IMUNOLOGIA

TRANSPLANTULUI

ILEANA CONSTANTINESCU

EDITURA UMF CAROL DAVILA

1

2009

PREFA
Atunci cnd m gndesc la o boal,
nu caut niciodat un leac pentru aceasta,
ci un miljoc de a o preveni.
LOUIS PASTEUR

Imunologia transplantului este o specialitate nou care i croiete

drumul ntre specialiti prin frumuseea abordrii noilor tehnologii de
biologie molecular, prin semnificaia rezultatelor i impactul acestora
asupra deznodmntului transplantului.
Att genotiparea alelelor HLA ct i detecia i identificarea
anticorpilor citotoxici sunt investigaii imunologice de transplant care au
nevoie de o interpretare extrem de laborioas, iar expertiza imunologului
este extrem de important n transplantul renal, medular, cardiac,
hepatic, pulmonar, pancreatic, etc.
Alturi de investigaiile imunologice pretransplant sunt foarte
importante i evalurile posttransplant care urmresc posibila apariie a
rejetului subclinic, apariia neoplaziilor sau a altor complicaii
imunologice legate de regimurile imunosupresoare practicate, care sunt
decisive n ceea ce privete evoluia pacienilor transplantai.
Centrul de Imunogenetic i Virusologie, Fundeni, a fost nfinat n
anul 2000 i are ca domeniu de activitate imunologia transplantului,
imunologia tumoral, diagnosticul virusologic. Acest centru, este centru
de referin metodologic n imunologia transplantului pentru Romnia din
anul 2006, n acelai an obinnd i acreditarea cu Federaia European
de Imunogenetic (EFI). Seria acreditrilor a fost completat de
acreditarea ISO realizat n anul 2009. Prin intermediul acestui centru, sau organizat numeroase workshop-uri interne i internaionale,
simpozioane, cursuri pentru toate centrele de imunogenetic din ar i
pentru comunitatea de transplant din Europa.
Prin realizrile profesionale, centrul nostru, care este i primul
centru de biologie molecular n diagnosticul imunologiei de transplant
din Romnia, are o activitate deosebit de susinut pe toate tipurile de

transplant care se efectueaz la noi n ar, monitoriznd anual peste

1000 de pacieni care au efectuat un transplant.
Avem sperana c aceast monografie va fi util tuturor rezidenilor
care doresc s aprofundeze aspectele imunologiei de transplant, de
cercetare sau de practic clinic n domeniul transplantologiei i s
reprezinte o lucrare de referin pentru colegii notrii imunologi din
ntreaga ar.

Octombrie, 2009
Conf. Dr. Ileana Constantinescu
eful Centrului de Imunogenetic i Virusologie, Institutul Clinic
Fundeni
Directorul Departamentului de Granturi i Cercetare tiinific,
UMF Carol Davila

CUPRINS

COMPLEXUL
MAJOR
DE
HISTOCOMPATIBILITATE....................................................................................
.9
ORGANIZAREA GENELOR ANTIGENELOR LEUCOCITARE UMANE (HLA)
N
COMPLEXUL
MAJOR
DE
HISTOCOMPATIBILITATE
..9

(MHC)

STRUCTURA
MOLECULELOR
HLA
.13

STRUCTURA
MOLECULELOR
HLA
DE
I13

STRUCTURA
MOLECULELOR
HLA
DE
CLASA
A.14

EMERGENA
DE
NOI
ALELE
15

LINKAGE
DISEQUILIBRIUM
(LEGTUR
.16

CLASA

II-

DEZECHILIBRAT)

GENETICA
HLA
..17

SEMNIFICAIE
CLINIC
...17

METODE SEROLOGICE DE TIPIZARE

HLA
18

TIPIZAREA
HLA
PRIN
TESTUL
DE
LIMFOCITOTOXICITATE.19

IZOLAREA
CELULELOR
.20

PROTOCOL DE LUCRU PENTRU TESTUL

COMPLEMENT21

VARIABILITATEA
REZULTATELOR
DE
TIPIZARE
SEROLOGICE.22

LIMFOCITOTOXICITII DEPENDENTE DE

TIPIZAREA
HLA
PRIN
METODE
DE
MOLECULAR23

HLA

BIOLOGIE

INTRODUCERE
.23

PRINCIPIILE
METODELOR
MOLECULARE
DE
LUCRU
HISTOCOMPATIBILITATE..25

AMPLIFICAREA
GENELOR
..26

GENOTIPAREA
HLA
SSOP
27

GENOTIPAREA
HLA
SSP
28

TIPIZAREA HLA BAZAT PE SECVENIERE (SBT)

30

TEHNOLOGIA
MICROARRAY
32

LIMITELE METODELOR DE BIOLOGIE

MOLECULAR..34

EVALUAREA
ACURATEEI
METODELOR
DE
HLA34

EVALUAREA
IMUNOLOGIC
N
RENAL..........................................................................35

TIPIZARE

TRANSPLANTUL

STATUSUL
CURENT
AL
TRANSPLANTULUI
RENAL...35
FACTORI
DETERMINANI
AI
EVOLUIEI
PE
LUNG36

TERMEN

EVALUAREA
ANTICORPILOR
CITOTOXICI
39

SCREENING-UL
ANTICORPILOR
CITOTOXICI
DEPENDENTE DE COMPLEMENT.39

SCREENING-UL
ANTICORPILOR
CITOTOXICI
ELISA..39

IDENTIFICAREA
ANTICORPILOR
CITOTOXICI
PRIN
.41

SCREENING-UL
ANTICORPILOR
CITOTOXICI
LUMINEX.43

PRIN

METODA

LIMFOCITOTOXICITTII

PRIN

METODA

METODA

PRIN

ELISA

METODA

TESTUL
CROSSMATCH
..44

TESTUL
CROSSMATCH
PRIN
METODA
LIMFOCITOTOXICITII45

TESTUL
CROSSMATCH
PENTRU
T45

CELULA

TESTUL
CROSSMATCH
PENTRU
B46

CELULA

CROSSMATCH
PRIN
TEHNICA
ELISA
PENTRU
B.47

CROSSMATCH
PRIN
METODA
FLOWCITOMETRIEI.49

CROSSMATCHING
PRIN
TEHNOLOGIA
LUMINEX...............................................................................................................50

CROSSMATCH-UL
PENTRU
AUTOANTICORPI
51

CELULA

ALGORITMUL
EVALURII
IMUNOLOGICE
N
VIU.51

TRANSPLANTUL

RENAL

CU

DONATOR

ALGORITMUL
EVALURII
IMUNOLOGICE
N
CADAVRU..52

TRANSPLANTUL

RENAL

CU

DONATOR

EFECTUL
SURSEI
DONATORULUI
ASUPRA
ALOGREFEI.............................................................................55

MATCHING-UL
IMUNOLOGIC:
CONCEPTUL
DE
RENAL57

MATCHING

SUPRAVIEUIRII

TRANSPLANTUL

TRANSPLANTURILE
RENALE
ABO
INCOMPATIBILE..58

EVALUAREA
IMUNOLOGIC
N
HEPATIC.......................................................................62
COMPATIBILITATEA
DONATOR

PRIMITOR
HEPATIC.64

TRANSPLANTUL

TRANSPLANTUL

BOALA
ACUT
DE
GREF
CONTRA
GAZD
HEPATIC..65

(GVHD)

TRANSPLANTUL

MONITORIZAREA
PACIENTULUI
POSTTRANSPLANT
HEPATIC.66

EVALUARE
IMUNOLOGIC
67

EVALUAREA
VIRUSOLOGIC
67

EVALUAREA
IMUNOLOGIC
N
MEDULAR......................................................................73

TRANSPLANTUL

STABILIREA
COMPATIBILITII
HLA..7
3

SELECIA
DONATORULUI
NRUDIT
..74

SELECIA
DONATORULUI
NENRUDIT
..74

SELECTIA
DONATORULUI
DIN
BANCA
DE
OMBILICAL..76

APRECIEREA
PROBABILITII
DE
A
GSI
NENRUDIT76

SNGE

DIN

UN

CORDONUL

DONATOR

GENELE
KIR
I
TRANSPLANTUL
DE
CELULE
HEMATOPOETICE..77

STEM

IMUNOGENETICA
NON-HLA
I
TRANSPLANTUL
HEMATOPOETICE79

STEM

DE

CELULE

POLIMORFISMUL
GENELOR
CITOKINELOR
79

ANTIGENELE
MINORE
DE
HISTOCOMPATIBILITATE
.80

INCOMPATIBILITATEA
ABO
I
SUPORTUL
TRANSFUZIONAL80
RECONSTITUIREA
SISTEMULUI
IMUN
DUP
TRANSPLANTUL
HEMATOPOETICE.81

DE

CELULE

STEM

GLOSAR
DE
TERMENI
IMUNOLOGIA
TRANSPLANTULUI85
IMUNOLOGIA
TUMORAL
A
POSTTRANSPLANT...............................................................92

NEOPLAZIILOR

INTRODUCERE
.92

ONCOGENE
I
CANCER.........................................................................................................................................
...........................96
BAZA
MOLECULAR
A
CANCERCINOGENEZEI
N
TREPTE.................................................................................................96

MAI

MULTE

BIOLOGIA
CRETERII
TUMORALE
..98

MECANISMELE
INVAZIEI
I
METASTAZRII
.99

MECANISME
EFECTOARE
ANTITUMORALE.10
1

IMUNOSUPRAVEGHEREA
.103

Antigenele
tumorale
umane
recunoscute
T..........................................................................104

de

celulele

ANTIGENE
TUMORALE
COMUNE............................................................................................................................
........106

ANTIGENE
DE
DIFERENIERE....................................................................................................................
......................108

PROTEINE
MUTANTE...........................................................................................................................
........................109

PROTEINE
SUPRAEXPRIMATE..............................................................................................................
..........................110

PRODUSE
GENICE
NORMALE
SUBGLICOZILATE..............................................................................................................1
11

ANTIGENE
VIRALE..............................................................................................................................
..........................113

CONCEPTE
EMERGENTE...................................................................................................................................
............................,.113
IDENTIFICAREA
ANTIGENELOR
TUMORALE
UMANE.......................................................................................................................113

DIAGNOSTICUL
DE
LABORATOR
CANCERULUI................................................................................117

AL

MARKERI
TUMORALI

APLICAII
CLINICE...................................................................................................................................117
ANALIZA
STATISTIC
A
DATELOR
DE
IMUNOLOGIC...........................................................................................122

MONITORIZARE

ROLUL
IMUNOLOGULUI
N
MONITORIZAREA
CLINICE....................................................122

ANTITUMORAL

RECOMANDRI
PENTRU
MANAGEMENTUL
TUMORALI............................................................................................123

STUDIILOR

MARKERILOR

METODE
DE
LUCRU
UTILIZATE
N
TUMORAL...................................................................129

IMUNOLOGIA

TESTE
IMUNOENZIMATICE.........................................................................................................................
...................................129
TESTE
DE
BIOLOGIE
MOLECULAR
N
DIAGNOSTICUL
TUMORAL..131

IMUNOLOGIC

VACCINURI
N
CANCER
.140
IMUNIZAREA
GENETIC......................................................................................................................................
..........................144
MONITORIZAREA
TERAPIILOR
IMUNOLOGICE
CANCER................................................................................................................145

CONTROLUL
DE
CALITATE
N
MONITORIZAREA
IMUNOLOGIC.........................................................................................146

EVALUAREA IMUNOLOGIC A NEOPLAZIILOR

RENAL148

APARATULUI

RENAL

POSTTRANSPLANT

EVALUAREA
IMUNOLOGIC
A
TUMORILOR
PARANCHIMATOASE148

RENALE

EVALUAREA
IMUNOLOGIC
A
TUMORILOR
URINARE.153

VEZICII

EVALUAREA IMUNOLOGIC A
ADENOCARCINOMULUI
PROSTAT..166

DE

GHID PRACTIC PRIVIND SELECIA TESTELOR IMUNOLOGICE PENTRU

MONITORIZARE N CANCERUL UROLOGIC POSTTRANSPLANT
RENAL.176
EVALUAREA
IMUNOLOGIC
A
DIFERITELOR
POSTTRANSPLANT HEPATIC.182

TIPURI

EVALUAREA IMUNOLOGIC A DIFERITELOR TIPURI

POSTTRANSPLANT CARDIAC184

DE

EVALUAREA IMUNOLOGIC A DIFERITELOR TIPURI

POSTTRANSPLANT MEDULAR.185

DE

CANCERUL
N
VIITOR:
DIAGNOSTICUL
PROGNOSTICUL.186

DE

CANCER

CANCER

CANCER

MOLECULAR

GLOSAR
DE
TERMENI
IMUNOLOGIA
TUMORAL..187

10

COMPLEXUL MAJOR DE
HISTOCOMPATIBILITATE

Ileana Constantinescu

Organizarea genelor antigenelor leucocitare umane (HLA)

11

n complexul major de histocompatibilitate (MHC)

Complexul HLA ocup un segment de 1,5-2 centiMorgani

pe braul scurt al cromozomului 6 i conine gene care codific
moleculele de histocompatibilitate de clasa I, avnd 2000
kilobaze
(HLAA,
HLAB,
HLAC),
moleculele
de
histocompatibilitate de clasa II, de aproximativ 1000 kilobaze
(HLADRB1, HLADQB1, HLADQA1, HLADPB1), moleculele
de clasa a treia, de aproximativ 1000 kilobaze (C2, C4, factorul
B, citocromul P-450, 21-hidroxilaza) [2].
Genele care codific aloantigenele HLA de clasa I i clasa
a II-a sunt apropiate unele fa de altele la nivelul braului
scurt al cromozomului uman 6. Aceast parte a genomului
constituie sistemul major de histocompatibilitate (MHC) i este
denumit complexul HLA [4,28].
Moleculele HLA de clasa I sunt exprimate la nivelul
tuturor celulelor nucleate i al plcuelor sanguine, pe cnd
moleculele HLA de clasa a II-a se gsesc la nivelul celulelor
prezentatoare de antigen, cum sunt celulele dendritice,
limfocitele B i macrofagele [30]. Rolul fundamental al
moleculelor de clasa I i clasa a II-a este de a se lega la peptide
proprii i peptide non-proprii, pe care apoi le transport la
membrana plasmatic a celulelor pentru fenomenul de
recunoatere de ctre receptorul pentru antigen al celulei T
[15].
Astfel, prezentarea peptidelor virale i bacteriene de ctre
moleculele de clasa I i clasa a II-a antigenelor receptorilor
pentru antigen ai celulelor T, conduce la un rspuns imun.
Moleculele HLA de clasa I leag peptide formate din 8 10 aminoacizi, peptide ce rezult din degradarea proteosomic
a proteinelor citoplasmatice i prezint aceste peptide
limfocitelor T citotoxice, CD8 +. Astfel, moleculele de clasa I
sunt primele care alerteaz celulele T fa de celulele infectate
viral.
Moleculele HLA de clasa a II-a leag peptide formate din
13-25 de aminoacizi, care rezult din degradarea endosomal a
12

proteinelor exogene i endogene i prezint aceste peptide

limfocitelor T helper, CD4+. Moleculele de clasa a II-a joac un
rol important n stimularea rspunsului imun fa de organisme
cum sunt bacteriile piogene. Activarea celulelor T CD8 + i
CD4+ prin aceste dou ci duce la diviziune celular i
difereniere, rezultnd un rspuns imun celular i respectiv
umoral [15].
Complexul HLA conine aproximativ 4.000.000 de perechi
de baze de ADN i este de dimensiune comparabil cu genomul
bacteriei Escherichia coli. n interiorul complexului HLA se
disting trei regiuni (Fig.1).

Fig.1. Harta simplificat a complexului HLA.

Gruparea complexului HLA n regiunile de clasa I, a II-a i a III-a.
n regiunile de clasa I i a II-a sunt redate poziiile relative ale genelor
codificnd izotipurile funcionale ale HLA clasa I i clasa a II-a. La
nivelul regiunii clasei a III-a se observ poziia relativ a genelor care
codific componentele complementului C2, C4 i factorul B. Toate
aceste trei regiuni conin i alte gene.

n apropierea centromerului cromozomului 6, exist

regiunea clasei a II-a care conine genele de clasa a II-a; pe
cnd n apropierea telomerului, braului scurt al cromozomului
6, exist regiunea clasei I care conine genele de clasa I [21].

13

ntre regiunile clasei I i a II-a este situat regiunea clasei

a III-a. Aceast regiune conine o varietate de proteine diferite
care codific componentele complementului C4, C2 i
FACTORUL B. Att regiunea clasei I ct i regiunea clasei a IIa conin i alte gene dect cele ale clasei I sau clasei a II-a
care sunt nenrudite structural cu acestea.
Genele care dau denumirea oficial a HLA sunt cele din
interiorul complexului HLA care codific aloantigenele de clasa
I i clasa a II-a, gene i pseudogene.
Principalele gene de clasa I codific lanurile grele
denumite i lanurile alfa ale celor 6 forme de clasa I , HLA-A,
-B, -C, -E, -F i -G. n completare mai exist i HLA-H, -J, -K i -L
care sunt pseudogene nefuncionale strns nrudite din punct
de vedere al secvenei nucleotidice cu genele funcionale de
clasa I (Fig.2)

Fig.2. Harta regiunii HLA clasa I.

Aceast figur ilustreaz genele HLA-H, -J, -K i -L care sunt gene
complete de clasa I neexprimate, respectiv pseudogene. Familia de
gene MIC conine 5 gene ntre care genele MICA i MICB sunt
exprimate, iar MICC, MICD i MICE sunt pseudogene. Genele
nedenumite (barele verticale scurte) sunt fragmente de gene de clasa I.
HFE este o gen funcional, asemntoare clasei I, la ~4 Mb
telomeric de HLA-F. n completarea genelor cunoscute din aceast
figur mai exist nc ~50 de gene care sunt rspndite printre genele
clasei I i care nu sunt nrudite structural cu acestea. n populaia
uman toi cromozomii 6 poart cele 6 gene HLA de clasa I. n
contrast cu acest fapt, anumii cromozomi 6 au deleii de ~50 kb n
regiunea clasei I care include i pseudogena HLA-H [21].
14

Gena care codific 2 microglobulina, lanul uor al

moleculelor HLA de clasa I, nu este situat n complexul HLA ci
pe cromozomul uman 15. Din cauza acestei localizri
cromozomiale gena 2 microglobulinei nu are o denumire n
nomenclatura HLA.
Moleculele HLA de clasa a II-a sunt heterodimeri compui
din lanuri i de dimensiuni similare. Exist 5 izotipuri ale
proteinelor HLA de clasa a II-a care sunt denumite HLA-DM,
-DO, -DP, -DQ i -DR.
Genele pentru lanurile i sunt localizate n regiunea
HLA de clasa a II-a i cele mai multe dintre acestea sunt
organizate n perechi de lanuri i genice care contribuie la
acelai izotip (Fig.3).

Fig.3. Harta regiunii HLA de clasa a II-a

Sunt ilustrate 3 tipuri de categorii de gene: gene care
codific lanurile i ale moleculelor HLA de clasa a
II-a, pseudogene nrudite cu genele lanurilor i i
genele care codific alte funcii implicate n procesarea
i prezentarea antigenelor de ctre HLA de clasa I. De
asemenea, sunt menionate genele LMP2 i LMP7 care
codific subuniti ale proteozomei, genele TAP1 i
TAP2 care codific un peptid transportor i gena
tapasinei care faciliteaz eliberarea peptidelor din TAP
la nivelul moleculelor de clasa I.

15

Genele care codific lanurile sunt denumite A (DMA

i DOA) iar
genele ce codific lanurile genelor sunt
denumite B (DMB i DOB). Aceste gene care codific HLA-DQ
i sunt HLA-DQA1 i respectiv HLA-DQB1. Partea din
regiunea HLA de clasa II care codific moleculele HLA-DR este
mai complicat deoarece are cteva gene funcionale de lan
precum i pseudogene, numrul lor variind ntre diferii
cromozomi 6 [21]. Diferitele aranjamente pentru genele
lanului sunt denumite haplotipuri DRB.
Structura moleculelor HLA
Structura moleculelor HLA de clasa I
Moleculele HLA de clasa I conin fiecare o copie a dou
polipeptide i anume: un lan greu, glicoprotein de ~45kDa
care este ancorat la membran, i un lan uor, solubil n ap,
de 12kDa (Fig.4).

Fig.4. Structura schematic a moleculei HLA de clasa I.

Genele care codific lanurile grele HLA de clasa I au o structur
caracteristic n care diferite domenii proteice sunt codificate de exoni
separai.

n total, exonii genelor lanurilor grele de clasa I conin

1089-1101 nucleotide (incluznd codonul terminator) i
codific lanuri grele de 362-366 reziduri de aminoacizi. (Fig.5)

16

Fig.5. Organizarea exon-intron a unei gene HLA de

clasa I.
La nivelul lanului greu de clasa I, fiecare domeniu
proteic este codificat de exoni diferii. L codific
secvena conductoare, TM codific regiunea transmembranar, CYT codific coada citoplasmatic i 3UT
este regiunea 3 netradus. Diferene mici n lungimea
lanurilor grele de clasa I din diferite alele sau locusuri,
provin
din
inserii
i
deleii
n
regiunea
transmembranar i din modificri de lungime ale cozii
citoplasmatice datorit plasrii difereniale a codonului
terminator n interiorul exonilor 6, 7 sau 8.

Polimorfismul antigenic al moleculelor HLA-A, B i C este

datorat diferenelor n secvenele de aminoacizi ale lanulului
greu al HLA de clasa I. Cele mai multe dintre aceste diferene
apar prin substituii nucleotidice la nivelul exonilor 2 i 3.
Genele lanului greu al HLA- A, B i C sunt foarte polimorfe n
contrast cu genele lanului greu al HLA-E i G, ce dezvolt un
polimorfism limitat denumit oligomorfism. Pentru HLA-F, o
singur alel este recunoscut n prezent i de aceea gena este
considerat a fi monomorf.

Structura moleculelor HLA de clasa a II-a

Moleculele HLA de clasa a II-a conin fiecare o copie a
unui lant i , amndou fiind ancorate la membran (Fig.6).

17

Fig.6. Structura schematic a moleculelor HLA de clasa II.

Lanurile i prezint fiecare dou domenii
extracelulare, o regiune trans-membranar i o coad
citoplasmatic. Domeniile extracelulare ale lanului
sunt 1 i 2 iar cele ale lanului sunt 1 i 2.

