INTRODUCERE

Imunologia studiaz, n primul rnd, funcia de aprare a organismului uman i animal, care face parte din categoria funciilor de relaie i este esenial pentru supravieuire. Sistemul imunitar este esenial pentru supravieuirea organismelor multicelulare, datorit agresiunii permanente a agenilor infecioi (microorganisme i virusuri). Omul adult poart pe suprafaa mucoaselor i a tegumentului, un numr uria de celule bacteriene (circa 10 14), mai multe dect propriile celule, unele avnd potenialul de a iniia procese infecioase. Disfuncia sever congenital sau dobndit a funciei imunitare este incompatibil cu viaa. Termenul de imunitate are o provenien social: n Roma antic, persoanele scutite de impozite ctre stat, erau considerate imune. Sensul termenului s-a extins, ulterior desemnnd persoanele scutite de a suferi efectele infeciei cu ageni patogeni. Imunologia s-a nscut i s-a dezvoltat ca un domeniu al Microbiologiei, bazndu-se pe cunotiinele i conceptele Patologiei i Biochimiei. n sensul clasic, restrns al noiunii, Imunologia studiaz reactivitatea organismului animal i uman, consecutiv contactului cu agenii patogeni, mecanismele elaborrii rspunsului imun, precum i particularitile esuturilor, celulelor i moleculelor care condiioneaz starea de imunitate. In sens clasic, noiunea de imunitate definete starea de nereceptivitate sau de rezisten a organismului fa de un agent patogen infecios, n situaia n care sunt ndeplinite condiiile pentru apariia unei maladii infecioase. Din acest motiv, Imunologia s-a dezvoltat ca un domeniu al Microbiologiei. n concepia clasic, s-a considerat c activarea funciei imunitare are un efect exclusiv benefic, protector pentru organism. n concepia modern, funcia imunitar se definete ca o proprietate biologic esenial a organismului uman i animal, care const n capacitatea de a diferenia rapid i specific, substanele proprii de cele strine. Sistemul imunitar este tolerant fa de substanele proprii, deoarece a nvat s le recunoasc n timpul vieii embrionare, dar este dotat cu proprietatea de a recunoate i de a diferenia prompt substanele strine, fa de care se activeaz i le ndeprteaz din organism. Tolerana imunitar este rezultatul unui proces de selecie a clonelor de limfocite, selecie ce are loc n perioada dezvoltrii embrionare a limfocitelor, ele fiind celulele efectoare ale rspunsului imun. Selecia const n eliminarea clonelor de limfocite potenial autoreactive (potenial reactive fa de moleculele proprii) Componentele chimice proprii organismului, pe care sistemul imunitar le tolereaz, sunt incluse n noiunea de self (self, englez = propriu), iar cele strine, care se abat de la structura chimic programat genetic a organismului, poart denumirea de substane nonself sau antigene. Astfel, funcia imunitar este o funcie biologic esenial, prin intermediul

creia organismele difereniaz prompt i cu mare sensibilitate, componentele self de substanele nonself. Funcia imunitar are un rol determinant pentru pstrarea homeostaziei mediului intern i a individualitii chimice a fiecrui organism, prin faptul c sistemul imunitar recunoate i tolereaz moleculele proprii, dar se activeaz la contactul cu substanele strine care se abat de la programul biochimic tolerat. Dup ce nva s tolereze self-ul, chiar din perioada dezvoltrii embrionare, funcia imunitar realizeaz un permanent control de calitate a moleculelor self. Aa cum aparatul genetic asigur stabilitatea i integritatea unei specii ca sistem biologic, sistemul imunitar asigur pstrarea homeostaziei biochimice a organismului. Funcia imunitar este mediat de molecule cu rol de receptori de pe suprafaa limfocitelor i de molecule solubile n umorile organismelor. Obiectul de studiu al Imunologiei s-a diversificat odat cu progresul general al tiinelor biologice i n special, odat cu aprofundarea cunoaterii funciei de aprare. ncepnd din anii 60, interesul tiinific pentru Imunologie a crescut considerabil din dou motive: 1) n primul rnd s-a demonstrat c funcia imunitar este esenial pentru organism, insuficiena sa mrind riscul infeciilor cu microorganisme patogene sau potenial patogene, iar disfuncia imunitar sever este incompatibil cu viaa. 2) S-a demonstrat c activarea funciei imunitare nu este totdeauna benefic pentru organism, ci uneori, stimularea ei determin leziuni tisulare severe, chiar ireversibile, asociate cu strile de hipersensibilitate sau iniiaz evoluia unor stri patologice grave, ca de exemplu, maladiile autoimune. Exemplul clasic este oferit de infecia cu Mycobacterium tuberculosis sau cu M. leprae. Leziunile tisulare, materializate n existena granuloamelor, se datoreaz chiar rspunsului imun, care este aa de amplu nct produce manifestrile patologice. Strile de hipersensibilitate definesc o stare de reactivitate imunitar crescut i se caracterizeaz prin aceea c, la primul contact cu o substan nonself, nu se produce un rspuns imun detectabil, ci organismul dobndete o stare special de sensibilizare imunitar fa de un antigen. La contactul secundar ulterior, chiar cu cantiti foarte mici ale antigenului sensibilizant, organismul rspunde cu manifestri patologice de intensiti variabile, al cror rezultat final poate fi fatal. Aa se ntmpl n strile de hipersensibilitate (alergii) la polen, la diferite medicamente (de exemplu, penicilina), la veninul insectelor sau la diferite substane alimentare. Modificrile patologice consecutive alergiilor pot fi locale sau generalizate. Un domeniu vast, n continu expansiune, dar relativ recent al Imunologiei l constituie maladiile autoimune. In esen, maladiile autoimune semnific ntreruperea strii de toleran perfect pe care sistemul imunitar o manifest fa de componentele self. Datorit unor stri fiziologice legate de procese de mbtrnire, unor procese infecioase, datorit unor procese patologice degenerative sau ca urmare a utilizrii substanelor medicamentoase, n organism se produc modificri chimice tisulare care sunt detectate de celulele sistemului imunitar. Consecina este declanarea unui rspuns imun fa de componentele self modificate chimic. Astfel se iniiaz un conflict autoimun, n cursul cruia sistemul imunitar genereaz

efectorii si celule activate i molecule care recunosc specific moleculele self modificate. Respingerea grefelor de esuturi i organe este consecina activrii funciei imunitare. Antigenele esutului grefat, solubile sau fixate pe suprafaa celulelor din gref, activeaz limfocitele (celulele efectoare ale rspunsului imun). Autogrefele sunt totdeauna tolerate. n condiiile unei reactiviti imunitare normale, alogrefele i xenogrefele sfresc prin a fi respinse. Cu ct diferenele genetice i implicit biochimice ntre organismul donor i cel receptor de gref sunt mai accentuate, cu att grefa este respins mai repede.

Etapele dezvoltrii Imunologiei ca tiin

Imunologia este o tiin relativ tnr, care a aprut iniial ca un domeniu a Microbiologiei, care la nceputurile sale a studiat mecanismele reaciilor de aprare a organismului uman i animal fa de agresiunea infecioas. Imunologia a fost fundamentat de descoperirile lui Pasteur i Metchnikoff i pstreaz nc legturi de esen cu disciplina mam - Microbiologia, dei astzi ea este una dintre ramurile cele mai importante i mai dinamice ale tiinelor biologice. Apariia Imunologiei ca tiin a fost precedat cu milenii, de observaii empirice referitoare la faptul c vindecarea unor maladii infecioase era urmat de o stare de rezisten permanent la reinfecie sau cel mult de forme uoare de mbolnvire. Cu 2-3 secole .C., n China i India s-a observat c unele maladii foarte grave (variola, pesta, ciuma), las n urm o stare de rezisten permanent la reinfecie sau cel mult, persoanele fceau forme foarte uoare de mbolnvire. n infecia variolic, apar leziuni caracteristice mai ales pe tegumentul feei. Mai nti apar vezicule mici, pline cu lichid clar, al cror coninut se tulbur datorit infiltratului celular i fac crust, iar dup vindecare, las o cicatrice ce se pstreaz toat viaa (vrsat de vnt). S-a trecut la infectarea artificial a persoanelor sntoase n scopul declanrii unei mbolnviri uoare, care s instaleze starea de imunitate. Practica variolizrii prin prizarea pe nas a mojaratului de cruste uscate, recoltate de la cei trecui prin boal, era nsoit de infecii grave, datorit cantitii mari de virus inhalat. n 1418, procedeul variolizrii a fost introdus n Anglia de Mary Wortley Montagu i s-a practicat o perioad, cu toate riscurile mbolnvirii cu severitate necontrolat. Vaccinarea antivariolic a fost introdus de E. Jenner (1796). Ca vaccin, el a utilizat un virus de la bovine (cowpox). Metoda s-a bazat pe observaia empiric a rezistenei n cursul marilor epidemii de variol, a mulgtorilor care fuseser infectai cu virusul cowpox. Acesta, produce o infecie pustular i fiind nrudit antigenic cu virusul variolei, confer protecie antivariolic. Vaccinarea persoanelor sntoase s-a fcut cu lichidul recoltat din pustulele de pe ugerul vacilor. Perioada tiinific a Imunologiei a fost inaugurat de L. Pasteur, prin descoperirea unor vaccinuri cu o larg aplicaie practic. Denumirea de vaccin a fost dat de Pasteur, n

amintirea produsului recoltat de Jenner din leziunile de pe ugerul vacii. Denumirea s-a pstrat pentru toate produsele folosite n practic, pentru a crea o stare de rezisten preventiv fa de eventualul contact cu agentul patogen. Pasteur a fundamentat tiinific practica producerii i utilizrii vaccinurilor. El a demonstrat c proprietile biologice (patogenitatea i virulena) bacteriilor i virusurilor patogene nu sunt fixe. In anumite condiii, aceste proprieti se pot diminua prin anumite artificii de tehnic, aa nct un agent virulent care de regul determin o infecie mortal, poate fi transformat ntr-un agent care produce o infecie uoar, fr semne clinice, dar creeaz o rezisten foarte solid. Vaccinurile atenuate ndeplinesc aceste deziderate. Pasteur a atenuat virulena agenilor patogeni prin dou metode: prin nvechirea culturilor i prin cultivarea la temperaturi ridicate. Pasteur a descoperit trei vaccinuri: al holerei ginilor, al antraxului la ovine i al rabiei. Agentul patogen al holerei ginilor Yersinia pestis este o bacterie foarte virulent. Un inocul de cteva celule este suficient pentru a produce mbolnvirea i moartea organismelor sensibile. Cultura virulent de Yersinia, prin meninere la temperatura camerei (nvechire) se atenueaz i dup inoculare la ginile normale, nu mai produce mbolnvirea. Psrile inoculate cu cultura bacterian atenuat, devin rezistente la reinfecia cu o cultur virulent, spre deosebire de psrile lotului martor, care se mbolnvesc i mor. Cultura bacterian veche a creat o stare de imunitate, adic a avut rolul unui vaccin. Atenuarea virulenei prin nvechirea culturii este un proces necontrolat i probabil se datoreaz modificrilor biochimice sau genetice ale celulelor, sub influena produselor de catabolism acumulate n mediul de cultur sau se datoreaz epuizrii mediului n substanele eseniale pentru cretere. Agentul patogen al infeciei crbunoase (anthrax) este Bacillus anthracis, o bacterie sporulat. Sporul se formeaz la 37 o. Cultura bacterian crescut la 42 o, i modific proprietile biologice, pierde capacitatea de sporulare (devine asporogen). Aceste modificri se nsoesc de pierderea progresiv a virulenei. Incubarea la 42 o este o modalitate a obinerii dintr-o cultur virulent, a unei culturi cu virulen progresiv atenuat pentru organismul gazd(oaie, iepure, cobai, oarece). Crbunele este o boal grav a oilor, ce se transmite i la om. Pasteur a imaginat o schem de vaccinare a ovinelor, ncepnd cu un inocul bacterian virulent pentru oarece i continund cu inocul bacterian cu virulen mai mare. A creat o stare de imunitate a ovinelor, crora le-a conferit rezisten la bacteriile foarte virulente. Agentul infecios al rabiei nu a fost evideniat de Pasteur. Autorul a utilizat esut nervos medular sau creier de la iepurele infectat experimental, pe care l-a modificat prin uscare n prezena potasei caustice. A obinut un vaccin care, administrat ct mai repede dup muctura animalului rabid, creeaz o stare de rezisten, n absena creia infecia rabic evolueaz invariabil spre moarte. Cercetrile lui Pasteur au pus bazele Imunologiei medicale i ale obinerii i utilizrii pe baze tiinifice a vaccinurilor. A urmat o perioad n cursul creia s-au nregistrat progrese importante n obinerea i administrarea vaccinurilor. Bazele conceptului imunitii humorale au fost puse de Behring i Kitasato (1890), care au evideniat anticorpii serici, dup imunizarea animalelor de laborator. Serurile imune pot fi folosite n scop terapeutic pentru a stopa sau a atenua evoluia unei boli infecioase, cu condiia ca administrarea acestor seruri s fie foarte precoce. In 1923, Behring a organizat

producia de seruri imune, preluat de Institutul Pasteur din Paris (nfiinat n 1894) i apoi de Institutul Babe i de Institutul Cantacuzino. n 1894, Pfeiffer a descris fenomenul de bacterioliz, demonstrnd c serul sanguin al animalelor imunizate are proprietatea de a provoca liza celulelor bacteriene. El a demonstrat c bacterioliza necesit dou componente: serul sanguin al animalului imunizat i o pictur de ser proaspt de cobai. Procesul este foarte specific: serul produce numai liza celulelor bacteriene care au specificitate fa de anticorpii serici. J. Bordet a evideniat c fenomenul lizei se produce i n cazul hematiilor, dac sunt puse n contact cu serul sanguin de la iepurele imunizat cu hematii, la care se adaug ser proaspt de cobai, n care se gsete complementul (alexina). Conceptul imunitii mediate celular a fost formulat de Metchnikoff (1891). El a evidniat c n organism exist o serie de celule specializate, cu capacitatea de a recunoate celulele strine i de a le ngloba prin procesul de fagocitoz, care sunt digerate i eliminate din celula fagocitar. Metchnikoff a fcut observaii pe crustaceul Daphnia magna, ale crui celule fagocitare nglobeaz i diger sporii fungici ( Monospora bicuspidata). Cnd infecia cu spori este masiv, capacitatea de aprare a organismului este depit i gazda moare. Cele dou doctrine ale fenomenului imunitar, care s-au confruntat prin reprezentanii lor, au fost unificate de Wright (1903). El a demonstrat existena n ser a unor anticorpi naturali denumii opsonine, care acioneaz n cooperare cu fagocitele. n 1930, K. Landsteiner a evideniat o structur antigenic pe suprafaa hematiilor umane i a stabilit existena sistemului antigenic ABO, precum i a normelor ce trebuie respectate n practica transfuziei de snge. Ramon (1925) a demonstrat c unii ageni patogeni (ca de exemplu, al difteriei, al tetanosului) produc toxine foarte puternice. Aceste toxine au un potenial foarte ridicat: cantiti foarte mici de toxine sunt suficiente pentru a provoca moartea animalelor de experien. Tratarea preparatului de toxin cu formol 4% o i meninerea amestecului la 39o pentru o perioad de timp, este urmat de pierderea complet a proprietilor toxice. Preparatul atoxic este inofensiv i poate fi administrat n cantiti relativ mari, fr s determine efecte patologice. Preparatul atoxic i pstreaz proprietile imunogene i induce o stare de rezisten a organismelor imunizate. Sub aciunea combinat a formolului i temperaturii, toxinele difteric i tetanic au fost transformate n anatoxine. Cercetrile de biochimie(1930-1950) au permis elucidarea structurii moleculare a antigenelor, a imunoglobulinelor i a haptenelor. Studiul mecanismelor celulare ale proceselor imunitare (1950-1980) este marcat de progresele biologiei moleculare i de interferena cu Virologia, Microbiologia, Biologia celular, Biofizica, Biochimia, Genetica. S-a evideniat rolul esenial al limfocitului n fenomenele imunitare, precum i rolul plasmocitelor n sinteza i secreia anticorpilor. Mc Farlane Burnet (1959) a elaborat teoria seleciei clonale a rspunsului imun, iar J.F.A.P.Miller (1960) a stabilit rolul esenial al timusului n dobndirea competenei funcionale a limfocitelor T. R. Good (1960) a evideniat rolul bursei lui Fabricius n geneza sistemului imunitar la psri.

J. Dausset (1954) a demonstrat c pe suprafaa celulelor oricrui organism se gsete o serie de molecule (antigene), care confer fiecrui organism o individualitate antigenic unic. Datorit acestor antigene, reaciile care sunt determinate de o gref de esut sau de organ, pot evolua n mod diferit: ntre organismele foarte nrudite, grefa prinde foarte bine, iar o gref ntre organisme cu diferene majore de ordin genetic, produce o reacie de respingere, care este cu att mai rapid cu ct diferenele antigenice sunt mai mari. Antigenele suprafeei celulare care confer individualitate biochimic unic fiecrui organism, se numesc antigene de histocompatibilitate. Evaluarea diferenelor celor doi parteneri (donor i receptor) n ceea ce privete moleculele de histocompatibilitate, este esenial nainte de grefarea organului. Dup 1970, studiul sistemului imunitar corespunde unei abordri integratoare. Dup opinia lui N. K. Jerne (1985), imunologia i-a pierdut statutul de disciplin izolat, fiind pe cale de a fi absorbit de biologia clasic . Dup 1980, Imunologia s-a diversificat i s-a aprofundat, dar n acelai timp este mai unificat ca oricnd, sub imperativul numitorului comun al nelegerii funciei imunitare la nivel molecular. Abordrile moleculare vor sta la baza tuturor cercetrilor viitoare, legate de funcia imunitar. n perspectiv, orizontul de evoluie a Imunologiei se extinde asupra nelegerii genelor codificatoare ale moleculelor efectoare i reglatoare ale rspunsului imun i ale mecanismelor aciunii lor. Astfel vom nelege diferenierea limfocitelor, activarea lor, mecanismele sintezei, secreiei, recirculrii limfocitelor i mecanismele aciunii moleculelor efectoare. Ar urma utilizarea cunotiinelor imunologice pentru prevenirea maladiilor cu substrat imunitar (alergii, maladii autoimune), pentru prevenirea respingerii grefelor de esuturi i organe i pentru imunoterapia neoplaziilor. Va fi o perioad a rentoarcerii aplicrii Imunologiei moleculare, la nivelul ntregului organism.

Diviziunile Imunologiei

Imunologia s-a nscut ca un domeniu al Microbiologiei i s-a dezvoltat ca un domeniu al Bacteriologiei medicale, cu care a rmas n raporturi de dependen pn ctre anul 1960. Treptat ns, prin acumularea unui volum mare de date tiinifice care au demonstrat intervenia funciei imunitare i a reaciilor imune n numeroase fenomene normale i patologice, Imunologia a devenit o tiin de sine stttoare. Consecina fireasc a implicrii funciei imunitare ntr-o multitudine de procese normale i patologice, a fost aceea c din domeniul Imunologiei s-au desprins ramuri care, la rndul lor, tind s aib o existen autonom. Imunobiologia este cea mai cuprinztoare dintre ramuri. Ea studiaz fenomenele imunitare ca manifestri ale unei funcii biologice eseniale funcia de aprare. Studiaz substratul biologic al rspunsului imun (celulele imunitare, originea i mecanismele diferenierii lor, factorii celulari i humorali care asigur diferenierea lor), mecanismele celulare i moleculare ale biosintezei anticorpilor, explic implantarea celulelor tumorale i geneza cancerului clinic n condiiile aciunii efectorilor sistemului imunitar. Studiaz

mecanismele imunitare ale respingerii grefelor de esuturi i organe, mecanismele reactivitii imunitare n filogenie i ontogenie, precum i bazele celulare i moleculare ale strilor de hipersensibilitate i ale maladiilor autoimune. Imunochimia este o disciplin de grani ce aparine Imunologiei i Biochimiei, care studiaz funcia imunitar sub aspect biochimic. Preocuparea esenial a constat n studiul chimiei antigenelor i anticorpilor i al mecanismului lor de interaciune n reacia antigenanticorp. Datele referitoare la structura chimic a antigenelor i anticorpilor au pus bazele Imunochimiei, dar ulterior, domeniul i-a lrgit sfera de activitate i studiaz urmtoarele aspecte: factorii moleculari ai rspunsului imun i n special ai imunitii mediate celular; moleculele de histocompatibilitate; markerii antigenici specifici diferitelor populaii de celule limfoide; moleculele cu funcie de receptor de antigen, pe suprafaa celulelor limfoide; factorii de cooperare celular n cursul elaborrii rspunsului imun (interleuchine); componentele complementului etc.

