IZOLAREA I

CONFIRMAREA
BACTERIILOR COLIFORME

Bacteriile coliforme sunt
- bacili aerobi sau facultativ anaerobi,
nesporulai, Gram negativi;
- fermenteaz lactoza la 37
0
C, cu producere de
gaze, n condiiile indicate incubrii uzual pe
mediul B.B.L.V.;
Cele mai multe STANDARDE descriu
procedurile de izolare a speciilor care
fermenteaz lactoza i produc gaze la 35-37C,
de form bacilar sau cocobacilar: E. coli,
Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter i
Serratia.
Limitele contaminrii cu bacterii coliforme
n cazul produselor alimentare de origine
animal sunt foarte largi.
Bacteriile coliforme, nu sunt n general,
bacterii patogene;
sunt INDICATOR SANITAR (igienic);
este recunoscut faptul c i numrul mare,
de bacterii coliforme poate produce fenomene
nedorite produsului sau consumatorului.
n grupa bacteriilor coliforme sunt
cuprinse , n principal, genurile:
-Escherichia,
- Enterobacter i
- Klebsiella (Brzoi D., 1978).
Criteriile morfologice nu sunt suficiente
pentru identificarea genurilor.
Configuraia biochimic este important,
ns examenele serologice bazate pe
structura lor antigenic, sunt considerate
exacte.
Confirmarea serologic a speciei de
cercetat, urmeaz apoi doar ca o continuare
fireasc a finalizrii rezultatelor nu este
utilizata n mod curent.

Pentru efectuarea unor examene serologice
precise este nevoie de decodificarea profilului
biochimic.
Profilul biochimic a fost stabilit prin utilizarea
galeriilor ID 32 E sau galeriilor tip 32 GN,
utilizate pentru identificarea tulpinilor de
Enterobacteriaceae.
Directive generale pentru stabilirea
numrului de bacterii coliforme.
Tehnica numrului cel mai probabil
SR ISO 4831/2009
SR ISO 4831/2009 Directive generale
pentru stabilirea numrului de bacterii
coliforme Tehnica numrului cel mai
probabil prevede directivele generale
pentru stabilirea numrului cel mai
probabil de bacterii coliforme din
produsele ALIMENTARE DE ORIGINE
ANIMAL destinate consumului uman.
Din cauza diversitii produselor alimentare
care intr n acest domeniu de aplicare se
vor aplica pe ct posibil aceste directive
cu exactitate i nu se va recurge la
derogri, dect atunci cnd acest lucru nu
poate fi evitat.
Metoda este mai puin precis dect SR ISO
4832 metoda prin numrarea coloniilor
obinute pe mediu solid, ns permite o
analiz mai substanial.
Definiie
Utilizarea prezentului Standard Internaional, se
aplic urmtoarea definiie:
coliforme sunt bacterii care cresc/se dezvolt la
temperatura specificat (35
o
C sau 37
o
C),
produc fermentarea lactozei, cu producere de gaz,
atunci cnd analiza este efectuat pe mediile de
cultura i n condiiile prevzute n metoda
specificat conform SR ISO 4831.
INCUBAREA
Tuburile nsmnate se vor incuba la
30
o
C, 35
o
C sau 37
o
C (ultimele dou
temperaturi fiind preferate), timp de 24
ore sau 48 de ore (dac la 24 de ore nu se
constat cretere microbian).
Principiu de lucru
nsmnarea a trei eprubete cu mediul de
mbogire B.B.L.V., la trei diluii succesive
(de ex. 10-3, 10-4, 10-5), cu o cantitate
determinat de eantion pentru analiz (1 ml),
dac produsul care se examineaz este lichid
sau cu o cantitate determinat de suspensie-
mam, n cazul produselor solide.
Identic se procedeaz cu nsmnarea
diluiilor obinute din eantionul pentru
analiz sau din suspensia-mam, dar se
utilizeaz mediu BBLV dublu concentrat.

Rensmnarea se face din culturile aflate n
eprubetele cu mediul bulion cu triptoz i
lauril sulfat (LST) dublu concentrat i din
culturile provenite din prima serie de
eprubete cu mediul bulion cu triptoz i
lauril sulfat (LST) simplu concentrat, care
sunt opace, tulburi sau care au provocat o
degajare de gaz, ntr-o serie de eprubete cu
mediu de confirmare bulion lactozat cu bil
i verde briliant (BBLV)
METODA ORIZONTAL PENTRU
ENUMERAREA BACTERI I LOR
COLI FORME.
METODA NUMRRII COLONIILOR.
SR ISO 4832/2009
SR ISO 4832/2009

