Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
DETERMINAREA PROTEINELOR - Determinarea Azotului
DETERMINAREA PROTEINELOR - Determinarea Azotului
Rolul proteinelor:
- surs de energie
- surs de aminoacizi eseniali - meninerea sntii
- component major al alimentelor
- utliziat ca i ingredient - confer alimentelor proprieti speciale.
1.
Nt = Na + No = Na + Nnep + Np
- anorganic : NO3-, NH4+
- organic : proteic i neproteic.
(De regul speciile anorganice sunt solubile n ap putnd fi uor de ndeprtat
din aliment prin simpla dizolvare n ap)
Cnd exist cantiti mari de elemente ale grupei metalelor alcalinopmntoase, sulfaii acestora precipit provocnd pierderi prin
coprecipitare.
Operaia dureaz de obicei mult, n funcie de cantitatea i de natura
substanei oxidate (mai ales n cazul probelor bogate n grsimi).
NH4+ + H2BO3-
Avantaje i dezavantaje
Avantaje: Este mult mai rapid dect metoda Kjeldahl (sub 4
min/determinare). Nu necesit reactivi toxici, msurarea se poate face
automat, este simplu de utilizat.
Protein
pH-izoelectric
Pepsin
1
Ovalbumin
4.6
Albumin seric
4,9
-lactoglobulin
5,2
Protein
1- globulin
Hemoglobin
Mioglobin
Ribonucleaz
pH-izoelectric
6,6
6,8
7
9,6
ANALIZA AMINOACIZILOR
Analiza aminoacizilor depinde de muli factori:
- matricea probei,
- concentraia de aminoacizi,
- sensibilitatea ceruta,
- tipul analizei.
In urma analizei se determina:
- profil de aminoacizi liberi
- profil total de aminoacizi (dup hidroliz).
ETAPE
1. Pregtirea probei
Tratamentul probelor difer, depinznd de scopul analizei.
- Pentru determinarea aminoacizilor liberi este necesara obinerea unui extract,
purificare si derivatizare nainte de determinare.
- Pentru determinarea coninutului total de aminoacizi - etapa de hidroliz.
Extracia - se poate realiza in cazul matricilor insolubile (peste, carne, cereale, etc.) si de obicei
se realizeaz prin omogenizarea probei mrunite sau mcinate ntr-un solvent potrivit. Exist
aparate specializate (Polytron Stomacher) sau dispozitive mai simple care presupun agitarea
cu sau fr nclzire. Aminoacizii sunt solubili n ap, cisteina i tirozina avnd solubilitatea
mai mic. De regula se utilizeaz ap sau o soluii de acid sulfosalicilic 4%, acid tricloracetic
5%, HCl 0,1 N. Se pot utiliza de asemenea i soluii alcoolice (etanol, metanol) care prezint
avantajul de a nu extrage proteinele (nu mai este necesar purificarea ulterioara a extractului).
Solidele solubile necesit doar dizolvare preliminar.
In cazul probelor lichide nu se mai pune n discuie extracia.
ANALIZA AMINOACIZILOR
2. Purificarea probei
- izolarea aminoacizilor de ali compui extrai (proteine, carbohidrai, grsimi)
- este necesar pentru a evita probleme poteniale cum ar fi colmatarea coloanei
analitice i/sau interaciunea cu ali compui extrai cum ar fi proteinele.
Prezena grsimilor nu ridic probleme pentru extracie dar trebuie ndeprtate pentru a
preveni interferenele sau deprecierea coloanei. Grsimile sunt extrase din probe solide cu un
amestec cloroform : acetona (1:3), sau extractul poate fi splat succesiv cu acetat de etil i
dietileter.
Extractul obinut este centrifugat la rece (4 C) iar supernatantul filtrat prin vat de sticl cnd
se rein materiile grase de pe suprafaa supernatantului.
Separarea de proteine i polipeptide - deproteinizare.
- chimic se realizeaz cu soluii concentrate de acizi tari, acid sulfosalicilic,
percloric, trifluoracetic, picric, fosfomolibdenic, soluii concentrate saline, solveni organici
(metanol, etanol, acetonitril). n aceste condiii proteinele precipita prin denaturare n timp ce
aminoacizii rmn n soluie.
