TEODOR VAIDA

DIAGNOSTICUL
MICROBIOLOGIC
I
IMUNOLOGIC
N
LABORATORUL CLINIC

1. PRINCIPII I TEHNICI DE DIAGNOSTIC N

LABORATORUL CLINIC
1.1. STERILIZAREA I DEZINFECIA
Cele mai multe tehnici bacteriologice nu pot fi aplicate fr certitudinea
c se lucreaz n condiii de asepsie riguroas, cu instrumente i medii
de cultur ce nu conin nici un fel de microorganisme viabile.
Sterilizarea este operaiunea prin care se realizeaz distrugerea
complet a tuturor microorganismelor vii de pe suprafaa i din interiorul
unor obiecte.
Dezinfecia este procedeul prin care se distrug doar unele
microorganisme, mai ales cele patogene, n principal, prin metode
chimice.
Alegerea procedeelor de sterilizare este n funcie de:
- natura obiectelor sau substanelor de sterilizare;
- sensibilitatea microorganismelor fa de aciunea unor factori de mediu
extern.
Metodele mai importante sunt cele de sterilizare prin:
- cldur;
- filtrare;
- radiaii.

1.1.1.

Sterilizarea prin cldur

Metodele de sterilizare prin cldur se bazeaz fie pe utilizarea cldurii

uscate, fie pe cea a cldurii umede.
Materialele ce urmeaz a fi sterilizate vor fi pregtite dup curire,
splare i uscare n scopul de a se menine sterile un anumit timp.
Pentru aceasta, unele obiecte (pipete, plci Petri, plnii, mojare etc.) vor
fi mpachetate n hrtie, iar altele (eprubete, baloane etc.) vor fi
prevzute cu dop de vat (fig. 1 - 4).

~2~

~3~

1.1.1.1. Sterilizarea prin cldur uscat

nclzirea la incandescen i flambarea
Se realizeaz prin dou metode importante:
- nclzirea i flambarea direct, care const n meninerea unui obiect n
flacra unui bec Bunsen, pn cnd este adus la rou (sterilizarea ansei
bacteriologice fig. 5). Pentru alte obiecte (pipete, orificiul baloanelor i
al eprubetelor) se practic trecerea prin flacr de 3 4 ori a acestora
sau prile amintite.

Fig. 5

- Flambarea n alcool (fig. 6) permite realizarea unei sterilizri rapide a

unor obiecte contaminate.

Fig. 6

Sterilizarea cu aer supranclzit n cuptorul Pasteur, Poupinel, etuve

etc. (fig. 7).
~4~

Toate tipurile de aparate de acest gen sunt prevzute cu un sistem de

reglare a temperaturii interioare la 180C, necesara pentru sterilizare,
timp de o or, asigurndu-se astfel carbonizarea tuturor
microorganismelor.
Metoda se aplic pentru sterilizarea unor obiecte de sticl si porelan. Nu
se sterilizeaz astfel obiectele cu armtur metalic (seringi, de
exemplu), cele din cauciuc, plastic si nici lichidele. Controlul sterilizrii se
face prin urmrirea temperaturii interioare cu ajutorul unui termometru,
dar si prin culoarea hrtiei cu care sunt mpachetate aceste obiecte sau
a dopurilor de vat care trebuie s fie brun glbui la terminarea
sterilizrii. Dac temperatura s-a ridicat peste 200C, hrtia si vata se
carbonizeaz, devin sfrmicioase si nu mai asigur protecie obiectului.
Dac temperatura nu a depsit 170C, hrtia si vata rmn albe,
denotnd o sterilizare incomplet.

Fig. 7

1.1.1.2. Sterilizarea prin cldur umed

Poate fi efectuat prin mai multe procedee, n funcie de natura
materialelor si, n principal, a soluiilor ce urmeaz a fi sterilizate.
Principalele metode de sterilizare prin vapori cureni sunt: fierberea,
pasteurizarea si tindalizarea
Autoclavarea
Principiul. Destrucia total a germenilor este asigurat prin vapori de
ap sub presiune. Aceasta este mai penetrant i, de aceea, reprezint
cea mai sigur metod de sterilizare. O presiune a vaporilor de ap din
~5~

interiorul autoclavului de o atmosfera, realizeaza o temperatura de 1200C

i n 30 de minute distruge att formele vegetative, ct i sporii
microorganismelor.
Componentele autoclavului (fig. 8)
1.
Corpul reprezint un cazan de fier cu perei dubli, groi, rezisteni
la presiune.
2.
Coul sau cmaa din metal, cu orificii, n interiorul cruia se
introduc materialele pentru sterilizat.
3.
Grtarul sau suportul pe care se aeaz obiectele mari, cele mici
fiind introduse n couri de srm sau n glei de metal.

Fig. 8

4.
Robinetul de golire, fixat la exterior, la baza corpului autoclavului,
necesar pentru evacuarea apei n exces dintre cele dou componente
ale corpului (extern i intern).
5.
Capacul, care se nchide ermetic cu ajutorul unei garnituri de
cauciuc.
6.
uruburile servesc la strngerea capacului peste garnitura de
~6~

cauciuc i mpiedic ieirea vaporilor n timpul sterilizrii.

7.
Robinetul de vapori pentru evacuarea aerului dintre pereii
autoclavului.
8.
Supapa de siguran pentru mpiedicarea creterii presiunii peste 2
atmosfere i evitarea exploziei.
9.
Manometrul care msoar presiunea din interiorul autoclavului.
Utilizarea autoclavului
Se introduce n cazan apa distilat, puin sub nivelul grtarului. Obiectele
se aeaz n aa fel ca s fie asigurat circulaia vaporilor de ap. Se
nchide capacul strngnd uruburile dou cte dou, diametral opuse.
Robinetul de vapori se deschide i se pornete sursa de cldur (gaz,
sursa electric etc.). Un jet continuu de vapori de ap indic momentul
cnd aerul a fost evacuat n ntregime. Acest moment este important,
pentru c urmele de aer dintre pereii autoclavului denatureaz valorile
indicate de manometru. Se nchide robinetul de vapori i se las s se
ridice presiunea la o atmosfer, moment n care se regleaz sursa de
cldur ca s menin aceast presiune timp de minim 30 de minute. Se
nltur sursa de cldur, se ateapt ca acul manometrului s cad la
zero. Se deschide capacul i se scot obiectele sterilizate. Deschiderea
capacului nainte ca presiunea s fi sczut la zero poate produce
accidente. Dac obiectele se las n autoclav mai mult timp, dopurile se
vor uda datorit apei de condens. n mod obinuit, prin acest procedeu, o
sterilizare buna se realizeaza la 1200C (o atmosfera de vapori de ap)
timp de 60 de minute, pentru materialele infecioase, culturi bacteriene
etc.
n autoclav se sterilizeaz: lichidele care nu se altereaz la temperatura
mai mare de 1000C, mediile de cultura, materialul chirurgical, materialele
de prelevare (tuburi, ace, seringi), obiectele din cauciuc i materialul
infecios.
Controlul sterilizrii se face prin: teste chimice, teste biologice i prin
termometre (termo-manometre). Testele chimice utilizeaz tubuoare de
sticl ce conin substane sub form de praf cu punct de topire n jur de
1200C (sulf 1180C, acid benzoic 1210C). Acestea se aseaz n autoclav
odat cu obiectele de sterilizat. Dac n autoclav s-a realizat temperatura
de topire a acestor substane, la deschidere se constat c acestea sunt
solidificate n bloc. Testele biologice folosesc culturi sporulate de Bacillus
stearothermophilus cu care se impregneaz fire de bumbac ce se
introduc n tubuoare nchise la flacr. Dac s-a atins temperatura de
120C, sporii sunt distrui i rensmnarea lor pe medii de cultur nu
va fi urmat de dezvoltarea culturii de bacili.
~7~

Sterilizarea prin vapori cureni

Se realizeaz cu ajutorul unei oale cu vapori cureni (fig. 9.a) sau cu
autoclave cu robinetul de vapori deschis (fig. 9.b). Este o metod de
sterilizare imperfect, prin care se distrug formele vegetative ale
bacteriilor, nu i toate formele sporulate. Se aplic la sterilizarea
lichidelor care nu sunt alterate la temperatura de peste 100C .

Fierberea
Este o metod de sterilizare rapid, dar incomplet. Utilizeaz de obicei
casolete (fig. 10), n care se recomand introducerea de ap
demineralizat. Timpul de sterilizare este de minimum 30 de minute,
socotit din momentul cnd ncepe fierberea. Sunt sterilizate astfel
instrumentele ce se utilizeaz imediat (seringi, ace, pense etc.).

~8~

Fig. 10

Pasteurizarea
Se realizeaz prin nclzire ntr-o baie de ap la temperatura de 60 65C timp de 30 minute, la 70 - 75C timp de 15 minute sau la 85 - 90C
cteva secunde. nclzirea este urmat de rcire brusc la 4C. Prin
acest metod sunt distruse doar formele vegetative (n urma coagulrii
proteinelor acestora) i are loc reducerea considerabil a numrului
microorganismelor, prin trecerea sporilor n forme vegetative. Este
utilizabil pentru conservarea unor produse alimentare (de exemplu,
laptele).
Tindalizarea
Este o sterilizare fracionat sau discontinu, care const n nclzirea
produselor la 56 - 60C n baia de ap consecutiv 3 7 zile, timp de o
or. n acest timp se distrug formele vegetative. Operaiunea se repet
dup 24 de ore, timp n care produsul a fost inut la temperatura camerei
pentru a permite trecerea sporilor n forme vegetative, pe care noua
nclzire le va distruge. Metoda este aplicat n special pentru
substanele termolabile nefiltrabile, care peste 100C se altereaz
(vaccinuri, unele medii de cultur etc)

1.1.2. Sterilizarea prin filtrare

Const n reinerea microorganismelor din lichidele de sterilizat de ctre
porii unor filtre sau ai unor membrane filtrante. Se realizeaz la
temperatura ambiant i se aplic unor lichide biologice sau soluii
injectabile, care se altereaz prin tratare termic (soluii hidrolizabile,
~9~

seruri etc).
Filtrarea se face la presiune realizat cu ajutorul unei pompe de vid sau
trompe de ap, la care se ataeaz vasul n care se face filtrarea (flacon
Kitasato). Dup filtrare se face controlul produsului fcnd nsmnri
din filtrat pe medii de cultur adecvate. Dac n 3 4 zile de termostatare
(la 37C) nu se dezvolt microorganisme, filtratul este steril.
Filtrele cele mai des folosite sunt:
filtrele Chamberland, denumite i filtre lumnare, confecionate din
porelan poros de diferite dimensiuni;
filtrele de sticl (G) sunt discuri de sticl neutr poroas, cu pori n
jur de 1 micrometru, care rein bacteriile (dup dimensiunile porilor fiind
notate cu G0, G1.....G5);
filtrele Seitz, din asbest, care se utilizeaz pentru sterilizarea unor
soluii proteice, a plasmei sanguine, a unor lichide nlocuitoare de snge,
n controlul bacteriologic al apei etc;
membranele filtrante (filtrele milipore), care sunt nite discuri
confecionate din nitrat de celuloz, acetat de celuloz, policlorur de
vinil, ce rein selectiv microparticulele solide i microorganismele
coninute n lichide, datorit unui numr mare de pori (milioane de pori
pe cm2) cu dimensiuni ntre 8 i 0,01 micrometri.

1.1.3. Sterilizarea i dezinfecia prin radiaii

1.1.3.1. Radiaiile ionizante
Dintre radiaiile ionizante, razele gamma sunt cele mai penetrante i mai
bactericide, ele atacnd ADN-ul microorganismelor. Ionizarea compuilor
celulari
prin
expulzarea
electronilor
duce
la
distrugerea
microorganismelor. Aceste raze se obin dintr-o surs radioactiv de
cobalt 60 sau cesiu 137. Metoda se utilizeaz pentru produse
medicamentoase, instrumente i materiale degradabile prin cldur.
1.1.3.2. Radiaiile neionizante (ultraviolete)
Utilizarea unor astfel de radiaii neionizante cum sunt radiaiile solare, se
bazeaz pe observaiile c lumina solar are efect microbicid, care
variaz n raport cu specia microbian, cu intensitatea luminii i, mai
ales, cu coninutul luminii solare n radiaii ultraviolete (UV). Astfel, la
lumina solar: Escherichia coli moare n interval de o or, Salmonella
~ 10 ~

typhi n 2 3 ore, Mycobacterium tuberculosis n 5 7 ore. S-a

constatat, de asemenea, c UV sunt penetrante i puternic bactericide n
zona lungimilor de und de 2500 2800 . Aceasta provoac la nivelul
ADN-ului reacii chimice care distrug germenii patogeni.
Ultravioletele produse de lmpile bactericide sunt folosite pentru
sterilizarea aerului din slile de operaie, laboratoare, dezinfecia
ncperilor din spital, mobilierului etc. n utilizarea acestora trebuie inut
seama ns de faptul c, alturi de activitatea bactericid, radiaiile UV
au i o mare activitate fotochimic asupra substanelor chimice,
medicamentelor, pe care le modific, le altereaz.

1.1.4. Dezinfecia prin ageni chimici

Unele substane chimice sunt utilizate ca antiseptice sau dezinfectante.
Dezinfectant - este termenul prin care sunt cel mai adesea desemnate
substane puternic microbicide, capabile s omoare i sporii, utilizate
pentru decontaminarea (sterilizarea chimic) meselor de lucru,
instrumentarului, veselei de spital, bideurilor etc. i care, din cauza
efectelor iritante sau toxice, se pot aplica numai pe suprafee inerte.
Antiseptic - este substana antimicrobian (de obicei folosit n
concentraii reduse, ca soluii diluate) util pentru decontaminarea
tegumentelor (aseptizarea minilor, de exemplu), mucoaselor
(gargarisme, instilaiile conjunctivale etc.), plgilor supurate i altele.
Antisepticele trebuie s fie ct mai puin toxice i neiritante pentru
mucoase, tegumente, plgi. Unele substane n concentraii diferite pot fi
folosite att ca antiseptice, ct i ca dezinfectante.
Agenii chimici dezinfectani difer prin eficien antimicrobian, ca i prin
activitatea lor n prezena substanelor organice sau prin toxicitate. Cele
mai sensibile microorganisme, la majoritatea dezinfectantelor, sunt cele
sub form vegetativ, ca de exemplu bacteriile, fungii, protozoarele i
virusurile cu nveli lipidic, n timp ce sporii bacterieni i muli dintre cei
fungici sunt rezisteni.
Numrul substanelor cu aciune antimicrobian este foarte mare i de
natur chimic foarte diferit: compui anorganici (acizi, baze, sruri),
compui organici (detergeni, fenoli, alcooli, colorani, spunuri etc.). n
raport cu mecanismul principal de aciune, aceste substane pot fi
mprite n trei categorii: ageni tensioactivi, ageni de denaturare ai
proteinelor, inhibitori enzimatici.
1.1.4.1. Ageni tensioactivi
~ 11 ~

Din aceast categorie fac parte fenolii, detergenii i spunurile.

Fenolul (acidul fenic sau carbolic), primul antiseptic folosit de J. Lister
(1867) este utilizat n diferite concentraii: soluia de fenol 5%,
dezinfectant, omoar i spori; soluia de fenol 1% este util pentru
inactivarea toxinelor; soluia de 0,25% ca i conservant pentru vaccinuri.
Detergenii au numeroase caliti: inodori, incolori, activi n diluii mari,
netoxici i neiritani pentru piele, sunt substane dezinfectante i
antiseptice valoroase. Pot fi grupai n dou categorii chimic diferite:
detergeni anionici, cu aciune antibacterian mai slab, activi n special
asupra bacteriilor Gram-pozitive n diluii de 1/1000 i detergeni
cationici, compui de amoniu cuaternar n numeroase formule, folosii ca
dezinfectani n soluii apoase slab diluate i ca antiseptici n diluii mari.
n utilizarea detergenilor cationici se va ine seama de incompatibilitatea
acestora cu spunurile. n amestec, activitatea lor antimicrobian
dispare. De aceea, cnd detergenii cationici urmeaz s fie folosii
pentru antiseptizarea pielii, spunul trebuie bine ndeprtat n prealabil
cu ap i apoi cu alcool.
1.1.4.2. Agenii de denaturare ai proteinelor
Sunt substane care modific starea fizico-chimic a celulei
bacteriene prin precipitarea proteinelor, suprimnd astfel ntreaga
activitate metabolic. Astfel de activitate au acizii, bazele, alcoolii i
cloroformul.
Acizii sunt substane ionizante, aciunea lor bactericid fiind
proporional cu concentraia ionilor de hidrogen eliberai prin disociere.
Sunt activi sub limita de pH 5.
Bazele, substane ionizante, au aciune microbicid datorit concentraiei
anionilor OH-, uneori fiind toxic i cationul. Ca dezinfectant frecvent
utilizat este hidroxidul de sodiu, care n soluie 5% distruge i spori, iar n
cea de 10% omoar bacilul Koch din sput.
Alcoolii, dintre care alcoolul etilic, produs netoxic, n concentraie de 96%
precipit repede proteinele bacteriene de suprafa. Alcoolul sub 70
este folosit frecvent ca antiseptic pentru tegumente.
1.1.4.3. Inhibitori enzimatici
Ageni de interferare metabolic, inhibitorii enzimatici sunt substane care
reacioneaz cu grupri chimic-active ale proteinelor enzime
(carboxilice, aminice, fenolice etc.), determinnd blocarea funciei
acestora.
Formolul diluat 30% este puternic sporulicid (omoar sporii n 10 30
~ 12 ~

minute). Formolul 5 /oo, transform toxinele n anatoxine.

Halogenii acioneaz ca ageni oxidani, punnd n libertate oxigen n
stare nscnd care produce oxidarea general a produilor organici
celulari, prin intermediul ionului mineral care se substituie n structurile
aminoacizilor, producnd denaturarea total a proteinelor.
Astfel, clorul se folosete sub variate forme:
o
clor gazos 2 3 mg /oo pentru potabilizarea apei,
cloramina 1% folosit n acelai scop;
hipocloritul de calciu sau clorura de var, folosit n dezinfecia
localurilor;
hipocloritul de sodiu, sub diferite denumiri, utilizat ca dezinfectant
al apelor sau ca antiseptic pentru splarea plgilor.
Efectul bactericid al hipocloriilor este larg, acionnd asupra bacteriilor
sub form vegetativ, inclusiv asupra micobacteriilor (bacilul
tuberculozei), dar i a fungilor sau a sporilor unor bacterii. Aceste
substane se vor folosi ns cu precauie, din cauza efectelor iritante (n
funcie de concentraie) asupra pielii, ochilor i cilor respiratorii.
Iodul, sub form de tinctur de iod 6% n alcool, este puternic antiseptic
pentru piele, iar n alcool iodat 0,5 11%, un foarte bun antiseptic
neiritant pentru tegumente, n tratarea piodermitelor i a altor infecii.
Ali ageni oxidani sunt:
apa oxigenat 3%, un foarte bun antiseptic pentru splarea plgilor
infectate;
permanganatul de potasiu 3/1000 1/10000, un bun antiseptic
pentru mucoase i plgi, n concentraie de 5% fiind un dezinfectant
eficace.
Coloranii bazici sau acizi altereaz proteinele bacteriene i au aciune
selectiv asupra microorganismelor. Se folosesc mai ales pentru
coloraiile necesare examinrilor microscopice n vederea studiului
morfologiei bacteriene, avnd totodat proprieti bactericide. Astfel de
colorani sunt: albastrul de metilen, violetul de genian, fuxina bazic.
Acetia sunt folosii i ca substane antiseptice pentru piele i mucoase.

1.1.4.4. Dezinfectanii gazoi

Formaldehida sub form gazoas este indicat pentru dezinfectarea
suprafeelor, echipamentelor i a unor efecte care nu pot fi udate.
De un interes deosebit sunt dezinfectanii gazoi pentru sterilizarea
ncperilor i a echipamentului moale n spitale, a articolelor din cauciuc,
~ 13 ~

plastic etc., cel mai valoros dezinfectant gazos alturi de formaldehid

fiind oxidul de etilen. Este un gaz incolor cu miros plcut, folosit n
amestecuri neinflamabile cu CO2 sau alte gaze. Reacioneaz cu
gruprile sulfhidril, amino, carboxil i hidroxil din molecula de protein.
Sterilizarea se face n etuve cu vapori 50%, la 54C, timp de expunere 3
5 ore. Are mare penetrabilitate chiar n containere nchise din plastic, n
pachete etc.

~ 14 ~

1.2. STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE

Punerea n eviden a formei, dimensiunilor i aezrii bacteriilor prin
examen microscopic n preparate native sau dup colorare, constituie un
criteriu de diagnostic.

1.2.1. Efectuarea i examinarea preparatelor

microscopice
Materialele necesare:
ansa bacteriologic (fig. 11), un fir metalic format dintr-un aliaj de
nichel i crom, fixat pe un suport metalic i avnd, n partea terminal, o
bucl cu diametrul de aproximativ 2 mm (ansa calibrat);
lame de sticl splate i degresate cu un amestec de alcool-eter;
lame de diferite dimensiuni: 18x18 mm, 22x22 mm etc.;
bec Bunsen cu flacra reglabil.

Fig. 11

Examenul microscopic se execut fie direct din produsele patologice

(puroi, sput, sediment urinar, LCR etc.), fie direct din culturi pure de
bacterii. Examinarea microscopic arat prezena microorganismelor n
preparat i ofer relaii asupra proprietilor morfotinctoriale: forma (coci,
bacili, spirili), mrimea, mobilitatea, existena eventual a unor formaiuni
neobligatorii (cili, capsul, spori), aezarea n frotiu (lan, ciorchine, cte
doi etc.), proprietile tinctoriale (colorabilitatea).
Uneori, examenul microscopic efectuat direct din produsul
patologic permite stabilirea diagnosticului etiologic pentru unele infecii
(gonoree, sifilis, tuberculoz, stafilococii).
1.2.1.1. Examenul microscopic al unui preparat nativ
Examinarea microscopic direct ntre lam i lamel a unei
~ 15 ~

suspensii de germeni vii (fig.12), ntr-o soluie salin fiziologic sau

mediu de cultur lichid, este utilizat n urmtoarele variante:
preparate umede n lumin direct;
preparate umede n cmp ntunecat;
preparate umede n contrast de faz.

Fig. 12
Examinarea n lumin direct se face cu ajutorul unor
obiective uscate (20x sau 40x). Se coboar condensatorul, pn cnd se
obine un contrast care s permit obinerea unei imagini clare. Punerea
la punct a imaginii se face astfel:
se apropie obiectivul de preferat cu ajutorul vizei macrometrice,
privind lateral pentru a evita: atingerea lamei cu obiectivul, spargerea
lamelei, deteriorarea i infectarea obiectivului;
se privete prin ocular n timp ce se ridic obiectivul cu viza
macrometric, pn cnd apare cmpul microscopic;
se obin detaliile imaginii cu ajutorul vizei micrometrice.
Aceast examinare d indicaii orientative asupra numrului,
formei i mai ales asupra mobilitii germenilor.
Examinarea n cmp ntunecat prin utilizarea unui
condensator de tip special (cardioid), care realizeaz un cmp
microscopic ntunecat, n care bacteriile apar ca imagini luminoase,
observndu-se clar conturul i micrile acestora, se practic pentru a
decela Treponema pallidum din serozitatea ancrului venerian i pentru
vizualizarea leptospirelor din snge sau urin. n sifilisul primar,
examenul secreiei recoltate din ulcerul luetic prin aceast metod este
hotrtor pentru punerea diagnosticului.
Examinarea n contrast de faz. Pentru preparatele native,
rezultate foarte bune se obin cu ajutorul microscopiei n contrast de
faz. Pentru obinerea contrastului ntre detaliile clare i cele ntunecate,
se utilizeaz condensatoare i obiective care deviaz razele luminoase.
~ 16 ~

Prin aceast metod se pot pune n eviden detalii morfologice: sporii,

capsula i se pot examina i protoplatii.
1.2.1.2. Examenul microscopic al preparatelor colorate
Proprietile morfotinctoriale ale bacteriilor se pot studia mai
detaliat pe preparate fixate i colorate, cu germeni omori, cunoscute i
sub denumirea de frotiuri. Obinerea unui preparat colorat se realizeaz
n mai muli timpi: etalarea, fixarea i colorarea.
Etalarea frotiurilor (fig.13.a - 13.d)
Frotiul se poate face dintr-un lichid cu ansa sterilizat prin
flambare (fig.13.a,b), cu care se ia o pictur i se aaz pe o lam
degresat, pe care se ntinde lichidul prin rotirea ansei (fig. 13.c,d), dup
care ansa se sterilizeaz din nou prin flambare (aducere la rou). Dac
lichidul se preleveaz cu pipeta Pasteur, dup aplicarea picturii pe
lam, se procedeaz la fel. Un frotiu corect etalat trebuie s
ndeplineasc urmtoarele condiii: s fie ntins subire i uniform, lsnd
de la marginile lamei, un spaiu liber de 1-2 cm. Se usuc frotiul etalat la
aer, la temperatura camerei (fig. 14).

~ 17 ~

Fig. 14

Fixarea frotiurilor (fig.15)

Se face prin nclzirea lamei, trecnd-o rapid de 2-3 ori prin
flacra unui bec de gaz, pn cnd primete o temperatur ce poate fi
suportat de partea dorsal a minii.
Scopul fixrii este multiplu. Microorganismele sunt omorte i
deci preparatul nu mai este infecios. Prin fixare corect, preparatul
ader la lam i nu se detaeaz n timpul operaiilor de colorare i
splare. Prin omorrea microorganismelor, se mrete permeabilitatea
peretelui celular i se produc modificri ale citoplasmei, care cresc
~ 18 ~

afinitatea fa de unii colorani.

Fig. 15

Colorarea frotiurilor
Pentru colorarea bacteriilor se folosesc diferii colorani
organici, care pot fi: bazici, neutri sau indifereni. Cei mai des folosii
sunt: fuxina bazic, violetul de genian, albastrul de metilen, albastrul
de toluidin, verdele de malachit, verdele metil. Coloranii se folosesc
sub form de soluii apoase, la care se adaug cantiti mici de alcool
sau fenol.
Coloraia este un proces fizico-chimic complex, n care
coloranii se combin cu constituenii celulari, fcndu-i vizibili la
microscop. Colorantul se absoarbe, apoi se dizolv i difuzeaz n
coninutul celular, unde are loc formarea unei combinaii stabile.
Colorarea se execut de obicei acoperind suprafaa frotiului fixat cu
colorant, care este lsat s acioneze un timp limitat, la cald sau la rece.
Preparatele colorate dau mai multe indicaii de structur
celular, asupra formei, dimensiunilor aezrii n frotiu, prezenei unor
structuri celulare (capsul, spori, cili). Astfel, bacteriile pot fi difereniate
dup proprietile lor de colorabilitate.
Dup scopul urmrit, se pot utiliza mai multe tipuri de
coloraii:
coloraia simpl, care se execut cu un singur colorant;
coloraia combinat, care se realizeaz prin aciunea succesiv
sau simultan a mai multor colorani, fiecare acionnd independent,
fixndu-se pe anumite elemente;
~ 19 ~

coloraii speciale, pentru formaiuni morfologice celulare i

extracelulare: corpusculi, cili, spori, capsul.
Splarea frotiurilor colorate se face cu ap de robinet sau cu
ap distilat, pn la ndeprtarea complet a excesului de colorant de
pe lam. Uscarea frotiului colorat se face la temperatura camerei,
punnd lama ntr-un stativ, n poziie vertical.

1.2.2. Examinarea microscopic a frotiului colorat

Preparatele colorate se examineaz cu ajutorul microscopului
optic, ntotdeauna cu obiectivul de imersie. Imersia const n utilizarea
uleiului de cedru, care are un indice de refracie apropiat de cel al sticlei.
n acesta este introdus obiectivul 90x, iar condensatorul este ridicat.
Imaginea microscopic se pune la punct n felul urmtor: se ridic
condensatorul la maximum i se fixeaz lama pe care s-a depus uleiul
de cedru. Cu ajutorul vizei macrometrice se coboar obiectivul, privind
din lateral, pn cnd acesta intr n ulei. Apoi, privind prin ocular, se
ridic ncet viza macrometric pn cnd apare imaginea, care se pune
la punct cu ajutorul vizei micrometrice.
Microscopul optic are o putere de mrire de pn la 1500x i
o putere de rezoluie de 0,2 micrometri.
1.2.2.1. Metode de colorare n microbiologie
Coloraia simpl
Frotiul fixat este acoperit complet cu un singur colorant:
albastru de metilen sau fuxin diluat, timp de 1-2 minute, apoi se spal
cu ap curent i se usuc.
Coloraia simpl permite stabilirea formei i mrimii
bacteriilor, aezrii i dispoziiei (intra sau extracelulare) acestora,
precum i existena n produsul patologic a unor elemente celulare. Este
util n diagnosticul, prin examen direct, al gonoreei, meningitei
meningococice i al altor infecii.

~ 20 ~

Coloraiile combinate
Coloraia GRAM
Este larg utilizat n microbiologie, deoarece permite
deosebirea germenilor Gram-pozitivi, colorai n violet, de cei Gramnegativi, colorai n rou.
Timpii coloraiei Gram (fig. 16.a-16.d)

Fig. 16.a- Acoperirea preparatului cu violet de genian filtrat extemporaneu,

timp de 2 minute, apoi scurgerea colorantului.

Fig. 16.b- Acoperirea cu soluie lugol (iod-iodur de potasiu) pentru

mordansare (ntrirea coloraiei), timp de 2 minute. Se scurge
mordantul.

Fig. 16.c- Se decoloreaz preparatul cu o soluie de alcool-aceton timp de 20

de secunde i se spal cu ap curent. n acest timp rmn colorate doar
bacteriile Gram-pozitive (n violet)

~ 21 ~

Fig. 16.d- Se recoloreaz cu fuxin diluat, timp de 2 minute, apoi se spal cu

ap curent n exces, timp n care se coloreaz n rou bacteriile
Gram-negative.

Diferena de comportament a celor dou categorii de bacterii,

se explic prin structura i compoziia chimic diferit a peretelui celular.
Aspectul morfologic i coloraia Gram a principalelor specii
bacteriene de interes medical permit ncadrarea acestora n mai multe
grupe (tabelele I i II ).
Coci Gram-pozitivi
Stafilococii, bacterii sferice, dispuse n grmezi (ciorchine),
aezare caracteristic.
Streptococii, bacterii sferice sau ovale, aezate n perechi,
lanuri scurte sau lungi.
Pneumococii, coci ovalari sau lanceolai, aezai n perechi,
avnd capetele distale ale fiecrei perechi mai ascuite; n produsul
patologic sunt adeseori capsulai i predominant intracelulari.
Coci Gram-negativi
Gonococii (Neisseria gonorrhoeae) i meningococii
(Neisseria meningitidis) sunt coci Gram-negativi aezai n perechi cu
marginile adiacente aplatizate. n produsele patologice sunt dispui
predominant intracelular.

~ 22 ~

Tabelul I
Principalele bacterii aerobe n form de coci i bacili

Tabelul II
Principalele bacterii strict anaerobe

~ 23 ~

Bacili Gram-pozitivi
Germenii din grupul Bacillus sunt bacili mari i groi (3-10/11,3) cu spori dispui central sau paracentral, fr deformarea conturului
bacteriei.
Listeria spp., bacili scuri sau cocobacili, necapsulai, nesporulai. n
frotiuri din produse apar intra sau extracelulari.
Bacilii difterici (Corynebacterium diphtheriae) sunt bacili pleomorfi
variabili ca mrime i form. Majoritatea sunt ncurbai i aezai n
perechi sau grmezi, formnd unghiuri care imit diferite litere.
Caracteristic este prezena de granulaii metacromatice, dispuse mai
ales la poli.
Actinomicetele apar n preparatele din unele produse (sput,
puroi, LCR etc.) ca bacterii n form de filamente ramificate, cu tendin
de a se fragmenta n forme bacilare sau cocobacilare.
Bacili Gram-negativi
Germenii din grupele Enterobacteriaceae, Yersinia,
Aeromonas, Pseudomonas se prezint ca bacili Gram-negativi
nesporulai cu capete rotunjite, de mrimi diferite.
Vibrio, bacili Gram-negativi, nesporulai, uor ncurbai (majoritatea), cu
aezare necaracteristic.
~ 24 ~

Haemophilus sunt bacili sau cocobacili, cu un pronunat

polimorfism.
Alte bacterii Gram-negative cocobacilare, cu polimorfism, sunt:
Pasteurella, Moraxella, Brucella, Bordetella.
Coloraia ZIEHL-NEELSEN
Principiul
Bacilul tuberculozei Mycobacterium tuberculosis, ca i alte
micobacterii acido-alcoolo-rezistente, se coloreaz n rou cu fuxin,
pstrnd aceast culoare i dup tratarea frotiului cu alcool i acid, n
timp ce alte bacterii, mpreun cu celulele, se coloreaz n albastru (cu
albastru de metilen).
Timpii coloraiei Ziehl-Neelsen (fig. 17.a-17.f)
17.a-17.b- Colorarea cu fuxin fenicat timp de 5 minute la cald:

Se acoper complet lama cu fuxin filtrat, apoi cu un tampon mbibat n

alcool se nclzete lama pn ies vapori, fr s fiarb. Se repet
operaiunea de 2 ori.
17.c- Splarea frotiului cu ap distilat, pn cnd apa de
splare rmne incolor.
~ 25 ~

Fig. 17.c
17.d- Decolorarea cu alcoolul acidifiat (alcool etilic i acid
clorhidric): se acoper lama cu decolorant i se ateapt 3 minute.

Fig. 17.d

17.e- Splarea
decolorarea este complet.

cu

ap

de

robinet,

verificnd

dac

Fig. 17.e

17.f- Recolorarea cu albastru de metilen

Se acoper frotiul cu colorant i dup 30 de secunde se
spal cu ap de robinet. Se usuc preparatul la temperatura camerei i
se examineaz la microscop.
~ 26 ~

Fig. 17.f

Examinarea frotiurilor
Germenii acido-alcoolo-rezisteni cu aezare caracteristic (fig.18)
apar colorai n rou, ceilali germeni i elemente celulare din frotiu fiind
colorati n albastru (plana I.2).

Fig. 18 Micobacterii foarte subiri, cu granulaii fine.

Coloraia
Ziehl-Neelsen
este
caracteristic
genului
Mycobacterium i are o semnificaie diagnostic deosebit pentru
tuberculoz. Proprietatea de acido-alcoolo-rezisten a acestor bacterii
se datorete structurii particulare a peretelui celular, cantitii mari de
lipide pe care acestea le conin i, n special, acidului micolic din peretele
celular.
Coloraii speciale
Coloraia pentru capsul prin metoda BURRI modificat.
O pictur din suspensia de bacterii se amestec cu o
pictur de tu de China. Se ntinde un frotiu subire i se las s se
usuce, apoi se fixeaz. Se coloreaz cu fuxin diluat 1/10 timp de 4
minute. Se spal, se usuc, apoi se examineaz la microscop (obiectivul
cu imersie). Pe fondul negru, bacteriile apar colorate n rou, cu o zon
clar, incolor, n jur. Aceast zon corespunde capsulei, care nu se
coloreaz.
~ 27 ~

Coloraia pentru spori (coloraia MLLER). Frotiul se fixeaz

cu alcool etilic 96% timp de 2 minute. Se mordanseaz cu acid cromic
5% timp de 5 minute. Se spal cu ap curent. Se execut coloraia
Ziehl-Neelsen, eliminnd operaiunea de decolorare cu alcool.
Se spal, se usuc i se examineaz cu imersia.
Sporii apar colorai n rou, formele vegetative n albastru.
Alt metod de evideniere a sporilor este cea care utilizeaz
verdele de malachit:
se acoper lama cu o soluie verde de malachit 5%;
se nclzete ca la coloraia Ziehl-Neelsen;
se spal frotiul cu ap de robinet;
se acoper lama cu fuxin Ziehl diluat 1/10 30 secunde;
se spal bine cu ap de robinet.
Corpii bacterieni apar colorai n rou, iar sporii n verde.
Coloraia pentru corpusculii metacromatici (DEL VECCHIO)
Tehnica:
Frotiul uscat i fixat prin cldur este tratat astfel:
albastru de metilen Lffler, timp de 10 minute;
splare cu ap de robinet;
soluie Lugol, timp de 10 minute;
splare cu ap de robinet.
Corpul microbian apare de culoare galben nchis, iar
corpusculii metacromatici n albastru verde.
-

~ 28 ~

1.3. MEDIILE DE CULTUR

Multiplicarea in vitro a agenilor microbieni dintr-un produs cultivarea
se realizeaz
pe medii de cultur, formate din amestecuri de
substane necesare dezvoltrii acestora.
Cultura este efectuat n diverse scopuri:
izolarea agenilor microbieni din produsele patologice i
obinerea unei culturi primare pe medii ce permit cultivarea unei mari
varieti de germeni, inclusiv a celor cu necesiti nutritive speciale;
izolarea germenilor patogeni din produsele pluricontaminate n
cultur pur a unei bacterii cu potenial patologic;
identificarea bacteriilor patogene dup caracterul lor de cultur
pe medii care au o compoziie complex i potenialitate mare i pe medii
de cultur selective;
obinerea de produse biologice pentru diagnosticul, tratamentul
sau prevenirea unor mbolnviri.
Orice mediu de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
s asigure substanele nutritive necesare: sursa de carbon i
azot, donorul i acceptorul de hidrogen, minerale, factori de cretere;
s asigure condiiile de desfurare optim a metabolismului:
pH, potenial redox, aerare i cantitate necesar de CO2 etc.;
s fie steril.
Majoritatea bacteriilor de importan medical sunt heterotrofe, relativ
uor cultivabile, cu cteva excepii: bacteriile cu dezvoltare strict
intracelular (n celule vii), rickettsiile i chlamydiile, care nu se pot
dezvolta pe medii sintetice.

1.3.1. Compoziia mediilor de cultur

1.3.1.1. Substane nutritive
Cteva dintre bacteriile de importan medical, printre care i
Escherichia coli, pot crete i pe medii care au ca singur surs de
carbon i energie, glucoza. Majoritatea bacteriilor necesit un amestec
complex de substane, utilizndu-se n acest scop, extracte din carne
sau alte esuturi, amestecuri naturale de proteine etc.
Peptonele se obin prin hidroliza acid, alcalin sau enzimatic. Ele
conin aminoacizi, peptide, peptone alturi de zaharuri, vitamine, sruri i
altele. Exemple: peptona Bacto, proteazo-peptona.
Extractele de carne conin substane hidrolizabile din carne sau alte
~ 29 ~

esuturi, fr adugare de enzime, macerat de carne sau autolizat de

drojdie.
Proteinele naturale: ser sangvin, snge defibrinat, lichid de ascit, ou,
lapte .a., pot fi adugate dup sterilizarea mediilor, obinndu-se medii
cu proteine native sau pot fi coagulate termic n timpul preparrii
mediului.
1.3.1.2.

Ageni de solidificare

Izolarea n cultur pur a unei bacterii dintr-un amestec natural (produs

patologic, ap, aer) se obine, de cele mai multe ori, pe suprafaa
mediilor de cultur solide. Ca ageni de solidificare a mediilor de cultur
se utilizeaz, de obicei, agarul i gelatina.
Agar-agar este un phytocoloid de natur polizaharidic, obinut din algele
marine. Nu are valoare nutritiv, iar utilizarea acestuia se bazeaz pe
dou proprieti fundamentale:
nclzit la 80900C n ap, d o soluie care dup rcire sub
450C se solidific sub forma unui gel;
la cldur adsoarbe cantiti mari de ap (de 50 de ori volumul
su) necesar dezvoltrii bacteriilor.
Concentraia obinuit n mediile de cultur este 2-2,5%.
1.3.1.3.

Alte componente

Indicatorii de pH, ca: albastru de bromtimol, rou neutru, purpura de

bromcrezol, indicatorul Andrade .a., se utilizeaz mai ales pentru
demonstrarea producerii de acid din zaharurile din mediu, prin utilizarea
acestora de ctre bacterii.
Agenii selectivi sunt substane colorate sau nu, uneori chimioterapice,
introduse n mediile selective pentru dezvoltarea unor bacterii i
inhibarea creterii altora. Dintre aceti ageni se utilizeaz mai frecvent:
cristalul violet, azida de sodiu, verdele malachit, fuxina, selenitul de
sodiu, teluritul de potasiu, citratul de sodiu etc. Pentru unele medii,
substanele care cresc pH-ul la 8-9 sau l scad la 4-5, constituie factori
selectivi. Clorura de sodiu este, de asemenea, un astfel de factor.
Agenii reductori se utilizeaz n mediile pentru cultivarea bacteriilor
anaerobe, care -alturi de lipsa oxigenului molecular- au nevoie de un
potenial de oxidoreducere sczut. Astfel sunt thioglicolatul, cisteina etc.
Substanele pentru teste biochimice se utilizeaz pentru evidenierea
unor proprieti metabolice necesare identificrii bacteriilor n mediile n
care s-au introdus unul sau mai multe substraturi, ca -de exempluzaharuri, polialcooli, aminoacizi etc. Uneori, evidenierea produilor
~ 30 ~

rezultai din metabolismul bacterian se face prin indicatorii existeni n

mediu, alteori, indicatorul se adaug ulterior.

1.3.2. Prepararea mediilor de cultur

Se face dup urmtoarea schem general:
Amestecul ingredientelor n proporia i ordinea indicate n
reeta de preparare.
Ajustarea pH-ului. n general, mediile de diagnostic au un pH
uor alcalin (7,2 7,8). Determinarea acestuia se face prin metode
colorimetrice, iar corectarea la pH-ul dorit are loc fie cu acid clorhidric
10%, fie cu hidroxid de sodiu 4%.
Repartizarea mediului de cultur n recipiente adecvate
(eprubete, baloane, cutii Petri), dup ce a fost sterilizat i dup controlul
sterilizrii.
Controlul calitii mediului de cultur prin nsmnarea acestuia
cu bacterii inute n laborator n acest scop.
Deoarece mica producie a fiecrui laborator sufer variaii n calitatea
mediilor, se tinde la nlocuirea acesteia cu producia pe scar larg n
laboratoarele specializate, actual, majoritatea mediilor de baz fiind
furnizate de Institutul Cantacuzino din Bucureti.
Mediile de cultur pot fi lichide sau solide. Dup compoziia lor, pot
fi medii simple sau uzuale, care se folosesc separat sau mpreun cu
mediile complexe: cu proteine native, medii selective, medii de
mbogire, pentru anaerobi etc.
1.3.2.1.

Mediile simple

Sunt medii de cultur care se prepar uor i au n compoziia lor

substane nutritive care permit multiplicarea unui numr mare de specii
bacteriene. Acestea se pot prezenta sub form de:
ap peptonat, cel mai simplu mediu, coninnd pepton 1% i
NaCl 0,5%;
bulion nutritiv, coninnd n plus extract de carne, care asigur o
varietate de sruri i factori de cretere, pe lng polipeptidele i
aminoacizii din compoziia peptonei;
agar nutritiv, un mediu solidificat ce conine bulion nutritiv i
agar-agar 2%, acesta constituind baza pentru diferite tipuri de medii de
cultur i putndu-se prepara n cutii Petri sau n tuburi nclinate.
1.3.2.2.

Medii mbogite cu proteine native

~ 31 ~

Unele bacterii se pot cultiva mai uor pe medii foarte bogate n substane
nutritive, cum sunt cele din snge, ser sau ou. Dintre aceste medii fac
parte: geloza-snge, geloza-chocolat, mediul Mueller-Hinton etc.
Geloza - snge conine, pe lng agar nutritiv, 10% snge defibrinat de
berbec, cal sau snge uman. Amestecul gelozei cu sngele defibrinat pe
perle de sticl se face la temperatura de 450C (pentru a evita degradarea
proteinelor din snge), dup care se toarn n plci Petri i, astfel, se
obine un mediu care, pe lng valoarea sa nutritiv mrit, permite
stabilirea unor proprieti utile n identificarea bacteriilor, prin aciunea lor
hemolitic (realizat de toxinele bacteriene eliberate, de exemplu, de
Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes) (plana III.1).
Geloza - chocolat este preparat asemntor cu geloza-snge, dar se
nclzete treptat dup amestecul agarului cu sngele, pn la
temperatura de 750C 800C, mediul primind o culoare chocolat prin
eliberarea unor substane nutritive din hematii, necesare dezvoltrii unor
specii bacteriene, cum sunt cele din genurile Haemophilus i Neisseria.
Geloza - snge Mueller-Hinton este un mediu selectiv pentru Neisserii
(meningococi, gonococi), care are la baz geloza-snge glucozat, la
care se adaug lincomicin i colimicin.
1.3.2.3.

Medii selective

Aceste medii conin substane care inhib multiplicarea unor bacterii i,

astfel, se va dezvolta un numr mic de specii bacteriene, care pot fi
identificate att prin proprietile lor nutritive, ct i prin cele biochimice,
deoarece unele medii conin i indicatori pentru difereniere. Unele medii
selective au mai multe substane nutritive (n principal: aminoacizi,
glicerin, ou), pe lng ageni inhibitori (de exemplu, mediile pentru
Mycobacterii).
Dintre mediile selective fac parte i cele care permit:
izolarea stafilococilor (mediul hiperclorurat Chapman);
izolarea i identificarea enterobacteriilor;
medii selective pentru neisserii, corynebacterii, vibrioni holerici
etc.
Unele bacterii prezente n produsele patologice se izoleaz pe medii
selective dup ce mai nti sunt nsmnate pe medii lichide de
mbogire, cum sunt: apa peptonat la pH 8 pentru vibrionul holeric;
mediul cu selenit acid de sodiu pentru Salmonella; mediul O.S.C.T.
~ 32 ~

pentru Corynebacterium diphtheriae etc.