Termenul de Imunochimie a fost introdus de chimistul suedez Arrhenius (1907). El i-a intitulat astfel studiul cu privire la reaciile chimice care se produc n organismul uman i animal, dup imunizare. Fondatorul Imunochimiei este P. Ehrlich. El a introdus metode cantitative n studiul reaciilor antigen-anticorp i a elaborat o teorie general asupra recunoaterii imune (teoria catenelor laterale sau a receptorilor). Dup 1950, Imunochimia sa dezvoltat spectaculos, datorit descoperirilor din domeniul biochimiei, datorit utilizrii unor metode fizico-chimice de analiz a macromoleculelor i prin aplicarea acestora la domeniul Imunologiei. S-a nscut un set de metode, n esen biochimice, puse n slujba analizei moleculelor implicate n funcia imunitar. Domeniul s-a numit analiz imunochimic i utilizeaz metode care deriv din mbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice. Imunochimia este deservit de metoda imunodifuziei, imunofluorescenei, RIA, ELISA, dializa la echilibru etc. Efectul utilizrii acestor metode de investigare a fost cunoaterea mecanismelor moleculare care stau la baza rspunsului imun, ndeosebi humoral i aplicarea n laboratorul clinic, a unor noi metode de diagnostic. n clinic, studiile de Imunochimie au propus noi metode de tratament, bazate pe interaciunea unor molecule cu rol de vehicul pentru anticorpi, cu receptorii unor celule int (imunotoxine). Imunogenetica studiaz determinismul genetic al rspunsului imun: mecanismele genetice care asigur diversitatea anticorpilor i a antigenelor de histocompatibilitate. Imunohematologia s-a nscut odat cu stabilirea diferenelor antigenice ale eritrocitelor umane i cu precizarea grupelor sanguine (K. Landsteiner, 1901) i s-a dezvoltat dup ce sa stabilit existena unor diferene fine ntre diferite tipuri de eritrocite i, n special, dup descoperirea factorului Rh i a rolului su n patologia sarcinii. Imunologia medical uman i veterinar s-a dezvoltat n trei direcii: - direcia profilactic, orientat spre descoperirea i producerea unor noi vaccinuri, capabile s creeze o stare de rezisten. Ea se preocup, de asemenea, de schemele de vaccinare, de posibilitatea asocierii diferitelor vaccinuri i de posibilitatea stimulrii rspunsului imun cu ajutorul adjuvanilor;

- direcia terapeutic studiaz posibilitatea obinerii serurilor imune. Ele conin anticorpi i se administreaz organismelor care prezint riscul mbolnvirii prin infecii; - direcia diagnosticului studiaz posibilitatea identificrii agenilor etiologici ai diverselor maladii infecioase, cu ajutorul reactanilor imunologici (seruri imune i antigene). Imunopatologia studiaz fenomenele imunitare n relaie cu diferite maladii. In multe situaii patologice, rspunsul imun (activarea funciei imunitare) are efecte defavorabile, prejudiciante asupra organismului. Rspunsul imun se instituie drept cauz, dar n special ca mecanism, pentru producerea unor manifestri patologice. Afeciunile generate de activarea sistemului imunitar (imunopatii) se grupeaz n dou categorii: - strile de hipersensibilitate(alergiile); - maladiile autoimune. Imunopatologia studiaz, de asemenea, imunodeficienele (nscute i dobndite), imunitatea de transplant i imunitatea antitumoral, rspunsul imun n maladiile infecioase virale i bacteriene, precum i n maladiile parazitare. Serologia (Imunoserologia) s-a dezvoltat ca o ramur practic, dedicat studiului tehnicilor de explorare a reaciilor imune in vitro.
CARACTERIZAREA GENERAL A ANTIGENELOR

GR. MIHESCU, CAMELIA MIHESCU

Convenional, antigenele se definesc ca substane strine, care, consecutiv introducerii n organismul uman sau animal pe o cale parenteral (alta dect cea digestiv), declaneaz sinteza anticorpilor cu care se combin specific. Definiia este incomplet din cteva motive. 1. Calea digestiv de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilitatea declanrii rspunsului imun. Pentru agenii infecioi care se multiplic n tractul digestiv, administrarea oral asigur o bun imunizare (de exemplu, vaccinul polio se administreaz oral, dei calea parenteral este mai eficient). 2. Unele substane nonself sunt n mod eronat considerate ca neantigenice, deoarece, dei in vivo stimuleaz reactivitatea imunitar i induc sinteza unei cantiti mici de anticorpi, in vitro nu produc reacii vizibile antigen-anticorp. 3. Fa de unele antigene, organismele nu declaneaz rspunsul imun, ci manifest o stare de toleran. 4. Unele molecule n stare nativ nu induc un rspuns imun, ci numai dup cuplarea covalent cu o molecul purttor. Molecula nativ i pstreaz proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizai. Astfel de molecule se numesc haptene.

J. F. Bach (1976) definete antigenele ca fiind molecule care, consecutiv introducerii n organism pe o cale adecvat, induc un rspuns imun materializat prin proliferarea celulelor limfoide i sinteza moleculelor de recunoatere (anticorpi i receptori celulari), cu care se combin in vivo i in vitro.

Modelul general de structur a unui antigen

O molecul antigenic este alctuit din dou componente; - componenta purttor (carrier), care corespunde celei mai mari pri a moleculei: - gruprile determinante de specificitate sau epitopi, localizate pe suprafaa componentei purttor i formate din secvene specifice de monomeri. Epitopii, prin secvena proprie a monomerilor i prin configuraia spaial specific, confer individualitate chimic i specificitate antigenic moleculei nonself. Gruprile determinante de specificitate sunt echivalenii moleculari i funcionali ai haptenei. Gruprile determinante de specificitate se gsesc n numr variabil pe suprafaa purttorului i pot fi identice att n ceea ce privete compoziia chimic, ct i configuraia spaial (ca n cazul antigenelor polizaharidice cu epitopi repetitivi) sau sunt diferite, att ca secven a monomerilor ct i n privina configuraiei spaiale. Fig. 1. Modelul general de structur a unui antigen. Cea mai mare parte a oricrei molecule antigenice este reprezentat de gruparea carrier, pe care sunt localizai epitopii cu diferite configuraii spaiale, stimulatori ai reactivitii imunitare. Unii epitopi pot fi unici, iar alii sunt multipli. Uneori, epitopii stimuleaz sinteza anticorpilor cu afiniti diferite.

Proprietile definitorii ale antigenelor n studiile experimentale asupra imunogenitii unor molecule sintetice, M. Sela (1969) a descris dou proprieti eseniale ale antigenelor: 1. Imunogenitatea sau antigenitatea este proprietatea unui antigen complet, format din gruparea carrier i epitopi, de a declana un rspuns imun, humoral sau celular, ori de cte ori ptrunde n organism pe o cale adecvat. Proprietatea de imunogenitate este asociat cu gruparea carrier a moleculei de antigen, grupare care ntr-o oarecare msur influeneaz i specificitatea anticorpilor. 2. Specificitatea definete capacitatea antigenului ntreg sau numai a epitopilor si de a se combina specific cu anticorpii sau cu receptorii celulari a cror sintez a fost indus. Proprietatea de specificitate este dependent, n primul rnd de epitopi, dar este influenat ntr-o msur mai mare sau mai mic i de gruparea carrier. Noiunea de imunogen, uneori, este distinct de aceea de antigen. Noiunea de imunogen este mai restrictiv i semnific proprietatea unei substane, n stare nativ, de a stimula rspunsul imun, fr s necesite conjugarea cu o alt molecul.

Noiunea de antigen este mai larg, deoarece desemneaz molecule nonself care sunt imunogene n stare nativ sau devin imunogene dup conjugarea cu o molecul purttor. Antigenul poate fi uneori inacapabil, n forma sa nativ, s stimuleze rspunsul imun.

CLASIFICAREA I IMUNOGENITATEA ANTIGENELOR

Dup originea lor, antigenele sunt exogene i endogene. Antigenele exogene sunt cele mai numeroase i pot fi mprite n trei categorii: 1) naturale; 2) artificiale; 3) sintetice.
Antigene naturale

Antigenele naturale formeaz categoria cea mai cuprinztoare. Aici sunt incluse toate macromoleculele naturale din virusuri, microorganisme, fungi, plante i animale.
Dup dimensiuni se disting antigene moleculare (solubile) i antigene corpusculare. Antigenele moleculare (solubile) constituie gruparea cea mai numeroas, care include toate tipurile de macromolecule: proteine, polizaharide, lipide, acizi nucleici. Antigenele corpusculare (insolubile) sunt reprezentate de virusuri i de celule (procariote i eucariote). Antigenele moleculare

Cele mai studiate antigene sunt proteinele i polizaharidele, la care se adaug conjugatele: glicoproteine, nucleoproteine, lipoproteine, peptidoglicani, glicolipide. Proteinele sunt cele mai numeroase i mai importante antigene moleculare. Diversitatea lor chimic, generat de variaia secvenei de aminoacizi este uria. Practic, fiecare tip de molecul proteic nonself din lumea vie este un antigen pentru organismul animal i uman, deoarece are o secven unic de aminoacizi, care determin o structur secundar i tridimensional proprie i implicit, existena unor epitopi proprii ca secven a aminoacizilor i conformaie spaial.
Imunogenitatea este o proprietate general a proteinelor, a celor cu rol structural (colagenul, cheratina, elastina, fibroina viermelui de mtase, proteinele capsidei virale), a celor cu rol funcional (miozin, actin, albumin, hemoglobin, mioglobin, enzime, hormoni, imunoglobuline), a celor cu rol de depozit de aminoacizi(ovalbumina, cazeina, gliadina din seminele de gru). Toate proteinele i polipeptidele cu o greutate molecular mai mare de 1000 D sunt imunogene, ntr-o msur mai mare sau mai mic. De cele mai multe ori, pentru antigenele proteice, nu se face distincia dintre epitopii inductori ai rspunsului imun i gruparea carrier, deoarece proteinele posed un spectru continuum de determinani antigenici, ce corespund unor secvene discrete ale suprafeei moleculare localizate n

zonele cele mai expuse contactului cu receptorii sistemului imunitar. Antigenitatea moleculelor globulare este determinat adeseori, de configuraia lor spaial, rezultat din plierea tridimensional. Pentru cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina, lizozimul, ribonucleaza etc.), aproape toi determinanii antigenici sunt conformaionali, adic sunt rezultatul plierii spaiale a moleculei, iar alii sunt secveniali, adic sunt reprezentai de o secven particular de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare (cheratina, colagenul, fibroina) au configuraii mai simple dect cele globulare, catenele lor fiind aranjate sau rsucite pe o singur dimensiune. Determinanii antigenici ai acestor proteine sunt secveniali, formai din 3-6 aminoacizi. Sistemul imunitar al unui organism recunoate un numr limitat de determinani antigenici ai unei molecule proteice. Epitopii, conformaionali sau secveniali, care stimuleaz rspunsul imun in vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc epitopi dominani. O parte a determinanilor antigenici ai unei molecule native, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilenioi), nefiind accesibili sistemului imunitar al organismului, dar se pot exprima ntr-un anumit set de condiii de imunizare (gazd, adjuvant etc.). Acetia sunt epitopi interni ai proteinelor globulare. Un determinant intern poate fi silenios n molecula nativ, dar devine imunostimulator dup clivarea enzimatic a moleculei, in vivo sau in vitro. De aceea, M. Sela a recomandat utilizarea termenului de grupare imunodominant, pentru epitopul sau epitopii care se exprim n anumite condiii(gazd, adjuvant, cale de administrare) i determin specificitatea rspunsului imun. Fig.2. Epitopii dominani sunt localizai la suprafaa moleculei globulare. Epitopii subdominani devin accesibili dup clivarea moleculei n etapa prelucrrii n macrofag, iar epitopii criptici sunt inaccesibili fenomenului de recunoatere imunitar. Imunogenitatea antigenelor proteice se modific n diferite condiii. Denaturarea moleculelor native sub aciunea agenilor chimici i a cldurii, modificarea configuraiei moleculei sub aciunea agenilor reductori sau hidroliza enzimatic, modific imunogenitatea. Anticorpii specifici fa de proteina nativ precipit slab sau de loc proteina denaturat termic sau chimic. Formaldehida i glutaraldehida sunt ageni de legare ncruciat a moleculelor proteice, constituind reele multimoleculare stabile. Aceti ageni produc denaturarea proteinelor i modific funciile celor cu activitate biologic (toxine, enzime). Astfel, exotoxinele tratate cu formaldehid, i pierd proprietile toxice, dar rmn imunogene. Formaldehida i glutaraldehida se folosesc pentru conservarea antigenelor cu greutate molecular mic (peptide), dar sunt mai puin utilizate pentru conservarea proprietilor antigenice ale moleculelor mari. Agenii chimici de legare ncruciat modific imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformaiei moleculei i mascarea epitopilor sau prin modificarea chimic a aminoacizilor epitopului. Denaturarea semnific deplierea structurii rsucite a moleculelor proteice i are loc prin modificarea pH, prin nclzire, prin reducerea legturilor S-S sub aciunea ureii i a betamercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare, proteina i pierde nu numai funcia biologic, dar i modific specificitatea antigenic. De exemplu, cele 4 puni S-S ale RN-azei, ntre resturile de cistin, sunt reduse de -mercaptoetanol i transformate n 8 resturi de cistein, cu pierderea total a activitii enzimatice. Anticorpii fa de RN-aza pancreatic bovin nativ nu precipit moleculele de RN-az denaturat prin reducerea legturilor S-S. Invers, anticorpii fa de

RN-aza denaturat, nu precipit RN-aza nativ. Modificarea specificitii anticorpilor sugereaz c reducerea legturilor S-S determin pierderea epitopilor conformaionali. Proteinele denaturate reverseaz greu la forma nativ, chiar prin restabilirea condiiilor de mediu. Hidroliza enzimatic modific configuraia spaial a moleculelor proteice native i diminu imunogenitatea lor, cu att mai mult cu ct fragmentele rezultate au dimensiuni mai mici. Prin clivare enzimatic se anuleaz imunogenitatea epitopilor conformaionali i se relev epitopi care n molecula nativ au statutul de epitopi criptici. O atenie special s-a acordat studiului imunogenitii unor proteine ale cror proprieti biologic-active sunt uor de evaluat: enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine, imunoglobuline (n calitatea lor de antigene), proteine ale capsidei sau ale nveliului viral. Enzimele sunt antigenice, indiferent de originea lor. Reacia moleculelor de enzim cu anticorpii specifici a constituit o modalitate de determinare a poziiei epitopilor. Anticorpii fa de diferii epitopi ai moleculei de enzim modific n grade foarte diferite activitatea ei catalitic. Dac anticorpii sunt specifici fa de epitopi localizai la nivelul situsului activ al enzimei, molecula i pierde activitatea fa de substrat, deoarece legarea anticorpilor la situsul activ inhib competitiv legarea moleculelor de substrat. Gradul de inhibiie a activitii enzimatice este cu att mai accentuat, cu ct molecula este mai mare. Efectul inhibitor al anticorpilor nu se produce dac enzima a legat deja substratul specific. Dac gruprile determinante de specificitate ale moleculei de enzim sunt situate n afara situsului catalitic, activitatea enzimei este parial inhibat, datorit modificrilor conformaionale care survin dup reacia antigen-anticorp, sau rmne intact. Foarte rar, complexul enzim-anticorp are un efect catalitic superior, comparativ cu enzima nativ. Hormonii sunt molecule slabimunogene, datorit uniformitii relative a structurii lor chimice n regnul animal. Anticorpii specifici fa de majoritatea hormonilor proteici se obin prin asocierea lor prealabil cu adjuvantul Freund. Imunogenitatea hormonilor este ntr-o relaie direct cu gradul deosebirilor chimice existente ntre hormonul exogen i hormonul produs de organismul receptor. Consecina este sinteza anticorpilor antihormon. Proprietile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute, datorit utilizrii clinice a hormonului. Molecula de insulin este alctuit din dou catene polipeptidice, cu un numr total de 51 de aminoacizi: 21 ai catenei A i 30 ai catenei B. Cele dou catene sunt reunite prin puni S-S. Structura moleculelor de insulin de la diferite specii este foarte asemntoare, 47 din cei 51 de aminoacizi fiind identici. Deosebirile se gsesc n catena A pentru aminoacizii 8, 9 i 10 (la bovine Ala, Ser, Val, la om sunt Thr, Ser, Ile, iar la ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferena este limitat la aminoacidul C-terminal. Aceste mici diferene ale secvenei de aminoacizi nu modific funcia hormonului. De aceea, insulina, indiferent de provenien, este la fel de eficient pentru tratamentul diabetului uman. Micile diferene de secven, n general, nu sunt sesizate de organismul receptor. Totui, dup administrare prelungit, organismele receptoare cu reactivitate imunitar mai nalt, sintetizeaz anticorpi anti-insulin. Polizaharidele, dei au complexitate structural relativ mare, condiionat de multitudinea posibilitilor de legare a atomilor de carbon, sunt molecule slabimunogene n stare nativ, comparativ cu proteinele. Antigenitatea lor este conferit de succesiunea unitilor componente, de configuraia spaial a moleculei i de greutatea molecular. Cele cu greuti mai mici de 50 kD nu

sunt imunogene. Polizaharidele sunt antigene cu epitopi secveniali repetitivi i cel puin uneori, n funcie de originea polizaharidului i de specia imunizat, sunt imunogeni. Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting dou tipuri de polizaharide: a) cele care au o caten central pe care se inser ramificaiile laterale; b) polizaharide lipsite de o caten central, iar ramificaiile sunt dispuse aleatoriu, fr nici o simetrie. Rolul catenelor centrale n conferirea imunogenitii este controversat, dar ramificaiile laterale au o importan deosebit pentru determinarea specificitii antigenice a polizaharidelor. Din punctul de vedere al compoziiei chimice pot fi homo- sau heteroplizaharide, iar n ceea ce privete sarcina, pot fi neutre sau ncrcate. Oligoi polizaharidele pot dobndi o structur teriar (globular). Uneori, configuraia spaial a polimerului glucidic este determinant pentru specificitatea sa antigenic. Schimbrile conformaionale ale polizaharidelor se produc mai uor dect ale proteinelor, pentru c au bariere energetice sczute. Pentru polizaharide, denaturarea este practic necunoscut, ceea ce le confer stabilitate. Dac imunogenitatea polizaharidelor native este slab, adeseori ele se comport ca haptene, adic devin antigenice dup cuplarea cu un purttor proteic, rezultnd lectine, cu o foarte larg distribuie n lumea vie. In calitate de haptene, polizaharidele au proprietatea de specificitate, adic se combin cu anticorpii complementari fa de complexul glicoproteic. Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacterian: dextranul i polizaharidele capsulare. Dextranii sunt polimeri ramificai de glucoz, resturile glucozil fiind unite mai ales prin legturi de tip 1-6, dar n funcie de specia productoare, punctele de ramificaie ale catenelor polimere pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4. Dextranii sunt sintetizai n special de unele bacterii lactice, din zaharoz, dup reacia: Dextranaz N(zaharoz) --------------- (Glucoz)n + (Fructoz)n Dextranii au greuti moleculare foarte diferite (pn la 106 D), n funcie de gradul de polimerizare. Nu sunt imunogeni i de aceea se folosesc ca nlocuitori ai plasmei. Prin transfuzii repetate cu soluii de dextran la om i prin injectare repetat la oarece, s-au sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor antidextran este foarte nalt. In serul animalelor imunizate cu dextrani s-au detectat dou tipuri de anticorpi: unii specifici fa de resturile de glucozil legate 1-2 i alii specifici fa de resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reacii ncruciate, dei deosebirea dintre cele dou categorii de molecule de dextran const numai n modul diferit de legare a resturilor de glucozil ntre ele. Polizaharidele capsulare se pot gsi fie subforma moleculelor libere ( solubile), fie subform corpuscular (ataate celulelor bacteriene capsulate). Variaiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate de compoziia glucidic a catenei, de secvena monomerilor sau de modul de legare a lor n caten, confer tulpinilor bacteriene, specificitate antigenic de tip. La Str. pneumoniae s-au identificat peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In compoziia lor intr hexoze, pentoze, derivaii lor aminai, metilai etc. Specificitatea antigenic a polizaharidelor capsulare depinde att de compoziia chimic, ct i de succesiunea monomerilor n catena polizaharidic. Ca vaccinuri, polizaharidele induc starea de toleran.

n stare purificat sunt molecule neimunogene, datorit uniformitii lor structurale n lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce sinteza anticorpilor. Acizii nucleici nativi sunt conjugate nucleoproteice, n care acizii nucleici au rolul de hapten. Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformaionali. O fracie din anticorpii anti-conjugat se combin cu acizii nucleici. Anticorpii anti-acizi nucleici se combin cu acizii nucleici n stare pur, indiferent de provenien. Proteinele asociate acizilor nucleici confer o nou specificitate antigenic i determin sinteza anticorpilor care se combin cu proteina puttor. Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obin pe una din urmtoarele ci: 1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T2, T4, T6), supui ocului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebete de ADN din celulele eucariote, prin prezena 5-hidroxi-metilcitozinei glicozilate, n locul citozinei. Anticorpii au specificitate fa de bazele glicozilate, ceea ce explic lipsa reaciilor ncruciate cu ali acizi nucleici. 2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu ARN de origine bacterian, vegetal sau animal, precum i cu polinucleotidele sintetice(poli-A, poli-C, poli-U), dar nu reacioneaz cu ADN nativ i nici cu ADN denaturat. 3. Imunizarea cu conjugate hapten-protein, n care haptena este reprezentat de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide, nucleotide, dinucleotide i trinucleotide. Anticorpii sintetizai reacioneaz att cu haptena ct i cu ADN nativ sau denaturat. 4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici i albumin metilat. Cele dou molecule formeaz un complex necovalent, datorit interaciei dintre gruprile negative ale acizilor nucleici i cele pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetizai reacioneaz cu complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ i denaturat de diferite origini. 5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gsesc n sngele pacienilor cu lupus eritematos diseminat (LED). Anticorpii sintetizai fa de acizii nucleici cu rol de haptene n conjugatele cu proteine nu au specificitate, deoarece precipit ADN monocatenar, ARN de diferite origini, poliribonucleotide i acizii nucleici dublu catenari. Lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativ, dar se pot cupla cu proteinele i n conjugatul format au rolul de haptene. Din punct de vedere imunologic, cele mai importante lipide sunt fosfatidele (sfingomielina i cefalina) i glicosfingolipidele(galactocerebrozida). O hapten lipidic cu o importan practic deosebit este cardiolipina, din cordul mamiferelor. In sngele indivizilor infectai cu T. pallidum se gsesc anticorpi care reacioneaz cu cardiolipina nalt purificat (reacie ncruciat), extras din cordul bovin. Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al sintezei anticorpilor hemaglutinani i n prezena complementului, hemolitici. Studiul imunogenitii lipidelor a fost ngreunat de insolubilitatea lor n ap. Problema reactivitii anticorpilor cu antigenele lipidice a fost depit parial, prin utilizarea lipidelor auxiliare

(lecitina i colesterolul) n suspensia antigenic. Disponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitii lipidelor asociate cu membranele. Haptene Haptenele(haptein, grec = a apuca) sunt substane chimice naturale sau de sintez, cu molecul mic, a cror imunogenitate este condiionat de cuplarea cu o molecul purttor, dar i pstreaz proprietatea de specificitate, adic reacioneaz cu anticorpii specifici a cror sintez a fost indus de haptena conjugat cu o molecul cu rol de purttor. Denumirea de hapten a fost introdus de Landsteiner pentru a caracteriza din punct de vedere funcional un extract alcoolic de rinichi de cal, neimunogen ca atare pentru iepure, dar capabil s se combine cu anticorpii sintetizai dup imunizarea iepurelui cu extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o molecul purttor. El a propus ca n categoria haptenelor s fie cuprins orice substan natural sau sintetic, cu greutate molecular mic sau mare, care n form nativ nu poate s induc un rspuns imun detectabil, dar dobndete capacitatea imunogen, dup cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o molecul purttor cu greutate molecular mare. Conjugatul este imunogen nu numai n raport cu epitopii moleculei purttor, ci i cu epitopul haptenei. Din punct de vedere funcional, haptenele s-au numit jumti de antigene, deoarece au numai una din cele dou proprieti eseniale ale antigenelor: nu sunt imunogene, dar i pstreaz proprietatea de specificitate. De aceea, termenul antigenic nu este sinonim cu cel de imunogenic. Haptena este un antigen, dar n forma sa nativ, nu este imunogen. n general, haptenele sunt molecule mici, dei uneori, macromoleculele pot funciona ca haptene. Extractul alcoolic de rinichi de cal este o hapten complex. Haptenele simple sunt reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele medicamente etc. Utiliznd haptenele simple, prin reacii de cuplare cu o molecul purttor s-au obinut antigene artificiale. Haptena din complexul molecular are rolul gruprii determinante de specificitate. Studiul imunogenitii conjugatelor hapten-molecul purttor a permis determinarea mrimii gruprilor determinante de specificitate ale antigenelor i indirect, determinarea situsului de combinare a anticorpilor. Pe aceiai cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea i heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru studiile de cristalografie cu raze X a unui complex antigen-anticorp. Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate molecular mic, a cror particularitate const n aceea c, dup injectare, n organism se combin spontan cu proteinele tisulare i formeaz conjugate hapten-protein, in vivo. Conjugatele hapten-protein induc sinteza anticorpilor i determin procese de hipersensibilitate sau iniiaz maladii autoimune. Astfel se comport derivaii dinitrofenolului substituii cu clor sau fluor, unii produi de degradare a penicilinei. Antigenele corpusculare Antigenele corpusculare sunt, n esen, antigene moleculare asociate virusurilor i celulelor. Proteinele capsidale i glicoproteinele nveliului viral sau proteinele prezentate pe suprafaa celulelor infectate cu virusuri, sunt foarte imunogene i stimuleaz rspunsul imun al gazdei. De aceea, imunitatea consecutiv infeciei virale este, de obicei, de lung durat. Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate n mediul extracelular), fie corpusculare (legate de celul). Din prima categorie fac parte exotoxinele i polizaharidele capsulare libere, iar din

cea de a II-a, antigenul somatic O (endotoxina bacteriilor Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix, flagelina, pilina, acizii teichoici, mureina etc. Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafeei eritrocitare, cu determinism biochimic cunoscut, n sistemul A, B, 0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gsesc i pe suprafaa celulelor tisulare, dar i n secreiile exocrine (saliv, suc gastric etc.), la circa 75% dintre indivizi, denumii secretori. Glicoproteinele din secreii sunt hidrosolubile i studiul lor a fost mai uor dect al moleculelor eritrocitare. Gruprile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare au rol dominant n determinarea specificitii de grup sanguin, aa cum au evideniat studiile de digestie enzimatic controlat. Eritrocitele tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun antigenul H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafaa antigenelor de grup 0 i n cantiti progresiv descrescnde pe hematiile de grup A, Bi Ab. Specificitatea antigenic de grup 0 este conferit de L-fucoz. Grupul A are o gen ce codific sinteza glicozil-transferazei, enzim ce adaug N-acetil-D-galactozamina, la galactoza preterminal a moleculei H. De aceea, specificitatea antigenic a eritrocitelor de grup A este conferit de trizaharidul N-acetil-galactozamin, galactoz i L-fucoz: N-acetil galactozamin ( 1-3) Gal R (R = restul catenei polizaharidice) 1-2 Fuc Indivizii de grup Bau o gen ce adaug D-galactoza (n loc de N-acetil galactozamin) la galactoza preterminal a moleculei H, avnd un determinant antigenic format din dou resturi terminale de D-galactoza i L-fucoza. Fig. 3. Oligozaharidele cu rol de epitopi determinani ai grupelor sanguine ABO. Oligozaharidul este ancorat n membrana eritrocitului prin intermediul sfingomielinei, denumit ceramid. 85% din indivizii umani secret substanele de grup sanguin n saliv. La indivizii secretori, oligozaharidele sunt prezente sub forma conjugatelor cu polipeptidele codificate de genele secretoare (dup Roitt, 1997).

