celulare trebuie realizata si in
laboratoarele de cercetare dupa dezghetarea stocurilor de linii celulare, la
fiecare doua luni in timpul tehnologiei de cultivare si inainte de publicare a
datelor experimentale.

Alte metode de analiza a cross-contaminarii: tiparea HLA (human
lymphocyte antigen), analiza cromozomiala, kariotiparea, etc

Cross- contaminarea liniilor celulare
Evaluarea cantitativa a celulelor in cultura
Metodele directe: evaluarea numarului celulelor
Lama de numarare, microscop in contrast de faza Counter electronic Coulter
Metode indirecte: evaluarea continutului in DNA, proteine
Determinarea viabilitatii celulare
Eliberarea LDH in mediu
Aplicatii
1. Sisteme model:studii fundamentale privind inter-relatiile dintre celule si
boli, efectele unor medicamente, procesul de imbatranire

2. Cercetarea cancerului: studiul diferentelor dintre o celula normala
si o celula canceroasa, transformarea unei celule normale utilizand
radiatii, substante chimice si virusuri, mecanisme care conduc la
tranformarea maligna, medicamente care distrug celulele canceroase, etc

3. Virologie: culturile de celule animale sunt utilizate pentru a replica
virusurile pentru productia de vaccinuri, pentru a detecta si izola
virusuri, pentru a studia cresterea si ciclul de dezvoltare a virusurilor,
studiul mecanismelor de infectie, etc

4. Testarea toxicitatii: studiul efectelor noilor medicamente, cosmetice
asupra supravietuirii, cresterii unor tipuri celulare, dozarea cantitatii maxime
permise Productia de vaccinuri: polio, rabie, varicela, pojar, hepatita B
Productia de proteine prin inginerie genetica: anticorpi
monoclonali , insulina si alti hormoni
Aplicatii
5.Inlocuiri de tesuturi sau organe: piele artificiala pentru vindecarea
ulcerelor metabolice si a arsurilor

6.Consiliere genetica: cultura de celule fetale extrase de la o femeie
gravida permite evidentierea unor anomalii cromozomiale, detectarea
timpurie a unor maladii fetale

7.Inginerie genetica: culturile de celulele animale pot fi utilizate
pentru introducerea unui nou material genetic in celule si studiul expresiei
noilor genesi efectul lor asupra sanatatii celulei

8.Terapie genica: culturile de celule animale pot fi modificate genetic pt
a fi utilizate in terapia genica. Sunt indepartate celule de la un pacient
caruia ii lipseste o gena functionala. In celula se corecteaza defectul
genetic, noile celule se cultiva si sunt transplantate la pacient.

9.Screening si dezvoltare de medicamente:studiul citotoxicitatii unor noi
medicamente

Cultura si ingineria tisulara
Culturile de celule componenta fundamentala a ingineriei tisulare
intelegerea principiilor cresterii tesuturilor si aplicarea lor pentru ameliorarea
sau inlocuirea unor tesuturi
Aplicatii: ficat bioartificial (hepatocitele viabile), pancreas artificial
(celule insulare care produc si regleaza productia de insulina la diabetici, vezi-
ca biliara artificiala , tesut cartilagi-
nos ( reparare cartilaj genunchi ),
piele
artificiala ( celule din pielea
umana crescute in gel de cola-
gen), maduva osoasa artificiala
Alogenice: organismele donor si
receptor apartin aceleasi specii
Xenogenice : celule izolate de la
organisme donor din alte specii
decat organismul receptor
celule stem
celule
Singenice sau isogenice:
organismele donor si receptor sunt
genetic identice
Autoloage: organismul donor
este acelasi cu cel acceptor

Strategii in terapia unor defecte tisulare:
1. celule singure;
2. scaffold singur;
3. Culturi celulare 3-D in scaffold in prezenta
unor factori de crestere
Probleme majore
Sursa celulara: celule mature, progenitor
celule stem din tesuturi umane
Studiul efectelor unor factori de mediu si
a conditiilor de cultivare asupra cresterii
si diferentierii celulare
Dezvoltarea de noi biomateriale 3-D cu diferite
arhitecturi si compozitii bazate pe compusi sin-
tetici sau naturali ce permit atasarea, cresterea si
diferentierea celulelor
Indepartarea gradata a
biomaterialului si inlocuirea lui
cu tesutul regenerat, functional

Culturi de celule stem
Celulele stem pot fi cultivate intr-un mediu artificial si transformate
(diferentiate) la tipul celular dorit
In stroma BM 2-5 celule stem MSC la 1 milion de celule nucleate cu rol crucial in
formarea si regenerarea stromei BM

Materialul start alicote de BM obtinute de la donori sanatosi ce sufera aspirarea
BM pentru transplantul maduvei alogenice (donor similar genetic, dar nu identic)

hMSCs pot fi izolate dintr-un monostrat dupa separarea BM prin centrifugare
in gradient de densitate. Dupa insamantare, la mica densitate, intr-un mediu bazal
suplimentat cu 10 % ser fetal bovin (FBS), populatia celulara aderata la plastic
reprezinta sursa ex vivo primara de MSC