Redm mai jos principalele medii selective i difereniale cu
indicatori, folosite n laboratoarele clinice.
Geloza Tinsdale (mediu selectiv pentru bacili difterici). Este un agarsnge cu telurit de potasiu i tiosulfat de sodiu, utilizat pentru izolarea
bacteriei Corynebacterium diphtheriae din secreiile faringiene, coninnd
inhibitori pentru flora normal a tractului respirator superior. Acest mediu
permite i diferenierea bacililor difterici de difteromorfi prin formarea de
ctre Corynebacterium diphtheriae a unor colonii de culoare neagr, n
urma reducerii teluritului (plana III. 3).
Mediul O.C.S.T. (ou-cistein-ser-telurit). Este un mediu de mbogire
pentru bacilul difteric. Conine: ser normal de bou, bulion glucozat, telurit
de potasiu, cistein i ou.
Mediul Bordet Gengou. Este un mediu selectiv pentru bacteriile din
genul Bordetella i conine un mediu de baz (macerat de cartofi i
glicerin n ap distilat), la care se adaug snge defibrinat de berbec.
Pentru inhibarea altor bacterii din tractul respirator se adaug antibiotice
(penicilin).
Mediul Lwenstein Jensen. Este un mediu selectiv complex, mbogit
cu substane nutritive, ou, sruri minerale i verde de malachit, care
inhib dezvoltarea altor bacterii n afar de cele din genul
Mycobacterium. Mediul este coagulat la 800C n tuburi, iar micobacteriile
cresc pe aceste medii sub forma unor colonii de aspect caracteristic
(plana III.5).
Mediul MacConkey. Este utilizat pentru cultivarea i identificarea
enterobacteriilor, fiind compus din: pepton, agar, lactoz, rou neutru
(ca indicator) i sruri biliare (ca inhibitori ai altor bacterii dect cele
intestinale).
Acest mediu poate diferenia dou grupe majore de enterobacterii
(plana III.2):
lactozo pozitive, care fermenteaz lactoza i cresc pe acest
mediu sub form de colonii de culoare roz, incluznd Escherichia coli i
coliformii;
lactozo negative, care nu fermenteaz lactoza i cresc pe
acest mediu sub forma unor colonii glbui, incluznd enterobacteriile din
genurile Salmonella i Shigella.
~ 33 ~

Mediul agar T.S.I. (Triple Sugar - Iron) sau agar triplu zaharat sulfat
feros, numit i mediu multitest, este folosit pentru identificarea
enterobacteriilor. n compoziia acestui mediu intr, pe lng extract de
carne, drojdie, pepton, o cantitate mic de agar i glucoz 0,1%,
lactoz 1%, zaharoz 1%, sulfat feros (pentru detectarea producerii de
H2S), rou fenol (ca indicator). Mediul se toarn n tuburi nclinate astfel
nct s se obin o parte dreapt (la fundul tubului) de circa 2,5 cm i
alta nclinat (aproximativ 4 cm). Nensmnat, la pH 7,4, mediul TSI
are culoare roz portocalie (plana IV.1).
nsmnarea mediului se face prin neparea prii drepte i, n
continuare, prin efectuarea de striuri pe suprafaa nclinat. Dup
incubare timp de 24 de ore, se poate face citirea, a crei interpretare
depinde de modul n care vireaz culoarea mediului, care poate fi dat
de :
acidifierea prii drepte (culoare galben), care nseamn
fermentarea glucozei;
acidifierea prii drepte i a celei nclinate, care semnific
fermentarea glucozei, lactozei sau/i a zaharozei;
culoarea nemodificat arat c bacteria nu atac zaharurile;
producerea de gaz este marcat prin apariia bulelor de gaz la
fundul tubului i chiar deplasarea coloanei de mediu;
producerea de H2S este evideniat de nnegrirea prii drepte a
mediului.
Pentru exemplificare, a se vedea plana IV. 1-5.
Mediul M.I.U. (mobilitate, indol, uree). Este un mediu de cultur multitest
folosit pentru identificarea enterobacteriilor, avnd n compoziie
peptone, agar, glucoz i rou fenol (ca indicator), iar n momentul
folosirii, se adaug i o soluie de uree 20%. Mediul se distribuie n tuburi
i se solidific n poziie vertical, iar nsmnarea se face numai prin
nepare n lungul peretelui tubului.
Dup 20 de ore de incubare la 370C se face interpretarea:
cnd este atacat ureea (testul ureazei este pozitiv), mediul
vireaz n rou (plana IV.2);
mobilitatea se recunoate prin creterea culturii de-a lungul
traiectului de inoculare.
Pentru determinarea indolului se pot folosi benzi de indol livrate de
Institutul Cantacuzino sau se poate utiliza un mediu asemntor cu
MIU, denumit xiloz lizin dezoxicolat (XLD), n care formarea
indolului se traduce prin apariia unei culori roii pe o poriune din band
sau a unui inel rou la suprafaa mediului (plana IV.3).
~ 34 ~

1.3.2.4.

Medii pentru cultivarea anaerobilor

n anaerobioz se cultiv bacteriile care nu se dezvolt n prezena O2,

cum sunt cele din genul Clostridium sau flora Veillon (anaerobi
nesporulai), care ncadreaz un numr foarte mare de specii bacteriene,
ca: peptococi, peptostreptococi, lactobacili, actinomicete, fusobacterii,
Bacteroides, Veillonella etc.
Anaerobioza poate fi obinut fie prin ndeprtarea oxigenului prin
combinare cu hidrogen n prezena catalizatorului de palladium prin
sistemul Gas Pak, fie prin adugare la mediul de cultur a unor
substane reductoare.

Fig. 19. Sistemul anaerobic Gas Pak

Sistemul Gas Pak anaerobic (fig.19). ntr-un recipient special prevzut cu

un capac cu garnitur, care se nchide ermetic, se gsete un catalizator
din aluminiu acoperit cu palladium. n acest sistem se introduc mediile
nsmnate, iar hidrogenul este generat nuntrul recipientului prin
plasarea unui nveli comercial special Gas Pak, care elibereaz
hidrogen i bioxid de carbon. Hidrogenul se combin cu oxigenul din
interiorul recipientului i se creaz condiii stricte de anaerobioz.
Metoda pirogalolului alcalin este o metod care se bazeaz pe
utilizarea unui amestec de substane reductoare a cror baz o
constituie pirogalolul i carbonatul de potasiu. Aceste amestecuri se
introduc n plicuri mici de hrtie de filtru confecionate n laborator.
Pliculeul se lipete cu dou benzi de leucoplast pe capacul cutiei Petri,
peste care se pune partea de plac Petri cu mediul nsmnat. Se lipesc
~ 35 ~

cele dou pri ale plcii cu parafin topit. Prin aceast parafinare, ntre
cele dou pri ale plcii se formeaz un spaiu nchis ermetic. Se
incubeaz la termostat, la 370C.
Mediul Veillon este un mediu semisolid format din agar nutritiv
moale, ce conine glucoz i care este turnat n tuburi nguste, n
coloan nalt (cultivarea se face n profunzime). Bacteriile strict
anaerobe se vor dezvolta n partea inferioar a coloanei de mediu.

~ 36 ~

1.4. PRELEVAREA PRODUSELOR BIOLOGICE

Modul de prelevare i de transport al produselor biologice destinate
examinrii bacteriologice condiioneaz direct eficiena etapelor
ulterioare i, n final, obinerea unui rezultat fidel n ceea ce privete
diagnosticul etiologic al unei boli infecioase.
Prelevatele sunt probe de material biologic n care se bnuiete prezena
microorganismelor. Acestea pot fi:
produse normale, care prezint unele modificri n caz de boal
(snge, urin, materii fecale, lichid cefalorahidian etc.);
produse patologice care apar numai n mbolnviri (puroi, lichid
peritoneal, lichid articular).

1.4.1.

Reguli generale de recoltare

Pentru fiecare boal infecioas trebuie cunoscut: de unde, cnd, cum i

ct trebuie recoltat.
Prelevatul trebuie obinut din acele locuri n care agenii etiologici se pot
gsi, n mod deosebit, n cursul bolii. Selectarea produsului se face deci
n raport cu patogenia infeciei: poarta de intrare a microorganismelor,
cile de diseminare, cile de eliminare etc. De pild, prelevatul trebuie
obinut direct din leziune, n aa fel nct s conin poriunile cele mai
caracteristice ca semnificaie etiologic.
Momentul cel mai potrivit pentru recoltare este n raport cu perioada de
evoluie a bolii. Este necesar ca prelevarea s fie executat naintea
nceperii terapiei cu substane antimicrobiene sau dac aceasta a
nceput la 48 de ore de la ncetarea ei.
Este indicat ca prelevarea s fie realizat n momentul optim al
evoluiei bolii, adic atunci cnd agentul etiologic se gsete n cantitate
mai mare n produsul respectiv, aplicnd tehnica cea mai corect.
Este necesar a se recolta cantiti suficiente de material, pentru a
face posibile toate examinrile de laborator necesare, inclusiv cele care
vor fi - eventual - indicate ulterior.

Prelevarea oricrui produs pentru examenul bacteriologic

trebuie s se fac steril, n condiii de riguroas asepsie i ntr-un
recipient sterilizat prin cldur, fr urme de substane.

Recipientul care conine produsul va fi etichetat

corespunztor (n lipsa unor etichete tip se vor folosi fii de leucoplast
care au avantajul c nu se desprind uor de pe recipient). Pe etichete se
37

va nota (cite) numele bolnavului i, eventual, felul produsului. Orice

produs patologic va fi nsoit de un buletin de analiz care s cuprind
datele bolnavului: numele i prenumele pacientului, vrsta, diagnosticul
prezumtiv, natura produsului recoltat i examinrile solicitate, precum i
tratamentul antimicrobian care s-a fcut (dac este cazul).

Produsul se va ambala corespunztor, n recipiente bine

nchise i protejate, n aa fel nct s fie evitat alterarea lui,
contaminarea mediului nconjurtor sau a persoanelor care l
manevreaz. Dac laboratorul este la distan, se va nota pe etichet
Material infecios.

Se va asigura expedierea produsului imediat dup recoltare.

Cu ct durata de timp ntre prelevare i prelucrare este mai mare, cu att
scade ansa obinerii unui rezultat corect. ntrzierea prelucrrii scade
posibilitatea izolrii agenilor etiologici, permitnd nmulirea celor care nu
au potenial infecios sau a celor care pot proveni din eventuala
contaminare a produsului.

n funcie de natura prelevatului i a examenului solicitat, se

vor folosi medii sau soluii conservante. Utilizarea lor este indicat, mai
ales, n situaia n care avem de-a face cu un produs pluricontaminat
care conine un numr redus de bacterii patogene. n cursul expedierii la
laborator se vor asigura condiii de meninere a temperaturii la 370C
pentru bacteriile care nu rezist la temperaturi mai sczute
(meningococi, gonococi).
Transportul se face numai de ctre personal sanitar instruit n acest
scop. Nici un produs infecios nu se expediaz prin pot.

Pentru bacteriile anaerobe, recoltarea se face prin procedee

care s asigure, pe ct posibil, condiii de anaerobioz (mai ales pentru
lichidele de puncie care se recolteaz n seringi ce conin un strat de
ulei de parafin steril, iar vrful acului se nfige, imediat dup recoltare,
ntr-un dop steril). Pentru alte produse care nu pot fi ferite, prin natura lor,
de contactul cu aerul (de exemplu: sputa), prelucrarea pentru izolarea
germenilor anaerobi se va face imediat dup recoltare, fapt ce implic o
colaborare perfect ntre clinician i diagnosticianul de laborator.

38

1.4.2.

Recoltarea principalelor produse patologice

1.4.2.1. Recoltarea de la nivelul tractului respirator

Secreiile din tractul respirator se recolteaz n raport cu localizarea
infeciei. n interpretarea rezultatelor se ine cont de flora bacterian
normal abundent i foarte variat din cile respiratorii superioare.
Prelevarea secreiei faringiene
Se face cu un tampon faringian steril, dimineaa pe nemncate sau la cel
puin 4 ore de la ingerarea de alimente. Pentru recoltare, se deschide
gura pacientului la maximum i se apas limba, pentru a evidenia
peretele posterior al faringelui, amigdalele i vlul palatin (fig. 20). Se
insist asupra zonelor cu puroi, pseudomembranelor i asupra secreiei
mucopurulente de pe peretele posterior (avnd grij, pe ct posibil, s nu
atingem limba cu tamponul). Se recolteaz cel puin 2 tampoane, iar n
cazul suspiciunii de difterie 3 tampoane.

Fig. 20

Pentru prelevarea secreiilor nasofaringiene se recomand tampoane

lungi, ncurbate, n indicaiile acestor prelevri pornindu-se de la
constatarea c, n multe cazuri, o infecie trenant a cilor respiratorii
superioare poate fi ntreinut de un focar nasofaringian sau nazal. Cnd
leziunile sunt situate n fosele nazale, recoltarea se face de ctre
specialist.

39

Prelevarea sputei
Sputa reprezint nsumarea secreiilor patologice ale arborelui respirator
(laringe, trahee, bronhii, pulmoni) i este eliminat prin expectoraii n
afeciuni cu manifestri clinice variate, n funcie de localizare i felul
agentului etiologic: traheobronite, congestii pulmonare, pneumonii,
bronhopneumonii, abcese pulmonare etc.
n toate aceste sindroame, examenul bacteriologic al sputei reprezint
singurul mijloc de diagnostic etiologic, dar rezultatul acestei examinri
depinde n mare msur de respectarea condiiilor de prelevare,
transport i prelucrare corect.
Recoltarea sputei se face din expectoraia de diminea, cnd bolnavul
i face spontan toaleta bronhiilor. n prealabil, pacientul va face o
toalet bucal nsoit de gargar cu ser fiziologic steril. Se va insista
asupra obinerii sputei propriu-zise i nu a salivei sau a secreiilor nazale
(care ar contamina sputa i ar duce la rezultate eronate).
Produsul este prelevat ntr-o plac Petri steril (cnd recoltarea se face
n laborator sau n apropierea acestuia) sau n flacoane cu gt larg.
Alte metode mai laborioase, dar mai fidele, realizabile numai n
serviciile de specialitate, sunt:
aspiraia bronic prelevat prin lumenul bronhoscopului
ndreptat direct spre locul leziunii;
puncia transtraheal etc.
Transportul produselor la laborator trebuie s fie asigurat n cel mult 2
ore de la recoltare, n condiii adecvate, pentru a evita degradarea
elementelor necesare diagnosticului etiologic.

1.4.2.2. Prelevarea de la nivelul tractului digestiv

De la acest nivel, produsul care permite cele mai multe izolri de
microorganisme patogene este scaunul proaspt materiile fecale emise
spontan. Pentru examenul bacteriologic coprocultur alturi de care
se efectueaz, de obicei, i examenul parazitologic coproparazitologic
prelevarea se face din scaunul emis spontan, cu sau fr administrare
de purgativ, din cel recoltat cu sonda Nelaton sau cu tamponul rectal (la
copiii mici). Pentru aceste recoltri se folosesc recipiente numite
coprocultoare, din sticl sau plastic, prevzute cu o spatul cu ajutorul
creia se prelev din scaun poriuni cu mucus i, eventual, cu urme de
snge. Cantitatea de materii fecale care va fi recoltat este n jur de 5
40

grame, suficient pentru toate examinrile amintite.

La bolnavii cronici purttori de bacili tifici, prelevarea se face timp de 3
zile consecutiv, dup o administrare unic de purgativ.
Transportul prelevatelor destinate examenelor microbiologice se face n
cel mai scurt timp (n maximum 2 ore de la prelevare). n cazul n care
acest interval nu poate fi asigurat, este obligatorie folosirea unui lichid
conservant sau mediu Cary-Blair.
Alte produse din tractul digestiv, care pot fi utile examenului bacteriologic
sunt lichidele de vrstur (care se recolteaz n toxiinfeciile alimentare)
i bila, a crei examinare bacteriologic, dup recoltarea cu sonda
Einhorn, se numete bilicultur.
1.4.2.3. Recoltarea de la nivelul tractului uro-genital
Prelevarea probei de urin
Se poate efectua la nivelul unei uniti sanitare sau chiar la domiciliu,
dac sunt respectate instruciunile de recoltare. Se recolteaz prima
urin de diminea.
n acest scop, se face n prealabil o toalet a organelor genitale
exterioare cu ap i spun. Se elimin prima poriune din urin, apoi
miciunea se ntrerupe i urmtoarea poriune, jetul mijlociu, se
recolteaz ntr-un vas steril (fig. 21).

Fig. 21
Volumul necesar examenului bacteriologic obinuit este de 15 ml, iar
pentru diagnosticul de tuberculoz urogenital este de minimum 50 ml.
Urina trebuie trimis la laborator i prelucrat n decurs de o or de
la recoltare. nsmnatrea urinii pe medii, urocultura, se face cu scopul
izolrii microorganismelor n cazul infeciilor cilor urinare: cistite, cistopielite, tuberculoz etc.
41

Urocultura, n sensul uzual al termenului, nseamn determinarea

cantitativ a numrului de bacterii pe ml (urocultura cantitativ). Astfel, se
accept c prezena a peste 100.000 bacterii/ml este semnificativ
pentru infecia urinar. O bacteriurie mai joas de 100.000 bacterii/ml
(1.000 100.000) poate fi semnificativ n unele situaii ca: tratament
recent cu antibiotice, hidratare masiv, pH sub 5 sau prezena unor
microorganisme care se dezvolt mai greu ( genul Streptococcus,
Haemophilus etc.).
Recoltarea secreiei uretrale
n mod normal, uretra - att la brbat, ct i la femeie - este lipsit
de flor bacterian, aa nct secreia uretral este considerat ca fiind
un produs patologic. n general, examenul bacteriologic al organelor
genitale externe este dificil i fidelitatea rezultatelor este condiionat
direct de modul corect de prelevare, transport, examinare i interpretare
a datelor.

Fig. 22 Recipiente cu mediu solid pentru conservarea gonococilor i

meningococilor

Fig. 23 Recipiente cu mediu semisolid pentru transportul i conservarea

gonococilor

Prelevarea secreiei uretrale la brbat se face dimineaa nainte de

miciune. Pictura de secreie care apare din meatul uretral, se ia cu
42

ansa, flambat i rcit, sau cu un tampon subire. Dup scopul urmrit,

materialul obinut poate fi etalat direct pe lam (lsat s se usuce i
trimis astfel la laborator) pentru examenul microscopic sau/i tamponul
este utilizat la nsmnarea imediat ori va fi plasat ntr-un recipient ce
conine mediu de transport adecvat (fig. 22 i 23).
La femeie, prelevarea secreiilor vaginale i uretrale se face din
urmtoarele locuri de elecie: orificiul glandelor Bartholin, orificiul colului
uterin i meatului urinar. Comportamentul ulterior este identic cu cel
descris mai sus n ceea ce privete descrcarea ansei i a tamponului.
Pentru cercetarea Chlamydiei sau virusurilor herpetice se
procedeaz la recoltarea materialului celular prin raclarea sau brosajul
(periajul) mucoaselor uretral (la brbat) i a endocolului (la femeie), cu
scopul de a evidenia incluziunile intracelulare date de aceste
microorganisme cu dezvoltare strict intracelular.
1.4.2.4. Recoltarea sngelui pentru examenul bacteriologic
(hemocultura)
Hemocultura este una dintre cele mai importante examinri de
microbiologie clinic. Rezultatul corect al acestei probe este esenial
pentru orientarea sau reorientarea terapeutic n septicemii.
Hemocultura se practic ori de cte ori semnele clinice (frison, cretere
brusc a febrei la 390C-400C) indic posibilitatea ptrunderii
microorganismelor n circulaie (bacteriemie).
Starea septicemic, clinic manifest, poate fi ntlnit n diferite
situaii:
boli infecioase cu bacteriemie constant (bruceloz, febr
tifoid etc.);
complicaii ale unor infecii primare sau ale unor focare de
infecie (abcese, furunculoz, meningit, pneumonie etc.);
consecutiv unor intervenii sau manevre chirurgicale;
ptrunderea agenilor infecioi prin intermediul unor vectori
(tifos exantematic, malarie).
Exist i o bacteriemie pasager la pacieni cu deficiene importante n
sistemul imunitar, dup terapie cu citotoxice, n cancer si alte situaii.
n toate cazurile n care agentul patogen este reprezentat de bacterii,
independent de situaiile mai sus amintite, hemocultura se execut dup
aceeai tehnic.
Practicarea hemoculturii n condiii speciale are loc n cazul
ptrunderii n snge a altor microorganisme (virusuri, rickettsii,
43

mycoplasme, parazii, levuri).

Momentul i numrul recoltrilor depinde de bacteriemia maxim
(prezena n snge a microorganismelor fiind pasager), care poate
precede ascensiunea febril i frisonul, de aceea se vor recolta 2-3
probe n 24 de ore, ntotdeauna naintea tratamentului antimicrobian.
Prelevarea se practic, de obicei, dintr-o ven a plicii cotului. Aseptizarea
regiunii se realizeaz prin tergerea cu un tampon mbibat cu alcool etilic
(70-95%) i apoi cu tinctur de iod.
Sngele se recolteaz n condiii de absolut sterilitate de ctre
medic, la patul bolnavului, folosindu-se n acest scop o sering Luer sau,
de preferin, un set de transfer adaptat la un balon de hemocultur care
asigur un circuit nchis. Volumul de snge necesar este de 10 ml,
adugat la 100 ml mediu lichid cu o valoare nutritiv ridicat, care
asigur dezvoltarea unor specii bacteriene ct mai variate.
Balonul de hemocultur se incubeaz, de preferin, ntr-un
container cu atmosfer de CO2 sau, n lipsa acestuia, se realizeaz o
incubare aerob la 370C, n medie 7 zile. Examinarea vizual
macroscopic se face zilnic n primele 5 zile i la sfritul perioadei de
incubare. n cazul n care, ntre timp, apare turbiditate, hemoliz,
producere de gaz sau pelicul, se efectueaz examinri microscopice,
preparat nativ i colorat Gram, precum i subculturi pe medii adecvate:
geloz-snge, geloz-chocolat, geloz-lactat, n funcie de rezultatul
examenului bacterioscopic. Inoculrile se fac att n aerobioz, ct i n
anaerobioz, urmnd s se identifice microorganismele izolate.
1.4.2.5. Recoltarea lichidului cefalorahidian (LCR)
Examinarea bacteriologic a lichidului cefalorahidian este una din cele
mai urgente probe de microbiologie clinic, dat fiind gravitatea
deosebit a meningitelor. Acest examen se practic ori de cte ori este
prezent un sindrom meningian sau chiar o stare de intoxicaie grav.
Infecia LCR i a membranelor meningiene (meningita), cu interesarea
eventual a creierului i a mduvei spinrii (meningoencefalita), apare ca
o consecin a variate situaii: invazia meningelui, pe cale hematogen,
de ctre bacteriile, virusurile sau fungii prezeni n diferite focare
infecioase de vecintate sau de la distan, ori introducerea din exterior
a germenilor patogeni n mod accidental.
Recoltarea se execut la patul bolnavului (fig.24 a i b) de ctre medicul
clinician, n condiii de absolut sterilitate, dup tehnica bine cunoscut.
Datorit presiunii crescute a LCR n meningite, acesta poate fi recoltat
direct pe ac n eprubete sterile.
44

Aspectul lichidului orienteaz medicul clinician spre operaiunile de

urgen i spre cele ulterioare. Lichidul normal este limpede ca apa de
stnc.

Fig. 24 a

Fig. 24 b

n afar de acest aspect, care nu nseamn neaprat normalitate, se

poate constata, n funcie de agentul etiologic, aspectul de:
lichid clar, incolor (fig. 25-A); tulbure (fig. 25-B), coninnd snge
(fig. 25-C);
lichid hemoragic (fig. 26): al crui supernatant este limpede
(hemoragie prin atingere accidental a vaselor); al crui supernatant este
colorat (hemoragie subarahnoidian);
lichid xantocromic (colorat glbui); opalescent, tulbure (purulent)
(fig.27).
45

Fig. 25

Fig. 26

Fig.27

n cazul unui lichid tulbure, se va proceda la o nsmnare la patul

bolnavului a 0,2 0,5 ml LCR n tuburi cu diferite medii sau se va
transporta imediat flaconul cu LCR la laborator, meninndu-se la
temperatura de 370C. Laboratorul va continua explorarea.
1.4.2.6. Recoltarea exsudatelor i transsudatelor din seroase
(lichide pleurale, peritoneale i articulare)
46

Exsudatele i transsudatele cavitilor nchise reprezint reacia de

tip inflamator sau neinflamator a seroaselor respective fa de anumii
excitani, ducnd la acumularea de lichid ntre membrana visceral i
cea parietal.
Prelevarea lichidelor amintite se efectueaz n mod obligatoriu prin
puncie cu seringa, n condiii de asepsie foarte riguroas. ntruct n
aceste produse se gsesc adeseori bacterii anaerobe, se vor lua msuri
ca lichidele s nu vin n contact cu aerul (seringa s nu conin bule de
aer), iar pentru nsmnarea n condiii anaerobe este indicat transportul
acestora n seringa folosit pentru recoltare, cu acul nfipt ntr-un dop de
cauciuc steril.
1.4.2.7. Prelevarea secreiilor purulente din coleciile deschise
Secreiile purulente rezultate din infeciile pielii i din plgile de
diferite categorii (traumatice, chirurgicale, arsuri), conin ageni
microbieni foarte diferii, adeseori, n asociere. Astfel, bolile pielii i
esuturilor subiacente sunt dominate de piodermitele stafilococice
(foliculite, hidrosadenite, panariii, furunculoze etc.) i streptococice
(impetigo, panariii, ectime etc.), singulare sau n asociere. Alte infecii,
subacute sau cronice, ale pielii sunt cauzate de variate bacterii
patogene.
Prelevarea se poate face n orice unitate sanitar dac examenul
se limiteaz la bacterioscopie. n general, recoltarea se face, ns, n
scop de cultivare. Din coleciile purulente relativ profunde, neabcedate,
prelevarea se face prin puncie, dup aseptizarea regiunii respective. n
cazul plgilor profunde, insuficient drenate, fistulizate, se recolteaz
produsul de la baza leziunii, n sering sau n tuburi. Din leziunile
cutanate superficiale nchise (vezicule, pustule, furuncule) se indic
prelevarea prin puncionare cu pipeta Pasteur (flambat i rcit), dup
aseptizarea regiunii cu alcool i apoi splare cu ser fiziologic steril. n
unele situaii, se iau msuri de recoltare n vederea izolrii bacteriilor
anaerobe.
1.4.2.8. Probe de exerez chirurgical i necroptice
Examenul microbiologic al acestor probe poate constitui, n unele
cazuri, singurul mijloc de diagnostic etiologic al unei infecii. Eficacitatea
acestui examen depinde de respectarea unor condiii, dintre care mai
importante sunt: recoltarea unei probe din zona implicat n procesul
infecios; evitarea contaminrii produsului n cursul recoltrii; efectuarea
47

necropsiei n primele 6 ore dup deces; efectuarea nsmnrilor pe o

varietate mare de medii.
Se recolteaz prin puncie-biopsie: esut ganglionar, medular,
hepatic, pulmonar etc. n caz de necropsie, se recolteaz snge din
inim, organe, esuturi i colecii purulente. Deoarece n astfel de
produse se gsesc frecvent bacterii anaerobe, este recomandabil
recoltarea pentru anaerobioz i, pe ct posibil, nsmnarea pe loc.

48

1.5. METODE DE IZOLARE I DE IDENTIFICARE A

BACTERIILOR
1.5.1. Cultivarea
Etap principal n stabilirea unui diagnostic etiologic,
cultivarea bacteriilor include:
nsmnarea prelevatelor;
examinarea coloniilor (culturilor) i repicarea lor n vederea
identificrii.
1.5.1.1. nsmnarea prelevatelor
Izolarea agenilor microbieni dintr-un prelevat sau a unei bacterii
cu potenial patogen dintr-un produs pluricontaminat izolare numit i
cultur primar este hotrtoare pentru diagnostic cnd rezult din
produse normal lipsite de microorganisme (LCR, snge, lichide pleural,
peritoneal, articular) sau are valoare orientativ mare cnd provine din
produse n care predomin flora bacterian comensal (tract respirator,
digestiv etc.).
n scopul izolrii bacteriilor, se practic nsmnarea prelevatelor
pe medii de cultur potrivite, la suprafaa sau n profunzimea acestora.
nsmnarea primar necesit medii cu potenialitate deosebit,
care s permit dezvoltarea unei mari varieti de bacterii, iar inocularea
trebuie executat n aa fel nct s obin o cultur reprezentativ pe
medii lichide i colonii izolate pe medii solide.
O colonie reprezint o populaie bacterian, omogen, provenit
dintr-o singur celul. Genetic, aceast populaie reprezint o clon.
Prelund cu ansa bacteriologic o singur colonie i nsmnnd-o pe
un alt mediu de cultur adecvat repicare se obine o cultur pur,
care poate fi studiat n continuare n vederea identificrii.
nainte de inoculare, mediile se prenclzesc, operaie care este
absolut obligatorie pentru bacteriile termosensibile ca neisseriile
patogene, pneumococi, haemophili etc.
Inocularea se execut cu ansa, tamponul sau cu pipeta Pasteur.
Ansa este mai frecvent utilizat pentru inoculare. Se depune inoculul pe
un sector limitat al plcii Petri, cu ansa, cu tamponul pe care s-a fcut
prelevarea sau cu pipeta Pasteur. Apoi, cu ansa sterilizat i rcit se
disperseaz inoculul pe aproximativ o treime din suprafaa plcii (fig.28
sector 1). Se flambeaz ansa i apoi se fac striuri perpendiculare pe
49

primele i pornind de la aceasta (fig.28 sector 2), dup care se

flambeaz din nou i se continu dispersia n striuri pe restul suprafeei
plcii (fig. 28 sector 3).

Fig. 28 Sensul micrii ansei (1, 2, 3, sectoarele de dispersie)

Dac inoculul nu este prea bogat, se poate proceda la dispersia

continu n striuri perpendiculare, fr flambarea intermediar a ansei,
pn la epuizarea inoculului. Astfel se vor obine colonii izolate (fig. 29).

Fig. 29 Colonii izolate din care se va face repicarea pentru subcultur

n afara depunerii inoculului pentru o ulterioar dispersie cu ansa,

nsmnarea cu pipeta Pasteur este indicat pentru inocularea n serie
a tuburilor cu medii lichide sau solide nclinate.
nsmnarea direct cu tamponul se practic pentru unele produse,
cnd acestea se inoculeaz pe geloz nclinat (fig. 30) sau pe medii de
conservare (fig. 31).
nsmnarea n profunzime a mediilor solide se poate face
prin nepare cu o ans bacteriologic dreapt sau prin nglobare n
mediu topit, pentru: cercetarea mobilitii bacteriilor, a unor proprieti
biochimice, cultivarea anaerobilor (vezi diagnosticul infeciilor cu
50

anaerobi).

Fig. 30

Fig. 31

1.5.1.2. Examinarea culturilor

Mediile de cultur nsmnate, dup incubare la 37C, se
examineaz sub aspectul dezvoltrii coloniilor pe mediile solide i a
caracterelor de cultur pe mediile lichide.
Perioada de incubare obinuit este peste noapte, dar n
cazul mediilor selective, se va prelungi la 48 ore i la 5 zile pentru
bacteriile cu dezvoltare lent (haemophil, meningococ, gonococ, yersinia
etc.). Urmrirea plcilor incubate anaerob, se va face la 24-48-92 ore;
pentru plcile Sabouraud 2-5 zile, iar pentru mediul Lwenstein 5-8
sptmni.
Se noteaz aspectul culturii, numrul i felul coloniilor pe diferite medii;
chiar i absena creterii pe un anumit mediu poate s constituie un
factor relevant.
51

Caracterizarea culturilor n medii lichide

Gradul dezvoltrii: absent, srac, moderat, abundent.
Turbiditatea - absent sau prezent: moderat, intens,
uniform, granulat, floconar; majoritatea bacteriilor tulbur uniform
mediul; altele se sedimenteaz i supernatantul rmne limpede.
Depozitul - absent sau prezent: puin, abundent, granular,
floconar.
Creterea la suprafa - absent sau prezent: cu inel sau pelicul
subire sau groas.
Culoarea - absent sau prezent: verde (pentru bacilul
piocianic).
Mirosul - absent sau prezent: aromat (piocianic), fetid (anaerobi).

Aspectul culturilor pe medii solide

Pentru descrierea aspectului culturii sau a coloniilor pe plci, se vor nota
cel puin o parte din urmtoarele caracteristici (fig.32):
relieful: turtit sau bombat, redus, pronunat, ombilicat, cu
suprafa neted sau rugoas, mucoid;
conturul: bine delimitat, circular, dantelat, cu prelungiri;
opacitatea: transparente, translucide, opace;
culoarea: alb, pigmentare aurie, rou etc.
consistena: mucoas, untoas, friabil, cremoas;
suspendarea n ser fiziologic: omogen sau granular.
n funcie de aceste caracteristici, se deosebesc dou tipuri de colonii:
colonii de tip S (smooth = neted) cu suprafa bombat, neted,
lucioas, contur bine delimitat, consisten cremoas, uor
emulsionabil;
colonii de tip R (rough = rugos), cu suprafaa turtit, neregulat,
contur crenelat, uscate, cu suspensii granulare.
Importana diagnostic a acestor aspecte este dat de faptul c
majoritatea speciilor patogene se dezvolt sub form de colonii S.
Excepie fac bacilul difteric, crbunos i bacilul tuberculozei, care se
izoleaz de la bolnavi i sunt patogene n forma R.

52

Fig. 32 Aspectul coloniilor pe medii solide (mrime normal).

(A) Staphylococcus epidermidis pe agar nutritiv; (B) Streptococcus faecalis pe
agar lactozat cu indicator rou neutru (colonii punctiforme); (C) Shigella sonnei
pe agar nutritiv (colonii S i R); (D) Klebsiella pneumoniae pe agar nutritiv
lactozat (colonii mucoide datorate produciei viguroase de polizaharide
capsulare).

Alte caracteristici
Pe plcile de snge se urmrete tipul hemolizei: alpha, beta
i gamma; precum i raportul dintre aria de hemoliz i mrimea coloniei
(plana II-3).
Pe mediile difereniale i selectiv-difereniale se apreciaz
frecvena coloniilor lactozopozitive sau lactozonegative (plana II-4).
Repicarea coloniilor bacteriilor potenial patogene, dup
aspectul coloniei, natura prelevatului, rezultatele examenului
bacterioscopic, cu scopul de a obine culturi pure, este obligatorie.
Aceast repicare se recomand a fi fcut cu ansa n form de bucl
fin (sau fir de ans fr bucl), astfel nct 1/2 din colonie s fie trecut
53

pe mediul de repicare, iar cealalt jumtate pe frotiu, operaie necesar

pentru antibiogram i, mai ales, pentru identificare.

1.5.2. Principalele metode de identificare a agentului

etiologic
Scopul final al examinrii oricrui prelevat este identificarea agentului
etiologic, care n unele situaii se poate realiza pe baza datelor oferite de
caracterele morfotinctoriale i cultur. n cele mai multe cazuri este
nevoie de completarea informaiilor amintite cu cele oferite de:
caracterele metabolice generale (de gen) i particulare (de
specie);
caracterele antigenice;
caracterele proprietilor de patogenitate ale bacteriei n cauz.
1.5.2.1. Teste metabolice de identificare
n investigarea proprietilor metabolice, accentul este pus pe
cele generale: catalaza, oxidaza, testele de fermentare-oxidare (F-O) ale
glucozei i producerea de gaz. Pentru determinri suplimentare se mai
folosesc i alte teste.
Catalaza
Catalazele sunt enzime care catalizeaz descompunerea
apei oxigenate n ap i oxigen:

2H2O2 + catalaz

2O

+ O2

Testul este pozitiv dac bacteriile au metabolism oxidativ, i

se execut prin descompunerea pe suprafaa culturii a soluiei reactiv
(hidrogen peroxid H2O2 15%), fie n tubul cu cultur, fie ntr-o
suspensie de cultur pe lam. Apariia bulelor de gaz denot un rezultat
pozitiv.
Testul fermentare-oxidare (testul F-O)
Principiul. Modul de degradare a glucozei sau altui substrat
de ctre bacterii: pe cale fermentativ (F) prin fosforilare; prin oxidare
direct (O) sau prin ambele modaliti (F+O).
54

Se utilizeaz o geloz semimoale, tamponat i cu adaos de

glucoz sau alt substrat, i un indicator de pH (albastru de bromtimol).
Mediul repartizat n tuburi se nsmneaz n toat coloana. Dup
incubare, prin degradarea substratului cu formare de acizi, indicatorul va
vira n galben.
Bacteriile care degradeaz oxidativ glucoza, vireaz n galben numai la
suprafa. Bacteriile care degradeaz oxidativ i fermentativ glucoza, vor
vira n galben toat coloana mediului, iar cele care degradeaz
fermentativ substratul, vireaz coloana mediului n galben numai n
profunzime (anaerobii).
Oxidaza
Este o enzim oxidativ prezent la unele specii bacteriene,
care acioneaz asupra unor amine aromate producnd compui
colorai. Fiind pozitiv la grupul Neisseria, se folosete curent n
identificarea meningococilor i gonococilor.
Pentru executarea testului sunt mai multe procedee, dintre
care metoda Kovacs este frecvent folosit. Aceasta const n mbibarea
unei fii de hrtie de filtru n reactivul pentru oxidaz, pe care se aplic
o poriune din colonie, cu ansa. Testul pozitiv se traduce prin apariia
culorii purpurii n decurs de 10 secunde.
Fermentarea hidrailor de carbon
Utilizeaz medii de cultur cu bulion de baz pentru
fermentaie, care conine unul din carbohidrai: glucoz, lactoz,
zaharoz, manit, dulcit.
Mediile cu pH de 7,1-7,2 (indicatori: bromthymol blau sau
bromcrezol purpur), repartizate n tubuoare de fermentaie, se
inoculeaz cu o cantitate mic dintr-o cultur tnr (18-20 ore de
incubare). Incubate la 37C, se examineaz zilnic 4-5 zile, notndu-se
producia de acid (prin virarea mediului) i volumul de gaz produs de
bacteriile aerogene. Testul este util identificrii grupurilor principale de
Enterobacteriaceae.
Testul Voges-Proskauer
Unii germeni au capacitatea ca prin fermentaia acetonic s
degradeze acidul piruvic (rezultat din desfacerea glucozei) i s dea
natere la acetilmetil carbinol, care este oxidat n prezena aerului i n
55

mediu alcalin pentru a forma diacetil, ce poate fi evideniat printr-o

reacie chimic.
Institutul Cantacuzino prepar o soluie de cupru
amoniacal pentru efectuarea testului. La 1 ml cultur, se adaug 1 ml
soluie cupru amoniacal. Citire dup 20 de minute. Rezultat pozitiv:
apariia unei culori roii.

Testul beta-galactozidazei
Pentru identificarea multor bacterii, degradarea lactozei prin
beta-galactozidaze are mare importan. Prezena enzimei se deceleaz
prin determinarea colorimetric a ortonitrofenolului eliberat dintr-un
substrat ONPG (ortonitrofenil galactozid), atunci cnd este pus n contact
cu o suspensie bacterian dens.
La o suspensie n soluie salin fiziologic de cultur, se
adaug o rondel mbibat cu ONGP. nclzind eprubeta n palm,
soluia devine galben (la testul pozitiv), datorit formrii
ortonitrofenolului sub aciunea beta-galactozidazei. Testul este pozitiv
pentru Escherichia coli.
Testul producerii de indol
Unele bacterii, prin enzima triptofanaz, catalizeaz
triptofanul, ducnd la formarea de indol. Acest produs, n prezena
reactivului, duce la formarea de nitrozoindol de culoare roie (fig. 33).
Testul se poate efectua uor prin folosirea de benzi pentru
reacia indolului, preparate de Institutul Cantacuzino. Acestea se
ataeaz la dopul tubului cu mediu (ap peptonat sau mediu MIU),
astfel nct, captul poriunii impregnate cu reactiv s ajung la un cm
deasupra mediului. n caz de pozitivare, apare o culoare roie n 24 de
ore. Testul este pozitiv la Escherichia coli.
Testul decarboxilazelor
Prezena enzimelor care pot decarboxila aminoacizii, la unele
bacterii, face din acesta un test important pentru identificarea
enterobacteriilor.
Sunt folosii ca substraturi urmtorii aminoacizi : lizina, arginina i
ornitina. Fiecare din acetia, sunt decarboxilai de o enzim specific, cu
eliberare de CO2 i a aminei corespunztoare.
56

Producerea de hidrogen sulfurat

Unele microorganisme posed o enzim din grupul liazelor
(C-S-liaze), care acioneaz pe substane organice derivate din pepton,
ca cisteina, cistina sau pe produi anorganici ca sulfurii-tiosulfurii, dnd
natere la H2S (hidrogen sulfurat), care intr n combinaie cu srurile de
fier sau de plumb, producnd sulfuri de culoare neagr.
Tehnica de referin pentru testarea formrii de H2S, este folosirea
mediului TSI, preparat de Institutul Cantacuzino.

Fig. 33 Testul producerii de indol. Tubul din stnga arat un test pozitiv
(inel rou). Tubul din dreapta cu testul indol negativ (inel galben).

Pentru efectuarea testului, mediul se nsmneaz prin

depunerea culturii n striuri, pe partea nclinat, i prin neparea prii
drepte. n majoritatea cazurilor, reacia pozitiv apare n 24 de ore, i se
evideniaz prin nnegrirea coloanei drepte a mediului.
O alt tehnic pentru folosirea formrii de H2S, const n
folosirea de benzi de hrtie impregnate cu o soluie de acetat de Pb, care
se depune n tubul de cultur.
Testul ureazei
Enzima ureaz, prezent la unele bacterii, are capacitatea de
57

a scinda ureea, cu eliberarea de CO2 i NH3. Producerea de amoniac, se

nsoete de virarea spre alcalin a mediului, decelabil prin indicatorul
rou fenol. Testul este util n identificarea germenilor din genurile Proteus
i Yersinia, i se execut pe mediul MIU, livrat de Institutul
Cantacuzino. Reacia pozitiv: virarea spre rou (fig. 34).

Fig. 34 Testul ureazei. Tubul din stnga cu testul ureazei pozitiv

(culoare roie). Tubul din dreapta cu testul ureazei negativ (culoare galben).

Testul fenilalanindesaminazei
Bacteriile din grupul Proteus, posed o enzim care
acioneaz pe substratul fenilalanin i duce la formarea de acid betafenilpiruvic, iar acesta, n prezena ionilor de fier, formeaz fenil-piruvat
de fier, de culoare verde.
Institutul Cantacuzino prepar att mediul cu substratul
respectiv, ct i reactivul clorur feric 10%.
Mediul se folosete n poziie nclinat, i se inoculeaz bogat
dintr-o cultur tnr, pe geloz. Incubare la 37C, timp de 4 ore picturi
din reactiv, i, prin nclinare, se face contactul cu cultura. Testul pozitiv,
se traduce prin apariia unei culori verzi a lichidului i a gelozei nclinate.
Utilizarea citratului ca surs de carbon
n acest scop, se folosete mediul Simmons, preparat de
58

Institutul Cantacuzino. Pentru utilizare, mediul se topete, se

repartizeaz n tuburi i se rcete n poziie nclinat.
Germenii care folosesc citratul, vor crete producnd prin metabolii
alcalini o virare n albastru a mediului.
Martor pozitiv: Salmonella, Klebsiella.
Martor negativ: Shigella, Escherichia coli.
Dezvoltarea pe mediu cu acetat
Escherichia coli folosete acetatul ca unic surs de carbon
(prin ciclul glioxilic) i se dezvolt pe un mediu minimal, care conine
acetat de sodiu i un indicator de pH. Prin acest test poate fi difereniat
genul Escherichia de genul Shigella, care nu poate utiliza acetatul ca
unic surs de carbon.
Sisteme de echipamente (kituri) comerciale
Sistemele de identificare biochimic miniaturizate sunt obinute din surse
comerciale, de exemplu sistemele API (fig. 35). Acestea sunt compuse
dintr-o plac de plastic avnd cupe mici (miniaturizate) care conin
substane deshidratate. Fiecare cup are un mic orificiu la vrf. Pentru
efectuarea testului, o suspensie salin (ser fiziologic) coninnd cultur
dintr-un microorganism este introdus cu o pipet Pasteur n orificiul
cupelor pn la umplere, placa de plastic se acoper apoi cu un capac i
se plaseaz ntr-o camer umed din plastic, cu care se incubeaz la
370C, pentru 24 48 ore.
Profilele biochimice se determin prin citirea modificrilor de culoare, iar
interpretarea se face conform unui grafic.
Rezultatele sunt convertite printr-un cod numeric care poate fi citit, dnd
posibilitatea identificrii microorganismului izolat.
Exist mai multe sisteme API pentru diferite grupe de microorganisme,
ca de exemplu: API 20 E i API 20 NE pentru enterobacterii; API 20
STREP pentru streptococi etc.