Lanurile au 33-35 kDa, iar lanurile au 26-28 kDa,

diferenele n dimensiuni datorndu-se n principal glicozilrii.
Organizarea exon intron a genelor de clasa a II-a este
asemntoare genelor de clasa I, astfel exonii codific domenii
separate ale proteinelor [29].
Genele lanurilor i au structur similar n care
exonul 1 codific peptidul conductor i exonii 2 i 3 codific
cele dou domenii extracelulare.
La nivelul genelor lanului exonul 4 codific domeniul
transmembranar i exonul 5 codific coada citoplasmatic. Prin
contrast, la nivelul genelor lanului , att regiunea
transmembranar ct i coada citoplasmatic sunt codificate
de exonul 4 (Fig.7).

Fig.7. Organizarea exon intron a genelor codificnd lanurile i

ale moleculelor
HLA de clasa a II-a.
18

Legend: L - secvena conductoare; TM - regiunea transmembranar;

CYT - coada citoplasmatic; 3UT - regiunea 3 netradus.

Polimorfismul moleculelor HLA de clasa a II-a poate

deriva att de la nivelul lanurilor ct i de la nivelul
lanurilor , dar acest lucru depinde de izoforma clasei a II-a.
Pentru HLA-DR, lanul este monomorf i toate polimorfismele
deriv din genele lanurilor . Componentul cel mai polimorf al
genelor de clasa a II-a este HLA-DRB1 pentru care sunt
definite 221 de alele [21].
Pentru HLA-DQ i DP att lanurile i contribuie la
polimorfism, iar genele corespunztoare sunt foarte polimorfe.
n contrast, izoformele HLA-DM i HLA-DO sunt puin
polimorfe.
Emergena de noi alele
Microvariaii la nivelul serotipurilor i crearea de noi alele
care sunt chimere a dou serotipuri distincte pot fi fenomene
relativ dinamice.
Alelele noi emerg cu o rat nalt i devin fixate n populaie, n
teorie, dac au un avantaj selectiv n prezentarea peptidelor
provenite de la organisme infecioase.
Alelele noi sunt generate via mutaii punctiforme,
recombinri i evenimente asemntoare conversiei genice [3].

19

Fig.9. Nomenclatura specificitilor HLA.

Prefixul HLA precede antigenele sau alelele pentru a
defini MHC-ul speciei. Denumirile A, B, C, DR etc,
definesc locusul. Acesta este urmat de un numr care
denot antigenul definit serologic sau un numr cu un
asterix care denot alela definit molecular. n anumite
cazuri, litera w este plasat naintea
antigenului
serologic indicnd c este o denumire de lucru,
provizorie.

Linkage Disequilibrium (Legtur dezechilibrat)

Observaia c alelele de la nivelul diferitelor locusuri
genetice exist n populaie n acelai haplotip, semnificativ
mai frecvent dect ar fi ateptat, se numete Linkage
Disequilibrium. Frecvena estimat a dou alele (f1, f2) a se
produce mpreun este produsul frecvenei genei fiecrei alele
din populaia respectiv ([f ateptat = f1 x f2]) [17]. Frecvena
observat este determinat din studii familiale n cadrul
aceleai populaii.
Linkage Disequilibrium este un fenomen tipic pentru
MHC uman i se extinde de la HLA-A pn la HLA-DQ. Cel mai
cunoscut exemplu pentru acest fenomen este haplotipul din
populaia caucazian A1, Cw7, B8, DR17 [4], DR52, DQ2 care
este ntlnit aproximativ de 4 ori mai frecvent dect este
estimat [17].

Genetica HLA

20

Una din consecinele conglomeratului de gene HLA de la

nivelul cromozomului 6 este c cei mai muli indivizi motenesc
un set de alele HLA nerecombinat de la fiecare printe. Aceste
gene sunt exprimate codominant. Astfel, dac tipurile HLA ale
membrilor familiei sunt determinate, segregarea tipurilor HLA
n interiorul familiei poate fi utilizat pentru construirea
tipurilor HLA din fiecare cromozom. Setul alelelor HLA gsit
pe un cromozom este denumit haplotip. Determinarea
haplotipurilor este important pentru identificarea persoanelor
nrudite identice, deoarece purtarea de antigene din
haplotipuri diferite este frecvent.
Fiecare individ motenete dou haplotipuri MHC de la
fiecare printe i astfel are dou alele pentru fiecare dintre
gene. Aceste alele sunt exprimate codominant. Motenirea
genelor MHC urmeaz regulile segregrii ale lui Mendel.
n
cadrul unei familii, fiecare copil motenete un haplotip MHC
de la mam i unul de la tat [17]. Prin convenie, haplotipurile
paternale sunt denumite a i b i cele maternale c i d. Astfel,
exist patru genotipuri posibile MHC la nivelul copiilor: ac, ad,
bc i bd. Probabilitatea de a exista oricare dintre cele patru
variante de genotipuri este de 1:4 [17]. ntr-o familie cu 5
copii, cel puin doi dintre copii vor fi identici HLA
(presupunnd ca nu exist fenomen de crossing over) (Fig.8).

Fig.8. Segregarea alelelor la nivelul unui locus genetic.

Semnificaie clinic

21

Elementul cheie, pentru transplantul renal de succes, este

reprezentat de abilitatea identificrii corecte a potrivirii
histocompatibilitii dintre primitori i donatori i de a ncerca
un prognostic de funcionalitate, vindecare i de via pentru
aceti pacieni avnd n vedere posibilitatea apariiei
fenomenului de rejet (gazd versus alogref renal, sau n
cazul transplantului medular alogref versus gazd).
Tipizarea antigenelor leucocitare umane (HLA) joac un
rol important deoarece moleculele HLA sunt intele primare ale
rspunsurilor imune n transplanturile alogenetice, sunt critice
pentru rspunsurile la stimuli antigenici i sunt implicate n
susceptibilitatea genetic fa de anumite boli imune i
autoimune.
Antigenele
i
alelele
complexului
major
de
histocompatibilitate sunt definite i revizuite de ctre
Organizaia Modial a Sntii, care organizeaz periodic
manifestri tiinifice prin care se asigur o abordare comun a
nomenclaturii i tipizrii. Cea mai bun potrivire HLA dintre
toate variantele este potrivirea ntre gemeni identici.
n practic, acest lucru se ntmpl foarte rar i marea
majoritate a transplantelor se efectueaz ntre donatori
nenrudii i receptori potrivii din punct de vedere al
histocompatibilitii. Este foarte clar c, att pentru
transplantul renal ct i pentru transplantul de mduv, cu ct
potrivirea este mai bun cu att alogrefa va funciona n
condiii bune iar complicaiile ulterioare vor fi minore. Dac
potrivirea este redus primitorul va necesita cantiti
considerabile de imunosupresoare pentru a preveni rejetul
grefei. Acest lucru conduce la riscul unor maligniti secundare
i la apariia infeciilor oportuniste.

Metode serologice de tipizare HLA

Metodele serologice furnizeaz foarte rapid i simplu
rezultatele histo-compatibilitii. Aceste metode folosesc ser
22

care conine anticorpi fa de antigenele HLA. Anticorpii anti

HLA sunt foarte specifici pentru determinanii structurali
individuali care caracterizeaz antigene diferite ale sistemului
HLA.
Astfel, cnd serurile coninnd anticorpi anti-HLA
sunt puse n contact cu limfocite, anticorpii se leag numai de
antigenele specifice int. Cnd complexul antigen - anticorp
este format pe suprafaa celulei n prezena complementului,
activarea complementului duce la liza celular. Astfel, moartea
celulei este un indicator de specificitate comun a antigenului
i a anticorpului i este un rezultat al testului pozitiv.
Detecia acestei specificiti ntre anticorp i antigen
furnizeaz rspunsul la cteva ntrebri fundamentale n
testarea histocompatibilitii:
1. Care sunt antigenele HLA ale unei celule particulare?
Cnd este cunoscut specificitatea anticorpului (aa cum
se ntmpl la reactivii de tipizare HLA) i celula este de
fenotip necunoscut, rezultatul testului pozitiv cu anticorpi
specifici identific antigenele celulei.
2. Sunt anticorpi anti HLA ntr-un ser particular?
Cnd un ser este testat pentru prezena anticorpilor antiHLA, un test pozitiv indic activitate anti limfocitar n ser. Din
modelul de reacii pozitive i negative, cu un panel de celule
tipizate HLA, poate fi gsit specificitatea anticorpilor. Dac
serul pacientului reacioneaz cu celulele donatorului, cei doi
indivizi sunt incompatibili. Astfel, printr-un proces iterativ, de
testare a serului i tipizare a celulelor, antigenele HLA sunt
definite, panelul de limfocite tipizate este generat i sunt
create coleciile de seruri tipizate anti-HLA de specificitate
cunoscut.

Tipizarea HLA prin testul de limfocitotoxicitate

Tipizarea HLA serologic este realizat prin expunerea
celulelor necunoscute la o baterie de antiseruri de specificitate
HLA cunoscut. Serurile pentru tipizare sunt selectate pentru

23

a rezulta scoruri pozitive puternice care s asigure

reproductibilitatea. Dac celulele sunt omorte, n prezena
antiserului i a complementului, celula se presupune a avea
acelai antigen HLA ca i specificitatea anticorpului.
Un ser ideal pentru tipizare HLA ar trebui s fie
monospecific, adic s aib specificitate pentru un singur
antigen HLA.
Totui, n realitate, aloanticorpii observai ntr-un singur
ser sunt n general polispecifici. Un aloantiser poate conine
anticorpi fa de multipli determinani de pe antigenul
imunizant.
Anumii determinani sunt clasici, adic, este vorba de
specificitile HLA private care caracterizeaz fiecare tip HLA.
Ali determinani sunt publici, adic, sunt mpriti la cteva
antigene care, n mod colectiv, constituie antigene cross
reactante de grup cross-reacting antigen group (CREG group).
Majoritatea antiserurilor HLA sunt seruri complexe obinute de
la femei multipare. Lichidul placentar s-a dovedit a fi o surs
secundar valoroas de aloantiseruri pentru tipizarea HLA.
Anticorpii anti-HLA sunt de asemenea gsii la pacieni expui
la antigene HLA prin transfuzii de snge sau grefe de organe.
Totui, aceste metode de obinere a antiserurilor HLA
sunt dificile i de aceea au fost elaborate metode care s
utilizeze anticorpi nefixatori de complement i care se bazeaz
numai pe legarea antigenului, cum este ELISA sau citometria
n flux.
Muli anticorpi multiclonali reacioneaz cu mai mult de o
specificitate HLA ceea ce arat existena de determinani
antigenici comuni la nivelul moleculelor HLA.
Mai nou, folosirea metodelor moleculare de tipizare HLA
a crescut, astfel c eforturile prin metodele serologice au fost
reduse mult.

24

Un numr foarte mic de laboratoare mai menin nc

metodele serologice de tipizare HLA dar, i n aceste situaii,
acestea sunt completate obligatoriu de metodele de biologie
molecular pentru a rezolva incertitudinile i limitele metodei
serologice.

Izolarea celulelor
Limfocitele sunt tipul celular preferat pentru tipizarea
HLA serologic, screening-ul anticorpilor i crossmatching. n
mod tradiional, limfocitele sunt izolate din snge total
periferic prin
separare n gradient de densitate cnd
donatorul este viu. n cazul donatorului cadavru, limfocitele
sunt separate din splin sau ganglioni limfatici. Lucrnd
aceast metod, trebuie o grij deosebit pentru a prepara o
suspensie celular de viabilitate foarte bun i care s nu
conin eritrocite i trombocite. Tipizarea HLA pentru clasa II
de antigene HLA, HLA DR i DQ este performat pe preparate
limfocitare mbogite cu limfocite B. Procedurile de izolare
speciale, performate, sunt necesare, deoarece aproximativ 80%
din limfocitele din sngele periferic sunt celule T inactive care
nu conin antigene HLA de clasa a II-a pe suprafaa lor.
Izolarea limfocitelor T i B cu ajutorul bilelor magnetice
este n prezent cea mai comun metod pentru tipizarea HLA
i crossmatching. Bilele, cptuite cu anticorpi ofer
versatilitate, vitez a revenirii celulare i o bun puritate a
preparatului celular final. Bilele peliculizate cu anti-CD2 sau
anti-CD8 sunt folosite pentru izolarea celulelor T i anti-CD19
pentru celulele B. Bilele magnetice pot fi folosite pentru
obinerea numrului adecvat de celule din sngele total, din
diferite tampoane sau din preparate de limfocite din sngele
periferic.
Celulele legate de aceste bile devin mai sensibile ca inte
posibil datorit modificrii membranelor celulare i astfel

25

testele necesit o perioad de incubare mai redus ca timp,

fa de metodele standard de citotoxicitate.

Protocol de lucru pentru testul limfocitotoxicitii dependente de complement

Antiseruri HLA individuale sunt dispensate cte 1 L n
godeuri microtest, de specificitate desemnat, n plcue de
plastic compuse din 60 sau 72 de godeuri avnd capacitatea de
15L. Un model de seruri anti HLA este ales cu specificiti
care acoper toate posibilitile variantelor de tipuri HLA. n
general, fiecare tip este reprezentat de cel putin doua
antiseruri. Astzi, laboratoarele obin plcue de tipizare
congelate, comerciale, gata de folosit.
Pentru tipizarea HLA, serurile dintr-o plcu de testare
sunt dezgheate i aproximativ 2000 de limfocite sunt
dispensate n godeu. Apoi plcua este incubat 30 de minute
la temperatura camerei pentru a permite anticorpilor anti-HLA
a se lega la antigenele lor HLA int specifice. Complementul
(5 L) este adugat n general ca ser de iepure i plcua este
incubat timp de 60 de minute. Testul de citotoxicitate
dependent de complement pentru tipizarea HLA-DR i DQ
este performat cu seruri corespunztoare de tipizare de clasa
aII-a, numai c metoda este modificat pentru celule B: iniial
are loc incubarea celulelor, iar serul este nclzit la 37 0C sau
220C pentru 60 de minute; dup adugarea complementului,
amestecul este incubat timp de 120 de minute la temperatura
camerei. Creterea temperaturii este folosit pentru a evita
reaciile fals pozitive care pot rezulta din legarea anticorpilor
nespecifici, reactivi la rece. Cnd se utilizeaz pentru tipizarea
clasei a II-a bile imunoabsorbante, timpii de incubare sunt n
general redui cu aproximativ jumtate, posibil din cauza
slbirii membranei celulare datorit atarii bilelor.
Pentru a vizualiza celulele moarte i vii este adugat un
colorant, eozina Y urmat de formalin pentru a fixa reacia,
apoi se utilizeaz microscopul cu contrast de faz. Celulele vii

26

exclud colorantul i apar luminoase i refractante, iar celule

moarte conin colorant i sunt uor mrite de volum i
ntunecate. Exist o metod alternativ de vizualizare care
folosete fluorocromi, cum este fluoresceina diacetat (verde),
nainte de dispensarea n plcu. Cnd celulele sunt omorte
testul este pozitiv, iar fluoresceina curge afar i celulele
dispar. Rezultatele pozitive sunt comparate cu un godeu
negativ, unde toate celulele sunt viabile. Se poate aduga un al
doilea fluorocrom de culoare contrastant, cum este ethidium
bromide (rou), pentru a vizualiza celulele moarte.
Fiecare godeu este scorificat individual prin inspecie,
notnd procentul celulelor moarte per godeu. Testul este clar
pozitiv cnd cel puin jumatate din celule sunt moarte. Tipajul
HLA rezult prin interpretarea modelului de reactivitate al
unor seruri individuale i a specificitii lor. n fenotiparea unui
individ pentru HLA clasa a I-a se ateapt s se gseasc
modele de rezultate cu dou antigene pentru, fiecare din
locusurile A, B i C. Cnd numai un singur antigen este
identificat ntr-un locus, individul poate fi homozigot pentru
acel tip de antigen sau, laboratorul a euat n a identifica cel
de-al doilea antigen deoarece serurile pot s nu conin
anticorpi pentru epitopii prezeni pe celulele int sau exist o
exprimare redus a moleculelor HLA pe limfocitele testate.
Variabilitatea rezultatelor de tipizare HLA serologice
Serurile de tipizare HLA nu sunt uniforme deoarece
complexitatea polimorfismului HLA face imposibil crearea un
reactiv standard pentru fiecare specificitate. Fiecare laborator
de tipizare HLA are responsabilitatea de a obine antiserurile
adecvate i de a monitoriza performana acestora, inclusiv a
produselor comerciale.
Rezultate obinute cu plcuele de tipizare ale
laboratorului pot fi comparate cu acelea ale altor colecii de
seruri pentru confirmarea unui anumit fenotip HLA. Toate
laboratoarele de tipizare HLA sunt controlate de ctre
inspectorii Federaiei Europene de Imunogenetic (EFI) sau de
27

ctre Societatea American pentru Histocompatibilitate i

Imunogenetic (ASHI), pentru a verifica calitatea reactivilor
serologici i a reactivilor celulari folosii pentru testarea
clinic.
Programele de control de calitate naionale i
internaionale sunt disponibile pentru tipizare, crossmatching
i anticorpi citotoxici, iar performana satisfctoare este
obligatorie pentru acreditarea EFI i/sau ASHI a laboratorului.
O a doua variabil a tipizrii HLA serologice este
complementul seric, un reactiv disponibil comercial care
cumuleaz practic serurile de la cteva sute de iepuri. Serul de
iepure conine anticorpi heterofili cu activitate limfocitar
antiuman care i mrete eficiena n testele de citotoxicitate.
Supraabundena acestor anticorpi antiumani face ca i
complementul s fie citotoxic i astfel se produc rezultate fals
pozitive. Fiecare laborator trebuie s i verifice sursa de
complement pentru a gsi varianta care promoveaz reacii
citotoxice intense fr a produce toxicitate nespecific.
Deoarece nu exist o surs standard de complement, acelai
ser testat n diferite laboratoare, are potenialul de a produce
rezultate discordante.
Alte variabile sunt metodele folosite pentru a vizualiza
celulele vii i moarte, timpii de incubare i definirea terminrii
perioadei de lucru a testului, precum i interpretarea
rezultatelor.

Tipizarea HLA prin metode de biologie molecular

Introducere
Specificitile serologice au fost identificate prin modelul
de legare al anticorpilor n testele serologice i din activarea
limfocitelor de ctre antigenele distincte ale complexului major

28

de histocompatibilitate
limfocitare (MLC).

(MHC)

testul

culturii

mixte

Cu ajutorul clonrii genice i a secvenializrii ADN,

specificitile antigenelor HLA sunt n prezent cunoscute a
deriva din diferenele de secven localizate n cteva regiuni
hipervariabile de la nivelul moleculelor MHC.
Cele mai multe dintre diferene au aprut din
evenimentele de conversie intragenic i intergenic care au
condus la polimorfismul complex care caracterizeaz sistemul
HLA.
La nivelul genelor HLA de clasa aII-a, regiunile variabile
se gsesc n principal n exonul 2, iar la genele HLA clasa I;
zonele polimorfe sunt concentrate n exonul 2 i 3.
Aceste variaii de secven, sunt localizate n zona de
legare a antigenului i la nivelul regiunilor alfahelix care
ntmpin receptorul celulei T.
Aceste localizri strategice sunt expuse abilitii
sistemului imun de a recunoate i a rspunde la patogeni (i
posibil autoimunogeni) i la antigeni endogeni sau exogeni.
Alelele HLA poart multe din aceleai motive secveniale
dar n combinaii diferite.
n consecin, antigenele de clasa I i clasa aII-a, pot fi
aezate ca un pachet de combinaii ale acestor polimorfisme
secveniale, care au ca baz o secven comun de nucleotide.
Fenomenul observat al crossreactivitii antiserurilor i
mai recent fenomenul de crosshibridizare al nucleotidelor
marcate poate fi explicat de faptul c anumite antigene pot
avea aceleai secvene.
O consecin important a acestor motive secveniale
purtate n comun este c anumite combinaii heterozigote ale
alelelor nu pot fi ntodeauna distinse de o a doua combinaie
diferit.

29

Toate metodele de tipizare ADN trebuie s ia n

considerare aceste aspecte cnd propun schemele pentru
identificarea alelelor.
n mod evident, cea mai performant metod de tipizare
HLA ar fi aceea care ar putea performa o analiz complet
secvenial a ADN-ului de la nivelul genelor HLA pentru fiecare
individ.
Secvenierea nucleotidic automat este folosit n mod
curent ca i standardul de aur pentru tipizarea HLA, dar
aceast tehnologie este n general mai restrns pentru
Centrele de Imunogenetic care sunt implicate n programele
de transplant de celule stem hematopoetice care folosesc
frecvent donatori nenrudii.
n tabelul urmtor sunt redate comparativ caracteristicile
metodelor de tipizare HLA serologice i moleculare.
Tabelul nr.1. Comparaie ntre metodele de tipizare HLA
serologice i bazate pe ADN [2].

Metode

SEROLOGICE

ADN: SSP/SSOP

ADN: SBT

Numrul de tipuri identificabile

HLA-A

21

21-151

151

HLA-B

43

43-301

301

HLA-C

10

10-83

83

HLA-DR

18

18-282

282

HLA-DQ

9-43

43

HLA-DP

6-87

87

Materialul
probei

2-3
milioane
limfocite vii

Reactivi

Aloantiseruri
(furnizare limitat)
cteva monoclonale

30

de

Cantiti
ADN

infime

de

Cantiti infime de
ADN

Oligonucleotide
sintetice
primeri
/
oligonucleotide
marcate
(furnizare
nelimitat)

Oligonucleotide
sintetice
primeri
(furnizare
nelimitat)

Puterea
de
a
identifica
noi
alele

Foarte
limitat:
depinde
de
disponibilitatea
i
specificitatea
serurilor

Limitat: bazat pe
cunotina
secvenelor i pe noi
modele de reacie

Nelimitat:
noi
alele
identificate
prin secveniere

Nivelul
de
rezoluie pentru
alelele cunoscute

Nivel generic

De la generic la nivel
alelic

Nivel alelic

Factori
importani

Expresia HLA pe
suprafaa celular.

Calitatea i cantitatea
ADN-ului genomic i
factorii
de
amplificare.

Calitatea
i
cantitatea
ADNului genomic i
factorii
de
amplificare.