Analiza la microscopul optic sau in contrast de faza arata o populatie de celule
MSC relativ omogena cu un fenotip tip fibroblastic

Dupa subcultivare, MSC manifesta un inalt potential expansiv si variabil.
Unele preparate MSC sufera peste 15 dedublari celulare, altele isi inceteaza
replicarea dupa maximum 4 dedublari diferente datorate numarului mic de
MSC in BM, varsta, alte particularitati ale donorului
Izolarea MSC
ISCT (International Society for Cellular Therapy) recomanda utilizarea termenului de
Multipotent mesenchymal stromal cells pentru acronimul MSC daca celulele
respective indeplinesc urmatoarele criterii:
1. Adera pe vase de plastic in
conditii de cultura standard

3. Potential de diferentiere
multipotent in vitro in osteoblaste,
adipocite, condrocite

2. Exprima specific antigene pe suprafata celulei
Pozitiv > 95 % Negativ < 2 %
CD105, CD73, CD90
CD79 sau CD19, HLA-DR
CD45, CD34, CD14 sau CD11b
MSC human multipotent mesenchymal stromal cells
substante capabile, in conditii adecvate, de a induce un raspuns imun specific si de a
reactiona cu produsii acestui raspuns, anticorpii

determi nant anti geni c - porti unea di n mol ecul el e protei ce sau polizaharidice
care se combina cu anticorpul


Anti genel e CD (Cl uster of Differentiation),
exprimate de leucocite, markeri de pe
suprafata celulelor, utilizati in distingerea unor
linii celulare (cell lineages), a stadiilor de
dezvoltare, identificati cu anti-corpi
monoclonali specifici
Antigenele CD pot fi receptori, glicani,
molecule de adeziune, enzime legate la
membrana
Antigene
Criterii pentru demonstrarea MSC umane
(Dominici et al., 2006)
1. MSC trebuie sa fie celule care adera la plastic cand sunt mentinute in
conditii de cultura standard (numai un subset de MSC isi mentin aceasta
proprietate)

2. > 95 % din populatia MSC trebuie sa exprime CD105 (endoglin,
recunoscut initial de MAb SH2), CD73 (ecto 5-nucleotidaza recunoscuta initial de
MAb SH3 si SH4) si CD90 (numit si Thy-1) evaluate prin flow citometrie; in
contrast cu celulele stem hematopoietice MSC trebuie sa piarda expresia
unor antigene hematopoietice CD45, CD34, CD14 (CD11b), CD79 (CD19) si
HLA clasa II (< 2 % pozitive)

3. Celulele se pot diferentia in osteoblaste, adipocite si condroblaste in
conditii standard de diferentiere in vitro (formarea osteoblastelor
demonstrata prin colorare cu Alizarin Red sau von Kossa; diferentierea
adipocitelor colorare cu Oil Red O; diferentierea condroblastelor colorare cu
Alcian blue sau imunohisto pentru colagen tip II
Detectia fluorescentei la
un flow-citometru dupa
sortarea celulelor
Flow ctometria permite studiul unei singure celule, sortata pe baza unor
caracteristice fizice, biochimice si antigenice, prin masuratori de fluorerscenta
Identificarea mai multor markeri prezenti pe suprafata celulei
demonstreaza existenta unui tip celular stem si permite chiar izolarea lui
dintr-o populatie celulara heterogena


Se observa diferente in expresia antigenelor de pe suprafata celulara
Intre celulele umane si celulele unor specii animale
Intre tipurile de tesuturi la aceeasi specie (om) cu metoda de izolare si cultivare pe
parcursul pasajelor initiale in schitele de expresie in vitro si in vivo

Fenotiparea celulelor pe baza studiului unui numar mare de markeri de
suprafata - garantia rezultatelor unei cercetari pe MSCs
Celulele MSC au fost identificate si in alte tesuturi ale organismului adult:
sangele periferic, periost, tesuturi muscular, adipos si cartilaginos, in
plamani, sistemul nervos centrral, ficat, splina, timus, pulpa dentara, placenta,
etc, s-a demonstrat capacitatea acestor celule de a se diferentia in alte linii
celulare decat cele mezenchimale (hepatocite, celule renale, astrocite) ceea ce
ridica probleme de nomenclatura.