59

Fig. 35 Dou plci API cu reacii biochimice pentru dou tipuri diferite de
microorganisme.

1.5.2.2. Teste complementare de identificare

Alturi de testele metabolice, se folosesc n mod curent i
alte proprieti ale bacteriilor, care faciliteaz identificarea germenilor
patogeni.
Testul mobilitii
Se execut n mod obinuit, nsmnnd prin nepare, pe o
adncime de 5 mm, un tub cu geloz dreapt 0,4%. Se incubeaz la
37C. Este indicat ca inoculul s provin de pe un mediu care
favorizeaz dezvoltarea flagelilor (bulion sau geloz 0,2%).
Martor pozitiv: Escherichia coli, Proteus.
Martor negativ: Shigella.
Testul la bacitracin
Se bazeaz
-hemolitici de
grup A de a fi inhibai de o anumit concentraie din acest antibiotic.
Acest test servete la separarea preliminar a streptococilor de grup A,
considerai ca avnd un potenial patogenic deosebit.
Se utilizeaz discuri de bacitracin difereniale, care conin
0,04 U/disc innd seama de faptul c discurile antibiograme, cu o
concentraie de 10 U/disc, nu sunt adecvate pentru acest test.
Testul se efectueaz prin inocularea unei culturi de
streptococi, pornind de la colonii izolate din cultura primar, pe plci cu
60

geloz-snge, peste care se depune discul de bacitracin. Obinerea

unei zone de inhibaie de cel puin 8 mm diametru, caracterizeaz
streptococii de grup A. Se supun acestu
-hemolitici,
inclusiv pneumococii, pot fi sensibili la bacitracin.
Testul la optochin
Servete la separarea pneumococilor de streptococii
hemolitici, folosind discuri impregnate cu 5 mcg optochin.
Culturi pure de pneumococi de pe mediul lichid sau colonii de
pe geloz-snge, se etaleaz n strat subire pe geloz-snge, peste
care se depune discul cu optochin. Se incubeaz la 37C, aerob.
Un test pozitiv este dat de o zon de inhibiie de minimum 9
mm diametru.
1.5.2.3. Identificarea dup caracterele antigenice
Definirea caracterelor antigenice are o valoare diferit, de la
o bacterie la alta. Astfel, n identificarea germenilor din grupurile:
Salmonella, Shigella i Vibrio cholerae, procedeul este indispensabil. n
alte cazuri, determinarea structurilor antigenice are valoare mai redus
(meningococi, streptococi, pneumococi, grupurile Brucella i Bordetella),
n comparaie cu proprietile morfologice, culturale i metabolice pe care
aceste determinri le completeaz. Uneori, procedeul se folosete
pentru precizarea caracterelor de subspecie (serotip), nu ntotdeauna
necesare pentru orientarea terapeutic.
Cercetarea caracterelor antigenice se efectueaz n mod predilect
prin reacia de aglutinare pe lam sau n tuburi, cu seruri imune (seruri
de animale imunizate cu antigene bacterii cunoscute), de unde i
denumirea de identificare serologic. n unele cazuri se folosesc i alte
reacii antigen-anticorp pentru identificarea bacteriilor patogene. Astfel,
pentru definirea grupului Streptococcus, se utilizeaz reacii de
precipitare.
1.5.2.4. Determinarea caracterelor de patogenitate
Cercetarea proprietilor de patogenitate in vivo sau in vitro,
prin reproducerea infeciei experimentale la animale de laborator (oareci
albi, cobai, iepuri) sau evidenierea toxinogenezei (eliberri de toxine),
ct i a unor produi extracelulari netoxici, ofer posibiliti de identificare
61

sigur pentru un numr redus de germeni, al cror diagnostic de

certitudine este ns deosebit de important, dat fiind gravitatea bolii.
Testele de patogenitate in vivo
Se face apel la determinare caracterelor de patogenitate ale
bacteriilor, prin inoculri la animale de laborator, pentru germenii care
dau antraxul, tetanosul, tuberculoza etc.
Inocularea la animale a unei suspensii dintr-o cultur de
bulion, subcutan, la oarecele alb:
n caz de infecie cu bacil crbunos (Bacillus anthracis),
determin septicemie i moartea animalului n 24-48 ore;
n infecia tetanic (Clostridium tetani), dup 9-10 zile se
instaleaz boala cu simptomatologie caracteristic.
Demonstrarea patogenitii reprezint deci un test obligatoriu
pentru identificarea bacilului crbunos i testul cel mai sigur de
identificare a bacilului tetanic.
Inocularea subcutanat, la cobai, a unei suspensii de cultur sau
filtrat al unei culturi de bacil difteric, duce la moartea animalului
neprotejat cu ser antidifteric, n 24-96 ore. Inocularea toxinei la aceste
animale, permite stabilirea unitilor de msur in vivo a toxinei, care
este doza limit mortal.
Testul kerato-conjunctivitei la cobai, demonstreaz proprietile
invazive ale bacteriilor din grupul Escherichia coli (tulpini invazive), i a
bacililor dizenterici Shigella (amnunte n capitolele urmtoare).
Dermatonecroza la iepure (testul Fraser), dup inocularea
intradermic a unui filtrat de cultur de bacil difteric toxigen
(Corynebacterium diphtheriae), evideniaz proprietatea de patogenitate
a germenilor din acest grup.
Testul ansei ligaturate la iepure, evideniaz enterotoxina tulpinilor
enterotoxigene de Escherichia coli, Vibrio cholerae, Pseudomonas etc.
Testul Dolman, pentru evidenierea enterotoxinei termorezistente a
stafilococului patogen, responsabil de producerea toxinfeciilor
alimentare stafilococice.
Teste de patogenitate in vitro
Dei izolarea dintr-un produs, a unui agent etiologic, confer
acestuia atribut de germen patogen, frecvent se utilizeaz teste de
patogenitate n vitro, n vederea identificrii unora din aceste bacterii,
punnd n eviden: toxigeneza (testul Elek); coagulaza; fibrinoliza;
62

lizotipia etc. (descrise n capitolele urmtoare).

1.5.2.5. Identificarea rapid a microorganismelor prin metode ale
biologiei moleculare
Identificarea microorganismelor prin metode de biologie molecular este
posibil la ora actual prin sonde de ADN i prin amplificarea genic a
acizilor nucleici, metode de depistare i identificare rapid a unor
microorganisme care se cultiv lent sau nu se pot cultiva.
Sondele moleculare ADN
Sondele ADN sunt utile att pentru detectarea rapid a unor
microorganisme n prelevatele patologice, ct i pentru identificarea unor
bacterii sau fungi cultivate n medii lichide i pentru care sunt
comercializate aceste sonde.
Metodele de utilizare a sondelor ADN sunt standardizate i permit
detectarea direct a unor bacterii n produsele patologice, cum sunt:
Chlamydia trachomatis, Gardnerella vaginalis, Neisseria gonorrhoeae,
Streptococcus pyogenes de grup A etc. De asemenea, se pot detecta
protozoare (Trichomonas vaginalis), fungi (Candida spp.) i virusuri
(Papillomavirusuri umane). Un numr mare de specii bacteriene i fungi
pot fi identificate rapid din culturi prin aceast tehnic de hibridare cu
sonde ADN.
n prezent, trei metode de hibridare cu sonde ADN sunt mai frecvent
folosite: hibridarea n faz solid, n soluie i in situ.
Hibridarea n faz solid este mai mult utilizat n cercetare i n unele
laboratoare clinice ca o metod slot blot sau dot blot, n care celulele
intacte sunt lizate, ADN-ul denaturat i aspirat de o membran de nylon,
sub form de dot (pictur) i apoi fixat pe membran, astfel nct
membrana de nylon particip la reacia de hibridare, fiind imersat ntr-o
soluie care conine sonda ADN-receptor. Sondele receptor nelegate sunt
eliminate prin splare i astfel poate fi detectat numai sonda legat.
Dot blot poate fi folosit ca i o variant sandwich, care utilizeaz dou
sonde ce se leag la situsuri diferite pe acidul nucleic int. Acest sistem
este uneori mai sensibil dect hibridarea standard pe membran i
63

utilizeaz de obicei, truse comercializate pentru identificarea unor tulpini

de Papillomavirusuri umane. Alte variante de hibridare n faz solid
sunt: southern-blot, care permite determinarea mrimii fragmentelor ADN
legate la zona receptor i northern-blot, n care sonda receptor este
folosit pentru detectarea ARN-ului.
Hibridarea n soluie utilizeaz mai multe surse i truse de sonde ADN, n
care att acidul nucleic, ct i sonda sunt libere i reacioneaz n mediul
lichid. Metoda uzual este hibridarea de protecie - hybridization
protection assay (HPA) n care sonda ADN marcat cu un ester de
acridin este hibridat cu ADN int i apoi tratat cu alcali, astfel c
dup adugarea peroxizilor, esterul de acridin emite lumina detectabil.
Hibridarea in situ apare pe esuturi infectate i utilizeaz seciuni
histopatologice fixate cu formaldehid i parafinate, dup care are loc
procesarea esutului n aa fel nct morfologia tisular s fie pstrat,
dar n acelai timp s aib loc denaturarea acizilor nucleici din celule
pentru a-i face accesibili sondelor, care sunt relativ mici (cu 300 baze),
pentru a avea accesibilitate mai mare n celul.
Tehnici de amplificare a acizilor nucleici
Exist mai multe metode de amplificare a acizilor nucleici in vitro,
procesul amplificrii fiind oarecum analog cu cultivarea unui
microorganism, prin amplificare reuindu-se dublarea enzimatic i a
secvenelor specifice de acizi nucleici a unui microorganism sau a unei
game variate de microorganisme. Aceste procedee au un avantaj
selectiv fa de cultivare, n sensul c nu sunt limitate de capacitatea de
cretere a microorganismului pe medii artificiale.
PCR (Polymerase Chain Reaction) este metoda cea mai cunoscut i
mai frecvent utilizat, fiind o tehnic bazat pe capacitatea ADNpolimerazei de a copia o caten de ADN i astfel fiecare ciclu de reacie
dubleaz cantitatea de ADN int.
Principiul metodei const n: amplificarea unei matrie de ADN (secvena
de amplificat) prin polimerizri succesive; doi oligomeri de sintez
servesc drept amors i confer specificitatea reaciei; dup denaturare,
64

fiecare lan nou sintetizat servete drept matri.

Tehnica pentru amplificarea acizilor nucleici are nc o aplicare limitat la
laboratoarele mari de referin i de cercetare, deoarece metoda poate
da rezultate fals pozitive datorate contaminrii, iar pe de alt parte,
automatizarea acestor tehnici este foarte scump i laborioas. Cu toate
acestea, laboratoarele clinice beneficiaz de metode de amplificare
genic pentru detectarea n produse patologice a micobacteriilor,
meningococilor, gonococilor, chlamydiilor, treponemelor, a virusurilor
hepatitei C, virusului citomegalic etc., cu posibiliti de lrgire a acestei
liste n diagnosticul infeciilor bacteriene i virale, dar i a unor boli
datorate mutaiilor genetice sau n tipizarea HLA n transplantul de
organe, prin multiplele variante ale PCR existente la ora actual.

1.5.3. Testarea sensibilitii bacteriilor patogene la

antibiotice-antibiograma
Antibiograma sau testarea sensibilitii unei tulpini bacteriene la
chimioterapice, se bazeaz pe capacitatea acestor ageni de a opri
multiplicarea bacterian efect bacteriostatic sau de a omor bacteriile
efect bactericid.
Introducerea n terapie a unui antibiotic sau chimioterapic,
fiind o operaie de mare responsabilitate medical, cere respectarea unor
condiii:
antibiograma se face dup izolarea n cultur pur i identificarea
agentului patogen;
n cazuri de urgen, tratamentul se instituie fr antibiogram,
numai dup recoltarea produselor patologice necesare;
antibiograma trebuie repetat dac tratamentul cu antibiotice
este de durat mai lung, deoarece agentul patogen poate s ctige
rezisten fa de antibioticul utilizat.
Dintre multiplele metode, procedee i variante, pentru laboratorul clinic sa produs standardizarea antibiogramei, recomandndu-se metoda
difuzimetric, varianta Kirby-Bauer ca metod de rutin, alturi de tehnici
prin diluii n medii lichide folosite n cercetare.

65

1.5.3.1. Metoda difuzimetric

Principiul
Prin depunerea discurilor (microcomprimate) cu antibiotice pe
suprafaa unui mediu solid, nsmnat cu o cultur bacterian,
substana antimicrobian activ va difuza n mediu. Dup un timp de
incubaie la 37C - perioada critic se vor contura 2 zone distincte: una
n care creterea bacterian este inhibat, i o zon de cretere n care
concentraia de antibiotic este mai mic sau bacteria este rezistent la
antibioticul respectiv.
Cu ct diametrul zonei de inhibiie este mai mare cu att germenul este
mai sensibil, iar cantitatea de antibiotic necesar inhibiiei este mai mic
(concentraia minim inhibitorie = CMI). Comparnd CMI-ul cu nivelul de
antibiotic care se poate obine n organism n timpul tratamentului, s-a
putut formula care sunt diametrele (i implicit nivelurile) critice pentru
fiecare antibiotic, permind clasificarea germenilor studiai n sensibili
(S), rezisteni (R) i intermediari (I) fa de antibioticul n cauz.
Tehnica
Condiiile tehnice care concur la efectuarea antibiogramei,
pot influena diametrul de inhibiie, astfel c mediul de cultur
(compoziia, pH-ul), inoculul, felul discurilor (microcomprimatelor) sunt
standardizate.
Mediul de cultur este geloza Mueller-Hinton, care are o
valoare nutritiv mare, permite dezvoltarea optim a unei varieti de
germeni, i nu conine inhibitori. Pentru testarea sensibilitii
streptococilor beta-hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, a unor
enterococi, geloza Mueller-Hinton se suplimenteaz cu snge de oaie
(5%).
Inoculul preparat din cultur se face din 4-6 colonii identice,
pentru a cuprinde un numr ct mai mare de germeni din populaia
bacterian ce poate prezenta variaii de rezisten (inoculul
reprezentativ). Mrimea inoculului este standardizat prin metoda
nefelometric, i este corespunztoare opacitii dintr-un tub cu sulfat de
bariu care corespunde la un coninut de aproximativ 5x10-9x10 germeni /
ml, n funcie de specia microbian.
Substanele antimicrobiene pentru antibiogram, sunt livrate
sub form de microcomprimate pentru antibiogram de ctre Institutul
Cantacuzino. Fiecare disc sau microcomprimat de 6 mm diametru
66

are notat simbolul antibioticului.

Depunerea inoculului pe suprafaa mediului de cultur, se face cu
pipete Pasteur, cu care apoi se va acoperi uniform ntreaga suprafa a
plcii Petri, dup care se ndeprteaz excesul. Se las s se usuce
suprafaa mediului, capacul plcii rmnnd uor ridicat. Se depun
microcomprimatele, lsnd ntre ele o distan corespunztoare i se
incubeaz la 37C, timp de 18 ore.
Citirea i interpretarea rezultatelor
Citirea se face cu ochiul liber, msurnd diametrul zonei de
inhibiie n mm, cu ajutorul unei rigle sau pe o schem grafic (fig. 36).
Se apreciaz inhibiia complet a creterii, aa cum se
observ cu ochiul liber. Se iau n considerare i eventualele colonii
izolate, bine dezvoltate, aprute n interiorul zonei de inhibiie, deoarece
acestea pot reprezenta mutante rezistente, n cadrul unei populaii
microbiene predominant sensibile.
Lectura se face pentru fiecare antibiotic, msurnd diametrul
de inhibiie, i comparnd acest diametru cu standardele diametrelor
critice stabilite prin folosirea unor tulpini de referin cu CMI precizat, i
trecute ntr-un tabel interpretativ ntocmit conform unor standarde, n
funcie de familia de antibiotice i specia bacterian izolat, supus
testrii.

Fig. 36 Antibiogram prin metoda difuziunii n geloz (A,B,C,D,E: discuri cu

antibiotice diferite)

Exprimarea rezultatelor antibiogramei n buletinul de analiz,

67

se face prin notarea direct de: S (sensibil), R (rezistent) sau I

(intermediar), trecut n dreptul simbolului sau al denumirii antibioticului
(fig. 37).
n interpretarea rezultatelor, se ine seama de faptul c, prin
antibiogram, se ofer medicului clinician numai unele indicaii privind
CMI-ul pentru germenul n cauz, care poate fi corelat difuzimetric cu
nivelul concentraiei sanguine, urinare etc. Este obligaia clinicianului de
a seleciona pe baza rezultatului antibiogramei antibioticul cel mai
adecvat pentru terapie, n funcie de caracterele de sensibilitate ale
germenului patogen, de proprietile farmacologice ale antibioticului, de
modul de aciune i de toxicitatea medicamentului.
1.5.3.2. Tehnici prin diluii n mediul lichid
Metoda diluiilor n medii lichide, permite determinarea
sensibilitii microorganismelor la antibiotice, i mai ales CMI-ul,
permind o confruntare ntre nivelul acestuia cu nivelul de antibiotic care
se poate obine n organism (la nivelul focarelor infecioase).

Fig. 37 Interpretarea antibiogramei: bacteria testat este sensibil la

cloramfenicol (discul 2) i gentamicin (discul 4), intermediar la ampicilin
(discul 1) i rezistent la eritromicin (discul 3)

n plus, aceste tehnici permit dozarea nivelelor de antibiotice din umorile

68

organismului, teste necesare monitorizrii tratamentului antibacterian,

mai ales n infecii severe (endocardite, septicemii, meningite,
osteomielite etc.), cnd se testeaz efectul bactericid sau nivelul de
eficien bactericid din serul sangvin sau alt lichid biologic (Ex.: cea mai
mare diluie de ser sangvin care omoar cel puin 99,9% din bacteriile
testate).
Actual, diferite sisteme automatizate, fac apel la mediile de cultur
lichide ce conin antibiotice, permind evidenierea efectului inhibitor al
antibioticului dat asupra creterii bacteriene. Aceast apreciere poate fi
direct (turbidimetric, nefelometric) sau indirect (activitate
enzimatic, producie de CO2 etc.).
Unele sisteme automatizate i unitile de msur utilizate, fac
apel la metode matematice pentru compararea rezultatelor numerice
obinute, exprimate n mg/l. Astfel s-a ajuns la examinarea Concentraiei
Minimale Inhibitorii (CMI) a antibioticului la 2mg/l 4mg/l, putndu-se
trasa curbe de cretere a diferitelor specii bacteriene n prezena unor
concentraii variabile dintr-un antibiotic, i totodat fcnd posibil
trasarea limitei dintre efectul bacteriostatic i bactericid.

1.5.4. Testarea variabilitilor genetice la bacterii

Variabilitatea genetic reprezint o proprietate fundamental
a microorganismelor (ca de altfel a tuturor organismelor vii), care asigur
generarea de noi genotipuri. Se cunosc dou mecanisme care au rol n
generarea variabilitilor: mutaiile i recombinarea.
1.5.4.1. Caracterul spontan al mutaiei
Mutaiile se traduc prin modificri n secvena nucleotidelor din
moleculele de ADN cromozomial i care se transmit la descendeni.
Caracterul spontan al mutaiilor la bacterii, nedirecionate de factorii de
mediu, dar care au rol de selecie a mutantelor prin experiena
convingtoare, sunt: testul fluctuaiei i testul nsmnrii repicative.

69

Testul fluctuaiei (Luria i Delbruck)

Pune n eviden apariia, ntr-o celul de Escherichia coli
sensibil la bacteriofag, mutantele rezistente la virusul respectiv. Pentru
aceasta, se inoculeaz bacilul coli ntr-un mediu de cultur, ntr-o diluie
calculat astfel ca s ajung la 1000 celule/ml mediu, dup care aceasta
se repartizeaz:
ntr-o eprubet, 10ml din acest mediu;
n alte 12 eprubete mici, cte 0,5ml mediu;
Dup 18 ore de incubare, se nsmneaz pe plci Petri cu
geloz, care conin bacteriofag, astfel:
din eprubeta cu 10 ml mediu, se nsmneaz 12 plci cu
geloz cu bacteriofag;
din fiecare eprubet mic, se nsmneaz cte o plac ce
conine geloz cu bacteriofag.
Apariia variantelor rezistente la bacteriofag, se evideniaz n
raport cu dou posibiliti:
- rezistena poate aprea n urma adaptrii la bacteriofag (considerat ca
factor de mediu), i n acest caz, n cele 24 de plci Petri, numrul
coloniilor va fi egal sau variaz n limite restrnse;
- rezistena la bacteriofag poate aprea prin mutaie (independent de
factorul de mediu), i atunci pe plcile nsmnate din cultura unic (de
10 ml), se va dezvolta un numr egal de colonii rezistente (clonele
mutante fiind repartizate egal n mediul lichid). Pe plcile nsmnate din
cele 12 eprubete mici, numrul de colonii va fi variat, deoarece mutantele
rezistente se dezvolt diferit n fiecare eprubet. n acest caz, n unele
eprubete nu apare nici o clon mutant, iar n altele, mutantele rezistente
aprute sunt n numr variabil.
Testul nsmnrii repicative (Lederberg)
Cu ajutorul unei tampile din lemn, acoperit cu material din
catifea (ale crei fire joac rol de anse de nsmnare), aplicat pe
suprafaa unei plci Petri pe care s-au dezvoltat colonii izolate, se
transpune cultura din aceast plac pe un mediu proaspt. Fiecare
colonie va fi astfel transpus pe mediul nou i se va obine o dezvoltare
n copie a culturii de pornire.
Cu aceast tehnic, se nsmneaz un numr de plci Petri (cu geloz
simpl), cu o cultur de E. coli sensibil, de exemplu, la streptomicin, i
apoi se fac nsmnrile repicative pe plci cu geloz n care s-a
70

nglobat streptomicin. Pe multe copii nu se va dezvolta nici o colonie.

Dac pe una dintre plci se va dezvolta chiar i o singur colonie
rezistent, aceasta nsmnat pe un mediu fr antibiotic i repetnd
nsmnarea repicativ, se obine o cultur pur de E. coli rezistent la
streptomicin (demonstrnd rolul selectiv al factorului de mediu
streptomicina).
1.5.4.2. Transferul de rezisten la antibiotice prin
plasmide R
Principalele mecanisme de transfer genetic i recombinare
sunt: transformarea, transducia i conjugarea, aceasta din urm putnd
fi mediat de urmtoarele plasmide:
plasmida sau factorul F de fertilitate;
unele plasmide R de rezisten la antibiotice;
unele plasmide sau factori colicinogeni (Col).
Plasmidele R au importan medical deosebit, avnd
capacitatea de a transfera rezistena n bloc la mai multe antibiotice.
Acest transfer de la o tulpin bacterian donatoare la alta receptoare,
prin mecanismul principal de ctigare a rezistenei, este nepenit la
bacteriile Gram negative.
Utiliznd o tulpin test cunoscut, receptoare de plasmide R, care are
markeri de rezisten cromozomial, se poate urmri rezistena la
antibiotice a unei bacterii izolate de la bolnav, datorate unei plasmide R
conjugate.
Pentru efectuarea transferului prin conjugare, se utilizeaz:
Tulpina donatoare A Shigella izolat de la bolnav, care este
rezistent la sulfamid, streptomicin i cloramfenicol;
Tulpina receptoare B E. coli care are markerul de rezisten
cromozomial la acid nalidixic, dar este sensibil la alte antibiotice.
Din fiecare tulpin, se face o inoculare cu ansa a cte 5 ml, n
bulion nutritiv special, i ambele culturi se incubeaz 18-20 ore la 37C,
dup care se va rensmna n bulion, obinndu-se culturi tinere pentru
produsul de conjugare. Dup aducerea ambelor culturi la o densitate
bacterian bine determinat, se amestec o parte din tulpina donatoare
(A), cu patru pri din tulpina receptoare (B). Se incubeaz amestecul de
conjugare la 37C timp de 4 ore, dup care se nsmneaz cte 0,1ml
pe urmtoarele medii de selecie:
- geloz simpl, n care s-a inclus: sulfamid, streptomicin i
cloramfenicol;
- geloz simpl, n care s-a introdus acid nalidixic;
71

- geloz simpl cu sulfamid, streptomicin, cloramfenicol i acid

nalidixic.
Dup incubare la 37C, 24 de ore, se remarc dezvoltarea tulpinii
donatoare A, numai pe mediul cu primele trei antibiotice, a tulpinii
receptoare B, numai pe mediul cu acid nalidixic i a transconjugaiilor pe
toate trei mediile. Explicaia fenomenului este posibil prin transferul
plasmidelor R de la tulpina donatoare la cea receptoare, demonstrnd
posibilitatea transmiterii plasmidelor R ntr-o populaie bacterian, i
permind nelegerea modului de ctigare a rezistenei la antibiotice a
unor bacterii.

72

1.6. REACII ANTIGEN ANTICORP

UTILE DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC
Reaciile antigen-anticorp practicabile n scop de diagnostic etiologic se
execut cu produsele biologice (seruri i antigene) standardizabile, n
dou situaii:
- pentru identificarea unui agent bacterian izolat din produsele patologice
cu ajutorul serurilor imune standard (seruri de animale imunizate cu
antigene purificate, cunoscute);
- pentru evidenierea anticorpilor specifici n serul bolnavilor cu ajutorul
antigenelor standardizate (diagnostic serologic).
Antigen nseamn orice substan sau particul, vie sau inert, pe care
organismul o recunoate ca nefiind a lui proprie - nonself - i care odat
recunoscut conduce la un rspuns imun, cu formare de anticorpi
specifici.
Din punct de vedere tehnic -in vitro- serurile i antigenele de diagnostic
se utilizeaz n cadrul mai multor sisteme antigen-anticorp i anume:
reacii de aglutinare - n care antigenul este particulat (de tip
corpuscular);
reacii de precipitare - cu antigen solubil ce reacioneaz cu
anticorpul, formnd un precipitat vizibil;
reacii de fixare a complementului de ctre complexul antigenanticorp, fixare pus n eviden cu un al doilea sistem antigen-anticorp,
cunoscut (format din hematii i anticorpi antihematie);
reacii de imunofluorescen (direct sau indirect) n care
antigenul formeaz complexul cu un anticorp marcat cu o substan
fluorescent, reacie vizibil la microscopul cu fluorescen;
reacii de neutralizare (in vitro sau in vivo) bazate pe
neutralizarea de ctre anticorp a unei proprieti (infectante, toxice,...) a
antigenului (ex.: neutralizarea toxinelor);
intradermoreacii (in vivo) I.D.R.

1.6.1. Reacii de aglutinare

1.6.1.1. Reacia de aglutinare n identificarea agentului patogen
Aglutinarea bacterian este o reacie antigen-anticorp (Ag-Ac) de
agregare n care antigenul este reprezentat de celule bacteriene (antigen
particulat). Sub aciunea anticorpilor din serurile standard (seruri
aglutinante) apar agregate bacteriene vizibile macroscopic, n urma
73

formrii complexelor Ag-Ac. Reacia de aglutinare direct - macroscopic

- se poate efectua pe lam sau/i n tuburi.
Aglutinarea pe lam
Pentru aceast metod serurile de diagnostic se dilueaz cu soluie
salin fiziologic conform indicaiei de pe etichet (obinuit la diluie de
1/10).
Tehnica. Pe o lam de sticl degresat, se depune cte o pictur din
serurile aglutinante i, n imediata apropiere, o cantitate mic din cultura
de cercetat. Se omogenizeaz, treptat, pn cnd ntreaga cultur este
suspendat n serul aglutinant.
Se consider aglutinare pozitiv atunci cnd apar agregate vizibile (dup
un timp de 1-4 minute). Pentru comparaie, se poate folosi o suspensie
din aceeai cultur n ser fiziologic (fr ser aglutinant) (fig.38).

Fig.38 Testul aglutinrii pe lam: n stnga, testul pozitiv

(suspensia bacterian a fost aglutinat de ctre anticorpii specifici
din serul standard); n dreapta, testul negativ (suspensia bacterian
nu a fost aglutinat, test martor).

74

Aglutinarea n tuburi
Se practic atunci cnd este necesar o confirmare a unei aglutinri
pozitive pe lam sau n cazul cnd aglutinarea pe lam este incert.

Schema reaciei de aglutinare n tuburi

Eprubeta nr.
Soluie salin
fiziologic (ml.)
Ser standard
diluat 1/10 (ml.)

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5
0,5

Antigen
(suspensie
bact.)(ml)
Diluiile finale

0,5
0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

1/40

1/8 1/16
0
0

1/32
0

1/64 martor
0

Practic, reacia se efectueaz de obicei n 6 tuburi (conform schemei), n

care se realizeaz diluii crescnde din serul standard la care se adaug
aceeai cantitate de antigen 0,5 ml dintr-o suspensie omogen de
cultur bacterian de 800 milioane germeni /ml.
n fiecare eprubet se pune cu pipeta gradat o cantitate de 0,5 ml
soluie salin fiziologic. Apoi, n prima eprubet se adaug 0,5 ml ser
standard diluat 1/10 (cnd reacia se folosete pentru dozarea
anticorpilor n sngele bolnavilor - diagnostic indirect - atunci se adaug
ser de bolnav n aceeai diluie). Se omogenizeaz, prin aspirarerespingere, cu pipeta, dup care se trec 0,5 ml din prima eprubet (5
inclusiv) din care se arunc 0,5 ml (eprubeta nr.6 nu conine anticorp
martor). n toate cele 6 eprubete se adaug 0,5 ml antigen (suspensie
(variabil dup tipul de
bacterie - de antigen) formrii complexelor Ag-Ac:
- pentru antigene O sistemul se incubeaz timp de 20 de ore;
- pentru antigene H 4- pentru antigene de suprafa Vi, K 2 ore sau peste noapte.

75

Citirea reaciei se face apreciind caracterul aglutinrii (floconar sau

granular). Limita de aglutinabilitate a tulpinii bacteriene supus
identificrii reprezint diluia de ser standard la care se mai poate
observa o aglutinare vizibil cu ochiul liber, notndu-se aceast diluie,
care reprezint titrul reaciei. (ex. 1/160) (fig. 39).
n aglutinarea bacterian, dup natura i localizarea antigenului care
particip la reacie, se distinge:
- aglutinarea O sau somatic este dat de antigenul care intr n
constituia peretelui celular al unor bacterii fiind n general identic cu
endotoxina i avnd natura glucido-lipido-polipeptidic, termostabil,
aprnd sub forma unor grunji fini;
- aglutinarea H sau flagelar dat de antigenul H , prezent la
bacteriile mobile, antigen de natur proteic, termolabil, apare sub forma
unor flocoane care formeaz un sediment abundent, lax, care dispare la
agitare energic.
Reacia de aglutinare se utilizeaz n identificarea diferitelor genuri,
specii i tipuri de bacterii.

Fig. 39 Reacia de aglutinare n tuburi: pozitiv pn la 1/160(la 1/40 proporia

dintre Ag i Ac este optim).

1.6.2.1. Reacia de aglutinare n diagnosticul serologic

Evidenierea anticorpilor serici i a strii de sensibilizare se poate face cu
ajutorul unor antigene purificate, cunoscute sub denumirea de antigene
pentru diagnosticul serologic al infeciilor bacteriene. Deci, diagnosticul
serologic este orientat spre decelarea anticorpilor n serul bolnavilor cu
ajutorul unor antigene cunoscute, care pot fi de tip aglutinant,
hemaglutinant, fixatori de complement i neutralizani.
Reacia de aglutinare pentru evidenierea aglutininelor serice
76

(anticorpi serici aglutinani), ca mijloc de diagnostic, se practic la noi n

ar pentru urmtoarele infecii bacteriene: febr tifoid i paratifoid
reacia Widal; bruceloz reacia Wright i reacia Huddleson; tifos
exantematic reacia Weil-Felix; tularemia i yersinioza prin tehnica
standard.
Tehnica general (standard) const n: diluarea serului de bolnav cu
soluie fiziologic tamponat pH 7; adugare de antigen standard (diluat
dup
indicaiile productorului) n cantitate fix; incubare variabil n funcie de
antigen i citirea reaciei prin notarea caracterului aglutinatelor (O granular, H - floconar).
Titrul reaciei este dat de ultima diluie a serului, n care se constat o
aglutinare vizibil cu ochiul liber.
De reinut c tehnicile pentru febrele tifoparatifoide i cea pentru
bruceloz sunt adaptate diagnosticului acestor afeciuni.
Reacia de hemaglutinare pasiv (pe suport)
Acest tip de reacie este standardizat pentru diagnosticul tifosului
exantematic al crui agent etiologic este Rickettsia prowazeki.
Reacia de aglutinare pasiv sau aglutinare pe suport se utilizeaz atunci
cnd antigenul este o soluie, iar n urma fixrii pe un suport particulat
(latex, polistiren, hematii etc.) devine aglutinabil. n cazul hemaglutinrii
pasive amintite antigenul este un extract din culturi toxigene (o toxin de
R. prowazeki cultivat n oul embrionat de gin), cu care sunt
sensibilizate hematiile de berbec.
n diagnosticul poliartritei reumatoide, reacia de hemaglutinare pasiv
Waaler-Rose este util, alturi de reacia latex (reacia de aglutinare pe
particule de latex ca suport), fiind deosebit de sensibil. Principiul acestui
test const n capacitatea pe care o au eritrocitele de berbec
sensibilizate cu anticorpi antihematii de berbec (hemolizin) de a fi
aglutinate de seruri care conin factor reumatoid (imunoglobulineanticorpi ce apar fa de imunoglobulinele proprii).

1.6.2. Reacii de precipitare

Sunt reacii n care antigenul este reprezentat de macromolecule n
soluie coloidal. Punerea n contact a antigenului solubil cu anticorpul
corespunztor duce la formarea unor complexe antigen-anticorp (Ag-Ac)
care precipit. innd cont de faptul c n reacia de precipitare
77

antigenul, ca soluie coloidal, poate fi bine caracterizat chimic

(polizaharizi bacterieni purificai, proteine bacteriene etc.), aceasta
confer reaciei un mare grad de specificitate i sensibilitate.
n principiu, n reaciile de precipitare antigenul este o macromolecul
solubil, iar mediul de reacie cu seruri imune de referin poate fi lichid
sau sub form de gel.
1.6.2.1. Reacia de precipitare inelar
Antigenul i serul imun sunt puse n contact n tuburi capilare, n aa fel
nct cele dou componente s nu se amestece, iar la locul de contact
s se poat forma un inel de precipitare, dup 15-20 de minute.
Reacia este foarte sensibil putnd evidenia cantiti mici de antigen i
se utilizeaz n:
- industria alimentar pentru a diferenia originea crnii sau a
preparatelor din carne;
- medicina legal pentru a identifica originea petelor de snge (specia de
la care provin);
- diagnosticul bolilor infecioase prin identificare unor antigene, cum sunt
cele bacteriene de grup sau tip.
Reacia Ascoli utilizat n diagnosticul retrospectiv al infeciilor
crbunoase la animalele moarte. Din organele animalului suspectat de
moarte prin infecie crbunoas se prepar antigenul, deoarece bacilul
crbunos conine o fraciune antigenic termostabil care are
proprietatea de a rezista timp ndelungat chiar n materialele intrate n
putrefacie. Antigenul obinut prin fierbere este folosit n reacie: ntr-un
tub capilar se introduce, cu o pipet Pasteur, 0,5ml ser ce conine
anticorpi antibacil crbunos. Se prelinge apoi pe peretele eprubetei
aceeai cantitate de antigen Ascoli, aa nct s nu se amestece, ci s
se produc o interfa de contact. n cazul unei reacii pozitive, dup 5-10
minute, la limita de separare dintre cele dou lichide, apare un inel
opalescent, de precipitare.

78

Reacia Vincent-Bellot care se folosete n diagnosticul meningitei

cerebro-spinale epidemice. L.C.R.-ul recoltat de la bolnav constituie
antigenul (conine fraciuni antigenice provenite din liza meningococului)
care este pus n contact cu serul antimeningococic. Reacia pozitiv
apare sub forma inelului de precipitare la interfaa dintre cele dou
lichide. Metoda este nlocuit n prezent n mare msur cu
contraimunoelectroforeza.
Reaciile pentru identificarea de grup a streptococilor. Pentru
identificarea de grup a streptococilor A, C, D i G prin reacii de
precipitare se procedeaz la precipitarea extractelor ce conin substana
hidrocarbonat C, dup metoda Lancefield specific de grup.
Carbohidratul se pune n contact cu seruri standard (anti-A, B, C, D etc.)
preparate pe iepure. Serul cu care se obine o reacie pozitiv indic
grupul antigenic la care aparine tulpina izolat.
Evidenierea proteinei C-reactive (PCR) n tub capilar. Metoda n tub
capilar pentru evidenierea proteinei C-reactive se efectueaz n tuburi
cu diametrul de 0,7 mm i o lungime de 70-90 mm, n care se
antreneaz prin capilaritate ser antiprotein C-reactiv pn la nlimea
de aproximativ 25 mm i apoi un volum egal de ser de cercetat. Prin
nclinare lent se amestec coninutul dup care tubul se introduce
vertical ntr-un bloc de plastilin lipit pe lame de microscop. n mod
similar se monteaz un tub ce conine martorul pozitiv (ser de referin
furnizat de Institutul Cantacuzino mpreun cu antiserul).
Rezultatele se citesc dup 24 de ore de meninere la temperatura
laboratorului. Formarea unui precipitat ce se depune n partea inferioar
a coloanei de lichid indic prezena PCR, nlimea precipitatului
notndu-se dup caz cu +, ++, +++.
Pentru determinri semicantitative se indic compararea nlimii
precipitatului obinut la prob cu cea a precipitatului produs de serul de
referin PCR cu o concentraie cunoscut.
Pentru determinarea cantitativ a proteinei C-reactive sunt utile
imunoplci ce conin ser monospecific antiprotein C nglobat n gel de
agar (vezi metoda Mancini).
1.6.2.2. Reacia de floculare
Este o reacie de precipitare care apare, prin amestecul cu seruri imune,
sub form de flocoane. Aceasta se utilizeaz n principal pentru titrarea
79

toxinelor i a serurilor antitoxice pornindu-se de la observaia c

flocularea apare prima dat n eprubeta n care exist proporie optim
de antigen i anticorp. n felul acesta, cunoscnd titrul serului se
determin valoarea antigenic a toxinei i invers.
S lum ca exemplu titrarea valorii antigenice a toxinei difterice, care se
face dup schema de mai jos.

Eprubeta nr.
5
Ser antidifteric 100 U.A.(ml)
Soluie salin fiziologic
Toxin de titrat (ml)
Uniti antitoxice

0,1
0,9
1

0,2
0,8
1

0,3
0,7
1

0,4
0,6
1

0,5
0,5
1

10

20

30

40

50

urmrete (la interval de 5

minute) n care eprubet apare prima dat flocularea.
Dac reacia apare iniial n tubul 3 care conine 0,3 ml ser antitoxic, deci
30 uniti antitoxice, toxina de cercetat va conine 30 de uniti
antigenice. La fel se poate titra i o anatoxin, cunoscnd valoarea
toxinei.
Un alt tip de reacie de floculare este cel aplicat n testul VDRL (Veneral
Diseases Research Laboratory) pentru diagnosticul sifilisului ca test de
triaj.
Principiul reaciei VDRL const n utilizarea unui antigen cardiolipin
furnizat de Institutul Cantacuzino pentru a pune n eviden anticorpii
antilipoidici din serul sangvin al bolnavilor de sifilis, testul putnd fi
calitativ sau cantitativ i are ca rezultat apariia unor grunji ce pot fi
observai cu ochiul liber pe fond negru, sau cu lupa, cu mrirea de 100 x.
n funcie de mrimea flocoanelor reacia se noteaz cu: +, ++, +++ sau
++++.
1.6.2.3. Reacii de precipitare n gel
Reaciile de precipitare n gel de agar/agaroz sau imunoprecipitrile n
gel au intrat n domeniul explorrii imunochimice ca metode calitative i
cantitative de determinare a proteinelor care particip la o reacie
imunologic i la diagnosticul indirect n unele boli infecioase.
Principalele tehnici n gel de agar sau de agaroz, folosite n laboratorul
80

clinic (fig. 40) sunt utile pentru:

- determinarea cantitativ a fraciunilor proteice (IgG, IgA, IgM, fraciunea
-macroglobulina, transferina etc.);
- decelarea de fraciuni proteice (componenta M, proteina Cfetoproteina etc.);
- decelarea de antigene solubile i de anticorpi n diverse infecii (ex.
antigenul hepatitei B).
Agarul i/sau agaroza n care se desfoar reaciile de acest tip sunt
preparate n amestecuri de substane tamponate la pH 7,2 n concentraii
variabile, dup scopul urmrit.
Antiserurile folosite n tehnicile respective sunt seruri imune antiprotein
uman care conin anticorpi fa de alte fraciuni proteice. Aceste
antiseruri sunt livrate la noi n ar de Institutul Cantacuzino n stare
liofilizat ca:
- antiser antiprotein uman (ser polivalent);
- antiseruri monospecifice (IgG, IgA, IgM, transferin, fibrinogen, protein
C-fetoprotein etc.).
Serul de cercetat - ser de bolnav - n care se caut anticorpii ca i
lichidele biologice (LCR, lichid pleural, lichid de ascit) este necesar s
fie proaspt, mai rar n stare conservat.

81

Fig. 40 Principalele tehnici n gel de agar sau agaroz i

metodele de tanare.

Imunodifuzia radial Mancini

Metoda imunodifuziei radiale (RID), imaginat de Mancini, Carbonara i
Heremans n 1965, urmrete n principiu determinarea cantitativ a
diverselor fraciuni proteice cu ajutorul antiserurilor monospecifice
nglobate ntr-un strat de gel de agar, n care se practic godeuri de
dimensiuni mici pentru introducerea n acestea a serurilor de studiat.
Reacia pozitiv apare ca un inel de precipitare n jurul godeului, acest
inel avnd un diametru proporional cu concentraia fraciunilor proteice
din serul de cercetat (fig. 41). Imunodifuzia radial Mancini permite deci
determinarea cantitativ a imunoglobulinelor i a unor proteine
patologice.

Fig.41 Determinarea imunoglobulinei G (IgG) n mai multe seruri sangvine.

Anticorpii anti-IgG au fost ncorporai n gelul de agar, iar n godeuri s-au plasat
serurile de cercetat. Dup migrarea serurilor n agar se msoar diametrul
inelelor de precipitare i se determin concentraia IgG pe baza
diagramei.

Dozarea imunoglobulinelor: IgG, IgA, IgM constituie imunograma, pentru

82

care se fac calcule pe baza unor curbe de referin, comparativ cu

valorile din seruri martor (seruri normale), n imunoplci livrate
laboratoarelor de Institutul Cantacuzino.
Exprimarea rezultatelor, bazate pe msurarea diametrului fiecrui inel de
precipitare cu un ablon i calculul concentraiei fraciunilor cercetate se
face cu ajutorul curbei de referin, iar exprimarea se face n mg/100ml dac se folosete ca martor ser standard Behring - i n uniti
internaionale (U.I.), dac se folosete serul standard preparat de
Institutul Cantacuzino.
Alte dozri prin metoda Mancini sunt cele care msoar concentraia
pentru C3, principala component a sistemului complement i, prin
analogie, orice fraciune proteic pentru care dispunem de ser imun
monospecific.
Dubla difuziune (Ouchterlony)
Dac ntr-un gel de agar sau agaroz turnat pe o lam, se taie
dou godeuri alturate i n unul se pune un antigen solubil, iar n cellalt
antiser omonim, proteinele difuzeaz una ctre cealalt i precipit la
locul de ntlnire sub forma unei linii albicioase (fig. 42).

Fig. 42. Dubla difuzie n gel de agar pentru testarea grupelor

streptococului -hemolitic. n godeul din mijloc sa introdus un
extract proteic din bacterie, iar n cele periferice antiseruri pentru
grupele A,B,C,D i G. Linia de precipitare a aprut n dreptul
godeului cu antiser anti-A.
Reactanii se pot introduce n orificii rotunde sau dreptunghiulare la o
distan corespunztoare, liniile de precipitare formndu-se la unghiuri i
83

la distane constante pentru fiecare sistem Ag-Ac.

-6
godeuri periferice n jurul unui godeu central, se descriu patru tipuri de
reacie (fig.43): reacia de identitate complet (I); reacia de neidentitate
(II); reacia de identitate parial a liniilor (III) i reacia de interferen cu
inhibiie fr devierea fuziunii (IV).
Metoda este utilizat i pentru decelarea produilor de degradare a
fibrinogenului i a altor proteine patologice care apar n diferite infecii:
proteina C-fetoproteina, precum este util pentru decelarea
de antigene bacteriene, virale etc., solubile (exemplu antigenul HBs).

Fig. 43- Dubla difuziune Outchterlony. Tipuri de reacie

(a,a1,b antigene; A, A1, B - anticorpi)

Difuzia
n
cmp
contraimunoelectroforeza

electric:

imunoelectroforeza

si

Electroforeza este o metod prin care proteinele serice migreaz n

cmp electric datorit ncrcturii electrice a fiecrui tip de protein din
serul sangvin i astfel se pot separa cel puin cinci tipuri de proteine
dintr-globuline,
-globuline. Aceast tehnic ofer date importante
referitoare la raportul proteinelor din sngele uman (n primul rnd cel
dintre albumine i globuline), precum i modificrile acestor proteine n
diferite afeciuni.