Viabilitatea celulelor

Obligativitatea
respectrii
strictee
protocolului

cu
a

Metodele moleculare de tipizare ofer

avantaje
importante fa de metodele serologice incluznd acurateea
mult mbuntit, rezoluia nalt i flexibilitatea probelor.
Metodele moleculare de tipizare pot fi n particular avantajoase
pentru tipizarea probelor coninnd molecule HLA care sunt n
acelai CREG.
Cteva publicaii au documentat beneficiul clinic al
tipizrii moleculare evideniind n special cele dou aspecte
deja menionate i anume acurateea mult mbuntit i
rezoluia nalt a tipizrii.
Menionm c datele de secveniere furnizate de
metodele moleculare mpreun cu cunotinele despre
structura i funcia sistemului HLA sunt n mod curent folosite
pentru nelegerea mai bun a bazei moleculare a
alorecunoaterii i a bolilor cu determinism genetic HLA.

Principiile metodelor moleculare de lucru n

histocompatibilitate

31

Prima metod de tipizare molecular a detectat lungimea

polimorfismului fragmentului de resctricie (RFLP) n ADN-ul
genomic i a fost folosit n special pentru tipizarea HLA de
clasa aII-a.
De asemenea o alt metod de biologie molecular
utilizat frecvent este metoda cu hibridizare la matria ARN
folosind oligonucleotide marcate cu secven specific (SSOP).
Dup descoperirea reaciei de amplificare genic (PCR) au fost
dezvoltate rapid cteva metode facile i robuste de tipizare
HLA prin biologie molecular. Prima metod utilizat a fost
SSOP. Aceast metod a fost urmat de dezvoltarea metodei cu
primeri de secven specific care se bazeaz pe specificitatea
amplificrii pentru a determina tipurile de HLA.
Cea mai recent dezvoltare n domeniul metodelor de
biologie molecular pentru tipizarea HLA este tipizarea bazat
pe descifrarea secvenelor secveniere (SBT) care are
avantajul automatizrii i a unei acuratei perfecte.
Secvenierea este urmat de dezvoltarea tehnologiei
microarray pentru genotiparea HLA.
n tabelul 2 sunt prezentate cele mai folosite metode de
biologie moleculare n tipizarea HLA.
Tabelul nr.2. Tehnici moleculare de testare a histocompatibilitii
[2].
REACTIVI
NUME

PROCESE

CARACTERISTICI

CARACTERISTICE

RFLP

Endonucleaze
bacteriene
restricie

SSP

Primeri
PCR
de PCR/gel electroforez
secven specific

De la nivel generic la
nivel de alel

Oligonucleotide cu
secven specific,
marcate

De la nivel generic la
nivel de alel

SSOP

32

Southern blotting

Polimorfismele
detectate

de

PCR/hibridizare a
oligonucleotidelelor
marcate la produsul
PCR

Lungimea fragmentului
de restricie

SBT

Primeri
etichetai/terminato
ri de secveniere

PCR/secvenierea
nucleotidic a
produsului PCR

Nivel de alel

*n prezent este n curs de investigare clinic i tehnologia microarray

pentru genotiparea HLA.

Amplificarea genelor
Majoritatea metodelor moleculare de genotipare HLA
folosesc reacia PCR pentru a amplifica selectiv segmentele
genelor HLA care sunt necesare tipizrii.
Specificitatea amplificrii poate fi specific de locus (de
exemplu, HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1), specific de grup (de
exemplu: DRB1-01, DRB1-02) sau cu specificitate alelic (de
exemplu: DRB1*-0401, DRB1*0402).
Pentru PCR specificitatea este determinat de secvena
primerilor i condiiile de amplificare (cum sunt ciclurile de
temperatur i Mg2+).
Cele mai multe scheme de tipizare necesit condiii care
evit co-amplificarea pseudogenelor.

Genotiparea HLA SSOP

Hibridizarea cu oligonucleotide marcate de secven
specific (sonde) a fost prima metod de tipizare HLA bazat
pe PCR. Aceast metod simplific amplificarea selectiv a
HLA int urmat de hibridizarea cu un panel de
oligonucleotide marcate.
Cele dou formate mai frecvent folosite sunt:
Dot sau slot blot cu ADN-ul amplificat legat de un suport
solid (cum este membrana) i hibridizat cu substane de
marcat n soluie

33

 Revers dot sau slot blot cu substane de marcat legate

de un suport solid, hibridizat cu ADN-ul amplificat n soluie.
Formatul dot blot este favorabil pentru tipizarea unui
numr mare de probe. Unele laboratoare cu volum mare de
lucru, folosesc aceast metod pentru tipizarea unor loturi de
96 sau 384 de probe. Metoda revers dot blot este favorabil
pentru testarea unui numr mic de probe. Reactivii pentru
dot/slot-blot sunt disponibili comercial, existnd kituri
standardizate avnd toate componentele necesare lucrului
incluse.
O cantitate de 1-5 L de ADN amplificat din fiecare prob
este aplicat pe o membran de nylon. Dupa hibridizarea cu
oligonucleotidele marcate, membranele sunt splate pentru a
ndeprta legarea nespecific.
Se utilizeaz un substrat astfel nct se dezvolt o reacie
de culoare rezultnd un model al hibridizrii pozitive i
negative care este folosit pentru a desemna tipul HLA.
Un avantaj major al acestui procedeu este c, att
controlul pozitiv ct i controlul negativ pot fi incluse pentru
fiecare reacie.
n rezumat, principiul metodei este bazat pe revers
hibridizare. Materialul ADN extras i amplificat biotinilat este
aport denaturat chimic i separat n spire care sunt hibridizate
cu oligonucleotide specifice marcate (sonde) imobilizate ca linii
paralele pe benzi.
n etapa urmatoare, de splare, are loc ndeprtarea
materialului amplificat nelegat. Dupa splare, este adugat
conjugatul cu streptavidin i fosfataz alcalin care se leag
la hibrizii biotinilai formai anterior.
Incubarea cu o soluie substrat, coninnd un cromogen,
conduce la obinerea unui precipitat gri/maro.
Reacia este oprit printr-o etap de splare i modelul
reactivitilor sondelor este nregistrat.

34

Amplificarea este efectuat prin PCR (Fig.10). Datele

obinute sunt introduse n calculator, iar programul
interpreteaz i red tipul alelic HLA.
Tipizarea PCR-SSOP reprezint o metod cu un nalt nivel
de rezoluie i acuratee.
Aceast metod este foarte adecvat pentru analiza unui
numr mare de probe pe o perioad lung de timp, fiind foarte
eficient pentru lucrul pacienilor aflai pe listele de ateptare.
Dezavantajele acestei metode sunt durata mare a timpului de
lucru (9,50 ore) i costul ridicat n cazul n care se utilizeaz
pentru un numr redus de probe.

Fig.10. Genotiparea ADN HLA prin metoda SSOP.

Genotiparea HLA SSP

Una din cele mai frecvente metode de biologie molecular
utilizat pentru genotiparea HLA este metoda de amplificare
genic cu primeri cu secvena specific (SSP). Perechile de
primeri sunt elaborate pentru a amplifica specific fiecare
secven polimorf HLA care trebuie s fie detectat, pentru a
furniza nivelul dorit de rezoluie al tipizrii. Trebuie menionat
c exist o pereche de primeri care amplific un segment
diferit al ADN-ului i care n mod curent este inclus n acelai

35

tub ca i control intern pozitiv al amplificrii. ADN-ul int este

adugat n reacie alturi de primeri i celelalte componente
de reacie (ADN polimeraza, tamponul, Mg2+)apoi este
performat ciclizarea termic.
Produsele de amplificare PCR sunt uzual detectate prin
separare pe un gel de agaroz. Dup electroforez, ADN-ul
este marcat cu ethidium bromide i reacia este scorificat
pentru prezena produilor de amplificare ai primerilor
controlul intern i prezena sau absena produsului de
amplificare specific HLA. Combinarea reaciilor HLA pozitive i
negative este folosit pentru a desemna tipul HLA. Dac nu
sunt prezente produse de amplificare specifice HLA i nu se
identific nici produsul controlului intern, reacia este cotat
ca eec i trebuie repetat.
Numrul de primeri inclui n test variaz n funcie de
locus i de nivelul de rezoluie cerut. Pentru o rezoluie sczut
HLA DRB este nevoie de 20-30 de reacii; pentru o tipizare
ABC, n mod curent, este nevoie de 100-200 de reacii. Setul de
primeri pentru tipizare sunt furnizai comercial.
Cum numrul de alele cunoscute este n continu cretere
i numrul minim de reacii necesare pentru tipizarea SSP
crete de asemeni.
Avantajul major al acestei metode este c dotarea cu
echipament este minim, timpul necesar pentru testare este
scurt, ceea ce face ca metoda s fie ideal pentru lucru n cazul
donatorului cadavru i este uor de performat (Fig.11).
Dezavantajele majore sunt reprezentate de necesitatea
unui numr mare de reacii i de nevoia unei cantiti mari de
ADN nalt purificat care s asigure ca specificitatea reaciei nu
este compromis.
Una din slbiciunile formatelor de lucru actuale este c
primerii de tipizare HLA nu sunt ntodeauna controlai intern.
Astfel, un rezultat fals negativ poate fi obinut dac controlul

36

intern (o pereche diferit de primeri) este pozitiv, iar primerii

specifici HLA sunt disfuncionali.
Mai nou, productorii acestor kituri includ, de regul, i
controale interne pentru fiecare reacie.
n rezumat, metoda parcurge urmtoarele etape:
ADN-ul este extras din prob i amestecat cu primeri avnd
specificitate pentru secvenele caracteristice ale fiecrui tip de
HLA. Aliquote din prob sunt plasate n tuburi separate fiecare
coninnd un set specific de primeri i apoi sunt amplificate n
termobloc.
Produsele de amplificare sunt apoi vizualizate n
electroforez, gelul fiind marcat cu ethidium bromide i
fotografiat n lumin UV.
Prezena benzilor indic faptul c proba ADN a avut
secvena corespunztoare unui tip particular de HLA.
Absena amplificrii implic absena acelei secvene
alelice particulare n proba ADN.
Toate tuburile conin un primer suplimentar care servete
ca i control al amplificrii PCR.

37

Fig.11. Rezultatele metodei SSP ADN HLA.

Tipizarea HLA bazat pe secveniere (SBT)

Tipizarea HLA bazat pe secveniere (SBT) implic
determinarea secvenei nucleotidice a unei segment amplificat
aparinnd unei gene HLA. Aceasta se realizeaz folosind un
secvenializator nucleotidic automat, iar procedeul se
desfoar, pe scurt, dup cum urmeaz: segmentul de gen
HLA este amplificat i excesul de nucleotide i primeri este
ndeprtat. ADN-ul amplificat este folosit ca matri pentru
reacia de secveniere iar produsele reaciei de secveniere
sunt purificate i aplicate pe un gel de secveniere.
Reaciile SBT conin un amestec de nucleotide normale i
nucleotide modificate (dideoxinucleotide) care termin
polimerizarea cnd sunt ncorporate n spira replicativ a
ADN. Un primer este folosit pentru a iniia sinteza ADN
folosind ADN polimeraza. Cnd un dideoxinucleotid este
ncorporat ntr-o nou molecul ADN polimerizarea este
terminat. Astfel, extensia primerilor este generat astfel nct
se termin la fiecare poziie a moleculei ADN.
Markeri fluoresceni sunt utilizai pentru a distinge
lanurile terminate de fiecare baz (A, C, G sau T). Markerii
sunt ncorporai folosind culori pentru primeri sau culori
pentru dideoxinucleotidele terminatoare.
Extensiile primerilor sunt separate pe un gel care rezolv
diferenele de dimensiuni ale acestor secvene ADN pn la
nivel de o singur baz. Gelul este efectuat ntr-un
secvenializator ce conine laser care excit moleculele
markerilor i un detector care nregistreaz emisia fiecrui
marker.
Software-ul
convertete
datele
primare
ntr-o
cromatogram i aliniaz automat nucleotidele pentru fiecare
38

poziie. Datele sunt editate automat i secvena este comparat

cu o baz de date coninnd toate secvenele cunoscute, pentru
a alinia alelele n prob.
Un avantaj al acestei metode este c fiecare secven, din
fiecare spir ADN poate fi determinat pentru a confirma tipul.
Acest lucru este recomandat deoarece artefactele tehnice pot
determina cteodat pierderea unui nucleotid particular care
poate conduce la o interpretare incorect a datelor de la
heterozigoi.
n concluzie, variaiile mici n secvena genic pot fi
relevate numai prin secveniere direct care confer o
acuratee perfect rezultatelor.
n rezumat, etapele metodei sunt: ADN-ul este izolat
din prob i amplificat prin PCR folosind primeri specifici de
locus, grup sau alel.
Produsul de amplificare este apoi distribuit n 4 tuburi,
fiecare coninnd polimeraz, dideoxinucleotide (dNTP) i
amestecuri de secveniere. Fiecare din cele 4 amestecuri este
marcat cu un terminator de secvene fluorescent: tubul 1 cu
citozina marcat (C*); tubul 2 cu guanin marcat (G*); tubul 3
cu thymin marcat (T*), iar tubul 4 cu adenin marcat (A*).
Produsul este amplificat prin PCR pentru a ncorpora
terminatorii marcai. Cele 4 tuburi cu probe sunt puse n
electroforez pentru a separa produsele de extensie ale
primerilor n funcie de dimensiuni.
Secvenializatorul detecteaz fluorescena n fiecare
band i software-ul
convertete datele n secvene
nucleotidice. De asemenea, software-ul compar secvenele cu
o baz de date de secvene HLA i descifreaz tipul HLA.

Tehnologia Microarray

39

Principiul de baz al hibridizrii ADN microarray este

legarea complementar a secvenelor de acizi nucleici simplu
spiralate. Pe un microarray (numit i microcip), secvene
cunoscute denumite inte, sunt ataate la locaii fixe (puncte spots) pe o suprafa solid cum este sticla, folosind punctarea
robotic (Fig.12).
Cele mai frecvent folosite sunt dou tipuri de ADN
microarray:
a. cADN sau ADN genomic array, cu secvene
lungi de ADN complementar de 500-5.000
perechi
de
baze
imobilizate,
fiecare
reprezentnd o gen sau un fragment specific
de cromozom.
b. Oligo array, ale cror microcipuri au secvene
ADN mai scurte (oligo-nucleotide), de 20-100
perechi de baze imobilizate ca inte; secvenele
necunoscute n soluie numite sonde (cum este
cADN sau ARN marcat fluorescent), se vor lega
la inte complementare imobilizate.
Acelai principiu se poate aplica i altor inte i sonde ca:
proteine, glicani, etc.
Pentru HLA, tehnologia microarray va trebui s-i
dovedeasc eficiena i performana, deoarece secvenierea
este un concurent redutabil n ceea ce privete sensibilitatea,
specificitatea i descifrarea de alele noi.

40

Fig.12. Microarray microcip ADN HLA.

Limitele metodelor de biologie molecular

Metodele care detecteaz secvene cheie polimorfe,
pentru a deduce un tip HLA pot, uneori, elabora un tip incorect
dac sunt prezente alele necunoscute. Aceste metode nu pot
detecta ntodeauna alele noi la nivelul locusurilor polimorfe
testate.
Mai mult, probleme pot aprea cu diferite interpretri ale
datelor depinznd de lista secvenelor HLA folosite pentru
asamblarea tipului HLA. Aceste circumstane fac s fie dificil
compararea tipizrilor performate la date diferite.
n completare, extrapolarea de la datele de secveniere,
limitate la un anumit tip HLA, poate determina uneori
asamblarea de diferite tipuri depinznd de metoda i reactivii
folosii pentru tipizare.
O limitare major, care afecteaz tipizarea ampliconilor
heterozigoi, este c multiplele interpretri ale datelor sunt
posibile pentru anumite combinaii de alele. Aceast situatie
poate fi rezolvat prin performarea tipizrii pe alele amplificate
selectiv. Cteodat ambiguitile pot fi rezolvate folosind o
combinaie de date provenite de la dou metode cum ar fi de
exemplu, SSOP i SSP sau SBT i SSP.
Din aceste considerente, este obligatoriu ca toate centrele
de imunogenetic i histocompatibilitate s aib posibilitatea
de a performa cel putin dou metode de genotipare HLA.
O limitare major este dat de faptul c interpretarea
datelor este influenat de baza de date de secvene folosite
pentru a interpreta rezultatele obinute. SBT, care determin
41

secvena unui segment ce reprezint o poriune substanial a

genei HLA, este mai puin susceptibil la aceste probleme. Dac
secvena este determinat pentru o alel amplificat selectiv,
secvena este precis. Deoarece multe laboratoare nu
determin secvena pentru ntreaga gen HLA, polimorfismul
din afara regiunii secvenei nu este detectat.
Multe laboratoare performeaz metoda SBT folosind
matrie heterozigote cum ar fi dou alele HLA-A care sunt coamplificate. Aceste date sunt tipic interpretate comparnd
secvena determinat cu secvenele pentru toate combinaiile
posibile de alele cunoscute.
Uneori aceste rezultate sunt ambigue, cum ar fi multiplele
interpretri ale rezultatelor de secveniere ale datelor
heterozigoilor. Dac baza de date al secvenelor HLA este
lrgit ca numr, atunci numrul ambiguitilor sau al
interpretrilor alternative ale datelor obinute crete.
Evaluarea acurateei metodelor de tipizare HLA
Complexitatea
identificrii
alelelor
asigurarea unor rezultate de nalt calitate.

HLA

necesit

Standardele actualizate i detaliate pentru tipizarea HLA

bazat pe ADN, sunt meninute de ctre Societatea American
pentru Histocompatibilitate i Imunogenetic (ASHI) [1] i de
ctre Federaia European de Imunogenetic (EFI).
Centrele de Imunogenetic i Histocompatibilitate sunt
obligate s participe n scheme de control extern de calitate.
n tipizarea HLA calitatea este o problem cheie.
Conceptul de control de calitate n laborator asigur c testul
adecvat este performat cu o competen tehnic de un
standard nalt pe proba adecvat i c rezultatul corect este
trimis cu interpretarea calificat ctre clinicianul care o cere.
Testele imunologice de histocompatibilitate au nevoie de
interpretarea expertului astfel nct rezultatele ajunse n
clinic s poat fi nelese corect de ctre clinician.
42

Cu alte cuvinte, laboratorul face parte din echipa de lucru

a clinicii, imunologul avnd un rol important n stabilirea
gradului de potrivire HLA dintre donator i primitor i n a da
verdictul pentru transplant din punct de vedere imunologic.
De asemenea, evaluarea imunologic post-transplant
renal este la fel de important, dozarea imunosupresiei i
determinarea anticorpilor anti-HLA orientnd terapia de
ntreinere.
Centrele de imunogenetic i histocompatibilitate din
Europa sunt obligate s se acrediteze cu Federaia European
de Imunogenetic (EFI), care documenteaz i actualizeaz
toate tehnicile de lucru n ceea ce privete tipizarea HLA,
determinarea anticorpilor citotoxici i testul crossmatch.
Federaia European de Imunogenetic (EFI) elaboreaz
standardele
de
performan
n
imunogenetic
i
histocompatibilitate.

EVALUAREA IMUNOLOGIC N
TRANSPLANTUL RENAL
__________

___________

Ileana Constantinescu, Ioanel Sinescu, Ana Moise

Statusul curent al transplantului renal

Primul transplant renal de succes a fost performat la
Boston n 1954 ntre gemeni genetic identici. In Romania,

43

primul transplant renal a fost efectuat de ctre Domnul

Profesor Dr. Eugen Proca n anul 1980 la Institutul Clinic
Fundeni. n anul 1997 s-a efectuat primul transplant renal de
la cadavru, dup recoltare multiorgan. n anul 1998 a fost
performat primul transplant renal la un pacient diabetic. n
acelai an, s-a efectuat primul transplant renal la un adult cu
insuficien
renal
cronic
prin
neoplasm.
Seria
performanelor continu, n 1999 avnd loc primul transplant
renal la copil, cu rinichi prelevat de la cadavru iar n 2005
realizndu-se primul transplant renal la un copil anefric prin
tumora Wilms bilateral.
Transplantul renal este tratamentul cel mai eficient
pentru marea majoritate a pacienilor cu insuficien renal
cronic, mbuntind semnificativ calitatea vieii, n anumite
cazuri crescnd sperana de via.
Imunosupresia actual performant, a condus la o
evoluie n timp mult mbuntit, supravieuirea alogrefelor
renale la un an i respectiv la cinci ani dup transplantul renal
de la cadavru fiind n prezent, de aproximativ 90% i respectiv
70% [3].
Acest succes a dus la creterea numrului de
transplante renale care nu pot fi susinute doar de donatori
cadavru, al cror numr rmne staionar.
n prezent se utilizeaz din ce n ce mai mult rinichi de la
aa numiii donatori marginali sau donatori cadavru cu
criterii de donare extinse sau de la donatori non-heartbeating. De asemenea se utilizeaz foarte mult i rinichii
provenii de la donatori vii care acoper aproximativ 25% din
transplanturile renale n Marea Britanie i 50% n Statele Unite
[3].
n Romnia, programul de transplant renal se bazeaz
aproape exclusiv pe donatori vii, donatorii cadavru fiind n
medie de 20 pe an.

44

Actualmente, n transplantul renal, toate eforturile se

concentreaz pentru mbuntirea pe termen lung a evoluiei
pacienilor.
Factori determinani ai evoluiei pe termen lung
mbuntirile supravieuirii pe termen lung sunt n
principal rezultatul unei evoluii bune n primul an posttransplant [12].
Rata pierderilor alogrefelor renale dup un an a rmas,
ns, relativ neschimbat din anii 1980, la 3 5 % pe an.
Pierderea alogrefelor se datoreaz n principal nefropatiei
cronice a alogrefei. Recurena bolii renale iniiale are loc n
aproximativ 10% din cazuri [3].
Factorii de risc imunologic pentru nefropatia cronic a
alogrefei includ episoadele de rejet i imunosupresia
suboptimal.
Missmatch-urile ntre donatori i primitori pentru locusurile
HLA-DR, HLA-A i HLA-B reduce de asemeni, supravieuirea pe
termen lung n transplantul renal.
Factorii non-imunologici care duc la nefropatia cronic a
alogrefei sunt numeroi i includ vrsta naintat a
primitorului, sexul masculin, hipertensiunea i vrsta naintat
a donatorului.
Deoarece nu exist un tratament eficient pentru
nefropatia cronic a alogrefei, i aceasta necesit retransplant,
este important s se ncerce pe ct posibil a minimaliza factorii
de risc asociai.
*****
Pentru transplantul renal, din punct de vedere
imunologic, trebuie parcurse trei etape. Dac pacientul cu
insuficien renal cronic se afl nscris pe lista de ateptare
de civa ani, se evalueaz periodic detecia i identificarea
anticorpilor citotoxici.