Prezena restului de fucoz (adic antigenul H) este esenial pentru expresia epitopilor A i B. Gena H i antigenul su lipsesc la fenotipul Bombay. De aceea, transferazele A i B nu pot aduga glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului i antigenele de grup A i B nu sunt exprimate. Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificat prin tratamentul in vitro cu glicozidaze: o -glicozidaz (extras din bobul de cafea verde) poate cliva restul de Gal de pe hematiile de grup B i le convertete n hematii de grup 0, ce pot rmne funcionale dup transfuzia

la de grup 0.

subiecii

Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset, 1958) sunt molecule de suprafa ale majoritii esuturilor. Din punct de vedere biochimic, ele sunt strict specifice fiecrui organism uman i animal i confer individualitate biochimic proprie fiecrui organism. Se numesc i antigene de transplantare, deoarece, dup grefarea unui esut sau a unui organ, moleculele de histocompatibilitate se comport ca antigene i declaneaz rspunsul imun al organismului receptor, care determin respingerea grefei. Antigenele individuale de histocompatibilitate se evideniaz prin reacia de respingere a grefei. n funcie de raportul genetic dintre donor i receptor, antigenele de histocompatibilitate aparin urmtoarelor categorii: 1) autoantigenele includ antigenele proprii de histocompatibilitate, care, n condiii normale sunt tolerate de sistemul imunitar. Sub aciunea unor factori fizici, chimici sau biologici, antigenele de histocompatibilitate se modific devenind autoantigene, generatoare ale conflictelor autoimune; 2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune orga-nismelor identice din punct de vedere genetic, care aparin unei linii genetic pure (inbred). Verificarea puritii genetice a unei populaii de organisme se face prin transplantul de piele. Dac grefa este acceptat, organismele respective aparin aceleiai linii inbred. Termenii izoantigen i inbred nu au coresponden pentru populaia uman; 3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dup injectare declaneaz rspunsul imun la organisme ale aceleiai specii, dar diferite genetic, de organismul donor. Aloantigenele sunt inegal rspndite la indivizii unei specii i induc rspunsul imun la organismele care nu posed antigenul respectiv. Aloantigenele se evideniaz dup imunizarea unui organism, cu o suspensie celular provenit de la organisme ale aceleiai specii, dar aparinnd unui alotip diferit; 4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strin) includ molecule care se gsesc n/pe celulele tuturor indivizilor unei specii i care se comport ca antigene fa de organismele altei specii. Heteroantigenele se evideniaz prin sinteza anticorpilor fa de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii diferite. Celulele unei specii diferite aduc n organismul receptor nu numai heteroantigene, ci i aloantigene i chiar autoantigene. De aceea injectarea unui heteroantigen este una dintre cele mai utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor. Antigenele de organ sunt molecule specifice care confer particularitile biochimice i funcionale ale celulelor unui organ. De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare difer de proteinele esutului renal al aceluiai organism. Antigene artificiale La origine, antigenele artificiale sunt antigene naturale, modificate chimic prin cuplarea, cel mai adesea covalent, cu una sau mai multe molecule mici, care le confer o nou individualitate antigenic i o nou specificitate de combinare cu anticorpii, n raport cu molecula de origine.

Antigenele artificiale s-au obinut, n principal, pornind de la moleculele proteice. Prin legarea moleculelor proteice cu diferite haptene s-au obinut trei tipuri de antigene artificiale: a) conjugate hapten-protein, prin reacia de diazotare, iodurare i respectiv substituie nucleofil; b) conjugate protein-protein, prin intermediul unor ageni bifunc-ionali de legare (diizocianaii i carbodiimidele); c) proteine legate de suporturi insolubile, prin reacia de diazotare sau prin intermediul carbodiimidelor. a) Conjugatele hapten-protein au fost utilizate de Landsteiner, n studiile cu privire la mecanismele rspunsului imun. In conjugate, haptenele ndeplinesc rolul de epitopi (grupri determinate de specificitate), iar mole-culele proteice au rolul de carrier. Rspunsul imun nu este orientat strict fa de epitopii haptenici, ci i fa de determinani antigenici ai gruprii carrier. Cuplarea hapten-purttor necesit existena unei grupri reactive a haptenei, care s se lege covalent cu gruprile funcionale ale purttorului, cu condiia pstrrii integritii funcionale a celor doi reactani. Haptenele se pot cupla cu purttori foarte diveri, dar proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeaz conjugate foarte imunogene. Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule proteice, prin reacia de diazotare i a obinut azoproteine:

Dup cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei proteine, rezult un antigen artificial care induce formarea a dou categorii de anticorpi cu specificiti diferite, dup cum reacioneaz cu haptena, sau cu molecula purttor. Conjugatele azoproteice au permis studiul influenei configuraiei spaiale a haptenei, asupra specificitii antigenice. Gruparea sulfonat a fost legat n poziia orto, meta sau para a haptenei aminobenzen. Antiserurile obinute au specificitate fa de fiecare izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu proteina, pstreaz capacitatea de a precipita cu anticorpii specifici fa de proteina nativ, n timp ce conjugatele cu izomerii orto- i para- dau reacie foarte slab de precipitare. Concluzia este c izomerii de poziie induc modificri sterice (conformaionale) ale haptenei.

Conjugatele hapten-protein se pot obine prin reacia de iodurare. Proteinele puternic iodurate i modific specificitatea antigenic. Ele induc sinteza anticorpilor care dau reacii ncruciate de precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnificaia este c prin iodurare, proteinele i pierd specificitatea antigenic. Toate proteinele iodurate induc sinteza anticorpilor fa de o grupare iodurat, n special fa de tirozina iodurat, indiferent de specificitatea gruprii purttor. O alt reacie de obinere a conjugatului hapten-protein este cea de substituie nucleofil. Cele mai folosite haptene sunt 2,4-dinitrofenolul(DNP) i 2,4,6-trinitrofenolul(TNP). Mecanismul molecular al cuplrii este urmtorul: un atom de H din gruparea OH - , NH2+ sau SSH a proteinei, este nlocuit de gruparea haptenic prin eliminarea apei. Proteina pierde electroni, iar nucleul benzenic i accept. Gruprile donoare de electroni sunt OH - , NH2+, S-SH. Gruprile DNP i TNP sunt cuplate cu proteina purttor sub forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a 2,4,6trinitrobenzen-sulfonatului de Na sau subforma derivailor halogenai. Reacia dintre o protein i 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu ilustreaz mecanismul atacului nucleofilic, reacie n care proteina cedeaz electroni, iar nucleul benzenic i accept.

b) Conjugatele protein-protein se obin prin intermediul agenilor bifuncionali de legare: diizocianaii i carbodiimidele. Deoarece gruprile ciano au reactivitate diferit, reacia de cuplare se realizeaz n trepte. De exemplu, gruparea din poziia 4 a toluilen-diizocianatului este mai reactiv dect gruparea ciano din poziia 2. Aceasta permite ca una dintre proteine s se cupleze n poziia 4, iar ulterior, ntr-o nou etap a reaciei, cea de a II-a protein se va cupla la gruparea ciano din poziia 2:

Carbodiimidele, utilizate ca ageni bifuncionali pentru cuplarea proteinelor, sunt considerate anhidride simetrice ale ureii:

H2N C NH2 HOH O Uree

HN = C =NH Carbodiimida simetric

H2N C 4 N

Cianamida asimetric

Carbodiimidele pot fi substituite simetric sau asimetric cu molecule proteice: R1N = C = NR1 sau R1N = C = NR2. Agenii bifuncionali de cuplare permit obinerea conjugatelor proteice (conjugate anticorpiferitin, insulin-albumin), dar se folosesc i ca mediatori ai legrii diferitelor molecule proteice pe suprafaa eritrocitelor. Marcajul cu feritin este deosebit de important din punct de vedere practic, deoarece se folosete pentru evidenierea electrono-optic, la nivelul membranei, a diferitelor molecule proteice. c) Conjugatele protein-suport insolubil se obin prin cuplarea proteinelor cu un suport insolubil, prin reacia de diazotare, prin intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se

folosesc derivai celulozici: sephadex, sepharoza, agaroza etc. Legarea proteinei de suport, prin reacia de diazotare, se face prin intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau argininei. Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbeni i sunt folosii cu o eficien deosebit pentru purificarea proteinelor dintr-un amestec, datorit specificitii lor de combinare cu anticorpii corespunztori, fixai ntr-o coloan de material inert. Antigenul complementar specificitii de legare a anticorpului fixat n coloan, se leag necovalent de imunosorbent, dup care poate fi eluat cu un agent chimic. Anticorpii pot fi imobilizai pe un suport insolubil, prin tratamentul cu un agent de legare ncruciat (glutaraldehid), dar multe din situsurile reactive pt fi denaturate sau rmn ascunse. Fig. 4. Principiul funcional al imunosorbenilor utilizai n cromatografia de afinitate. Coloana conine sefaroz, pe care sunt fixate moleculele de anticorp. Amestecul de antigene este trecut prin coloan, unde va fi reinut numai antigenul care recunoate specific anticorpul fixat.

Cel mai bun suport de imobilizare este agaroza, un polizaharid obinut prin fracionarea agarului. Agaroza este rezistent la aciunea degradativ a enzimelor bacteriene i a agenilor chimici i poate fi regenerat. Este disponibil subforma sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 m i conine 2-8% agaroz n soluie apoas. In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci i antigenele sau chiar celule intacte. Imunosorbenii se folosesc n activitatea de cercetare i n clinic, pentru prepararea unor produse biologice i a medicamentelor. Antigene sintetice Antigenele sintetice sunt polimeri de aminoacizi, cu secven cunoscut, obinui in vitro. Proprietile imunogenice ale homopolimerilor (poli-Lys, poli-Glu, poli-Pro) i ale heteropolimerilor au fost studiate de M. Sela. Studiul imunogenitii heteropolimerilor are avantajul c ofer posibilitatea studiului influenei compoziiei chimice, a greutii moleculare i a conformaiei moleculare, uurnd studiul imunochimic al gruprilor determinante de specificitate antigenic. Catenele polipeptidice sintetice pot fi lineare sau ramificate. Cele ramificate rezult prin ataarea polimerilor lineari, la o caten polifuncional. Ramificarea se obine mai uor cu aminoacizi aromatici. Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu excepia poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, poli-L-Lys. Copolimerii formai din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultai prin polimerizarea a trei aminoacizi diferii sunt totdeauna imunogeni. Cu ct compoziia lor este mai heterogen, imunogenitatea este mai accentuat. Prezena aminoacizilor aromatici confer o anumit rigiditate a epitopilor i implicit, o imunogenitate superioar. Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie s fie catabolizai de aparatul enzimatic al celulelor care prelucreaz i prezint antigenul. Polipeptidele formate din D-aminoacizi sunt slab imunogene,

datorit incapacitii organismului de a cataboliza polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile n studiile de imunochimie, cu privire la: - determinarea mrimii gruprii determinante de specificitate i indirect, a situsului de combinare a anticorpilor specifici; - rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietilor de imunogenitate; - rolul configuraiei spaiale a moleculei n conferirea proprietii de imunogenitate; - identificarea epitopilor secveniali i conformaionali.

IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII)

Existena anticorpilor a fost demonstrat de Behring i Kitasato (1890), n serul animalelor imunizate experimental cu toxina tetanic. Serul lor neutralizeaz toxina in vitro i o face inofensiv pentru animalele de experien. Autorii au folosit denumirea de anticorp pentru a desemna substanele protectoare ce apar n ser, cu specificitate fa de un antigen corpuscular (bacterii). Heidelberger (1930) a purificat anticorpii din ser i a evideniat c aparin fraciei proteice. Tiselius i Kabat (1938) au demonstrat experimental c, de cele mai multe ori, funcia de anticorp este asociat cu fracia gama a proteinelor serice i le-au dat denumirea de gamaglobuline. n 1970, prin consens ntre specialiti, OMS a stabilit ca substanele cu proprieti de anticorp, s fie grupate n categoria imunoglobulinelor, pornind de la faptul c toate substanele din acest grup au funcie imunitar i sunt cuprinse n fracia globulinic a serului. Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Exist i alte globuline cu funcie de anticorp, dup cum exist i gamaglobuline care nu au activitate de anticorp (de exemplu, proteinele patologice Bence-Jones). Fig.10. Mobilitatea electroforetic a imunoglobulinelor serice. IgG are cea mai heterogen sarcin electric i migreaz n regiunile gama i beta. IgE are are mobilitate similar cu a IgD, dar nu poate fi identificat pe electroforegram datorit nivelului seric sczut.

Anticorpii sunt imunoglobuline care se sintetizeaz n organism dup ptrunderea unui antigen i au proprietatea de a se cupla specific cu antigenul inductor i de a-i anihila aciunea nociv. Termenul de anticorp n accepiunea sa actual, a fost folosit de Ehrlich (1891) n lucrarea Studii experimentale asupra imunitii.

Anticorpii formeaz 20% din totalul proteinelor plasmatice, dar se gsesc i n lichidele extravasculare, n secreiile exocrine (saliv, lapte, lacrimi) i ca molecule receptor de antigen pe suprafaa limfo-citelor B. Moleculele de anticorpi au cea mai mic mobilitate electroforetic. Dei sunt asemntoare ca structur, moleculele de imunoglobuline formeaz o familie de o diversitate imens, nentlnit la nici o alt protein. Diversitatea lor uria este ordonat n clase i subclase, n primul rnd pe baza compoziiei n aminoacizi. Heterogenitatea compoziiei n aminoacizi se reflect n sarcina lor electric, foarte diferit. La electroforez, celelalte proteine serice migreaz ca o band compact, cu o mobilitate caracteristic, deoarece moleculele lor sunt omogene n ceea ce privete sarcina electric, la un pH dat. Imunoglobulinele migreaz ca o band larg, fiind heterogene, nu numai prin secvena aminoacizilor, ci i prin sarcina electric. Structura moleculei de imunoglobulin Structura moleculei de imunoglobulin (Ig) s-a stabilit prin analiza proteinelor omogene secretate de plasmocitoame, cu metodologii complexe: biochimice, analitice, cristalografia prin difracie cu raze X. Unitatea structural de baz a moleculei de Ig este monomerul. Acesta este o unitate tetrapeptidic, format prin asocierea a dou lanuri grele (H, Heavy = greu), fiecare avnd circa 450 de aminoacizi i o greutate molecular cuprins ntre 50-76 kD i dou lanuri uoare (L, Light = uor), fiecare avnd circa 216 aminoacizi i o greutate molecular de 25 kD. Cele 4 catene polipeptidice sunt legate ntre ele prin puni S-S i se rsucesc n spiral - att unul fa de altul, dar i fiecare separat fa de propria-i ax, rezultnd o configuraie tridimensional, stabilizat prin 16-24 legturi S-S i prin alte interaciuni necovalente. Monomerul tetrapeptidic tridimensional are form de T sau de Y. n funcie de secvena aminoacizilor, fiecare lan polipeptidic este alctuit din dou regiuni distincte: a) regiunea constant (C ) corespunde jumtii C-terminale a celor 4 catene polipeptidice. Are o secven relativ uniform a aminoacizilor i asigur unitatea structural i funcional a moleculei de Ig; b) regiunea variabil (V) cuprinde o secven de circa 110 aminoacizi n jumtatea Nterminal a celor 4 catene polipeptidice. Mrimea sa nu este fix, deoarece intervin inserii sau deleii de 3-6 aminoacizi. Regiunile variabile ale fiecrei perechi de catene formeaz situsul de combinare al moleculei de Ig, care confer specificitate de legare cu antigenul. Variabilitatea maxim a secvenei de aminoacizi a catenei L se concentreaz n poziiile 24-34, 50-55, 89-97, iar a catenei H, la secvenele 30-36, 50-56, 86-91 i 95-100. Aceste secvene formeaz regiunile hipervariabile sau regiunile determinante de complementaritate (RDC), fa de configuraia spaial a epitopului. Aminoacizii acestor secvene intr n alctuirea situsului de combinare al moleculei de Ig. Secvenele relativ invariante se numesc regiuni cadru (RC) i formeaz 80-85% din regiunea variabil a moleculei de Ig. Variaia secvenei aminoacizilor la nivelul regiunilor cadru este limitat la 5%. Secvena regiunilor cadru i a celor determinante de complementaritate alterneaz astfel: RC1, RDC1, RC2, RDC2, RC3, RDC3, RC4, RDC4.

Aproape de jumtatea catenelor H se gsete o secven de circa 15 aminoacizi, n care sunt grupate toate resturile de cistein ce formeaz puni S-S intercatenare. Aceast secven se numete regiunea balama. Este sensibil la aciunea proteazelor fiind clivat de papain, pepsin etc. La IgM i IgE, regiunea balama lipsete, dar cea omolog balamalei este clivat de proteaze. Regiunea balama asigur flexibilitatea moleculei de Ig, permind mobilitatea fragmentelor Fab, care, teoretic, pot forma unghiuri variabile, ntre 0-180o, conferind moleculei o geometrie variabil. Cele 16-24 legturi S-S ale monomerului tetrapeptidic sunt constante ca numr i localizare pentru diferitele clase de Ig. Se disting 3 categorii de puni S-S: - legturi intercatenare H-H sau L-H, ale unui monomer. Legturile L-L s-au descris la IgA2 i la proteinele Bence-Jones, care sunt dimeri de lanuri L; - legturi intracatenare, care determin structura teriar a fiecrui lan polipeptidic. - legturi intercatenare, ntre lanurile H ce aparin unor monomeri diferii, la IgA 2 i IgM, care formeaz complexe moleculare polimerice: moleculei de Ig se formeaz prin plierea fiecreia din cele 4 catene polipeptidice i prin rsucirea lor n spiral. Domeniile sunt regiuni globulare ale moleculei, legate ntre ele prin secvene lineare scurte. Domeniile se pliaz ntr-o conformaie stabil, conferit de secvena proprie de aminoacizi. Comparativ cu secvenele lineare, domeniile pliate sunt mai rezistente la proteoliz. Catena L are dou domenii: unul corespunztor regiunii variabile (VL) i altul corespunztor regiunii constante (CL). Catena H are 4 domenii: unul corespunztor regiunii variabile (VH) i trei domenii ale regiunii constante: CH1, CH2, CH3. Fig. 11. a. Reprezentarea schematic a structurii primare a moleculei de imunoglobulin. Fig. 11. b. Localizarea diferitelor funcii ale moleculei de anticorp. Fiecare caten H a moleculelor de IgM i IgE are 5 domenii: unul n regiunea variabil (VH) i 4 n regiunea constant (CH1 CH4). Secvena de legtur ntre regiunea constant (CH 1) i cea variabil a fiecrei catene se numete zon de comutare (s = switch). Fiecare domeniu are o form cilindric sau globular, cuprinde o secven de circa 60 de aminoacizi i este stabilizat prin interaciuni necovalente de tip trans, cu domeniul omolog din lanul opus i de tip cis, cu domeniul vecin al aceleiai catene. Domeniile fiecrui lan, mpreun cu cele omologe ale lanului opus, formeaz uniti funcionale denumite module. Cooperarea lor funcional este ilustrat de faptul c domeniile VL i VH separate, au o capacitate foarte limitat de legare a antigenului, n timp ce forma lor asociat (care constituie situsul de legare al moleculei) este foarte eficient n legarea antigenului.