- fizic presupune centrifugarea prin filtre membrane limitative (CUT-OFF) care
permit trecerea aminoacizilor n timp ce compuii cu masa moleculara mare sunt reinui.
Diferena dintre aceste metode consta in:
- diferena ntre masa moleculara a moleculelor excluse,
- grad de recuperare a aminoacizilor,
- compatibilitatea cu condiiile de derivatizare i cele necesare separrii analitice.
ANALIZA AMINOACIZILOR
Exemple:
- Acidul fosfomolibdenic este foarte eficient dar produce pierderi de aminoacizi cu
caracter acid si/sau bazic n special lizin. Acizii tari scad foarte mult valoarea pH-ului n contextul n
care derivatizarea se realizeaz n medii bazice pentru analizele prin derivatizare precoloan.
ndeprtarea acidului se realizeaz prin evaporare i/sau ajustarea pH-ului. n cazul n care analiza
se realizeaz prin cromatografie de schimb ionic i derivatizare postcoloan nu mai apar probleme.
Chiar dac acidul sulfosalicilic este cel mai utilizat agent de deproteinizare s-au constatat unele
interferene i grade sczute de recuperare.
- Utilizarea solvenilor organici prin amestecarea a 2-3 volume solvent organic cu un
volum extract are rezultate foarte bune, gradul de recuperare fiind aproape de 100%. Prezint
avantajul c este uor de ndeprtat prin evaporare.
- Soluiile saline concentrate nu sunt utilizate la deproteinizare deoarece interfer n
procesul de derivatizare i hidroliz.
Purificarea probelor utiliznd rini schimbtoare de cationi (cationii) rein aminoacizii din
medii acide n timp ce ali interfereni cum ar fi carbohidraii trec prin coloana nefiind reinui.
Ulterior aminoacizii sunt desorbii cu o baz volatil care apoi este nlturat prin evaporare.
n cazul extraciei pe faz solid cu C18 compuii cum ar fi grsimile, proteinele i peptidele
sunt reinute, n timp ce compuii polari i aminoacizii trec nereinui. Metoda nu este foarte
bun deoarece aminoacizii hidrofobi se pot reine (grade mici de recuperare) iar compuii
hidrofili nu se rein, impurificnd extractul.
ANALIZA AMINOACIZILOR
Hidroliza
1. Hidroliza acid - proba este tratat cu HCl 6N la 110C timp de 20-96 h sau 145C timp de 4 h.
n aceste condiii dure poate avea loc degradarea unor aminoacizi. Digestia se realizeaz n
recipiente nchise n atmosfer inert de azot, pentru a minimiza degradrile. Hidroliza poate fi
realizat att cu metode n faz lichid ct i gazoas. n metodele n faz lichid HCl este n
contact direct cu proba, fiind potrivit pentru probe complexe (cereale etc.). Hidrolizatul
contine multi interferenti, de aceea analiza necesita metode cromatografice prin schimb ionic
i derivatizare postcoloan. Digestia n faz gazoas reduce zgomotul de fond. n cazul
cantitilor limitate de probe se utilizeaz hidroliza n faz de vapori. n aceast metod n
tubul de hidroliz este plasat proba i apoi totul ntr-un vas mare ce conine HCl. Atmosfera
oxidant (oxigen) este nlocuit cu azot inert. n urma nclzirii numai vaporii de HCl vin n
contact cu proba, fiind astfel exclus contaminarea cu compui nevolatili. Aceast metod
este mai potrivit pentru determinrile cu derivatizare precoloan.