45

Pacienii pot dezvolta aloanticorpi ca rspuns fa de

moleculele HLA strine dobndite din sarcini, transfuzii sau
alogrefe anterioare. Aceti anticorpi pot fi cauza rejetului
alogrefei renale.
n momentul n care se pune problema transplantului
renal se efectueaz tipizarea HLA, att pentru primitor ct i
pentru donator, iar n etapa a treia se efectueaz testul
crossmatch. Crossmatching-ul a fost dezvoltat pentru a detecta
aloanticorpii donator specifici n serul pacienilor care
candideaz pentru un transplant renal. Folosirea tehnicilor de
crossmatch sensibile, pentru a evalua compatibilitatea
primitorilor i donatorilor de rinichi, a eliminat fenomenul de
rejet hiperacut al alogrefelor renale i a avut o contribuie
major la mbuntirea supravieuirii alogrefelor i a
pacienilor.
Tipizarea HLA joac un rol
foarte important
n
transplantul renal. Caracteristica moleculelor HLA este imensa
lor diversitate la nivelul populaiei umane. Tipizarea HLA
detecteaz i clasific aceast diversitate. De-a lungul anilor,
odat cu progresele tehnicii, au fost n mod continuu
descoperite noi molecule HLA, astfel nct n 1999 s-a trecut
oficial de numrul de 1000 de alele HLA recunoscute [2].
Identificarea alelelor HLA este, cu siguran, problema
actual cea mai complex n diagnosticul molecular.
n prezent se cunosc mai mult de 1300 alele n populaia
din ntreaga lume, la nivelul celor 12 locusuri exprimate ale
clasei I i clasei a II-a [10].
Polipeptidele codificate de ctre aceste alele difer una de
alta prin una sau mai multe substituii aminoacidice care sunt
de fapt mutaii cu sens greit (missens) [30].
Nu exist alte locusuri genetice umane mai polimorfe
dect locusurile HLA. De exemplu, locusul HLA-B are mai mult
de 400 de alele cunoscute [30]. n prezent este cunoscut
secvena genomic complet a MHC [26].
46

MHC conine mai mult de 200 de gene, iar dintre acestea

mai mult de 20 de locusuri codific proteine implicate n
legarea i prezentarea produselor de degradare peptidice ale
proteinelor la receptorul antigenic al celulei T.
Astfel, MHC particip la diferite nivele n procesarea
peptidelor antigenice i la prezentarea acestora [24]. n
completarea genelor HLA exprimate, exist numeroase
pseudogene de clasa I i clasa a II-a care sunt localizate n
complexul major de histocompatibilitate. Aceste pseudogene
pun probleme dezvoltrii metodelor moleculare de tipizare
HLA, deoarece este necesar a tipiza genele exprimate fr a fi
posibil a se detecta i pseudogenele apropiat nrudite. Foarte
rar prezena unei pseudogene poate duce la ambiguiti ale
tipizrii moleculare HLA.
Numrul de alele cunoscute, coresunztoare unei
specificiti particulare, variaz de la 1 la mai mult de 50 [2].
Avantajul imens al metodelor de tipizare HLA moleculare este
c depisteaz alturi de alelele exprimate i alelele nule,
silenioase sau puin exprimate. Relaia ntre specificitile
serologice i tipurile moleculare nu este ntodeauna direct
(Fig.9). De exemplu, multe alele recent descoperite nu au fost
tipizate prin metode serologice i de aceea nu au specificitatea
serologic definit.
n contrast fa de metodele de tipizare serologice,
tipizarea HLA molecular
poate detecta orice secven
nucleotidic polimorf. Aceasta furnizeaz oportunitatea de a
performa tipizare HLA la diferite nivele de rezoluie ncepnd
de la grupuri de alele pn la alele idividuale.
Tipizarea care definete grupuri de alele, n mod curent
aproximnd specificitile serologice, este considerat de
rezoluie joas sau generic (de exemplu, HLA-DRB1-04).
Tipizarea prin metode care rezolv toate alelele cunoscute este
considerat de nalt rezoluie (de exemplu, HLA-DRB1 *0401).
Tipizarea care rezolv tipurile HLA dincolo de specificitile
serologice, dar nu atinge nivelul alelic, este descris ca tipizare
47

de
rezoluie
medie
0401/09/13/16/21/26/33).

(de

exemplu,

HLA-

DRB1

Complexitatea deosebit este cauzat de diferenele

dintre tipizrile HLA moleculare i exist o nevoie crescnd
continu, de a actualiza interpretarea datelor de tipizare
moleculare ca i numrul de alele HLA cunoscute.
Cteva metode moleculare detecteaz secvenele cheie
polimorfe i folosesc aceste date pentru a depista alelele.
Interpretarea acestor date este influenat de baza de date a
secvenelor HLA folosit pentru interpretarea acestor
rezultate.
Preponderena mare a polimorfismului de la nivelul
genelor clasei I i a II-a are loc n exonii care codific 1 i 2
la clasa I (exonii 2-3) i 1 i 1 la clasa aII-a, (exonul 2),
domenii care leag peptidele procesate [18].
Anumite poziii ale nucleotidelor la nivelul acestor exoni
sunt invariabile, altele pot avea dou, trei sau chiar patru din
bazele existente ca posibiliti. Astfel, anumii codoni sunt
constani pe cnd alii expun variate grade de variabilitate.
Avnd n vedere c exonii polimorfi sunt relativi scuri n
lungime (aproximativ 250 nucleotide) ei pot fi uor amplificai
n PCR pentru studii de diagnostic molecular.
De exemplu, toate alelele DRB1 au codificat glicina la
poziia 20 pe cnd alte alele pot codifica glicina, valina sau
acidul aspartic la nivelul codonului 86. Cele 289 de alele DRB1
apar din multiplele combinaii posibile ale acestor polimorfisme
[3].

Evaluarea anticorpilor citotoxici

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda
limfocitotoxicittii dependente de complement

48

Screening-ul anticorpilor anti HLA este folosit pentru a

detecta prezena acestora la pacienii care sunt candidai
pentru transplant renal. Screening-ul a fost n mod tradiional,
performat folosind metoda limfocitotoxicittii dependente de
complement.
Cele mai multe laboratoare evalueaz lunar, din punct de
vedere al screening-ului anticorpilor citotoxici, pacienii aflai
pe listele de ateptare. Serurile fiecrui pacient sunt testate
pentru prezena anticorpilor mpotriva unui panel de celule
care conin cele mai frecvente tipuri HLA n populaia
donatoare, prezent la nivelul unor diferite combinaii de HLAA i B (sau DR i DQ pentru clasa II), pentru a permite
determinarea specificitilor aloanticorpilor [13]. Formatul
poate fi astfel gndit ca un test n mas pentru toi pacienii
sau un test pentru un singur pacient. Procentul de anticorpi ,ca
panel (PRA), este calculat ca procent al numrului de celule
pozitive fa de numrul total de celule din panel, multiplicat
cu 100.
PRA este indicatorul imunizrii pacientului fa de HLA.
Trebuie menionat c specificitatea anticorpilor din serurile cu
un PRA nalt nu poate fi determinat, de cele mai multe ori.
Anumite proceduri cum ar fi diluia serurilor sau ambele, se
pot utiliza pentru a determina identificarea anticorpilor.
Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda ELISA
Recent a fost dezvoltat o metod foarte sensibil de faz
solid pentru detecia anticorpilor anti-HLA folosind tehnica
ELISA. Preparate purificate ale antigenelor HLA sunt
peliculizate pe plcue de plastic i sunt utilizate pentru a
capta anticorpii anti-HLA din serul pacienilor.
n acest fel se evit folosirea celulelor cu ntregul lor
complex de markeri de suprafa. Reaciile fals pozitive,
datorate legrii anticorpilor la antigenele non HLA, sunt
evitate prin folosirea acestei tehnologii. Antigenele HLA

49

purificate, cu afinitate, sunt izolate din plcue sanguine sau

din liniile celulare limfoblastoide, cumulate i fixate la baza
godeului din plcua de plastic n care are loc testul.
Antigenele derivate din placuele sanguine sunt numai HLA de
clasa I, pe cnd antigenele din liniile celulare limfoblastoide
pot fi de clasa I, de clasa II sau combinaii ale ambelor tipuri de
antigene [19].
Avantajele testului ELISA, fa de testul convenional de
limfotoxicitate dependent de complement, includ procesarea
rapid i uoar a mai multor probe, prin cititoare automate de
plcue, i eliminarea dependenei testului de viabilitatea
limfocitelor i a complementului [22].
Serul pacientului este incubat n godeul plcuei
respective unde orice anticorp anti-HLA de aviditate adecvat
se leag de antigenul fixat. Dup ndeprtarea anticorpilor
nelegai este adugat un anticorp cuplat cu o enzim care este
direcionat mpotriva IgG uman. Adugarea substratului
enzimatic conduce la dezvoltarea reaciei de culoare n cazul
testelor pozitive.
Formatul de interpretare a citirii rezultatelor pentru
detecia anticorpilor citotoxici prin tehica ELISA poate fi, fie
pozitiv (anticorpi prezeni ), fie negativ (anticorpi abseni). Nu
se calculeaz PRA, iar testul de identificare a anticorpilor
citotoxici n cazul reaciei pozitive, se efectueaz tot prin
tehnica ELISA i are o valoare diagnostic pretransplant
deosebit de important.
De exemplu, este important de tiut dac primitorul aflat
pe lista de ateptare este imunizat i dac anticorpii citotoxici
identificai sunt identici cu alelele HLA ale potenialului su
donator de rinichi.
n acest caz, testul crossmatch va fi clar pozitiv iar
pericolul unui rejet acut, imediat n perioada post-transplant,
este iminent.

50

Testul ELISA este formulat numai pentru detecia

anticorpilor HLA de tip IgG. n consecint, testul ELISA
standard nu poate detecta anticorpii citotoxici de tip IgM i
anticorpii non-HLA dar detecteaz anticorpii IgG nefixatori de
complement pe care testele de citotoxicitate i omit.
Testul ELISA poate eua n a detecta un anticorp cu
specificitate pentru un antigen HLA rar, care poate fi absent
sau la nivele foarte sczute n cumulul de antigene. Recent au
fost dezvoltate teste ELISA capabile s identifice i anticorpii
de tip IgM.
n rezumat, principiul metodei de lucru pentru
screening-ul anticorpilor citotoxici de clasa I i aII-a prin
metoda ELISA este: serul pacientului este adugat n godeuri
cptuite cu glicoproteine HLA clasa I, respectiv clasa aII-a,
permind anticorpilor s se lege (dac sunt prezeni).
Anticorpii nelegai sunt apoi splai. Se adaug n godeuri
un reactiv ce conine globulin anti-uman (anti-IgG) cuplat
cu fosfataz alcalin i se incubeaz. Anticorpii anti-IgG
nelegai sunt apoi splai i se adaug substratul PNPP (pnitrofenil fosfat). Dup 30 de minute de incubare reacia este
oprit adugnd soluie de hidroxid de sodiu. Densitatea optic
a probelor este msurat cu un spectrofotometru.

Interpretarea
rezultatelor
screening-ului
ANTICORPII anti-HLA clasa I i clasa AII-A este:

pentru

Rezultatele cu absorban mai mare sau egal de 2

ori
dect
media
controalelor
negative
sunt
POZITIVE.
Not: diferenele de citire ntre absorbane pentru
duplicatele rezultatelor nu trebuie s fie mai mari de
20%. Pentru a nu interfera citirea, pe spatele plcii nu
TREBUIE S existe urme de reactivi sau urme de talc.

51

Identificarea anticorpilor citotoxici prin metoda ELISA

Metoda de identificare a anticorpilor anti HLA clasa I i aII-a

prin tehnica ELISA are, ca principiu de lucru urmtoarele
etape:
1. Serul pacientului este adugat n godeuri cptusite
cu glicoproteine HLA clasa I, respectiv clasa aII-a,
permind anticorpilor s se lege (daca sunt
prezeni).
2. Anticorpii nelegai sunt apoi splai.
3. Se adaug n godeuri un reactiv ce conine globulin
anti-uman (anti-IgG) cuplat cu fosfataz alcalin i
se incubeaz.
4. Anticorpii anti-IgG nelegai sunt apoi splai i se
adaug substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat).
5. Dup 30 de minute de incubare reacia este stopat
adugnd soluie de hidroxid de sodiu.
6. Densitatea optic a probelor este msurat cu un
spectrofotometru.
Interpretarea
rezultatelor
Pentru
identificarea
anticorpilor anti-HLA clasa I, validarea rezultatelor este
efectuat dac:
media controalelor negative < 0,225
media controalelor pozitive > 0,900
Pentru identificarea de anti-HLA clasa
validarea rezultatelor este efectuat dac:

II-a,

media controalelor negative < 0,225

media controalelor pozitive > 1,000
Att pentru identificarea de anti-HLA de clasa I ct i antihla clasa aII-a, rezultatele cu valoarea densiti optice egal sau
mai mare dect valoarea prag (cut of) sunt considerate
pozitive [27].
52

% PRA

Numr rezultate pozitive 100

numr de godeuri continand antigene HLA de clasa I

% PRA

Numr rezultate pozitive 100

numr de godeuri continand antigene HLA de clasa II

Fig.13. Principiul metodei ELISA pentru detecia anticorpilor

citotoxici.

Screening-ul anticorpilor citotoxici prin metoda Luminex

Odat cu creterea numrului de pacieni de pe lista de
ateptare, se pune problema identificrii anticorpilor citotoxici
pentru a evalua ansele acestor pacieni de a efectua
transplantul renal n condiii imunologice de siguran.

53

Sistemul multiplex Luminex poate fi folosit att pentru

screening-ul ct i pentru identificarea anticorpilor citotoxici
avnd o sensibilitate i o specificitate performant.
Principiul acestei noi tehnologii este capacitatea de a
msura simultan analii multiplii ntr-un singur godeu de
reacie.
Cu tehnologia Luminex, reaciile moleculare au loc pe
suprafaa seturilor de microsfere colorate codificat, folosind un
amestec de 2 colorani fluoresceni de intensitate diferit.
Microsferele acioneaz ca purttori moleculari care
captureaz o prob i apoi sunt etichetate cu un raportor
fluorescent care se leag la proba capturat de pe microsfer.
Microsferele sunt apoi transferate ntr-un instrument care
folosete microfluide pentru a le alinia ntr-un singur ir care
va trece printre dou lasere. Un laser lumineaz culorile din
interiorul microsferei, pentru a identifica bila care va fi citit,
i al doilea laser excit culoarea de pe suprafaa bilei. Printr-o
tehnic optic avansat sunt captate semnalele de culoare i
procesarea digital a semnalelor este translatat, n timp real,
n date cantitative pentru fiecare reacie [20].

Fig.14. Tehnologia Luminex de identificare a anticorpilor.

54

Comparnd Luminex-ul cu alte metodologii folosite pentru

screening-ul anticorpilor (cum sunt CDC-AHG, ELISA i
flowcitometrie), a fost relevat faptul c sensibilitatea acestei
metode este comparabil cu cea a flowcitometriei [14] (tabelul
3).
Tabelul nr. 3. Comparaie ntre metodele actuale folosite pentru
detecia
anticorpilor citotoxici
Metod

Anticorpi detectai /
total

CDC-AHG

12 / 66

18

ELISA

32 / 66

48

Luminex

44 / 66

67

Flowcitometri
e

48 / 66

73

Prin tehnica Luminex se pot lucra deodat 96 de probe,

astfel nct, se poate face screening-ul i identificarea
anticorpilor pe o singur plac, ceea ce nseamn eficien
maxim n testarea pacienilor [14].
Testul crossmatch
Scopul testului crossmatch este de a detecta prezena, n
serul pacienilor, a anticorpilor direcionai mpotriva
antigenelor HLA ale potenialului donator de rinichi. Dac sunt
prezeni, anticorpii semnalizeaz c sistemul imun al
primitorului a fost sensibilizat fa de alelele donatorului i
este susceptibil a rejeta puternic orice alogref ce poart
respectivele antigene.
La nivelul rinichiului transplantat, inta principal a
acestor anticorpi sunt antigenele HLA de pe endoteliul
vascular al capilarelor i arteriolelor.
Complexele
antigen
HLA anticorp de pe endoteliu activeaz complementul i duc
la distrugerea celular, apoi, plcuele agregate, eventual

55

producnd cheaguri de fibrin

cauzeaz necroza ischemic.

care

ngusteaz

vasele,

Chiar i titrul sczut de anticorpi, n

particular cei
direcionai mpotriva clasei I de antigene, pot contribui la
rejetul alogrefei renale.
De asemenea, un alt rol important al testului crossmatch
este performana de sensibilitate i specificitate pentru
antigenele HLA.

Testul crossmatch prin metoda limfocitotoxicitii

Un test crossmatch simplu poate fi performat prin metoda
citotoxicittii clasice utiliznd drept int limfocitele din
sngele periferic al donatorului. Acest tip de crossmatch este
folosit curent ca i evaluare preliminar pentru potenialii
donatori vii nrudii pentru transplant de alogref renal.
Limfocitele din sngele periferic sunt aproximativ 80% celule T
care poart numai antigene HLA de clasa I i 20% celule B i
monocite care poart att antigene HLA de clasa I ct i de
clasa aII-a.
Un rezultat crossmatch intens pozitiv, prin citotoxicitate
dependent de complement (CDC) (50% sau mai mult, celule
moarte per godeu), indic n mod clar prezena anticorpilor
anti-HLA de clasa I.
Astfel, 10-20% din moartea celular poate rezulta dintr-un
anticorp specific pentru clasa aII-a sau se poat datora unui
anticorp slab anti clasa I. Pentru a rezolva specificitatea
anticorpilor, crossmatch-ul este performat apoi pe preparate
celulare mbogite att cu limfocite T ct i B.

Testul crossmatch pentru celula T

Crossmatch-ul pentru celula T se performeaz la
temperatura camerei dar i la 370C n anumite laboratoare
56

pentru a evita legarea anticorpilor reactivi la rece, presupui a

fi autoreactivi. Un test crossmatch pozitiv pe celula T, prin
orice metod, contraindic transplantul renal indiferent
ct de slab este nivelul de reacie. Exist cteva metode
pentru mbuntirea sensibilitii testului crossmatch prin
CDC pentru celula T:
1. Incubaia extins pentru a crete sensibilitatea cea mai
simpl modificare a testului de citotoxicitate este extinderea
timpului de incubare al celulelor, serului i complementului.
2. Etapa de splare Amos aceast metod intercaleaz o
etap de splare dup incubarea celulelor donatorului cu
serul primitorului nainte de adugarea complementului,
pentru ndeprtarea factorilor anticomplementari din ser.
3. Globulina anti-uman - citotoxicitatea anumitor anticorpi
poate fi amplificat prin adugarea unui anticorp, ntr-o
etap ulterioar, n mod obinuit un reactiv policlonal tip
imunoglobulin anti-uman (AHG).
n rezumat, testul crossmatch pentru celula T prin
metoda CDC prezint urmtoarele etape de lucru:

1 L din serul primitorului este dispensat n multiple

godeuri ale plcuei microtest; pentru pacienii
imunizai sunt puse n reacie seruri multiple cu PRA
cunoscut.
Sunt adugate celulele T ale donatorului (2-3 x 106)
i testul este incubat pentru 30-60 de minute.
Pentru a crete sensibilitatea testului, serurile sunt
splate
din
godeuri
nainte
de
adugarea
complementului.
Adugarea unui al doilea anticorp, cum este IgG-ul
de capr anti-uman crete i mai mult sensibilitatea.
Dup cteva minute de incubare cu AHG, este
adugat complementul i testul este incubat pentru
nc 60 de minute.
Incubarea de lung durat a complementului pn la
3 ore, este uneori performat n loc de adaugarea
AHG.

57

Dac serul primitorului conine anticorpi care

reacioneaz cu celulele donatorului, celulele sunt
omorte i colorantul (eozina sau ethidium bromide)
ptrunde n interiorul celulelor indicnd un test
crossmatch pozitiv.
Un test crossmatch pozitiv pentru celula T este o
contraindicaie pentru transplantul renal.

Testul crossmatch pentru celula B

Testul crossmatch pentru anticorpi cu specificitate fa de
antigene HLA de clasa aII-a necesit folosirea limfocitelor B ca
i inte i aceiai timpi de incubare extins ca i la tipizarea
serologic HLA DR i DQ. Un test crossmatch pozitiv pe celula
B poate apare datorit unor anticorpi care se leag la antigene
HLA de clasa I sau de clasa aII-a.
Mai mult, celulele B sunt un indicator mai sensibil pentru
anticorpii slabi de clasa I deoarece ei poart molecule de clasa
I ntr-o mai mare densitate dect celulele T. Crossmatch-ul prin
flowcitometrie poate distinge ntre anticorpii B adevrai i
anticorpii slabi de clasa I ai unui crossmatch citotoxic pozitiv
pe celul B.
Pentru
evoluia
transplantului
renal,
anticorpilor
preformai fa de antigenele HLA de clasa aII-a nu este clar
nc semnificaia.
Transplantul renal de succes la pacieni cu titru sczut de
anticorpi anti HLA clasa aII-a fost raportat, dup cum a fost
raportat i fenomenul de rejet acut al alogrefei renale n cazul
titrului crescut al anticorpilor anti-HLA clasa aII-a.
Este posibil ca pierderea grefelor transplantate n cazul
crossmatch-ului negativ pe celula T i pozitiv pe celula B s fie
datorat componentelor anti-HLA clasa I ale acestor seruri
aloreactive.

58

Fig.15

Crossmatch prin tehnica ELISA pentru celula T i B

ELISA folosete anticorpi anti-HLA de clasa I i respectiv
clasa aII-a, care sunt peliculizate n microgodeurile plcuei.
ntr-o prim etap se pune lizatul de limfocite extrase din
sngele donatorului i antigenul HLA vor fi captate i fixate n
godeu de ctre aceti anticorpi. Ulterior, este pus n reacie
serul primitorului, urmat de adugarea unui anticorp secundar
anti IgG uman cuplat cu o enzim
Prin adugarea substratului rezult o reacie de culoare a
crei intensitate este masurata cu ajutorul cititorului ELISA.
Interpretarea rezultatelor testului este bazat pe compararea
densitilor optice ale godeurilor de testat fa de godeurile de
control pozitiv i negativ. [5].
Principalul avantaj const n faptul c nu este nevoie de
limfocite viabile sau de fixare de complement, iar testul
imunoenzimatic nu este confruntat cu interferene ale
medicamentelor citotoxice cum este globulina anti-timocite sau
muronomab OKT3 [5].
n Centrul de Imunogenetic i Virusologie din Institutul
Clinic Fundeni crossmatch-ul este performat printr-un test
59

calitativ ELISA n faz solid pentru detecia anticorpilor IgG

direcionai ctre antigenele HLA din clasa I i aII-a specifice
donatorului.
Principiul metodei de lucru
Prepararea lizatului de limfocite ale donatorului
Reacia ELISA propriu-zis (Fig.16)

Fig.16. Crossmatch principiul metodei ELISA.