Acest Standard Internaional stabilete
directivele generale privind obinerea
numrului de bacterii coliforme din
produsele alimetare destinate consumului
uman, prin numrarea direct a coloniilor
caracteristice obinute pe un mediu solid
specific - VRBL, dup incubare la 35
o
C sau
37
o
C i fermentarea lactozei cu producere de
gaz pe mediul BBLV - specificat de standard.
Stabilirea numrului de bacterii
coliforme se efectueaz prin
numrarea direct a coloniilor
obinute pe un mediu solid (VRBL
mediu cu cristal violet, rou neutru,
bil i lactoz), dup incubare la 30
o
C
sau 37
o
C, temperatura fcnd obiectul
unui acord ntre prile interesate.
Definiie
La utilizarea prezentului Standard
Internaional (S.I.), se aplic urmtoarea
definiie: prin bacterii coliforme se neleg
bacteriile care cresc/se dezvolt, la
temperatura specificat (adic 35
o
C sau 37
o
C,
conform nelegerii), formeaz colonii
caracteristice n mediu de VRBL (geloz-
lactoz, bil, cristal violet i cu rou neutru),
atunci cnd analiza este efectuat dup
metoda specificat n prezentul S.I.
Principiu
nsmnarea n profunzimea unui mediu
selectiv solid (VRBL), turnat n dou plci
Petri, cu o cantitate determinat de eantion
pentru analiz, dac produsul care se
examineaz este lichid sau cu o cantitate
determinat de suspensie-mam.
nsmnarea a cel puin nc o diluie
urmtoare, obinute din eantionul pentru
analiz sau din suspensia-mam.
INCUBAREA plcilor se face la 35
o
C sau
37
o
C, timp de 24 - 48 ore.
ATENIE!
NSMNAREA
Pe mediul VRBL se efectueaz ntre 2 straturi de
mediu. Aceasta presupune turnarea unui strat n
cantitate de 12-15ml, se las la solidificat, se adaug
inoculum, iar dup ce acesta a ptruns n mediu se
adaug un al doilea strat de mediu (4 ml la
temperatura de 44
o
C, maxim 47
o
C), pentru a limita
dezvoltarea coloniilor i a fi numrate cu uurin.

INCUBAREA plcilor se face la 30
o
C, 35
o
C sau
37
o
C, timp de 24 - 48 ore.
CITIREA sau NUMRAREA
Se consider colonii prezumtive de bacterii
coliforme, acele colonii care prezint coloraie
roz i au un diametru mai mare de 0,5 mm.
Se citesc plcile cu colonii tipice care conin ntre
10 i 150 de colonii.
Citirea coloniilor caracteristice pe mediul VRBL
trebuie difereniate de coloniile de Escherichia
coli i alte tipuri de coliformi.
Coliformi totali Coliformi termotolerani


Coliformi totali Coliformi termotolerani

Coliformi totali sunt bacteriile care cresc pe
medii specifice pentru coliformi la temperatura
de incubare de 35
o
C sau 37
o
C.

Coliformi termotolerani sunt reprezentani de
bacteriile care cresc pe medii specifice pentru
coliformi la temperatura de incubare de 44
o
C.




Tipul de bacterii
Care se dezvolt
Incubare le 30
o
C Incubare le 44
o
C sau
44,5
o
C
Coliformi totali Colonii roz
Diametru <0,5 mm
Inhibate sau colonii necaracteristice
Coliformi termotolerani Colonii roz
Diametru > 0,5 mm
Colonii roz
Diametru > 0,5 mm
Alte bacterii
Necoliforme
Colonii incolore sau de alte culori
Diametru < 0,5 mm
Inhibate sau colonii necaracteristice
Bacterii coliforme pe mediul VRBL
CONFIRMAREA
Se preleveaz cte 5 colonii minim din fiecare plac n
care s-au identificat colonii tipice de bacterii coliforme
i se nsmeaz n cte un tub cu cte 10 ml de BBLV
(bulion , bila, lactoz i verde briliant ).
INCUBAREA
Tuburile cu cte 10 ml de bulion lactoz i verde
briliant nsmnate se vor incuba 35
o
C sau 37
o
C,
timp de 24 - 48 ore.
Se considera coliformi - bacteriile care formeaz
colonii tipice pe mediul VRBL i formeaz gaz n
tubuleele DURHAM - la T
o
de incubare din SR ISO
pe mediul BBLV.