Fig. 12. Reprezentarea schematic a domeniilor pliate i stabilizate ale moleculei de IgG. Moleculele de imunoglobuline exist sub dou forme: secretate, ca anticorpi n umorile organismului i legate de membrana limfocitelor B, ndeplinind funcia de receptori de antigen. Forma legat prezint o secven hidrofob la captul C-terminal, de circa 30 de aminoacizi, care strbate membrana i se ancoreaz n structura ei. Metodele de clivare i de denaturare chimic a moleculei de imunoglobulin au contribuit la nelegerea structurii i funciei sale. Clivarea s-a realizat cu enzime proteolitice (papain, pepsin, tripsin) sau prin cianoliz cu BrCN. Fig. 13. Clivajul enzimatic al moleculei de IgG1 umane. Pepsina cliveaz catena H i elibereaz fragmentele F(ab)2 i regiunea Fc (segmentul cristalizabil). Hidroliza prelungit taie fragmentul Fc n peptide scurte. Papaina cliveaz molecula n regiunea balama (la restul 224) i elibereaz dou fragmente Fab i un fragment Fc (dup Roitt, 1984). Papaina scindeaz mo-lecula de imunoglobulin la nivelul regiunii balama (aminoacidul 224) i elibe-reaz dou fragmente Fab (Fragment antigen binding) i fragmentul Fc (cristalizabil). Fiecare fragment Fab (50 kD) conine un lan L ntreg i jumtatea N-terminal a lanului H, notat cu Fd (difficult), care cuprinde domeniile VH i CH 1. Frag-mentul Fab poate fi scindat transversal i rezult frag-mentul Fv (variabil) format din domeniile VL i VH, se-parat de domeniile CL i CH1. Fragmentul Fc (50 kD) este format din jumtile C-terminale ale celor dou catene H, unite printr-o legtur S-S i prin legturi necovalente. Pepsina cliveaz lan-urile H sub regiunea balama i elibereaz fragmentul Fc , mai mic dect fragmentul Fc papainic i dou fragmente Fab legate ntre ele (Fab)2, prin puni S-S intercatenare. BrCN scindeaz lanurile polipeptidice la nivelul secvenelor cu Met, pe care o transform n homoserin. Fragmentele rezultate sunt heterogene ca mrime, n funcie de frecvena metioninei. Polipeptidele rezultate prin clivare enzimatic, ct i prin cianoliz, se separ prin tehnici cromatografice. Denaturarea moleculei de imunoglobulin prin reducerea legturilor S-S. Agenii reductori (mercaptoetanolul, mercaptoetanolamina, ditiotreitolul) au o grupare SH liber i reduc legturile S-S intercatenare i intracatenare. HO CH2 CH2 SH (Mercaptoetanolul) Legturile intercatenare (H-H sau H-L) sunt reduse mai uor, iar cele intracatenare, care stabilizeaz buclele domeniilor moleculei de imunoglobulin, sunt disociate mai greu. Reducerea legturilor S-S este reversibil. Dup ndeprtarea agentului denaturant, renaturarea este rapid i complet. Din acest motiv, agenii denaturani se ncorporeaz n sistemul supus denaturrii. Denaturarea se poate stabiliza prin diferite metode chimice.

Funciile moleculei de imunoglobulin n ansamblul efectorilor sistemului imunitar, moleculele de imunoglo-bulin ndeplinesc dou categorii de funcii: - funcii de specificitate - funcii grupate sub denumirea de activiti biologice efectoare Specificitatea imunoglobulinei fa de un antigen este exprimat prin capacitatea de recunoatere fin a epitopului complementar al antigenului i de combinare cu acesta. Specificitatea moleculei de imunogobulin este conferit de situsul su de combinare. Marea diversitate a moleculelor de anticorpi, asigur o diversitate uria a situsurilor de combinare, de ordinul a 108 109 specificiti de legare. Specificitatea de legare este dat de structura spaial a situsului de combinare cu antigenul, conferit de resturile de aminoacizi ale regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L. Aminoacizii care formeaz situsul de combinare al moleculei de imunoglobulin, prin plierea regiunilor hipervariabile, delimiteaz o cavitate molecular ce difer ca form i mrime. Cavitatea prezint substructuri (proeminene i depresiuni), pe care le formeaz secvenele hipervariabile, n timp ce restul regiunilor variabile ale celor dou catene confer structura tridimensional a cavitii moleculare. Potrivirea spaial dintre situsul de combinare al moleculei de anticorp i epitopul specific, din punctul de vedere al configuraiei spaiale, este perfect. Eventualele imperfeciuni geometrice pot fi ocupate de moleculele de ap. Potrivirea perfect a celor dou uniti combinante este sugerat de metafora cheie-broasc. Dup combinarea cu antigenul, modificrile spaiale ale situsului de combinare a anticorpului sunt minime, nedectabile. Epitopul antigenic are un rol important n potrivirea conformaional perfect cu situsul de combinare a anticorpului, deoarece corespunde unei regiuni moleculare cu factor de temperatur mai ridicat, ceea ce sugereaz o flexibilitate mai accentuat a secvenei moleculare respective. Flexibilitatea unui determinant antigenic i permite s se adapteze mai uor ntr-un situs de legare preexistent al moleculei de anticorp, chiar dac epitopul nu se potrivete exact geometriei situsului de combinare a anticorpului. Datorit flexibilitii epitopului, legarea antigenului cu anticorpul se aseamn cu ntlnirea a doi nori i nu cu aceea a dou pietre. Anticorpii specifici fa de secvenele peptidice mobile (calde) ale antigenului proteic, se leag cu afinitate mai mare de proteina nativ. Aceste rezultate sunt foarte importante din punct de vedere practic, pentru selectarea segmentelor peptidice n vederea obinerii vaccinurilor sintetice subunitare. Dimensiunile situsului de combinare s-au dedus indirect, prin determinarea mrimii haptenei care blocheaz reacia de combinare a anticorpilor cu antigenul nativ: oligozaharidul format din 6-8 uniti monomerice ocup complet situsul de combinare al moleculei de

anticorp. Oligozaharidele mai mici inhib parial reacia specific de precipitare. Pentru anticorpii specifici fa de antigene proteice, tetrapeptidele au blocat cu maxim eficien reacia de precipitare dintre anticorpi i antigenul nativ. Funciile biologice efectoare sunt amorsate de reacia antigen-anticorp. Numrul funciilor biologice efectoare este mai mic i sunt dependente de regiunile constante ale moleculei de imunoglobulin. Fiecare domeniu al regiunii constante a moleculei de imunoglobulin ndeplinete anumite funcii: - legarea antigenului pe imunoglobulinele de suprafa care funcioneaz ca receptori pe limfocitele B, declaneaz proliferarea i diferenierea lor, iar legarea antigenului cu imunoglobulinele citotrope pentru mastocite, declaneaz degranularea acestor celule; - dup cuplarea cu antigenul, moleculele de imunoglobulin expun fragmentul Fc, recunoscut ulterior de receptorii specifici pentru Fc de pe suprafaa monocitelor, macrofagelor, PMNN. Astfel se stimuleaz procesul de fagocitoz a celulelor nonself tapetate cu imunoglobuline, denumit imunofagocitoz; - celulele K, prin intermediul receptorilor pentru Fc, interacioneaz cu celulele nonself tapetate cu IgG i realizeaz liza de contact prin fenomenul de citotoxicitate; - interaciunea antigen-anticorp genereaz un semnal care se transmite regiunii Fc. Aceasta i modific configuraia spaial i expune un situs de recunoatere (pentru IgG situat ntre Glu 318 i Lys 322), de care se leag C1q; - regiunea balama este transductoare de semnale i are un rol important n flexibilitatea moleculei de imunoglobulin, permind variaia unghiului dintre fragmentele Fab: ele trec reversibil de la forma T la Y. Geometria variabil a moleculei de imunoglobulin mrete eficiena de legare a antigenului, deoarece ajusteaz poziia celor dou situsuri de combinare ale anticorpului, n funcie de distana la care se gsesc determinanii antigenici pe suprafaa unui antigen particulat (virus sau celul); - regiunea balama a moleculelor de IgG i IgD este sensibil la aciunea enzimelor proteolitice, iar a moleculei de IgA este rezistent. Componenta glucidic a imunoglobulinei ndeplinete urmtoarele funcii; - realizeaz i menine o conformaie a moleculei de imunoglobulin, esenial pentru secreie; - mrete solubilitatea moleculelor de imunoglobulin; - are rol de spaiator ntre domeniile unui lan i ntre catenele moleculei; - particip la funciile citotrope ale moleculei de imunoglobulin; - are rol n legarea C1q, component a sistemului complement. Heterogenitatea anticorpilor

Moleculele de imunoglobuline din plasma oricrui organism sunt foarte heterogene, att datorit diversitii epitopilor fa de care s-au sintetizat ceea ce induce variaii ale secvenelor hipervariabile ale moleculei, ct i datorit variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunile constante ale moleculei. Heterogenitatea anticorpilor este ordonat n clase, subclase, tipuri, alotipuri i idiotipuri, pe baza variaiei secvenei de aminoacizi. Moleculele de imunoglobuline au caliti duble: ele se comport nu numai ca molecule de recunoatere, care recunosc specific antigenul, dar la rndul lor sunt recunoscute ca antigene. Pentru sporirea gradului de imunogenitate, moleculele de imunoglobuline se asociaz cu adjuvantul Freund i se injecteaz la animale de experien. Variaiile de structur chimic a imunoglobulinelor se comport ca determinani antigenici i induc sinteza anticorpilor anti-imunoglobulin. Variaiile de ordin chimic ale imunoglobulinelor se evideniaz prin metode imunochimice de precipitare ntre moleculele de imunoglobulin cu rol de antigen i anticorpii anti-imunoglobulin din serul imun. Din punctul de vedere al manifestrii imunopotenei determinanilor antigenici ai imunoglobulinelor, s-au definit trei nivele de heterogenitate: izotipic, alotipic i idiotipic. Heterogenitatea izotipic Heterogenitatea izotipic (izos = acelai) definete variantele biochimice ale imunoglobulinelor, comune pentru toi indivizii unei specii. Variantele biochimice se datoreaz variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunea constant a catenei H. Ele se comport ca determinani antigenici dup injectarea n organismul altei specii. Pentru identificarea epitopilor izotipici ai moleculelor de imunoglobulin uman, acestea, n asociaie cu adjuvantul Freund, se injecteaz la iepure. Fiecare individ al unei specii exprim toate variantele antigenice izotipice caracteristice speciei. Variantele antigenice izotipice ale imunoglobulinelor umane s-au identificat iniial, n regiunea constant a catenei H. Exist 5 variante antigenice distincte ale catenelor H n regiunea constant, notate cu g, m, a, d, e, corespunztoare celor 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Serul imun fa de un determinant antigenic de clas nu d reacii ncruciate cu celelalte tipuri de determinani, deoarece catenele H ale diferitelor clase de imunoglobuline prezint diferene mari de ordin chimic ntre domeniile echivalente, care merg pn la circa 60% din totalul aminoacizilor. Determinanii antigenici ai unei clase de imunoglobuline sunt comuni tuturor indivizilor unei specii i se evideniaz n serul imun heterolog, obinut prin imunizarea organismelor altei specii. De exemplu, un antiser fa de lanul uman , obinut pe iepure, va precipita numai anticorpii clasei IgG din orice ser uman. Ulterior, determinanii antigenici s-au identificat i n regiunile constante ale catenelor L. Determinanii antigenici ai catenelor L determin tipurile de imunoglobuline. Catena L are dou variante antigenice, notate cu k i l, care se gsesc la toate cele 5 clase de imunoglobuline. Cele dou tipuri structurale de lanuri L (k i l) prezint deosebiri de secven a aminoacizilor n regiunea constant i nu au determinani antigenici comuni. De aceea, nu dau reacii imune ncruciate. Serul imun heterolog anti-molecule de imunoglobuline

umane cu caten Lk, obinut pe iepure, precipit toate moleculele de imunoglobuline umane care conin catena Lk, indiferent de clas. Serul imun anti-Lk nu precipit moleculele de imunoglobuline care conin catena L l. O molecul de imunoglobulin are dou catene de tip k sau l. Formula general a diferitelor clase de imunoglobuline este g2k2 (sau g 2 l 2), m2k2 (m2 l 2), a2k2 (a2 l 2). Catenele L de tip k i l determin tipurile moleculare de imunoglobuline. La om, raportul Ig k/ l este 7/3, iar la oarece este 19/1, valori care probabil reflect raportul numeric al genelor codificatoare pentru cele dou tipuri de catene. Izotipurile catenelor H nu influeneaz funcia de specificitate a moleculelor de imunoglobuline: acelai antigen poate fi legat de oricare din cele 5 clase de imunoglobuline. Pe lng variantele antigenice menionate clase i tipuri s-au identificat diferene mai subtile ale moleculelor de IgG i IgA, n ceea ce privete proprietile fizice, chimice i biologice, diferene care corespund subclaselor antigenice. Aceasta nseamn c, pe lng determinanii antigenici de clas, exist i alte variante antigenice ale regiunii constante ale catenei H, corespunztoare subclaselor. Ele se noteaz cu litera clasei, urmat de o cifr: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, respectiv IgA1, IgA2. Moleculele de imunoglobuline ale subclaselor au n comun determinanii antigenici proprii fiecrei subclase, aducnd un nivel superior de heterogenitate a catenelor H. Diferenele secvenei de aminoacizi ai catenei H, ntre diferite subclase sunt mici: 24 de aminoacizi ntre IgG1 i IgG4. Cea mai important deosebire const n numrul legturilor S-S intercatenare. Moleculele diferitelor subclase sunt sintetizate de celule diferite. Variantele alotipice Descoperirea alotipiei (alos = altul) a pornit de la urmtorul fapt de observaie: n serul pacienilor cu artrit cronic reumatoid se gsesc molecule de tip special, ncadrate n categoria factorilor reumatoizi (FR). Factorii reumatoizi sunt molecule de auto-anticorpi, adic IgM anti- IgG. Factorii reumatoizi se evideniaz in vitro, prin capacitatea lor de a determina aglutinarea eritrocitelor tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici antieritrocitari (IgG). Grubb (1956) a observat c FR seric, uneori, aglutineaz hematiile tapetate cu autoanticorpi specifici (care se sintetizeaz n anemia hemolitic autoimun) ale unor pacieni, iar alteori, reacia de hemaglutinare nu se produce, testul evidenierii FR in vitro fiind fals negativ. Concluzia reaciei de hemaglutinare pe care, uneori, FR din serul pacienilor de artrit reumatoid o produce asupra hematiilor tapetate cu o doz subaglutinant de anticorpi specifici, a fost urmtoarea: autoanticorpii de pe suprafaa eritrocitelor unor indivizi cu anemie hemolitic autoimun, posed determinani antigenici diferii, pe care FR poate s-i recunoasc. Astfel s-a dedus c moleculele de imunoglobulin de la indivizi diferii, sunt diferite din punct de vedere antigenic. n consecin, imunizarea unui individ cu imunoglobulinele provenite de la alt individ al aceleiai specii, determin sinteza anticorpilor fa de determinanii antigenici ai moleculelor imunoglobulinice ale donorului.

Imunoglobulinele sunt aloantigene ineficiente dac sunt injectate ca proteine solubile n organismul uman. De aceea, transfuziile de snge total, de plasm sau injectarea imunoglobulinelor solubile, de cele mai multe ori, nu induc sinteza anticorpilor antiimunoglobuline ale donorului. Moleculele de imunoglobuline devin antigenice dup asocierea lor cu adjuvantul Freund. Semnificaia variantelor antigenice alotipice ale moleculelor de imunoglobuline este analog celei a antigenelor de grup sanguin. Fenomenul este general, adic i alte molecule provenite de la un organism pot fi imunogene pentru alte organisme ale aceleiai specii, la care se comport ca aloantigene. Variantele alotipice ale imunoglobulinelor se detecteaz n reacia de precipitare cu aloantiseruri obinute pe organisme ale aceleiai specii, dar cu alotip diferit de acela al organismului donor al antigenului imunoglobulinic. Variantele moleculare alotipice sunt consecina existenei genelor alele perechi (aa), o caracteristic general a organismelor diploide. Prin mutaii succesive, n acelai locus, apar mai multe alele care formeaz o serie polialelic - a 1, a2, a3 an. Genele alele ocup acelai locus pe cromosomii omologi, ca i gena de tip slbatic a. Fiecare individ va avea o combinaie de gene alele: aa1, aa2 .. aan sau a1a2, a1a3 a1an, cu variante antigenice distincte. Alotipurile imunoglobulinelor sunt rezultatul variaiilor secvenei aminoacizilor n regiunile constante ale catenelor H i L, ceea ce le confer un grad superior de heterogenitate, consecin a alelelor codominante la acelai locus. Pentru moleculele imunoglobulinice umane s-au descris trei categorii de markeri alotipici: - factorii Gm (gama marker), numerotai de la 1 la 25, pe catena H a subclaselor de IgG. De exemplu, markerul G1m(a) pe moleculele de IgG1 are secvena Asp-Glu-Leu-Thr-Lys, iar moleculele altor indivizi au secvena Glu-Glu-Met-Thr-Lys, adic doi aminoacizi diferii. Pentru IgG3 sau descris 14 alele; - factorii A2m(1) i A2m(2), identificai pe catenele H ale subclasei IgA2; - factorii Km(Inv), pe catenele Lk, n numr de trei; - dou variante alelice pentru IgE. Foarte rar, determinanii antigenici alotipici sunt localizai n domeniile variabile ale moleculei. Ca i n alte sisteme alelice, indivizii pot fi homozigoi sau heterozigoi pentru genele care codific markerii. Genele se exprim codominant i se transmit n descenden dup mecanismul mendelian. De exemplu, alotipurile b4b5 pe catenele L ale imunoglobulinelor de iepure se exprim astfel: un organism homozigot b4b4 sau b5b5 exprim alotipul b4, respectiv b5. Dar genotipul b4b5 rezultat n descendena lor exprim markerul b4 pe o fracie a moleculelor i markerul b5, pe restul moleculelor de imunoglobuline. Variantele idiotipice Idiotipul (idios = individual) este reprezentat de o populaie omogen de molecule de anticorpi, sintetizate de descendenii unei clone celulare, care recunosc i se combin cu un singur determinant antigenic (epitop). Specificitatea idiotipic a unei populaii de anticorpi s-a dedus pe cale experimental:

- antigenul (celule de S. typhi) s-a injectat la organismele A i B (iepuri), identice din punct de vedere genetic. Se sintetizeaz anticorpi aglutinani anti S. typhi; - anticorpii aglutinani 1(produi de organismul A) s-au injectat la organismul C (iepure din aceiai linie genetic). Se sintetizeaz anticorpi anti-anticorpi 1, evideniai n reacia de precipitare. Surprinztor, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii 2, dei anticorpii 1 i anticorpii 2 au aceiai specificitate fa de antigenele S. typhi, iar organismele A, B, C aparin aceluiai alotip. Concluzia este c anticorpii 1 i anticorpii 2, dei au aceiai specificitate fa de antigenul de S. typhi, la rndul lor, au determinani antigenici proprii. De aceea, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipit anticorpii 2, sintetizai de un alt organism. Moleculele de anticorpi cu aceiai specificitate de combinare fa de un antigen, sintetizate de organisme identice genetic, au o individualitate antigenic distinct, denumit specificitate idiotipic. Heterogenitatea idiotipic este consecina determinanilor idiotipici, localizai n regiunile hipervariabile ale catenelor H i L. Specificitatea idiotipic a moleculelor de anticorpi sintetizai de o clon de celule este conferit de unicitatea secvenei de aminoacizi de la nivelul secvenelor hipervariabile ce particip la formarea situsurilor de combinare, care determin epitopi cu caracter strict individual denumii idiotopi. Unii idiotopi sunt localizai chiar n interiorul situsului de combinare sau n imediata sa vecintate. Dovada o constituie faptul c legarea epitopului specific de situsul de combinare a anticorpului, blocheaz ntr-o msur mai mare sau mai mic, legarea anticorpilor anti-idiotipici. Fig. 14. Ilustrarea diagramatic a heterogenitii anticorpilor. Colecia de idiotopi ai situsului de combinare a unei molecule de imunoglobuline formeaz idiotipul ei. Idiotipul este rezultatul configuraiei spaiale unice a regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L, conferit de o secven unic a aminoacizilor. Repertoriul idiotipurilor este de acelai ordin de mrime cu acela al specificitii situsurilor de com-binare. Pentru situsul de combinare al moleculei de imunoglobulin s-a pro-pus denumirea de paratop. La alctuirea idiotipului particip ambele catene. Cele dou catene disociate nu pot s lege anti-idiotipul sau l leag cu o eficien foarte sczut.
SISTEMUL IMUNITAR

Existena tuturor organismelor vii este condiionat de activitatea unor mecanisme de rezisten i de imunitate, capabile s protejeze individualitatea lor chimic, prin mecanisme de recunoatere i difereniere a substanelor proprii (self) de cele strine (nonself). In mod normal, aceste mecanisme sunt perfect tolerante fa de moleculele self, dar se activeaz i reacioneaz mai mult sau mai puin viguros pentru a ndeprta, a neutraliza sau a distruge substanele nonself. Mecanismele de rezisten i imunitate sunt prezente pe toat scara evolutiv a organismelor, ncepnd cu bacteriile i se complexeaz n evoluie.

Celulele bacteriene posed mecanisme de protecie a individualitii genetice, reprezentate de: - fenomenele de restricie mediate de prezena unor sisteme enzimatice specifice (enzime de restricie), care recunosc moleculele strine de ADN, le cliveaz la nivelul unor situsuri specifice, rezultnd fragmente mai mici, sensibile la aciunea exo- i endonucleazelor; - fenomenele de reparaie genetic dependente de activitatea unor sisteme enzimatice care recunosc modificrile ADN induse de mutaii sau de lipsa de fidelitate a mecanismelor de replicare, transcriere i traducere genetic, corectndu-le fie complet (sistemele error free) sau minimaliznd erorile n cazul sistemelor reparatorii predispuse la erori (error prone systems). La plantele superioare, mijloacele de aprare specific, aparent sunt absente, dar exist o gam larg de modaliti de aprare nespecific: - continuitatea i integritatea esuturilor epidermice, acoperite sau impregnate cu substane impermeabile pentru virusuri i microorganisme; - rezistena fiziologic conferit de coninutul nalt de zaharuri reductoare, prezena taninurilor, a diferiilor acizi organici, a pseudoanticorpilor cu activitate hemaglutinant n sucurile vegetale. La protozoare, procesele de recunoatere asigur selecia hranei, identificarea partenerilor pentru conjugare la parameci, iar la cele parazite, procesele de recunoatere mediaz interaciunea cu gazda.