Glicoproteinele HLA sunt preparate din limfocite prin

solubilizarea celulelor cu un detergent neionic. Dup
solubilizare, lizatele de limfocite se adaug n godeurile n care
au fost imobilizai anticorpi monoclonali specifici pentru HLA
clasa I i clasa a II-a. Glicoproteinele HLA sunt lsate s se
lege de anticorpii monoclonali i apoi glico-proteinele nelegate
sunt ndeprtate prin splare.
Godeurile coninnd glicoproteinele legate sunt testate cu
ser uman pentru a detecta anticorpii anti-molecule HLA.
Anticorpii nelegai sunt ndeprtai prin splare.
Se adaug apoi n godeuri un reactiv anti-globulin uman
(anti-IgG) marcat cu fosfataza alcalin i godeurile se
incubeaz. Anti-IgG nelegat se ndeprteaz prin splare
Se adaug substratul PNPP (p-nitrofenil fosfat)(Fig. 16).
Dup 30 minute de incubare reacia este oprit cu soluie de
hidroxid de sodiu.
60

 Densitatea optic a culorii formate se masoar cu un

spectrofotometru.
Interpretarea rezultatelor Criteriul de pozitivitate
Se citesc absorbanele la 405 sau 410 nm folosind filtrul
de referin de
490 nm.
Control negativ

0,300

Control pozitiv

1,000

Control lizat

0,900

Rezultatele care au media absorbanelor > 2X media

valorilor
controalelor negative, sunt pozitive.

Crossmatch prin metoda flowcitometriei

Aceast tehnic de lucru este ntre 30 - 250 de ori mai
sensibil dect metodele serologice vizuale pentru detecia
anticorpilor anti-HLA de tip IgG. Celulele T sunt separate
electronic de celulele B, prin folosirea unui anticorp fa de
antigene de suprafa ale celulelor T,(cum ar fi complexul CD3PCR, marcat cu fluorescein)
O poart electronic poate fi creat astfel nct, numai
celule T marcate cu fluorescein sunt selectate. Limfocitele
donatorului sunt incubate cu serul primitorului pentru a
permite legarea oricror anticorpi anti-donator. Anticorpii
legai la populaia de celule T selectat sunt detectai prin
adaugarea unui anticorp anti IgG uman, anti Fc specific.
F(ab)2 este cuplat cu un fluorocrom de culoare diferit de
cea a anticorpului care marcheaz celulele T (de exemplu
verde dac anti CD3 a fost rou). Flowcitometrul numr
celulele T cuplate i creaz o histogram proiectnd numrul
de celule versus intensitatea fluorescenei. Celulele necuplate
61

rmn lng origine iar celulele cuplate la dreapta originii pe

axa X.
O deplasare la dreapta a vrfului de celul T, n
comparaie cu controlul negativ, indic faptul c anticorpii antiHLA de clasa I din serul pacientului s-au legat de celulele T ale
donatorului. Flowcitometria se poate performa i pe celule B
legate cu anticorpi specifici acestora.
Flowcitometria este n general performat pe serul cel
mai recent i pe o selecie de seruri istorice, reactive, pentru
toi pacienii aflai pe lista de ateptare pentru donatori
cadavru i care au un risc crescut de rejet (cum ar fi alogrefa
rejetat anterior, PRA nalt, donator viu nrudit cu crossmatch
serologic pe celula T negativ i pe celula B pozitiv).
Cteodat crossmatch-ul
pozitiv prin flowcitometrie
apare cnd crossmatch-ul serologic pe celula T i B este
negativ. Indicaiile pentru transplant, n aceste cazuri, rmn
controversate. Exist dou posibile explicaii pentru aceste
observaii: existena prezenei anticorpilor anti-HLA care nu
sunt citotoxici sau exista prezenei anticorpilor blocani care
interfereaz cu testarea.

Crossmatching prin tehnologia Luminex

Prin aceast metod se poate lucra crossmatch cu
sensibilitate i specificitate de performan comparabile cu
cele obtinute prin flowcitometrie. Totui, la ora actual,
utilizarea cea mai de succes a Luminex-ului, ca i cost/eficien
i acuratee este pentru detecia i identificarea anticorpilor
citotoxici (Fig. 17).

62

Fig.17. Principiul tehnologiei Luminex.

Crossmatch-ul pentru autoanticorpi

n evaluarea crossmatch a serului primitorului pentru
compatibilitate cu donatorul, cel mai important este s
distingem
anticorpii
nespecifici,
antilimfocitari
numii
autoanticorpi, de anticorpii specifici anti-donator. Prezena
autoanticorpilor este detectat de testul auto crossmatch n
care serul pacientului i limfocitele acestuia sunt combinate n
testul standard de citotoxicitate.
Autoaticorpii pot da rezultate fals pozitive ntr-un test
crossmatch cu limfocitele potenialului donator conducnd la
descalificarea eronat a acelui donator. Alternativ, anticorpii
preexisteni pot masca prezena anticorpilor specifici antidonator. Auto crossmatch-ul este performat de rutin n cazul
tuturor crossmatch-urilor cu donatori vii pentru fiecare ser
care este testat.
Algoritmul corect de testare crossmatch pentru un
receptor aflat pe lista de ateptare pentru un transplant renal,
const n punerea n reacie a limfocitelor donatorului cu serul
istoric de la data precedentei evaluri i cu serul din pre-ziua
transplantului;
concomitent
se
lucreaz
i
testul
autocrossmatch.

63

Testarea pentru autoanticorpi prin flowcitometrie este, de

asemenea, recomandat n particular n cazul unui crossmatch
serologic negativ cuplat cu un test crossmatch pozitiv
neateptat prin flowcitometrie.
Rezultate de crossmatch fals pozitive, prin tehnica
flowcitometric, se pot produce cnd pacientul are
autoanticorpi de specificitate nedeterminat. Astfel de
autoanticorpi pozitivi prin flowcitometrie nu sunt considerai a
fi o contraindicaie pentru transplantul renal.

Algoritmul evalurii imunologice n transplantul renal cu donator viu

Grupele sanguine ale donatorului i receptorului trebuie
s fie compatibile. Tipizarea HLA ajut la selectarea celui mai
adecvat donator viu cnd sunt disponibili mai muli donatori.
nainte de transplant se efectueaz testul crossmatch
pentru evitarea fenomenului de rejet hiperacut. Un test
crossmatch pozitiv exclude transplantul renal de la acel
donator.

64

Fig.18. Evaluarea imunologic n vederea transplantului renal de

la donator viu.

Algoritmul evalurii imunologice n transplantul renal cu

donator cadavru
Donatorul cadavru i potenialii receptori trebuie s aibe
grupe sanguine compatibile. Apoi este performat tipizarea
HLA i gradul de compatibilitate este folosit pentru alocarea
rinichilor de la cadavru.
Anumite date sugereaz c prezena nepotrivirilor HLA
care au fost prezente ntr-o alogref anterioar (n special
pentru locusul DR), poate duce la pierderea timpurie a
alogrefei renale. Astfel, ar fi nelept s evitm astfel de
nepotriviri.
Cnd PRA este > 10% este prudent s efectum teste
pentru a determina dac unii dintre anticorpi sunt mai mult
autoreactivi dect aloreactivi. Anticorpii autoreactivi nu cresc
riscul de rejet dar cei aloreactivi cresc riscul de pierdere a
alogrefei renale. Titrul mare de anticorpi aloreactivi se
datoreaz, de obicei, sarcinilor anterioare, transplanturilor sau
transfuziilor de snge.
Determinarea anticorpilor citotoxici poate fi util n
evitarea anumitor antigene HLA. La pacienii foarte

65

sensibilizai (PRA > 50%) poate fi foarte dificil de gsit un

donator crossmatch negativ. Evitarea transfuziilor poate ajuta
ca titrul anticorpilor citotoxici s scad n timp.

Fig.19. Evaluarea imunologic n vederea transplantului renal de

la cadavru.

Alegerea unui donator viu versus donator cadavru pentru

transplantul renal

66

Fig.20 Donator viu versus cadavru pentru

transplantul renal.

Folosirea donatorului viu pentru transplantul renal este

avantajoas deoarece supravieuirea alogrefei este mai bun i
este posibil transplantul preemptiv [6]. Cel mai bun donator
este, de obicei, un membru din familie.
Donatorul marginal
Dei nu este acceptat nc o definiie unanim, aceti
donatori includ persoane la vrste extreme, cu hipertensiune
sau diabet sau indivizi cu un risc crescut de transmitere a
diferitelor boli. n mod surprinztor, transplantul de rinichi de
la un astfel de donator marginal duce n multe cazuri la o
funcie renal bun la nivelul receptorului.
S-a constatat c transplantul renal dual de la donatori
marginali d rezultate similare transplanturilor cu un singur
rinichi de la donatori non-marginali [16]. Transplantul dual nu
pare s creasc rata complicaiilor chirurgicale [16]. Sistemele
de scorificare care folosec variabilele donatorului cum sunt:
vrsta, hipertensiunea arterial n antecedente, funcia renal,
67

rezultatele biopsiei renale i missmatch-ul HLA, pot furniza o

abordare cantitativ pentru furnizarea rinichilor marginali
[23].
Donatori non-heart-beating
Principala problem legat de transplanturile renale de la
acest tip de donatori este rata crescut de funcie renal
ntrziat i de nefuncionare primar comparativ cu rinichii
provenind de la donatori cadavru heart-beating [8].

Efectul sursei donatorului asupra supravieuirii alogrefei

Comparaia ntre primitorii de rinichi cu diferite surse de
donatori, la 3 ani de supravieuire a alogrefelor renale, a artat
c cea mai bun supravieuire a fost observat la cei cu
donatori frati, HLA identici [6].
Grefele provenite de la soi sau soii i ali donatori vii
nenrudii au supravieuit la fel ca i grefele provenite de la
prini, toate supravieuind mai mult n comparaie cu grefele
provenite de la donatori cadavru [6].

Fig.21. Impactul sursei donatorului asupra supravieuirii alogrefei

68

renale de la donori vii nrudii.

Aceste date au ncurajat centrele de transplant renal

pentru a face ct mai multe transplanturi de la donatori vii, n
acest fel evitnd i lunga ateptare pentru un donator de
rinichi cadavru.

Efectele potrivirii HLA asupra

supravieuirii alogrefei renale provenite de la un
donator viu

Fig.22. Impactul potrivirii HLA asupra supraviuirii

grefei renale de la donatori vii nrudii
(dup L.K. Lebeck i M.R. Garovoy Histocompatibility testing and organ
sharing, chapter 8).

Supravieuirea alogrefei este cea mai bun pentru

alogrefe HLA identice de la frai i este urmat apoi de
69

alogrefe cu un singur haplotip nepotrivit. Important este c

timpul de njumtire (T) al grefelor care supravieuiesc la
cel puin un an este proporional cu gradul de matching.
Aceast informaie poate fi folosit mpreun cu ali factori
pentru a selecta cel mai adecvat potenial donator de rinichi
[27].

Matching-ul imunologic: conceptul de matching n transplantul renal

Influena pozitiv a potrivirii HLA asupra supravieuirii
grefei renale a fost demonstrat timp de mai bine de 25 de ani
[11, 31, 6]. n practic, gasirea unui donator de rinichi cu zero
missmatch HLA este extrem de rar. De aceea, eforturile se
concentreaz pentru gsirea unui donator cu minimum de
nepotriviri HLA sau, se merge mai departe, pn spre limita
maxim de nepotriviri, astfel nct s putem avea, totui, un
matching HLA optim.
n acest sens, de exemplu, ntre 1988 i 1996 programele
de transplant renal ale Eurotransplant au mers pe minim
potrivire pentru cel puin un antigen HLA-B i un antigen HLADR.
Chiar i n prezent, multe programe continu s
foloseasc aceste cerine minime pentru potrivirea HLA aa
cum reiese din profilul de matching HLA al programului de
alocare de rinichi al Eurotransplant [9].
n mod regretabil nu exist nc un consens general
despre definiia a ceea ce nseamn un donator inacceptabil
HLA.

70

n orice caz, anticorpii citotoxici detectai n serul actual

al pacientului identific antigenele HLA de clasa I
inacceptabile ale donatorului i prognozeaz un crossmatch
pozitiv care este testul final nainte de transplant.
Relevana anticorpilor pentru urmatoarele aspecte este
controversat:
1) antigenele HLA de clasa a II-a;
2) antigenele HLA de clasa I care au fost identificate numai n
serurile istorice ale pacientului;
3) antigenele HLA ale donatorului care au fost nepotrivite n
cazul unui transplant anterior, dac acest lucru este aplicabil.
Toate aceste restricii imunologice afecteaz aproximativ
30% din pacienii aflai pe lista de ateptare a Eurotransplant
[9].
n mod ideal ar trebui considerat un index de potrivire i
pentru antigenele HLA inacceptabile ale donatorului.
Matching-ul imunologic este relevant numai cnd exist
un numr suficient de mare de donatori [31]. Cu ct sunt mai
muli donatori cu att este mai mare ansa unui matching bun,
prin aceasta nelegnd o potrivire de 50% pentru alelele HLAA, B i DR.
Orice politic de a maximiza numrul de zero missmatchuri HLA-A, B, DR ar trebui s acioneze pe un numr ct mai
mare de donatori posibili. Acelai lucru trebuie s se aplice i
pentru pacienii nalt sensibilizai.
n anii receni, progrese mari s-au efectuat prin potrivirea
HLA la nivel de alel [7]. De asemenea, trebuie menionat c
muli primitori de alogref renal cu nepotriviri HLA continu
s aib o funcie bun muli ani dup transplant, sugernd c
anumite nepotriviri HLA sunt totui acceptate [8].
n timpurile testrii serologice HLA un ser cu PRA nalt
era considerat a fi compus din muli anticorpi anti-HLA. Mai
71

trziu s-a observat c serul pacienilor nalt sensibilizai

ateptnd un transplant renal era, n general, compus dintr-un
numr mic de anticorpi direcionai fa de antigenele publice,
denumite i CREGs i mai puin din anticorpi multipli, fiecare
reacionnd cu un antigen HLA specific convenional. Mai
mult, frecvena CREGs era mult mai mare, 35% pn la 88%,
fa de cele mai comune antigene HLA-A i B. Prin interferen
potrivirea pentru antigenele donatorului i receptorului incluse
n acelai CREG, respectiv potrivirea CREG, poate duce la un
numr mai mare de transplanturi potrivite i la un nivel mai
redus de sensibilizare a pacienilor avnd grefe repetate. n
completare, datorit includerii unor antigene private HLA-A i
B n cadrul aceleai CREG, un numr de antigene rare pot fi
potrivite mult mai uor, oferind posibilitatea unei supravieuiri
alogrefei mult mbuntite pentru un numr mai mare de
pacieni.
Un studiu recent de potrivire pentru CREGs (cross
reactive groups), a sugerat c att donatorii ct i primitorii
care sunt potrivii pentru aceste grupuri de antigene, pot avea
mai puine teste crossmatch pozitive i pot beneficia de o
alogref renal cu o supravieuire de lung durat [8].
n rezumat, evaluarea imunologic pretransplant renal a
pacienilor cuprinde: genotipul HLA, anticorpii citotoxiciscreening, dac este cazul identificare i testul crossmatch.

Transplanturile renale ABO incompatibile

72

n mod tradiional, compatibilitatea de grup sanguin este

considerat esenial pentru transplantul renal de succes,
deoarece rinichii ABO incompatibili transplantai sunt rapid
distrui de fenomenul de rejet hiperacut datorat anticorpilor
anti-A i/sau anti-B care se leag de antigenele A i/sau B de pe
endoteliul grefei, activnd cascada complementului i inducnd
agregarea trombocitar i tromboza intravascular [8].
n 1981, Slapak i colaboratorii au observat c
plasmafereza rezolv rapid rejetul la un transplant renal
accidental incompatibil ,ABO care s-a produs din cauza unei
erori de lucru a grupelor sanguine.
Recent interesul pentru folosirea rinichilor de la donatori
vii ABO incompatibili a crescut foarte mult, mai ales n ri
unde din motive culturale nu exist surs alternativ de
donatori.
Chirurgii japonezi au raportat faptul c subgrupe
selectate de pacieni pot atinge o evoluie acceptabil dup
transplantul renal ABO incompatibil, dac anticorpii anti-ABO
sunt redui pretransplant combinat cu splenectomie i/sau
anticoagulante
postoperator
i
doze
nalte
de
imunosupresoare.
Titrurile de anticorpi pretransplant sunt reduse prin
schimbare de plasm (plasma exchange) sau imunoabsorbie
cu nlocuire ulterioar cu plasm tip AB.
Splenectomia este performat n ncercarea de a reduce
capacitatea primitorului de a produce anticorpi anti-A/anti-B n
cazul n care transplantul se efectueaz de la un donator de
rinichi ABO incompatibil.
Terapia anticoagulant cu inhibitori ai agregrii
trombocitare este utilizat pentru a preveni iniierea coagulrii
intravasculare diseminate intrarenal, datorit rejetului umoral.
Acest tip de transplant poate fi aplicat cu succes pentru
pacienii care primesc rinichi de la donatori vii i nu este
posibil n cazul donatorilor cadavru.
73

BIBLIOGRAFIE

1. American Society for

http://www.ashi-hla.org

Histocompatibility

and

Immunogenetics,

2. Baxter-Lowe, L.A, and Colombe, B.W., Histocompatibility Testing

(19), in Lange Medical Immunology, Tenth Edition, 2001.
3. Callaghan, C. J., and Bradley, J. A., Current status of Renal
Transplantation Cpt. 1 in Transplantation Immunology Methods and
Protocols edited by Philip Horniclx, Marlene Rose, Humana Press
Inc. 2006.
4. Campbell, R.D. and Trowsdale, J. Immunology Today 18, 43, 1997.
5. Cecka, J.M. and Reed F.E., Histocompatibility Testing, CrossMatching, and Allocation of Kidney Transplants in Handbook of
Kindey Transplantation, Fourth Edition, Gabriel M. Danovitch, 2005
by Lippincott Williams & Wilkins.
6. Cecka, J.M., The role of HLA in renal transplantation. Human
Immunology 56: 6-16, 1997.
7. Chua, M.S., Sarwal, M. Microarrays: New tools for transplantation
research. Pediatric Nephrology, 18:319-327, 2003.
8. Danovitch, G.M., Handbook of Kindey Transplantation Fourth Edition,
Lippincott Williams & Wilkins, 2005
9. De Meester, J., Persijn, G.G., Claas, F.H.J., Frei, U: In the queue for a
cadaver donor kidney transplant: new rules and concepts in the
Eurotransplant International Foundation. Nephrology Dialysis
Transplantation 15,3, 333-338, 2000.
10.

European Bioinformatics Institute, http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla

11.
Gilks, W.R., Gore, S.M., Bradley, B.A., Matchability in kidney
transplantation. Tissue Antigens; 32:121-129, 1988.
12.
Hariharan, S., McBride, M.A., Cherikh, W.S., Tolleris, C. B.,
Bresnahan, B. A., and Johnson, C. P., Posttransplant renal function in

74

the first year predicts long-term kindey transplant survival. Kidnei

Int. 62, 311-318, 2002.
13.
Harrison, J, Navarrete, C., Selection of Platelet Donors and
Provision of HLA Matched Platelets, in Histocompatibilitz Testing.
Imperial Collage Press, 2000; 379
14.
Herczyk, W.F., Luminex, Vendor Forum, ASHI Quarterly, 104,
Third Quarter, 2003.
15.
Janeway, C.A., Travers P: Antigen recognition by T lymphocytes.
Ed 3 Immunobiology 41-46, 1997, Garland Publishing, New York and
London.
16.
Jerius, J. T., Taylor, R. J., Murillo, D., and Leone, J. P. Double renal
transplants from marginal donors: 2-year results. Journal of Urology,
163, 423-425, 2000.
17.
Johnson, A.H., Katovich, Hurley. C., Hartzman, R.J., Wade, J.A.,
Human Leucocyte Antigen : The Major Histocompatibility Complex of
Man, 40, 927-946, in Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, John Bernard Henry, M.D., 2001, Saunders,
Twentieth Edition.
18.
Little, A-M., Parham, P: Polymorphism and evolution of class I
and class II genes and molecules. Reviews in Immunogenetisc,
1105-123, 1999.
19.
Lucas, D.P., Paparounis, M.L., Meyers, L., Mart, J.M., Zachary,
A.A.,: Detection of HLA class I specific antibodies by the QuikScreen
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Clin Lab Diagn Lab Immunol,
1997;4:252
20.
Luminex Corporation, 1998-2000. Luminex 100 User Manual
Version 1.7 Rev B.
21.
Marsh, S.G.E., Parham, P. Barber., Barber L.D., The HLA
FactsBook, Academic Press, 2000.
22.
Moore, S.B., Ploeger, N.A., DeGoey, S.R.,: HLA antibody
screening: Comparison of a solid phase enzyme-linked immunoassay
with antiglobulin augmented lymphocytotoxicity. Transplantation
1997; 64:1617.
23.
Nyberg, S. L., Matas, A. J., Kremers, W. K., et. al. Improved
scoring system to assess adult donors for cadaver renal
transplantation. American Journal of Transplantation. 3, 715-721,
2003.
24.
Rhodes, D.A., Trowsdale, J.: Genetics and molecular genetics of
the MHC. Reviews in Immunogenetics, 1:21-31, 1999.
25.

Rodey Glenn E. HLA Beyond Tears. De Novo, Inc. 2000;213.

26.

Sanger Centre, http://www.sanger.ac.uk./HGP/Chr6/MHC/shtml

75

27.
Thelan, D., Rodey, G., American Society of Histocompatibility and
Immunogenetics Laboratory Manual, edn. Lenxa, K.S: ASHY.
28.

Trowsdale, J. Immunogenetics 41,1-17,1995.