Hidroliza poate fi mbuntit prin optimizarea temperaturii i a timpului de hidroliza, sau prin
adugarea de compui protectori ai aminoacizi labili (tirosin, serin, treonin, metionin,
triptofan-foarte sensibil n probele cu coninut ridicat de carbohidrai) cum ar fi: fenol,
Na2SO3, triptamin, mercaptoetanol, acid mercaptoetenoic, acid tio- i ditiodipropionic. De
asemenea HCl poate fi nlocuit cu acid metansulfonic 4 N. Se utilizeaz agenii de alchilare
pentru a stabiliza aminoacidul (cisteina) rezultat n urma hidrolizei: acid brompropionic, acid
iodoacetic bromopropilamina, vinilpiridina. Glutamina i asparagina sunt dezaminate n timpul
hidrolizei i sunt codeterminate cu acidul glutamic i aspartic. O alt problema de care trebuie
inut cont este rmnerea intact a unor peptide chiar dup 24 de ore de hidroliz. Aceste
polipeptide sunt formate n principal de ctre aminoacizii hidrofobi cum ar fi valina, leucina,
isoleucina, i fenilalanina. Aceste peptide sunt mult mai rezistente fa de hidroliz i necesit
o perioad mai lung. Dar aceste condiii ar duce la degradarea altor aminoacizi.
ANALIZA AMINOACIZILOR
Aa cum se observ nu exist nici un set de condiii experimentale care s ndeplineasc toate
condiiile metodele utilizate reprezint un compromis pentru obinerea unui numr ct mai mare
de aminoacizi. Se realizeaz o hidroliza la 110 C 22-24 h, de preferat n stare de vapori, n
prezen de ageni protectivi (fenol). Pentru analiza triptofanului i cisteinei sunt necesare
proceduri speciale.
2. Hidroliza alcalin se realizeaza cu soluii 4,2 M de NaOH, KOH, LiOH sau Ba(OH)2 cu sau
fr adiie de 1% (m/v) tioglicol timp de 18 h la 110 0C.
3. Hidroliza enzimatic - se realizeaz cu enzime proteolitice cum ar fi tripsina, chimotripsina,
carboxipeptidaz, papain, thermolizin. Trebuie sa se tina cont de activitatea specific a
enzimei utilizate.
ANALIZA AMINOACIZILOR
DETERMINAREA CANTITATII TOTALE DE AMINOACIZI
Cea mai simpla sarcina este determinarea continutului total de aminoacizi, fara a face
discriminare unii de altii. Sunt metode spectrofotometrice, care se bazeaza pe reactia
gruparilor -aminice cu reactivi:
- o-ftaldialdehida,
- ninhidrina
- acid trinitro-benzen-sulfonic.
Exista o corelatie liniara intre intensitatea absorbtiei/emisiei si concentratia gruparilor aminice.
Se aplica pentru:
- obtinerea indexului protelitic,
- controlul gradului de hidroliza a proteinelor alimentare,
- controlul procesului de eliminare a proteinelor din vin,
- controlul proceselor de fabricatie (branza),
- dezvoltarea aromei pe baza aminoacizilor care in urma transformarilor genereaza
compusi ce comfera aroma, etc.
ANALIZA AMINOACIZILOR
METODE DE DETERMINARE CARE IMPLICA TEHNICI DE SEPARARE
Analiza aminoacizilor individuali necesit o separare prealabil mai puin cazul in care se
utilizeaz metode selective de determinare.
determinare Separarea aminoacizilor din amestec necesita
tehnici de separare foarte eficiente cum ar fi cromatografia (HPLC, CG) sau electroforeza
capilara. Alegerea tehnicii de analiza depinde in principal de echipamentul disponibil i de
preferinele personalului, deoarece fiecare metoda prezint avantaje si dezavantaje.
A) Cromatografia de lichide
1. Metode prin schimb cationic - se bazeaz pe faptul ca aminoacizii au sarcin electric. Ca
faz staionar se utilizeaz polistirenul sulfonat cu soluii apoase tampon de citrat de sodiu
ca faze mobile. Elutia se realizeaz cu gradient, creterea att a pH-ului ct si a concentraiei.
In aceste condiii aminoacizii cu caracterul cel mai acid vor iei primii iar cei cu doua sau mai
multe grupri amino primare vor fi eluati mai trziu. Dup separare aminoacizii sunt
derivatizai pentru detecie fie in VIZ fie in fluorescen. Se pot utiliza de asemenea si
detectori electrochimici. Avantajul metodei este ca da rezultate foarte precise pentru toate
tipurile de probe cunoscute. Este considerat metoda de referint. Fiecare metod noua
trebuie sa se raporteze la aceast metod. Dezavantajul major const in costul ridicat al
aparaturii, a fazelor mobile complexe i a timpului lung de analiz.