MECANISME DE APRARE LA NEVERTEBRATE

Dei nu au sistem limfoid, nevertebratele recunosc i rspund la substanele nonself, la fel de eficient ca i vertebratele. La ele funcioneaz o diversitate de mecanisme, unele fiind inductibile. Rspunsul este de scurt durat i nu are specificitate fa de agentul infecios patogen. Rspunsul imun al nevertebratelor se aseamn calitativ cu cel nscut al vertebratelor mediat de celulele fagocitare i de moleculele neimunoglobulinice. La nevertebrate, aprarea organismului este asigurat de bariere fizico-chimice complexe: secreia mucoas care acoper corpul celenteratelor, anelidelor, molutelor i protocordatelor, omoar potenialii patogeni. Exoscheletul dur al celenteratelor, molutelor, artropodelor, echinodermelor i protocordatelor, formeaz o barier protectoare eficace fa de agenii infecioi. Majoritatea nevertebratelor superioare au sistem circulator cu celule albe, denumite hemocite sau celomocite, n funcie de natura cavitii corpului. Lipsesc hematiile. n mediul intern al nevertebratelor se gsesc fagocite, factori antimicrobieni constitutivi i inductibili cu efect neutralizant i litic, factori de coagulare a macromoleculelor strine. Toate nevertebratele, chiar cele care nu au caviti ale corpului (spongieri, anemone, viermi lai), au fagocite, uneori de mai multe tipuri. Ca i la vertebrate, fagocitele sunt efectorii rspunsului inflamator, sintetizeaz enzime lizosomale i posed mecanisme citocide dependente de superoxid.

Reaciile de aprare (repararea tisular, fagocitoza, reacia de ncapsulare)sunt mediate de fagocite i de celulele hemostatice. Ingestia microorganismelor invadatoare este rezultatul aciunii fagocitelor, iar un numr mare de microorganisme i de metazoare parazite este ncapsulat de celulele hemostatice i de tip fagocitar. Endoparazitul care ptrunde n organismul nevertebratelor este fagocitat, sau dac are dimensiuni prea mari, este ncapsulat. Incapsularea este rezultatul unei fagocitoze fruste. Adeseori, endoparazitul ncapsulat, este omort sub aciunea intermediarilor toxici ai unei cascade enzimatice.

La nevertebrate lipsesc limfocitele i moleculele de imunoglobuline, dar acestea sunt compensate de o varietate de factori umorali de aprare: aglutinine, lizozim, bactericidine, enzime lizosomale, factori de imobilizare. La insecte s-au detectat peste 15 tipuri de proteine antibacteriene inductibile n cteva ore dup injectarea unui antigen.
Nevertebratele nu au proteinele cascadei complementare, dar viermii, insectele, crustaceii conin sistemul profenoloxidazei. Componentele acestui sistem sunt activate de o serie de enzime. La captul cascadei de activare se formeaz enzima activ fenoloxidaza, cu rol esenial n ndeprtarea substanelor nonself. Fig.26. Un mecanism posibil de activare a profenoloxidazei la fenoloxidaz, la artropode. Activarea este stimulat de leziunile tisulare, de infecia cu microorganisme, de schimbri ale concentraiei ionilor de Ca2+ i ale valorii pH, care pot duce la coagularea plasmei i generarea factorilor care mediaz evenimentele ulterioare ale imunitii (dup Roitt, 1997).

Fagocitoza este foarte activ i este stimulat de aglutininele i bactericidinele cu rol de opsonine. Din punct de vedere funcional, aglutininele i bactericidinele sunt similare anticorpilor. Acestea sunt lectine, cu rolul de a lega componenta glucidic a glicoproteinelor de pe suprafaa celulelor nonself, rezultatul fiind aglutinarea. Lectinele sunt molecule care au aprut timpuriu n evoluie i sunt ubicvitare: se gsesc la bacterii, plante, nevertebrate i vertebrate. Ele tapeteaz microorganismele invadatoare i au rolul de a le imobiliza, dar au i rol opsonizant, uurnd fagocitoza. In funcie de specificitatea lor de legare cu glucidele, lectinele sunt foarte diferite. n corpul gras al insectelor superioare s-au caracterizat circa 100 de peptide antimicrobiene, a cror sintez rapid este indus de infecie. Din punct de vedere structural sunt de dou tipuri: - peptide ciclice, care conin puni S-S (de exemplu, drosmycina), active fa de bacteriile Gram pozitive i fa de fungi; - peptide lineare (cecropine bogate n Gly i Pro), active fa de bacteriile Gram negative. Componentele celulare i humorale cu funcii protectoare mediaz reacii aprare nespecifice (nscute), fr rspuns accelerat la stimularea antigenic secundar. de

ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUNITAR LA VERTEBRATE

La vertebrate, aprarea este asigurat de mecanisme complicate celulare i humorale, de rezisten i imunitate. Funcia esenial a sistemelor de aprare este protecia fa de agenii patogeni invadatori. Interaciunea permanent cu microorganismele are un rol hotrtor n dobndirea complexitii structurale i funcionale a sistemului imunitar. Dovada o constituie faptul c la animalele germ-free (axenice), numrul limfocitelor B i titrul anticorpilor serici naturali sunt de 5-10 ori mai mici dect la organismele convenionale. Evoluia a generat tipuri celulare specializate, tot mai eficiente funcional, care neutralizeaz, sechestreaz, omoar sau ndeprteaz agenii infecioi. La vertebrate, reaciile de aprare sunt rezultatul aciunii unor factori humorali nespecifici (complement, substane bactericide) i specifici (anticorpi) i a unor populaii de celule specializate, cu aciune nespecific (fagocite) sau specific (limfocite). Din punct de vedere structural, n concepia modern, sistemul imunitar al organismelor superioare este considerat ca un organ difuz sui-generis, alctuit dintr-un numr foarte mare de molecule i celule, reunite ntr-o reea de interaciuni complexe, a crei funcie este asigurarea integritii i individualitii structurale a organismului. n concepia restrictiv a lui N.K. Jerne, sistemul imunitar este reprezentat n exclusivitate de limfocite, iar ntr-o accepiune mai larg, pe lng limfocite, n alctuirea sistemului imunitar intr o serie de celule accesorii cu rol esenial n declanarea rspunsului imun: macrofagele i o serie de celule nrudite(celulele Lagerhans din tegument, celulele dendritice i cele interdigitate). Se apreciaz c numrul limfocitelor, la adultul normal, este de 10 12, iar al moleculelor de imunoglobuline, de ordinul a 1020. Impreun, aceste componente formeaz organul difuz, cu greutatea de circa 910 g (1-2% din greutatea corpului), a crui existen este adeseori ignorat, datorit caracterului sau difuz, n tot organismul. Celulele i moleculele sistemului imunitar sunt prezente n toate esuturile, dar n unele organe (splin, ganglioni limfatici, plci Peyer, amigdale, timus), componentele celulare au o densitate maxim. Sistemul imunitar este unul din cele mai complexe ale organismului. Complexitatea lui deriv din structura de reea complicat de comunicaii intercelulare, din ubicvitatea sa n organism i din efectele multiple pe care le determin un numr mic de categorii celulare. Sistemul imunitar este considerat un adevrat creier mobil. Din punct de vedere structural i funcional, sistemul de aprare al organismelor superioare prezint numeroase dualiti: existena unui compartiment al rezistenei nespecifice i neadaptative (nscut) i a unui compartiment cu aciune specific i adaptativ (sistemul imunitar); - prezena a dou populaii nclinate de limfocite (T i B), care mediaz imunitatea celular i respectiv humoral;

- activitatea limfocitelor este modulat fie stimulator, fie inhibitor, sub aciunea unor celule i a unor factori humorali; - existena organelor limfoide centrale (primare) i periferice (secundare); - existena unui rspuns imun primar i a unui rspuns imun secundar; - dualitatea structural (dou perechi de catene polipeptidice) i funcional (bivalena) a moleculei de anticorp; comportamentul dublu al moleculei de anticorp: molecula de corp recunoate epitopul specific i la rndul ei este recunoscut de molecule cu rol receptor. anti-

Numrul celulelor sistemului imunitar (cu un ordin de mrime superior neuronilor) i al moleculelor sale nu reflect fidel potenialul de aprare a organismului, deoarece n cursul rspunsului imun are loc proliferarea i amplificarea numeric a limfocitelor, precum i a potenialului de biosintez. La aceasta se adaug o rat nalt de renoire i refacere a rezervelor sale celulare. La om se produc zilnic un miliard de limfocite ce trec n circulaie. Circulnd i recirculnd prin reeaua vaselor sanguine i limfatice, celulele i moleculele sistemului imunitar asigur supravegherea organismului, recunoaterea moleculelor i a celulelor nonself, pentru a le elimina.

Limfocitele
Sistemul imunitar este reprezentat de esuturi derivate din mezoderm, a cror principal component celular este limfocitul. De aici deriv denumirea de sistem limfoid. In ultimul timp se folosete denumirea de limfon, care semnific totalitatea organelor limfoide primare i secundare, precum i celulele componente cu funcia de a recunoate antigenul. Limfocitele sunt celule care n cursul elaborrii rspunsului imun, recunosc specific antigenul i de aceea se mai numesc imunocite. De aici deriv denumirea de sistem imunocitar, echivalent celei de sistem limfoid. Toate celulele acestui sistem poart pe suprafaa lor, molecule cu rol receptor, capabile s recunoasc specific determinanii antigenici strini. Sistemul imunitar funcioneaz pe baza interaciunii dintre semnal (antigen) i receptorul specific limfocitar preformat. n concepia modern, limfocitul este celula central a sistemului imunitar. Ea nu este celula cap de serie aa cum o considerau vechii histologi, ci prezint o extraordinar capacitate de reactivitate i difereniere. Numrul limfocitelor. Copiii au un numr mai mare de limfocite i de aceea vrsta trebuie considerat ca un parametru fiziologic de variaie, n evaluarea numeric a acestor celule. Ele reprezint 25-33% din totalul leucocitelor, adic circa 2100 celule/mm3 de snge. Valori mai mici de 1500 limfocite/mm 3 semnific starea de limfocitopenie i cel mai adesea semnific un deficit numeric al limfocitelor T. Pn n anii 50, limfocitele erau distinse numai dup dimensiuni: mari, mijlocii i mici. Cele mai multe limfocite circulante au dimensiuni mici: 7-10 m diametru. La microscopul optic, pe frotiul

colorat May Grunwald Giemsa, limfocitele se disting de celelalte dup dimensiuni, sunt agranulare i au cel mai mare raport nucleocitoplasmatic. Limfocitele mari au un raport nucleocitoplasmatic mai mic i n citoplasm se gsesc granulaii azurofile. Se numesc limfocite granulare mari (LGL). In vitro, limfocitele sunt neaderente i nu fagociteaz. Astzi, Imunologia are la baz conceptul unei heterogeniti funcionale nelimitate a limfocitelor, care deriv din diversitatea specificitii receptorilor suprafeei lor. Populaia de limfocite care are receptori identici de antigen i recunoate un singur epitop (sau civa nrudii) formeaz o clon. Toate celulele unei clone sunt descendente ale unei singure celulemam. In consecin, n organism sunt tot attea clone de limfocite, cte tipuri de determinani antigenici exist (teoretic) n natur. Corespondena complementaritii spaiale dintre receptorii limfocitari de antigene i epitopii antigenici asigur posibilitatea elaborrii unui rspuns imun specific, dup contactul limfocitelor cu oricare dintre epitopi. Caracterizarea funcional a limfocitelor este rezultatul cercetrilor ntreprinse dup anul 1960. n raport cu organul limfoid primar n care se produce diferenierea i maturarea, Roitt i col. (1966) au mprit limfocitele n dou categorii distincte; - limfocite T, care se difereniaz i se matureaz n timus; - limfocite B, care se difereniaz i se matureaz n bursa lui Fabricius la psri i n echivalenii ei funcionali, la mamifere. n funcie de capacitatea lor de a interaciona cu antigenul specific, limfocitele sunt: - incompetente (imature), cele care nu recunosc antigenul; - competente (mature), cele care recunosc antigenul specific. Starea de competen este condiionat de prezena receptorilor prin intermediul crora antigenele sunt recunoscute. Pe suprafaa unei celule pot fi pn la 100 000 de molecule receptoare identice, care ateapt ntlnirea cu substanele nonself corespunztoare. Dup ce limfocitul i-a dobndit competena n unul din organele limfoide primare, poate s rmn n repaus, dac organismul nu a recepionat mesajul antigenic corespunztor. Aceste limfocite sunt neangajate (neinformate sau naive). Cele care au venit n contact cu antigenul specific sunt limfocite angajate (informate). Ele constituie substratul material al memoriei imunologice i ori de cte ori se vor rentlni cu antigenul, vor produce un rspuns imun rapid i amplu. Dup durata vieii, limfocitele sunt: - cu via scurt (efectoare ale rspunsului imun); - cu via lung (de memorie). Ele recircul n organism perioade ndelungate (de ordinul anilor). La om, limfocitele de memorie ar supravieui circa 10 ani, fr s se divid. n raport cu funcia pe care o ndeplinesc, se disting urmtoarele categorii de limfocite: - efectoare, cele care direct sau indirect, prin molecule efectoare, neutralizeaz antigenul;

- reglatoare, cele care ralizeaz echilibrul optim al rspunsului imun.

Limfocitele B

Limfocitele B reprezint 5-15% din totalul limfocitelor circulante i constituie o diviziune funcional major a populaiei limfocitare. Impreun cu descendenii lor difereniai (limfoblastul, plasmocitul), limfocitele B sintetizeaz anticorpi, efectorii rspunsului imun mediat humoral (RIMH). Limfocitul B imunocompetent (matur, neangajat) sintetizeaz cantiti mici de molecule ale unui izotip de imunoglobuline, care rmn legate de membrana limfocitului, avnd rol de receptori de antigen, adevrate antene de detectare a antigenului specific. Sub aspectul specificitii de legare a antigenului, fiecare organism posed milioane de clone de limfocite B, adic mici populaii celulare identice, descendente din aceiai celul mam, care recunosc i leag acelai antigen i produc anticorpi cu aceiai configuraie spaial a situsului de combinare. Dup activare, toi descendenii limfocitului B sintetizeaz imunoglobuline i le secret ca anticorpi, cu aceiai specificitate de legare pe care a avut-o receptorul. Receptorul de antigen al limfocitelor B. Majoritatea limfocitelor B umane din sngele periferic exprim dou izotipuri de imunoglobuline pe suprafaa lor: IgM i IgD sau numai IgD. Situsurile de legare ale celor dou izotipuri sunt identice. Numai 10% dintre limfocitele B au pe suprafaa lor, ca receptor de antigen, molecule de IgG, IgA sau IgE. Cele care au ca receptor molecule de IgA, sunt localizate n esutul limfoid asociat mucoaselor. Moleculele receptoare de imunoglobulin sunt inclavate cu captul C-terminal n membran. Intre IgM legat de membran (IgMm), cu funcia de receptor de antigen i IgM seric (IgMs), sunt dou deosebiri majore: - IgMm conine o secven C-terminal hidrofob, prin care se ancoreaz n membrana limfocitelor mature neangajate, care nu au venit n contact cu antigenul; - IgMm este monomer, iar IgM seric este pentamer. Secvena C-terminal a IgMm cuprinde 25 de aminoacizi hidrofobi ce formeaz domeniul transmembranar, urmat de o secven cationic Lys-Val-Lys. Ca la toate proteinele ancorate n membran, acest domeniu formeaz un -helix, cu o lungime suficient pentru a strbate membrana. Fiind hidrofob, secvena de aminoacizi are interaciuni strnse cu lipidele membranei. Secvena cationic se extinde n citoplasm, mrind gradul de stabilitate a moleculei n membrana celular. Dup stimularea antigenic, sinteza se comut la IgM seric. Trecerea de la IgMm la IgMs este rezultatul unor diferene ale modului de prelucrare a ARN premesager. Copia de ARN premesager pentru sinteza catenei (H) are dou situsuri poteniale de clivare i ataare a resturilor de poli-A, ce marcheaz captul ARNm. Dup stimularea antigenic, din ARN premesager sunt clivate secvenele codificatoare ale domeniului C-terminal hidrofob i se sintetizeaz molecule de IgM fr secvena Cterminal de aminoacizi hidrofobi. Comutarea IgMm --- IgMs nu modific lanul L al moleculei. Cele dou forme ale IgM au domenii identice VH i VL, adic au aceiai specificitate de legare a antigenului (au acelai idiotip).

Limfocitul B are receptori membranari pentru substanele mitogene, pentru complement (C 3b), pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor, pentru insulin etc. Receptorul pentru C 3b funcioneaz i ca receptor pentru virusul Epstein-Barr. Limfocitele B neactivate au receptori de mic afinitate pentru IL2, dar dup stimularea antigenic, ele exprim rapid, receptori pentru IL-2 de nalt afinitate. Limfocitele B rspund la efectul stimulator al IL-2, prin proliferare rapid i secreia IgM. Pe suprafaa limfocitelor B se gsesc la densitate nalt, moleculele CMH II.
Limfocitele T

Limfocitele T reprezint pn la 80% din totalul limfocitelor circulante. Valorile normale n snge, pentru limfocitele T sunt cuprinse ntre 1620-4320/mm 3, ntre una i 18 luni de via i ntre 590-3090/mm3, dup 18 luni. Proporia limfocitelor T se poate determina prin metoda rozetelor cu hematii de berbec sau prin metoda imunofluorescenei cu anticorpi monoclonali fa de receptorul de antigen. Limfocitele T mature exprim markerul* CD4** sau CD8. Aceste molecule aparin suprafamiliei imunoglobulinelor. Celulele CD4 au de obicei funcie helper, iar cele ce exprim markerul CD8 sunt citotoxice. Limfocitele T ndeplinesc funcii complexe, att efectoare ale rspunsului imun mediat celular ct i reglatoare, prin intermediul unor factori humorali pe care-i secret, denumii limfochine. Limfocitele T realizeaz urmtoarele funcii: lizeaz celulele care exprim molecule nonself pe suprafaa lor; regleaz rspunsul imun; mediaz reaciile de hipersensibilitate ntrziat. Aceste funcii sunt rezultatul heterogenitii funcionale i se datoreaz activrii unor subpopulaii distincte de limfocite T: - limfocite Tc (Tcl, citotoxice sau citolitice) exprim pe suprafaa lor markerul T8 (CD8); - limfocite Th (helper) au pe suprafa markerul CD 4. Acestea sunt cele mai numeroase, reprezentnd 60-65% din numrul total de limfocite T ale organismului uman; - limfocite Ts (supresoare), purttoare ale markerului CD4; - limfocite TD sau TDH (delayed hypersensitivity) exprim markerul CD8. Funciile limfocitelor Th se realizeaz prin intermediul limfochinelor secretate. In funcie de limfochinele pe care le sintetizeaz, limfocitele Th se clasific n dou subseturi:Th-1 i Th-2. Celulele Th-1 (Th-c) secret IFN gama, IL-2 i TNF beta (citochine de tip 1, stimulatoare ale imunitii mediate celular). Citochinele de tip 1 produc urmtoarele efecte: stimuleaz reacia de citotoxicitate i inflamatorie asociat cu reaciile de hipersensibilitate ntrziat. In esen, limfocitele Th-1 au rol n edificarea unui rspuns imun mediar celular (RIMC).

Celulele Th-2 (Th-b) secret citochine de tip 2: IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10 (dar nu secret Il-2) i stimuleaz activitatea limfocitelor B de memorie. Citochinele tip 2 (IL-4, IL-5) stimuleaz rspunsul imun humoral fa de paraziii extracelulari (stimuleaz diferenierea limfocitelor B spre plasmocit) i instalarea strilor alergice prin capacitatea lor de a induce sinteza IgE i de a stimula mastocitele. In esen, limfocitele Th-2 sunt implicate n edificarea rspunsului imun mediat humoral (RIMH). Prin toate aceste efecte, limfocitele Th sunt amplificatoare ale rspunsului imun Limfocitele CD8 (T citototoxice) reprezint 25-35% dintre limfocitele T circulante. Funcia lor const n efectul litic prin contact celular direct asupra celulelor infectate cu virusuri, malignizate sau alogenice. Limfocitele TD sunt mediatoare ale reaciilor de hipersensibilitate ntrziat (delayed) de tip tuberculinic. Ele secret limfochine cu efecte locale asupra macrofagelor i limfocitelor din focarul inflamator. Limfocitele Ts sunt inhibitoare ale amplitudinii rspunsului imun, dup epuizarea antigenului. Ele au rolul de a diminua intensitatea RIMC i RIMH, meninnd n limite fiziologice intensitatea reaciilor imunitare. Se pare c i exercit rolul supresor asupra rspunsului imun, prin inhibarea activitii limfocitelor Th, dar au i efect supresor direct asupra limfocitelor T i B efectoare. Limfocitele Ts au rol important n inducerea strii de toleran fa de antigenele exogene, ca i fa de moleculele self. Deficienele funcionale ale limfocitelor Ts creeaz predispoziii pentru maladiile autoimune. Distincia funcional ntre limfocitele TCD 4 i TCD8 nu este totdeauna net. Unele clone de limfocite TCD4 au proprieti citotoxice, iar unele clone TCD 8, dup contactul cu antigenul, prolifereaz i secret limfochine, ca i limfocitele TCD4. Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT) Dei moleculele de anticorpi au fost printre primele a cror structur chimic s-a identificat, caracterizarea biochimic a receptorului de antigen al celulelor T s-a fcut foarte greu, deoarece nu a existat un echivalent celular T al tumorilor de mielom. Molecula cu rol de receptor de antigen a limfocitelor T s-a identificat recent, dup ce a fost posibil cultivarea liniilor de hibridom de celule T. Moleculele receptoare de antigen ale limfocitelor T au o larg variaie biochimic, corespunztoare specificitii de legare a spectrului foarte larg de antigene. Ca i n cazul anticorpilor, pentru receptorul de antigen al celulelor T, se folosete termenul de idiotip (Ti), pentru a desemna o molecul a RCT cu un set unic de epitopi asociai, derivai din configuraia sa spaial unic, complementar pentru legarea specific a unui epitop antigenic. Pentru izolarea i identificarea receptorului Ti s-au utilizat anticorpi monoclonali (AMC) anti- Ti, care precipit specific moleculele Ti dintr-un amestec complex de proteine membranare. Examinarea peptidelor n imunoprecipitatele diferitelor clone de celule T, prin metoda electroforezei n SDSpoliacrilamid, a evideniat c RCT este un heterodimer i const dintr-o glicoprotein de 80-90 kD, care n condiii reductoare se disociaz n dou peptide de 40 i respectiv 43 kD. Molecula ntreag const dintr-o pereche de lanuri peptidice, similare ca dimensiuni, legate prin puni S-S.

Lanul

Lanul

Fig. 27. Structura receptorului de antigen al limfocitului T. Molecula este un heterodimer format din lanurile i , care se extind prin membrana celular i au scurte poriuni citoplasmatice. Complexul T3 este alctuit din 4 subuniti proteice (, i 2 ), localizate i dublul strat lipidic i n citoplasm.