29.
Trowsdale, J. In HLA and MHC: Genes, Molecules and Function
(Browning, M. And McMichael, A. Eds), 1996, Bios Scientific
Publishers, Oxford.
30.
Williams, T.M., Human Leucocyte Antigen Gene Polymorphism
and the Histocompatibility Laboratory, The Journal of Molecular
Diagnostics, 3, 3, 2001.
31.
Wujciak, T., Opelz, G., Matchabililty as an important factor for
kidney allocation according to the HLA Match. Transplantation
Proceedings; 27: 1403-1405, 1997.
32.
Zachary, A.A., Delaney, N.C., Lucas, D.P., Laffell, M.S.,
Characterization of HLA Class I Specific Antibodies by ELISA Using
Solubilized Antigen Targets: I. Evaluation of the GTI Quik-ID Assay
and Analysis of Antibody Patterns. Human Immunology 2001; 62:3,
228-235

EVALUAREA IMUNOLOGIC N
TRANSPLANTUL HEPATIC
_______________

_______________

Ana Moise, Ileana Constantinescu

76

Primul transplant de ficat la om, a fost realizat n 1963 de

ctre echipa chirurgical condus de dr. Thomas Starzl, n
Denver, SUA. n ciuda perfecionrii continue a tehnicilor
chirurgicale, transplantul hepatic a rmas la nivel
experimental, cu o rat a supravieuirii la un an de cca. 25%,
pn prin anii 80 cnd a fost introdus Ciclosporina ca
tratament imunosupresor.
i n prezent, dei rata supravieuirii la 1an a ajuns la 80
85% i continu s se mbunteasc, transplantul de ficat
rmne o procedur formidabil dar grevat de complicaii
frecvente.
n general, afeciunile hepatice care induc necesitatea
unui transplant, pot fi divizate n dou grupe:
- afeciuni acute: cum ar fi hepatitele virale fulminante.
- afeciuni cronice: hepatite virale cronice, hepatite
autoimune, hepatopatii
alcoolice (indicaie controversat, condiionat de abstinena
pretransplant),
ciroz
biliar
primitiv,
colangit
sclerozant, boli metabolice (boala Wilson ).
Transplantul hepatic este limitat de numrul de organe
cadaverice disponibile. n ultimii ani, numrul organelor
disponibile de la cadavru a rmas relativ stabil, n timp ce
numrul pacienilor nscrii anual pe lista de ateptare pentru
transplantul hepatic este n continu cretere.
Aceast discrepan ntre organele disponibile i nevoia
de transplant a condus la reevaluarea continu a criteriilor de
selecie i includere pe lista de ateptare. n prezent, scorul
MELD (Model for End-Stage Liver Disease) este recomandat,
deoarece se bazeaz pe 3 parametri biochimici obiectivi, larg
disponibili i reproductibili (bilirubina seric, creatinina seric
i INR protrombin), iar pentru populaia pediatric se
utilizeaz un model similar, scorul PELD (Pediatric End- Stage
Liver Disease) care folosete urmtoarele variabile: vrsta,
albumina seric, bilirubina seric total, INR i retardul
statural. [1, 2, 3, 4]
77

Donatori marginali:
1. vrst > 50 ani: dei vrsta naintat a donatorului se
poate asocia cu funcia deficitar a grefei, lipsa de organe
i evoluia favorabil post-transplant par s justifice
numrul n cretere al donatorilor > 50 ani.[5]
2. steatoza hepatic: ficatul cu infiltrare gras uoar sau
moderat poate fi utilizat cu rezultate bune dac timpul de
ischemie rece este redus.[6]
3. markeri pozitivi pentru virusul hepatitic B sau C: grefele
provenind de la donatori cu markeri de infecie VHB sau
VHC pot fi utilizate la receptori cu ciroz secundar
infeciei VHB, respectiv VHC, dac se administreaz
tratament profilactic specific.[7,8]
Transplantul
cu
ficat
mprit
(split
liver
transplantation ): un ficat de la cadavru este mprit n dou
grefe funcionale, lobul drept fiind folosit pentru un receptor
adult, iar lobul stng (segmentele 2, 3 i 4) sau segmentul
lateral stng (segmentele 2 i 3) pentru un adult scund sau un
copil. Majoritatea centrelor consider c mprirea in vivo
este superioar celei ex vivo dac sunt luate n considerare
rezultatele imediate i pe termen lung. Principalul dezavantaj
al tehnicii cu ficat mprit const n supravieuirea mai mic a
grefei i numrul crescut de complicaii biliare comparative cu
transplantul hepatic integral.
Transplantul hepatic n domino reprezint situaia n
care un pacient cu o afeciune genetic i ficat normal
morfologic (de exemplu, amiloidoz familial) primete un ficat
de la donator cadavru, iar ficatul pacientului cu amiloidoz este
transplantat unui receptor marginal avnd n vedere c
apariia manifestrilor amiloidozei familiale apar dup o
perioad lung (20-30 ani).[9]
Transplantul hepatic cu donator viu (living donor liver
transplantation- LDLT). Este o metod bazat pe capacitatea
remarcabil de regenerare a ficatului. Din punct de vedere
istoric, metoda se adresa iniial prinilor ce aveau copii cu

78

afeciuni hepatice i care erau dispui s le doneze o poriune

din ficatul lor sntos, dar n prezent se efectueaz si
transplantul adult adult. Ficatul donatorului se regenereaz
i este funcional 100% n circa 4 6 sptmni.
Avantajele LDLT sunt: scurtarea perioadei de ateptare;
posibilitatea alegerii momentului optim, nainte de apariia
deteriorrii progresive a funciei hepatice i condiiei
pacientului; scderea timpului de ischemie rece; creterea
rezervorului de donatori;
Dezavantajul major al LDLT este morbiditatea de aproximativ
10% i, n cazuri rare (0.2-0.5%), mortalitatea donatorului [1013].
Compatibilitatea donator primitor n transplantul hepatic

Potrivirea dintre donator i receptor implic doi factori:

1. grupul sanguin: donatorul trebuie s aib grupul
sanguin compatibil dar nu neaprat identic cu al
primitorului. Totui, studiile au artat c un transplant
izogrup ofer o supravieuire mai bun dect un
transplant cu grup compatibil.
2. dimensiunea corpului (body size): este foarte dificil s
introduci ficatul unei persoane bine dezvoltate n corpul
unei persoane de statur mic i ca urmare potrivirea
dimensiunilor ntre primitor i donator este
esenial.
Spre deosebire de transplantul de rinichi sau de mduv
osoas, n transplantul hepatic, compatibilitatea HLA nu este
necesar cu toate c a fost raportat o relaie invers ntre
compatibilitate i supravieuire [14]. Oricum, genotiparea HLA
se efectueaz numai n scopuri tiinifice nu i n scopul
alocrii alogrefelor hepatice.

79

Genotipul HLA DRB1*11 este asociat n 70% din cazurile

de transplant hepatic cu episoade de rejet acut i cu creterea
nivelului seric al neopterinului, IL-1, IL-2R, IL-8.
Genotipul HLA DRB1*13 este asociat cu infecii VHC
posttransplant i sepsis.
Crossmatch-ul nu se performeaz de rutin preoperator
dar, ocazional, poate fi realizat retrospectiv. Au fost raportate
numai cteva cazuri de rejet hiperacut datorate prezenei
anticorpilor anti-donor. Motivul acestei aparente rezistene a
ficatului la rejet hiperacut nu este nc pe deplin cunoscut. S-a
sugerat c ficatul nu este sensibil la anticorpii preformai sau
c, datorit dimensiunilor sale mari, rezult o diluie a
anticorpilor la nivele la care ei nu mai sunt nocivi.
Ocazional, n cazul unor transplante combinate, ficat i
rinichi, crossmatch-ul pozitiv pretransplant s-a negativat
posttransplant. Dou ipoteze au fost lansate n ce privete
mecanismul prin care se produce aceast scdere a nivelului
anticorpilor citotoxici: 1) formarea de complexe imune solubile;
2) pierderea de snge asociat operaiei de transplant hepatic
ce determin o scdere a titrului anticorpilor [14].

Boala acut de gref contra gazd (GVHD) n transplantul hepatic

Ficatul face parte din sistemul reticuloendotelial, este un

organ mare cu o reea vascular ntins i care conine n
parenchim un numr mare de celule limfoide. Se estimeaz c
numrul limfocitelor din parenchimul unei grefe hepatice este
mult mai mare dect cel dintr-o gref de mduv osoas.
GVHD acut posttransplant hepatic apare cnd limfocitele
imunocompetente ale donatorului, transferate odat cu ficatul,
sunt activate i sufer o expansiune clonal. Mecanismul intim
al acestui proces nu este nc bine cunoscut. Lezarea ficatului
datorat manevrelor chirurgicale ar induce o stare de
80

imunosupresie i alterarea raportului citokinelor TH1/TH2.

Recent, o mai mare atenie se acord limfocitelor T reglatoare
CD4+ CD25+, deoarece ele joac un rol important n
imunoreglare i imunotoleran, fiind capabile s inhibe
funciile limfocitelor T CD4+, CD8+ i a celulelor NK [15].
Diagnosticul precoce al acestei afeciuni i strategia
terapeutic reprezint o provocare, ntruct rata de mortalitate
este nc mare, n jur de 85%. Din fericire incidena acestei
boli este sczut, 1 2%, i pare s fie influenat de mai muli
factori ce in att de donator ct i de primitor:
compatibilitatea HLA, vrsta naintat a primitorului,
imunodeficiena primitorului [16, 17,18].
Legat tot de aceste limfocite imunocompetente ale
donatorului, transferate primitorului odat cu
organul
transplantat, se descrie aa-numitul "sindrom al limfocitelor
pasagere" (SLP) [19].
Acest sindrom se refer la fenomenul de hemoliz
aloimun mediat de complement, datorat produciei de
anticorpi antieritrocitari de ctre limfocitele B cu memorie ale
donatorului. Faptul c aceti anticorpi provin de la donator a
fost demonstrat prin teste de alotipizare a imunoglobulinelor.
De obicei, specificitatea este fa de antigene eritrocitare
ale sistemelor ABO i Rh si doar ocazional fa de antigene
aparinnd altor sisteme eritrocitare ( Kidd, Lewis ), situaie
ntlnit atunci cnd donatorul a fost sensibilizat prin transfuzii
sanguine sau sarcin. Tratamentul imunosupresor administrat
posttransplant joac un rol etiologic important. Ciclosporina i
tacrolimusul permit proliferarea rapid a limfocitelor B
transferate, care vor produce anticorpi.
Este o complicaie raportat mai frecvent n cazul
transplantelor cu mismatch minor ABO si poate fi cauza unor
hemolize "neexplicate" aprute n perioada postoperatorie.
Incidena SLP biochimic (haptoglobin sczut, transaminaze

81

i bilirubin indirect crescute) n transplantul hepatic este de

circa 30 40% .
De obicei apare n sptmnile 1 3 posttransplant i are
o evoluie autolimitat cu remisiune complet n circa 3 luni.
Dintre factorii ce influeneaz severitatea hemolizei amintim:
cantitatea de esut limfoid transferat, nivelul izoaglutininelor
eritrocitare la donator nainte de transplant, capacitatea de
clearence a acestor anticorpi de ctre primitor [20-23].
n cele mai multe cazuri tratamentul implic doar
substituia cu mas eritrocitar, izogrup cu donatorul, i numai
rareori sunt necesare
i alte mijloace terapeutice:
plasmaferez, Ig intravenos, corticosteroizi sau anticorpi
monoclonali anti CD20 (Rituximab) [24].

Monitorizarea pacientului posttransplant hepatic

Evaluare imunologic
Fenomene de rejet post transplant hepatic pot fi ntlnite
la peste 50% din pacienti i sunt tratate relativ uor i cu
succes dac sunt diagnosticate precoce. Din pcate, semnele i
simptomele clinice (febr, dureri abdominale, ascit,
hepatomegalie, inapeten ) i testele paraclinice (creterea
nivelelor serice ale bilirubinei, transaminazelor, fosfatazei
alcaline) sunt nespecifice.
Uzual, diagnosticul se pune prin biopsie hepatic
percutan aspectul histopatologic sugestiv fiind reprezentat de
infiltratul celular mixt n spaiul port, cu epiteliul ductelor
biliare i al venei centrale/porte alterat.
O provocare continu pentru imunologii i cercettorii ce
activeaz n domeniul transplantului, este descoperirea unor
noi markeri, ct mai specifici i ct mai accesibili, care s
permit un diagnostic ct mai precoce i prin metode
neinvazive, a fenomenelor de rejet.

82

Citokinele TH1 i alte citokine proinflamatorii, incluznd

TNF-, IFN-, IL-2, sunt mediatori primari ai rejetului alogrefei
[25,26]. Pe de alt parte citokinele TH2, cum ar fi IL-4 sau IL10, inhib rspunsul TH1 i compromite imunitatea gazdei, dar
promoveaz tolerena transplantului (27).
n plus, limfocitele T helper, sub aciunea Transforming
Growth Factor ( TGF- ) i a IL-6, se pot diferenia ntr-un
subset de celule ce secret IL-17, citokin recent recunoscut
ca inductoare a rspunsurilor inflamatorii.
IL-1, IL-2R, IL-6, IL-8, TNF- i neopterina seric
reprezint indicatori fideli ai rspunsului imun mediat celular
la pacienii cu transplant hepatic i din acest considerent sunt
markeri imunologici prognostici pentru fenomenul de rejet
acut.
Algoritmul immunologic de evaluare posttransplant
trebuie s cuprind, n mod obligatoriu, cel puin determinarea
IL-2R, TNF- i neopterinei pentru o monitorizare imunologic
de acuratee, care s ofere o imagine ct mai fidel asupra
rspunsului imun celular.
Evaluarea imunologic este cu att mai important n
condiiile imunosupresiei cu inhibitor de calcineurin i n cazul
infeciilor posttransplant induse de virusuri din familia
herpesviridae care, la rndul lor, manipuleaz rspunsul imun
al gazdei.

Evaluarea virusologic
Evaluarea virusologic pre i posttransplant este foarte
important pentru monitorizarea pacienilor cu transplant
hepatic.
Recurena afeciunii iniiale post-transplant este o provocare
major pentru hepatolog.

83

Afeciunea care ridic cele mai importante probleme

legate de recidiva post-transplant este infecia cu VHC.
Reinfecia grefei cu VHC este universal, recurena histologic
fiind notat la 50-80% din pacieni la 1 an post-transplant. O
proporie de 15-30% dintre pacienii cu hepatit cronic C
recurent dezvolt ciroz hepatic la 5 ani post-transplant.
O serie de factori se asociaz cu riscul hepatitei VHC
recurente post-transplant: ncrctura viral mare pretransplant i precoce posttransplant, genotipul 1b i 4, anumite
antigene HLA ( HLA DRB1*13 ), timpul de ischemie rece
prelungit, steatoza sever (> 30%), asocierea carcinomului
hepatocelular, vrsta donatorului > 50 ani, tipul de
imunosupresie (utilizarea OKT3), numrul episoadelor de rejet
acut tratate cu bolusuri de metilprednisolon, tratamentul
rejetului cu anticorpi anti-limfocitari, infecia cu virusul
citomegalic, absena coinfeciei VHB pretransplant [6,9,28,29].
Rareori recurena infeciei VHC se asociaz cu forme
agresive de hepatit ce pot duce la pierderea grefei, iar cteva
rapoarte recente sugereaz c incidena i severitatea
recurenei sunt mai crescute n cazul transplantului de ficat de
la donatori vii [31].
Eradicarea infeciei VHC pre-transplant reprezint
modalitatea optim de profilaxie a infeciei grefei. Regimul
antiviral optim pentru tratamentul hepatitei C recurente posttransplant este regimul combinat interferon, preferabil
pegylat, plus ribavirin. Durata i doza optim a fiecrui agent
antiviral nu sunt nc standardizate. Retransplantarea
pacienilor cu infecie VHC recurent rmne controversat
datorit rezultatelor slabe.
Pn n urm cu aproximativ o decad, pacienii
transplantai pentru ciroz de etiologie VHB prezentau cel mai
nefavorabil prognostic dintre toi pacienii transplantai pentru
afeciuni hepatice non-maligne cu o proporie de 73% din
decesele nregistrate n primele 60 zile posttransplant.

84

Reinfecia VHB a grefei se poate produce cu particule

VHB circulante, cu particule virale provenind din sursele de
replicare extrahepatice ale VHB (sistemul hematopoetic,
pancreas) sau ambele.
Factorii asociai cu o rat de reinfecie mai mic i cu
mbuntirea supravieuirii posttransplant includ [31]:
1.

replicare viral absent (absena n ser a ADN-HBV

i/sau AgHBe);

2. profilaxia pe termen lung a hepatitei VHB;

3. hepatita HBV fulminant;
4.

coinfecia cu virus delta (VHD);

Combinaia imunoglobulin specific anti-VHB (HBIG)lamivudin reprezint n momentul actual regimul profilactic
preferat n majoritatea centrelor de transplant hepatic din
lume, fiind asociat cu o rat de reinfecie cuprins ntre 0 i
9.5% [30, 32], iar rata de supravieuire la 5 ani a acestor
pacieni este asemntoare cu a pacienilor transplantai
pentru alte afeciuni non-virale. Monoterapia cu HBIG sau
lamivudin se asociaz ns cu dezvoltarea de mutaii ce
confer rezisten la tratament (mutaii n gena S pentru HBIG
sau mutaii n gena P a polimerazei virale mutaii YMDD
pentru lamivudin).
Retransplantare pacienilor cu infecie VHB recurent
poate fi realizat cu succes dac se asociaz
o terapie
antiviral i cu HBIG n doze crescute.
Citomegalovirusul (CMV) este un patogen frecvent
implicat n infeciile posttransplant, contribuind semnificativ la
creterea morbiditii i mortalitii n transplantul de organe
solide. Un risc mai mare de a dezvolta infecie primar
simptomatic prezint primitorii seronegativi care au avut un
donator seropozitiv. Ali factori de risc pentru activarea CMV
sunt: tipul de organ transplantat, mismatch-ul HLA dintre

85

donator i primitor, intensitatea terapiei imunosupresoare,

sexul feminin.
Pe lng efectul direct determinat de invazia esuturilor,
CMV este implicat n patogeneza rejetului acut sau cronic i
de asemenea crete riscul de recuren al infeciei VHC si
scade supravieuirea global a pacientului i a grefei [33].
O dovad a rolului jucat de CMV n rejetul alogrefei este
observaia c terapia profilactic i antiviral mbuntete
funcia grefei i inhib rejetul acut. Dei reactivitatea imun n
infeciile CMV a fost intens studiat n ultimii ani, mecanismul
imunologic prin care CMV induce rejetul alogrefei rmne
controversat. Una din ipoteze susine c limfocitele T CMVspecifice, cu potenial citotoxic i productoare de citokine
proinflamatorii, cum ar fi TNF-, pot reaciona direct cu
anumite complexe CMH/peptide alogene, proces cunoscut sub
denumirea de "imunitate heteroloag". O alt ipotez se refer
la stimularea indirect a aloimunitii. Infecia CMV induce
producia local de citokine proinflamatorii, cum ar fi TNF-,
IL-1, IL-6, IL-8, sau chemokine CC i CXC, care determin
recrutarea i activarea leucocitelor din gref (34,35).
Este deja bine cunoscut rolul pe care l joac imunitatea
celular n controlul infeciei. Concentraiile crescute de
neopterin reflect rspunsul imun mediat celular i n
infeciile produse de CMV sau EBV, fiind un marker imunologic
foarte util n diagnosticul acestor infecii la pacienii cu
transplant hepatic, deoarece nivelele serice de neopterin
cresc n stadiile timpurii ale acestor infeci, de obicei chiar
nainte de seroconversie.