84

Fig. 44. Electroforeza proteinelor serice ntr-un ser uman normal

Imunoelectroforeza (fig.45) permite vizualizarea, n arcuri de precipitare,

a unui mare numr de fraciuni proteice din snge i alte lichide
biologice. Metoda combin electroforeza cu precipitarea n gel de agar,
folosind antiser total antiproteine umane sau antiseruri pentru fraciuni
proteice (antiseruri monospecifice). Este o metod ce ofer informaii
pentru diagnostic, folosindu-se n special n studiul paraproteinemiilor, a
agammaglobulinemiilor totale sau pariale, mai mult ca un procedeu
ilustrator al datelor obinute prin electroforeza n gel de agar i prin
metoda Mancini.

Fig. 45- Imunoelectroforeza. Tehnica anului scurtat.

Imunoelectroforeza permite:
separarea i determinarea numrului de constitueni dintr-un
amestec de antigene;
definirea antigenelor pe baza mobilitii electroforetice i a
proprietilor specifice;
izolarea din gel a antigenului urmrit pentru a realiza o analiz
imunochimic mai amnunit.
Contraimunoelectroforeza (fig.46) poate fi folosit pentru determinarea
85

de proteine (antigene) a cror migrare n cmpul electric se face spre

-fetoproteina). La ntlnirea antigenului cu
anticorpul corespunztor care se deplaseaz prin electroendosmoz
ctre catod - se produce n gel o linie de precipitare.

Fig. 46 Contraimunoelectroforeza. P1 P6 = probele de ser examinate.

+ = martor pozitiv

n comparaie cu metoda Ouchterlony, contraimunoelectroforeza este

mai rapid, avnd sensibilitatea mare, fr a avea ns o strict
specificitate. Este utilizat n serologia bolilor transmisibile deoarece
evideniaz unele antigene bacteriene sau virale. O astfel de aplicare
este util n laboratorul clinic pentru detectarea antigenelor virusului
hepatitei B i se bazeaz pe faptul c antigenul HBs antigen de
suprafa al virusului hepatitei B numit i antigen Australia, apare n serul
bolnavilor cronici cu hepatit B.
Alte indicaii ale metodei, pe lng cele artate mai sus, se refer la
identificarea unor proteine serice patologice i a antigenelor bacteriene:
meningococice, pneumococice, streptococice etc.
Electroimunodifuzia (EID)
Imaginat de Laurell (1965), are o sensibilitate mai mare dect
imunodifuzia radial simpl fapt pentru care este utilizat pentru
determinarea cantitativ a concentraiilor mici de protein (ex. din lichidul
cefalorahidian, lichide pleurale, secreii etc.).

86

Fig . 47 Electroimunodifuzia. Godeurile 1, 2 i 3 conin diluii ale antigenului

standard, iar godeurile 4, 5, 6 i 7 conin probele.

Principiul. Electroforeza antigenului (probelor) ntr-un strat de gel ce

conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici determin
formarea unor conuri de precipitare, a cror nlime (sau arie) este
direct proporional cu concentraia antigenului (fig. 47). Plcile pot fi
citite ca atare la o surs luminoas i, de preferin, prin colorarea lor,
msurndu-se nlimea conurilor. Concentraia proteinelor se apreciaz
pe o curb de referin realizat cu 3 diluii ale unui antigen cu coninut
proteic cunoscut.

1.6.3. Reacii antigen-anticorp cu participarea

complementului
Complementul
sistemul complement sau alexina este un
complex de 11 factori prezeni n orice ser normal. Complementul reprezint principalul sistem de amplificare a reaciilor imune prin fixarea
pe complexe antigen-anticorp i, ca urmare, activarea n lan a tuturor
celorlalte componente C1-C9).
Dintre multiplele roluri ale sistemului complement, activitatea
bacteriolitic, efectul bactericid al acestuia i proprietatea de a se fixa pe
complexul antigen-anticorp (n reacia de fixare a complementului) sunt
proprieti utile n diagnostic.
1.6.3.1. Reacia de bacterioliz i efectul bactericid al
complementului
Bacterioliza se traduce printr-o serie de modificri ale celulei bacteriene
sub aciunea anticorpului specific i a complementului, care n final duc
la liza celulei. Prima observaie de acest fel a fost fcut asupra
87

vibrionului holeric, fenomenul fiind denumit vibrioliz fenomenul lui

Pfeiffer. Efectul de bacterioliz poate fi demonstrat in vivo prin
inoculare la cobai imunizai antiholeric, comparativ cu efectul asupra
animalelor neimunizate i in vitro, prin punerea n contact a unei
suspensii de vibrioni cu ser imun proaspt recoltat (n care se gsesc
anticorpi specifici, iar complementul este activ).
In vitro
intervale de 10-15 minute se fac preparate native, n care se pot urmri
la microscop fazele succesive de: imobilizare, aglutinare, granulare
(bacteriile se rotunjesc) i liz.
(cnd se inactiveaz complementul) reacia se oprete la stadiul de
aglutinare (datorit aciunii anticorpilor). Dac apoi se adaug ser
proaspt de cobai (care conine complement activ) se ajunge la liza
vibrionilor.
Fenomenul de bacterioliz se poate demonstra i pentru ali bacili Gramnegativi: bacilul dizenteric, bacilul piocianic etc., n interpretarea acestuia
fiind necesar s se in seama de activarea i participarea tuturor
componentelor complementului.
Efectul bactericid al complementului poate fi demonstrat asupra unor
bacterii la care particip complementul activat i pe cale alternativ n
aciune combinat cu lizozimul asupra peretelui celular bacterian. In
vitro, aciunea bactericid a complementului poate fi urmrit pe o
suspensie de E. coli, de exemplu, din care:
o parte rmne ca suspensie celular netratat;
o alt parte se pune n contact cu anticor
incubnduSe determin apoi, pentru ambele probe, numrul de bacterii vii/ml. n
acest scop, se prepar din cele dou probe cteva diluii, din care se
nsmneaz cte 0,1 ml pe plci Petri cu geloz. Dup incubare 24 de
dintr-o celul bacterian, se reporteaz numrul de colonii la diluie i la
cantitatea nsmnat, rezultnd numrul de colonii, deci numrul de
bacterii vii la ml.
1.6.3.2. Fenomenul de imunohemoliz
n prezena anticorpilor antihematie (anticorpi cunoscui i sub numele de
hemolizin) i a complementului hematiile sunt lizate, n urma formrii
complexului hematii-ser antihematie
imunohemoliz. Acest fenomen de hemoliz imun st la baza
88

mare de ser ce conine complement, care lizeaz 50% din hematii n

prezena unei cantiti optime de anticorpi antihematie, notndu-se DH50
(doz hemolitic pentru 50% din hematii).
n serul sanguin este
important datorit multiplelor implicaii ale acestui sistem n rezistena
natural a organismului, n imunitate i n reaciile biologice favorabile
la precizri importante n unele mbolnviri. De pild, aceasta scade n
lupusul eritematos sistemic, glomerulonefrita acut, n anemiile
hemolitice etc., crescnd n unele infecii i n tumorile maligne
(ajungnd la valori foarte mari n cancerul hepatic primitiv).
O alt aplicare practic, deosebit de important a fenomenului de
imunohemoliz, este folosirea acestuia ca indicator al reaciei imune (de
formare a complexului Ag-Ac).

1.6.3.3. Reacia de fixare a complementului (RFC)

Este o reacie in vitro util pentru identificarea unui antigen necunoscut
cu ajutorul serurilor standard cunoscute, dar mai ales n scopul testrii
anticorpilor din serul sanguin al bolnavilor folosind antigene standard
cunoscute (diagnostic serologic).
Principiul reaciei
n reaciile Ag-Ac, complementul se fixeaz pe complexul imun format,
fixare ce poate fi pus n eviden indirect prin fenomenul de
imunohemoliz utiliznd deci un complex antigen-anticorp cunoscut,
format din hematii i anticorpi antihematie (specifici). Astfel, dac n serul
unui bolnav se caut anticorpi cu ajutorul unui antigen cunoscut, n cazul
unui rezultat pozitiv C se va fixa pe complexul Ag-Ac format, fr a
produce modificri vizibile n tubul de reacie. De aceea, pentru
evidenierea fixrii C se adaug n reacie complexul imun format din
hematii i hemolizin (ser antihematii) - numit i sistem indicator
deoarece, dac nu s-a format primul complex (anticorpii lipsind din serul
bolnavului) C se va fixa pe acest complex i va produce ruperea
hematiilor (imunohemoliza = rezultat negativ). n cazul n care n serul
cercetat exist anticorpi fa de antigenul cunoscut introdus n reacie nu
se va produce hemoliza, C fiind fixat pe acest complex (RFC = pozitiv).
Acest principiu este reprezentat n urmtoarea schem:
89

Siste
Complem
Sistem
m de
ent
indicat
cercet
or
at
Antige x
x hematii
n

Rezultat

Lipsa
hemolizei

x
Anticor x
p
Antige
n

x hemolizi
n
x hematii

RFC = pozitiv
imunohemoliz

x
Anticor
p

x hemolizi
n

RFC =negativ

RFC poate fi lucrat n tuburi sau pe plci de material plastic cu godeuri.

Exist mai multe tehnici pentru efectuarea reaciei de fixare a
complementului, din care se desprind dou metode mai importante:
metoda clasic Wassemann, practicat n diagnosticul sifilisului,
brucelozei, tusei convulsive etc. i metoda Bengston care titreaz
anticorpii fixatori de complement pentru diagnosticul tifosului
exantematic, rickettsiozelor, al ornitozei i al leptospirozei pe lng
diagnosticul serologic al unor viroze).
Reacia Bordet Wassermann
Se lucreaz n trei eprubete, cu dou cantiti diferite de ser de bolnav.
Schema
Eprubeta
-ser de bolnav (ml)
-antigen B-W (ml)
-complement (ml)
-soluie sal.fiziol. (ml)

1
0,1
0,3
0,3

2
0,2
0,3
0,3

0,8

3 (martor)
0,2
-0,3

0,7

Incubare 45 de minute la 37C

90

-sistem indicator
(hemolitic) (ml)

1,0

1,0

1,0

Incubare 30 min. la 37 C

Citirea se face urmrind apariia hemolizei (rezultat negativ) sau lipsa ei

(rezultat pozitiv).
Tehnica Ida Bengston
Metoda Bengston, adoptat n ara noastr pentru diagnosticul serologic,
titreaz anticorpii fixatori de complement pentru diagnosticul
leptospirozelor, rickettsiozelor, infeciilor cu chlamydii etc.
Tehnica Bengston, n care fiecare din componentele ce intr n reacie
este folosit n volum de 0,2 ml, este aceeai pentru toate afeciunile
amintite diferind doar felul antigenului i modul de interpretare, de aceea
se va descrie doar principiul reaciei pentru diagnosticul serologic al
tifosului exantematic, al crui factor etiologic l constituie bacterii din
grupul Rickettsia.
Serul de cercetat recoltat de la bolnav trebuie s fie steril, limpede, fr
hematii, se va inactiva 30 de minute n baie de ap la 560C.
Antigenul rickettsian se va dilua conform indicaiei de pe etichet, astfel
nct diluia de lucru s cuprind 4 uniti antigenice n cei 0,2 ml.
Hemolizina va fi ntotdeauna titrat pentru fiecare reacie astfel ca n 0,2
ml din aceast diluie s se afle 2 uniti hemolitice.
Suspensia de hematii de berbec 2% proaspt splate.
Alexina (complementul) titrat n aceeai zi n prezena antigenului, este
diluat astfel nct 0,2 ml s conin 2 uniti alexice.
Pentru o prim comparaie se recomand folosirea unui set martor sigur
pozitiv i altul sigur negativ.
Regul. n toate cazurile reaciile serologice se efectueaz pe probe de
ser sanguin perechi. Astfel, de la fiecare bolnav se va recolta snge n
primele zile de boal (proba nr. 1), se va separa serul i se va ine la 20C pn n ziua prelucrrii, iar dup aproximativ 14 zile se va recolta a
doua prob de snge. Cele dou probe se vor lucra concomitent,
urmrindu-se creterea n dinamic a titrului de anticorpi (putnd fi
utilizate reacii serologice cu mai multe tipuri de antigene bacteriene sau
virale pe probele perechi de seruri).
Interpretare: creterea titrului de anticorpi, de cel puin patru ori, n proba
a doua de ser este semnificativ pentru diagnostic. Titrul reaciei este dat
de diluia cea mai mare de ser de bolnav unde se constat absena
total a hemolizei
91

Particulariti ale tehnicii RFC

n diagnosticul serologic al febrei Q antigenul reprezint o suspensie
purificat de Coxiella burneti, cultivat pe sacul vitelin al embrionului de
gin, suspensie din care se face diluie de lucru conform indicaiei de
pe etichet.
n diagnosticul serologic al infeciei cu Chlamydia antigenul este un
extract purificat obinut dintr-o cultur de Chlamydia pe sacul vitelin al
oului embrionat.
Pentru diagnosticul leptospirozei este necesar antigenul Leptospira
biflexa suspensie concentrat preparat dintr-o tulpin nepatogen de
leptospira.
Tehnica Bradstreet i Taylor, larg aplicat n ultimul timp n infeciile
virale, infecii cu Mycoplasma, febra Q etc. ca metod standard dup
tehnica la rece. Aceasta utilizeaz titrarea complementului n prezena
diluiilor de hemolizin n tabl de ah. RFC este efectuat n plci sau
microplci cu godeuri.

1.6.4. Reacia de neutralizare

Acest tip de reacie se bazeaz pe proprietatea anticorpilor de a anihila
(neutraliza) efectele antigenelor toxice, litice, infectante prin combinarea
Ag-Ac specific, in vitro i in vivo. Astfel, n reaciile de neutralizare Ag
este reprezentat de toxine, enzime, virusuri pe care anticorpii specifici le
pot neutraliza. n laboratorul clinic, acest tip de reacii se utilizeaz
pentru determinarea anticorpilor antistreptolizin O (reacia ASLO), dar
i pentru identificarea infeciilor bacteriene sau virale.
1.6.4.1. Reacia ASLO
Este o reacie de neutralizare pentru determinarea antistreptolizinelor
O, anticorpi fa de streptolizina O antigen de virulen al
streptococilor. Este reacia serologic frecvent folosit pentru
hemolitic.
Principiul reaciei. Serul de cercetat, n diluii succesive, este tratat cu o
cantitate standard de streptolizin O (antigenul) i dup o scurt
incubare, necesar combinrii specifice, se repartizeaz suspensia de
eritrocite ca mijloc revelator. n tuburile n care diluiile de ser conin o
cantitate suficient de antistreptolizine O (anticorpi), efectul litic al
92

antigenului va fi inhibat, ceea ce se traduce prin lipsa hemolizei, iar n

diluiile de ser n care anticorpii sunt insuficieni pentru a putea neutraliza
streptolizina, efectul litic al acesteia se observ prin prezena hemolizei.
Interpretarea rezultatelor
Exist o schem de lucru standard n care se obin prin diluii
succesive ale serului i dup adugarea tuturor componentelor: 100,
125, 166, 250, 333, 500, 625, 833, 1250, 2500 uniti ASLO/ml.
Titrurile normale de antistreptolizin O ating valori pn la 166250 U/ml. Titrurile peste aceast limit indic, n antecedentele recente
ale pacientului, existena unei afeciuni streptococice sau
poststreptococice: scarlatin, angin, glomerulonefrit, reumatism
articular acut. Aceste titruri crescute pot fi ntlnite i la purttorii de
-hemolitic la nivel amigdalian. Titrul ASLO crete
semnificativ n reumatismul articular acut (RAA), ajungnd la valori
maxime ntre sptmna a 3-a i a 6-a de la debutul articular, dar
rmne crescut timp de 6-12 luni dup puseul reumatismal. Titrul ASLO
poate fi la valori normale i n anginele streptococice dac determinarea
s-a fcut mai devreme de 15 zile de la debutul anginei.
1.6.4.2. Testarea strii de susceptibilitate in vivo
Susceptibilitatea fa de difterie (reacia Schick) i fa de
scarlatin (reacie Dick) se testeaz prin urmrirea neutralizrii de ctre
anticorpii specifici din sngele bolnavilor (antitoxine) a unei doze
cunoscute din toxina difteric, respectiv din toxina eritrogen
streptococic, inoculate intradermic. Aceste reacii vor fi descrise la
capitolele care vor trata diagnosticul n difterie i respectiv n infeciile
streptococi\

1.6.5. Teste care utilizeaz vizualizarea complexelor

antigen-anticorp prin artificii tehnice
Sensibilitatea reaciilor antigen-anticorp utilizate n diagnostic poate fi
mrit legnd de anticorp, mai rar de antigen, un marker uor de
identificat, care s nu interfereze cu proprietile imunologice ale
reactanilor. Acest marker poate fi:
93

o substan fluorescent (izotiocianat de fluorescein,

rhodamin etc.), n tehnica de imunofluorescen;
(RIA);

izotopi radioactivi (de obicei 125I), n metoda radioimunotestrii

o enzim (peroxidaz, fosfataz alcalin), n testele

imunoenzimatice.
1.6.5.1. Imunofluorescena
Prin cuplarea unei substane fluorescente cu anticorpii se obin anticorpi
fluoresceni care, fixndu-se pe antigenul omolog, induc complexe
imunofluorescente observabile prin examinarea la microscopul cu
fluorescen n lumina ultraviolet (UV).
Reacia de imunofluorescen (IF) se poate efectua prin metoda direct
sau indirect.
Metoda direct
Anticorpii monospecifici sunt conjugai cu substana fluorescent.
Materialul testat pentru prezena antigenului se etaleaz pe lam, dup
care se incubeaz cu anticorpii marcai. Excesul de anticorpi se
ndeprteaz prin splare, preparatul uscat fiind apoi examinat la
microscopul cu fluorescen, unde complexele Ag-Ac formate apar ca
zone fluorescente, uor vizibile.

Fig. 48 Imunofluorescena direct

94

Metoda indirect
Este frecvent utilizat i comport doi timpi (fig. 49):
preparatul care conine antigen se incubeaz cu anticorpul
specific, nemarcat;
vizualizarea complexului imun format se face prin adugarea
unui indicator fluorescent, care este serul antiimunoglobulin
(corespunztor anticorpului adugat n reacie) marcat.

Fig. 49- Imunofluorescena indirect

Imunofluorescena indirect are o larg aplicare permind:

evidenierea antigenelor ntr-un produs, prin aciunea succesiv
a anticorpilor specifici nemarcai, apoi a serului globulinic marcat;
detectarea anticorpilor ntr-un ser necunoscut, utiliznd antigene
cunoscute i ser fluorescent antiglobulinic.

Imunofluorescena se aplic n bacteriologie pentru identificarea unor

germeni patogeni, de exemplu pentru E. coli serotipurile enteropatogene,
Bordetella pertussis, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, ca i
a unor virusuri implicate n infecii respiratorii.
Probele care se testeaz prin imunofluorescen sunt de obicei exsudate
sau raclate de la nivelul unor leziuni cutanate sau din mucoase, ca i
95

probe bioptice, amprente din esuturi, culturi de celule infectate, sput,

aspirat bronic, secreii genitale etc.
Pentru depistarea de anticorpi, metodele imunofluorescente sunt utile n
infecii virale sau n cele bacteriene cu Mycoplasma pneumoniae,
Helycobacter pylori, Treponema pallidum etc., dar i n infeciile
parazitare (malarie, tripanosomiaz, toxoplasmoz, pneumocistoz etc.).
1.6.5.2. Radioimunotestarea (RIA)
Iniial aplicat pentru testri de hormoni i enzime, RIA s-a extins i n
diagnosticul bolilor infecioase, fiind una din cele mai sensibile i precise
metode de detectare i dozare a antigenelor i anticorpilor, prin izotopi
radioactivi (125I, 3H etc.).
Se practic fie marcarea unuia din reactani (antigenul sau anticorpul), fie
marcarea unui ser antiglobulinic care reacioneaz cu complexul imun
primar. Radioactivitatea complexului format se msoar fie n faz
lichid, fie n faz solid i este utilizat n principal pentru detectarea
enterotoxinei stafilococice, a toxinei botulinice, pentru evidenierea
polizaharidului capsular la pneumococi etc.
n infeciile virale cunoate de asemenea o larg aplicare n: diagnosticul
gripei, infeciilor hepatice i n diagnosticul hepatitelor cu virus B (AgHBs,
anticorpi anti-HBs).
Succint, etapele unei dozri radioimunologice (fig.50) sunt urmtoarele:
peste o cantitate de anticorp de testat, fixat pe un suport se
adaug o cantitate variabil de antigen;
dup o etap de preincubare (i apoi splare) pentru formarea
complexelor Ag-Ac, se adaug o cantitate fix de anticorp marcat cu
radioizotop 125 I.

96

Fig. 50 Principiul metodei n faz dubl

n acest sens, este ilustrat i tehnica radioimunologic pentru

detectarea antigenului de suprafa al hepatitei B, AgHBs (fig.51), pentru
care se folosete principiul sandwich, o tehnic n faz solid pentru
msurarea cantitilor de AgHBs din ser sau plasm.

Fig. 51 Principiul tehnicii de detectare a AgHBs

Bile din material plastic, acoperite cu anticorp antiHBs, sunt

incubate cu eantioane de ser de testat. AgHBs, dac este prezent, se
97

fixeaz pe anticorp. Se adaug anticorp antiHBs marcat 125I, i n timpul

celei de-a doua incubri, aceasta se fixeaz pe AgHBs, formnd
complexul anticorp-antigen-anticorp marcat radioactiv. Dup splarea
bilei, se msoar radioactivitatea, care este cu att mai ridicat, cu ct
cantitatea de AgHBs este mai mare.

1.6.5.3. Teste imunoenzimatice

Principiul. Antigenul sau anticorpul se cupleaz cu o enzim
care are o mare afinitate, rezultnd att activitatea imunologic ct i cea
enzimatic.
Complexul imun va fi detectat prin aprecierea activitii
enzimatice fa de un substrat specific.

Testul ELISA (enzime-linked-immuno-sorbent-assay)

Se cunosc diverse tehnici imunoenzimatice, dintre care n
diagnosticul bolilor infecioase se aplic preferenial testul ELISA cu
diferite variante:
tehnica direct pentru determinarea antigenelor (fig.52);
tehnica dublu sandwich pentru determinarea antigenelor sau
anticorpilor (fig.53).

Fig. 52 ELISA direct. AB anticorpul specific antigenului din proba de

cercetat; A antigenul de determinat; AB-E conjugat anticorp specific
antigenului A, cu enzima (E)

98

Fig. 53 ELISA dublu sandwich. AB anticorpul specific antigenului din

proba de cercetat; A antigenul din prob; AB1 anticorp specific antigenului;
AB2-E conjugat antiimunoglobulin AB1, cu enzima (E)

Succesiunea etapelor pentru efectuarea testului ELISA este:

alegerea unui suport solid convenabil;
imobilizarea antigenului sau anticorpului pe acest suport;
legarea prin reacie imunospecific a anticorpului sau antigenului
din proba de testat pe antigenul i respectiv anticorpul imobilizat pe
suportul solid;
legarea prin reacie specific antigen-anticorp a reactantului
marcat enzimatic, de complexul format anterior, i fixat pe suport;
adugarea n final, a substratului specific enzimei folosite drept
marker, producndu-se o reacie de culoare a enzimei cu substratul,
aceasta fiind citit colorimetric.
ELISA se utilizeaz:
pentru detectri de antigene bacteriene sau virale, pentru
evidenierea toxinelor: toxina difteric, toxinele bacteriilor din speciile E.
coli toxigene, toxinele stafilococice; detectarea brucelelor, treponemelor,
rickettsiilor etc.;
pentru detectri de anticorpi antibacterieni (n salmoneloze,
bruceloze, rickettsioze etc.) sau antivirali;
pentru identificarea i determinarea cantitativ a anticorpilor
antinucleari, antiADN, complexelor imune circulante i urmririi
tratamentului n boli cu component autoimun.

99

1.7. TESTAREA REZISTENEI NATURALE

ANTIINFECIOASE
Aprarea fa de infecie se realizeaz prin:
mecanisme nespecifice de rezisten natural ca: barierele
cutanate i mucoase, factorii umorali, tisulari i celulari,
microbiocenozele, febra, fagocitoza i inflamaia;
mecanisme imunitare specifice: umorale (prin anticorpi) i
celulare (prin limfocite, celule citotoxice i citokine).
Aria de investigaii a acestor parametri este tot mai larg,
interesnd att statusul normal, ct mai ales, definirea strilor patologice.

1.7.1. Teste de apreciere a rezistenei naturale

1.7.1.1. Determinarea cantitativ a complementului seric
Dozarea C se bazeaz pe proprietatea acestuia de a
hemoliza eritrocitele sensibilizate (eritrocite nvelite cu anticorpi specifici).
n laborator, folosim eritrocite de berbec sensibilizate cu ser hemolitic
(ser antieritrocite de berbec).
Multiplele implicaii ale sistemului C i ale componentelor sale
n rezistena natural a organismului uman, ct i n reaciile biologice
favorabile sau nefavorabile, au dus la introducerea unor tehnici de
laborator care s determine valoarea C total i a C3 n serul sanguin.
Ca punct final al reaciei se ia hemoliza 50%, pentru c aceasta d o
precizie mult mai mare dozrii complexului dect hemoliza 100%.
Reacia necesit prepararea reactivilor dup reguli stricte.
Acestea sunt:
diluentul tampon la pH 7,3 diluat 1:5 cu ap distilat;
eritrocitele de berbec recoltate pe soluie Alsever, splate cu
ser fiziologic, se suspend 1:60 n ser fiziologic;
serul hemolitic ntr-o diluie stoc 1:50, se pregtete nainte de
utilizare;
sistemul hemolitic rezult din amestecul n pri egale a
suspensiei de eritrocite i ser hemolitic;
serul de bolnav n care se face dozarea complementului, se va
recolta proaspt.
100

Reacia
Pentru fiecare ser studiat, se pipeteaz n cte 6 tuburi,
diluent, ser de bolnav i sistem hemolitic, dup urmtoarea schem:
Tub nr.
1
Diluent (ml)
Ser bolnav dil. 1/40 (ml)
Sistem hemolitic (ml)

2
3
4
5
6
1,30 1,25 1,20 1,10 1,00 0,70
0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 0,80
1
1
1
1
1
1

Volumul total de reacie = 2,5 ml

Incubarea la termostat 37C, timp de 30 de minute.
Centrifugare la 3000 ture, timp de 3 minute.
Citire la fotometru fa de un martor de hemoliz 100% (2,5
ml ap amoniacal 0,4% + 1 ml sistem hemolitic). Se msoar extincia
probelor, apoi se face un calcul pentru transformarea n procente i
stabilirea hemolizei 50%.
Se poate aplica i o procedur direct, prin care se determin
direct procentul de hemoliz n tubul de reacie, prin comparare cu o
scar de hemoliz, cuprins ntre 10% i 90%.
Dozarea complementului seric, aduce informaii importante n
boli renale, boli hepatice, colagenoze i boli alergice. Astfel, scade n
glomerulonefrita acut, n lupusul eritematos i n ciroza hepatic, i
crete n unele infecii i boli neoplazice.
1.7.1.2. Testarea lizozimului
Lizozimul, factor umoral bactericid din snge, lichide
biologice, mucus etc., acioneaz alturi de polipeptidele bazice,
proteazele lizozomale, interferoni, prin mecanisme neoxidative asupra
microorganismelor patogene.
Efectul lizozimului asupra peretelui bacterian, se poate
evidenia pe culturi de Micrococcus lysodeikticus n medii lichide sau
solide.
Tehnica mai frecvent utilizat este cea pe medii solide (fig.
54), n care se face o suspensie de Micrococcus, avnd o densitate de
10 germeni/ml, n agar bacteriologic la pH 7,2 i la o concentraie de
2,5%. Suspensia se introduce n agar cnd acesta are o temperatur de
45C. Se toarn n plci Petri i, dup solidificare, se practic godeuri n
masa agarului. n patru din aceste godeuri se introduc urmtoarele
concentraii de lizozim (soluie martor, preparat extemporaneu): 25g;
50g; 100g i 200g. Probele martor i cele de cercetat (ser sanguin,
101

saliv etc.) se introduc n godeuri n cantiti identice, astfel ca lichidele

s nu se rspndeasc n afara godeurilor. Dup 24 de ore se msoar
diametrele de inhibiie a soluiilor martor i se traseaz curba standard
(fig. 55) i totodat diametrele de inhibiie ale probelor (unde se face
media).

Fig. 54 Metoda de determinare cantitativ a lizozimului n placa Petri, n

funcie de diametrul de liz bacterian (din colecia autorului).
25, 50, 100, 200 = concentraiile de lizozim standard introduse n godeuri.
a i b = probele de cercetat.

Concentraiile lizozimului n lichidele biologice, se exprim conform

curbei standard, n g/ml. Alturi de reacia de fixare a complementului
(vezi cap. 1.6.3.3), aceast tehnic poate fi utilizat fie pentru
identificarea antigenelor specifice de grup, fie pentru serodiagnosticul
unor infecii respiratorii acute (pneumonii, grip), a rickettsiozelor sau
leptospirozelor.

102

1.7.1.3. Fagocitoza
Evidenierea fagocitozei
Fagocitoza este definit ca proprietatea unor celule de a
ngloba i digera particule strine (fagein = a mnca) sau macromolecule
(pinocin = a bea). Deoarece endocitoza (nglobarea n celula fagocitar)
nu este urmat obligatoriu de omorrea i digerarea bacteriilor, n testele
de laborator se urmresc separat cele dou procese.
Sunt preferate testele in vivo, deoarece: permit folosirea unor
populaii omogene de celule fagocitare (polimorfonucleare, macrofage);
este eliminat intervenia n procesul fagocitar a unor ali factori (serici) i
se poate studia separat nglobarea i efectul bacteriilor intracelular.

Fig. 55 Reprezentarea grafic a concentraiei de lizozim standard

In vitro, pentru determinarea procentului de fagocite care au

nglobat bacterii, se pune n contact suspensia de PMN cu o suspensie
de cultur bacterian, n mai multe eprubete. Dup incubarea acestui
amestec la 37C, la diferite intervale de timp (15, 30, 60, 120 minute), se
fac frotiuri care se coloreaz cu coloraia Giemsa i se examineaz la
microscop, notnd:
numrul mediu de microorganisme nglobate pe fagocit;
103

procentul de fagocite care au nglobat bacterii.

n vederea cunoaterii capacitii de distrugere intracelular a
microorganismelor n procesul de fagocitoz, se determin numrul de
bacterii viabile intracelulare.
Pentru aceasta, dup incubarea amestecului de celule
fagocitare i microorganisme timp de 15 minute la 37C (perioad n care
are loc nglobarea), se oprete fagocitoza prin plasarea eprubetelor la
ghea. Dup o uoar centrifugare timp de 4 minute, fagocitele
sedimentare se spal n soluie Hanks, i se incubeaz la 37C. Dup
fiecare 15, 30, 60, 120 minute, se ia 0,5 ml din suspensie i se amestec
cu 0,5 ml soluie Hanks. Dup o nou centrifugare, se elimin
supernatantul i se lizeaz fagocitele cu ap distilat steril, de la
ghea, care conine i albumin bovin. Determinarea numrului de
bacterii viabile se face prin cultivarea pe medii de cultur adecvate.
Datele statistice arat c neutrofilele ucid n 60 minute 95,8% din
stafilococii albi i 86% din stafilococii aurei hemolitici.
Pentru aprecierea indicelui fagocitar (numrul mediu de particule
fagocitate de un granulocit sau monocit) se pot aplica metode cantitative,
mai obiective i mai rapide, cum este utilizarea unor particule colorate,
ca de exemplu, picturile de ulei O rou, acoperite cu LPS
(lipopolizaharide bacteriene), care face posibil determinarea
spectrofotometric a fagocitozei. Alte metode se bazeaz pe marcarea
bacteriilor cu izotopi radioactivi sau pe citometria n flux (cnd bacteriile
sunt marcate cu fluorocromi).
-

Coloidopexia
Microorganismele sau diferite particule inerte inoculate intravenos
la animalele de laborator (oareci, cobai), sunt uor fagocitate de ctre
fagocitele circulante sau fixe. Experienele mai frecvent fcute au fost
cele cu tu de China. Dup diferite intervale de timp (30, 60, 120
minute), sacrificarea animalului i efectuarea de seciuni histologice, au
demonstrat care sunt organele mai bogate n macrofage (ganglionii
limfatici, splina, ficatul etc.), cuprinse n sistemul mononuclear fagocitar.
Testul NBT (Nitrobluetetrazolium)
Este un test frecvent utilizat pentru a evidenia activitatea
enzimatic a fagocitelor, mai ales a PMN, celule generatoare de peroxizi
de hidrogen i radicali activi ai oxigenului.
Principiul. Proprietatea fagocitelor de a ngloba colorantul n
104

vacuole fagocitare, unde sub influena unor nucleotid-oxidaze are loc

reducerea acestora ntr-un precipitat insolubil de formazan (albastrunegru), evideniabil prin coloraia Giemsa.
Metoda cu snge integral, se practic recoltnd 1-2 ml snge
ntr-o sticlu cu anticoagulant (2 mg Na EDTA uscat). ntr-o eprubet
se amestec:
0,08 ml soluie tampon Michaelis pH 7,4;
0,02 ml soluie NBT 1%;
0,1 ml snge recoltat pe anticoagulant.
Dup incubarea amestecului la 37C, timp de 30 de minute,
se agit i se fac frotiuri: uscate, fixate cu alcool metilic i colorate
Giemsa.
Se examineaz cel puin 100 PMN i se difereniaz
procentual celulele cu depozite de formazan (NBT pozitive).
La o persoan sntoas, fagocitele NBT-pozitive, reprezint
7-14%. Odat cu creterea metabolismului oxidativ al neutrofilelor
stimulate prin infecii bacteriene, procentul lor crete mult. n infeciile
virale sau stri febrile de origine neinfecioas, valorile se menin n limite
normale.

Chemiluminiscena
O metod alternativ de apreciere a metabolismului oxidativ al PMN este
cea prin care se evideniaz fenomenul de chemiluminiscen cu ajutorul
unor aparate (chemiluminometre).
Radiaiile luminoase (chemiluminiscena) generate n timpul fagocitozei
sunt amplificate prin utilizarea unei substane intermediare luminol
i/sau lucigenin care prin oxidare emit unde luminoase i acestea pot
fi convertite de aparate, n semnale electrice, msurate n milivoli.
Prin aceste metode de apreciere a activitii PMN i a capacitii
bactericide a acestor celule se pot evidenia deficienele funcionale ale
fagocitelor, n principal deficitul activitii bactericide, care se traduce
clinic prin infecii repetate, rebele la tratament, care afecteaz mai ales
esuturile profunde, determinnd modificri cu aspect de infiltrate
granulocitare (boli cronice granulomatoase).

105

1.7.2. Teste de imunitate celular

Realizarea rspunsului imun celular are la baz eliberarea
mai multor categorii de factori solubili: limfokine, factori ajuttori i
supresori, factori mitogeni, factori de transfer, factorul de inhibare a
migrrii macrofagelor (MIF) i muli alii.
Pentru explorarea imunitii celulare se folosesc att teste in vitro ct i
in vivo.
1.7.2.1. Explorarea imunitii celulare in vitro
Exist mai multe metode experimentale care utilizeaz
limfocite din snge.
Evaluarea
monocitelor

numrului

absolut

al

limfocitelor

Normal, numrul absolut al limfocitelor sanguine este de

1500-3000/mm, iar al monocitelor (macrofage tinere) de 300-600/mm.
Cunoscnd procentul acestora n tabloul sanguin, se poate uor calcula
numrul absolut, raportat la numrul total al leucocitelor/mm.
Actual, identificarea i evaluarea subpopulaiilor limfocitare T, B i a
celulelor NK din sngele periferic i din esuturi, apeleaz la anticorpii
monoclonali i la metode de citometrie n flux care pot identifica aceste
celule pe baza markerilor i a receptorilor specifici fiecrei populaii i
subpopulaii limfocitare.
Fenotipizarea sau imunofenotipizarea limfocitelor T i B se poate face pe
suspensii unicelulare din snge, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, fa
de markerii: CD 2, CD 3, CD 4, CD 19, CD 20 etc. Pentru celulele NK se
testeaz markerii: CD 16 i CD 56.
Metodele de separare a limfocitelor i macrofagelor
Pentru cercetarea in vitro a unor mecanisme care intervin n
cooperarea celular i reglarea rspunsului imun este necesar
obinerea claselor i subclaselor de celule. Pentru acest scop, au fost
imaginate diverse metode de separare a celulelor, dintre care se
desprind:
-

tehnicile de separare a celulelor bazate pe diferene de

106

sedimentare;
separarea celulelor pe baza unor atribute biologice particulare;
metode de separare pe baza unor receptori de membran i a
moleculelor marker specifice subpopulaiilor limfocitare i altor celule cu
rol n rspunsul imun.
Tehnicile de separare prin centrifugare n medii cu diferite
densiti (gradient de densitate), folosesc substane care cresc rata de
sedimentare a eritrocitelor: Dextran, Ficoll-Odiston etc.
Separarea de Ficoll-Metrizoat (Odiston), se face prin centrifugare, n care
se introduc: o parte din sngele recoltat pe anticoagulant i dou pri
Ficoll-Metrizoat (fig. 56). Centrifugarea timp de 20 de minute la 400
turaii, duce la separarea a patru straturi principale, precis delimitate:
abcd-

mediu de cultur i plasm sanguin;

strat de forma unui inel alb, format din limfocite i monocite;
stratul de Ficoll-Metrizoat;
sedimentul de hematii i celule moarte.

Fig. 56 Aspectul coloanei nainte i dup centrifugare: 1 nainte de

centrifugare sunt dou straturi: unul superior (S), reprezentat de sngele diluat
n mediu, i altul inferior (I), format de ctre soluia de Ficoll-Metrizoat; 2 dup
centrifugare apar cel puin 4 straturi: a- stratul superior (mediu i plasm
sanguin); b- stratul sub form de inel cu limfocite i monocite; c- soluia sub
form de Ficoll-Metrizoat; d- sedimentul de hematii i celule moarte.

Cu ajutorul unei pipete Pasteur sau a unei pipete cu bul

(prelungit cu un tub de cauciuc pentru a se putea urmri cu uurin
toate operaiunile), se elimin stratul superior, pentru decopertarea
inelului limfocitar. Celulele care formeaz inelul alb sunt aspirate cu
107

ajutorul pipetei bine efilate i introduse ntr-o eprubet de centrifug, care

conine mediu de cultur pentru limfocite. Se vor spla celulele de 3 ori,
prin centrifugare (10 minute la 200 turaii/s), n mediu de cultur, dup
ultima splare aducndu-se la concentraia dorit. Prin aceast metod
se obine o populaie celular format din aproximativ 90% limfocite i
monocite, iar restul este format din trombocite i rare hematii.
Alte metode de separare sunt utilizate n scop de cercetare i se refer
la:
separarea macrofagelor i monocitelor prin aderarea la sticl;
separarea macrofagelor dup fagocitarea fierului coloidal, cu
ajutorul unui magnet;
separarea prin fixarea liganzilor la receptorii de pe membran ai
limfocitelor, cu formare de rozete,etc.
Pentru celulele din esuturi, mai ales cele limfatice, fenotipizarea se face
cu ajutorul anticorpilor monoclonali cuplai cu substane fluorescente, iar
evidenierea celulelor astfel marcate se realizeaz prin citometrie n flux
sau cu microscopul de fluorescen.
Prin tehnicile cu anticorpi monoclonali se pot stabili att proporiile, ct i
numrul de celule din snge. Astfel au putut fi stabilite valorile normale
ale unor markeri mai frecvent cercetai, din care fac parte CD 2 i CD 3
pentru limfocitele T totale (pan T); CD 4 pentru limfocitele T-helper; CD 8
pentru limfocitele T-citotoxice/T-supresoare i raportul CD 4:CD 8; CD 19
i CD 20 pentru limfocitele B totale; CD 16 i CD 56 pentru celulele NK
totale. Pentru caracterizarea imunitii celulare, evaluarea acestor
subpopulaii celulare majore are o importan deosebit att pentru
diagnosticul, ct i pentru prognosticul unor afeciuni virale sau maligne.
Teste cu formare de rozete
Principiul.
Limfocitele, monocitele i macrofagele au receptori de
membran capabili s lege specific diferite structuri care se gsesc fie pe
membrana unor hematii, fie a unor bacterii. Ataarea hematiilor, prin
liganzii lor, n jurul limfocitelor care posed receptori pentru acetia iau
forma unor rozete, de unde denumirea de rozetare dat procesului
respectiv.
n funcie de natura liganzilor, rozetele pot fi: E, EA, EAC, ES.
Rozetele E
Limfocitele T umane au capacitatea de a lega hematiile de
oaie prin receptori E formnd rozete E totale , de mare sau mic
afinitate.
108

n vederea obinerii unor rezultate comparabile, Comisia

Naional de Imunologie a precizat condiiile standard de rozetare a
limfocitului T uman cu hematiile de oaie.
Se lucreaz pe snge venos uman recoltat pe heparin (100
UI/ml snge), urmat de separarea limfocitelor pe amestec Ficoll-Odiston
(3ml amestec i 8ml snge diluat n TFS = tampon fosfat salin),
conform tehnicii descrise la 7.2.1.2.
Tehnica rozetrii
Rozetarea se face n mediu IC, n tuburi de hemoliz cu
diametrul de 10m, n duplicat. Se introduc 50l suspensie de limfocite
umane i 100l suspensie hematii de oaie. Se adaug 100l ser fetal de
viel inactivat i adsorbit cu hematii. Centrifugare 5 minute la 100 turaii,
incubare 60 minute ntr-o baie de ap la 290C (pentru rozetele de mare
afinitate) sau 16-24 ore la +40C (pentru rozetele totale).
Citirea i interpretarea rezultatelor.
Se face o resuspendare blnd a suspensiei (prin aspirri
uoare cu o pipet Pasteur cu tetin). Suspendarea se ntinde pe o lam
de microscop, se usuc rapid prin nclinare, apoi fixare cu alcool metilic
i colorare cu Giemsa. Se citesc minimum 250 celule limfoide rozetate i
nerozetate i se calculeaz procentul de rozetare. Se consider rozete
numai acelea care au minimum 3 eritrocite aezate la un limfocit.
Se determin procentul de rozete totale (incubare la +40C),
cel de mare afinitate (incubare la 290C) i cel de mic afinitate (prin
scderea din procentul de rozete totale a procentului de rozete de mare
afinitate).
La om, media valorilor normale este urmtoarea: rozete E
totale (limfocite T totale) = 68 2%, din care rozete E de mare afinitate =
43 2% i de mic afinitate = 25 2%.
Rozetele EA
Limfocitele sau monocitele au receptori Fc care leag
imunoglobulinele IgG i/sau IgM (prin fragmentul lor Fc). Dac
imunoglobulina are funcie de anticorp pentru hematia de oaie, atunci se
leag prin fragmentul Fab de hematie i prin fragmentul Fc de limfocit.
Astfel se formeaz rozete prin intermediul anticorpilor (rozete EA).
Folosind eritrocite de bou i ser antieritrocite de bou, se pot identifica
toate limfocitele cu receptori Fc.
Rozetele EAC
Limfocitele B, n principal, au receptori pentru fraciunile complementului,
mai ales pentru C3b, astfel, eritrocitele sensibilizate la IgM i C3b se
109

leag de aceti receptori, formnd rozete EAC (eritrocite + anticorpi +

complement), doza de complement fiind calculat astfel ca s nu fie
hemolitic.
Procentul de celule formatoare de rozete EAC este de 21
2%.
Legarea stafilococului Cowan la IgG i rozetele ES
Principiul. Proteina A din peretele stafilococului aureu Cowan, se
leag la fragmentul Fc al moleculei de IgG. n cazul n care molecula de
IgG este fixat specific prin Fab la antigenele de membran ale
limfocitului, stafilococul se leag de fragmentul Fc al imunoglobulinei (fig.
57.a). Cnd molecula de IgG se fixeaz nespecific de receptorul Fc al
membranei limfocitare (FcR), stafilococul se va ataa prin proteina A la
fragmentul Fc al imunoglobulinei (fig. 57.b.). Examinat la microscop,
limfocitul apare nconjurat de bacterii. Marcarea stafilococului Cowan cu
izotiocianat de fluorescen i examinarea rozetelor n lumin UV,
permite obinerea de imagini mult mai clare.
Citirea. Se numr minim 200 de celule rozetate (limfocite
rozetate) i nerozetate. Se face procentul de rozetare.

Fig. 57 Posibiliti de ataare a Stafilococului aureus la celula limfoid:

amolecula de IgG are funcie de anticorp, prin Fab fixndu-se specific la
receptorii de membran (anticorpi), iar stafilococul se ataeaz apoi la
domeniul CH-2 al Fc.
bMolecula de IgG se fixeaz nespecific, prin fragmentul Fc, la receptorul
FcR al membranei celulare, iar stafilococul se va ataa prin proteina A la
domeniul CH-2 al Fc.