Cele dou peptide sunt distincte i s-au notat i . Lanul are 248 aminoacizi, cu punctul izoelectric la pH = 5,0-5,5. Lanul are 282 aminoacizi, iar punctul izoelectric este la pH 6,5-7,0. Fiecare caten are 4 domenii: unul variabil (V , respectiv V ), unul constant (C , respectiv C ), unul transmembranar i unul intracitoplasmatic. Astfel alctuit, molecula RCT face parte din suprafamilia moleculelor imunoglobulinice. Prin dimensiuni se aseamn cu lanul L al imunoglobulinelor: domeniul variabil al fiecrui lan are 110 aminoacizi, dar pentru c se ancoreaz n membran, se aseamn cu lanul H. Domeniile variabile ( i ) sunt extrem de variabile (ca i regiunile variabile ale celor dou catene ale imunoglobulinelor) i particip la formarea situsului de combinare al RCT. Situsul de combinare al RCT este alctuit din regiunile hipervariabile sau regiunile determinante de complementaritate RDC (3 ale catenei i 4 ale catenei ) i este aplatizat, adaptat funciei sale de a lega suprafaa aplatizat a moleculelor CMH. La om, RCT heterodimer este asociat cu molecula T 3, o grupare de trei peptide asociate necovalent. Funcia probabil a lui T3 este aceea de transductor al semnalului de activare, de la Ti la citoplasm, constituind, prin modificri conformaionale, un canal de trecere a ionilor de Ca 2+ prin membran, dup ce receptorul a legat epitopul specific. S-au identificat dou tipuri de RCT: Fig.28.a. Subseturi majore de celule T

Fig. 28.b. Subseturi funcionale de celule T CD4+ Subseturi de limfocite T, n funcie de tipul de RCT (RCT-2, RCT-2).

Limfocitele RCT-1 au un repertoriu restrns de interaciune cu antigenul, dar nu manifest fenomenul restriciei CMH. Limfocitele RCT-2 exprim CD4 sau CD8, care determin recunoaterea antigenului asociat cu moleculele CMH II sau CMH I. Limfocitele TCR-2+ CD4+ sunt divizate pe baza limfochinelor pe care le secret, n subseturi de celule Th1(stimulatoare ale IMC) i Th2 (stimulatoare ale IMH) (dup Roitt, 1997).

- RCT-2 este heterodimerul format din polipeptidele i , legate prin puni S-S, prezent pe suprafaa a circa 90% dintre limfocitele T; - RCT-1 este asemntor structural cu RCT-2, dar const din polipeptidele i , cu o alt specificitate antigenic, identificat prin intermediul anticorpilor monoclonali. Se gsete pe suprafaa a 0,5-15% dintre limfocitele T circulante umane, dar este mai frecvent pe limfocitele intraepiteliale ale mucoasei intestinale. Limfocitele T / exprim markerul CD3 i recunosc antigenul printr-un mecanism asemntor cu acela al limfocitelor T /, adic recunosc epitopii asociai cu moleculele CMH I i II, dar frecvent par s interacioneze cu molecule CMH neclasice, iar specificitatea interaciunii lor cu epitopii antigenici este limitat. Aceste limfocite pot s recunoasc antigene neconvenionale, ca de exemplu, proteinele de oc termic i antigenele nepeptidice (glucidice). n general, limfocitele cu RCT-1 ( /) sunt negative pentru markerul CD 4 i pentru CD8, dei unele exprim nivele sczute ale unuia dintre markeri. Unele studii sugereaz c aceste celule contribuie la rspunsul iniial al gazdei, la diferii ageni infecioi: virusuri, bacterii(n special micobacterii), parazii, dar i la rspunsul anti-tumoral. Ele par s constituie prima linie de aprare. Ipoteza este n acord cu localizarea lor anatomic, la poarta de intrare n organism, n esuturile nelimfoide (tegument, intestin), dar i n situsurile inflamatorii. Limfocitele T / se aglomereaz n focarele inflamatoare cronice(membrana sinovial, leziunile asociate cu lupusul eritematos diseminat). La rumegtoare, 30-80% din totalul limfocitelor T circulante au receptor /, valorile maxime nregistrndu-se la organismele nou-nscute. La alte specii, numrul acestor limfocite T este mic. Abundena lor numeric la rumegtoare este corelat, probabil, cu bacteriemia masiv care nsoete procesul digestiv. n esen, markerii RCT i CD3 sunt definitorii pentru limfocitele T. Limfocitele T au un marker distinctiv pe suprafaa lor, fa de limfocitele B: Thy 1 (CD 90). Acest marker poate fi exprimat i pe alte tipuri celulare i lipsete la o mic proporie a limfocitelor T.
Celulele NK

Celulele NK (natural killer) reprezint circa 15% din totalul limfocitelor sanguine. Ele deriv din mduva osoas i au origine comun (acelai progenitor), ca i celulele T. In vitro, sunt neaderente i nefagocitare, ceea ce le aseamn cu limfocitele. Din punct de vedere morfologic, celulele NK sunt mari, granulare (LGL, large granular lymphocytes), avnd citoplasm mai bogat dect celelalte limfocite, cu granulaii azurofile.

Celulele NK nu au nici unul din receptorii de antigen caracteristici limfocitelor T sau B i de aceea au fost denumite celule nule. Celulele NK au pe suprafaa lor unii markeri caracteristici limfocitelor: au receptor pentru Fc de mic afinitate, formeaz rozete E, au receptor de mic afinitate pentru IL-2, produc IL-2 i IFN . Au i receptori caracteristici seriei mieloide.

n dezvoltarea lor, celulele NK nu sunt dependente de timus.

Celulele NK au via scurt i reprezint o linie important, primordial n evoluie, cu rol esenial n mecanismele de aprare nscut a organismului: sunt active n respingerea grefelor i a celulelor modificate sub raport antigenic. Funcia celulelor NK este de a recunoate i de a liza anumite celule tumorale i celule infectate cu virusuri. Celulele NK au lizat celulele liniilor B limfoblastoide transformate de EBV, deficiente n molecule CMH I, dar nu au mai lizat aceste inte dup transfecia cu genele HLA-B sau HLA-C. Mecanismul recunoaterii celulelor purttoare de molecule nonself nu este cunoscut. Se admite c celulele NK recunosc moleculele CMH i se activeaz cnd receptorii lor nu ntlnesc moleculele CMH pe suprafaa celulelor int sau cnd moleculele CMH au o densitate mai mic dect cea normal. Efectul interaciunii este liza celulei int. Aciunea definitorie a celulelor NK este citotoxicitatea. Ele lizeaz fr restricie CMH, celulele tumorale sau pe cele infectate cu virusuri. Activitatea celulelor NK este foarte nalt la oarecele nud (fr timus) sau la oarecii timectomizai neonatal. Dup activare, celulele NK elibereaz IFN . Cel mai studiat receptor membranar al celulelor NK este receptorul de mic afinitate pentru Fc al IgG (CD16). O subpopulaie distinct a celulelor NK o reprezint celulele K (killer). Ele sunt tot LGL, dar spre deosebire de celulele NK, exprim receptorul de mare afinitate pentru Fc . Aciunea lor principal este citotoxicitatea mediat de anticorpi (ADCC), fa de celulele modificate antigenic. In vitro, limfocitele T din snge, sub aciunea stimulatoare a unor citochine (IL-2, IFN ) difereniaz o subpopulaie, care au fost denumite LAK (lymphokine activated killers). In vitro, prin adugarea IL-2 i a antigenului tumoral, devin citotoxice fa de celulele tumorale omologe.

* Markerii de suprafa ai limfocitelor T umane s-au identificat cu dificultate, datorit naturii outbred a populaiei. S-au notat cu literele TCD, urmate de o cifr, n ordinea descoperirii: TCD1, TCD2 etc. Anticorpii monoclonali au constituit instrumentul esenial de lucru. Cel mai cunoscut este markerul TCD4, deoarece funcioneaz ca receptor pentru HIV. Este un glicopeptid cu o regiune extracelular format din 4 domenii, un domeniu transmembranar i unul citoplasmatic, iar CD 8 este dimeric i prezint un domediu asemntor cu domeniul variabil al moleculei de imunoglobulin. ** CD (cluster designation) se refer la grupele (cluster) de anticorpi monoclonali utilizai pentru identificarea subpopulaiilor de limfocite. Fiecare grup de AMC are specificitate fa de un anumit marker celular.

ANTIGENELE COMPLEXULUI MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (C M H)

Existena antigenelor de histocompatibilitate a fost dedus din faptul c alogrefele tegumentare sau de organe, nu sunt viabile n organismul receptor. Dup 7-10 zile, esutul transplantat se inflameaz i curnd dup aceea, grefa este respins. Respingerea grefei este de natur imunitar: sistemul imunitar al receptorului de gref recunoate ca nonself, anumite molecule ale celulelor grefei i se activeaz. Moleculele de suprafa ale celulelor grefate, recunoscute ca nonself, sunt denumite antigene de histocompatibilitate. Ele confer individualitate biochimic fiecrui individ. Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca molecule ale suprafeei celulare i care, datorit diferenelor biochimice individuale sunt recunoscute de sistemul imunitar al unui organism cu un alotip diferit (cu o alt combinaie de gene alele la situsul codificator). Diversitatea biochimic la nivel individual a acestor molecule, st la baza unicitii biochimice a fiecrui individ uman i este determinat de o diversitate genetic corespunztoare. Deoarece se comport ca antigene majore n organismul receptor de gref, antigenele CMH se numesc i antigene de transplantare. n funcie de capacitatea lor de a stimula rspunsul imun de respingere a grefei, antigenele CMH sunt tari i slabe. Antigenele CMH tari reprezint principala barier n calea transplantului de esuturi i organe. La oarece, moleculele CMH tari aparin sistemului H-2. Grefele de esuturi i organe ntre organisme care difer prin antigenele complexului H-2 ale suprafeei celulare sunt invariabil respinse n 10-14 zile. Antigenele tari aparin claselor I i II. Antigenele slabe (uoare) sunt codificate de sistemul minor de histo-compatibilitate i determin respingerea lent a grefei de piele, n circa 200 de zile. La om, corespondentul sistemului molecular antigenic H-2 de la oarece este complexul antigenic al sistemului HLA (Human Leucocyte Antigen). Denumirea semnific faptul c moleculele sistemului au fost detectate iniial (J. Dausset, 1958), pe suprafaa leucocitelor. Antigenele complexelor H-2 i HLA au o varietate antigenic individual i de aceea natura lor chimic se poate studia numai n populaii genetic pure (inbred) de oarece, obinute prin mperecheri multiple ntre indivizii aceleiai descendene. Structura molecular a antigenelor CMH clasa I Antigenele codificate de genele CMH clasa I sunt glicoproteine de membran, a cror regiune C-terminal se gsete n citoplasm, iar cea N-terminal este expus extracelular.

O molecul CMH clasa I este alctuit dintr-un lan H (Heavy) polipeptidic glicozilat (45 kD), n asociaie strns, necovalent, cu -2 microglobulina (12 kD), un polipeptid care se gsete i n ser. Catena H este alctuit din 339 aminoacizi, distribuii n urmtoarele 5 domenii: - trei domenii extracelulare, n regiunea N-terminal, notate cu -l, -2, -3, fiecare cu cte 90 de aminoacizi. Sub aciunea papainei, pot fi clivate de restul moleculei. Domeniile -2 i -3 prezint legturi S-S intracatenare i formeaz bucle de 63 i respectiv 86 aminoacizi; Fig.52. Reprezentare schematic a structurii moleculelor CMH clasa I, ancorate n membrana citoplasmatic. Catena codificat de gena CMH prezint 3 domenii globulare (-1, -2, -3). Domeniul -3 este asociat cu un peptid -2 microglobulina, un mic peptid globular de 12 kD cu o structur teriar asemntoare unui domeniu al Ig, stabilizat printr-o punte S-S.

- domeniul transmembranar conine 25 resturi de aminoacizi hidrofobi, care traverseaz membrana. Imediat deasupra acestui domeniu se gsesc 5 aminoacizi bazici (Arg, Leu), tipici pentru proteinele legate de membran, cu rolul de a ancora lanul polipeptidic n membran; - domeniul hidrofil cito-plasmatic (30 de aminoacizi la om, 40 la oarece), conine n special serin, unele resturi fiind fosforilate, este implicat n transmiterea semnalului de la domeniile extracelulare, la mediatorii citoplasmatici. Acest domeniu conine resturi de cistein cu rol n legarea prin intermediul punilor SS, de alte catene H sau de proteine citoplasmatice. Componenta glucidic este alctuit din dou grupri, fiecare fiind format din 12-15 resturi de zaharuri, ataate de domeniile -1 i -2. Sunt oligozaharide care conin manoz, de care se leag catene laterale de glucozamin i acid sialic. Catena H are o regiune variabil n jumtatea N-terminal, cu dou subzone hipervariabile, care difer prin mai mult de 60% din aminoacizi, de la un organism la altul, localizate n domeniile -1 i -2. Studiile prin difracie cu raze X ale domeniilor extracelulare, cristalizate dup clivarea cu papain arat c domeniile -1 i -2 sunt foarte asemntoare ca secven de amino-acizi i prin pliere formeaz mpreun o cavitate molecular, presupus a fi situsul de legare stabil a epitopului antigenic. Cavitatea, susinut de secvene -pliate ale acelorai domenii -1 i -2, este ocupat de o molecul linear, care este un peptid ce cristalizeaz concomitent cu catena H. Situsul cavitar, dup ce leag antigenul, formeaz un complex recunoscut de limfocitele TCD8. Restul catenei H corespunde regiunii constante. Fig.53.a. Reprezentarea schematic n ochi de pasre a suprafeei superioare a moleculei CMH clasa I umane, bazat pe structura obinut n cristalografie cu raze x. Secvenele -pliate care formeaz baza cavitii sunt marcate prin sgei groase, orientate n direcia amino-carboxil. Secvenele -helicale sunt reprezentate prin liniile groase spiralate. Suprafeele interne ale celor dou helice i faa superioar a secvenelor pliate formeaz o cavitate. Cele dou sfere negre reprezint o legtur S-S ntracatenar. b. Vedere lateral a aceleiai molecule, care arat anatomia cavitii i

plierea domeniilor -3 i -2 m (4 catene -pliate antiparalele pe o fa i 3 pe cealalt) (dup Roitt, 1997)

-2 microglobulina (-2 m) (o globulin mic, ce migreaz la electroforez n regiunea -2) a fost descoperit n 1968, n urina pacienilor cu disfuncie renal provocat de intoxicaia cronic cu cadmiu. Este sintetizat de majoritatea celulelor din organism. Conine circa 100 aminoacizi, cu uoare variaii numerice. Nu prezint variabilitate detectabil pe cale chimic sau imunologic i nu este glicozilat. Ca i domeniul -3 al catenei H, -2 m prezint omologie a secvenei de aminoacizi cu domeniile constante ale moleculei de Ig. Secvena de aminoacizi a -2 m formeaz un singur domeniu stabilizat printr-o punte S-S, ntre dou resturi de cistein. -2 m se asociaz necovalent cu lanul H al moleculei CMH clasa I, prin interaciunea cu domeniul -3, dar studiile recente de cristalografie cu raze X, sugereaz un contact extins cu toate cele trei domenii. Moleculele de -2 m legate, se afl n echilibru cantitativ cu cele din plasm. Asocierea celor dou catene se face dup terminarea sintezei lor i este o condiie obligatorie pentru transportul moleculelor CMH I de la reticulul endoplasmic la membrana citoplasmatic i pentru ancorarea lor n membran. Celulele liniei Daudi (derivat din limfomul Burkitt), dei sintetizeaz catena H, nu exprim molecule CMH I, deoarece nu sintetizeaz -2 m. Moleculele CMH I au un turnover constant. Cele vechi se elibereaz i trec n circulaie sau sunt endocitate i se sintetizeaz altele noi. Stabilitatea lor este condiionat de rata disocierii peptidului i -2 m. Catenele H libere se denatureaz i sunt degradate. Moleculele CMH clasa I sunt adevrate certificate de identitate biochimic i genetic, pentru fiecare organism, datorit polimorfismului lor biochimic foarte accentuat. Ele vegheaz la pstrarea homeostaziei biochimice a organismului i devin inta sistemului imunitar n urmtoarele situaii: dup grefarea esuturilor i organelor care poart molecule incompatibile; dup ce se asociaz cu antigenele virale, tumorale sau cu cele induse de agenii chimici; dup modificarea biochimic printr-un proces mutaional.

Structura molecular a antigenelor CMH clasa II

Antigenele CMH clasa II-a sunt glicoproteine heterodimere de membran, formate din dou catene diferite, notate cu i . Prin solubilizare cu detergent, aceste molecule se elibereaz ntregi. Lanul are 30-34 kD, iar lanul are 26-29 kD. Fiecare caten este format din 4 domenii:

- dou extracelulare, alctuite din circa 90 de aminoacizi fiecare, notate cu -1, -2, respectiv 1, -2; un domeniu transmembranar (circa 30 de aminoacizi); un domeniu citoplasmatic (10-15 aminoacizi). Fig. 54. Reprezentarea schematic a moleculelor CMH clasa II-a. Molecula este format din 2 catene diferite ( i ), legate necovalent, a cror extremitate C-terminal se inser n citoplasm. Cele dou catene au cte dou domenii globulare, asemntoare cu domeniile Ig. Cu excepia domeniului -1, toate celelalte sunt stabilizate printr-o punte SS intracatenar. Cele dou catene sunt glicozilate (dup Roitt, 1997).

Domeniile -1 i -1 au o variabilitate accentuat a secvenei de aminoacizi. Ele se asociaz pentru a forma o structur ce delimiteaz o cavitate n care este legat peptidul antigenic. Domeniile -2 i -2 pre-zint omologie a secvenei de aminoacizi, cu domeniile mole-culei de Ig. Domeniile -2, -1 i -2 sunt stabilizate prin legturi S-S, iar domeniile -1, -2 i -2 sunt glicozilate. Gruparea glucidic conine manoz, galactoz, fucoz, glu-cozamin. Diferenele greutii mo-leculare a celor dou catene se dato-reaz nivelului diferit de glicozilare. Determinismul genetic al moleculelor CMH Moleculele CMH sunt codificate de genele complexului major de histocompatibilitate. Calificativul complex este justificat de numrul mare de gene componente, iar cel de major semnific importana deosebit a moleculelor codificate de aceste gene, n realizarea unor funcii imunitare importante: -elaborarea rspunsului imun -respingerea grefelor de esuturi i organe. n raport cu tipul de proteine pe care le codific, genele CMH aparin clasei I i clasei a II-a. La oarece, genele CMH codificatoare ale moleculelor complexului antigenic H-2 sunt localizate pe cromosomul 17, ntr-un fragment de 2000-4000 kb perechi, suficient de mare pentru a codifica circa 200 de proteine de dimensiuni medii. In acest complex se gsesc 3 tipuri de gene descoperite independent: -primul grup de gene (descoperit n anii 40) codific antigenele tari de transplantare, care induc respingerea rapid a grefelor de tegument i de organe, ntre indivizi neidentici genetic (aparin unor alotipuri diferite). Acestea sunt genele CMH clasa I, care codific moleculele CMH clasa I;

-al II-lea grup, denumite genele rspunsului imun (IR) codific sinteza unor molecule care condiioneaz intensitatea rspunsului imun al organismului, slab sau puternic, fa de un antigen. Genele IR codific proteinele clasei a II-a de molecule CMH, denumite i molecule Ia (I associated); -al III-lea set de gene ale complexului CMH codific sinteza unor componente ale complementului. La oarece, moleculele CMH I sunt codificate de gene situate la extremitile complexului genic H-2, notate K i D. Gena K are circa 55 de variante alelice. Fiecare variant codific proteine distincte. Fig. 55. Reprezentare diagramatic a localizrii subregiunilor genice CMH la oarece i om i poziia genelor majore n aceste subregiuni. La om, locusurile genice clasa II-a sunt localizate ntre centromer i locusurile clasei I, ca i la alte specii de mamifere.

Complexul H-2 la oarece (pe cromosomul 17).

Regiunea cromosomal Clasa Locusuri genice

K I K

I II A, E

S III C4, C2, Bf, TNF

D I D, L

La om, moleculele CMH clasa I sunt codificate de genele HLA, iar moleculele CMH II, de regiunea cromosomal D, localizate pe cromosomul 6. Moleculele CMH I sunt codificate de trei gene: HLA-A, HLA-B, HLA-C. S-au descris genele HLA-E, -F, -G, -H i -J, dar acestea sunt considerate gene neclasice pentru c produsele lor de sintez se deosebesc structural i funcional de ale genelor HLA-A, -B i C. Moleculele CMH II sunt codificate de regiunea cromosomal HLA-D, ce aparine genelor clasei a II-a. Genele clasei a III-a codific sinteza acelorai proteine plasmatice (C4, C2, Bf).

Complexul HLA (pe cromosomul 6).