BIBLIOGRAFIE
1. Forman LM, Lucey MR. Predicting the Prognosis of Chronic Liver
Disease: An Evolution From Child to MELD. Hepatology 2001; 33:
473-5
86

2. Garcia-Tsao G, Elferink RO. MELD: the end of Child-Pugh

classification? J Hepatol 2002; 36: 141-5
3. Kamath PS, Wiesner RH, Malinchoc M et al. A model to predict
survival in patients with endstage liver disease. Hepatology 2001;
33: 464-70
4. Wiesner R, Edwards E, Freeman R et al. The model for end-stage
liver
disease
(MELD)
and
allocation
of
donor
livers.
Gastroenterology 2003; 124: 91-6
5. Hoofnagle JH, Lonbardero M, Zetterman RK et al. Donor age and
outcome of liver transplantation.Hepatology 1996; 24: 89-96
6. Keeffee EB. Selection of patients for liver transplantation. In
Transplantation of the Liver, edited by Maddrey WC, Schiff ER,
Sorrell MF. Lippincott Williams & Wilkins 2001; 5-34
7.
Vergas HE, Laskus T, Wang LF et al. Outcome of liver
transplantation in hepatitis C virusinfected who received hepatitis C
virus-infected grafts. Gastroenterology 1999; 117:149-53
8. Dodson SF, Bonham CA, Geller DA et al. Prevention of de novo
hepatitis B infection in recipients of hepatic allografts from antiHBc positive donors. Transplantation 1999; 68: 1058-61
9. Wiesner RH, Rakela J, Ishitani MB et al. Recent Advances in
Liver Transplantation. Mayo Clin Proc 2003; 78: 197-210
10. American Society of Transplant Surgeons, Ethics Committee.
Position paper on adult-to adult living donor liver transplantation.
Liver Transpl 2000; 6: 815-817
11. Broering DC, Sterneck M, Rogiers X. Living donor liver
transplantation. J Hepatol 2003; 38: S119-S135
12. Renz JF, Roberts JP. Long-term complications of living donor
liver transplan-tation. Liver Transpl 2000; 6(6 suppl 2): S73-S76
13. Ghobrial RM, Saab S, Lassman C et al. Donor and recipient
outcomes in right lobe adult living donor liver transplantation. Liver
Transpl 2002; 8: 901-909
14. Manikkam S, Stock P, et al. Clinical transplantation, in Medical
Immunology, tenth edition edited by Parslow TG, Stites DP, Terr AI,
Imboden JB. McGraw-Hill 2001; 719-742

87

15. Edinger M, Hoffman P, Ermann J, et al. CD4 + CD25+ regulatory

T cells preserve graftversus-tumor activity while inhibiting graft
vs. host disease after bone marrow transplantation. Nat Med 2003;
9:1144 -50
16. Perri R, Assi M, Talwalkar J, et al. Graft vs. host disease after
liver transplantation : a new approach is needed. Liver Transpl
2007; 13: 1092-9
17. Smith DM, Agura E, Netto G, et al. Liver transplant- associated
graft vs. host disease. Transplantation 2003; 75:118-26
18. Chan EY, Larson AM, Gernsheimer TB, et al. Liver Transpl
2007; 13: 516-22
19. Audet M, Panaro F, Piardi T, et al. Passenger Lymphocyte
Syndrome and Liver
Transplantation.Clinical
and
Developmental
Immunology 2008;
20. Yazer MH and Triulzi DJ Immune hemolysis following ABOmismatched stem
cell or solid organ transplantation Current
Opinion in Hematology 2007;14, 6,664 670.
21. Sternberg A J, Lee G, Croxton T, et al. Severe hemolysis after
minor ABO unmatched kidney transplanta non-secrector
transplanted from a donor with high
anti-A titre. Transfusion
Medicine2000;10;1, 8789
22. Sokol RJ, Stamps R, Booker DJ, et al.. Posttransplant immunemediated hemolysis
Transfusion 2002 , vol. 42, no. 2, pp. 198204
23. Shortt J, Westall GP, Roxby D, et al. A dangerous group O
donor: severe hemolysis in all recipients of organs from a donor
with multiple red cell alloantibodies. American Journal of
Transplantation, vol. 8, no. 3, pp. 711714, 2008.
24. Panaro F, DeChristopher PJ, Rondelli D, et al. Severe hemolytic
anemia due to passenger lymphocytes after living-related bowel
transplant Clinical Transplantation 2004; 18, 3, 332335
25. Amirzargar A, Lessanpezeshki M, Fathi A, et al. TH1/TH2
cytokine analysis in Iranian renal transplant recipients. Transplant
Proc 2005; 37(7): 2985-7
26. Lessanpezeshki M, Amirzargar A, Fathi A, et al. Value of
pretransplantation cytokine profiles for predicting acute rejection in
renal transplant recipients. Transplant Proc 2005; 37(7): 2982-5

88

27. Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, et al. Interleukin-10

and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 2001; 19:683765
28. Gheorghe L, Gheorghe C. Transplantul hepatic: indicaii,
contraindicaii,
selecia
pacienilor,
evaluare
i
alegerea
momentului optim. Revista pentru Educaie Medical Continu
2002; 1: 107-114.
29. Ponce M, Berenguer M, Prieto M et al. Should we discard old
donors for hepatitis C candidates? The importance of donor
steatosis. Hepatology 2003: 38: 226A.
30. Han SH, Ofman J, Holt C et al. An efficacy and cost-effectiveness
analysis of combination hepatitis B immune globulin and lamivudine
to prevent recurrent hepatitis B after orthotopic liver
transplantation compared with hepatitis B immune globulin
monotherapy. Liver Transpl 2000; 6: 741-748.
31. Imperial JC, Keeffe EB. Liver transplantation in Handbook of
liver disease, second edition, edited by Lawrence S. Friedman,
Emmet B. Keeffe, Churchill-Livingstone, 2004; 401-415
32. Rao W, Wu X, Xiu D. Lamivudine or lamivudine combined with
hepatitis B immunoglobulin in prophylaxis of hepatitis B recurrence
after
liver
transplantation:
a
meta-analysis.
Transplant
International 2009; 22 (4): 387-395
33. Razonable RR. Cytomegalovirus infection after liver
transplantation:
current
concepts
and
challenges.
World
Gastroenterology 2008; 14(31):4849-60
34. Reinke P, Prosch S, Kern F. Mechanisms of human
cytomegalovirus (re)activation and its impact on organ transplant
patient. Transpl Infect Dis 1999; 1(3): 157-64
35. Adams AB, Williams MA, et al. Heterologous immunity provides
a potent barrier to transplantation tolerance. J Clin Invest 2003;
111(12): 1887-95

89

EVALUAREA IMUNOLOGIC N
TRANSPLANTUL MEDULAR
____________

____________

Ana Moise, Ileana Constantinescu

n prezent, transplantul autolog sau alogeneic de celule

stem hematopoietice ( TCSH ), reprezint o opiune
terapeutic binecunoscut, avnd un loc bine stabilit n
algoritmul de tratament al multor afeciuni: afeciuni
hematologice congenitale sau dobndite, tumori solide, boli
autoimune, amiloidoz, anomalii ereditare de metabolism [1].
90

Sursele de celule stem sunt reprezentate de mduv osoas,

snge periferic, snge din cordonul ombilical. Rezultatele
clinice obinute par s fie similare, indiferent de surs, iar
alegerea modalitii de recoltare depinde de vrsta
primitorului i/sau donatorului, indicaia de transplant,
preferina donatorului, experiena i dotarea centrului unde se
face transplantul.
Rezultatul unui TCSH depinde n mare msur de
urmtorii factori de risc: stadiul bolii, intervalul de timp scurs
de la diagnostic pna la momentul transplantului, vrsta
pacientului ( n general, se obin rezultate mai bune la copii
dect la aduli ), histocompatibilitatea donator-primitor,
combinaia de sex donator-receptor ( riscul de rejet este mai
mare dac donatorul este femeie iar primitorul brbat) . De
asemenea, exist un risc potenial de transmitere a unor boli,
de la donator la primitor, cum ar fi: infecii, boli congenitale,
boli autoimune, cancere [2].

Stabilirea compatibilitii HLA

Federaia European de Imunogenetic ( EFI ) este forul
european ce definete standardele n laboratoarele de
histocompatibilitate i stabilete criteriile minime privind
tipizarea HLA pentru TCSH de la donator nrudit sau
nenrudit.
Dar, dac n transplantul de organe solide, putem vorbi de
mismatch-uri HLA acceptabile situaia este complet diferit
n cazul transplantului de mduv osoas sau de celule stem.
Acest tip de transplant implic chiar celulele sistemului imun i
orice nepotrivire ntre donator i receptor, chiar i modificarea
unui singur aminoacid n situsul de recunoatere a antigenului,
poate determina fenomene grave de rejet, fie n sensul unei
boli gazd contra gref fie n sens invers ca boal de gref
contra gazd.

91

Determinarea unui potenial donator implic o apreciere

riguroas a disponibilitii i statusului de potrivire HLA a
membrilor familiei, i identificarea unui donator nenrudit
potrivit, dac nu exist donator nrudit disponibil. Deoarece
antigenele HLA determin un rspuns aloimun, potrivirea
HLA joac un rol preventiv critic n reducerea riscului de
afectare a grefei i de apariie a bolii de gref contra gazd.
Pe de alt parte, efectul de gref contra leucemie, asociat cu
mismatch-ul HLA, reprezint un mijloc imunologic de a reduce
riscul de recuren de boal la pacienii cu risc crescut.
Selecia donatorului nrudit
Cel mai adecvat donator este un frate potrivit din punct
de vedere al genotipului HLA.
Conform recomandrilor EFI este obligatorie tipizarea
imediat a HLA A, B, DRB1 la toi membrii familiei
disponibili. Iniial se poate face un screening prin tipizare
fenotipic dar ulterior, la perechile compatibile fenotipic,
tipizarea se definitiveaz prin metode de biologie molecular
de rezoluie nalt care permit descrierea alelelor HLA la nivel
de 4 digits.
Tipizarea ABDR poate confirma identitatea genotipic
pentru ntregul set de gene HLA ( potrivire 12/12 ). Din cauza
unui slab dezechilibru de legare ntre locusul DP i locii
DR/DQ, n 1 2% din cazuri, datorit recombinrilor pot apare
mismatch-uri DP ntre frai altfel identici. Probabilitatea ca un
frate s fie identic HLA este de 25%, n timp ce probabilitatea
unui frate haploidentic este de 50%.
Selecia donatorului nenrudit
Dac un frate, identic din punct de vedere al genotipului
HLA, nu este disponibil, transplantul cu celule stem
hematopoietice potrivite HLA A, B, C, DRB1/DQB1 de la un
donator nenrudit are aceleai rate de supravieuire fr boal,
mai ales pentru pacienii cu risc sczut, dar se asociaz cu o
frecven crescut a complicaiilor posttransplant [3,4].
92

Mismatch-urile alelice de obicei implic diferene n situsul de

legare al peptidului, ceea ce influeneaz recunoasterea
dependent de celulele T.
Standardul de aur este reprezentat de tipizarea cu
rezoluie nalt a locusurilor HLA A, B, DRB1, DQB1, DPB1.
Dac transplantul se face pentru o afeciune nemalign, nu
este necesar efectul de gref contra leucemie, mediat prin
incompatibilitatea DP, i potrivirea DPB1 poate fi luat n
considerare cnd sunt disponibili mai muli donatori
compatibili HLA A/B/C/DR/DQ (5).
Realizarea n siguran a transplanturilor de celule stem
de la donatori nenrudii se datoreaz, n mare parte,
progreselor obinute n domeniul imunogeneticii. La nceputul
anilor '90, stabilirea compatibilitii tisulare era stnjenit de
metodele de tipizare HLA de rezoluie slab ( metode
serologice ), n special pentru alelele HLA de clasa I. Studiile
recente, bazate pe metode de tipizare de rezoluie nalt
( metode moleculare ), au artat c potrivirea la nivel de alel
se asociaz cu rezultate mai bune oricare ar fi regimul de
condiionare, mieloablativ sau de intensitate redus [3].
Oricum, importana relativ a fiecrui locus n parte rmne o
problem discutabil. n timp ce efectul mismatch-urilor
A/B/C/DRB1 a fost bine documentat prin multiple studii
retrospective, rolul incompatibilitii DQ sau DP rmne
controversat. Date recente privind transplantul de celule stem
cu depleie de limfocite T, de la donator nenrudit, arat c
matching-ul HLA- DPB1 se asociaz cu risc crescut de recdere
independent de statusul de compatibilitate a celorlalte locusuri
[6].
Rezultate diferite au fost raportate i n studii ce implicau
pacieni de etnii diferite. n populaia japonez, mismatch-urile
A/B/C/DRB1 reprezint factor de risc semnificativ pentru
GVHD acut de gradul III sau IV, i numai diferenele A, B sau
DRB1 se asociaz cu mortalitate crescut [7]. Un alt studiu din
SUA arat c nepotrivirile HLA-A/B/C/DRB1, dar nu i

93

mismatch-urile DQ sau DP, se nsoesc de o scdere a ratei de

supravietuire [8].
n cazul potrivirii alelice HLA n proporie de 80-90%, n
completarea tipizrii HLA de nalt rezoluie se efectueaz i
testul crossmatch. n cazul n care testul crossmatch este
pozitiv, acest fapt nu reprezint o contraindicaie absolut
pentru transplantul medular, dar regimul imunosupresor
trebuie reconfigurat n totalitate.
n concluzie, toate aceste aspecte legate de potrivirea sau
nepotrivirea alelelor HLA, trebuie luate n considerare, n
funcie i de particularitile clinico-biologice ale cazului care
urmeaz a fi transplantat medular.

Selectia donatorului din banca de snge din cordonul

ombilical
n general, n acest caz se face tipizare HLA-A/B cu
rezoluie joas i tipizare HLA-DRB1 cu rezolutie nalt i
matching-ul se stabilete la acest nivel, deoarece se pare c
incompatibilitile HLA sunt mai puin duntoare i cel mai
important
parametru,
de
care
depinde
rezultatul
transplantului, este cantitatea de celule stem coninut de
unitatea de snge recoltat [9].
Aprecierea probabilitii de a gsi un donator nenrudit
Identificarea unui donator nenrudit potrivit la nivel de
alele HLA, este un proces mare consumator de timp i bani. Pe
baza noilor cunotiine privind frecvena alelelor i
haplotipurilor n populaii diferite, se apreciaz c urmtorii
parametri au un impact negativ (10):
prezena unor alele rare la pacient ( B*4405 );
un haplotip HLA-ABDR care nu se numr printre cele 10
mai frecvente haplotipuri la populaia caucazoid;
asocieri B-DR neobinuite ( ex. B65-DRB1*0101 );
94

 asocieri DR-DQ neobinuite ( ex. DRB1*1501-DQB1*0603

);
prezena alelelor B*2705, B18, B*4402, B*4403, B51 ce
se nsoesc de un risc crescut de mismatch HLA-C;
primitor i donator de etnii diferite;
n concluzie: Sistemul HLA, cu circa 100 de specificiti
definite serologic i peste 2500 de alele, reprezint o barier
major n transplantul de celule stem hematopoetice.
Consensul actual este c, selectarea donatorilor nenrudii pe
baza genotiprii HLA prin metode moleculare de rezoluie
nalt se nsoete de cele mai bune rezultate.
Dac sunt disponibili mai muli donatori HLA identici, se
recomand alegerea unui brbat, ABO identic i/sau CMV
negativ.
Oricum, importana fiecrui locus individual rmne nc o
problem deschis, ce necesit o definire mai clar i, n acest
sens, o contribuie important vor avea studiile multicentrice.
De asemenea, mai rmne de stabilit care este rolul pe care l
joac ali factori imunogenetici care pot fi implicai, cum ar fi:
antigenele sistemului minor de compatibilitate, genele
citokinelor i chemokinelor, genele KIR.

Genele KIR i transplantul de celule stem hematopoetice

Receptorii KIR (Killer cell immunoglobulin-like receptors)
sunt molecule care fac parte din familia imunoglobulinelor i
care se gsesc pe suprafaa celulelor NK. Locusul genelor KIR
se afl pe cromozomul 19 i face parte dintr-un complex mai
mare numit Complexul Receptorului Leucocitar (leukocyte
receptor complex LRC). Din punct de vedere structural,
receptorul KIR este constituit dintr-o poriune extracelular, cu
2 sau 3 domenii imunoglobulinice (2D sau 3D), i o poriune
intracelular, lung sau scurt, L (long) i S (short). KIR-urile
cu domeniul intracelular lung au o aciune inhibitoare asupra
95

celulelor NK, pe cnd cele cu domeniul intracelular scurt

transmit semnale activatoare.
Prin interaciunea izotipurilor inhibitoare cu anumite
molecule HLA de clasa I, celulele sntoase sunt protejate de
aciunea citolitic a celulelor NK.
Astfel, receptorii KIR par joace un rol semnificativ n
controlul rspunsului imun, ceea ce explic asocierile
observate ntre anumite gene KIR i boli autoimune (artrita
reumatoid), psoriazis, progresia infeciei HIV [11, 12,13].
KIR 2DL1 au ca ligand alelele HLA-C de grup 2,
caracterizate prin prezena resturilor de lizin n poziia 80 i
asparagin n poziia 77 (Cw2, Cw4, Cw5, Cw6), pe cnd KIR
2DL2 si 2DL3 recunosc alelele HLA-C de grup 1, cu
asparagin n poziia 80 si serin n poziia 77 (Cw1, Cw3,
Cw7, Cw8). KIR 3DL1 este receptor pentru alelele HLA-Bw4.
Deoarece sunt localizate pe cromozomi diferii, genele
receptorilor KIR i liganzilor se transmit independent
descendenilor. Genotipul HLA clasa I determin n final ce
repertoriu de receptori KIR va fi exprimat pe suprafaa
celulelor NK, astfel nct fiecare celul NK funcional s
exprime cel puin un receptor KIR inhibitor pentru antigenele
HLA proprii. Coexpresia a dou sau mai multe KIR-uri
inhibitoare este mult mai rar [14].
Celulele NK care exprim receptori KIR pentru propriul
HLA de clasa I, dac ntlnesc celule cu un alt fenotip HLA
(aa cum se poate ntmpla n cazul unui alotransplant ),
sesizeaz lipsa ligandului specific i mediaz alloreaciile
(missing self recognition) [15].
Aceste mismatch-uri KIR - ligand apar deseori in
transplantul cu donator haploidentic. Cnd alloreactivitatea NK
se exercit n direcia donor versus- primitor pare s aibe un
rol crucial n mbuntirea rezultatelor posttransplant
haploidentic i se asociaz cu [16]:

96

 rat de recdere de boal, semnificativ mai mic;

rat de supravieuire fr evenimente mai bun, att la
pacienii transplantai n perioada de remisiune ct i la
cei cu recdere de boal;
reducerea riscului global de recdere sau deces;
n ceea ce privete receptorii KIR activatori, liganzii lor
specifici nu sunt pe deplin cunoscui. Se pare c exist o
interaciune slab ntre KIR2DS1 i moleculele HLA-C Lys80 i
ntre KIR2DS2 i moleculele HLA-C Asn80. Spre deosebire de
KIR-urile inhibitorii, cele activatoare prezint o mare varietate
i heterogenitate n populaia general i n diverse grupuri
etnice.
Circa 25% din caucazieni, care sunt homozigoi pentru
aa-numitul haplotip A, nu posed receptori KIR activatori,
restul, homo- sau heterozigoi pentru haplotipul B, prezint
gene inhibitorii i variate combinaii de gene activatoare.
n cazul unui transplant de la donator cu NK aloreactive,
prezena haplotipului B la donator se asociaz cu scderea
incidenei mortalitii legate de transplant, mortalitate
datorat n special infeciilor.
Receptorii KIR activatori stimuleaz secreia de citokine
i citotoxicitatea celulelor NK mpotriva celulelor infectate, n
contextul absenei selfului, i de asemenea pot controla infecia
printr-un mecanism indirect rezultat din interaciunea celulelor
NK cu celulele dendritice. In vivo, aceast interaciune
conduce la o cretere a raportului Th1/Th2 [17,18].
n concluzie, creterea numrului de transplante de celule
stem hematopoetice cu mismatch HLA este fezabil n prezent,
n condiiile unei nelegeri ct mai complete a mismatch-urilor
permise i a rolului genelor KIR.

97

Imunogenetica non-HLA i transplantul de celule stem hematopoetice

Dei tipizarea HLA rmne elementul central n selecia
donatorilor i este un factor determinant major n ce privete
rezultatele obinute posttransplant, secvenierea genomului
uman a relevat existena a mii de polimorfisme genice (single
nucleotide polymorphisms) a cror semnificaie i importan
n ce privete transplantul autolog rmne nc a fi elucidat.
Polimorfismul genelor citokinelor
Multe din polimorfismele genelor citokine apar in
regiunea reglatoare a genei i astfel este influenat cantitatea
de citokine produs ca rspuns la un stimul infecios sau
allogeneic.
Studiile iniiale s-au fcut n transplantul de organe solide
i s-a demonstrat c pacienii cu genotip high-secretor de
TNF- i low-secretor de IL-10 prezint risc mai mare de rejet
al grefei. Ulterior studiile au fost extinse i n transplantul de
CSH.
GVHD acuta este rezultatul eliberrii de citokine
proinflamatorii (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-) n timpul furtunii de
citokine consecutiv radioterapiei i chimioterapiei din
regimul de condiionare. La aceasta se adaug i activarea
limfocitelor T
i NK ale donatorului, activare urmat de
secreia predominant de citokine de tip Th1 (IL-2, IFN-, TNF ).
Citokinele inflamatorii sunt de asemenea implicate n
patogenia pneumoniei interstiiale, bolii venoocluzive, n
susceptibilitatea
la
infecii
sau
n
metabolismul
medicamentelor.
Un studiu japonez, facut pe pacieni
donatori potrivii, nenrudii, a artat
polimorfismul TNF-863 si 857 la donator
inciden mai mare a GVHD grad III-IV i
98

transplantai de la
o asociere ntre
i/sau primitor i o
o rat mai mic de

recdere de boal [19]. Polimorfismele TNF- (-308) si TNF (+1069) s-au asociat cu complicaii toxice [20].
Polimorfismele IL-10 -1082 i -592 determin apariia a
trei posibile haplotipuri care sunt low-, intermediate- sau highsecretoare de IL-10. Haplotipul low-secretor la primitor se
asociaz cu GVHD sever la pacienii tratai numai cu
Ciclosporin sau
Ciclosporin cu Methotrexat
i cu
supravieuire mai mic [21].
Polimorfismul IL-6 -174G/G la primitor se asociaz cu
GVHD acut i cronic.
Polimorfismul IL-1 -889 la donator sau la primitor se
asociaz cu mbuntirea ratei de supravieuire i reducerea
mortalitii legate de transplant [22].
Antigenele minore de histocompatibilitate
GVHD care apare dup un transplant de la frate HLA
identic este iniiat de limfocitele T care recunosc antigene
minore de histocompatibilitate ( peptide derivate din proteinele
intracelulare, codate de gene de pe cromozomi autozomali sau
de pe cromozomul Y ). Unele antigene (ex: HA-1, HA-2) se
gsesc numai pe celulele sistemului hematopoietic, iar altele
(ex: H-Y, HA-3) sunt exprimate ubicuitar pe esuturile normale.
Cele codate de gene de pe cromozomul Y sunt implicate n
transplantul cu mismatch de sex. Nepotrivirile ntre donator i
primitor pentru HA-1, HA-2, HA-4, HA-5 se asociaz cu
creterea incidenei GVHD [23].
Alte
gene
implicate
n
apariia
complicaiilor
posttransplant (GVHD, episoade infecioase) includ familia
supergenelor receptorilor hormonilor steroidieni (printre care
receptorul pentru estrogen i receptorul pentru vitamina D),
genele care regleaz rspunsul gazdei la microorganisme
(mieloperoxidaza, receptorul Fc),
genele TLRs (Toll-like
receptors care activeaz celulele prezentatoare de antigen),
genele NOD (nucleotide-binding oligomerisation domain) [2426].
99

Incompatibilitatea ABO i suportul transfuzional

Aproximativ 15 25% din perechile primitor donator
frate HLA-identic, sunt incompatibile ABO. n transplantul
mieloablativ, incompatibilitatea ABO se asociaz cu risc crescut
de ntrziere n grefarea celulelor roii, aplazie eritrocitar
pur, hemoliz. Mismatch-ul ABO nu afecteaz grefarea
neutrofilelor, incidena rejetului de gref, progresia bolii sau
supravieuirea global [27].