Testul transformrii limfoblastice (TTL)

Principiul metodei
Limfocitele, sub aciunea unor stimuli, i activeaz in vitro,
procesele metabolice care preced multiplicarea lor. Volumul celulei
110

crete, nucleul se coloreaz mai puin intens, nucleolii sunt mai vizibili,
etc. Acest stadiu al multiplicrii celulare este cunoscut sub denumirea de
blast, iar procesul n sine de transformare blastic.
Stimulii care induc transformarea blastic in vitro, pot fi de
natur diferit: mitogenic, antigenic sau allogenic.
Transformarea blastic a limfocitelor stimulate mitogenic,
utilizeaz
frecvent
fitohemaglutinina,
concavalina,
dar
i
lipopolizaharidele (LPS) bacteriene. Limfocitele pot fi obinute din
sngele periferic i cultivate fie ca populaii purificate prin separare n
gradient de densitate, fie n cultur de snge total.
Se adaug substanele mitogene, dozele optime n cazul
limfocitelor umane fiind n jurul valorilor de 1% n cultur pentru
fitohemaglutinin (PHA-M), i de 1-2g pentru concavalina A (Con A). Se
folosesc i culturi de celule martor, fr factori stimulatori.
Dup 48 de ore, n fiecare cultur se introduce cte 0,1 ml
din soluia de lucru, ce conine 3H-Td (timidin tritiat), i se reincubeaz
culturile timp de 24 de ore la 37C. Fiecare cultur este filtrat pe cte o
membran de sticl Millipore adecvat, care antreneaz n timpul
traversrii membranei, urmele rmase de timidin trinitat nencorporat.
Celulele rmase pe membrana filtrat se spal de 3 ori cu cte 10 ml
TFS. Celulele cultivate sunt fixate pe rondele de hrtie de filtru, mprit
prin linii, n ptrate cu latura de 4/4 cm (numerotate). Fiecare rondel,
reprezentnd o cultur de limfocite, este introdus n vasul de scintilaie
numerotat, n care se introduce lichidul de scintilaie. Se face o citire la
aparat, notndu-se impulsurile emise de fiecare prob.
Rezultatele sunt exprimate n Indice de stimulare,
calculndu-se mediana.
n lipsa aparatului de scintilaie, se poate calcula procentul de
limfoblati, pe frotiu colorat cu metoda Giemsa, aceasta neoferind ns
rezultate reproductibile.
Transformarea blastic prin stimuli antigenici in vitro, are
principii i tehnici de lucru identice, dar, n acest caz, limfocitele cultivate
trebuie s provin de la un organism care a venit n contact cu antigenul
(deci stimul in vivo ).
ntr-o cultur mixt limfocitar, limfocitele provenite de la doi
subieci sub raportul antigenelor de histocompatibilitate, se stimuleaz
reciproc dac sunt cultivate in vitro mpreun. Direcia de stimulare poate
fi:
bidirecional (double way), n cazul n care populaiile limfocitare
provenite de la subiecii A i B se stimuleaz reciproc i se transform
blastic;
111

unidirecional (one way), n cazul n care numai o populaie este

stimulat i se poate transforma blastic (A), iar cealalt (B), poate stimula
dar nu se poate transforma blastic, fiind blocat sinteza ADN-ului celular,
ca urmare a iradierii sau a tratamentului cu Mitomicin.
Domeniile de aplicare a transformrii limfoblastice este tot
mai larg, n special n cercetarea imunitii celulare, putnd informa
asupra unor eventuale depleii sau alterrii funcionale a celulelor T.
Cultura mixt limfocitar este un instrument util n determinarea gradului
de competen sau incompeten existent ntre doi subieci, donator i
receptor de grefon, sub raportul antigenelor de histocompatibilitate.
Inhibiia migrrii macrofagelor sau leucocitelor
Principiul metodei. Macrofagele i leucocitele, meninute n
condiii corespunztoare in vitro, prsesc locul n care se afl, migrnd
n diferite direcii. Normal, ntr-o cultur, limfocitele migreaz omogen
formnd o plaj rotund.
Unele limfokine, cum este factorul de inhibiie al migrrii
macrofagelor -MIF- sau al limfocitelor -LIF-, sunt citokine eliberate de
ctre limfocitele activate de un anumit antigen, inhib migrarea
macrofagelor i leucocitelor.
Tehnica inhibiiei migrrii, permite detectarea prezenei
limfocitelor sensibilizate fa de un anumit antigen sau identificarea
antigenului sensibilizat, responsabil de reaciile imune mediate celular.
Aceast tehnic poate fi efectuat prin dou metode diferite:
metoda direct, n care limfocitele sunt cultivate mpreun cu
celulele care migreaz, n prezena antigenului MIF-ul sau LIF-ul
secretat n mediu i inhibnd migrarea;
metoda indirect, n care limfocitele i macrofagele sunt cultivate
mpreun cu antigenul, dup care mediul de cultur n care s-au
eliberat factorii de inhibiie este folosit la determinarea inhibiiei
migrrii.
Tehnicile de lucru sunt diverse: tehnica inhibiiei migrrii din
capilar (cea mai utilizat), din coagul de snge, din fragment de organ,
din pictur de agaroz, etc.
Inhibiia migrrii leucocitelor din tubul capilar de sticl (fig. 58), se
execut pe snge venos, recoltat pe heparin. Se recolteaz de obicei
40 ml snge, care se amestec cu 20 ml soluie Dextran 5%, pentru
separarea celulelor seriei albe (prin sedimentare spontan, hematiile
sedimenteaz, iar plasma din stratul superior, ce conine leucocitele, se
va prelucra mai departe).
112

Fig. 58 Inhibiia migrrii macrofagelor n tub capilar.

amartor, fr antigen;
bproba de cercetat, fa de antigenul sensibilizat.

n final, se va obine un sediment de leucocite, care se va

suspenda n mediu pentru culturi celulare, aproximativ 5x10 celule/ml.
Suspensia celular este introdus, prin capilaritate, n tuburi care se
nchid la un capt cu plastelin, dup care se centrifugheaz (4 minute la
1300 rotaii/minut). Dup sedimentare, se secioneaz tubul de sticl
deasupra sedimentului, apoi partea nchis este fixat n camera de
migrare, astfel ca tubul s adere la lama de sticl (o lam de microscop).
Dup incubare, n poziie orizontal, 24 de ore la 37C, se citesc
rezultatele prin msurarea coloanei de migrare i raportarea la un martor
fr antigen.
Dup aceast tehnic se poate cerceta migrarea i inhibarea
migrrii pentru macrofagele alveolare sau pentru macrofagele
peritoneale.
Principalele domenii de aplicare a inhibiiei migrrii
macrofagelor sau leucocitelor, privesc n principal, evaluarea
hipersensibilitii de tip ntrziat sau a unor reacii autoimune, n
aprecierea gradului de imunizare fa de unele antigene virale,
bacteriene sau tisulare prin testri ale activitilor biologice ale
citokinelor, alturi de alte tehnici care pot evalua efectul diferitelor
citokine asupra diferitelor celule imunocompetente.
n prezent, exist diferite kituri comerciale care se utilizeaz pentru
evidenierea sau cuantificarea producerii de citokine, att n serul
sanguin, ct i n supernatantele culturilor de limfocite i monocite
stimulate in vitro, dar n aceste cazuri, analizele apeleaz la metode de
tip ELISA.
Activitatea citotoxic
Activitatea celulelor citotoxice (limfocitele T-citotoxice, celulele Killer
i Natural Killer) se poate aprecia in vitro prin incubarea celulelor
113

mononucleare, izolate din snge sau esuturi limfoide, cu diverse celule

int marcate n prealabil cu crom radioactiv (51Cr ).
Celulele omorte de ctre cele citotoxice, elibereaz cromul
radioactiv, care poate fi msurat cu un aparat de msurat gamma i care
reflect activitatea citotoxic a celulelor. Testarea activitii citotoxice se
poate face pe celule int allogene (celule provenind de la alt individ din
aceeai specie), celule tumorale sau infectate viral (pentru testarea
capacitii citotoxice a limfocitelor T-CD 8).
n cazul testrii activitii celulelor NK se utilizeaz de obicei ca
int o linie celular tumoral. Dac se urmrete testarea citotoxicitii
celulare anticorpodependent (ADCC) a celulelor Killer, celulele int
sunt tratate n prealabil cu concentraii mici (subaglutinante) de anticorpi
(ser imun anticelul int) i apoi sunt incubate cu celule K, care devin
celule LAK (lymphokine-activated killer).

114

2.

DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC

2.1. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC N BOLILE

INFECIOASE
Metodele folosite n diagnosticul etiologic sunt grupate n dou mari
categorii:
metode de diagnostic direct sau bacteriologic;
metode de diagnostic indirect serologic i biologic.

2.1.1. Diagnosticul direct bacteriologic

Cuprinde toate etapele care urmresc evidenierea agentului patogen din
produsul patologic, izolarea i identificarea lui. Principalele etape ale
diagnosticului bacteriologic sunt: recoltarea produselor, examenul
microscopic, nsmnarea i izolarea bacteriilor; identificarea agentului
etiologic i determinarea sensibilitii la antibiotice a acestuia, n vederea
instituirii unei terapii corecte, eficiente.
2.1.1.1. Recoltarea produselor biologice
Prelevarea corect a produselor destinate examinrii bacteriologice
condiioneaz direct eficiena etapelor urmtoare i, n final, obinerea
unui rezultat fidel (vezi prelevarea produselor la cap. 1.4).
2.1.1.2. Examenul microscopic direct
Se face din produsul patologic sau biologic, prin efectuarea i
examinarea preparatului nativ i a frotiului colorat Gram, Ziehl-Neelsen,
coloraii pentru capsul, spori i uneori prin coloraia Giemsa. Se
obin informaii utile legate de prezena bacteriilor, care orienteaz spre
abordarea n continuare a celor mai potrivite tehnici de diagnostic. n
unele cazuri, bacterioscopia direct poate fi hotrtoare pentru stabilirea
diagnosticului, cum este cazul n sifilisul primar, n gonoree la brbai, n
tuberculoz etc.
2.1.1.3. nsmnarea prelevatelor i izolarea agentului patogen
115

Permite, pe lng evidenierea populaiei bacteriene dintr-un produs,

izolarea agenilor patogeni din produsele pluricontaminate, etap
necesar identificrii majoritii bacteriilor cu potenial patogen.
2.1.1.4. Identificarea agentului patogen
Dup izolarea n cultur pur, bacteriile sunt supuse identificrii,
fcndu-se apel la proprietile morfotinctoriale, de cultur, biochimice i
de patogenitate ale acestora.
Cercetarea proprietilor morfotinctoriale ale germenilor din cultura
pur se face folosind aceleai metode de examinare, n raport cu
aspectul coloniei pe mediul de cultur, ca i pentru bacterioscopia
direct (mobilitate, form, dimensiuni, aezare, colorabilitate etc.).
Proprietile de cultur permit identificarea prezumtiv a agentului
cauzal i selecionarea de colonii pentru repicat n vederea altor teste de
identificare. Pentru descrierea aspectului pe medii solide se vor lua n
considerare mai ales: forma coloniilor, mrimea, consistena, culoarea,
mirosul, tipul hemolizei (dac este cazul), creterea pe mediile selectivdifereniale lactozonegative sau lactozopozitive, caractere importante
pentru orientarea terapeutic, dar n cele mai multe cazuri fiind necesar
completarea informaiilor cu caracterele metabolice, de structur
antigenic i de patogenitate ale bacteriei n cauz.
Investigarea proprietilor metabolice (biochimice), n care accentul
trebuie pus pe cele generale: catalaza, oxidaza, modul de degradare a
glucozei (F/O) i producerea de gaz, permite ncadrarea unor bacterii n
familii, genuri sau specii. n situaiile n care identificarea nu poate fi
realizat prin acest set de teste metabolice se va proceda la determinri
suplimentare, limitndu-se ns la strictul necesar.
Definirea caracterelor antigenice are o valoare diferit. Astfel, n unele
situaii, de exemplu n identificarea speciilor din genurile Salmonella,
Shigella, Vibrio, procedeul este indispensabil. n alte cazuri,
determinarea structurii antigenice are o valoare mai redus (pentru
meningococ, pneumococ, Brucella, Bordetella, streptococ) n comparaie
cu proprietile morfologice, culturale i metabolice, pe care le
completeaz. Uneori, procedeul acesta se folosete pentru precizarea
subspeciei (serotipului), nu ntotdeauna necesar pentru orientarea
terapeutic.
116

Cercetarea caracterelor antigenice se efectueaz n mod predilect prin

reacia de aglutinare pe lam i n tuburi, cu seruri imune standard. n
unele cazuri (de exemplu pentru streptococ) se folosete reacia de
precipitare.
Cercetarea caracterelor de patogenitate in vivo sau in vitro se face
prin reproducerea infeciei experimentale la animale de laborator,
evidenierea eliberrii de toxine sau produi celulari netoxici (coagulaz,
fibrinolizin, hialuronidaz, hemolizin etc.).
2.1.1.5. Determinarea sensibilitii la antibiotice
Antibiograma este o etap obligatorie dup identificare, n primul rnd
din motive clinicoterapeutice, dar i ca investigaie epidemiologic.
Aceasta se efectueaz pe subcultur bacterian pur i nu pe amestec
de bacterii.

2.1.2. Diagnosticul indirect serologic

Se bazeaz pe apariia anticorpilor specifici n sngele bolnavilor, a cror
prezen poate fi evideniat cu ajutorul antigenelor standardizate. Dar
reaciile serologice de diagnostic se folosesc, pe lng decelarea
anticorpilor serici, i n scopul determinrii unei stri de imunitate sau a
unei alergii.
2.1.2.1. Metodele de diagnostic serologic
Acestea utilizeaz reaciile de: aglutinare, precipitare, fixare a
complementului, seroneutralizare, imunofluorescen etc. n diagnosticul
serologic, antigenele standard necesare decelrii anticorpilor serici sunt
deci de tip aglutinant, hemaglutinant, fixatori de complement i
neutralizani.
Indiferent de felul reaciei antigen-anticorp, n executarea serologiei de
diagnostic trebuie respectate unele reguli generale:
interpretarea corect a reaciilor serologice este posibil, n
general, numai pe seruri duble, recoltate n diferite faze ale bolii, cu
117

urmrirea n dinamic a titrului anticorpilor;

dac nu este disponibil dect o singur prob de ser, rezultatul
nu poate fi considerat pozitiv dect n cazul n care titrul anticorpilor
depete de cel puin 2 ori pragul de specificitate, corelat cu un suport
clinic adecvat;
serul trebuie s fie limpede, nehemolizat, neinfectat i
decomplementat (inactivarea complementului prin nclzire la 560C, timp
de 30 de minute).

2.1.2.2. Metodele de diagnostic biologic

Prin inocularea intradermic a antigenului se poate stabili apariia unei:
reacii de neutralizare a toxinei prin antitoxinele din sngele
bolnavilor, n cazul testrii n difterie (reacia Shick) i n scarlatin
(reacia Dick);
reacii pentru decelarea strii de hipersensibilitate tardiv ce
nsoete unele infecii: reacia la tuberculin (reacia Mantoux n
tuberculoz), la brucelin (reacia Burnet n bruceloz), la tularin (n
tularemie) etc.
Procedeul i tehnica reaciilor intradermice, precum i interpretarea lor
sunt descrise la capitolele de diagnostic etiologic respective.

118

2.2.DIAGNOSTICUL INFECIILOR STAFILOCOCICE

Genul Staphylococcus face parte din familia Micrococaceae, care
cuprinde mai multe specii diferite, din care unele pot fi patogene pentru
om i animale.
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, aero-anaerobi facultativi, dintre care
semnificaie clinic au:
Staphylococcus aureus, coagulazo-pozitiv, n general patogen;
Staphylococcus epidermidis (albus), coagulazo-negativ, specie
lipsit n mod obinuit de patogenitate sau condiionat patogen, avnd
mai multe serotipuri.
Habitat. S. epidermidis face parte din microbiocenoza nazal i cutanat.
S. aureus poate fi ntlnit la purttorii sntoi n cavitatea nazal,
faringe, pe tegumente, n colon (deci, simpla prezen a acestuia n
organism nu nseamn infecie stafilococic).
Infecii stafilococice
Stafilococii, bacterii oportuniste (care produc mbolnviri numai n
anumite condiii), produc infecii diverse ca localizare, manifestri clinice
i evoluie.
Din gama larg de infecii, sunt caracteristice infeciile cutanate ca:
furunculul (care are punctul de plecare foliculul pilos, cu extindere n
profunzime); carbunculul; panariiul (infecia periunghial); hidrosadenita
(infecia glandelor sudoripare axilare); mastita (infecia glandelor
mamare); abcese profunde.
Alte localizri ale infeciei sunt: osteoarticulare (osteomielita); respiratorii
(sinuzite, otite, pneumonii secundare etc.); urogenitale; ale seroaselor
(meningite, pleurezii, peritonite); toxiinfecii alimentare i septicemii (cu
punct de plecare, frecvent din leziuni cutanate).
Unele serotipuri produc enterotoxine de tip A, B, C1, C2, D i E, care
ingerate, determin toxiinfecii alimentare, sursa fiind de obicei la nivel
cutanat (furuncul, mastit, panariiu etc.).
Staphylococcus aureus cauzeaz i sindromul de oc toxic, prin toxina
de sindrom toxic de tip 1 (TSST-1).

119

2.2.1. Diagnosticul de laborator

Este numai direct (bacteriologic).
2.2.1.1. Recoltarea produselor
Prelevarea se face n funcie de localizarea infeciei : puroi n infeciile
cutanate; snge pentru hemocultur n septicemie; exsudat faringian;
urin n infeciile urinare etc.
2.2.1.2. Examenul microscopic direct
Din prelevate se ntind frotiuri care se coloreaz Gram. n cazul unui
puroi stafilococic se evideniaz coci Gram-pozitivi, aezai n ciorchine,
extracelular, pe un fond colorat n rou, reprezentat de celule, detritusuri
celulare i fibrin (fig. 59).

Fig. 59. Stafilococi n puroi, aezai n ciorchine, ntre resturi celulare.

2.2.1.3. Izolarea
Se bazeaz pe capacitatea stafilococilor de a crete pe medii simple i
pe medii hiperclorurate (ca mediul Chapman). Pe geloz-snge se
dezvolt colonii cu diametrul de 2-3 mm, de consisten cremoas, de
-hemoliz ( plana III-1). Pe mediul selectiv Chapman se
difereniaz colonii manitol-pozitive (vireaz mediul n galben). De pe
aceste medii, pornind de la o colonie, se izoleaz germenul n cultur
pur, pe geloz-snge.

120

2.2.1.4. Identificarea
Proprietile morfotinctoriale
Stafilococii sunt coci Gram-pozitivi, aezai n ciorchine, mai rar n diplo
sau izolai. n culturile tinere de 4 ore, la unele tipuri de stafilococ, se
poate evidenia i capsula. Sunt imobili, nesporulai.
Proprieti de cultur
Stafilococul crete pe medii simple, fiind aerob-anaerob facultativ. Pe
medii lichide, tulbur uniform mediul. Pe mediile solide crete sub form
de colonii rotunde, cu marginile regulate, bombate i de culoare alb sau
galben-citrin-auriu. n raport cu pigmentaia, se pot ntlni deci: stafilococi
cu pigment auriu, cu pigment alb i cu pigment citrin. Stafilococul auriu
produce o hemoliz total, iar cel alb produce mai rar hemoliza.
Tipurile de hemoliz produse de stafilococi sunt:
- hemoliza, care apare dup o incubare la 370C (hemoliza de
tip cald) ca un halou clar de liz complet, cu marginile nebuloase n
jurul coloniei;
- hemoliza, care apare dup o incubare la 370C ca o
hemoliz incomplet, dar care se intensific la 40C (hemoliz de tip caldrece). n situaiile n care n frotiul direct se observ coci Gram-pozitivi
dispui n diplo sau n grmezi, iar culturile rmn negative, este posibil
implicarea cocilor anaerobi (Peptococcus).
Proprieti biochimice
Prezena catalazei este caracteristic genului Staphylococcus i
Micrococcus, pentru identificarea acestora fcndu-se apel la testul F-O
(fermentare-oxidare) care este F+ (la stafilococi) i oxidativ (O) sau inert
(I) la micrococi.
Staphylococcus aureus degradeaz oxidativ i fermentativ manitolul i
este coagulazo-pozitiv (caracter de patogenitate).
Staphylococcus epidermidis degradeaz numai oxidativ manitolul i este
coagulazo-negativ.

121

Structura antigenic
Peretele stafilococilor aurei hemolitici conin numeroase antigene de tip
ce pot fi puse n eviden i utilizate n epidemiologie (determinarea
serotipului). Exist, de asemenea, pe suprafaa stafilococilor, receptori
pentru bacteriofagi (virusuri ale bacteriilor), utilizai pentru determinarea
tipului de stafilococ prin fenomenul de lizotipie, util n anchetele
epidemiologice.
Tipizarea cu ajutorul bacteriofagilor specifici se bazeaz pe sensibilitatea
sau rezistena unui gen sau a unor specii fa de un set de bacteriofagi,
ncadrnd tipuri fagice, lizotipuri.
Tehnica utilizat pentru lizotipie (fig. 60) se bazeaz pe folosirea
spotului de bacteriofagie, n care, pe o cultur de stafilococ (tehnica se
aplic i pentru alte bacterii), nsmnat n pnz pe suprafaa unei
plci Petri cu mediu de cultur solid, se pune o pictur din suspensia de
bacteriofag (n fiecare ptrel alt fag). Dac bacteria este sensibil, n
ptrelul cu fagul respectiv nu se dezvolt cultura.
Cei mai utilizai bacteriofagi ai stafilococilor, n numr de 21, au fost
mprii n patru grupe:
grupa I: 29, 52, 52A, 79, 80, 81;
grupa a II-a: 3A, 3B, 3C, 55, 71;
grupa a III-a: 6, 7, 42E, 47, 53, 54, 55, 77;
grupa a IV-a: 42D.
Precizarea tipurilor fagice este de mare ajutor n ancheta
epidemiologic, pentru depistarea sursei de infecie.

Fig. 60 Lizotipia unei tulpini de Staphylococcus aureus

122

Caractere de patogenitate
Patogenitatea stafilococului poate fi evideniat prin teste in vivo i
in vitro, bazate pe proprietatea acestor bacterii de a elabora produi
extracelulari netoxici i exotoxine.
In vitro pot fi evideniate: coagulaza, fibrinolizina i
dezoxiribonucleaza.
Coagulaza (fig. 61) este considerat proprietatea cea mai util i
mai constant de apreciere a patogenitii unei tulpini de stafilococ.

Fig. 61- Testul coagulazei n tub. Superior testul coagulazei negativ (coninutul
este lichid). Inferior, testul pozitiv (plasma a fost coagulat)

Aceasta poate exista sub form de :

coagulaz liber care se evideniaz punnd 1 ml de plasm
mpreun cu o pictur din cultur n bulion, iar dup 4 ore la 370C
(examinare din 30 n 30 de minute) se formeaz (la culturile cu
coagulaz pozitiv) un coagul de fibrin;
coagulaza legat care se determin fcnd cu ansa o suspensie
din cultura de pe mediul solid ntr-o pictur de plasm uman, pe o
lam de sticl (se evideniaz precipitate de fibrin n plasm, n timp de
aproximativ 15 secunde).
Interpretare : Staphylococcus aureus este coagulazo-pozitiv i are
caractere de patogenitate, iar Staphylococcus epidermidis i
Staphylococcus saprophiticus sunt coagulazo-negativi.
Fibrinolizina reprezint proprietatea unor tulpini de stafilococ de a liza
fibrina i se evideniaz nsmnnd punctiform suprafaa unui mediu,
n care a fost ncorporat fibrin, a unei tulpini de stafilococ. Prin
eliberarea de fibrinolizin se pune n eviden un halou clar n jurul
culturii.
Dezoxiribonucleaza se pune n eviden prin nsmnri punctiforme pe
geloz a unei tulpini de stafilococ, geloza coninnd acid
123

dezoxiribonucleic. Dup dezvoltarea culturii, se acoper suprafaa plcii

Petri cu acid clorhidric 1,5 N. n aceste condiii, n jurul coloniilor care
posed dezoxiribonucleaz apar zone clare, transparente, restul
mediului devenind opalescent.
In vivo, testele de patogenitate in de proprietatea stafilococului patogen
de a produce exotoxine. Principalele teste in vivo se bazeaz pe:
activitatea dermonecrotic, aceasta constnd n apariia
necrozei uscate, cu escar detaabil, dup 48-72 de ore de la
inocularea intradermic a filtratului de cultur la iepure;
exfolierea tegumentar produs de exotoxina exfoliativ dintr-un
filtrat de cultur inoculat subcutanat la oarecele nou-nscut;
efectele enterotoxinei (exotoxin termorezistent eliberat n
intestin) produs de tulpinile de stafilococ patogen, aceasta fiind
responsabil de producerea toxiinfeciilor alimentare stafilococice.
Prezena enterotoxinei este evideniat prin testul Dolman, inoculnd
filtratul culturii, fiert 20 de minute, intraperitoneal, la pisoi tineri. Dup 1060 de minute, animalul devine agitat, prezint sialoree, contracturi
musculare abdominale, vrsturi n jet i diaree. Dup aproximativ o or,
animalul revine la stare normal. Enterotoxina poate fi evideniat i prin
reacia de dubl precipitare n gel de agar.
Dup identificarea stafilococilor patogeni, este obligatorie
efectuarea antibiogramei n vederea unei terapii corecte, dat fiind
frecvena tot mai mare cu care se izoleaz surse de stafilococi rezisteni
la antibiotice.

2.3. DIAGNOSTICUL INFECIILOR STREPTOCOCICE

Familia Streptococcaceae este format din mai multe genuri, dintre care,
de interes medical sunt:
genul Streptococcus, inclusiv Streptococcus pneumoniae
(pneumococul);
genul Enterococcus, germeni frecvent recunoscui ca ageni
patogeni;
genul Peptostreptococcus, streptococi anaerobi obligatorii.
Clasificarea streptococilor interesai n patologia uman s-a fcut dup
124

un ansamblu de caractere metabolice (capacitatea de a liza hematiile,

natura hemolizei), proprietile biochimice, ct i dup proprietile
antigenice: majoritatea speciilor patogene posednd n peretele
bacterian un polizaharid cu rol antigenic (poliozidul C), a crui
specificitate permite mprirea acestora n aa-zii streptococi grupabili
n 19 grupe (clasificarea Lancefield), notate cu A,B,C,...,U. Ali
streptococi care nu posed acest poliozid C, denumii streptococi
nongrupabili, sunt considerai ca fiind comensali.
Dup proprietile hemolitice tipul de hemoliz pot fi relevate 3
aspecte:
hemoliz total sau
- hemoliz, care se traduce printr-un
halou clar, perfect transparent n jurul coloanei, corespunznd unei lize
totale a hematiilor, cu distrucia stromei globulare (Streptococcus
pyogenes de grup A, Streptococcus de grup B, C, G etc.)(plana III-2);
o hemoliz incomplet sau
- hemoliz, care se prezint ca
un halou mai puin clar, cu marginile zonei de culoare verzuie neregulate
(Streptococcus viridans, S. mutans, S. sanguis, S. faecalis, S.
pneumoniae etc.);
absena hemolizei (Streptococcus de grup D, fr enterococ).

2.3.1. Infeciile streptococice

Bacterii cu mare diversitate i rspndire, streptococii pot fi ntlnii
ca fiind comensali la om, la nivelul tegumentelor i mucoaselor, sau ca
germeni patogeni.
Streptococcus pyogenes sau streptococul
- hemolitic de grup A, cu
localizare preferenial la nivelul amigdalelor i faringelui, este o bacterie
responsabil de numeroase infecii acute specifice (scarlatina i
erizipelul) sau nespecifice (angine bacteriene eritematoase i
eritematopultacee, deseori complicate cu abcese periamigdaliene).
Acesta poate cauza de asemenea: rinite purulente, sinuzite, otite medii
supurate, infecii cutanate (impetigo, piodermite), infecii genitale
(salpingite) etc. Complicaiile post-streptococice sunt: reumatismul
poliarticular acut i glomerulonefrita acut.
Streptococii din grupul B colonizeaz intestinul i tractul genital
feminin, fiind reprezentativ Streptococcus agalactiae, considerat actual
ca agent etiologic al septicemiilor i meningitelor neonatale. Infeciile la
adult sunt mult mai rare, descriindu-se complicaii dup avort sau
natere (endometrite urmate de septicemie) sau infecii variate la
subieci cu mecanisme de aprare deficitare.
125

Streptococii din grupele C i G, prin caracterele lor bacteriologice i

-hemolitici de cei din
grupul A, participnd la rspunsul imunitar. Streptococii din grupul C sunt
cei mai muli de origine animal i provoac ocazional infecii umane.
Streptococii grupului G sunt, n general, comensali ai pielii i mucoaselor,
dar pot produce angine i infecii cutanate.
Streptococii din grupul D. Pn n urm cu civa ani, n genul
Streptococcus de grup D erau inclui i enterococii, dup separarea
crora au rmas n acest grup: S. bovis, S. equinus, S. suis, care pot fi
considerai ca bacterii condiionat patogene, unele fiind comensale n
cadrul florei intestinale umane, ele fiind rar responsabile de septicemii
sau endocardite.
Enterococii, considerai ca bacterii comensale, cu localizare n tubul
digestiv, dar putnd coloniza i cile urogenitale, sunt responsabili de
infecii urinare, infecii biliare, septicemii i endocardite, dar semnificaia
lor patologic trebuie interpretat cu pruden, strict comparabil cu cea
streptococic i innd seama de multirezistena enterococilor la
antibiotice.
Streptococii din celelalte grupe sunt frecvent comensali, prezeni
predominant n cavitatea bucal i faringe: S. viridans, S. mutans, S.
sanguis, care pot fi izolai de la cazuri cu endocardit.

2.3.2. Diagnosticul direct

2.3.2.1. Prelevarea
Datorit localizrii predilecte a streptococilor n faringe, principalul produs
care se va recolta pentru diagnostic este exsudatul faringian. Acesta va fi
recoltat dimineaa, folosind tampoane faringiene sterile, cu precauii
pentru a se evita mbibarea tamponului cu saliv, urmrindu-se numai
tamponarea faringelui i a amigdalelor. n infecii cu alt localizare se va
recolta produsul adecvat.
2.3.2.2. Examenul microscopic direct
Deoarece n faringe exist ntotdeauna streptococi comensali,
examenul microscopic al secreiei faringiene este lipsit de semnificaie,
dar prezint importan raportul dintre aceti germeni i alii care se
gsesc obinuit n cavitatea bucal i faringe (fig. 62), descriindu-se n
126

detaliu germenii observai, cantitatea, aspectul dup coloraia Gram etc.

Dac produsul provine din puroi sau lichide biologice, prezena
streptococilor (coci Gram-pozitivi dispui n lanuri) are valoare
orientativ (fig. 63).

Fig. 62- Amestec de diferite specii de bacterii comensale ce pot fi gsite n

exsudatul faringian: streptococi (a); pneumococi (b); diplococi Gram-negativi
(Neisserii comensale) (c); bacili Gram-negativi (d); stafilococi (e)

2.3.2.3. Izolarea
Se face prin cultivare pe geloz - snge, bulion glucozat 0,2% cu cristal
violet i azid III de sodiu (mediul Picke), eventual replicarea coloniilor
din cultura primar pe medii: agar-bil-esculin (ABE) pentru streptococii
de grup D i pe ABE + bulion salin pentru enterococi.

Fig. 63. Streptococi aezai n lanuri, ntr-un frotiu din puroi

127

2.3.2.4. Identificarea
Proprieti morfotinctoriale
Sunt coci Gram-pozitivi, aezai n lanuri, uneori foarte lungi, rar izolai
sau n diplo (fig. 64).

Fig. 64. Streptococi ntr-un frotiu din cultur

Proprieti de cultur
Streptococii sunt germeni aerobi-anaerobi facultativi. n cultura primar
(a produsului) unele tulpini de streptococi cresc bine pe medii n
anaerobioz. Acestea sunt surse anaerobe prefereniale, aero-tolerante
graie unui sistem flavoproteinic. Streptococii patogeni necesit pentru
dezvoltare medii de cultur cu adaus de proteine native: snge, ser,
lichid de ascit. Pe medii lichide nu tulbur mediul, formnd un sediment
redus ca volum, care prin agitare se disperseaz sub form de grunji
(dezvoltare granular). Pe bulion cu snge, cultura se dezvolt cu
eliminarea hemoglobinei n urma hemolizei, sub aciunea streptolizinelor.
Pe geloz-snge apar colonii mici, cu zon complet sau incomplet de
hemoliz (descriere la nceputul acestui capitol).
Structura antigenic
Structura cea mai superficial a streptococului de grup A este o capsul
a crei compoziie i ofer proprieti antigenice, alturi de cele ale
128

structurilor peretelui celular: polizaharidul C i proteinele M, R i T. (fig.

65).
Polizaharidul C caracterizeaz, prin compoziia sa chimic i proprietile
sale antigenice, fiecare grup streptococic. Aceasta st la baza
clasificrii lui Lancefield n cele 19 grupe antigenice ale streptococilor
-hemolitic de grup A ca i a
celorlali se face prin extragerea carbohidratului C (prin tratare la cald cu
acid clorhidric sau prin tratare enzimatic) i utilizarea lui n reacii imune
cu seruri standard de grup A, B, C, D, F i G, grupe care se ntlnesc la
om. n acest scop se folosesc reacii de precipitare inelar sau reacii de
aglutinare pe lam a particulelor de latex sensibilizate sau prin tehnica
de coaglutinare a tulpinii Cowan I pe care se leag, prin Fc-ul lor, IgG din
serurile de grup.

Fig. 65. Structura peretelui Streptococului -hemolitic de grup A

Proteinele M, R i T ale streptococilor de grup A permit diferenierea mai

multor serotipuri. Proteina M, fiind specific de tip, ofer posibilitatea
separrii a peste 60 de serotipuri, constituind, n acelai timp, factorul
major de virulen a streptococului de grup A, protejnd bacteria de
fagocitoz.
Testul la bacitracin permite identificarea rapid a streptococilor de grup
A, uniform sensibili la acest antibiotic, iar cei non-grup A sunt rezisteni.
Dar sensibilitatea la bacitracin poate fi detectat i la unele tulpini de
streptococi -hemolitici de grup C, G i E i astfel testul pozitiv la
bacitracin poate fi comunicat ca streptococ -hemolitic prezumtiv de
grup A.
Testul CAMP realizeaz o ncadrare provizorie a unei tulpini n grupul B.
Pe o geloz cu snge se inoculeaz un striu dintr-o cultur de stafilococ
-hemolitic i perpendicular pe acesta, dar oprindu-se la o distan de 1
cm, se nsmneaz n striu cultura de streptococ. Streptococii din
grupul B produc factorul CAMP care mrete zona de hemoliz a
stafilococului, astfel c la ntlnirea celor dou striuri apare o zon de
129

hemoliz mai intens.

Majoritatea streptococilor de grup B produc proteina difuzabil (factorul
CAMP) care acioneaz sinergic cu hemolizina stafilococic i
determin liza complet a hematiilor n mediul de cultur.
Proprieti de patogenitate
Streptococii patogeni elaboreaz peste 20 de produi extracelulari toxici
i netoxici rspunztori de marea varietate a infeciilor provocate de
acetia. Unele dintre aceste produse sunt puternic antigenice i
determin apariia de anticorpi specifici utili pentru diagnostic.
Toxinele eritrogene sau exotoxinele pirogene streptococice sunt
responsabile de erupia scarlatinoas (exantemul i enantemul). Ele sunt
sintetizate de streptococi din grupul A care sunt supui unei conversii
lizogenice de ctre un bacteriofag specific.
Streptolizina O este o hemolizin oxigeno-sensibil cu efect cardiotoxic
i antigenic. n urma unei infecii cu streptococ de grupa A, creterea
titrului de antistreptolizin O (ASLO) permite un diagnostic serologic
retrospectiv utilizat, mai ales, pentru diagnosticul complicaiilor poststreptococice.
Streptolizina S este o hemolizin citotoxic neantigenic. Produce
hemoliza beta din jurul coloniilor de streptococi din grupurile A, C, G, L.
Streptodornaza B (dezoxiribonucleaza de tip B) este o enzim specific
ale crei proprieti antigenice sunt utilizate pentru diagnosticul serologic
al complicaiilor post-streptococice. Antistreptodornazele i ASLO sunt
anticorpii cei mai frecvent cercetai.
Streptokinaza (fibrinolizina) este o protein antigenic ce induce apariia
antistreptokinazei (ASK) i este sintetizat de streptococii de grup A, C i
G.
Hialuronidaza este o protein antigenic ce polimerizeaz substana
fundamental a esutului conjunctiv. Cercetarea antistreptohialuronidazei
(ASH) poate fi util pentru un diagnostic de complicaie poststreptococic neacompaniat de creterea altor anticorpi.

130

2.3.3. Diagnosticul indirect

2.3.3.1. Diagnosticul serologic
Reacia ASLO evideniaz anticorpii antistreptolizin O din serul
bolnavilor. Pentru titrarea anticorpilor se pune n contact streptolizina O
standard cu o serie de diluii din serul de cercetat. Dup incubare 15
minute la 370C (pentru a permite eventualilor anticorpi s neutralizeze
streptolizina) se adaug o suspensie de hematii i se incubeaz din nou
45 de minute la 370C (acolo unde streptolizina nu a fost neutralizat, se
produce liza hematiilor). Titrul reaciei, exprimat n uniti ASLO, este dat
de diluia din ultima eprubet n care hematiile au rmas nelizate. Pentru
tehnica standardizat diluiile se fac astfel nct s se realizeze
urmtoarele uniti: 12, 50, 100, 125, 166, 250, 333, 500, 625,..., 1250.
Reacia este pozitiv (semnificativ) peste 250 de uniti ASLO. O
cretere semnificativ a titrului de anticorpi n dou seruri prelevate la 7
i 15 zile interval are o mare valoare diagnostic. Detectarea simultan a
creterii titrului ASLO i a anticorpilor antistreptodornaz B este
considerat, de asemenea, important n diagnosticul serologic al
complicaiilor post-streptococice (vezi i 1.6.4.1.).
Se
mai
consider
util
cercetarea
antistreptokinazelor
i
antistreptohialuronidazelor. Se semnaleaz existena unui test ce ar
permite evaluarea global a nivelelor de anticorpi serici antistreptococici,
test de mare interes ce va permite o depistare rapid.
2.3.3.2. Diagnosticul biologic
Se utilizeaz n diagnosticul scarlatinei: boal general caracterizat
printr-o erupie cutaneo-mucoas, urmnd primei faringite cu un
streptococ de grup A (lizogenizat) productor de eritrotoxin. Imunitatea
antitoxic (cu nivele crescute de anticorpi specifici) poate fi de durat
mai lung sau mai scurt. Ea poate fi testat prin teste intradermice al
cror principiu se bazeaz pe proprietatea eritrotoxinei (Dick) de a
produce erupie cutanat i pe capacitatea anticorpilor (antitoxinei) de a
neutraliza toxina i a mpiedica producerea efectului eritrogen al
acesteia.
Reacia Schultz-Charlton (fenomenul de stingere a erupiei) are dou
variante:
procedeul direct ntr-o erupie suspect de scarlatin se
inoculeaz intradermic 0,2 ml ser de convalescent (cu certitudine trecut
131

prin infecia scarlatinoas). Antitoxina (anticorpii antitoxici) din serul

inoculat provoac n 18-24 de ore dispariia local a eritemului
scarlatinos i las nemodificat un eritem de alt etiologie;
procedeul indirect ntr-un eritem sigur scarlatinos se
inoculeaz intradermic 0,2 ml ser de la convalescentul unei boli eruptive
fr diagnostic precizat.
Reacia Dick
Este o reacie de neutralizare toxin antitoxin in vivo i se efectueaz
injectnd intradermic pe faa anterioar a antebraului, n volum de 0,1
ml, o doz reactiv cutanat (1 STD) de toxin Dick, iar la antebraul
opus toxin fiart (martor = toxin inactiv). O doz 1 STD de toxin
Dick produce un eritem cu un diametru de cel puin 10 mm n absena
anticorpilor (reacie Dick pozitiv). Lipsa eritemului la locul de inoculare a
toxinei arat existena anticorpilor n sngele bolnavului testat. Dac
eritemul apare la ambele antebrae, se interpreteaz fie ca o reacie
alergic la antigenele streptococice, fie ca o reacie combinat reacie
Dick pozitiv (lipsa anticorpilor i susceptibilitate fa de infecia
scarlatinoas) i reacie alergic.

2.3.4. Infecia pneumococic (Streptococcus

pneumoniae)
Pneumococul, Streptococcus pneumoniae, aparine genului
Streptococcus, fiind coc aero-anaerob, Gram-pozitiv. Este o bacterie
comensal n rinofaringe, dar n numr mic la om. Pneumococul are un
rol etiologic aparte n infecii variate, uneori grave i chiar mortale.
Infeciile pneumococice mai importante sunt:
infecii bronhopulmonare responsabili n peste 50% din
pneumoniile bacteriene, pneumococii fiind ageni etiologici ai pneumoniei
france lobare acute, dar i a bronhopneumopatiilor, bronitelor i
pleureziilor, precum i a complicaiilor septicemice n peste 30% din
cazuri;
infecii ORL: otite acute susceptibile de complicaii ca
mastoidite, sinuzite i meningite;
meningite primitive (infecie primar) sau secundare, cu
prognostic sever;
infecii mai rare: artrite, endocardite, peritonite etc.
132

Prezeni la numeroi purttori sntoi, pneumococii sunt considerai ca

bacterii cu transmitere interuman neepidemic i care produc boala
acolo unde gsesc teren favorabil.
2.3.4.1. Diagnosticul bacteriologic
Prelevarea produselor
Prelevarea se face n funcie de localizarea infeciei: expectorate sau
recoltri dirijate din cile bronice inferioare n cazul infeciilor
pulmonare, secreie otic, LCR, snge etc., n celelalte localizri.
Hemoculturile pot fi pozitive la cazurile cu pneumonie sau meningit.
Examenul microscopic direct
Examenul microscopic din produsul patologic, pe frotiuri colorate Gram,
are o importan major datorit morfologiei caracteristice a
pneumococilor: diplococi Gram-pozitivi lanceolai ncapsulai. n
expectorate se evideniaz diplococi capsulai cu morfologie
caracteristic, alturi de alte elemente prezente, iar n puroi se vd
pneumococi i numeroase leucocite polimorfonucleare (fig. 66). Dac
pneumococii sunt n numr mare, se poate completa examinarea cu
testul de umflare a capsulei al lui Neufeld, bazat pe proprietile
antigenice ale pneumococilor (vezi identificarea).

Fig. 66. Streptococcus pneumoniae ncapsulai, pe un frotiu efectuat din ficat

de oarece infectat experimental.

Izolarea

133

Se face prin nsmnarea pe medii cu proteine native (gelozsnge, geloz-ascit) i pe geloz-chocolat cu incubare n atmosfer de
CO2 10%. Pe geloz-snge, pneumococul se dezvolt sub forma unor
colonii mici (1 mm diametru), nconjurate de o zon de hemoliz alpha
(verzuie), iar pe geloz-chocolat colonia este delimitat de o zon
galben-verzuie.
Rezultate bune se pot obine prin inocularea produsului patologic
intraperitoneal la oarecele alb. Dac este prezent un pneumococ
virulent, n 24-48 ore oarecele moare prin septicemie. Dac se cultiv
sngele recoltat din cordul animalului, se va obine cultur pur de
pneumococ. n frotiurile fcute din amprente de splin sau ficat se
evideniaz numeroi diplococi Gram-pozitivi cu capsul (fig. 66).
Identificarea
Proprietile morfotinctoriale. Pneumococii sunt germeni Grampozitivi, lanceolai, aezai n diplo, cu capsul, mai ales n produsul
patologic i mai puin n cultur.
Proprietile de cultur. Pe medii adecvate, coloniile sunt mici,
transparente, plate, cu alphahemoliz. Cultivai pe bulion Tiem, se
poate evidenia proprietatea de bilioliz a pneumococului.
Un test valoros de identificare a pneumococilor l constituie
sensibilitatea lui la optochin; cultura fiind inhibat n jurul rondelelor
mbibate cu aceast substan (fig. 67).
Proprieti biochimice. Pneumococul fermenteaz inulina pe mediul
Hiss.

Fig. 67. Testul de sensibilitate la optochin. Superior, testul pozitiv

(pneumococi). Inferior, testul negativ (alte specii de streptococi).

Proprieti antigenice. Identificarea serologic a tulpinilor de

pneumococ prin reacia de umflare a capsulei sau prin recia de
aglutinare este posibil n ara noastr pentru serotipurile 1, 2 i 3.
134

Testul de umflare a capsulei (testul Neufeld) se realizeaz punnd

n contact pe lama de sticl cte o pictur din cultura de pneumococ cu
seruri antipneumococice de tip, precum i o pictur dintr-o soluie de
albastru de metilen. Se examineaz la microscop ntre lam i lamel i
se constat o mrire de volum a capsulei, acolo unde exist
coresponden ntre tulpina de cercetat i tipul serului standard.
Evidenierea antigenelor capsulare solubile poate fi realizat n
LCR, lichidele peritoneale i sngele bolnavilor, fiind de mare interes
pentru un diagnostic rapid i n caz de infecii decapitate prin
antibioterapie

135

2.4. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU NEISSERII

Genul Neisseria cuprinde coci Gram-negativi, strict aerobi, diplococi
uniformi, catalazopozitivi i oxidazopozitivi, din care se disting:
dou specii patogene specifice pentru om: Neisseria
gonorrhoeae (gonococul) i Neisseria meningitidis (meningococul);
numeroase specii comensale: N. flava, N. sicca, N. lactamica
etc., bacterii ce se comport din punct de vedere al patogenitii ca
oportuniste (produc boala numai n anumite condiii, favorizante).
-

Neisseria catarrhalis a fost reclasificat n genul Branhamella.