Regiunea cromosomal

C4, C2, Bf B C A

E, F, G, H, J

Clasa Locusuri genice

II

III

Gene neclasice E, F, G, H, J

DP, DQ, DR C4, C2, Bf B C A

Genele HLA clasa I i II au cel mai nalt grad de polimorfism genetic dintre toi determinanii genici cunoscui ai organismului uman: HLA-A are 83 de alele HLA-B, 185 de alele HLA-C, 42 de alele. Numrul alelelor este n continu cretere pe msur ce se identific noi variante. Polimorfismul genic este consecina existenei a cel puin dou alele pentru un locus. Pe fiecare din cei doi cromosomi pereche, un individ prezint 3 gene CMH diferite (HLA-A, HLA-B, HLA-C). Celulele umane prezint 6 variante diferite de gene clasa I, cte trei de la fiecare printe. Genele CMH I sunt codominante, astfel c pe suprafaa fiecrei celule se exprim produsele de sintez ale ambelor alele parentale. Se sintetizeaz astfel 6 variante biochimice de molecule CMH I. ntr-o populaie uman, moleculele CMH I i CMH II sunt foarte diferite din punct de vedere biochimic, ca o expresie a polimorfismului genic al indivizilor umani. Antigenele HLA-A, B i C sunt antigenele majore recunoscute de sistemul imunitar al gazdei, n reacia de respingere a grefei. Cantitativ, moleculele HLA-C sunt inferioare fa de HLA-A i HLA-B. Toate sunt capabile s prezinte antigenul. Moleculele CMH neclasice (E, F, G) nu prezint antigenul. Polimorfismul biochimic al moleculelor CMH I este limitat la domeniile 1 i 2, la nivelul secvenelor ce formeaz cavitatea molecular. Genele CMH II sunt localizate n regiunea HLA-D. Regiunea genic HLA-D controleaz rspunsul limfocitelor n amestec. Specificitile alelice ale genelor CMH II au fost definite prin tipizare limfocitar i aparin locusurilor Dw i HLA-DP sau prin tipizare serologic i aparin locusurilor HLADP, DQ, DR. Regiunea D este divizat n trei subregiuni funcionale majore, care codific moleculele DR, DQ i DP. In subregiunile DQ i DP se gsete o pereche de gene funcionale DQA 1 i DQB1, respectiv DPA1 i DPB1, care codific cele dou catene ( i ) ale moleculei CMH II. Subregiunea DR este mai complex. Ea conine o singur gen pentru sinteza catenei , DRA 1 i una sau dou gene pentru sinteza catenei (DRB1, DRB3, DRB4 sau DRB5). Nr. alelelor DRA1 2

DRB1 DRB3 DRB4 DRB5 DQA1 DQB1 DPA1 DPB1

184 11 8 12 18 31 10 77

Ca i genele codificatoare ale moleculelor CMH I, genele codificatoare ale moleculelor CMH II sunt codominante. Se sintetizeaz astfel 8 variante biochimice de molecule CMH II (deoarece sunt dou gene codificatoare ale genei pentru mlecula HLA-DR). Combinarea aleatorie a numrului mare de alele explic polimorfismul extensiv al moleculelor CMH ntr-o populaie uman. Numrul combinaiilor genice posibile ntre aceste alele este evaluat la circa 1090, un numr cu mult mai mare dect al indivizilor umani care coexist la un moment dat. In contextul existenei unui numr mare de gene alele codificatoare, posibilitatea ca doi indivizi nenrudii s aib proteine identice ale moleculelor CMH clasele I i II este mic. Nu exist doi indivizi identici pentru toate cele 6 variante de molecule CMH I i pentru cele 8 variante de molecule CMH II. Moleculele CMH I i II au rolul de a lega peptidele antigenice. O variant molecular poate s lege un numr limitat de peptide antigenice(de ordinul milioanelor), dar probabilitatea unei potriviri spaiale crete mult prin existena a 6 variante de molecule CMH I i a 8 variante de molecule CMH II. Peptidul antigenic este legat deosebit de stabil n situsul cavitar al moleculelor CMH I i II. Evaluarea diferenelor antigenice ale moleculelor CMH Fiecare organism are o specificitate antigenic proprie conferit de moleculele CMH clasa I. Diferenele antigenice dintre indivizii alotipici ai unei specii, dependente de moleculele CMH I se evalueaz serologic. Serul imun specific anti-molecule CMH se obine prin injectarea unei suspensii de leucocite, la un organism al aceleiai specii, diferit din punct de vedere genetic, adic un organism cu o alt combinaie de gene alele codificatoare ale moleculelor CMH I. Organismul receptor sintetizeaz anticorpi fa de antigenele HLA ale leucocitelor donorului, care se deosebesc de propriile sale molecule. Specificitatea antigenic a unui organism poate s conste n prezena unei molecule antigenice pe sau n celulele sale, care nu exist pe sau n celulele altor organisme sau se datoreaz unor diferene structurale fine ale moleculelor de histocompatibilitate, prezente la toate organismele speciei, n variante genetice distincte.

Anticorpii anti-HLA se gsesc n serul femeilor multipare i se sintetizeaz ca rezultat al stimulrilor antigenice HLA de origine patern, exprimate pe celulele ftului, dar absente pe suprafaa celulelor organismului matern. Leucocitele ftului care strbat bariera placentar trec n circulaia matern i induc sinteza IgG, cu persisten ndelungat n circulaie. O alt surs de ser imun anti-HLA o constituie pacienii politransfuzai. Astfel ei se imunizeaz fa de antigenele HLA alotipice de pe suprafaa leucocitelor donorilor de snge. Antiserurile HLA se pot obine prin imunizarea voluntarilor. Diferenele antigenice dintre doi indivizi, determinate de moleculele CMH clasa II-a se evalueaz prin capacitatea lor de a iniia reacia limfocitar mixt (RLM). Limfocitele de la doi indivizi ce poart alele diferite la locusul HLA-D sunt co-cultivate in vitro. Condiia reactivitii limfocitare este diferena unei singure alele la locusul ce codific aceste molecule. Indivizii care au molecule CMH I identice nu reacioneaz serologic, dar dac celulele lor difer prin moleculele CMH II, codificate de alele diferite ale locusului HLA-D produc un rspuns intens n RLM. ntr-un amestec de celule limfoide homozigote aa i bb se activeaz ambele populaii de limfocite, deoarece limfocitele aa reacioneaz fa de antigenul b, iar limfocitele bb se activeaz fa de antigenul a. Intr-un amestec de limfocite homozigote aa, cu populaia de limfocite heterozigote ab, rspund numai limfocitele aa. Rspunsul bidirecional apare i n amestecul limfocitelor ac i ab. De obicei se evalueaz capacitatea limfocitelor receptorului de gref de a se activa fa de antigenele donorului i pentru a induce un rspuns unidirecional, populaia de limfocite a donorului este tratat cu mitomicin C (un inhibitor al sintezei ADN) sau este iradiat. Tratamentul nu modific imunogenitatea celulelor. Funcia stimulatoare a celulelor limfoide este restrns la celulele specializate prezentatoare de antigen, radiorezistente i care nu se divid in vitro. Rspunsul celulelor n RLM este orientat exclusiv fa de moleculele CMH I i II. Moleculele CMH II constituie un stimul primar esenial pentru RLM. Moleculele CMH clasa I i II au rol esenial n elaborarea rspunsului imun, iar din punct de vedere antigenic, determin respingerea alogrefelor (grefe ntre indivizi ai aceleiai specii, dar aparinnd unor alotipuri diferite). Distribuia tisular a moleculelor CMH I i II i semnificaia lor evolutiv Moleculele CMH I se gsesc pe suprafaa majoritii esuturilor, pe celulele endoteliale ale capilarelor, iar leucocitele exprim cea mai nalt densitate a moleculelor CMH I: 1% din moleculele de suprafa ale membranei leucocitare sunt molecule HLA. Moleculele CMH I au o densitate mai mic pe suprafaa celulelor hepatice, din plmn, rinichi i sunt foarte diluate pe suprafaa celulelor musculare i a celor mai multe glande endocrine (cu excepia suprarenalelor). Moleculele CMH II sunt exprimate predominant, pe suprafaa limfocitelor B i pe celulele specializate pentru prelucrarea i prezentarea antigenelor: celulele seriei monocit-macrofag, celulele endoteliale ale capilarelor sanguine i limfatice, celulele Kupffer, celulele dendritice, eozinofile, microglia SNC.

Moleculele CMH lipsesc pe eritrocite, pe celulele endoteliului corneean, pe componenta exocrin a pancreasului, pe celulele acinare ale glandelor parotide, pe neuronii SNC, pe celulele endoteliale ale capilarelor SNC, pe esutul placentar. n condiii normale, o form solubil de molecule HLA se gsete n plasm. Nivelul ei crete marcat n timpul infeciei virale, probabil datorit creterii ratei sintezei moleculelor HLA, stimulat de interferon i de alte citochine. Intensitatea exprimrii noleculelor CMH II este variabil, fiind controlat de diferii factori: interferonul i IL-2, sintetizai de limfocitele T, amplific nivelul de exprimare a moleculelor CMH II, iar PGE2, glucocorticoizii, -fetoproteina, LPS din bacteriile Gram negative, diminu densitatea acestor molecule, avnd astfel rol imunosupresor. Limfocitele B i celulele tumorale secret molecule CMH II. Privit n perspectiva evoluiei, existena moleculelor CMH nu semnific respingerea grefelor de esuturi i organe, deoarece acestea nu se realizeaz n mod natural, ci au fost introduse n practica medical a ultimelor decenii. In sens evolutiv, existena moleculelor CMH ar putea fi atribuit necesitii organismelor de a semnaliza rapid, celulele care prezint molecule antigenice pe suprafaa lor: celulele infectate cu virusuri sau cele transformate malign. In acest context, moleculele CMH au o semnificaie deosebit: pentru supravieuirea organismului, liza celulelor purttoare de molecule nonself trebuie s fie rapid, nainte ca virusul s se multiplice i respectiv, nainte ca celula malign s se divid i s formeze o microtumor. Pentru ca intervenia limfocitelor Tc s fie eficient, este necesar ca moleculele CMH s fie prezente pe oricare celul ce poate fi infectat de un virus sau poate s fie transformat malign. Pe de alt parte, moleculele CMH, al cror rol esenial este acela de a prezenta epitopii nonself, trebuie s permit aciunea eficient i rapid a limfocitelor Tc. Moleculele CMH ndeplinesc i funcii neimune. Moleculele CMH I sunt componente ale receptorilor de hormoni. De exemplu, linia celular stabilizat Daudi nu exprim moleculele CMH I i nu are nici receptor pentru insulin, deoarece nu sintetizeaz 2-microglobulina.

RSPUNSUL IMUN

Organismul, ca sistem funcional este echilibrat atta timp ct informaia antigenic pe care o primete, este identic cu cea proprie. Fa de moleculele strine, care se abat de la modelul informaional propriu, sistemul imunitar rspunde prin activarea mecanismelor de recunoatere pentru a ndeprta moleculele nonself. Ansamblul fenomenelor complexe n cascad, declanate de interaciunea specific a sistemului imunitar cu antigenul, n cursul crora celulele imunocompetente se activeaz,

prolifereaz i se difereniaz n celule efectoare i celule de memorie, constituie rspunsul imun. Funcionalitatea sistemului imunitar se suprapune parial, modelului general al arcului reflex, deoarece presupune existena unui flux informaional care corespunde unui excitant specific (Ag) fa de un receptor (limfocitele), o cale aferent (celulele care nglobeaz i prelucreaz Ag), un organ central (celulele limfoide dintr-un organ limfoid secundar) i efectorii rspunsului imun (anticorpi, celule efectoare). Asemnrile dintre sistemul imunitar i sistemul nervos se extind i asupra altor particulariti: - sistemul imunitar este dotat, ca i sistemul nervos, cu inteligen (capacitatea de a recepiona un numr mare de stimuli (adic de a recunoate un numr mare de determinani antigenici diferii) i de a prelucra informaie chimic. Sistemul nervos prelucreaz informaie senzorial, iar sistemul imunitar recunoate i prelucreaz informaie molecular. Inteligena sistemului imunitar se manifest discontinuu, n funcie de agresiunile antigenice asupra organismului; - educaia sistemului imunitar (adic stocarea informaiei antigenice primit prin stimulri repetate), ca i n cazul sistemului nervos, ncepe dup natere; - ambele sisteme nva prin experien, pentru c ambele sunt dotate cu memorie, care poate fi consolidat prin repetarea stimulului. Memoria ambelor sisteme este nscris n modificri moleculare persistente ale reelei, dar nu poate fi transmis la descendeni; - ambele sisteme sunt organizate dup modelul unei complexe reele celulare i moleculare. ntre cele dou sisteme exist i deosebiri: sistemul nervos recepioneaz stimuli de orice natur, care acioneaz la nivelul ntregului organism, iar sistemul imunitar recunoate i reacioneaz numai la stimuli de natur molecular, care tind s perturbe echilibrul chimic al organismului.

PARTICULARITILE GENERALE ALE RSPUNSULUI IMUN

Elaborarea rspunsului imun fa de o substan nonself este un proces fiziologic care se caracterizeaz printr-o mare eficien i suplee i are urmtoarele particulariti generale: - funcia imun are caracter adaptativ, care decurge din orientarea specific a reaciilor sale fa de o substan nonself. Caracterul adaptativ al rspunsului imun implic mobilizarea unor celule preprogramate care ateapt s fie activate de un anumit antigen, corespunztor specificitii lor; - caracterul foarte economic al funciei imunitare deriv din specificitatea aciunii sale. In timpul rspunsului imun se selecioneaz i se activeaz numai clonele de limfocite care au

recunoscut specific epitopii antigenului, toate celelalte clone rmnnd disponibile pentru alte interaciuni; - eficiena funciei imune deriv din caracterul foarte economic al mijloacelor celulare i moleculare pe care le mobilizeaz i din capacitatea de a amplifica efectorii si, pe dou ci; a) proliferarea masiv (circa 8 generaii celulare) a celulelor selecionate sub aciunea stimulatoare a substanei nonself. Dup activare se produc modificri funcionale calitative ale acestor celule, de difereniere proliferativ i maturare, rezultatul fiind generarea celulelor efectoare cu mare capacitate de aciune i a celulelor de memorie; b) celulele efectoare produc cantiti mari de molecule de recunoatere, sub forma receptorilor specifici fa de substana nonself; - caracterul de reea a celulelor activate n rspunsul imun, conectate prin mediatori moleculari (interleuchine) i care condiioneaz eficiena rspunsului imun; - celulele sistemului imunitar coopereaz stimulator cu numeroase alte categorii de celule, capabile la rndul lor s confere rezisten organismului. Cooperarea are loc, inclusiv cu factorii nespecifici (nscui) ai rezistenei (fagocitele, proteinele sistemului complement, molecule bactericide sau bacteriolitice din plasm); - rspunsul imun adaptativ necesit o perioad de timp pentru activarea i proliferarea limfocitelor care au recunoscut antigenul, n timp ce reaciile neadaptative sunt prompte; - rspunsul imun adaptativ asigur protecia organismului i a descendenilor si, prin transferul placentar al anticorpilor i prin secreia lactat; - rspunsul imun adaptativ are o proprietate fundamental unic - memoria imun consecin a experienei antigenice individuale, netransmisibil la descendeni. Rspunsul imun este rezultatul cooperrii unui numr restrns de tipuri celulare i moleculare. In funcie de predominana componentei celulare sau moleculare n compartimentul efector al rspunsului imun, se disting dou tipuri de reactivitate imunitar. 1. Rspunsul imun mediat humoral (RIMH), care se caracterizeaz n esen, prin sinteza anticorpilor ca molecule efectoare. Efectele RIMH sunt urmtoarele: - neutralizarea toxinelor i a infeciozitii particulelor virale - opsonizarea antigenelor celulare(bacterii, celule eucariote) - legarea antigenelor moleculare n complexe Ag-Ac i eliminarea lor. Imunitatea mediat humoral este transferabil de la un organism la altul prin intermediul serului. RIMH este protector fa de infeciile bacteriene (n special piogene), fa de reinfeciile virale i fa de antigenele moleculare pe care le neutralizeaz. 2. Rspunsul imun mediat celular (RIMC) se caracterizeaz prin aceea c, dup ptrunderea antigenului, de regul celular, sistemul imunitar mobilizeaz celule specializate,

care atac antigenul int. Atacul se realizeaz fie prin contact celular direct ntre limfocitele T efectoare i celula int, fie prin mediatori moleculari. Rspunsul imun mediat celular este declanat de antigene care se exprim pe suprafaa celulelor: - antigene virale exprimate pe suprafaa celulelor infectate, n special dup infecia viral primar; - antigene fungice; - antigene exprimate pe suprafaa celulelor infectate de bacteriile cu localizare intracelular obligat (Rickettsia, Coxiella, Chlamydia) sau facultativ intracelular (M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, Brucella sp., Listeria monocytogenes, Francisella tularensis), n special n macrofage; - antigenele tumorale; - antigenele celulare din grefele de esuturi i organe alogenice. Existena celor dou compartimente ale rspunsului imun este argumentat de rezultatele experimentale, dar i de observaiile clinice, adevrate experiene ale naturii, asupra unor indivizi cu afeciuni determinate de incapacitatea RIMH sau RIMC. Sindromul Di George se caracterizeaz prin aplazia congenital a timusului i paratiroidelor. Bolnavilor le lipsete reactivitatea fa de antigenele care mobilizeaz IMC i de aceea sunt sensibili la infeciile virale, fungice i la cele produse de bacterii cu localizare intracelular. Sinteza i titrul Ig serice sunt normale. Hipo- i agamaglobulinemia congenital de tip Bruton este o afeciune congenital determinat de gena tirozin-kinazei, situat pe cromosomul X, care afecteaz diferenierea celulelor limfoide B i produce imunodeficiena X lincat (Xid). Celulele B n snge sunt rare, dei numrul limfocitelor pre-B n mduva osoas nu este semnificativ redus, ceea ce sugereaz o moarte celular crescut la tranziia pre-B-B. Deficiena clinic const n incapacitatea de a sintetiza anticorpi i din aceast cauz, copiii, dup 3-6 luni de via, fac infecii repetate i recurente cu bacterii Gram pozitive i prezint manifestri ale maladiilor autoimune. Reactivitatea IMC rmne nemodificat, pentru c organismul i pstreaz rezistena fa de infeciile virale i fa de bacteriile Gram negative. Separarea celor dou compartimente ale rspunsului imun, humoral i celular, este artificial, deoarece ntre ele este o condiionare reciproc i profund: anticorpii au funcie opsonizant, favoriznd astfel IMC, iar pe de alt parte, IMC este mediat de numeroi factori solubili. Cele dou compartimente interacioneaz sinergic pentru producerea unui rspuns imun eficient. Totui, separarea este meninut deoarece reflect diferenele fundamentale ale mecanismelor de aciune ale celor dou populaii de limfocite: limfocitele B pentru RIMH i limfocitele T pentru RIMC. Nici un antigen nu induce un rspuns imun pur, humoral sau celular. Totdeauna rspunsul imun este mixt, cu predominana unuia sau a celuilalt dintre compartimente.

ETAPELE RSPUNSULUI IMUN

Rspunsul imun este rezultatul succesiunii urmtoarelor etape: - ptrunderea antigenului n organism i nglobarea lui de ctre celulele accesorii; - prelucrarea antigenului i prezentarea epitopilor pe suprafaa celulelor accesorii; - recunoaterea specific a componentelor nonself i activarea celulelor efectoare; - producerea efectorilor rspunsului imun. Ptrunderea antigenului n organism se realizeaz pe diferite ci: - pe cale cutanat - pe calea circulaiei sanguine - pe calea mucoaselor(respiratorie, gastro-intestinal i urogenital). Epiteliul tegumentar i mucoasele reprezint o suprafa foarte mare, expus la o mare diversitate de substane antigenice. Tegumentul este o barier mecanic fa de cele mai multe antigene, iar mucoasele sunt protejate, n primul rnd, de IgA din secreii. Epiteliul tegumentar i epiteliile mucoaselor au rol n fenomenul excluderii antigenice. Schimbul liber ntre mediul extern i cel intern are loc numai n situaii patologice. Elaborarea rspunsului imun este, n esen, rezultatul cooperrii a dou categorii de celule: celulele accesorii ale rspunsului imun i celulele limfoide. Antigenul este recunoscut de celule specializate funcional i nglobat, cel mai adesea prin aciunea unor mecanisme nespecifice, de celulele accesorii, cu rolul de a prelucra i de a prezenta antigenul. Celulele prezentatoare de antigen (CPA)

Celulele accesorii au rol esenial n elaborarea rspunsului imun, datorit capacitii lor de a ngloba substanele strine, de a le prelucra i de a le prezenta limfocitelor, de a fagocita celulele opsonizate i de a sintetiza substane imunomodulatoare. Prezentarea antigenului este treapta obligatorie care precede recunoaterea antigenelor proteice de ctre celulele T. Orice celul care poart pe suprafaa ei molecule CMH poate s participe la elaborarea rspunsului imun. Celulele prezentatoare de antigen au urmtoarele proprieti: preiau antigenele, le internalizeaz i le prelucreaz; exprim moleculele CMH I i II; exprim moleculele de aderen care favorizeaz interaciunea cu limfocitele; produc molecule stimulatoare ale creterii i diferenierii limfocitelor T; elibereaz citochine. Cele mai importante celule accesorii pentru elaborarea rspunsului imun sunt macrofagele. In vivo, macrofagul particip decisiv la procesul de imunogenez. Indiferent de

calea de ptrundere n organism, antigenele sunt captate de celule accesorii, cel mai adesea, de macrofag. Cea mai mare parte a antigenelor circulante sunt eliminate nainte de a declana rspunsul imun, n primul rnd de celulele Kupffer, localizate pe faa luminal a capilarelor sinusoide din ficat. La nivelul ficatului se elimin circa 90% din totalul antigenelor circulante (bacteriile care strbat bariera mucoasei digestive, endotoxinele absorbite la nivelul colonului, antigenele de origine alimentar). Alte celule specializate, cu rol major n prezentarea antigenului sunt celulele dendritice i limfocitele B. Celulele dendritice fac parte dintr-o familie care cuprinde urmtoarele tipuri de celule: - celulele Langerhans, localizate n epiderm, dar i n mucoase(oral, nazal, esofagian, bronic, n mucoasa traheii) - celulele cu voal, din limfa aferent - celulele dendritice, din epiderm, din epiteliile mucoaselor, din organele limfoide i din snge - celulele interdigitate, din aria paracortical a ganglionilor limfatici. Originea acestor celule nu este cert, dar se admite urmtoarea filiaie: monocitul sanguin, celula Langerhans din epiderm, celula cu voal din limfa aferent ganglionului limfatic, celula dendritic din derm, din organele limfoide i din snge. Celulele dendritice s-au izolat din organele limfoide i din snge, pe baza capacitii lor de a adera de suport (ceea ce permite eliminarea limfocitelor din amestec) i de a-i pierde aderena dup 24 de ore de cultivare. Rolul lor n prezentarea antigenului este argumentat de faptul c stimuleaz intens reacia limfocitar mixt. Celulele dendritice au rol foarte important pentru iniierea rspunsului imun. Sunt larg distribuite n esuturile limfoide i nelimfoide la toate speciile de mamifere studiate. Precursorii celulelor dendritice i ai macrofagelor sunt localizai n mduva osoas, iar monocitul este un stadiu comun, nainte de diferenierea pe cele dou linii. Monocitul trece n snge, de unde se disemineaz n esuturile nelimfoide (epiderm, epiteliul tractului respirator, gastrointestinal, urogenital) i se difereniaz n celul dendritic. n tegument, celulele dendritice i celulele Langerhans formeaz o reea ramificat n tot epidermul. Ele au capaciti optime de captare i prelucrare a antigenelor, care ptrund pe cale tegumentar. Dup maturare, favorizat de citochinele produse local, migreaz din esuturile nelimfoide, n esuturile limfoide secundare. Migrarea din epitelii are loc pe cale limfatic, pn n ganglionii limfatici regionali, iar cele din spaiile interstiiale migreaz pe cale sanguin n splin. In timus, celulele dendritice prezint complexele CMH-peptide, timocitelor care i dobndesc competena imunitar, pentru inducerea toleranei imune. Celulele acestei familii nu au receptori pentru Fc i nici pentru C3, dar exprim la un nivel ridicat, moleculele CMH I i II. Celulele Langerhans reprezint 2-8% din totalul celulelor epidermice i formeaz o reea printre cheratinocitele straturilor profunde. Ele reprezint celulele dendritice imature i

exprim nivele mai mari de molecule CMH II. Sunt capabile s preia antigenul exogen prin intermediul moleculelor de suprafa, fiind celule prezentatoare de antigen foarte eficiente. Celulele Langerhans pot s prezinte antigenul local, n epiderm, sau pot s se mobilizeze, s prseasc stratul bazal i s migreze pe cale limfatic, pn n ganglionii regionali. In timpul migrrii, celulele au prelungiri membranare i se numesc celule cu voal. In ganglionul limfatic, ele se distribuie n aria paracortical(cortexul profund) i devin celule dendritice i celule interdigitate (o variant morfologic cu prelungiri mai scurte), avnd rol esenial n prezentarea antigenelor i activarea limfocitelor T. Celulele Langerhans, celulele cu voal i celulele interdigitate sunt stadii diferite ale liniei celulelor dendritice. Celulele acestei familii nu au proprieti fagocitare. Totui, li se atribuie un rol important n procesul prelucrrii antigenelor. Antigenele rmn legate la nivelul membranei celulare i sunt prelucrate prin intermediul ectoproteazelor pe care le secret. Iradierea tegumentului cu raze UV duce la dispariia celulelor Langerhans. Limfocitul B este celula efectoare a RIMH, dar are i rolul de captare i prezentare a antigenului specific. Eficiena sa n captarea antigenului este maxim, deoarece receptorul imunoglobulinic leag specific epitopii corespunztori chiar la concentraii foarte mici, de 1000 de ori mai mici dect cele necesare prezentrii sale de ctre macrofag sau de ctre celula dendritic. Limfocitul B recunoate i prezint numai antigenele moleculare mici (peptide). Probabil c proteinele mari nu le sunt accesibile. Exist dovezi c antigenul peptidic legat la suprafaa limfocitului B, prin intermediul receptorului imunoglobulinic specific, este endocitat, prelucrat n compartimentul acid i prezentat n asociaie cu moleculele CMH II, pentru a fi recunoscut de limfocitele T. Limfocitele B exprim nivele relativ nalte ale moleculelor CMH II. Rolul lor de captare i eventual, prelucrare a antigenului este semnificativ la contactul secundar cu antigenul. Cele mai importante celule, cu funcia de captare i prelucrare a antigenului sunt macrofagele i celulele dendritice. Prima treapt a interaciunii antigenului exogen cu CPA (macrofag, celula dendritic) este legarea nespecific, necovalent, cu structuri nedeterminate ale suprafeei celulare. Antigenele din complexele imune sunt recunoscute de CPA prin intermediul receptorilor pentru Fc i C3. Dup ce a ptruns n organism, antigenul este repede nglobat i depozitat n interiorul macrofagului. Scoaterea antigenului din circulaie are o semnificaie funcional deosebit, deoarece constituie un depozit din care este eliberat treptat i stimuleaz imunogeneza. Antigenul liber n organism poate s induc una din cele dou stri defavorabile pentru reactivitatea imunitar: - poate fi eliminat prea rapid din organism, nainte de stimularea rspunsului imun; - dozele prea mari de antigen liber sunt defavorabile reactivitii imunitare, prin blocarea rspunsului limfocitelor. Starea caracterizat prin incapacitatea de rspuns imun a organismului se numete paralizie imunologic. Este o stare de blocare complet a reactivitii imunitare prin inundaie antigenic.