Posttransplant
transfuzional:

se

adopt

urmtoarea

politic

pentru incompatibilitate ABO major (ex. primitor grup 0donator grup A) se utilizeaz mas eritrocitar de grup 0,
indiferent de grupul sanguin al donatorului sau
receptorului, pn cnd anticorpii ABO-specifici ai
primitorului sunt nedetectabili i testul antiglobulinic este
negativ;
pentru incompatibilitate ABO minor (ex. primitor grup Adonator grup 0) se utilizeaz mas eritrocitar de grupul
donatorului;
pentru incompatibilitate ABO major i minor (ex.
primitor grup B-donator grup A) se utilizeaz mas
eritrocitar de grup 0, pn cnd anticorpii ABO-specifici
ai primitorului sunt nedetectabili i testul antiglobulinic
este negativ i apoi se trece la grupul donatorului;

Reconstituirea sistemului imun dup transplantul de celule stem

hematopoetice
100

Transplantul de celule stem ofer un model unic de

reconstituire imun gradual i ilustreaz perfect relaia dintre
tipul imunodeficienei i infeciile cu anumii patogeni [28].
Imediat dup regimul de condiionare apare o faz de
aplazie pn la regenerarea neutrofilelor de la donator. n
aceast faz exist un risc foarte mare pentru infecii
bacteriene, fungice (aspergiloz), virale (n special cu HSV).
A doua etap, primele 3-4 luni, se caracterizeaz prin
refacerea celulelor rspunsului imun nscut (granulocite,
monocite, macrofage celule NK) i printr-o deficien a
imunitii celulare. Infecia CMV, datorat n special
reactivrii, reprezint cea mai mare problem n aceast faz
i,
mai
puin
frecvent
apar
infecii
cu
virusuri
respiratorii/enterice sau adenovirusuri.
n a treia etap, dup 4 luni, majoritatea pacienilor
prezint o deficien a imunoglobulinelor, n special IgG2.
Regenerarea limfocitelor B, CD19+ se realizeaz, de obicei, n
decursul primului an posttransplant. Primitorii de transplant
alogeneic sunt n mod particular vulnerabili la infecii cu
bacterii ncapsulate (S. Pneumoniae, H. Influenzae).

BIBLIOGRAFIE
1. Ljungman P, Urbano-Ispizua A, Cavazzana-Calvo M, et al.
Allogeneic and autologous transplantation for haematological
disease, solid tumors and immune disorders: Definitions and
current practice in Europe. Bone Marrow Transplant 2006; 37:
439-449
2. Niederweiser D, Gentilini C, Hegenbart U, et al. Transmission of
donor illness bz stem cell transplantation: should screening be
different in older donors? Bone Marrow Transplant 2004; 34: 657665
3. Petersdorf EW. Risk assessment in hematopoietic stem cell
transplantation. Best Pract Res Clin Haematol 2007; 20: 155-170

101

4. Hurley CK, Wagner JE, Setterholm MI, Confer DL. Advances in

HLA: Practical implications for selecting adult donors and cord
blood units. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: (1 Suppl 1):
28-33
5. Tiercy JM. The rol of HLA in HSCT. The EBMT Handbook, 5th
edition 2008; 46-92
6. Shaw BE, Marsh SG, Mayor NP, et al. HLA- DPB1 matching status
has significant implications for recipients of unrelated donor stem
cell transplants. Blood 2006; 107: 1220-1226
7. Morishima Y, Sasazuki T, Inoko H, et al. The clinical significance
of HLA allele compatibility in patients receiving a marrow
transplant from serologically HLA-A, B, DR matched unrelated
donors. Blood 2002; 99: 4200-4206
8. Flomenberg N, Baxter-Lowe LA, Confer D, et al. Impact of HLA
class I and class II high resolution matching on outcomes of
unrelated donor bone marrow transplantation. Blood 2004; 104:
1923-1930
9. Gluckman E, Rocha V. Donor selection for unrelated cord blood
transplants. Curr Op Immunol 2006; 18: 565-570
10. Tiercy JM, Bujan-Lose M, Chapuis B, et al. Bone marrow
transplantation with unrelated donors: What is the probability of
identifying an HLA-A/B/C/w/DRB1/B3/B5/DQB1- matched donor?
Bone Marrow Transpl 200; 26: 437-441
11. Warrington KJ, Takemura S, Goronzy JJ, Weyand CM.
CD4+,CD28- T cells in rheumatoid
arthritis patients combine
features of the innate and adaptive immune systems. Arthritis
Rheum 44:13; 2001.
12. Martin MP, Nelson G, Lee JH, Pellett F, et al. Susceptibility to
Psoriatic Arthritis: Influence of Activating Killer Ig-Like Receptor
Genes in the Absence of Specific HLA- C Alleles. J Immunol
169:2818; 2002.
13. Martin MP, Gao X, Lee JH, Nelson GW, Detels R, Goedert JJ,
Buchbinder S, Hoots K, Vlahov
D, Trowsdale J, et al. Epistatic
interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to
AIDS, Nat Genet 31:429; 2002.

102

14. Yawata M, Yawata N, Draghi M, et al. Roles for HLA and KIR
polymorphisms in natural killer repertoire selection and modulation
of effector function. J Exp Med 2006; 203: 633-645
15. Ruggeri L, Aversa F, Martelli MF, Velardi A. Haploidentical
transplantation and NK cells recognition of missing self. Immunol
Rev 2006; 214: 202-218
16. Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor NK cell
allorecognition of missing self in haploidenrical haematopoietic
transplantation for acute myeloid leukemia. Challenging its
predictive value. Blood 2007; 110: 433-440
17. Smith HRC, Heusel JW, Mehta IK, et al. Recognition of a virusencoded ligand by a natural killer cell activation receptor. Proc Natl
Acad Sci USA 2002; 99: 8826-8831
18. Degli Esposti MA, Smyth MJ. Close encounters of different kinds:
Dendritic cells and NK cells take centre stage. Nature Reviews
Immunology 2005; 5: 112-124
19. Ishikawa Y, Kashiwase K, Akaza T, et al. polymorphisms in TNFA
and TNFR2 affect outcomes of unrelated bone marrow
transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29: 569-575
20. Mullighan CG, Bardy PG. Advance in the genomics of allogeneic
haematopoietic stem cell transplantation. Drug Development
Research 2004; 62: 273-292
21. Lin MT, Storer B, Martin PJ, et al. Relation of an IL-10 promoter
polymorphism to GVHD and survival after haematopoietic -cell
transplantation. N Engl J Med 2003; 349: 2201-2210
22. Cullup H, Stark G. IL-1 polymorphism and GVHD. Leuk
Lymphoma 2005; 46: 517-523
23. Goulmy E. Human minor histocompatibility antigens. Curr Opin
Immunol 1996; 8:75-81
24. Middleton PG, Cullup H, Dickinson AM, et al. Vitamin D receptor
gene polymorphism associates with GVHD and survival in HLAmatched sibling allogeneic bone marrow transplantation. Bone
Marrow Transplant 2002; 30:223-228
25. Napolitani G, Rinaldi A, Bertoni F, et al. Selected Toll-like
receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type

103

1-polarizing program in dendritic cells. Nature Immunology 2005; 6:

769-776
26. Holler E, Rogler G, Brenmoehl J, et al. Prognostic significance of
NOD2/CARD15 variants in HLA-identical sibling haematopoietic
stem cell transplantation: Effect on long term outcome is confirmed
in 2 independent cohorts and may be modulated by the type of
gastrointestinal decontamination. Blood 2006; 107: 4189-4193
27. Helbig G, Stella-Holowiecka B, Woinar J, et al. Pure red cell
apasia following major and bidirectional ABO-incompatible
allogeneic stem cell transplantation: Recovery donor-derived
erythropoiesis after long-term treatment using different therapeutic
strategies. Ann Hematol 2007
28. Toubert A. Immune reconstitution after allogeneic HSCT. The
EBMT Handbook, 5th edition 2008; 297-316

104

Glosar de termeni - Imunologia transplantului

Alel: variant a unei gene ntr-un locus genetic particular.
Cele dou alele, de pe cei doi cromozomi omologi, pot fi
identice, i individul este homozigot sau diferite i el este
heterozigot.
Alogref: este tipul cel mai rspandit de gref i se refer la
situaia n care un organ se transplanteaz unui individ
aparinnd aceleiai specii, dar diferit genetic.
Aloreactivitate: descrie stimularea celulelor T de ctre
moleculele MHC, altele dect cele proprii; marcheaz
recunoaterea moleculelor MHC alogenice. Astfel de
rspunsuri sunt numite aloreacii.
Anticorp: este o protein care se leag specific la o substan
particular, antigenul corespunztor. Fiecare molecul de
anticorp are o structur unic care i permite s se lege
specific la antigenul su corespunztor, dar toi anticorpii au
aceei structur i sunt cunoscui ca imunoglobuline sau Ig-uri.
Anticorpii sunt produi de celulele plasmatice ca rspuns fa
de
infecie
sau
imunizare,
legndu-se
la
patogeni,
neutralizndu-i i i pregtete pentru distrugere de ctre
fagocite.
Anticorpi citotoxici: anticorpi anti-HLA
Antigen: orice molecul care se leag specific de un anticorp.
Numele lor provine de la abilitatea acestora de a genera
anticorpi. Nu toate antigenele sunt capabile s stimuleze

105

producia de anticorpi; antigenele care induc producia de

anticorpi sunt denumite imunogene.
ASHI: Societatea
Imunogenetic.

American

de

Histocompatibilitate

Autogref: cnd un organ se transplanteaz aceluiai individ,

dar n alt parte a organismului.
CD: Clusters of diferentiation, sunt grupuri de anticorpi
monoclonali care identific aceeai molecul de la suprafaa
celular. Molecula de la suprafaa celulei este desemnat CD
urmat de un numar (de exemplu: CD1, CD2 etc).
Celulele prezentatoare de antigen: sunt celule nalt
specializate care pot procesa antigene ale cror fragmente
peptidice le proiecteaz pe suprafaa celular mpreun cu
moleculele necesare activrii celulelor T. Principalele celule
prezentatoare de antigen pentru celulele T sunt celulele
dendritice, macrofagele i celulele B.
Celulele T CD4 (helper): aceste celule ajut celulele B
pentru a produce anticorpi ca rspuns la stimularea antigenic.
Cele mai eficiente celule T helper sunt cunoscute ca celule
TH2, care produc citokinele IL4 i IL5. Celulele CD4 sunt
importante pentru recunoaterea peptidelor antigenice legate
la moleculele MHC de clasa aII-a. Acioneaz ca i co-receptori
prin legarea la partea lateral a moleculelor MHC de clasa aIIa.
Celulele T CD8: sunt celule T care poart co-receptorul CD8.
Aceste celule recunosc antigenele, de exemplu antigenele
virale, care sunt sintetizate n citoplasma celulei. Peptidele
derivate din aceste antigene sunt transportate de ctre TAP,
asamblate cu molecule MHC de clasa I n reticulul
endoplasmatic i expuse ca complexe peptide MHC de clasa I
pe suprafaa celular. Celulele T CD8 se difereniaz n celule
T CD8 citotoxice.
Centimorgan: unitate de msur a distanei dintre dou
locusuri n linkage, stabilit prin frecvena recombinrilor ntre

106

locusuri. Este egal cu o frecven de recombinare de 1% ntre

locusuri. Are simbolul cM. Unitate de recombinare.
Centromer: punct de unire a cromatidelor. La om secvenele
centromerice sunt diferite.
Chimera: coexistena la nivelul unui singur individ sau la
nivelul esuturilor sau celulelor a dou genotipuri diferite. De
exemplu, primitorul unui transplant de maduv de la un individ
genetic diferit are celulele sanguine de origine ale donatorului
ca i celulele autologe. Termenul provine din mitologia greac,
reflectnd un monstru cu un cap de leu, un corp de capr i
coada unui dragon.
Citokine: polipetide secretate care afecteaz funcia altor
celule. Citokinele sunt importante pentru interaciunile
celulare din cadrul rspunsului imun. Citokinele produse de
fagocitele mononucleare se numesc monokine; cele produse de
limfocite se numesc limfokine.
Cod genetic: triplete de baze din ADN i ARN care poart
informaia genetic, necesar sintezei proteinelor. Este un
veritabil dicionar care permite trecerea de la un grup de 3
nucleotide (triplet sau codon) la un aminoacid specific.
Codon: secvene a trei nucleotide mARN, care codific un
aminoacid specific.
Codon ambiguu: care codific mai muli aminoacizi cu sens
greit (missens)i care n urma unei mutaii devine un codon
terminator al sintezei lanului polipeptidic.
Codon iniiator: unul dintre cei 2 codoni AUG sau GUG care
marcheaz nceputul sintezei proteice.
Codoni sinonimi: care codific acelai aminoacid.
Codoni terminatori: care anun terminarea sintezei
proteinelor. Cnd ribozomii ajung n dreptul lor, sinteza se
oprete i lanul polipeptidic este eliminat.
Conversie genic: nlocuire a materialului genetic de pe un
sit particular al unei cromatide, de ctre materialul genetic
situat pe un punct exact corespunztor, de pe o cromatid ne107

sor; este o form particular de recombinare, care explic

apariia unor anomalii de segregri.
CREGs: Cross reactive groups (grupuri care reacioneaz
ncruciat) epitopi publici
care sunt responsabili pentru
crossreactivitatea serologic bine cunoscut care este
observat ntre aloantiserurile HLA. Modelul crossreactivitii
serologice a antiserurilor HLA au fost utilizate pentru a
categorisi genele HLA de clasa I n grupuri majore
crossreactive sau CREGs. Baza molecular a crossreactivitii
serologice este existena concomitent, difereniat a
epitopilor publici la nivelul mai multor gene HLA.
Cromatin: complexul de ADN, histone, proteine nehistonice
i puin ARN care compune cromozomul.
Cromozom: purttorul informaiei genetice.
Crossing-over: ncruciare, schimb de material genetic ntre
cromatidele cromozomilor omologi.
Crossmatch: test care evideniaz anticorpi direcionai fa
de antigenele HLA prezente la nivelul limfocitelor T ale
donatorului (clasa I) sau la nivelul limfocitelor B ale
donatorului (clasa a II-a) implicate n rspunsul imun; prin
acest test se previne fenomenul de rejet n transplantul renal.
EFI: Federaia European de Imunogenetic
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, este un test
serologic n care un antigen sau un anticorp legat este detectat
utiliznd anticorpi cuplai cu o enzim care convertete un
substrat incolor ntr-un produs colorat. Testul ELISA este larg
folosit n biologie i medicina ca i n imunologie.
Epitop: determinant antigenic definit
Epitop privat: iniial, un epitop privat a fost considerat a fi
unic la nivelul unui singur produs genetic alelic. Astzi prin
epitop privat nelegem epitopii care se afl la nivelul unui
grup limitat sau familii de alele strns nrudite, cum sunt
alelele A2 (A*0201-0229), sau alelele B39 (B*39 01011-*3915).
Epitop de grup este un termen i mai adecvat pentru a descrie

108

acest tip de epitop i poate fi interschimbat cu termenul de

privat.
.
Epitopi publici: exist concomitent, difereniat ntre
conglomeratele de gene HLA care n mod normal aparin la
grupuri diferite de gene, strns nrudite, de exemplu, existena
concomitent a epitopului public ntre A2 i moleculele B57
sau 58.
Exon: secven de nucleotide care codific o secven de
aminoacizi specifici. n medie, ei sunt constituii din 100-300
de nucleotide. O gen este, astfel constituit din mai muli
exoni separai prin introni, iar fiecare exon poate fi considerat
un modul al unei proteine.
Expresie genic: manifestare fenotipic a unei gene specifice;
este condiionat de natura genei, dominant sau recesiv, de
interaciunea cu alte gene, condiiile de mediu, penetran i
expresivitate.
Fenotip: caracteristicile detectate ale unei celule sau
organism; rezult din interaciunile genotipului cu mediul.
Gen: informaia nucleotid care asigur sinteza unei secvene
de aminoacizi i care ocup un locus specific.
Genom: set haploid de cromozomi. Totalitate a variantelor
genetice de pe un locus dat. Dac pe un locus se gsesc n
alele, atunci pot exista n homozigoi i n(n-1)/2 heterozigoi.
Numrul total al genotipurilor de pe acelai locus este egal cu
n(n+1)/2. Genomul uman conine 6,4 x 10-10 g ADN,
echivalentul a 5800 de milioane de baze, n timp ce al
Escherichia Coli are numai 4 milioane. Nucleul diploid uman
include 6 milioane de gene.
Genotip: constituia genetic a unui organism.
Haplotip: setul de alele HLA gsit pe un cromozom.
Histocompatibilitate: identitate la nivelul moleculelor de
histocompatibilitate de clasa I i clasa a II-a. Termenul este
folosit n sens operaional nsemnnd similaritate suficient
109

ntre moleculele HLA ale donatorului i primitorului, n

transplantul de organe.
HLA: antigene leucocitare
histocompatibilitate.

umane

sau

leucocite

de

Imunogenetic:
ramura
a
geneticii
care
studiaz
complexitatea proceselor ce asigur aprarea i integritatea
organismului, n ipoteza n care n organism ptrund antigene
strine; controlul genetic al imunoglobulinelor, deficienele
condiionate genetic, rspunsul imun, imunitatea celular etc,
variabilitatea genelor implicate n acest proces (ABO, Rh,
HLA) precum i tulburrile autoimune; imunogenetica a
descoperit complexul major de histocompatibilitate, a reuit s
cartografieze regiunea cromozomial 6 pe care este situat
acest
sistem,
a
elucidat
structura
anticorpilor
(imunoglobulinelor), a explicat fenomenele de compatibilitate
i incompatibilitate, a precizat existena asociaiilor dintre
genele sistemului HLA i diverse tulburri.
Interleukinele: sunt citokine secretate n principal de celulele
mononucleare (limfocitele i fagocitele mononucleare) care
induc creterea i diferenierea limfocitelor i a celulelor stem
hematopoietice pluripotente.
Intron: secven de 100-1000 nucleotide situat n afara sau n
interiorul genei care separ exonii (secvenele de nucleotide
ADN care sunt transcrise) i sunt prezente n mARN. Toi
intronii studiai pn acum ncep cu secvene GT i se termin
cu secvenele AG. Uneori, secvenele de nceput i de sfrit se
repet de numeroase ori. Intronii coordoneaz sinteza
proteinelor i diminueaz frecvena mutaiilor survenite n
cursul recombinrii.
Izogref: cnd un organ se transplanteaz ntre indivizi ai
aceleiai specii, cu configuraie antigenic identic (gemeni
monozigoi).
Linkage: asociere a dou sau mai multe gene nealele n aa fel
nct se transmit ca o singur unitate dac nu intervine
fenomenul de crossing-over.

110

Linkage disequilibrium : legtur dezechilibrat tendin a

unor alele situate pe locusuri diferite de a aprea mpreun pe
acelai cromozom sau haplotip, ntr-o secven mai mare dect
cea ateptat teoretic.
MHC: complexul major de histocompatibilitate: regiune
cromozomial format din locusurile care au rol fundamental
n procesele imune. La om MHC este sistemul HLA, omolog cu
complexul H2, la oarece.
Microarray: tehnologie cu microcipuri, care are ca principiu
de baz hibridizarea complementar a secvenelor simplu
spiralate ale acizilor nucleici. n genetica cancerului, ADN
microarray este creat prin plasarea diferitelor ADN-uri pe un
mic fragment al unui microcip, folosindu-le apoi, pentru a
evalua expresia ARN n celulele normale sau maligne.
Mutaie: modificare permanent i transmisibil a structurii i
implicit a funciei unei gene. De obicei, termenul de mutaie se
refer la o singur gen. Prin lrgirea conceptului, n categoria
mutaiilor au fost incluse modificrile numerice i structurale
ale cromozomilor, precum i modificrile numerice ale
genomului (poliploidia).
Neopterina: pteridin seric secretat de macrofag; valorile
serice crescute ale neopterinei reprezint expresia activrii
rspunsului imun celular.
Polimorfism: nseamn existena ntr-o varietate de forme
diferite. Polimorfismul genetic este variabilitatea de la nivelul
locusului genei n care se produc variante genice la o frecven
mai mare de 1%. Complexul major de histocompatibilitate
(MHC) este cel mai polimorf conglomerat de gene cunoscut la
om.
Prezentarea antigenic: descrie antigenul ca fragmente
peptidice legate la moleculele MHC pe suprafaa unei celule.
Celulele T recunosc antigenul cnd este prezentat n acest fel.
Procesarea antigenic: este degradarea proteinelor n
peptide care se pot lega la moleculele MHC pentru prezentare
la celulele T. Toate antigenele, cu excepia peptidelor, trebuie
111

s fie procesate n peptide nainte de a putea fi prezentate de

ctre moleculele MHC.
Rejetul grefei: reacie imunologic direcionat fa de
moleculele de histocompatibilitate din gref care conduce la
eliminarea sau rejetul grefei.
RT-PCR: reacie de amplificare genic folosit pentru a
amplifica secvenele ARN. Enzima revers-transcriptaza (RT)
este folosit pentru a converti secvena ARN ntr-o secven de
ADN complementar (cADN), care este apoi amplificat prin
PCR.
Segregare: separare a cromozomilor omologi n meioz,
implicit, separarea i migrarea n gamei diferii a celor 2
membri ai oricrei perechi de alele. n acest fel se disociaz i
caracterele materne i paterne. Este prima lege a lui Mendel,
legea segregrii genelor.
Sistemul complement: este un set de proteine plasmatice
care reacioneaz mpreun pentru a ataca formele
extracelulare ale patogenilor.
Sistemul grupelor sanguine ABO: antigene care sunt
exprimate pe eritocite. Ele sunt folosite pentru tipizarea
sngelui uman pentru transfuzii. Indivizii care nu exprim
antigenele A sau B pe eritrocitele lor, n mod natural formeaz
anticorpi care interacioneaz cu acestea.
Sit: pozitie, localizare; 1. Cea mai mic unitate a unei gene
care poate suferi o mutaie. 2. Secven de nucleotide
recunoscut specific de anumite proteine.
Tapasin (TAP associated protein): este o molecul cheie n
asamblarea moleculelor MHC de clasa I; o celul deficient n
aceast protein are numai molecule MHC de clasa I instabile
pe suprafaa celular. TAP1 i TAP2 (transporters associated
with antigen processing) sunt proteine caset care leag
ATP, implicate n transportul peptidelor scurte din citosol n
lumenul reticulului endoplasmatic, unde se asocieaz cu
moleculele MHC de clasa I.

112

TCR (T-cell receptor): receptorul celulei T este al lanurilor

nalt variabile i heterodimer legate disulfidic, exprimate de
membrana celular ca un complex cu lanurile CD3
permanente. Celulele T care poart acest tip de receptor
frecvent denumite celule T .
Telomer:
cromomer
terminal
situat
la
extremitile
cromozomilor care au rolul de a mpiedica fuziunea
cromozomilor intaci.
Xenogrefa: este transplantul de organe ntre specii diferite
(de exemplu: de la porc sau de la babuin la om).

113

114