ANALIZA AMINOACIZILOR
2. Crompatografie de lichide cu faz invers (RP-HPLC) - este foarte utilizata deoarece poate
fi folosita i pentru alte aplicaii.
n acest caz aminoacizii trebuie derivatizai nainte de separare pentru ai transforma n
molecule hidrofobe, astfel nct s poat participa la procese de repartiie ntre faza
stationar i cea mobil. Totodat derivatizarea va permite o detectie mai bun.
- Faza mobil trebuie s dizolve proba pentru a fi transparent pentru sistemul de
detectie. Faza mobil este o combinaie de tampon apos cu un solvent organic ca
metanol, acetonitril, tetrahidrofuran. Tamponul este format din soluii cel mult
100mM de acetat sau fosfat. De regul eluia se realizeaz cu gradient.
- Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel chimic modificate cu
grupri alchil, n principal C18. Selectivitatea obinut cu coloane provenite de la
productori diferiti este diferit datorit metodelor diferite de atasare a lantului
alchil de suprafata suportului de silicagel, de densitatea acoperirii care comfera
un grad mai mare sau mai mic de hidrofobicitate.
Deasemenea gruprile silanol nereactionate pot interaciona cu moleculele aminoacidului
ducnd la aparitia picurilor cu cozi. Pentru a preveni acest inconvenient se poaze aduga
trietilamin.
Analiza aminoacizilor
Derivatizarea - are ca scop mbuntirea :
- separarii,
- deteciei.
Eficiena agentului de derivatizare este evaluat pe baza urmtoarelor aspecte:
- s reacioneze att cu aminoacizii primari ct i cu cei secundari,
- s dea un singur derivat cu fiecare aninoacid,
- s reacioneze cantitativ i reproductibil,
- produsul rezultat s fie stabil,
- s nu existe interferene ale produilor secundari sau a excesului de agent de
derivatizare,
- s necesite condiii simple i blnde de reacie,
- s prezinte posibilitate de automatizare.
Analiza aminoacizilor
DERIVATIZARE N VEDEREA MBUNTIRII DETECIEI - sensibilitatea i selectivitatea deteciei
sunt influentate de proprietile spectrale i electrochimice a derivailor obinui. Alegerea
agentului de derivatizare este fosrte important.
Detecie spectroscopic - se bazeaza pe ataarea de molecula aminoacidului grupri care
confer moleculei derivate proprieti absorbante (UV/Viz) sau fluorescente. Derivatizarea se
poate realiza naintea separrii - derivatizare precoloan sau dup separare - derivatizare
postcoloan. Derivatizarea precoloan att on-line ct i off-line iar cea postcoloan se
realizeaz on-line.
C6H5-NH-CS-NH-HCR-COOH
Analiza aminoacizilor
b. Clorura de 4-dimetil-aminobenzen-4-sulfonil (Dabsyl-Cl sau DBS) - detecie n domeniul vizibil
la 448-468 nm. Lungimea de unda mare de absorbie face ca linia de baz a cromatogramei s
fie stabil pentru multe sisteme de solveni. Limita de detecie n domeniul picomolilor. Derivaii
sunt foarte stabili (1 sptmn) i pot fi formai att de aminioacizii primari ct i cei
secundari. Timpul de reacie este de aprox. 15 min la 70 C, are loc n mediu bazic cu exces de
reactiv. Eficiena reaciei depinde foarte mult de matrice i variaz funcie de tipul aminoacidului
i prezena clorurilor n concentraie mare.
O
H2N
N N
S Cl + H2N CH
O
COOH
-HCl
O
H2N
N N
S
O
R
HN CH
COOH
Analiza aminoacizilor
c. Clorura de 1-dimetilamino-naftalen-5-sulfonil (Dansyl-Cl) - este mult folosit pentru
determinarea azotului terminal din proteine i peptide. Reacioneaz cu aminoacizii primari i
secundari dnd un derivat puternic fluorescent (detecie prin excitare la 350 nm i msurarea
emisiei la 510 nm sau detecie la 250 nm). Derivatul este stabil 1 zi sau 7 zile la ntuneric i la
-40 C. Derivatizarea este simpl, necesit mediu bazic pH-9,5 timp de reacie 1 h la
temperatura camerei la ntuneric / 15 min la 60C sau 2 min la 100C. Poate forma derivai
multiplii cu histidina, lisina i tirosina, deci condiiile de reacie trebuie optimizate i atent
controlate.