2.4.1. Diagnosticul infeciilor gonococice

Gonococul este o bacterie patogen strict uman, agent etiologic al
gonoreei (blenoragiei), boal veneric frecvent ntlnit sub form de
infecie acut local care, netratat corect, se cronicizeaz ducnd la
complicaii. Cea mai frecvent este uretrita gonococic (anterioar - n
faza acut) la brbat; vulvovaginita i cervicita gonococic la femeie. Prin
infectarea ftului, n timpul travaliului, de la mama blenoragic, se poate
produce oftalmia gonococic a noului nscut.
Uretrita gonococic anterioar, acompaniat de secreie purulent
(de obicei verzuie), cu dureri la miciune, dup o perioad de incubaie
de 3-5 zile, uneori mai multe zile, se poate complica dac nu este tratat,
propagndu-se n cile genitale, dnd infecii ale epididimului, prostatei i
testiculelor.
Blenoragia la femei, contrar celei de la brbat, debuteaz
asimptomatic, pentru a deveni evident dup extinderea infeciei la
nivelul uretrei, de obicei nsoit de bartholinit (cnd se poate recolta
secreie purulent de la nivelul glandelor Bartholin), dar - cel mai frecvent
- bolnava se prezint la consultaie pentru leucoree, n acest caz
constatndu-se de regul i o recidiv, ce se poate complica mai trziu
cu peritonit.
De reinut: gonococul fiind foarte fragil, nu supravieuiete n mediul
extern, de aceea, contaminarea are loc prin contact direct (n raporturile
136

sexuale). Depistarea i tratarea unui bolnav nu are deplin utilitate dect

dac este completat cu depistarea i tratarea partenerului.
2.4.1.1. Diagnosticul direct
n diagnosticul acestor afeciuni se apeleaz numai la diagnosticul
bacteriologic (direct), deoarece nu dispunem la ora actual de reacii
imunologice sensibile, fiabile i specifice.
Recoltarea produselor patologice
La brbat, n cazul uretritelor acute, se recolteaz puroi uretral, cu ansa
ori cu un tampon subire, iar n formele subacute, dac secreia uretral
este minim i intermitent, se face o recoltare matinal (pictura
matinal), naintea primei miciuni. n leziuni extinse, se practic
recoltarea secreiei prostatice dup masaj prostatic concomitent cu
efectuarea unei spermoculturi.
La femeie, se fac sistematic, mai multe prelevri: de la nivelul
uretrei, orificiilor glandelor Bartholin, endocolului.
Este preferabil ca recoltarea s se fac n laborator, iar - dac produsele
se vor transporta - este necesar folosirea mediilor de transport.
Examenul microscopic direct
Prezint un interes deosebit pentru diagnostic n uretritele acute ale
brbatului, n care (dup etalarea frotiului i colorarea cu albastru de
metilen i coloraie Gram) se pun n eviden diplococii, reniformi,
intracelulari, Gram-negativi (fig.68).

137

Fig.68 Neisseria gonorrhoeae ntr-un frotiu din secreie uretral

(puroi gonococic). Majoritatea gonococilor sunt intracelulari, n PMN.

n celelalte forme de gonoree, n particular n uretritele cronice la brbat

i infeciile genitale la femeie, germenii specifici sunt rari sau predomin
flora bacterian asociat, fapt pentru care examenul microscopic este
puin relevant, iar cultivarea produselor este un mijloc mai eficient de
diagnostic bacteriologic.
Cultivarea gonococilor
Cultivarea produselor pentru izolarea gonococilor este delicat i
necesit nsmnarea imediat dup prelevare pe medii (prenclzite)
Mueller-Hinton cu snge sau pe medii chocolat. Mediile nsmnate se
incubeaz 48 ore la 370C n atmosfer de bioxid de carbon 10%.
Identificarea
Criterii morfologice: coci Gram-negativi n diplo (aspectul boabelor
de cafea).
Criterii de cultur: colonii opace, gri, granulare, convexe,
strlucitoare, de 1-2 mm diametru.
Caractere biochimice: sunt germeni catalazo-pozitivi; testul
oxidazelor este pozitiv i fermenteaz glucoza.
Antibiograma este obligatorie deoarece frecvena tulpinilor
rezistente la antibiotice este n continu cretere.

2.4.2. Diagnosticul infeciilor cu meningococi

Neisseria meningitidis, agentul cauzal al meningitelor
meningococice, este o bacterie cu patogenitate specific, adaptat strict
speciei umane, avnd habitatul pe mucoasa cilor respiratorii superioare,
138

astfel c poate fi gsit n rinofaringele purttorilor sntoi sau al

bolnavilor cu rinofaringite manifeste clinic. n condiii de scdere a
rezistenei naturale i/sau a imunitii, prin traversarea barierei mucoase,
ajunge n curentul sanguin i, prin acesta, n sistemul meningeal, unde
poate produce dou tablouri clinice principale:
meningita cerebro-spinal, n care sindromul meningeal are un
debut brutal i care, n lipsa tratamentului, provoac coma i moartea
bolnavului;
forma septicemic sau meningococemia grav (cu febr mare,
rash cutanat etc.), uneori mortal prin oc endotoxic.
n afara acestor forme clinice grave, se pot observa rinofaringite acute,
otite, conjunctivite, pericardite, infecii respiratorii etc.
Diagnosticul este numai direct -bacteriologic- examinarea LCR-ului fiind
una dintre cele mai urgente probe de microbiologie.

2.4.2.1. Recoltarea produselor

LCR-ul se recolteaz n condiii de absolut sterilitate, ct mai aproape
de debutul bolii i, de preferat, naintea nceperii tratamentului cu
antibiotice. n cazul meningitelor, de regul, LCR-ul este opalescent sau
purulent. n cazul n care aspectul lichidului sugereaz o etiologie
bacterian (lichid tulbure) se procedeaz la nsmnare la patul
bolnavului a 0,2-0,5 ml LCR n tuburi cu: bulion Tiem, geloz-snge i
geloz-chocolat, iar transportul flaconului cu LCR i a tuburilor cu medii
se face imediat i la temperatur ct mai apropiat de 370C.
Concomitent se recolteaz i exsudatul faringian, iar n cazurile cu debut
sugestiv pentru atingerea meningeal hemocultura este obligatorie.
2.4.2.2. Examenul microscopic direct
Include examinarea citologic pentru orientare i cea bacteriologic dup
coloraiile Gram, Ziehl-Neelsen i coloraia Giemsa.
n meningitele acute bacteriene, pe lng prezena unui lichid purulent,
hipertensiv, se observ la examenul microscopic, sute sau mii de
elemente celulare pe mm3, cu predominana net a polinuclearelor.
Bacterioscopia evideniaz coci Gram-negativi, n diplo, deseori
139

intracelulari.
2.4.2.3. Izolarea
Se face (n afara mediilor amintite mai sus) pe geloz-snge MuellerHinton glucozat, cu ageni selectivi (lincomicin i colimicin) care
inhib dezvoltarea florei comensale (de exemplu, neisseriile comensale
oro-faringiene). Mediile de cultur se incubeaz n atmosfer de bioxid
de carbon, la 370C. Dup 18-24 de ore, meningococii se dezvolt sub
forma unor colonii S, rotunde, nepigmentate, nehemolitice, asemeni
picturilor de rou.
2.4.2.4. Identificarea
Caracterele morfotinctoriale ale germenilor izolai prin cultivare arat,
la examenul microscopic al culturii, diplococi Gram-negativi sau Gramlabili, cu frecvente elemente celulare (bacteriene) lizate.
Proprietile de cultur sunt, n primul rnd, legate de creterea pe
mediile selective; fiind strict aerob, crete numai la temperatura de 370C
i incubat n atmosfer de CO2 10%. Dup 24 de ore, coloniile sunt
translucide, lenticulare, de aspect cenuiu.
Caracterele biochimice de mare importan sunt date de reacia
oxidazei (dup metoda Kovacs), pozitiv la grupul Neisseria, la
meningococ fiind nsoit de fermentarea glucozei i maltozei, fr
producere de gaz.
Caracterele antigenice se bazeaz pe prezena unui poliozid capsular
antigenic i a unor proteine din membrana extern, ambele avnd
specificitate ce permite definirea mai multor serogrupuri: A, B, C, X, Y, Z,
29E, W135 etc., precum i a diverselor serotipuri cu importan
epidemiologic.
Practic, ncadrarea n aceste grupe se face cu ajutorul serurilor standard.
Reacia de precipitare Vincent-Bellot utilizeaz LCR n care se gsesc
140

antigene de natur polizaharidic eliberate prin autoliza meningococilor,

care - n contact cu serul antimeningococic - formeaz un inel de
precipitare. Reacia amintit se poate realiza i prin tehnici de
imunofluorescen i contraimunoelectroforez, permitnd identificarea
antigenelor meningococice, direct n LCR.

2.5. DIAGNOSTICUL DIFTERIEI

Agentul etiologic al difteriei, Corynebacterium diphtheriae, este
reprezentantul (specia tip) genului Corynebacterium, n care sunt reunite
numeroase alte specii bacteriene, dintre care se cer amintite cele
comensale, prezente n microbiocenoza faringian i cutanat: C.
xerosis, C. hoffmani etc., cunoscute sub denumirea de pseudodifterici
sau difteromorfi, cu care bacilul difteric se poate confunda n cadrul
examenului de laborator.
Difteria se datoreaz toxiinfeciei, caracterizat prin:
angin pseudomembranoas (crup difteric), dat de false
membrane ce pot acoperi amigdalele, pilierii i vlul palatin, ntinznduse spre faringe i producnd asfixie prin obstrucie laringian;
efectele toxice (toxemia) la distan, date de exotoxina difteric
care difuzeaz n organism n timp ce bacilul difteric rmne localizat i
se nmulete n faringe.
Alte localizri:
-

pe mucoase, producnd: rinita difteric, conjunctivit etc.;

pe tegumente, unde bacilul difteric poate infecta leziuni cutanate

preexistente, dnd ulceraii profunde, cu stare general alterat.
n cadrul speciei Corynebacterium diphtheriae au fost separate, pe baza
unor proprieti patogenice, trei tipuri: gravis, izolat iniial din forme grave
de boal; mitis, izolat n general din forme clinice mai uoare, i tipul
intermedius.
141

2.5.1. Diagnosticul direct

Diagnosticul de laborator urmrete izolarea bacililor difterici de la
bolnavi sau de la purttori i identificarea lor.
2.5.1.1. Prelevarea produselor patologice
n angina difteric se recolteaz exudat faringian -trei tampoaneurmrind detaarea unor poriuni din falsa membran sau din depozitele
aderente de pe amigdale. Pentru depistarea purttorilor, se recolteaz un
tampon faringian i unul nazal. n alte forme clinice, se prelev secreia
purulent din leziune, concomitent cu investigarea cavitii nazale i a
faringelui.
2.5.1.2. Examenul microscopic direct
Din primul tampon recoltat de la bolnav se fac dou frotiuri: unul
pentru coloraia Gram, cellalt pentru coloraia special del Vecchio
prin care se evideniaz corpusculii metacromatici Babe-Ernst.
Examenul microscopic al frotiului evideniaz bacili Gram-pozitivi de
form caracteristic (fig.69): drepi sau uor ncurbai, cu una sau
ambele extremiti umflate (coryne = mciuc), datorit corpusculilor
metacromatici. Aezarea n frotiu sugereaz litere chinezeti.

Fig. 69 Aspecte ale bacililor difterici:

a- dispui n rnduri; b- dispersai; c- n form de V.

142

2.5.1.3. Izolarea
Al doilea tampon recoltat de la bolnav sau tamponul de la purttor
se introduce n mediul de mbogire OCST (ou-cistein-ser-telurit de K)
i se incubeaz 18-24 ore la 370C, dup care se fac treceri din acest
mediu, pe un mediu selectiv mediul Tinsdale. Al treilea tampon de la
bolnav este nsmnat pe:
mediul Lffler, mediu de elecie, care permite o dezvoltare mai
rapid (12 ore) a bacilului difteric;
mediul Tinsdale cu telurit de K, pe care bacilul difteric d colonii
mici, negre, cu halou brun, iar difteromorfii prezint colonii negre,
lucioase, fr halou (plana III-3);
st

mediul geloz-snge, pe care se va face izolarea eventualilor

-hemolitici, cu care bacilul difteric poate coexista.

2.5.1.4. Identificarea
Proprieti morfotinctoriale
Se fac de obicei frotiuri din culturile izolate pe mediul Lffler. Coloraia
Gram permite evidenierea bacililor Gram-pozitivi caracteristici, iar
coloraia del Vecchio evideniaz corpusculii metacromatici care apar
colorai n brun verzui, iar corpul bacterian n galben.
Caracterele de cultur
Bacilul difteric este aerob, microaerofil, creterea lui este favorizat
de adugarea cisteinei i a proteinelor native.
Dup aspectul culturii pe medii solide, Gndel-Tietz i Lffler,
precum i n mediile lichide, se recunosc cele trei tipuri de bacil difteric:
gravis: pe mediu solid crete sub form de colonii rugoase al
cror aspect a fost comparat cu o floare de margaret; mediul lichid este
limpede, cu pelicul granular i depozit;
mitis: colonii de tip S, netede, untoase, bine delimitate; tulbur
uniform mediul;
-

intermedius: colonii rotunde cu suprafa neregulat; medii

143

lichide limpezi, cu depozit.

Caracterele biochimice
Exist teste care urmresc definirea speciilor din genul Corynebacterium
i a tipului (gravis i nongravis) n cadrul speciei. Astfel, Corynebacterium
diphtheriae fermenteaz glucoza i maltoza, producnd hidrogen sulfurat
(test negativ la difteromorfi, care fermenteaz mai multe zaharuri). Tipul
gravis descompune dextrina, amidonul i glicogenul, spre deosebire de
celelalte dou tipuri.
Testele biochimice convenionale se fac pe medii de cultur, cum este
mediul Hiss n care s-au ncorporat substanele mai sus amintite i un
indicator de pH, indicatorul Andrade.
Corynetestul este un test miniaturizat destinat identificrii biochimice la
corynebacterii. Substratul este reprezentat de microdiscuri impregnate cu
zaharuri, avnd ca indicator albastru de bromtimol. Este un test rapid i
se efectueaz n plci din plastic cu godeuri. n fiecare godeu se
repartizeaz cte 2 discuri din fiecare zahar, n ordinea cunoscut:
glucoz, zaharoz, dextrin, glicogen, peste care se adaug cte 5
picturi dintr-o suspensie dens de cultur n ser fiziologic. Se incubeaz
placa (acoperit cu un capac) la 370C, timp de 4 ore, dup care se
citete reacia. Interpretare: galben = pozitiv (++); galben-verde = slab
pozitiv (+); albastru = negativ.

Teste de patogenitate
Se utilizeaz pentru evidenierea proprietii de toxinogenez.
Testul de toxinogenez in vitro Elek-Ouchterlony permite determinarea
elaborrii de exotoxin difteric, prin metoda de precipitare n gel (fig.70).

144

Fig. 70 Testul Elek pentru evidenierea tulpinilor toxigene de

Corynebacterium diphtheriae

Tehnica. n plci Petri cu geloz preparat cu ser de bou, se depune o

band de hrtie de filtru (steril) mbibat cu ser antitoxic (ser antidifteric
ce conine anticorpi antitoxin). Perpendicular pe banda de hrtie de
filtru se nsmneaz: tulpinile de cercetat; un martor sigur toxigen i un
martor netoxigen. Dup 24 de ore de incubare la 370C, tulpinile toxigene
vor prezenta linii de precipitare la locul de ntlnire dintre toxin i
anticorp (Corynebacterium diphtheriae toxigen).
Testele de patogenitate in vivo se efectueaz prin:
inoculare intradermic la iepure (testul Fraser) a unui filtrat din
cultur de bacili difterici toxigeni i urmrirea reaciei dermatonecrotice
(necroza esuturilor dermice) care apare la 2 3 zile la locul inoculrii
(reacia nu apare dac animalul este protejat cu ser antidifteric);
inoculare subcutanat la cobai a unui filtrat de cultur pentru
testat. n cazul unei tulpini toxinigene, cobaiul moare n urmtoarele 24
48 de ore, prezentnd semne specifice de intoxicaie difteric. n schimb,
cobaii protejai cu ser antidifteric nu vor prezenta semne de boal.
Inocularea toxinei la cobai a permis stabilirea unitii de msur in vivoa dozei limit mortale DLM. O doz limit mortal (1 DLM) de toxin
difteric este cantitatea de toxin care omoar un cobai de 250 g n patru
zile.
Lizotipia se practic n scop epidemiologic, fiind util identificrii tulpinilor
de Corynebacterium diphtheriae cu ajutorul unui set de 19 bacteriofagi.
145

2.5.2. Diagnosticul indirect

Este util pentru testarea imunitii antidifterice n colectiviti i pentru
controlul eficienei vaccinurilor.
Pentru investigarea nivelului de imunitate al populaiei se utilizeaz testul
intradermic Schick, test de neutralizare toxin antitoxin. Prin acesta
se stabilete dac un individ este susceptibil de a face boala sau este
imun.
Testul Schick se practic prin inocularea intradermic la antebraul drept
a 0,2 ml toxin difteric cu un coninut de 1/50 din DLM, iar la antebraul
stng se inoculeaz martorul Schick (aceeai toxin nclzit la 800C,
timp de 20 de minute). Citirea reaciei se face la 48 de ore: lipsa
anticorpilor antitoxici circulani se traduce prin apariia unei reacii
eritematoase, care poate varia ca mrime i intensitate, lundu-se ca
reacie pozitiv cea indicat de un eritem cu diametrul de minimum 10
mm. Reacia negativ arat c n sngele individului exist peste 0,03
UI/ml antitoxin difteric, cantitate numit i titru minim protector.
Apariia eritemului i la antebraul stng (pseudo-reacie) arat o
alergizare la proteinele toxice difterice.
La persoanele cu reacie Schick pozitiv (care nu au anticorpi la titrul
minim protector) se practic vaccinarea cu anatoxin difteric vaccin
puternic ce confer o imunitate solid. Vaccinarea antidifteric
presupune un program de aplicare riguroas cu vaccinuri asociate, ca de
exemplu: trivaccinul cu respectarea dozelor i intervalelor, fapt ce
poate duce la o reacie Schick negativ la cel puin 95% din persoanele
vaccinate.

146

2.6. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU

BACILLUS I LISTERIA
Bacilii Gram-pozitivi, alii dect cei din genul Corynebacterium, cu
pondere mai redus n patologia infecioas, au caractere morfologice i
de cultur asemntoare, fiind prezeni n cadrul florei bacteriene a unor
caviti deschise. n funcie de dezvoltarea pe medii de cultur au fost
mprii n dou grupe:
bacili Gram-pozitivi cu dezvoltare rapid: Bacillus, Listeria,
Erysipelothrix i Lactobacillus;
bacili Gram-pozitivi cu dezvoltare lent: Actinomyces, Nocardia
i unele specii din genul Mycobacterium.

2.6.1. Bacillus anthracis

Germenii genului Bacillus, cu o singur specie care are semnificaie
clinic deosebit Bacillus anthracis sau bacteria crbunoas se pot
separa uor prin caracterul lor morfologic principal prezena sporilor.
Fiind bacterii aerobe sau aerob-anaerobe facultative, sporii pot lipsi n
culturi tinere i n unele produse patologice.
n acest gen sunt cuprinse i specii bacteriene saprofite: B. subtilis, B.
cereus, B. polimixa etc., care, datorit rezistenei sporilor, pot contamina
uor materialele medico-chirurgicale, alimentele, mediile de cultur etc.
Singura specie patogen la om, Bacillus anthracis (bacteria crbunoas)
produce crbunele la animale (ovine, bovine) antropozoonoz ce poate
contamina omul prin contact cu animalul bolnav sau cu produsele
provenite de la acesta. Bacilii pot penetra pielea la nivelul leziunilor
acesteia i se nmulesc local, la poarta de intrare, formnd pustula
malign ce se dezvolt, trecnd prin diferite stadii, pn la acoperirea
de o crust neagr (de unde i numele de crbune). O parte dintre bacili
pot ajunge n snge, producnd septicemie i localizri viscerale
(intestinale, pulmonare etc.).

147

2.6.1.1. Diagnosticul de laborator

Este direct i urmrete izolarea agentului etiologic din produsele
patologice.
Recoltarea produselor
Principalul produs, serozitatea din pustul, se recolteaz cu o pipet
Pasteur steril. n formele pulmonare se recolteaz sput, iar n cele
intestinale, materii fecale. n toate cazurile cu septicemie, se recolteaz
snge pentru hemocultur.
Examenul microscopic direct
Pe frotiul colorat Gram se vd bacili lungi Gram-pozitivi, ncapsulai
(capsula aprnd ca o zon clar n jurul fiecrui bacil), aezai n lanuri
(streptobacili) (fig.71). n lichidul din pustul, n preparat nativ, se vd
numeroi bacili lungi, imobili.

Fig. 71 Preparat din cultur de Bacillus anthracis, cu spori ovali

n centrul bacteriei.

Izolarea
Bacillus anthracis crete pe medii simple i pe geloz-snge n
condiii de aerobioz. Pentru diagnosticul de laborator al crbunelui este
necesar i inocularea subcutan la oarecele alb a produsului
patologic, testul patogenitii pentru cobai oferind un diagnostic de
certitudine, deoarece inocularea este urmat, n cazul infeciei
crbunoase, de septicemie mortal.
148

Identificarea
Proprietile morfotinctoriale: bacili lungi, groi, drepi, cu capetele
tiate drept, aezai n lanuri asemntor trestiei de bambus (fig. 72).
Sunt bacili capsulai, imobili i sporulai (cu sporul situat central, mai mic
dect diametrul celulei).

Fig. 72 Preparat din cultur de Bacillus anthracis

(streptobacili lungi, cu capetele tiate drept i cu aezare caracteristic)

Proprietile de cultur: sunt bacterii nepretenioase i cresc pe medii

simple, sub form de colonii uscate -de tip R- glbui, cu marginile
dantelate, care emit filamente subiri, vizibile cu lupa, comparate cu o
coam de leu sau un cap de meduz. Pe gelatin, nsmnat prin
nepare, crete sub forma unui brad inversat, lichefiind mediul n
poriunea superioar. Fiind proteolitic, cultura se nsmneaz pe plci
cu gelatin, iar fenomenul apare dup 2-3 zile. Pe ser coagulat apar
colonii albicioase, care lichefiaz mediul.
Proprietile biochimice: B. anthracis este zaharolitic, proteolitic i
lichefiaz lent gelatina.
Proprietile antigenice: are un antigen capsular de natur polipeptidic,
un antigen proteic i altul polizaharidic, legai de peretele celular. Prin
extracie la cald, antigenul polizaharidic este folosit n reacia Ascoli
pentru diagnosticul retrospectiv la animalele moarte de infecie
crbunoas.
Caracterele de patogenitate: inocularea subcutanat la oarece
determin septicemie i moartea animalului n 24-48 ore, iar n
amprentele din splin, colorate Gram, se observ numeroi bacili Gram149

pozitivi capsulai. Infecia experimental la oarecele alb este prob

obligatorie pentru identificarea B. anthracis.

2.6.2. Listeria monocytogenes

Bacterie larg rspndit n natur, poate contamina produsele
alimentare, iar la om poate fi ntlnit la purttori sntoi cu localizare
digestiv tranzitorie, de aceea este considerat ca un germen patogen
oportunist. Pentru explicarea invaziei organismului i gravitatea bolii au
fost invocate modificrile date de imunodepresii, neoplazii, pacieni sub
chimioterapie ndelungat etc. La adult poate produce: meningite,
meningo-encefalite, septicemii i, mai rar, afeciuni cu localizare ocular,
ORL, endocardite etc. S-au descris i forme materno-fetale date de
Listeria monocytogenes prin transmiterea de la mama aparent sntoas
la ft, producnd frecvent avort.
2.6.2.1. Diagnosticul direct
Prelevarea. Produsele contaminate natural, ca: secreii vaginale,
esuturi, materii fecale, se recolteaz cu scopul de a fi nsmnate direct
pe medii selective, iar cele necontaminate: LCR, snge, avortoni, se
examineaz microscopic i se trec pe medii selective.
Examenul microscopic evideniaz bacili mici Gram-pozitivi,
mobili la 220C. Majoritatea acestora sunt intracelulari, n monocite.
Cultivarea se face pe un bulion cu tiogliconat de sodiu i, din
aceasta, se fac treceri pe geloz triptozat sau pe alte medii complexe,
n primele zile acestea fiind incubate la 40C, apoi la 370C, cnd se
examineaz coloniile prin tehnica iluminrii oblice, care permite
evidenierea coloniilor cu irizaie albstruie de Listeria monocytogenes.
Identificarea se face prin teste biochimice: sunt catalazo-pozitivi,
produc fermentarea glucozei etc.; mobilitatea la 220C. Identificarea
serologic se face cu ser polivalent i cu seruri de tip n cadrul reaciilor
de aglutinare.
2.6.2.2. Diagnosticul indirect
Diagnosticul indirect se poate practica prin reacii de hemaglutinare, RFC
etc., dar acesta ridic probleme, n primul rnd, legate de producia
inconstant de anticorpi.
150

2.7. DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI

Tuberculoza este o afeciune specific dat de bacterii din genul
Mycobacterium care cuprinde bacili acido-alcoolo-rezisteni, aerobi,
imobili, nesporulai, avnd un perete celular glicolipidic complex care
confer proprietile de acido-rezisten i caracterul granulomatos al
infeciei tuberculoase.
Se distinge un numr mare de specii de micobacterii, unele fiind
patogene pentru om i animale, altele saprofite prezente n ap, n sol,
dar i n unele produse patologice.
Micobacteriile patogene care produc tuberculoza la om sunt:
Mycobacterium tuberculosis (bacilul Koch de tip uman),
principalul agent cauzal al tuberculozei umane;
Mycobacterium bovis produce tuberculoza bovideelor, dar i a
omului;
Mycobacterium africanum patogen pentru om (are caractere
intermediare ntre bacilul Koch de tip uman i cel de tip bovin).
n marea majoritate a cazurilor, tuberculoza are o localizare pulmonar,
putndu-se distinge:
prima infecie tuberculoas;
tuberculoza pulmonar infiltrativ sau cavitar (forma puternic
contaminant);
tuberculoza ganglio-mediastinal;
pleureziile tuberculoase;
tuberculoza miliar pulmonar.
Localizri extrapulmonare: meningeal, osoas, articular, ganglionar,
renal, suprarenalian, digestiv etc.
Micobacteriile zise atipice, pe lng cele saprofite sau comensale
umane, cuprind un numr important de bacterii patogene oportuniste,
responsabile de infecii numite micobacterioze, cu localizare pulmonar,
ganglionar sau cutanat. Diagnosticul de micobacterioz se bazeaz pe
o serie de criterii, dintre care izolarea repetat a aceleai specii de
micobacterie atipic, n absena bacililor tuberculoi, este condiia
esenial. Frecvena mbolnvirilor cu micobacterii atipice este n
cretere, mai ales n rile n care tuberculoza este n scdere, acest fapt
datorndu-se i sindromului imuno-deficienei dobndite (SIDA), la aceti
151

subieci ntlnindu-se frecvente infecii generalizate cu micobacterii.

Exist mai multe clasificri ale micobacteriilor atipice, dintre care
cea mai frecvent acceptat este aceea care descrie patru grupe
principale de micobacterii.
Grupa I sau micobacterii fotocromogene, ale cror colonii se
pigmenteaz dup expunere la lumin:
M. kansasii produce infecii pulmonare i osteoarticulare,
uneori ganglionare;
M. marinum determin infecii cutanate.

Grupa II sau micobacterii scotocromogene, ale cror colonii

se pigmenteaz n galben oranj. Aceast grup cuprinde specii
saprofite gsite de obicei n ap, dar i dou specii cu potenial de
patogenitate:
M. scrofulaceum produce infecii ganglionare la copii;
M. szulgai specie ce determin excepional infecii pulmonare
ganglionare sau cutanate.

Grupa III sau micobacterii necromogene, ale cror colonii

sunt, n general, nepigmentate:
M. avium intracelulare produce infecii pulmonare mai ales
ganglionare, osoase i articulare. Este agentul esenial al infeciilor
generalizate cu micobacterii atipice care se observ la bolnavii de SIDA;
M. xenopi - specie mai frecvent gsit printre micobacteriile
responsabile de infecii pulmonare;
M. ulcerans - determin infecii cutanate.

Grupa IV cu cretere rapid ce se dezvolt n 3 5 zile:

M. fortuitum chelonei produce abcese locale, n principal la
drogai.

2.7.1. Diagnosticul direct al tuberculozei

2.7.1.1. Prelevarea
Pentru precizarea diagnosticului tuberculozei pulmonare se recolteaz:
expectoraia spontan sau provocat, suc gastric i lichid pleural. Pentru
diagnosticul tuberculozei extrapulmonare, prelevarea depinde de
localizarea infeciei.
Expectoraia (sputa) const din fragmente mucopurulente provenite
din etajul bronhopulmonar i nu din rinofaringe, care trebuie s conin
ct mai puin saliv. Pentru bolnavii care nu expectoreaz se utilizeaz
152

metode de provocare a tusei prin atingerea luetei cu un tampon laringian,

spltura bronic cu ajutorul unei seringi laringiene (cu soluie
fiziologic steril) sau prin aerosolizare cu o soluie de clorur de sodiu
8-10%, care produce o uoar iritare a cilor bronice i un reflex de
tuse cu expectoraie.
Se recomand recoltarea matinal de la acelai bolnav a minimum trei
eantioane de sput, la interval de o zi (n zile diferite). Fiecare eantion
se recolteaz ntr-un colector din plastic cu capac (cu o singur utilizare),
iar prelucrarea produsului pentru diagnostic se va face n ziua prelevrii.
Sucul gastric se recolteaz de la copii (sugar i copilul mic), care
nu expectoreaz, ci nghit sputa. Recoltarea se face dimineaa i se
prelucreaz ntr-un timp ct mai scurt posibil.
n cazul suspiciunii de tuberculoz urinar se recolteaz urina , din
jetul mijlociu, n cantitate de 50-100 ml (deoarece se prelucreaz
ntreaga cantitate prin centrifugare, diagnosticul fcndu-se din
sedimentul obinut). Se recomand recoltarea a cel puin 6 probe, fiecare
dintre acestea prelucrndu-se n dimineaa recoltrii.
Pentru elucidarea diagnosticului de tuberculoz genital, la brbat
se recolteaz lichidul spermatic, iar la femeie sngele menstrual (cu
ajutorul unor aparate numite pesare ocluzive).
n alte forme clinice se recolteaz: LCR, lichid pleural, peritoneal,
articular, puroi etc.
2.7.1.2. Examenul microscopic direct
Frotiul, efectuat direct din prelevat se coloreaz Ziehl-Neelsen i se
examineaz la microscopul cu imersie, unde apar bacili acido-alcoolorezisteni (de culoare roie) pe un fond albastru (format din elemente
celulare i alte bacterii prezente n sput flora asociat). Bacilii
tuberculozei sunt drepi sau uor ncurbai, subiri i, de obicei, granulai,
dispui izolat sau n grmezi (plana I-2).
Exprimarea rezultatului examenului bacteriologic se face dup
examinarea a cel puin 100 de cmpuri microscopice, n raport cu
numrul de bacili acido-alcoolo-rezisteni (b.a.a.r.):
negativ________________0 bacili/100 cmpuri examinate;
dubios______________ 1-3 bacili/100 cmpuri examinate;
slab pozitiv (+)_______ 4-9 bacili/100 cmpuri examinate;
moderat pozitiv (++)__10-100 bacili/100 cmpuri examinate;
intens pozitiv (+++)____peste 100 bacili/100 cmpuri
examinate.
153

Aceast exprimare cantitativ indic gradul de contagiozitate al

bolnavului.
Coloraia fluorescent a frotiului se execut n laboratoare specializate
pentru diagnosticul tuberculozei, dotate cu microscoape cu fluorescen.
Aceast coloraie este efectuat cu auramin-rhodamin (n locul
fuxinei), iar examinarea frotiului, cu un obiectiv 20x, evideniaz bacili de
culoare galben-portocaliu, strlucitori. n aceste condiii, cmpul
microscopic acoper o suprafa mare, ceea ce scurteaz timpul de
examinare.
2.7.1.3. Izolarea
Cultivarea
produselor pentru diagnosticul de tuberculoz este
important deoarece: ofer rezultate pozitive n plus fa de examenul
microscopic; permite izolarea n cultur pur a micobacteriilor i
identificarea acestora; ofer posibilitatea testrii sensibilitii
micobacteriilor la antibiotice (antibiograma la tuberculostatice).
Speciile de micobacterii difer mult ntre ele n ce privete viteza de
multiplicare i necesitile nutriionale. Astfel se explic dezvoltarea unor
micobacterii atipice n 5-12 zile de la nsmnare i a altora, ca M.
ulcerans care se dezvolt, n condiii similare, dup o incubare de cteva
luni. n aceast ierarhie, M. tuberculosis se situeaz ctre zona
micobacteriilor pretenioase din punct de vedere nutritiv i cu dezvoltare
lent (ntre 3-8 sptmni de la nsmnare).
Mediile de cultur pentru micobacterii sunt complexe i deosebit de
variate. Actual, pentru diagnostic se utilizeaz doar mediul cu ou
Lwenstein-Jensen i varianta acestuia, mediul Tebeglut.
Pe aceste medii, produsele care nu conin alte bacterii (ex.: LCR),
pot fi nsmnate ca atare. Celelalte produse, fiind n general
contaminate cu ali germeni (flora bacterian nespecific), se trateaz cu
o soluie de hidroxid de sodiu 4% i dup 30 de minute la 370C se
neutralizeaz cu HCl 8-10% pentru obinerea unui pH de 7. Incubarea
mediilor nsmnate, dup acoperirea eprubetelor cu mediu cu dopuri
de cauciuc sau prin parafinare, se face la 370C i se examineaz la
fiecare a treia sptmn. Dac pe medii nu se dezvolt bacterii, dup 8
sptmni, se d rezultatul negativ i culturile se scot din lucru.
n cazul culturilor pozitive, notarea rezultatelor se face cantitativ,
preciznd numrul coloniilor sau intensitatea pozitivrii. Se utilizeaz
urmtoarea notaie: +++ = cretere confluent; ++ = colonii izolate; + =
20-100 colonii izolate; sub 20 de colonii se consemneaz numrul
acestora; 0 = cultur negativ.
154

2.7.1.4. Identificarea tipului de micobacterie

Pentru identificarea micobacteriilor au fost propuse teste privind:
aspectele morfologice;
formarea de pigment la lumin i ntuneric;
timpul de cretere la 370C;
patogenitatea pentru diverse animale de laborator;
teste enzimatice (punerea n eviden a niacinei, a catalazei, a
lipazei, a nitrat-reductazei etc.);
compararea structurii antigenice prin teste imunologice;
sensibilitatea fa de chimioterapice sau alte substane.
Dat fiind numrul extrem de mare de teste propuse, s-a simit nevoia
unor scheme simplificate pentru a putea fi utilizate n practic. n mod
obligatoriu, din bateria de teste trebuie s fac parte determinarea
sensibilitii fa de tuberculostatice, n primul rnd pentru c un anumit
spectru al chimiorezistenei este caracteristic pentru micobacterii atipice,
dar i pentru faptul c, prin instalarea chimiorezistenei, micobacteriile
tipice i modific unele caractere biochimice i de patogenitate.
Proprietile morfologice i de cultur
Pe mediul Lwenstein i variantele sale, micobacteriile
tuberculoase de tip uman se dezvolt n 21-60 zile de la nsmnare,
sub forma unor colonii rugoase, bine dezvoltate, proeminente,
conopidiforme: cretere de tip eugonic (fig.73). Micobacteriile de tip
bovin cresc sub forma unor colonii mrunte, plate, uniforme, comparate
cu creterea n gazon, cunoscut sub denumirea de cretere disgonic.
Micobacteriile atipice cresc pe mediile amintite n 5-12 zile, sub
forma unor colonii de tip S, pentru unele specii cromogene (grupa II a lui
Runion - galben portocaliu intens scotocromogene, de exemplu), sau
necromogene (grupa III avium - intracelulare).

155

Fig. 73 Colonii proeminente, conopidiforme (eugonice)

de Mycobacterium tuberculosis pe mediul Lwenstein-Jensen.

Caractere biochimice
Testul niacinei (Konno) are valoare deosebit, fiind un test de triere a
tulpinilor de tip uman care au proprietatea de a produce niacin (o
enzim bacterian) - comparativ cu micobacteriile de tip bovin i cele
atipice la care testul este negativ. Testul se efectueaz n eprubete cu
culturi de testat, n care se adaug 0,5 ml ap distilat, se nclin astfel
ca s fie acoperit cultura de bacili i se nclzete pn la fierbere
pentru a extrage niacina liber. Lichidul este transvazat ntr-o eprubet
de hemoliz sau ntr-o plac cu godeuri pentru efectuarea reaciei de
culoare. Reacia se obine prin adugare la lichidul cu extract a 2-3
picturi de anilin 4% n alcool etilic (preparat extemporaneu) i 2-3
picturi de bromur de cianogen 10%. Operaiunea se face sub ni
prevzut cu exhaustor. n cazul prezenei niacinei, lichidul se coloreaz
n galben, indicnd testul pozitiv (M. tuberculosis var. hominis).
Testul nitratreductazei este util pentru a diferenia M. tuberculosis
de tip uman (test pozitiv) de M. bovis (test negativ), micobacteriile atipice
comportndu-se diferit n funcie de specie.
Reacia se execut pe cultur de patru sptmni. Cu o ans
bacteriologic calibrat se racleaz cultura (aproximativ 5 mg) i se
suspend n soluie de nitrat de sodiu tamponat la pH 7. Suspensia se
incubeaz la 370C timp de 4 ore, dup care se acidifiaz cu HCl diluat ,
apoi se pun dou picturi de soluie apoas de sulfanilamid 0,2% i
dou picturi de diclorur de naftil-etil-diamin 0,1%. Dac cultura
conine enzima nitratreductaz, apare imediat culoarea roie (rou
deschis).
Testul activitii catalazice
Reacia se bazeaz pe aprecierea intensitii de formare a bulelor de
oxigen ce se degaj la contactul culturilor de micobacterii cu apa
oxigenat sub aciunea catalazei. Se poate face o apreciere vizual
aproximativ efectund reacia direct pe tuburi cu cultur de micobacterii
sau dup raclarea unei anse de cultur (5 mg) n dou tuburi de
hemoliz care conin 0,5 ml dintr-o soluie apoas de 10% de Tween 80.
Unul din tuburi va fi nclzit 15 minute la 700C n baia de ap pentru
inactivare. n ambele tuburi se adaug 0,5 ml perhidrol 15%. Dac
tulpina elibereaz catalaz, n tuburi se formeaz numeroase bule de aer
156

(test pozitiv). Dac n tubul care conine cultura inactiv nu este

evideniat activitatea catalazic, iar n cellalt reacia este pozitiv, se
identific M. tuberculosis var. hominis sau bovis. Dac ambele tuburi au
catalaz se identific micobacterii atipice (catalaz termo-rezistent).
Ambele tuburi catalazo-negative indic bacili Koch cu rezisten
secundar sau primar la izoniazid.
Caractere antigenice
Antigenele de suprafa ale unor micobacterii au fost utilizate n
cadrul unor cercetri de imunologie (serotipaj), apelndu-se la metode
complicate i costisitoare care ns nu s-au dovedit a fi deosebit de utile
pentru identificare.
Din punct de vedere practic sunt importante antigenele extrase din
culturi de micobacterii, numite senzitine i utilizate pentru evidenierea, in
vivo, a hipersensibilitii de tip ntrziat.
Tipizarea cu ajutorul bacteriofagilor (lizotipia)
Este o metod de identificare relativ nou (aplicat n scop de
cercetare). Au fost izolai un numr de 12 fagi, desemnai cu codul
MTPH (Mycobacterial Typing Phage Human) i numerotai de la 1 la
12. Din punct de vedere al sensibilitii la fagi, M. tuberculosis a fost
divizat n trei tipuri fagice: A, B i C. S-au ntocmit scheme de fagotipaj
pentru diferite micobacterii cu potenial crescut de patogenitate, n scopul
urmririi surselor de infecie, n cadrul anchetelor epidemiologice.
Testele de sensibilitate la tuberculostatice
Sunt utile att pentru identificarea unor specii de micobacterii, ct
i pentru instituirea tratamentului cu tuberculostatice.
Testul de rezisten la hidraza acidului tiofen-2-carboxilic (THC). Pe
medii de cultur ce conin aceast substan, se dezvolt numai M.
tuberculosis varietatea european, n timp ce M. bovis, M. africanum i
M. asiaticum nu se dezvolt.
Rezistena la pirazinamid constituie un criteriu de difereniere ntre
tipurile umane, care sunt sensibile, i cele bovine, inclusiv BCG, care
sunt rezistente.
Constatarea chimiorezistenei la mai multe tuberculostatice,
inclusiv PAS, ndreptete suspiciunea c tulpina testat este o
micobacterie atipic.
Antibiograma pentru micobacterii poate fi fcut prin variate
metode, cea mai frecvent utilizat fiind metoda concentraiilor absolute
care const n inocularea tulpinii de testat pe mediu cu anumite
157

concentraii de tuberculostatice, denumite concentraii critice, alese

pentru fiecare antibiotic n funcie de concentraia minim inhibitorie a
acestuia (CMI). n alegerea CMI exist o relaie direct ntre
sensibilitatea germenilor i concentraiile obinuite realizate n
organismul uman.
Din cultura pur de bacili obinut pe medii de izolare se fac
suspensii ce se inoculeaz pe medii cu tuberculostatice (de obicei, cu 2
concentraii pentru fiecare antibiotic) i pe tuburi martor (fr antibiotice).
Prin aceast metod se exprim rezistena la concentraia
tuberculostaticului n tubul pe care s-a observat creterea micobacteriilor,
comparativ cu tuburile martor.
Infecia experimental micobacterian
Cobaiul este animalul cel mai sensibil la infecia cu M. tuberculosis,
iar iepurele este foarte sensibil la infecia cu M. bovis i M. avium.
Inocularea subcutanat la cobai a unei suspensii dintr-o cultur de
bacili Koch este urmat, dup 10-15 zile, de fistulizare la locul de
inoculare, apare un abces cazeos numit ancru de inoculare, care va
dura pn la moartea animalului. Simultan, au loc reacii inflamatorii ale
ganglionilor regionali, leziuni ale suprarenalelor, splinei, ficatului i apoi
ale plmnilor. Moartea animalelor are loc la 6 pn la 8 sptmni de la
inoculare.
Fenomenul Koch arat c, dac la cobaiul aflat n plin infecie
tuberculoas se inoculeaz intradermic o nou doz de bacili, se
produce o reacie precoce de necroz la locul inoculrii, explicat printr-o
stare de reactivitate specific de sensibilizare de tip imun, demonstrat
prin metode moderne ca fiind deosebit de complex.

2.7.2. Diagnosticul indirect

n diagnosticul tuberculozei nu exist metode serologice care s aduc
un aport important, fapt explicabil prin suportul celular al imunitii
antituberculoase. n schimb, diagnosticul biologic are importan n
evidenierea stadiului hipersensibilizrii vis-a-vis de proteinele purificate
ale bacilului Koch (IDR la tuberculin), alturi de testarea imunitii
celulare prin inhibiia migrrii macrofagelor i alte metode.
Tuberculina sau senzitina bacililor tuberculozei este un preparat purificat
PPD (derivat proteic purificat), coninnd 2 sau 10 uniti /0,1 ml.
Intradermoreacia la tuberculin (tehnica Mantoux) se practic prin
inocularea strict intradermic pe faa anterioar a antebraului a 0,1 ml din
158

soluia de PPD. Citirea se face la 72 de ore, lund n considerare

induraia palpabil a crui diametru este peste 10 mm n cazul unei
reacii de hipersensibilitate tardiv pozitiv. Apariia unei reacii pozitive
se interpreteaz n raport cu vrsta subiectului. La copii mari i la aduli,
rspunsurile pozitive au semnificaie cnd sunt foarte intense, sugernd
infecia cu bacilul tuberculozei.
Reacia negativ este ntlnit la persoane neinfectate,
nevaccinate BCG sau la cele care sunt lipsite de reactivitate de tip tardiv.
Utilizarea n scop epidemiologic a reaciilor la tuberculin servete
la selecionarea subiecilor neinfectai i care urmeaz s fie vaccinai cu
BCG.
Vaccinul BCG provine dintr-o surs de M. bovis pe care Calmette i
Guerin au obinut-o dup numeroase repicaje pe medii cu cartof, bil i
glicerin pn cnd virulena acesteia s-a atenuat att de mult, nct nu
mai produce infecia tuberculoas, dar stimuleaz imunitatea celular,
protejnd organismul de infecie.

2.8 DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU

ENTEROBACTERIACEAE
2.8.1. Caracterele generale ale enterobacteriilor
Numele de enterobacterii este dat acelor bacterii care sunt n
general localizate, normal sau patologic, n tubul digestiv al omului i
animalelor.
Prezena enterobacteriilor n mediul exterior prezint importan n
igiena alimentar, deoarece se ntlnesc unele specii (ca E. coli) frecvent
contaminante, indicnd o poluare fecal a elementelor din mediu.
Natural, enterobacteriile pot fi gsite i pe mucoase i tegumente.
Pe planul patologiei umane se disting mai multe specii bacteriene:
Bacterii patogene specifice, cu patogenitate
cert, care
mbolnvesc omul datorit contaminrii, fie prin contact direct, fie prin
intermediul alimentelor sau animalelor: Salmonella, Shigella i Yersinia
pestis.
Bacterii patogene oportuniste, aparinnd florei digestive
comensale, condiionat patogene cum sunt: Escherichia, Proteus,
Klebsiella etc., care prezint o importan deosebit prin mbolnviri i
uneori prin extinderea lor n mediul spitalicesc.