Izolarea si utilizarea acestror probleme nu ridica probleme etice sau de
tumorigenicitate ca CS embrionare, dand sperante utilizarii lor in terapia unor
maladii

Celulele stem pot parasi tesutul de origine (niche) si pot circula in fluxul sangvin,
unde gasim atat MSC cat si HSC

In tesuturile fetale frecventa MSC este mai mare decat in tesuturile adulte,
izolate din in primul trimestru (sangele, ficatul, BM fetala) si din plamani in al
doilea trimestru

Fluidul amniotic (al 2-lea trimestru) - o sursa bogata in MSCs fetale ce
manifesta un fenotip si un potential de diferentiere similar cu cel al MSC izolate
postnatal din BM utilizate terapeutic.
Alte surse de MSC
Diferentierea in vitro a MSCs
Metoda clasica de diferentiere a MSCs in osteoblaste - incubarea unui
monostrat confluent de MSCs cu acid ascorbic, -glicerofosfat si
dexametasone timp de 23 saptamani. MSCs formeaza noduli de
tesut osos ( colorati cu Alizarin Red si prin tehnica von Kossa ),
are loc cresterea expresiei fosfatazei alcaline (FA) si a acumularii
de calciu indici ai osteogenezei. Investigarea BMP (bone
morphogenic proteins) indice al osteogenezei.
A) RT- PCR pent ru ost eo-cal ci na si
f osf at aza alcalina (FA);

B) Colorarea cu Alizarin Red a depo-zitelor
de fosfat de Ca produse de osteoblastele
diferentiate;

C) colorarea pentru FA in culturi deMSC
si respectiv osteoblaste
Metoda clasica de diferentiere a MSCs in adipocite consta in incubarea culturilor de
MSC cu dexametasona, insulina, isobutil metil xantina si indometacin.

Acumul area de vacuol e pl i ne cu l i pi de se moni tori zeaza fie l a microscopul optic, fie
prin colorare cu Oil Red

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in condrocite consta in centrifugarea MSCs,
cultivarea micromasei sedimentate in prezenta TGF- (transforming growth factor-).









Peletul celular se dezvolta intr-o forma multistratificata, bogata in matrice, motiv
pentru care diferentierea este monitorizata histologic prin colorare cu toluidine blue
sau Safranin-O, care indica abundenta glicozaminoglicanilor in matricea extracerlulara si
productia colagenului tip II, tipic cartilajului articular (imunocolorare).


Diferentierea hMSCs in vitro: condro
genica (A) - colorare imuno pt colagen
II; osteogenica (B) colorare Kossa;
adipogenica (C-H) colorare Red Oil

Proprietatile diferite ale sistemelor hematopoietic si stromal
Sistemul hematopoietic Sistemul stromal din BM
Celule stem
(nu se reinoiesc continuu in mod necesar)
Se formeaza la anumite perioade de timp
Faza solida
Viata lunga
Structuri complexe
(multicelulara , legate la matrice)
Fenotip plastic
Celulele stem ce se reinoiesc
continuu
Se formeaza continuu
Faza fluida
Viata scurta
Structuri simple
( unicelulare, fara matrice)
Fenotip inflexibil
BM bone marrow
10/23/2012 10/23/2012
APLICATII
10/23/2012
Utilizarea MSC in terapia umana
10/23/2012
Tratamentul chirurgical post-traumatic sau a defectelor osoase

neoplazice - problema majora a practicii ortopedice. Succesul aplicatiei depinde de
co-prezenta unor factori osteoi nducti vi (i nduc osteogeneza) si
osteoconductivi (permit migrarea, atasarea si proliferarea celulelor, diferentierea
celulelor osteoprogenitor)

Defecte extinse la nivelul tesuturilor moi dupa arsuri profunde, rezectii de tumori
sau traume sunt probleme inca nerezolvate in chirurgia plastica si reparatorie
deoarece nu sunt accesibile inca materiale implant ce pot corec ta cu succes
aceste defecte.

O solutie promitatoare utilizarea celule precursor adipogenice, imature,
numite preadipocite, implantate pe biomateriale 3D

Leziunile traumatice si maladiile degenerative ale T cartilaginos, corelate cu varsta -
problema majora de sanatate a populatiei umane, nerezolvata dat orita
capacitatii limitate de auto-regenerare a TC (nevascularizat si neinervat), la care
mecanismele normale de reparare tisulara si recrutarea celulelor
stem/progenitor la situsul leziunii nu functioneaza. Mai mult densitatea
celulara mica din TC reduce probabilitatea participarii condrocitelor locale la
auto-regenerare

Tratamentul major al sterilitatii
De regula sunt creati mai multi embrioni, sunt pastrati numai cei sanatosi, cei
cu defecte sunt distrusi. Se implanteaza 2-4 embrioni pentru a creste sansa...

Embrionii care nu sunt folositi pot fi congelati pentru a fi utilizati in viitor . La
dezghetare 50 % din embrioni mor.

Zeci de mii de embrioni sunt distrusi in cursul terapiei unui cuplu , pana la final

Clonarea terapeutica - Somatic cell nuclear
transfer (SCNT)
1. De la o persoana cu defect tisular
se preleveaza tesut (piele) din care se
separa celule de la care prin soc
electric se izoleaza materialul nuclear
2. De la un ovul uman se indeparteaza
nucleul
3. In ovulul denucleat se
introduce materialul nuclear de la 1
rezultand o celula totipotenta ce
contine informatia intregului organism
Celulele stem rezultate pot fi
diferentiate la celule specializate ce
pot fi utile in tratamentul unor maladii
severe.
10/23/2012
1996 Primul mamifer clonat din celule adulte
oaia Dolly
2001 Primul embrion uman creat (are 6 celule)
de Advanced Cell Technology (USA)