IZOLAREA I CONFIRMAREA
SPECIEI ESCHERI CHI A COLI DIN
PRODUSELE ALIMENTARE DE
ORIGINE ANIMAL
Izolarea i confirmarea Escherichia coli din
produsele alimentare se efectueaz
- conform SR ISO/TS 16 649 1,2,3/2009 sau
conform SR ISO 7251/2009

E. coli reprezint cel mai bun indicator al
CONTAMINRII FECALE a produselor
alimentare.
E. coli reprezint un bun indicator al
CONTAMINRII RECENTE a produselor
alimentare.
Trebuie sublinat aspectul de adaptabilitate
al bacteriilor n general i al speciei E. coli
n special, la modificri de temperatur:
frig, congelare, modificri de umiditate
(uscciune), modificri de pH, rezisten
la antibiotice, etc.
Escherichia coli sau colibacilii sunt bacterii aerobe
din grupul coliformelor, se prezint sub form de
bastona, sunt mobile, nesporogene, fermenteaz lactoza
la 44
0
C, cu producere de gaze i formare de indol din
triptofan .
Ross T., Ratkowsky D.A., Mellefont L.A.,
McMeekin, (2003), consider c dezvoltarea speciei
E. coli este influenat de mai muli factori:
temperatur - este favorizat de o temperatur cuprins
ntre 7,63 i 47,43C, existena unor soluii, la o
activitatea a apei cuprins ntre 0,951 i 0,999, ajutat
de soluii de clorur de sodiu i la un pH situat ntre 4,0
i 8,2.
Mecanismele adaptrilor sunt de natur
genetic, traduse prin modificri n genom i
al transcripiei expresiei acestor modificri la
nivelul genelor.
COLIBACILII sunt bacterii care au form
de bastonae mici, drepte - bacili sau
cocobacili (2,0-6,0/1,1-1,5 micrometri, vii i
1,0-3,0/0,4-0,7 micrometri, moarte i
colorate), Gram negative, aezate izolat sau
n perechi, adesea mobile dar i imobile,
unele tulpini capsuleaz, formnd
microcapsule, asporogene.
Temperatura optim de dezvoltare este de 37
0
C,
dar se dezvolt foarte bine i la 44-45
0
C. Aceast
ultim temperatur fiind un criteriu de
diferniere, denumit testul Eyjkman-Mackensie.
n laboratoare de bacteriologie alimentar, aceast
test se utilizeaz pentru diferenierea lui E. coli
de speciile nrudite, de tip Enterobacter,
Klebsiella sau alte enterobacterii.
E. coli se dezvolt foarte bine n prezena
srurilor biliare i a bilei, a srurilor de seleniu, a
colorantului verde briliant, a tetrationatului, etc.
Se dezvolt bine la pH neutru; nu se dezvolt la
pH mai mic de 5,9 i mor la pH acid.
Pe medii nutritive simple se dezvolt bine,
producnd turbiditate intens, uneori cu inel la
suprafa pe bulionul simplu, cu adunarea unui
depozit n cazul culturilor vechi, iar pe suprafaa
agarului nutritiv cresc colonii netede, de 2-6 mm,
uor convexe, opace, nepigmentate, de tip S.
Culturile degaj miros fecaloid, amoniacal.
Brzoi D. i colab., (1999), descriu c
aproximativ 95% din tulpinile de E. coli sunt
indol pozitive, rou-metil pozitive, Voges-
Proskauer negative, citrat negative, beta-
galactozidaz i beta-glucuronidaz pozitive
i sunt cuprinse n E. coli biotipul 1.
Celelalte tulpini rspund diferit, fiind indol
negative, nu elaboreaz enzime de tipul
beta-galactozidaz i beta-glucuronidaz i
sunt catalogate ca aparinnd E. coli
biotipului 2.
Testele biochimice cele mai importante i care
sunt utilizate pentru identificarea speciei E. coli
au fost urmtoarele:
cretere aerob la 44-45
0
C;
producere de gaze captate n tubulee Durham
n medii specifice BBLV, LST, etc.;
producerea indolului;
fermentarea glucozei i/sau lactozei;
formarea de colonii roii-violacee, cu centrul
mai nchis la culoare, cu reflexe metalizate auriu-
verzui, caracteristice pe suprafaa mediului
GEAM sau Levine
utilizarea glucozei cu formarea de produi
acizi stabili, ceea ce determin reacia roului
de metil pozitiv;
metabolizarea glucozei cu producere de
acetoin, reacia Voges-Proskauer negativ;
neutilizarea citratului ca unic surs de
carbon;
fermentarea sorbitolul i producerea beta-
galactozidazei, exceptnd tulpinile de E. coli
O
157
H
7
- enterohemoragic.
Speciile din genul Escherichia fermenteaz
glucoza, lactoza, manita, trehaloza, produc
lizin-decarboxilaz. Exist i unele excepii, de
exemplu, tulpinile enteroinvazive, care sunt
lactoz i lizindecarbixilaz negative.
Diferenierea tulpinilor aparinnd biotipului 1
fa de biotipul 2 se efectueaz pe baza testului
IMVIC.