N(CH3)2
N(CH3)2
R
+
H2N CH
COOH
SO2Cl
-HCl
R
SO2 NH CH
COOH
Analiza aminoacizilor
d. 5-5'-ditio-bis(nitrobenzoic acid) (DTNB) - utilizat pentru aminoacizii cu sulf
HOOC
O2N
O2N
S
S
HOOC
HOOC
+
HS R
O2N
S S R
O2N
S H
HOOC
Analiza aminoacizilor
g. 9-fluorenilmetil-cloroformate (F-MOC) - d derivai fluorescenti atat cu aminele primare cat
si cu cele secundare, lungimea de und de excitare 265nm, emisie 315 nm. Dezavantajul cel
mai mare este ca reactivul de derivatizare este fluorescent i poate interfera in determinare.
Este extras nainte de analiz. Reactioneaza cu amine puternic hidrofobe rezultnd compui
cu timp de retenie mare. Timp de reacie 45-90s fara incalzire.
O
+
O C
Cl
H2N
CH
COOH
O
- HCl
O C
NH
R
CH
COOH
Analiza aminoacizilor
2. Derivatizarea postcoloan - implic separarea aminoacizilor liberi prin cromatografie de
lichide, introducerea n efluent a agentului de derivatizare potrivit, amestecarea i trimiterea
lor cu ajutorul unei pompe n camera de reacie i n final pomparea derivatului obinut n
detector. Principalul dezavantaj al acestui tip de derivatizare este c necesit echipament
adiional: o pomp pentru introducerea i amestecarea agentului de derivatizare i eventual un
dispozitiv de nclzire. Un alt dezavantaj este lrgirea picului la baz produs de ctre volumul
mort introdus dup coloan.
Ca i reactivi de derivatizare se utilizeaz: ninhidrina, fluorescamina i aldehida o-ftalic.
a. fluorescamina nu este fluorescenta, derivatul se masoara la 475 excitare la 390nm. Un
dezavantaj major este acela c reacia are loc n mediu bazic, n contextul n care separarea
prin schimb ionic are loc n mediu acid. Aceasta face necesar adaugarea unei pompe
suplimentare pentru a introduce un tampon bazic nainte de a reactia cu fluorescaina. Se
folosete numai n cazul derivatizrilor speciale.
R
R
HC NH2
COOH
O
+
HOOC C H
N
O
OH
OH
O
O
Analiza aminoacizilor
b. ninhidrina - reacioneaz cu toi cei 20 de aminoacizi dnd compui colorai fr a produce
compui secundari sau mai muli compui de derivatizare. Derivaii provenii de la amine
primare dau un produs albastru cu maximul de absorbie la 570 nm, iar cei provenii de la
amine secundare dau un compus brun cu maximul de absorbie n jur de 440 nm.
O
O
OH
H2N CH
OH
N CH
COOH
COOH
O
O
O
NH2
O
+
R C
CO2
O
O
O
OH
NH2
OH
O
O
N
2H O
2
Analiza aminoacizilor
DERIVATIZARI IN VEDEREA OBTINERII UNEI SEPRARI MAI BUNE
Scopul acestor derivatizari este de a obtine compusi volatili si termostabili in vederea
analizei GC.
Derivatizarea se realizeaza in doua etape:
- esterificare cu alcooli acidulati cu HCl 3M, de exemplu: metanol, i-propanol, ibutanol, n-propanol, n-butanol si alcool i-amilic (gruparea COOH).
- N-acilare cu o anhidrida acida in mediu anhidru : anhidrida trifluoracetica,
anhidrida pentafluoropropionica, N-tert(butildimetilsilil)trifluoracetamida
(gruparea NH2).