159

2.8.1.1. Morfologia
Sunt bacili Gram-negativi nesporulai, mobili datorit cililor peritrichi sau
imobili (Klebsiella, Shigella). Unele pot poseda capsul (Klebsiella),
altele au microcapsul (aceasta prezint antigene de suprafa).

2.8.1.2. Cultivarea
Enterobacteriile se dezvolt uor pe medii simple i sunt aeroanaerobe facultativ. n mediile nutritive simple, formele S se dezvolt
omogen tulburnd uniform mediul. Formele R determin o turbiditate
redus, culturile prezentnd depozit i pelicul incomplet. Pe geloz
simpl, exceptnd bacteriile din genul Proteus, formele S dezvolt colonii
rotunde de 1-3 mm diametru, bombate, semitransparente, cu marginile
regulate, n timp ce formele R cresc sub form de colonii plate, cu
suprafaa i marginile neregulate. Klebsiella dezvolt colonii mari
bombate, lucioase, mucoide, cu tendin de confluen.
Pentru izolarea enterobacteriilor din produsele patologice (materii
fecale, urin, puroi din plgi deschise etc.) se utilizeaz o gam larg de
medii selective care inhib dezvoltarea fungilor i bacteriilor Grampozitive.

2.8.1.3. Caracteristici metabolice

Pentru a ncadra o tulpin ca enterobacterie, precum i ntr-un gen
sau specie, sunt utile o serie de teste biochimice:
-

degradarea oxidativ i fermentativ a glucozei;

reducerea nitrailor la nitrii (nitratreductaza);
citocromoxidaza se evideniaz pe geloz nclinat;
testul indol evideniaz prezena triptofanazei;
testul rou-metil (fermentaia mixt a glucozei);
testul Voges-Proskauer (fermentaia acetonic);
ntrebuinarea citratului (pe mediul Simmons).
160

Ultimele patru teste sunt de mare valoare n identificarea

enterobacteriilor i sunt notate ca IMVIC.
n afara testelor mai sus amintite se utilizeaz i altele, care evideniaz:
scindarea ureei (ureaza), decarboxilarea aminoacizilor i, mai ales,
testele de fermentare a carbohidrailor (glucoz, lactoz, manitol,
zaharoz etc.).
O tulpin poate fi ncadrat n familia Enterobacteriaceelor dac, alturi
de proprietile morfotinctoriale i de cultur, are urmtoarele
caracteristici:
degradeaz oxidativ i fermentativ glucoza;
reduce nitraii la nitrii;
este citocromoxidazo-negativ.
Aceste teste difereniaz enterobacteriile de alte bacterii Gram-negative
(Pseudomonas, Alcaligenes, Moraxella etc.).
Studiul caracterelor biochimice a permis ncadrarea enterobacteriilor n
mai multe genuri, fiecare gen cuprinznd specii diferite. Principalele
genuri recunoscute la om sunt:
Escherichia
Klebsiella - Enterobacter - Hafnia Serratia
Proteus Morganella Providencia
Citrobacter
Edwarsiella
Salmonella
Shigella
Yersinia.
Alte caractere biochimice i/sau imunologice, pe lng caracterele de
cultur, au condus la noiunea de specie i serotipuri.
2.8.1.4. Structura antigenic
La enterobacterii se pot distinge:
antigenul somatic -de perete- sau antigenul O, totdeauna
prezent, comun mai multor serotipuri, constituindu-se pe aceast baz
grupe antigenice (Salmonella, Escherichia, Klebsiella etc.);
-

antigenul flagelar sau antigenul H, cu importan mare n

161

definirea tipurilor antigenice (Salmonella);

antigenul de suprafa (capsular sau de nveli) numit antigen
K (Klebsiella, Escherichia).
Antigenele O coninute n peretele bacterian, prezint o structur
complex de natur lipozaharidic, cuprinznd:
fraciunea lipidic, lipidul A, care este responsabil de toxicitate;
fraciunea poliozidic care, prin natura sa, determin
specificitate.
Acest antigen O este o endotoxin, care n cursul infeciei provoac la
om ocul endotoxinic. Bacteriile care posed acest antigen, n prezena
anticorpilor specifici aglutinina O vor aglutina bacteriile corp la corp
sub forma unor formaiuni granulare mici, dificil de a fi disociate prin
agitare.
Antigenul H, flagelar, este constituit dintr-o substan proteic.
Bacteriile care posed acest antigen, n prezena aglutininei H (anticorp
specific) ce leag bacteriile prin flagelii lor, producnd o aglutinare
floconoas, uor de disociat prin agitare.
Studiul diferitelor antigene permite stabilirea serotipurilor, acestea avnd
importan n descoperirea surselor de infecie.
n prezena unei infecii cu o enterobacterie, instituirea
tratamentului cu antibiotice se face n funcie de rezultatul antibiogramei
i de localizarea infeciei.

2.8.2. Diagnosticul infeciilor cu Salmonella

Genul Salmonella cuprinde bacterii larg rspndite n natur, toate
serotipurile cunoscute fiind patogene pentru om i animale. Cele dou
rezervoare naturale mari, animalele i omul (bolnavi sau purttori
sntoi) se afl la polii unui lan ale crui verigi eseniale sunt
alimentele, apele de suprafa i furajele.
Exist salmonelle adaptate strict la om (S. typhi, S. paratyphi A),
altele ntlnite la animale cu spectru restrns de gazd i altele cu
spectru larg de gazd (S. typhimurium, S. enteritidis etc.) care pot da
infecii i la om. Aceste bacterii cu patogenitate specific, ajungnd din
162

tubul digestiv al omului i/sau animalelor, bolnave sau sntoase, n

mediul exterior i provoac mbolnvirea prin ingerare de ap sau
alimente contaminate.
Salmonellele sunt agenii etiologici ai salmonelozelor, maladii ce
pot mbrca diferite aspecte clinice.
Febrele tifoparatifoide -enterice- forme septicemice, datorate unei
contaminri orale, caracterizate printr-o evoluie febril, determinat n
mod frecvent de S. typhi (febra tifoid), S. paratyphi A, S. paratyphi B i
S. paratyphi C (febrele paratifoide). n patogenia febrelor enterice a fost
descris o faz iniial cnd Salmonella se multiplic activ n
submucoas i formaiunile limfoide ale intestinului (plcile Peyer) i apoi
trece n ganglionii mezenterici. De aici, prin canalul toracic, determin
bacteriemia de debut i invadarea formaiunilor limfatice, splinei, ficatului
etc. Multiplicarea n aceste organe determin bacteriemie masiv cu
eliminarea germenilor prin bil i urin. Din foliculii intestinali, necrozai i
abcedai, precum i din bil, la sfritul primei sptmni de boal,
eliminarea se face prin materiile fecale.
Toxiinfecia alimentar salmonelozic - gastroenterita - este forma
comun de boal dat de toate celelalte serotipuri (mai frecvent S.
typhimurium, S. enteritidis, S. panama etc.) i se datorete ingestiei unei
cantiti mari de bacterii vii, de regul prin intermediul unui aliment
contaminat. Simptomatologia digestiv brutal apare dup 6-48 ore (spre
deosebire de cea dat de toxiinfecia stafilococic ce apare n 2-6 ore)
de la consumul alimentului contaminat i const n: diaree, vrsturi
nsoite de febr, cefalee i alterarea strii generale; n formele severe
putnd apare fenomene grave de deshidratare i oc toxiinfecios. Dup
remisiunea strii acute, unii indivizi rmn purttori de Salmonella pe
timp de mai multe luni.
Septicemia sau determinrile septico-piemice la copii i la aduli cu
rezisten sczut sau imunitate deprimat, apare n cursul toxiinfeciei
alimentare, dar i n situaii n care nu se manifest o interesare a
tractului digestiv. Acestea pot determina localizri ale unor focare
piemice din cele mai variate (osteoarticulare, pulmonare, meningeale
etc.) i sunt cauzate cel mai frecvent de S. paratyphi C i S. cholerae
suis.
Alte salmoneloze sunt mai rare: meningite, osteite, infecii urinare etc.

163

2.8.2.1. Diagnosticul direct

Urmrete izolarea i identificarea agentului patogen, studiul caracterelor
biochimice eseniale i stabilirea serotipurilor.
Recoltarea produselor biologice i izolarea Salmonellelor sunt
dependente de etapele de evoluie a febrelor enterice, examenele de
elecie fiind: hemocultura, coprocultura, urocultura i bilicultura. n
gastroenteritele salmonelozice, pe toat durata bolii, n convalescen i
la purttori, izolarea se face prin coprocultur. n perioada de debut se
fac examinri i din vomismente i resturile alimentare incriminate. La
purttori, examenul de rutin este coprocultura, iar la fotii bolnavi i
bilicultura.
Hemocultura se practic nsmnnd 10 ml de snge, recoltat steril, n
20 de ml bil de bou (salmonellele cresc bine pe acest mediu, iar efectul
inhibant al eventualilor anticorpi prezeni n snge este anihilat). Dup 24
de ore de incubare la 370C, i apoi zilnic, se face izolarea pe un mediu
pentru germeni intestinali (Drigalski, Istrate, Leifson). Se dezvolt colonii
lactozo-negative caracteristice, care se izoleaz n cultur pur pe
geloz nclinat. n cursul febrelor tifoide netratate cu antibiotice,
procentajul de pozitivitate a hemoculturii este de peste 90%, n prima
sptmn, de peste 75% n a doua, scznd semnificativ n
urmtoarele sptmni.
Coprocultura, practicat n paralel cu hemocultura cnd se suspecteaz
o febr tifoid sau paratifoid, este singura metod ce permite
confirmarea rapid a etiologiei unei toxiinfecii alimentare cu Salmonella
i, totodat, singura metod ce permite confirmarea purttorilor.
nsmnarea materiilor fecale din scaun spontan, dup
omogenizare n ser fiziologic steril, se face pe mediu de transport CaryBlair, medii de mbogire Mller-Kauffman i cu selenit acid de sodiu.
Urocultura, din sedimentul obinut prin centrifugare a 5-10 ml de urin,
se face direct pe mediul Wilson-Blair i pe medii de mbogire, dup
care se procedeaz ca la coprocultur.
Bilicultura se face pe medii de mbogire i pe medii selective pe care
coloniile de Salmonella se izoleaz n cultur pur. O parte din bila
recoltat cu sonda se incubeaz la 370C, bila fiind un mediu propice
multiplicrii salmonellelor.
164

Identificarea
n vederea identificrii, se recomand repicarea coloniilor pe mediul
multitest TSI (Triple Sugar Iron) i pe mediul MIU (mobilitate, indol, uree)
care permite trierea culturilor i ncadrarea prezumtiv de gen. n
continuare se face apel la identificarea biochimic, serologic i
efectuarea antibiogramei.
Testele biochimice pentru ncadrarea n genul Salmonella:
producere de hidrogen sulfurat i lizindecarboxilaz, dezvoltare pe
mediul cu citrat (Simmons), reacia rou metil pozitiv. Nu produc indol i
nu au fenilalanindezaminaz. Sunt lactozo-negative.
Pentru diferenieri n cadrul genului, Kauffman a preconizat o
schem de biotipie care este un auxiliar preios al serotipiei.
Identificarea serologic se face pe baza schemei Kauffman-White
raportat la structura antigenic, folosind antiseruri standard (seruri ce
conin anticorpi anti-Salmonella, att seruriO, ct i seruri H).
La noi n ar, se folosete un singur ser polivalent O care
cuprinde grupele majore: AO, BO, C1O...C4O, D1O, E1O...E4O. Cu
ajutorul serurilor monovalente O corespunztoare grupelor H se
asigur identificarea urmtoarelor serotipuri: S. paratyphi A, S. paratyphi
B, S. typhimurium, S. paratyphi C, S. infantis, S. typhi, S. enteritidis,
semnalate ca fiind cele mai frecvente.
Aglutinarea se face pe lam sau n tuburi, urmrindu-se apariia
aglutinrii de tip O i a celei de tip H.
Lizotipia, ca metod de difereniere n cadrul serotipurilor la Salmonella,
cunoate o larg aplicaie, impus de cerinele epidemiologice, deoarece
permite, pe lng urmrirea purttorilor, precizarea filiaiunii cazurilor n
toxiinfeciile alimentare, n infeciile de spital etc.
2.8.2.2. Diagnosticul indirect serologic
Se practic n febrele tifo-paratifoide, pe serul bolnavilor sau
convalescenilor i const n evidenierea prin reacii de aglutinare a
anticorpilor specifici anti O i anti H cu antigene standard, pentru S.
typhi, S. paratyphi A i S. paratyphi B.
Serodiagnosticul prin reacia Widal se efectueaz cu antigenele O i
H separate pentru fiecare din speciile amintite, pe suspensii de culturi
inactivate, livrate de Institutul Cantacuzino.
Tehnica reaciei
Se folosesc 6 serii a 7 eprubete, cte o serie pentru fiecare tip de
165

antigen: TO, TH, AO, AH, BO, BH, diluia pentru fiecare serie fcndu-se
conform schemei urmtoare.
Incubarea se face la 520C timp de 2 ore pentru antigenele H i 18-20
ore la 520C pentru antigenele O.
Interpretare: se noteaz diluia cea mai mare la care se observ
aglutinarea (titrul aglutininelor).
Valoarea diagnostic a titrurilor este diferit:
la bolnavi fr antecedente vaccinale, titrul O este semnificativ
peste 1/250, titrul H peste 1/500, dar o cretere la dublu dup 7 zile,
confirm suspiciunea de febr tifoid sau paratifoid;
la bolnavii cu antecedente vaccinale recente, n primele 2-3 luni
analiza seric calitativ nu furnizeaz informaii utile diagnosticului.
Aglutininele H se menin la valori ridicate dup 7-12 luni de la
vaccinare.
n toate cazurile, ns, certitudinea diagnosticului o confer izolarea
agentului etiologic.
Eprubeta
-soluie salin fiziologic
0,4
(ml)
-ser de bolnav (ml)
-diluie 1/10
-diluie 1/100
-antigen (ml)

Diluii

1 2
--- 0,2

0,4 0,2
--- --0,6 0,6
finale 1/25

0,1
--0,6
1/50

3
0,3

4
---

5
0,2

6
0,3

--------0,4
0,2
0,1
--0,6
0,6
0,6
0,6
1/100 1/250 1/500 1/1000 martor

166

2.8.3. Diagnosticul dizenteriei bacilare genul Shigella

Genul Shigella cuprinde bacterii cunoscute sub denumirea de bacili
dizenterici, agenii etiologici ai dizenteriei bacilare acute, boal
infecioas a omului, caracterizat prin scaune frecvente mucosanguinolente, tenesme, colici abdominale i fenomene generale ca
febr i deshidratare. Un tablou sever al bolii, cu fenomene tipice, stare
toxic, deseori cu sfrit letal, este caracteristic pentru dizenteria
determinat de Sh. dysenteriae tip 1 (bacilul Shiga).
Pe baza structurii antigenice O-somatice i a unor caractere
biochimice, genul Shigella a fost mprit (de Subcomitetul Internaional
pentru Enterobacteriaceae - 1986) n patru grupe:

Subgrupa A sau Shigella dysenteriae, cu 12 tipuri antigenice:

- Shigella dysenteriae I sau bacilul Shiga care se deosebete de toate
celelalte prin producia de exotoxin cu aciune predominant neurotrop;
- Shigella dysenteriae schmitzi, de tip 2;
- Bacilii dizenterici din grupa Large-Sachs, tipurile 3-10.

Subgrupa B Shigella flexneri, cu 6 serotipuri;

Subgrupa C Shigella boydi, cu 18 serotipuri;

Subgrupa D Shigella sonnei, cu 1 serotip.

Genele localizate pe o plasmid sunt responsabile pentru potenialul
invaziv al shigellelor n celulele epiteliale ale mucoasei colice. Caracterul
invaziv este condiionat de aderarea la mucoasa colic, apoi penetrarea
i multiplicarea intracelular a bacteriilor. Inflamaia intens,
microabcesele i ulceraiile determin aspectul mucopurulent i
sanguinolent al diareei.
Bacilii dizenterici sunt eliminai prin materiile fecale de ctre
subiecii infectai sau purttorii sntoi, contaminnd alimentele sau
apa.
2.8.3.1. Diagnosticul bacteriologic
Coprocultura este singura metod de diagnostic, n faza acut izolarea
tulpinilor de Shigella fiind uor de realizat.
Prelevarea se face din scaune emise spontan sau recoltate cu
sonda Nelaton ori cu tampon rectal. nsmnarea se face n cel mult 2
ore, iar dac aceasta nu este posibil se face o nsmnare pe mediul
Cary-Blair.
Izolarea se face pe medii selective: mediul Leifson, Istrate-Meitert,
167

mediul Shigella-Salmonella. Pe aceste medii se dezvolt colonii lactozonegative, din care se izoleaz culturi pure pentru testele de identificare.
Identificarea:
- bacili Gram-negativi, imobili, fr capsul;
rou-metil pozitiv; reacia Voges-Proskauer, ntrebuinarea
citratului i H2S negative;
n cadrul genului, Sh. flexneri, Sh. boydi i Sh. sonnei
fermenteaz manitolul, iar Sh.dysenteriae nu-l fermenteaz;
identifiarea antigenic se realizeaz practic prin aglutinare pe
lam a culturii cu serurile anti-shigae, anti-Sh.schmitzi i anti-LargeSachs-polivalente (cnd bacteria este manitol negativ) i cu antiserul
Sh. flexneri, Sh. boydi etc. (pentru bacteriile manitol-pozitive);
aglutinri pe lam cu seruri de tip, cnd se obine rezultat pozitiv
cu serul polivalent.
Proprietile invazive se evideniaz prin testul kerato-conjunctivitei la
cobai.
innd seama de prezena plasmidelor de transfer al rezistenei multiple
fa de antibiotice, diagnosticul se completeaz cu efectuarea
antibiogramei.

2.8.4.
comensale

Diagnosticul

infeciilor

cu

enterobacterii

Genurile: Escherichia, Citrobacter-Edwarsiella, Klebsiella-Enterobacter,

Proteus-Morganella i Providencia, ca i Yersinia, fac parte din
microbiocenoza de tip colon, fiind considerate ca enterobacterii patogene
oportuniste.
Acestea determin o mare varietate de infecii:
cu punct de plecare endogen, ce poate fi explicat prin
comensalismul lor i care apar mai ales ca i complicaii ale infeciilor
virale, interveniilor chirurgicale, manoperelor de terapie intensiv etc;
cu punct de plecare exogen, n general cunoscute ca infecii
nosocomiale (de spital, n colectiviti) sau ca infecii transmise prin
168

contaminarea mediului, prin bolnavi.

Eliminate n natur, aceste enterobacterii sunt un semnal al contaminrii
fecale, evideniind igiena defectuoas.
Att pentru diagnosticul clinic, ct i pentru investigaiile epidemiologice,
identificarea de gen i specie este obligatorie.
2.8.4.1. Escherichia coli
Escherichia coli sau colibacilii populeaz normal intestinul (colonul),
reprezentnd peste 80% din flora aerob a colonului. Pot fi gsite
deasemenea n numr redus la nivelul mucoaselor. Prezena lor n
mediul nconjurtor sau n alimente semnific o contaminare fecal.
n medicina uman, E.coli poate fi deci o banal bacterie comensal sau
un indiscutabil agent patogen, putnd determina diverse tipuri de infecie.
Infecii enterale (gr. enteron = intestin)
Se consider c mai ales unele tipuri de E. coli produc asemenea
infecii.
E. coli enterotoxigen elibereaz enterotoxine i determin
enterite cu scaune muco-apoase ca urmare a legrii cu un receptor
specific i interferrii cu metabolismul celular. Toxina legat de celulele
sensibile acioneaz ca i toxina holeric prin activarea adenilciclazei
intestinale
crescnd
nivelul
de
cAMP
(cyclic-adenosine-5monophosphate) care acioneaz prin pierdere de ap
i electrolii..

E. coli enteroinvaziv care produce enterite cu scaune mucoase

sau muco-sanguinolente, printr-un mecanism asemntor cu cel prin
care shigellele produc dizenteria.

E. coli enteropatogen responsabil de episoade diareice la cazuri

sporadice i de gravitate mai redus, fiind reprezentate ns i de tipuri
antigenice izolate din epidemii de enterit a nou-nscuilor i copiilor.

E. coli enterohemoragic productor de citotoxine (verotoxine) i

determin diaree hemoragic (colite hemoragice severe).

Infecii extraenterale (extraintestinale)

Infecii urogenitale. E. coli reprezint agentul etiologic al majoritii
infeciilor urinare. Cile urinare sunt infectate la femeie, ascendent, de E.
169

coli de origine fecal producnd cistite, cistopielite i uneori infecii

renale. Aceleai tipuri de bacterii sunt responsabile de uretrite, prostatite,
vaginite i salpingite (inflamaia trompelor uterine).
Infecii hepato-biliare sau digestive. E. coli poate fi izolat la cazuri
cu colecistit acut sau cronic, n icterele infecioase i n peritonite.
Meningite, rare, ntlnite la sugari, dar care sunt grave.
Septicemii. E.coli a fost izolat n 20% din cazurile cu septicemii
date de bacilii Gram-negativi.

2.8.4.2. Klebsiella-Enterobacter
Aceste bacterii pot fi gsite n cadrul florei bacteriene comensale din
tubul digestiv i cavitile naturale, n particular n cile respiratorii
superioare. Fiecare din cele dou genuri- cu care mai sunt nrudite i
genurile: Serratia i Hafnia au mai multe specii cu potenial patogen
pentru om:
genul Klebsiella: K. pneumoniae, K. ozaenae i K.
rhinoscleromatis;
genul Enterobacter: E. aerogenes, E. agglomerans (sau
Edwinia) etc.
Tablourile infecioase sunt:
infecii urinare, frecvente n serviciile de urologie, survenind
frecvent i n urma seleciei la antibiotice;
suprainfecii respiratorii dup manopere chirurgicale sau
suprainfecii n sfera ORL;
meningite;
suprainfecii biliare;
suprainfecii genitale etc.
2.8.4.3. Proteus-Morganella i Providencia
Sunt bacterii saprofite n mediul extern, dar i n colon, pe tegumente i
n caviti.
n situaia n care se constat o cretere a seleciei tulpinilor rezistente
la antibiotice, rolul lor n declanarea infeciilor este n cretere i aceste
170

infecii au tot mai mult un caracter nosocomial, producnd:

infecii urinare (Proteus mirabilis, P.vulgaris ocup un loc
important n cadrul acestor afeciuni, dup E. coli);
infecii secundare tot mai frecvente n mediul spitalicesc.

2.8.4.4. Diagnosticul bacteriologic

Prelevarea materiilor fecale (coprocultura), urinii (urocultura), sngelui
(hemocultura), LCR, puroiului, sputei etc. se va face cu mare atenie,
deoarece enterobacteriile din mediul spitalicesc pot contamina produsele
recoltate de la bolnav.
Examenul microscopic direct are valoare orientativ doar n unele
produse (exemplu: bacili Gram-negativi capsulai n sput presupune o
infecie cu Klebsiella), iar numrul mare de bacili Gram-negativi n urin
pledeaz pentru infecie urinar.
Izolarea se face pe medii pentru intestinali, puin inhibante: McConkey,
Levin, Leifson i pe mediu neinhibant Drigalski sau pe geloz-snge.
Identificarea
Caracterul comun: bacili Gram-negativi E. coli, mobili, iar cele de
cultur sunt comune enterobacteriilor. Pe mediul MIU, genul Escherichia
prezint mobilitate, este indol-pozitiv i are lizindecarboxilaz.
Particulariti de cultur: caracterul mucos al culturilor la Klebsiella, iar la
Proteus proprietatea de crare i de invazie pe toat suprafaa mediilor
neinhibante. Pe mediul Istrate, coloniile de Proteus au centrul negru
(colonii n ochi de pisic). E. coli i Klebsiella pneumoniae fermenteaz
lactoza (sunt lactozo-pozitive), caracter ce le deosebete de alte
Enterobacteriaceae (Salmonella, Shigella, Proteus etc.)(plana III-4 i III5).
Pentru genul Klebsiella sunt caracteristice reacia Voges-Proskauer
pozitiv i creterea pe mediul Simmons, iar pentru Proteus - testul
fenilalanindezaminazei.
Structura antigenic este util pentru identificarea grupelor i tipurilor
antigenice. E. coli posed antigenele O, K i H. Multe din tulpinile izolate
pot fi identificate pe baza acestor antigene i ncadrate ntr-un grup
antigenic, ca de exemplu tipurile enteropatogene: O111B4, O55B5, O26B6
etc., ncadrate prin teste de aglutinare.
171

Testele de patogenitate se practic n laboratoarele de specialitate i

sunt bazate pe caracterul invaziv (testul keratoconjunctivitei la cobai) i
pe evidenierea enterotoxinei (identificnd tulpinile enterotoxigene) prin :
testul ansei ligaturate la iepure; efectul citopatogen pe culturi de celule
sau prin teste imunologice ca ELISA, RIA, coaglutinarea stafilococului cu
proteina A etc.
Alturi de proprietatea de enterotoxigenez, pentru ca o tulpin s
produc enterit trebuie s posede i factori de colonizare (pili) care
favorizeaz ataarea de epiteliul intestinal i ptrunderea n celulele
acestuia.
O semnificaie major pentru diagnosticul enteritelor o are determinarea
cantitativ a bacteriilor din sucul jejunal, un numr de peste 10
bacterii/ml explicnd apariia sindromului diareic.

172

2.9. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU PSEUDOMONAS I

ALI BACILI GRAM-NEGATIVI
Grup foarte heterogen de bacili Gram-negativi, dein, mpreun cu
enterobacteriile comensale, un rol important n patologia infecioas cu
bacterii endogene, ocupnd un loc important n cadrul infeciilor de spital.
Dup comportamentul lor fa de zaharuri pot fi etichetate ca:
fermentative degradnd glucoza i ali hidrai de carbon, att
fermentativ, ct i oxidativ, cum sunt unii din reprezentanii genurilor:
Campylobacter, Pasteurella, Francisella, Aeromonas etc.;
nefermentative care nu degradeaz fermentativ glucoza i
care cuprind genurile: Alcaligenes, Acinetobacter, Moraxella i
Pseudomonas.

2.9.1. Infecii cu bacili Gram negativi fermentativi

2.9.1.1. Genul Campylobacter
Cuprinde bacterii Gram-negative responsabile de infecii intestinale i
septicemii la subiecii imuno-deprimai: C. jejuni, C. fetus etc. i
Helicobacter pylori (responsabil de gastrite i ulcer duodenal).
2.9.1.2. Pasteurella spp.
Cuprinde mai multe specii patogene pentru om i animale, responsabile
de producerea pasteurelozelor. Dintre acestea, Pasteurella multocida,
care reprezint specia tip, este comensal a cilor aero-digestive,
frecvent izolat de la animale n antropozoonoze, poate produce
accidental la om inflamaii loco-regionale extrem de dureroase, foarte rar
forme generalizate sau cu localizri pleuropulmonare i n alte organe, la
bolnavi imunodeprimai.
2.9.1.3. Francisella turalensis
Singura specie a acestui gen, agentul etiologic al turalemiei, este un
bacil Gram-negativ foarte mic, la limita de vizibilitate a microscopului
optic. Produce o antropozoonoz ce poate contamina omul, determinnd
inflamaii loco-regionale, cutanate i ganglionare (ulcerative), nsoite de
forme clinice: pulmonare, digestive, conjunctivale, cu adenopatii satelite.
2.9.1.4. Aeromonas spp.
173

Bacili Gram-negativi flagelai, prezeni n mediul acvatic, sol, produse

alimentare i excepional n tubul digestiv al omului. Ocazional, pot
infecta omul producnd: septicemii la bolnavii cu leucemii; ciroz; diaree
acut etc.

2.9.2. Infecii cu bacili Gram-negativi nefermentativi

2.9.2.1. Alcaligenes spp.
Vast ansamblu de specii microbiene diverse, gsite n mediu i ocazional
la om ca bacterii comensale condiionat patogene pe teren deficitar, ele
pot fi cauza unor infecii nosocomiale. Specii tip: Alcaligenes faecalis,
Achromobacter xylosoxidans, Flavobacterium meningosepticum (agent
etiologic al unor forme de meningit la prematuri).
2.9.2.2. Acinetobacter spp.
Acest gen, ce cuprinde mai multe specii (trei dintre acestea fiind frecvent
gsite n mediul de spital), saprofite (n ap, sol), pot constitui elemente
ale florei bacteriene normale a omului. Rezistena lor la antibioticele
uzuale face ca acestea s ocupe un loc important n cadrul agenilor cu
rol n infeciile nosocomiale (de spital), cum sunt: supuraiile
pleuropulmonare, infeciile urinare, meningitele etc.
2.9.2.3. Moraxella i Branhamella
Genurile Moraxella, cu 6 specii, i Branhamella, cu 4 specii, au fost
regrupate recent n familia Branhamaceae. Sunt bacterii comensale, la
om fiind gsite pe mucoase, n principal n tractul respirator superior.
Sunt bacterii patogene oportuniste, responsabile de infecii variate:
M. lacunata, este considerat un agent major al conjunctivitelor i
keratitelor (inflamaia corneei) la om, ct i un agent de suprainfecie a
bronhiilor. Alte specii din genul Moraxella au un potenial patogen
discutabil.
Branhamella catarrhalis (ntlnit i sub denumirea de Moraxella
catarrhalis, dup ce mult timp a fost numit Neisseria catarrhalis) este
frecvent izolat din cavitatea bucal, faringe, sinusuri, secreii bronhopulmonare, ct i n infecii generalizate, dar fiind considerat ca un
important agent etiologic al infeciilor respiratorii.
174

2.9.2.4. Infeciile cu Pseudomonas aeruginosa

Genul Pseudomonas cuprinde un numr foarte mare de specii (peste
260), din care numai un numr foarte redus prezint interes medical,
restul speciilor fiind gsite n mediu i frecvent ajunse n tractul digestiv
uman.
Pseudomonas aeruginosa, specia tip, cunoscut i sub denumirea de
bacil piocianic, este ntlnit foarte frecvent n mediul spitalicesc i este
responsabil de infecii ce pun grave probleme terapeutice. Pe lng
aceasta, mai pot fi ntlnite i Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
putida etc.
Infeciile cu bacili piocianici survin de obicei din mediul spitalicesc, infecii
nosocomiale, cauzele eseniale fiind:
prescripia de antibiotice, care antreneaz selecia de bacili
piocianici rezisteni;
tratamente cu corticoizi i imunosupresoare, care diminu
rezistena organismului la infecii;
n cadrul explorrilor organismului cu sonde, catetere (urologie,
reanimare), putnd antrena bacterii n caviti i organe.
Fiind bacterii puin virulente pe teren normal, infeciile, mai ales la
imunodeprimai, pot fi de origine endogen sau exogen i produc:
infecii locale: oculare, cutanate, urinare, meningeale,
bronhopulmonare (broniectazii) etc.;
septicemii, care survin n urma unor infecii localizate.
Diagnosticul bacteriologic al infeciilor cu Pseudomonas
Prelevarea se face n funcie de localizarea infeciei: puroi, urin, sput,
LCR, probe din mediu etc.
Examenul microscopic direct are o slab valoare orientativ (bacili
mobili, Gram-negativi).
Izolarea se face pe medii simple uzuale.
Identificarea apeleaz la proprietile de cultur, mai ales, precum i la
celelalte teste din schema de identificare (plana IV-1).
Astfel, bacilul piocianic crete abundent pe mediile simple. Pe mediile cu
pepton produce un pigment verde, tulburnd uniform mediile lichide i
formnd o pelicul. Pe mediile solide se dezvolt sub forma unor colonii
transparente, ce produc hemoliz pe geloz-snge. Datorit produciei
de piocianin pigment albastru i fluoresceina pigment verzui,
175

fluorescent, coloniile sunt uor de recunoscut pe mediile de cultur.

Proprietile biochimice sunt utile pentru identificarea tulpinilor de bacil
piocianic care nu produc pigment: strict aerob, oxidazo-pozitiv i sunt
lactozo-negativi. Au puternic activitate proteolitic i lipolitic.
Proprietile antigenice, dup care s-au conturat tipuri antigenice, sunt
caracterizate prin prezena antigenelor O i H.
Unele tulpini produc exotoxin cu efect dermonecrotic i enterotoxin
testabil pe ansa izolat de intestin de iepure.
Antibiograma este obligatorie, majoritatea tulpinilor fiind polirezistente la
antibiotice.

2.10. DIAGNOSTICUL HOLEREI

Vibrio cholerae O:1 vibrionul holeric agentul etiologic al holerei face
parte din genul Vibrio, care ncadreaz, pe lng bacteria patogen
amintit, mai multe specii de vibrioni cu rspndire larg n mediu i care
pot determina sindroame holeriforme fr gravitate sau unele infecii
intestinale, acetia fiind cunoscui ca vibrioni neaglutinabili cu seruri O:1
(NAG) sau vibrioni non-holerici.
Vibrionii holerici sunt sue de Vibrio cholerae recunoscute prin antiserul
O:1, n care sunt descrise dou biotipuri:
Vibrio cholerae cholerae (clasic);
Vibrio cholerae El Tor, cu trei serotipuri (Ogawa, Inaba i
Hikojima).
Aceti vibrioni sunt ageni ai holerei epidemice, o toxiinfecie intestinal
acut, n cadrul creia se individualizeaz dou etape:
ingestia bacteriilor prin consum de ap sau alimente
contaminate de excrementele bolnavilor sau ale purttorilor aparent
sntoi forme asimptomatice; aderarea la enterocite i apoi
penetrarea n celulele mucoasei, urmat de multiplicarea rapid i
colonizare;
efectele toxinei proteice (enterotoxin), cu rol esenial n
fiziopatologia holerei, prin activarea adenil-ciclazei, creterea
concentraiei de AMP-ciclic intracelular (cAMP), ce are ca efect
stimularea secreiei de anioni (Cl-) i antrenarea n lumenul intestinal a
apei i electroliilor (Na+ i K+), producnd un dezechilibru ionic,
deshidratare extracelular intens cu hemoconcentraie, oc hipovolemic
(scderea volumului total de snge circulant) i acidoz metabolic. n
absena tratamentului, n cteva ore poate surveni un sindrom de
176

deshidratare acut ce poate deveni mortal.

Exist i forme clinice intermediare ntre cele descrise i formele
inaparente depistate doar prin coprocultur.

2.10.1. Diagnosticul bacteriologic

Prelevarea materiilor fecale, concomitent cu lichidele de vrstur, se
face n recipiente din plastic cu o singur utilizare, prin sonda Nelaton
sau cu un tampon rectal. La persoanele suspecte de a fi purttoare se
practic o prealabil purgaie salin. Imediat dup recoltare, prelevatul
se trece pe mediul conservant i de transport, Cary-Blair.
Examenul microscopic direct, n preparatul nativ, se observ vibrionii
(form de virgul) cu mobilitate caracteristic graie singurului flagel
polar, iar n frotiurile colorate Gram apar ca bastonae ncurbate, Gramnegative (fig. 74).

Fig. 74 Frotiu din cultur de Vibrio cholerae (bacili Gram-negativi ncurbai)

Izolarea se face prin nsmnare pe ap peptonat alcalin (pH = 9

9,2), cu rol de mediu de mbogire. Din pelicula care se formeaz la
suprafaa acestui mediu, se fac dou treceri succesive din 6 n 6 ore, n
alte eprubete cu ap peptonat i pe medii speciale cu sruri biliare, cum
este mediul BSA.
177

Identificarea se face din culturi suspecte pe medii selective. Astfel pe

mediile BSA apar colonii transparente, circulare, cu marginile regulate i
suprafa neted (plana IV-2).
Testul indolfenoxidazei este pozitiv i difereniaz vibrionii holerici de alte
bacterii intestinale. Produc indol i reduc nitraii la nitrii, avnd lizin- i
ornitin-decarboxilaz.
n interiorul genului Vibrio, Vibrio cholerae i El Tor se determin prin
aglutinarea cu ser 0:1, reacia pozitiv separndu-i de speciile NAG i de
vibrionii halofilici (nonholerici), care sunt ageni poteniali ai unor enterite
umane. Pentru identificarea speciei Vibrio cholerae se poate utiliza i
fenomenul de vibrioliz.
Testele de patogenitate se bazeaz pe evidenierea enterotoxinei i
factorului de colonizare.
Serodiagnosticul este fr interes n perioada acut, n cazul cnd holera
evolueaz rapid, dar poate fi utilizat ntr-o anchet epidemiologic pentru
un diagnostic retrospectiv, aglutininele aprnd dup 10-15 zile.
Serotipia permite identificarea pentru Vibrio cholerae O:1, care are 3
serotipuri cu factori antigenici a,b i c i astfel se pot defini servovarurile:
Ogawa (a,b), Inaba (a,c) i Hikojima (a,b,c), primele dou fiind mai
frecvent izolate i cu rspndire endemic iar ultimul este rar ntlnit.

178

2.11. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU HAEMOPHILUS,

BORDETELLA I BRUCELLA
Bacteriile care fac parte din aceste genuri au comun faptul c sunt
cocobacili Gram-negativi.

2.11.1. Genul Haemophilus

Cuprinde cocobacili Gram-negativi, cu polimorfism accentuat, uneori
capsulai (caracter de virulen). Speciile mai importante sunt:
Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae, care se
gsesc frecvent ca bacterii comensale bucofaringiene, alturi de alte
specii care fac parte din microbiocenoza plcii dentare;
Haemophilus ducreyi, agent etiologic al ancrului moale (boal
veneric).
Haemophilus influenzae este responsabil de numeroase infecii.

Infecii primare:
rinofaringit, sinuzit, otit, conjunctivite;
meningit acut purulent;
mai rar septicemie, pericardit, osteomielit etc.

Suprainfecii secundare, complicaii ale unor maladii virale deja

instalate, fiind de asemenea, principalul agent al puseelor purulente ale
bronitelor acute i cronice.
2.11.1.1. Diagnosticul bacteriologic
Prelevarea produselor monomicrobiene: puroi, LCR, snge (pentru
hemocultur) i a celor polimicrobiene, ca secreiile bronice, se practic
respectnd regulile cunoscute.
Examenul microscopic direct aduce informaii preioase n meningitele
acute cu H. influenzae, n care frotiurile obinute din sedimentul LCR-ului
i colorate Gram evideniaz cocobacili Gram-negativi, ncapsulai (tip
antigenic b). Prin imunofluorescen pe frotiuri din sediment, cu antiser
de tip b se poate evidenia H. influenzae.
Examenul microscopic direct pe frotiuri colorate Gram, din secreia de
ancru moale, pune n eviden H. ducreyi, important pentru diagnostic
dac inem seama de faptul c aceste bacterii se cultiv dificil.
Izolarea se face pe geloz-snge i pe geloz-chocolat, pe care se
recomand ca, dup nsmnarea produsului patologic, s se fac o
nsmnare n spoturi de stafilococ, acesta elibernd factorul V i, astfel,
179

favorizeaz dezvoltarea de Haemphilus n jurul spoturilor (fenomenul de

satelitism).
Identificarea

Proprieti morfotinctoriale: cocobacili Gram-negativi, cu

polimorfism accentuat;

Proprieti de cultur: pe mediile solide se dezvolt sub form

de colonii mici, asemntoare picturilor de rou, prezentnd fenomenul
de satelitism amintit.

Proprieti biochimice: testele indol i ureaz pozitive.

Caracterele antigenice sunt determinate de antigenele solubile capsulare
(tip b) a cror cercetare efectuat direct n prelevate arat pe lng tipul
antigenic i aportul lor indiscutabil n infeciile grave. Antigenele
capsulare de natur polizaharidic, specifice de tip, au permis
individulizarea a ase tipuri capsulare: a, b, c, d, e i f (tipul b fiind cel
mai rspndit).

2.11.2. Genul Bordetella

Reprezentantul principal al genului, Bordetella pertussis, este agentul
etiologic al tusei convulsive, numit i bacilul Bordet-Gengou. Alte specii
care pot determina infecii benigne ale cilor respiratorii superioare, cu
simptomatologie asemntoare tusei convulsive, sunt B. parapertussis i
B. bronchiseptica.
Tusea convulsiv este o infecie acuta a cilor respiratorii cu evoluie n
trei faze distincte: faza cataral (8 10 zile), cu rinoree i tuse seac,
corespunznd unei perioade de maxim contagiozitate; stadiul
paroxistic caracterizat prin accese de tuse spastic, tipice (2 4
sptmni); convalescena (2 3 sptmni).
2.11.2.1. Diagnosticul direct
Prelevarea secreiilor traheobronice se face n timpul unui acces de
tuse n recipiente sterile i se nsmneaz imediat. n perioadele de
acalmie se recolteaz aspirat traheobronic sau lichid de spltur
rinofaringian. Recoltarea prin metoda plcii tuites-a dovedit a fi
eficient n perioada de contagiozitate maxim. Bolnavul tuete direct
ntr-o plac Petri n care se afl mediul Bordet-Gengou.
Izolarea se face prin nsmnare imediat (examenul microscopic fiind
lipsit de importan) pe mediul Bordet-Gengou i medii cu snge.
180

Identificarea se face dup aspectul coloniilor, asemntor picturilor de

rou, din care se fac frotiuri i se constat prezena de cocobacili Gramnegativi, capsulai n culturi tinere.
Proprietile biochimice nu sunt semnificative pentru identificare.
Caracterele antigenice sunt complexe i se disting: antigene capsulare
poliozidice; aglutinogene proteice de suprafa; hemaglutinine
imunogene piliare; lipopolizaharide i un antigen proteic parietal sau
factor pertusigen, responsabil de efectele biologice ale acestor bacterii.
2.11.2.2. Diagnosticul indirect
Diagnosticul serologic nu este eficient n practic, deoarece anticorpii
aglutinai apar tardiv (la 2-3 sptmni dup faza acut), dar este
important pentru controlul strii de imunitate dup mbolnvire sau
vaccinare cu trivaccin diftero-tetano-pertusis. Decelarea aglutininelor
specifice la populaia infantil vaccinat sau cu o tuse convulsiv atipic
n antecedente, are o valoare diagnostic numai prin punerea n
eviden a creterii de 4 ori a titrurilor aglutinante, n proba a doua de ser
recoltat la interval de 3 sptmni de la prima recoltare.

2.11.3. Genul Brucella

Bacteriile acestui gen sunt agenii etiologici ai brucelozelor, infecii ale
animalelor, transmisibile la om (antropozoonoze).
Genul Brucella cuprinde trei specii principale:

B. melitensis, adaptat la ovine;

B. suis, la porcine;

B. abortus bovis, la bovidee.

La om, boala este determinat de contactul direct cu animalul bolnav sau
cu produsele contaminate ale acestuia.
La animale, bruceloza se caracterizeaz prin infecii ale aparatului
genital, orhite la masculi i avort la femele, dar frecvent boala evolueaz
fr semne clinice aparente.
La om, dup o incubaie de 2-4 sptmni, boala poate mbrca trei
aspecte:
bruceloz acut septicemic cu febr ondulant;
bruceloz subacut localizat: osteo-articular, genital, rar
181

neuromeningeal i cu
localizri pulmonare sau cardiovasculare
excepionale;
bruceloz cronic cu infecii latente n organe diverse: hepatice,
articulare, nervoase, cu simptomatologie variat.

2.11.3.1. Diagnosticul direct

Prelevatele pentru examenul bacteriologic sunt: sngele (pentru
hemocultur) i mduva osoas; iar n raport cu localizarea: diverse
secreii, exsudate, puroi, urin, bil, lichid articular sau cefalorahidian,
sperm, puncii biopsii, piese de exerez sau necroptice etc.
Examenul microscopic direct i prin imunofluorescen direct este de
mic valoare n bruceloza uman, datorit densitii reduse a germenilor
n produse.
Izolarea agentului patogen prin cultivare este dificil n afara stadiului
acut al bolii. Chiar n perioada febril, hemoculturile trebuie repetate
datorit bacteriemiei trectoare.
Hemocultura se practic pe medii bifazice (lichide i solide mbogite cu
extract de ficat de viel) geloz F i bulion F dup procedeul
Castaneda: sngele recoltat steril, introdus n balonul cu cele 2 medii i
incubat la 370C; o dat la 3-5 zile suprafaa agarului va fi inundat cu
bulion din balon i se va urmri dezvoltarea bacteriilor. n paralel, se
nsmneaz i un balon cu mediu lichid care se ine n atmosfer de
dioxid de carbon 10%. Proba se consider negativ numai dac la o lun
de la nsmnare pe geloz F nu s-au dezvoltat colonii caracteristice.
Identificarea:
Cocobacili, imobili, Gram-negativi, nesporulai, necapsulai. Pe mediile
lichide tulbur uniform mediul, iar pe cele solide cresc colonii mici,
transparente la nceput i care devin apoi brune.
Antigenic, brucelele conin dou compexe A i M. Identificarea dup
aceste caractere se face printr-o aglutinare pe lam a tulpinii izolate cu
ser antibrucela.
Patogenitatea experiental la cobaiul inoculat subcutanat sau
intraperitoneal evideniaz o stare septicemic a animalului,
cu
hipertrofie ganglionar i leziuni articulare.
2.11.3.2. Diagnosticul indirect
Reacii serologice
Reaciile de aglutinare se practic de obicei pe lam sau plci cu godeuri
182

(reacia rapid Huddleson) n care se folosete serul bolnavului i

antigen brucelic concentrat i colorat. Dup amestecul picturilor de ser
n diluii diferite cu antigen, placa se nclzete la 370C cteva minute,
dup care se citete reacia, apreciind apariia i mrimea grunjilor
colorai albastru-violet (reacie pozitiv).
Reacia Wright, de aglutinare lent, folosete un antigen brucelic
corpuscular inactiv, care se adaug unor diluii de ser (conform schemei
de la reaciile de aglutinare n tuburi). Dup 24 de ore se citete reacia,
apreciind titrul anticorpilor (un titru mai mare de 1/100 este semnificativ).
Reacia de aglutinare are o valoare maxim n stadiile evolutive (form
acut primar), cnd titrul poate crete de peste 4 ori.
Reacia de aglutinare poate fi negativ sau dubioas n formele cronice
i n infeciile latente, cu rspuns umoral slab. O reacie negativ nu
exclude infecia, nici existena anticorpilor specifici, datorit eventualei
blocri a acestora. Exist diferite procedee de blocare.
Testul antiglobulinic Coombs pune n eviden anticorpi specifici IgG
neaglutinai, ce s-au fixat pe bacterii mpiedicnd aglutinarea n reacia
Wright. Dup splarea antigenului brucelic capsular, prin centrifugare, se
suspend n final sedimentul de bacterii (Brucella) la care se adaug ser
antiglobulinic, iar dup 24 de ore se citete reacia. Testul pozitiv =
bruceloz.
Reacia de fixarea a complementului persist pozitiv timp ndelungat i
pune n eviden IgG.
Testul de imunofluorescen indirect este util n depistarea brucelozelor
cronice.
Testele imunoenzimatice de tip ELISA permit s se fac distincie ntre
brucelozele acute i cele cronice.
Imunitatea mediat celular are n bruceloz, ca i n alte infecii cu
localizare intracelular, un rol principal n aprarea organismului infectat.
Determinarea indicelui opsonocitofagic (IOC) permite stabilirea
intensitii fagocitozei bacteriilor din suspensia antigenic de Brucella de
ctre polinucleare. n cursul infeciei cu Brucella, capacitatea fagocitar a
leucocitelor crete semnificativ fa de cea din sngele persoanelor
sntoase. Reacia poate aduce informaii asupra aprrii organismului
infectat sau chiar a eficacitii tratamentului, prin intensitatea fagocitozei.
Teste de explorare a hipersensibilitii specifice:
in vitro: testul de inhibare a migrrii leucocitelor i testul de
transformare blastic n prezena antigenelor brucelice. Aceste teste
aduc informaii utile n bruceloza cronic, cu serologie negativ;
in vivo: testarea rspunsului alergic prin IDR.
Intradermoreacia la brucelin atest starea de hipersensibilitate de tip
183

tardiv, gradul acesteia fiind apreciat dup intensitatea reaciei i

diametrul eritemului aprut, o reacie cu un eritem mai mare de 8 mm
fiind considerat pozitiv.

2.12. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU BACTERII

ANAEROBE
Bacteriile anaerobe caracterizate prin incapacitatea lor de a se
dezvolta n prezena oxigenului atmosferic sunt incriminate n etiologia
a cel puin un sfert din infeciile bacteriene. Pe de alt parte, acestea
asigur meninerea echilibrului ecologic n cadrul florei comensale a
organismului uman.
n cadrul laboratoarelor de microbiologie clinic, diagnosticul pentru
infeciile cu anaerobi se poate referi la dou situaii distincte:
izolarea de anaerobi sporulai genul Clostridium, care
determin infecii specifice, constituii din flor exogen de origine
teluric;
izolarea de bacterii anaerobe nesporulate, n afara unor infecii
specifice, practic din variate produse biologice, fcnd parte din flora
endogen comensal sau flora Veillon.

184

2.12.1. Infecii
Clostridium

cu

anaerobi

sporulai

genul

Diferitele specii aparinnd genului Clostridium au n comun:

morfologia microscopic: bacili Gram-pozitivi cu spori terminali
sau subterminali;
tipul de metabolism: strict anaerob;
marea rezisten a sporilor la factori fizico-chimici;
prezena de toxine proteice care le confer o patologie
specific;
majoritatea de origine exogen, rar endogen, sunt bacterii
patogene specifice, cnd li se asigur condiii de anaerobioz.
Speciile cu importan medical sunt:
Clostridium tetani, ce determin toxiinfecia tetanic sau
tetanosul;
Clostridium botulinum, agent etiologic al botulinismului
(toxiinfecie alimentar grav);
Clostridium perfringens i alte specii de Clostridium ale
gangrenei gazoase.
Infeciile apar dup ce se creeaz n organism condiii speciale de
anaerobioz, acestea doar oferindu-le posibilitatea de nmulire i de
elaborare de toxine n esuturi.
2.12.1.1. Toxiinfecia tetanic
Tetanosul este o toxiinfecie produs de toxina bacteriei Cl. tetani. Boala
apare n urma infeciei unor plgi adnci i zdrobite sau n urma unor
nepturi murdrite cu impuriti provenite din pmnt, resturi de
mbrcminte infectate etc.; plgi n care ptrund spori ai bacililor
tetanici, care germineaz n condiii de anaerobioz i de la acest nivel
elaboreaz toxine responsabile de producerea sindromului tetanic,
caracterizat prin contracii tonico-clonice (puternice, de lung durat i
repetate), datorit aciunii toxinei asupra plcii motorii neuro-musculare.
Primul semn al tetanosului este apariia de trismus (contractur
dureroas a muchilor masticatori), acompaniat de anxietate, pentru a
culmina (n lipsa tratamentului) cu moarte prin spasm laringian (asfixie).
Diagnosticul bacteriologic
Diagnosticul de laborator nu prezint interes dect n mic msur,
185

deoarece izolarea agenilor etiologici este lung i dificil, n timp ce

semnele clinice sunt suficient de evocatoare pentru afirmarea
diagnosticului. De aceea, atenia trebuie ndreptat spre administrarea
terapeutic a serului antitetanic i profilaxia plgilor tetanice, fr a
atepta rezultatul examenului bacteriologic.
Pentru confirmarea diagnosticului clinic se recolteaz: puroi i esuturi
din plag, pansamente etc. Examenul microscopic nu d rezultate pentru
c bacilii tetanici pot fi puini la numr i se pot confunda cu bacilii
asemntori (tetanomorfi).
Izolarea se face pe medii pentru anaerobi, cu o concentraie crescut.
Identificarea din cultura pe medii pentru anaerobi. Examenul microscopic
evideniaz bacili Gram-pozitivi, n form de b de toboar (spor
terminal) (fig. 75).

Fig. 75 Frotiu cu Clostridium tetani sub form de

bacili cu spori terminali

Caracterele de patogenitate: se inoculeaz o suspensie din produsul

patologic sau din cultur n mediu lichid, la cobai; dup 9-10 zile apar
semnele caracteristice de boal. Inocularea de toxin produce
simptomatologie caracteristic evideniat cu proba de neutralizare in
vivo cu antiser specific.
2.12.1.2. Toxiinfecia botulinic
Clostridium botulinum, agentul etiologic al botulinismului, intoxicaie de
origine alimentar, este o bacterie prezent n pmnt, ap i pe
vegetalele poluate cu spori. Alimentele contaminate sunt semiconservate
sau conservate necorespunztor, de origine animal: conserve,
186

mezeluri, unc etc., n care s-a dezvoltat bacilul botulinic i a eliberat

exotoxina ce va produce o intoxicaie grav. Exotoxina acioneaz
asupra sistemului nervos periferic la nivelul plcilor neuromusculare,
inhibnd sinteza de acetilcolin, fapt ce explic manifestrile paralitice,
mai ales oculare, apoi ale muchilor bucofaringieni. n lipsa
tratamentului, decesul survine n 36-48 de ore, prin paralizia centrilor
vitali.
Diagnosticul de laborator
Necesit maximum de urgen i pentru aceasta se recolteaz: probe din
alimentul incriminat, lichid de vrstur, materii fecale, urin i snge
pentru cutarea toxinei n ser. De regul, diagnosticul intoxicaiei i
determinarea tipului acesteia se face prin testul numit toxinotipie.
Toxina se caut n lichidul de spltur gastric, n ser sangvin, n
alimentul incriminat etc. Dac produsele nu sunt limpezi, se filtreaz prin
hrtie de filtru, apoi se efectueaz testul prin inoculare la animale:
oareci albi sau cobai, pentru efectuarea reaciei de neutralizare in vivo.
oarecii protejai cu seruri antibotulinice (antitoxine tip) supravieuiesc,
cei care nu sunt protejai mor, la fel oarecii la care nu corespund
antitoxinele cu tipul antigenic al bacilului botulinic. La noi n ar,
majoritatea cazurilor diagnosticate au prezentat toxina de tip B.
2.12.1.3. Clostridium perfringens i alte clostridii ale gangrenelor
gazoase
Cele mai multe specii din genul Clostridium sunt agenii etiologici ai unor
infecii particulare numite gangrene, caracterizate prin necroz i
putrefacia esuturilor datorit degradrii prin enzimele acestor bacterii,
acompaniate de o important producie de gaz.
Gangrena gazoas apare ca o complicaie a plgilor (de rzboi sau
accidentale) prin contactul cu pmntul i prin zdrobirea esuturilor, n
care se creaz condiii de anaerobioz prin devitalizare i formare de
cheaguri de snge. Cl. perfringens poate provoca i infecii endogene
(aceasta fiind gsit i n colon), n urma unor manopere instrumentale
(avort, intervenii chirurgicale sau injecii cu substane ischemiante care
reduc sau anuleaz oxigenarea esutului). Speciile anaerobe care
particip mai frecvent la acest proces sunt: Cl. perfringens (prezent
totdeauna), Cl. oedematiens, Cl. septicum, Cl. histoliticum (cu participare
inegal). n multe cazuri, n aceste plgi se dezvolt i alte bacterii
187

aerobe cu potenial patogen.

Infecia se caracterizeaz printr-o culoare livid a esuturilor, edem care
crete rapid, infiltrare cu gaze, miros putrid, necroz.
Cl. perfringens poate provoca septicemie, iar prin consum de alimente
infectate - printr-o enterotoxin - i intoxicaii alimentare.
Diagnosticul de laborator
Este direct i de urgen. Tehnica de izolare - prin metodele ce stau la
ndemn - este laborioas i de durat i de aceea nu se ateapt
confirmarea de laborator, ci se trece la tratamentul cu antibiotice i cu ser
antigangrenos polivalent imediat dup recoltarea fragmentelor de
esuturi, snge, urin, lichid de serozit etc.
Examenul microscopic al prelevatelor din puroi sau serozitate poate
arta, dup coloraia Gram, bacili Gram-pozitivi mari i groi cu spori
centrali (brcu, fus), subterminali (rachet de tenis) sau fr spori.
Izolarea se face n anaerobioz pe agar-snge sau pe agar-glbenulactoz pentru obinerea de cultur pur. n fiecare plac se include, ntro jumtate, cte o antitoxin specific, fapt ce permite - pe lng izolare i determinarea serologic rapid a tipurilor de clostridii prezente.
Identificarea se bazeaz mai ales pe unele caractere:
biochimic: unele specii sunt proteolitice (Cl. histoliticum i Cl.
septicum), digernd serul coagulat, fragmente de organe, laptele
turnesolat etc.;
antigenice: prin antigenele O i H, identificate prin reacii de
aglutinare pe lam cu seruri monovalente.
Caracterele de patogenitate pentru oarece i iepure. Prin inoculare
subcutanat sau intramuscular fiecare specie cauzeaz moartea
animalelor, provocnd leziuni caracteristice.

2.12.2. Anaerobi nesporulai

Sunt bacterii comensale ale tegumentelor i mucoaselor, cunoscute sub
denumirea de flor endogen strict anaerob, nesporulat (flor Veillon),
care nu invadeaz esuturile dect n urma unor traumatisme, a unor
manipulri chirurgicale (chirurgie abdominal, de ex.), precum i a
scderii rezistenei naturale la imunodeprimai.
Anaerobii nesporulai sunt responsabili de septicemii i supuraii:
cele mai frecvente sunt supuraiile abdominale: peritonite,
188

apendicite, supuraii post-operatorii abdominale, abcese subfrenice etc.;

supuraii n micul bazin: abcese perirectale, supuraii urogenitale
etc.;
supuraii pleuro-pulmonare, bucale (abcese dentare) i ORL
(otite cronice);
abcese ale creierului i meningit purulent.
Anaerobii nesporulai aparin mai multor genuri i specii, dintre care
principalii patogeni sunt:
Coci Gram-pozitivi: Peptococcus i Peptostreptococcus, genuri capabile
s produc: abcese dentare, amigdalite, sinuzite, abcese pulmonare,
infecii postabortum cu septicemii i diseminare n alte teritorii, apendicite
etc.
Coci Gram-negativi: genurile Veillonella i Acidaminococcus, componeni
ai microbiocenozelor, excepional implicai n patologie.
Bacili Gram-pozitivi: Eubacterium i Bifidobacterium (comensale);
Propionibacterium i Actinomyces cu specia A. israeli care se gsete n
microbiocenoza bucofaringian i este responsabil de producerea
abceselor dentare, infeciilor tractului respirator, actinomicozelor,
abceselor cerebrale, hepatice etc.
Bacili Gram-negativi: din genul Bacteroides i genul Fusobacterium cu F.
nucleatum i F. necrophorus care determin faringite necrozate, abcese
cerebrale i hepatice etc.
Cocobacili Gram-negativi, ca: Porphyromonas, Prevotella i
Actinobacillus actinomycetemcomitans.
2.12.2.1. Diagnosticul bacteriologic
Prelevarea trebuie s se fac evitnd total contactul produsului cu aerul.
Puncia se face cu o sering etan, al crei ac, dup aspirarea
produsului, este nfipt ntr-un dop din plastic steril i se expediaz imediat
la laborator, pentru a fi prelucrat ct mai rapid posibil. Alte produse se
recolteaz prin tehnici adecvate, n funcie de felul produsului.
Examenul microscopic, dup coloraia Gram, poate diferenia dou
situaii:
evidenierea unei singure specii, a crei dezvoltare pe medii n
anaerobioz permite diagnosticul etiologic, identificarea i antibiograma;
punerea n eviden a unui polimorfism microbian care poate fi
util n cazul n care alturi de bacili Gram-negativi apar i bacterii
fusiforme sau filamente cu ramificaii care sugereaz o etiologie
actinomicotic.
189

Cultivarea se recomand a se face direct pe medii solide i lichide, att

n anaerobioz ct i n aerobioz, pentru a diferenia anaerobii veritabili
de bacteriile aerobe-anaerobe facultative. Plcile cultivate n
anaerobioz se vor deschide dup 48 ore, cnd se examineaz cu lupa,
notndu-se aspectul coloniilor i fcndu-se frotiuri.
Prezena unei bacterii anaerobe este sugerat de:
cultura pozitiv n plcile incubate anaerob i absent n plcile
aerobe;
pe mediile n anaerobioz se constat colonii diferite, cu
germeni morfologic diferii fa de cei din aerobioz.
Identificarea speciilor este dificil i accesibil laboratoarelor de
specialitate, unde se apeleaz la teste biochimice, inclusiv analiza
cromatografic.

190

2.13. DIAGNOSTICUL SIFILISULUI

Agentul etiologic al sifilisului sau luesului, boal veneric specific uman,
este Treponema pallidum. Contaminarea se face prin contact direct:
contact sexual sau pe cale congenital (de la mam la ft) sifilisul
congenital.
Alte treponematoze sunt: Bejenelul sau sifilisul endemic dat de
Treponema pallidum n bazinul mediteraneean i n unele zone din
Africa, caracterizat prin leziuni cutanate; Pianul, o boal data de
Treponema pertenue, observat n regiunile tropicale i Pinta sau
Carate, determinat de Treponema carateum n America Central i de
Sud.
La adult, transmiterea sifilisului se face aproape exclusiv pe cale
sexual, dat fiind fragilitatea treponemelor implicate i distrugerea lor n
afara organismului.
Dup contactul infectant, incubaia sifilisului este n medie de trei
sptmni. Clinic, boala evolueaz n trei perioade:
Sifilisul primar dureaz 2-4 sptmni i se caracterizeaz prin
apariia unei leziuni unice, ulcerativ i indurat, numit ancru dur,
localizat genital n peste 99% din cazuri i numai rar n regiunea bucal
sau anal. Eroziunea indurat a ancrului, acoperit cu o crust, are o
serozitate foarte bogat n treponeme (spirochete), constituind principala
surs de contagiune. Dup aproximativ 2-4 sptmni, ancrul se
vindec spontan cu sau fr cicatrice.
Sifilisul secundar apare la 2-3 luni de la contaminare (45-50 zile de la
producerea ancrului) sub forma unor leziuni caracteristice, care
reprezint faza de infecie generalizat, treponemele fiind prezente n
umori i unele esuturi (contagiozitate mare). Leziunile secundare apar
ca rozeole cutanate i papule umede (mucoase). Dup cteva luni (mai
rar 1-3 ani) leziunile secundare se vindec spontan, urmnd o perioad
lung de sifilis latent care poate dura ani sau zeci de ani.
Sifilisul teriar apare (la bolnavii netratai sau tratai insuficient), dup
faza de laten, sub forma unor manifestri teriare: leziuni gomatoase
(gome), tegumentare i osoase; modificri degenerative ale sistemului
nervos central (tabes, paralizie); leziuni cardiovasculare (aortite,
anevrisme); hepatice etc.
Actual se descriu frecvent cazuri de sifilis decapitat la persoane
191

infectate i tratate cu antibiotice n doze insuficiente (exemplu: infecia

mixt sifilis-gonoree).

2.13.1. Diagnosticul bacteriologic

Diagnosticul de laborator urmrete:
punerea n eviden a agentului etiologic, Treponema pallidum,
prin examen microscopic direct;
punerea n eviden a anticorpilor antitreponema (diagnosticul
serologic).
2.13.1.1. Prelevarea produselor pentru examenul bacteriologic
Se rezum la serozitate ce poate fi recoltat de la nivelul
ancrului dur (rar din cea a rozeolelor cutanate sau plcilor mucoase).
Pentru obinerea unui produs patologic bogat n treponeme,
leziunea se spal (prin tamponare) cu o soluie salin fiziologic steril,
dup care se ndeprteaz parial crusta i cu o pipet Pasteur,
prevzut cu o tetin, se aspir serozitatea din leziune.
2.13.1.2. Examenul microscopic direct
Prelevatul se examineaz nativ i pe frotiuri colorate Giemsa, FontanaTribondeau sau prin imunofluorescen.
Prelevatul nativ examinat la microscopul cu fond ntunecat evideniaz,
pe fondul negru al preparatului, treponemele albe, strlucitoare,
refringente, cu 10-20 spire regulate, egale i dispuse n acelai plan
(fig.76).

192

Fig. 76 Treponema pallidum n serozitatea din ancrul dur (examinare n

cmp ntunecat)

Treponema pallidum se deosebete de treponemele saprofite i de alte

spirochete (fig.77), att prin form ct i prin micrile vii, caracteristice:
rotaie, nurubare, flexiune (treponemele saprofite avnd micri mult
mai lente). Caracterul de mobilitate poate fi util n diagnostic cnd
examenul direct se practic naintea aplicrii unui tratament local sau
general.

Fig. 77 Aspecte morfologice ale diferitelor genuri din familia Spirochetaceae

(dup Azele Ferron)

Treponemele saprofite pot fi ntlnite pe mucoasa genital (ex.:

193

Treponema genitalis) i, prin prezena lor, pot perturba diagnosticul

direct, n cazul n care s-au aplicat tratamente ce pot duce la inhibarea
mobilitii treponemelor patogene.
Tehnica imunofluorescenei directe prin care prelevatul se trateaz cu
ser specific antitreponema pallidum marcat fluorescent. Examenul
microscopic n U.V. relev treponemele fluorescente cu morfologia tipic,
permind diferenierea T. pallidum de cele saprofite.
Frotiurile colorate cu metoda Giemsa, coloraia Burri prin impregnarea
argentic (coloraia Fontana-Tribondeau) permit, de asemenea,
evidenierea treponemelor n microscopia direct.

2.13.1.3. Izolarea
2
Treponema pallidum nu poate fi cultivat in vitro, dar fiind patogen
pentru unele animale de laborator - se poate izola prin inoculare
intratesticular la iepure, care face o orhit. Metoda este folosit pentru
obinerea tulpinilor patogene, din care face parte i tulpina Nichols (surs
de antigene pentru serodiagnostic).

2.13.2. Diagnosticul indirect - serologic

Treponema pallidum are trei principale antigene n structura sa: lipidic,
polizaharidic i proteic. Antigenul lipidic are o structur identic cu a altor
lipide din structuri animale sau umane, cum este i lipidul din cord de
bou (antigenul cardiolipidic), folosit ca antigen netreponemic pentru
decelarea anticorpilor n diagnosticul serologic al sifilisului.
Anticorpii antitreponemici apar n serul bolnavilor n cursul fazei primare,
n medie la 20-40 zile de la contaminare.
2.13.2.1. Reacii serologice
n diagnosticul serologic al sifilisului se aplic dou grupe de reacii
serologice:
reacii cu antigene cardiolipidice;
reacii cu antigene treponemice.
194

Reacii cu antigene cardiolipidice

Antigenul prin care se evideniaz prezena anticorpilor anticardiolipidici
(reagine) este un extract lipidic nespecific (deoarece nu provine din
treponeme, dar are structur identic), cel mai frecvent, un extract
alcoolic purificat, din cord de bou, numit cardiolipin.
Pot fi folosite diverse reacii, fiecare prezentnd ns avantaje i
dezavantaje, de aceea n diagnosticul sifilisului se utilizeaz mai multe
teste serologice.
Reacia VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) se execut prin
tehnici uor reproductibile, prin micrometode, cu mare sensibilitate, dar
cu o slab specificitate, dnd cel mai mare procent de rezultate fals
pozitive (reacii pozitive la persoane care nu au sifilis).
Este o reacie de aglutinare pasiv, microcristalele de colesterol (din
componena antigenului), ncrcate cu cardiolipin fiind aglutinate cu
anticorpii antilipoidici din serul bolnavului.
Microreacia VDRL, efectuat n plci de polistiren cu godeuri, n care se
depun 0,1 ml ser de cercetat i o pictur de antigen VDRL (diluat dup
indicaiile productorului Institutul Cantacuzino). Se agit circular
placa timp de 4 minute. Reacia se citete cu lupa, urmrindu-se apariia
flocoanelor n lichidul care se va clarifica (rezultat pozitiv). Absena
anticorpilor n serul cercetat se traduce prin lichid tulbure, fr flocoane.
Microreacia este un test de triaj, care se completeaz cu tehnica n
tuburi (0,25 ml ser de cercetat inactiv; 0,25 ml antigen VDRL diluat
agitare 5 minute i apoi centrifugare 10 minute la 2000 rpm). Se noteaz
intensitatea reaciei slab pozitiv (+); pozitiv mediu (++); pozitiv (+++ sau
++++) flocoane mari n lichid clarificat.
Reacia de fixare a complementului (RFC) cu fixare la cald (370C), RBW
clasic, are mare specificitate, dar cu o sensibilitate mai redus dect
VDRL (putnd da rezultate negative la bolnavi de sifilis, mai ales teriar).
Pentru creterea sensibilitii se practic RFC la rece (+40 - + 80) prin
tehnica RFC Kolmer sau microreacia Bradstreet i Taylor.
n diagnosticul de rutin al sifilisului se recomand s se foloseasc
concomitent un test VDRL (de floculare) i un test RFC.

195

Reacii cu antigene treponemice

Aceste teste utilizeaz antigene provenite din Treponema pallidum
patogen, vie, omort sau extractele acesteia, evideniind anticorpi
antitreponemici de mare valoare diagnostic. Cu rezultate mai slabe este
folosit i Treponema Reiter ca surs de antigen.
Testul de imunofluorescen cu antigen treponemic din tulpina Nichols
testul FTA-ABS (Fluorescent Treponemal Antibody Absorbtion Test) se
practic recent, ca o prob de nalt valoare, att ca specificitate, ct i
ca sensibilitate.
Testul TPHA (Treponema Pallidum Hemagglutination Assay), bazat pe o
reacie de hemaglutinare pasiv, utilizeaz un lizat de T. pallidum fixat pe
hematii. Un test simplu, uor de efectuat n laboratoarele de serologie,
avnd o specificitate i sensibilitate mare.
Testul TPI (Treponema Pallidum Imobilization) = Testul lui Nelson.
Treponemele vii sunt imobilizate prin anticorpii (IgG) subiecilor cu
treponematoze.

2.13.2.2. Interpretarea reaciilor i evoluia anticorpilor

Reacia FTA i reacia VDRL se pozitiveaz odat cu apariia ancrului,
n perioada primar, cnd devine pozitiv i RFC, fiind urmate de
pozitivarea TPHA reacia Nelson avnd valoare mare n perioada
secundar.
n absena tratamentului, nivelul anticorpilor ncepe s scad lent i
progresiv dup 6-24 de luni de evoluie, cnd poate s se negativeze
complet, n timp ce alte reacii rmn pozitive mult timp.
Dup tratament, dac sifilisul este tratat corect, dup 6 luni se vor
negativa toate reaciile. Recontaminrile se traduc printr-o ascensiune
accelerat a nivelului de anticorpi.
196

Exist relativ numeroase cazuri cnd se obin rezultate pozitive la

persoane la care este exclus posibilitatea unei infecii treponemice
(rezultate fals pozitive). O parte se datoresc unor greeli de recoltare,
conservare sau transport al sngelui; starea fiziologic a pacienilor n
momentul recoltrii (oboseal, ingestie de alcool, graviditate etc.). Alte
rezultate fals pozitive se datoreaz unor infecii bacteriene, virale sau
unor parazitoze, care au n structura lor factori antigenici comuni cu ai
treponemelor (factor lipidic), acestea fiind pasagere.

197

2.14. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU

LEPTOSPIRA I BORRELIA
Bacterii spiralate, flexibile, cu un aparat locomotor intracelular,
aparinnd familiei Spirochaetaceae (alturi de cele din genul
Treponema), produc mbolnviri umane: leptospiroze i, respectiv,
febrele recurente (al cror agent etiologic principal este Borrelia
recurrentis).

2.14.1. Diagnosticul leptospirozelor

Foarte rspndite n natur, leptospirele sunt bacterii care pot infecta
numeroase specii animale (producnd zoonoze) i determinnd
accidental, la om, infecii dintre care cea mai grav este leptospiroza
ictero-hemoragic.
Exist dou specii de leptospire:
Leptospira interrogans, patogen pentru om i animale;
Leptospira biflexa, specie saprofit.
Leptospirele patogene cuprind mai multe subspecii sau serogrupuri,
clasificate n funcie de patogenitatea pentru om i de animalul care
reprezint rezervorul (obolan, oarece, porc, cine etc): L. interrogans
icterohaemorrhagiae, L. i. canicola, L. i. pomona etc.
n diferitele leptospiroze patogenia este asemntoare: bacteriile ptrund
n organism prin piele sau mucoase (leptospirele fiind capabile s
strpung pielea i mucoasele), disemineaz pe cale sanguin i se
localizeaz n rinichi, ficat, meninge etc.
Infecia uman tipic, cea mai sever, este dat de L.
icterohaemorrhagiae, care produce icterul infecios cu recrudescen
febril, cu semne de atingere renal i meningeal. Un numr mic de
cazuri pot prezenta o evoluie anicteric, febril, pseudogripal,
acompaniat de semne meningeale.
2.14.1.1 Diagnosticul direct
n cursul fazei acute febrile (n primele 12 zile) bacteriile se gsesc
n snge i LCR. Sunt necesare mai multe hemoculturi, pentru care
sngele se va recolta pe anticoagulant (oxalat de sodiu).

198

n practic:
-cutarea leptospirelor la microscopul optic pe fond ntunecat (mai ales
n LCR) este rar nsoit de succes;
-prin nsmnarea pe medii speciale (cu ser de iepure 10%), la
temperatura de 300C, culturile se pot pozitiva n a 5-a zi, pan la a 15-a
zi de la incubare;
-inocularea la cobai poate da rezultate pozitive (din organele animalului
putnd fi izolate leptospirele).
Dup 15-20 zile leptospirele sunt eliminate prin urin i pot fi
evideniate prin examen microscopic (fond negru), ca i prin cultivare sau
inoculare la cobai.
La examenul microscopic (preparat nativ) se vd filamente foarte subiri,
helicoidale, cu spire fine i regulate (n dini de fierstru), cu capetele
ndoite n form de crlig, mobile. Frotiurile se examineaz dup
coloraie Giemsa, Burri sau Fontana-Trobondeau.

2.14.1.2 Diagnosticul indirect

n leptospiroze anticorpii pot fi detectai ncepnd cu a asea zi de boal
i ating nivelul maxim la 3-4 sptmni.
Se folosesc o serie de teste serologice, dintre care n practica de
diagnostic sunt mai frecvente: reacia de aglutinare-liz, reacia de fixare
a complementului i reacia de imunofluorescen .

Reacia de aglutinare-liz
Antigenul este reprezentat de culturi n mediu lichid, cu tulpini cunoscute
de leptospire. Se fac diluii crescnde din serul bolnavului i din fiecare
diluie se practic aglutinri pe lam. Dup un contact scurt al serului
diluat cu antigenul cunoscut se examineaz lichidul la microscopul cu
fond ntunecat. Dac reacia este pozitiv se observ fenomenul de
199

aglutinare-liz (ngrmdirea leptospirelor cu aspect caracteristic). Tipul

de leptospir fa de care se nregistreaz titrul cel mai mare, constituie
agentul etiologic al infeciei.
Reacia de fixare a complementului - se face dup tehnica IdaBengston. Antigenul se prepar dintr-o leptospir saprofit care conine
antigene de grup, comun cu toate speciile patogene (permite
diagnosticul de leptospiroz).

2.14.2. Genul Borrelia

Numeroase specii de Borrelia se gsesc la artropode, roztoare, psri
i mamifere, putnd determina mbolnviri la om, cea mai cunoscut fiind
febra recurent transmis prin cpu sau prin Pediculus hominis
(pduche) . Dintre numeroasele specii, au fost mai frecvent descrise ca
specii patogene:
-

Borrelia recurrentis, agent etiologic al febrei recurente;

Borrelia burgdorferi (descris n 1982 de ctre Burgdorfer),

agentul boreliozei de Lyma.
Boala se manifest n trei faze:
faza primar, cu localizare la locul de inoculare;
faza secundar, cu septicemie n care agentul patogen este
prezent n snge i LCR;
faza teriar care poate dura mai muli ani de la contaminare (cu
semne articulare, nervoase i cardiovasculare) ; risc de transmitere prin
transfuzii.
Existena boreliozei de Lyma este azi recunoscut n mai multe ri din
Europa.
Diagnosticul direct al boreliozelor este dificil. Examenul LCR la
microscop, pe fond ntunecat, arat o spirochet lung, flexibil, foarte
200

mobil. Cultivarea necesit medii complexe, cu ingrediente folosite i la

culturile de celule. Bacteriile pot fi izolate din snge, LCR i din lichide
articulare (fig.78).
Diagnosticul indirect, serologic, se efectueaz prin imunofluorescen
indirect. Nivelul anticorpilor peste 1/256 este considerat ca semnificativ.

Fig. 78 Borrelia recurrentis ntr-un frotiu de snge colorat Giemsa.

2.15. DIAGNOSTICUL RICKETTSIOZELOR

Rickettsiile sunt bacterii care se multiplic numai n celule vii (cu excepia
R. quintana). Sunt larg rspndite n natur (la insecte, psri,
mamifere) i transmise la om prin artropode (pduche, cpue), rar pe
cale aerogen (febra Q) , producnd mbolnviri cu caracter
epidemiogen:

Tifosul exantematic epidemic, maladie febril al crui vector este

pduchele i avnd ca ageni etiologici:
Rickettsia prowazekii, provoac tifosul exantematic;
Rickettsia typhi (mooseri), determin tifosul exantematic endemic
201

sau murin;
Rickettsia canada, recent introdus, avnd ca principal vector
cpua.
La fotii bolnavi de tifos exantematic pot apare reactivri de infecii
cu R. prowazekii, boala Brill.

Febrele ptate, boli febrile cu evoluie grav: febra ptat a

munilor stncoi
(R. rickettsii); febra butunoas (R. conorii);
rickettsiozele de cpue etc.

Febra Q, determinat de Coxiella burnetti, manifestat prin

simptome pulmonare (cu numeroi vectori) .

2.15.1 Diagnosticul direct

Are o utilitate redus deoarece prezint un risc de contaminare,
prin manipularea materialelor infectate (transmitere la om prin aerosoli) ,
de aceea izolarea acestor bacterii se face n laboratoare de specialitate,
cu precauii deosebite.
2.15.1.1. Izolarea i identificarea rickettsiilor
Se recolteaz: sngele, urina, materiile fecale, LCR, lichide
pleurale etc. Artropodele pot fi recoltate dup gsirea lor pe un pacient
febril suspect de rickettsioz (febr Q- cpu, tifos exantematicpduche) .
Izolarea se face numai n celule vii, prin:
inocularea n oul embrionat (un embrion de 5-7 zile), n sacul
vitelin;
inocularea la cobai intraperitoneal, urmat de declanarea unei
boli febrile;
inocularea n culturi de esuturi neproliferative, n celulele crora
R.. prowazekii se dezvolt n citoplasm, iar celelalte rickettsii n
citoplasm i nucleu.
Identificarea
Din oul embrionat se fac frotiuri (amprente) din sacul vitelin, care
se coloreaz Giemsa iar la examenul microscopic se vd cocobacili. Din
sacul vitelin se mai pot prepara antigene care se identific cu seruri
standard, prin RFC.

2.15.2 Diagnosticul indirect

202

Are o utilizare mult mai mare i se practic prin:

Reacia Weil-Felix, de aglutinare n tuburi, prin diluii succesive a
serului de bolnav care se pun n contact cu antigen Proteus OX-19
(datorit comunitii antigenice a acestuia cu Rickettsia). Dup incubare
24 ore la 37C se citete reacia al crui titru este dat de diluia cea mai
mare la care apare aglutinarea. Titrul semnificativ este considerat cel de
peste 1/200.
RFC - dup metoda Ida-Bengston, pe probe perechi de seruri.
Imunofluorescena cu antigene purificate din sacul vitelin + ser de
bolnav i antiglobulin uman marcat.
Testele ELISA i RIA sunt tot mai des utilizate pentru evidenierea
anticorpilor fa de toate tipurile de rickettsii amintite.

203

2.16. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU

CHLAMYDIA
Bacteriile din genul Chlamydia, patogene pentru om i animale,
sunt parazite obligatoriu, intracelulare, multiplicndu-se numai n celula
gazd. Acest gen cuprinde trei specii patogene:

Chlamydia trachomatis, care paraziteaz omul i este agentul

etiologic al: trahomului, conjunctivitei cu incluziuni, al unor boli cu
transmitere sexual (uretrite, cervicite i limfogranulomatoza benign
inghinal venerian);

Chlamydia psittaci (ca rezervor de bacterii fiind psrile i

mamiferele) poate mbolnvi omul, determinnd pneumonii atipice i alte
infecii respiratorii pseudogripale;

Chlamydia pneumoniae, o nou specie regrupat n acest gen,

care provoac: pneumonii atipice, bronite, sinuzite i faringite, diferena
esenial fa de C. psittaci fiind absena unui rezervor animal, transmisia
fiind exclusiv interuman.
Maladiile sexuale transmisibile determinate de Chlamydii prezint o
importan deosebit prin frecvena lor (aproximativ 50% din uretritele i
cervicitele diagnosticate n ultimii ani), ct i numrul mare de
complicaii, alturi de problemele de diagnostic i tratament pe care le
ridic.
Astfel, la brbat infecia se manifest iniial ca o uretrit trenant ce
se poate complica n cele mai frecvente cazuri cu epididimit. La femei,
cervicita se complic, prin transmitere ascendent, cu salpingit, putnd
antrena o sterilitate secundar.

204

2.16.1. Diagnosticul direct

2.16.1.1. Prelevarea produselor
Este necesar ca prelevarea s se fac corect i produsele s se
conserve n mediu de transport pentru C. trachomatis, aceasta fiind de o
mare fragilitate.
La brbat, prelevatul trebuie s fie recoltat din uretr. Secreiile
sunt recoltate cu o chiuret sau un tampon subire, introduse 3-4 cm n
uretr. Printr-o rotaie uoar se antreneaz celulele uretrale care pot
conine Chlamydia.
La femei, prelevatele se obin de la nivelul canalului endocervical,
celulele vaginale neavnd receptori pentru C. trachomatis.
Pentru prelevatele conjunctivale se folosesc tampoane sterile, cu
ajutorul crora se recolteaz secreia purulent i celulele conjunctivale.
n pneumonii se vor recolta: secreii naso-faringiene, sput i
aspirate bronice.

2.16.1.2. Tehnici rapide de diagnostic

Dintre tehnicile care ne stau la dispoziie se recomand cele care:
pun n eviden incluziuni intracelulare caracteristice;
pun n eviden bacteriile prin cultivare.
Coloraia Giemsa relev prezena incluziunilor, dar poate furniza
multe rezultate fals pozitive, fiind puin sensibil, astfel c n infeciile
genitale se prefer izolarea pe culturi.
Imunofluorescena, att direct ct i indirect, este sensibil i
frecvent folosit n diagnosticul trahomului, uretritelor, cervicitelor i
conjunctivitelor cu Chlamydia. Imunofluorescena direct relev specific
prezena corpilor elementari bacterieni prin utilizarea anticorpilor
monoclonali antichlamydia. Imunofluorescena indirect accesibil unui
numr mare de laboratoare, utilizeaz seruri imune cu spectru de
reactivitate mare, obinute prin hiperimunizarea iepurilor. Acestea puse n
contact cu materialul din frotiuri se coloreaz cu antiseruri conjugate cu
izotiocianat de fluorescein. Incluziunile tipice apar ca o mas bine
205

definit n interiorul celulelor epiteliale, prezentnd o fluorescen

galben-verzuie.
Tehnica colorrii cu iod. Frotiurile de raclaj uscate la aer i fixate cu
metanol absolut se coloreaz cu Lugol, 3-5 minute. Se examineaz
imediat la mrime 200x, iar incluziunile apar ca mase brun-rocate, n
interiorul celulelor epiteliale.
2.16.1.3. Izolarea i cultivarea
Izolarea pe oarece
Se folosesc linii sensibile la infeciile cu Chlamydii:
inocularea intraperitoneal a 0,5 ml produs diluat 10-20%
produce moartea animalelor la 3-10 zile de la infectare;
inocularea intracerebral a 0,03 ml de suspensie 10% duce la
paralizie n 24-48 ore;
inocularea intranazal a 0,03-0,05 ml suspensie 10% sub
anestezie cu eter determin apariia unor semne de infectare i moartea
animalelor n 2-20 zile.
Izolarea i cultivarea pe sacul vitelin al oului embrionat de gin.
Se inoculeaz ou cu embrion de 6-7 zile. Dup 13 zile de la
inoculare se separ sacul vitelin din care se fac frotiuri care se coloreaz
Giemsa. Chlamydiile apar colorate n rou strlucitor, celulele sacului
vitelin n verde.
Izolarea n culturi de celule
Liniile celulare sensibile sunt: McCoy, HeLa 229, BHK-21 etc.
Culturile de celule infectate apar colorate galben-verzui, strlucitor, cu
form semilunar.

2.16.2. Diagnosticul indirect

n diagnosticul serologic, cele mai utilizate reacii sunt:
Reacia de fixare a complementului (RFC) pune n eviden
anticorpii fa de antigenul vitelin al embrionului. Metodele utilizate sunt
206

Ida Bengston, pentru care se ia n considerare ca titru minim 1/32 pentru

evidenierea anticorpilor n proba unic.
Testul de microimunofluorescen este mai sensibil i specific
pentru titrarea anticorpilor antichlamydia, permind un diagnostic de
specie. Marea sensibilitate a acestui test se traduce prin probele pozitive
n 80-90% din cazurile cu infecii genitale date de Chlamydii.
Testul ELISA se practic de obicei n microplci n care antigenul
speciilor de Chlamydia, preparat n culturi de celule McCoy este absorbit
la suprafaa godeurilor. Metoda d rezultate bune n ornitoz, psitacoz
i n limfogranulomatoza venerian.
Conduita diagnosticului de laborator al acestor infecii n corelaie
cu manifestrile clinice se poate rezuma astfel:
- n prezena unei infecii de suprafa (uretr, endocol,
conjunctiv), accesibil, etiologia chlamydian se confirm prin
evidenierea incluziunilor caracteristice ale acestor bacterii;
- n infeciile profunde (epididimite, salpingite, pneumopatii) nivelul
crescut al anticorpilor antichlamydieni este evocator pentru etiologia
chlamydian.

207

2.17. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU

MYCOPLASMA
Mycoplasmele sunt bacterii lipsite de perete celular, ceea ce
explic polimorfismul lor. Genul Mycoplasma cuprinde un numr mare de
specii, dintre care puine sunt patogene pentru om:
Mycoplasma pneumoniae, mycoplasm respiratorie al crui
potenial patogen este foarte mare;
Mycoplasma hominis, cu localizare genital;
Mycoplasma genitalium, specie nc puin cunoscut, izolat
iniial din tractul genital, dar care s-a dovedit a fi o mycolasm
respiratorie;
Ureaplasma urealyticum, mycoplasm genital.

2.17.1. Mycoplasma pneumoniae

Este o bacterie polimorf, care prezint o extremitate efilat
capabil de a se fixa pe mucoasele cilor respiratorii printr-o adezin
(unul din antigenele de natur proteic) .
M. pneumoniae provoac infecii respiratorii benigne, de tipul
traheobronitelor i mai rar pneumonia atipic primar, mai ales la
subiecii tineri, care se traduce printr-un tablou clinic polimorf i anomalii
radiologice sub forma infiltratelor limfoplasmocitare peribronice. Aceast
specie bacterian mai poate provoca i alte manifestri: ORL, cutanate,
hematologice, neurologice, cardiace etc.
2.17.1.1. Diagnosticul direct
Examenul microscopic al prelevatelor: expectoraii, lichide de lavaj
bronho-alveolar, nu aduce informaii utile. Imunofluorescena poate
evidenia M. pneumoniae n macrofagele din prelevate.
Izolarea se face pe medii speciale, prelevatele fiind nsmnate pe
aceste medii la patul bolnavului sau n medii de transport, dat fiind
fragilitatea acestor bacterii.
Identificarea se bazeaz pe examenul microscopic al coloniilor
prelevate din mediul de cultur, dup coloraie Giemsa, coloraie cu
acridin-orange etc., evideniind formaiuni extrem de polimorfe.
Caracterele de cultur pe medii acelulare (cu colesterol, fosfolipide,
extracte din drojdie de bere) i pe medii cu snge, pot orienta spre
diagnosticul de infecie cu Mycoplasma, dup aplicarea unor teste
208

biochimice i, mai ales, antigenice (imunofluorescen, inhibarea

dezvoltrii coloniilor n medii cu ser imun specific etc.) .
2.17.1.2. Diagnosticul serologic
Este esenial n diagnosticul infeciilor cu M. pneumoniae. Punerea
n eviden a aglutininelor la rece n serul bolnav (reacia de
criohemaglutinare) este posibil n majoritatea cazurilor.
Imunofluorescena utilizeaz ser antimycoplasm preparat pe
iepure i antigamm aglobulin de iepure marcat cu substan
fluorescent (metoda indirect) .
RFC-ul se practic folosind diferite antigene, n dou probe de ser,
recoltate la interval de 7-10 zile. Se consider reacie pozitiv dac, n
serul al doilea, titrul anticorpilor este de cel puin 4 ori mai mare dect
primul.
Alte reacii serologice: ELISA, reacia de hemaglutinare pasiv etc.,
sunt disponibile dar mai puin utilizate.

2.17.2. Mycoplasme genitale

Dou specii de mycolasme sunt responsabile de infecii genitale:
M. hominis i Ureaplasma urealyticum (mycolasm posednd ureaz) .
Prezena acestor specii ca i comensale la indivizii sntoi face
dificil aprecierea potenialului lor patogen.
U. urealyticum este responsabil de aproximativ 15% din cazurile
de uretrite negonococice, putnd juca rol n sterilitatea de cauz
necunoscut, precum i de avorturi spontane.
M. hominis este rar izolat n cazuri de salpingite. Rolul su n
vaginitele nespecifice nu este cert.
Diagnosticul de laborator este doar direct. Cultivarea prelevatelor
din vagin, cervix, biopsie de endometru etc., pe medii de cretere lichide
sau solide (nsmnare imediat dup recoltare) permite o izolare n 1848 de ore. Identificarea se face dup caracterul de cultur (colonii foarte
mici, circulare) i dup caracterele biochimice.
Diagnosticul serologic nu d rezultate, rspunsul n anticorpi fiind
foarte slab.
Mycoplasmele, ca i chlamydiile, sunt sensibile la antibioticele din
grupul tetraciclinelor i macrolidelor (eritromicina), totui este indicat
efectuarea antibiogramei.

209