Antigenele moleculare sau particulate cu o bun imunogenitate sunt reinute parial n macrofag sub o form rezistent la degradare, pentru perioade mai lungi de timp. Macrofagele modific imunogenitatea antigenelor: dup legarea de macrofag, cele slab imunogene devin mai imunogene, iar cele cu imunogenitate ridicat, dup legarea de macrofag i pierd parial aceast calitate. Prelucrarea antigenelor

Prelucrarea antigenelor exogene este o etap obligatorie deoarece limfocitele T (Th i Tc) nu recunosc i nu preiau direct informaia antigenic nativ. Limfocitele T recunosc numai informaia antigenic prezentat pe suprafaa CPA. Celulele accesorii ale rspunsului imun prelucreaz antigenele moleculare mari i pe cele particulate. Din punct de vedere biochimic, prelucrarea semnific deplierea, clivarea proteinelor i generarea peptidelor, ca rezultat al unei proteolize pariale. Prelucrarea antigenului exogen de ctre celulele prezentatoare, parcurge urmtoarele etape: internalizarea antigenului n veziculele membranare acide; proteoliza parial; cuplarea cu moleculele CMH; transportul la nivelul membranei plasmatice. Gradul prelucrrii antigenului este dependent de natura sa. Intervalul de prelucrare este de 45-60 minute. Durata s-a determinat prin inactivarea metabolic a macrofagelor cu paraformaldehid, la diferite intervale de timp dup contactul cu antigenul. Experienele cu antigen marcat au evideniat c n CPA, materialul imunogen are dou destinaii: o parte este expus pe suprafaa celulei i este recunoscut de celulele T, iar o alt parte este sechestrat n celul, de unde este eliminat activ n mediul extracelular i este preluat de alte CPA. Principalul mecanism degradativ care are loc n CPA este proteoliza lizosomal. Concluzia a fost dedus experimental: amoniacul i cloroquina (substane lizosomotrope) se acumuleaz n lizosomi i blocheaz activitatea enzimelor prin creterea pH lizosomal. Macrofagele astfel tratate sunt incapabile s prezinte antigenele proteice sau bacteriene. Cloroquina blocheaz numai etapa prelucrrii antigenului, dar nu i recunoaterea sa de ctre limfocitele T, deoarece administrarea ei dup o or de la contactul macrofagelor cu antigenul, a rmas fr efect. Cloroquina a blocat prezentarea antigenului de ctre celulele dendritice, dei ele nu sunt fagocitare in vitro i au un echipament lizosomal puin dezvoltat. S-a dedus c ele prelucreaz antigenul la suprafa, prin intermediul ectoproteazelor membranare, dei nu exist dovezi directe n acest sens. Prezentarea antigenelor i asocierea cu moleculele CMH I nu este sensibil la aciunea substanelor lizosomotrope alcalinizante. Proteinazele cisteinice (funcioneaz prin intermediari covaleni enzim-substrat) sunt importante pentru prelucrarea antigenelor proteice, aa cum s-a demonstrat cu antigene sintetice. Proteoliza rapid i extensiv este cauza slabei imunogeniti a unor antigene (sau chiar a absenei imunogenitii). Unele antigene sintetice (copolimerul L-acid glutamic-Lalanin) sunt mult mai imunogene dup inhibarea aciunii proteinazelor cisteinice.

Mecanismele moleculare ale prelucrrii antigenelor sunt puin cunoscute. In macrofage se produce o digestie selectiv a antigenului , n urma creia o parte din epitopi se pstreaz, dar cea mai mare parte a antigenului este complet degradat. Complexitatea antigenului condiioneaz numrul de peptide cu rol de epitopi, care deriv prin procesul de prelucrare i care pot fi legate de moleculele CMH. Dac antigenul este o bacterie, numrul de epitopi este nedeterminat i specificitatea lor antigenic este variabil, n funcie de complexitatea aparatului enzimatic hidrolitic al celulei care prelucreaz antigenul. Nu toate antigenele necesit proteoliza (fragmentarea) prealabil recunoaterii de ctre celulele T. Uneori este suficient numai denaturarea (deplierea) proteinelor pentru ca antigenul s fie prezentat de CPA, chiar tratate cu cloroquin. Forma sub care limfocitele T recunosc antigenele, depinde att de natura CPA, dar n special de natura antigenului. Majoritatea proteinelor sunt rapid endocitate i prelucrate, dar unele sunt legate de membrana celulei i prezentate n stare nativ, fr o prelucrare prealabil. Antigenele peptidice mici (insulina, angiotensina) pot fi recunoscute n form nativ, de unele subpopulaii de limfocite T, n timp ce altele recunosc formele prelucrate ale acelorai antigene. Dimensiunea i configuraia spaial a moleculei de antigen sunt hotrtoare n ceea ce privete gradul prelucrrii sale, nainte de a fi prezentat. De regul, moleculele mari necesit prelucrarea prealabil, iar cele mici sunt prezentate n form nativ. Forma chimic a antigenului, dup prelucrare, nu este cunoscut cu certitudine. Foarte probabil, este un polipeptid de dimensiuni mici (9-20 aminoacizi). Dup ali autori, prelucrarea nu este necesar pentru ca antigenul s fie prezentat limfocitelor T, dar totdeauna este necesar conversia sa la o form care s-i permit interaciunea cu moleculele CMH II ale CPA i cu receptorii limfocitelor T. Dovada este adus de faptul c liposomii cu molecule CMH II inserate n stratul lipidic, la care s-au ataat o varietate de antigene proteice native, stimuleaz clonele de limfocite T in vitro, n absena complet a CPA. Epitopii antigenelor peptidice exogene sunt expui la suprafaa CPA, n asociaie cu moleculele CMH clasa II, iar epitopii antigenelor de origine endogen sunt prezentai n asociaie cu moleculele CMH clasa I. Rolul moleculelor CMH n prezentarea antigenelor Rspunsul imun este rezultatul interaciunilor complexe ntre celulele care prezint antigenele i limfocitele T i B. Prezentarea antigenelor este o etap obligatorie a elaborrii rspunsului imun, ce deriv din faptul c limfocitele nu interacioneaz direct cu antigenele n stare nativ, ci numai dup ce acestea au fost prelucrate i prezentate pe suprafaa unei celule.

Moleculele CMH ndeplinesc funcia de prezentare a antigenelor i au un rol esenial n declanarea rspunsului imun. Pentru a deveni disponibili interaciunii cu receptorii de antigen ai limfocitelor, epitopii sunt asociai intracelular, cu moleculele CMH I sau II i sunt transportai la suprafaa CPA ca fragmente peptidice sau ca proteine intacte, n funcie de natura i de mrimea antigenului. Fig. 56. Prelucrarea i prezentarea antigenului exogen, n asociaie cu moleculele CMH II. Moleculele CMH II, cu catena invariant, sunt asamblate n reticulul endoplasmic (RE) i transportate prin reeaua Golgi, de unde sunt orientate spre vezicula endosomal, care conine protein degradat parial, derivat din antigenul exogen. Degradarea catenei invariante, face posibil asocierea peptidului antigenic cu molecula dimeric (DM). Complexul este transportat la suprafaa celulei i este recunoscut de limfocitele Th. Moleculele CMH I i II au capacitatea funcional de a lega i de a expune pe suprafaa celulei, un numr neli-mitat de peptide diferite. Complexul format de mo-leculele CMH I sau II i epitopul peptidic este recu-noscut de limfocitele T. Nu se cunoate modalitatea interaciunii dintre moleculele CMH i epitopii antigenici. Ar putea fi o interaciune ferm sau moleculele CMH au numai rolul de suport pentru epitopii antigenici. Se accept ideia unei ierarhii a epitopilor cu privire la ordinea legrii competitive de moleculele CMH, dato-rit sensibilitii diferen-iate la proteaze. Rezult peptide cu afinitate diferit fa de situsul de legare a moleculelor CMH. Astfel, exist epitopi dominani, care se asociaz cu mare probabilitate de molecu-lele CMH, epitopi subdominani, cu mai puine anse de asociere cu moleculele CMH i epitopi criptici, care se asociaz rareori n complexe cu moleculele CMH i care nu devin accesibili limfocitelor T potenial reactive. Antigenele exogene sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH II Moleculele CMH II leag peptide derivate din proteinele exogene endocitate de celule: proteine solubile, proteine ale capsidei virale, proteine bacteriene sau proteine ale protozoarelor endocitate de celul. In vitro, s-a demonstrat c moleculele CMH II purificate, leag suficient de stabil o molecul peptidic, pentru a fi izolate mpreun prin gel-filtrare. Antigenele exogene sunt nglobate i prelucrate n fagolizosomii celulelor prezentatoare de antigen (CPA). Moleculele CMH II se sintetizeaz n reticulul endoplasmic granular i sunt modificate post-traducere, n cisternele Golgi. Cele dou catene ale moleculei sunt reunite prin catena invariant. Asocierea este meninut pn cnd moleculele CMH II ajung n sistemul endocitar al celulei. In drumul lor spre suprafaa celulei, moleculele CMH II ajung prin fuziunea veziculei transportoare, n compartimentul fagolizosomului ce conine antigenul parial degradat. La acest nivel este eliminat catena invariant ce reunete catenele i i care ocup situsul de legare a antigenului. Moleculele CMH II se asociaz cu peptidul antigenic de 13-25 aminoacizi. Complexul format este expus la nivelul membranei, unde este recunoscut de limfocitele TCD4. Situsul de legare al moleculei CMH II este o cavitate format

prin -plierea domeniilor -1 i -1, delimitat de secvenele -helicale ale domeniilor -1 i -1. Complexul format este recunoscut de limfocitele TCD 4. Fig. 57. Reprezentarea schematic a asocierii moleculelor CMH II cu peptidul antigenic (dup Cresswell, 1994). Moleculele CMH II au funcia fundamental de a stimula elaborarea rspunsului imun specific fa de antigenele exogene, prin intermediul limfocitelor TCD 4. Limfocitele TCD4 secret IL-2, IL-4, IL-5, IFN , cu efect stimulator fa de limfocitele Tc i B. Asocierea unui peptid nonself cu moleculele CMH II semnific cererea de ajutor pentru eliminarea antigenului, materializat n activarea limfocitelor TCD 4 i secreia de limfochine stimulatoare ale rspunsului imun. Moleculele CMH II au rol esenial pentru stimularea rspunsului imun, dar i pentru reglarea intensitii sale. Interaciunea moleculelor CMH II cu epitopii antigenici nu este specific. Deoarece moleculele CMH sunt polimorfe, exist diferene, uneori importante, ntre organismele outbred ale unei specii de a rspunde la un antigen. Astfel se explic diferenele individuale de sensibilitate fa de un agent infecios. Un rspuns imun mai amplu, este generat de un organism care expune mai muli epitopi antigenici diferii, asociai cu diferitele variante de molecule CMH II, comparativ cu un organism care expune mai puine fragmente antigenice asociate cu 1 sau 2 tipuri de molecule CMH II. Antigenele endogene sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH I Rolul moleculelor CMH n procesul recunoaterii antigenelor care se sintetizeaz n interiorul celulei (proteine endogene), a fost demonstrat de Zinckernagel i Doherty (1974), pentru antigenele virale, n experiene de genul urmtor: - oarecii liniei inbred D au fost inoculai cu virusul coriomeningitei limfocitare (cu specificitate antigenic A), pentru a stimula proliferarea limfocitelor Tc fa de celulele infectate cu acest virus; - culturile de fibroblaste de la embrionii liniei D se infecteaz cu varianta antigenic A i respectiv B, iar fibroblastele liniei K se infecteaz cu varianta antigenic A; - limfocitele Tc ale organismelor liniei D, stimulate cu virusul A, recunosc i lizeaz, in vitro, fibroblastele liniei D, infectate cu varianta antigenic A, dar nu recunosc i nu lizeaz fibroblatele liniei D infectate cu varianta antigenic B i nici fibroblastele liniei K, infectate cu varianta antigenic A. Concluzia a fost c nucleoproteinele citosolice virale, sintetizate n celul, pot deveni inta celulelor Tc, dup ce sunt expuse ca un peptid prelucrat, n asociaie cu moleculele CMH I ale celulei infectate. Pe baza acestei concluzii s-a stabilit principiul general c proteinele intracelulare (care nu sunt destinate membranei citoplasmatice), pot s-i semnaleze prezena n raport cu celulele T, prin expunerea asociat cu moleculele CMH I. Rezultatele au fost extrapolate i pentru categoria larg a antigenelor exogene.

Fig. 58. Aciunea limfocitelor Tc este restrictiv n raport cu moleculele CMH I, deoarece celula Tc recunoate att antigenul specific, ct i molecula CMH I. Amnunte n text. Recunoaterea asociat a antigenelor cu moleculele CMH I sau II are dou semnificaii majore: - celulele sistemului imunitar interacioneaz cu proteinele proprii, numai dac acestea sunt asociate cu un determinant antigenic nonself, de origine viral, tumoral sau indus de ageni chimici; - recunoaterea antigenului este condiionat de existena fenomenului de histocompatibilitate, adic celulele care prezint antigenul i cele care l recunosc (limfocitele Tc i Th) trebuie s poarte molecule CMH identice, adic celulele care interacioneaz trebuie s aparin aceluiai organism sau unor organisme genetic identice(ale aceleiai linii inbred). Acesta este fenomenul de restricie (limitare) a interaciunilor celulare prin moleculele CMH. Moleculele CMH I au rolul de a lega i de a prezenta proteine self, peptide derivate din catabolismul proteinelor citosolice, antigene bacteriene sau ale paraziilor intracelulari, antigene virale sintetizate n celul prin traducerea unui ARNm viral, antigene tumorale sau antigene a cror sintez a fost indus de ageni chimici. Dup asocierea cu epitopi antigenici, moleculele CMH I devin inta atacului limfocitelor TCD 8. Limfocitele Tc sunt implicate, n primul rnd, n recunoaterea i eliminarea celulelor infectate cu virusuri sau a celor transformate malign. Ambele tipuri de antigene sunt sintetizate n celul i sunt considerate ca avnd origine endogen. Evenimentele celulare al cror rezultat este prezentarea peptidelor, se succed n urmtoarele trepte: - catabolismul antigenului proteic (n citoplasm) - transportul peptidului din citosol, n cisternele reticulului endoplasmic - asamblarea complexului format din peptid i molecule CMH I - transportul complexului la suprafaa celulei. Antigenele endogene se asociaz cu moleculele CMH I, chiar n cisternele reticulului endoplasmic granular. La acest nivel, moleculele CMH II sunt inaccesibile asocierii cu epitopii antigenici, deoarece catenele i sunt reunite prin catena invariant. Prezentarea antigenelor endogene, asociate cu moleculele CMH I nu este sensibil la aciunea agenilor lizosomotropi alcalinizani (amoniac, cloroquin), dar este sensibil la derivaii peptidici(di- sau tripeptide aldehidice) care inhib proteasomul. Proteasomul este un complex proteic multicatalitic, compus din mai multe subuniti inelare suprapuse, asamblate ntr-o structur cilindric, n care se produce proteoliza moleculelor proteice citosolice conjugate cu ubicvitina. Proteasomul este o structur care controleaz turn-overul proteinelor citosolice, inclusiv al factorilor de transcriere i al ciclinelor. Ubicvitina este un polipeptid mic, care este asociat pe cale enzimatic dependent de ATP, de lizina proteinelor citosolice.

Legarea ubicvitinei produce deplierea proteinei int i asigur recunoaterea de ctre elementele complexului proteasomic citosolic. Proteinele celulare modificate dup cuplarea cu ubiquitina, devin sensibile la proteoliz. Proteoliza are loc n mediul apos al structurii cilindrice i este independent de ATP. Astfel sunt protejai constituienii celulari de degradarea necontrolat. Peptidele rezultate n proteasom sunt foarte rapid degradate n citoplasm. De aceea s-a presupus c ele se asociaz cu proteinele chaperone, cu rol protector i de orientare a peptidelor n lumenul reticulului endoplasmic. Fig. 59. Prelucrarea i prezentarea antigenului endogen, de ctre moleculele CMH I. Proteinele citosolice sunt degradate de complexul proteosomic, n peptide care sunt transportate n reticulul endoplasmic (RE). La acest nivel, -2 m induce diso-cierea catenei H de proteina chaperone (calnexina). Se asambleaz molecula CMH I i se asociaz cu peptidul antigenic. Complexul peptid-CMH I se elibereaz din asocierea cu transportorul TAP, traverseaz cisternele Golgi i se exprim pe suprafaa celulei, gata s fie recunoscut de RCT. Celulele deficiente n TAP1/2 nu elibereaz peptidele pentru a se asocia cu moleculele clasa I i nu pot exercita efectul citotoxic asupra intei (dup Roitt, 1997). Fig. 60. Formarea complexului CMH I-peptid n cisternele RE. Peptidele rezultate din pre-lucrarea antigenelor endogene sunt transportate n reticulul endo-plasmic, de o categorie de proteine transportoare, denumite TAP (pro-teine transportoare asociate cu prezentarea antigenului) care folo-sesc energia rezultat din hidroliza ATP, pentru a transporta prin membrane diferite proteine, ioni, antibiotice. Molecula TAP este un heterodimer, format din dou subuniti (TAP 1 i TAP2). Fiecare subunitate are o regiune hidrofob N-terminal transmembranar i un domeniu C-terminal ce leag ATP. Moleculele TAP au capacitatea de a transloca peptidele prin membrana RE. Catenele moleculei CMH I se sintetizeaz separat pe cisternele RE i odat cu traducerea sunt transportate n RE. Catena H, -2 m i peptidul se asambleaz ntr-un complex, chiar n cisternele RE sau n compartimentul pregolgian. n cisternele Golgi, catena H este glicozilat, iar complexul CMH I-peptid este ancorat n membran i expus la suprafaa celulei. Moleculele CMH I leag peptide mici, de 8-10 aminoacizi. Specificitatea de legare este larg. Molecule CMH I identice leag peptide diferite. Liniile celulare care nu sintetizeaz -2 m, nu exprim molecule CMH I pe suprafaa lor. Acesta este un exemplu al funciei de control de calitate pe care l are RE. Moleculele CMH pliate incorect nu sunt transportate la nivelul membranei, ci rmn n cisternele RE i sunt degradate. Absena -2 m determin plierea greit i degradarea catenei mari. Controlul de calitate este mediat de un set de proteine chaperone, care se asociaz reversibil cu proteinele pliate incorect i astfel permit corectarea greelii de pliere. La nivel membranar, complexul molecular este recunoscut de limfocitele Tc i rezultatul interaciunii este liza celulei int. Moleculele CMH I nu disting ntre peptidele self i nonself. Peptidele asociate cu moleculele CMH I au fost izolate, fracionate prin HPLC (high-performance liquid chromatography) i secveniate. Fiecare celul expune pe suprafa , sute de peptide, cele mai multe fiind proteine citosolice autologe.

Asocierea moleculei CMH I cu un peptid nonself pe suprafaa celulei, semnific necesitatea distrugerii celulei int. Dovada n favoarea acestei ipoteze este adus de faptul c, in vivo, situsul de legare al moleculelor CMH I este ocupat de peptide self, adic fragmente ale proteinelor proprii, pe care celulele le capteaz din spaiul interstiial sau le produc n proteasom i le prezint ca i pe cele nonself. Dup disocierea peptidului, molecula CMH I goal expus la suprafaa celulei, este instabil. Faptul c situsul de legare al moleculelor CMH I este ocupat de peptide self, este n acord cu teoria supravegherii imune, conform creia, celulele killer i limfocitele Tc controleaz permanent suprafaa celulelor organismului, pentru a detecta eventuala apariie a antigenelor tumorale sau virale. Celulele care exprim pe suprafaa lor molecule nonself, sunt eliminate prompt. Deoarece celulele prelucreaz i prezint continuu molecule proprii, celulele sistemului imunitar sunt stimulate permanent. Limfocitele controleaz calitatea moleculelor CMH I i detecteaz celulele ce prezint molecule alterate sau molecule nonself. Indivizii umani deficieni ai moleculelor CMH I, nu par a avea o inciden crescut a infeciilor virale severe, ceea ce sugereaz existena i a altor mecanisme de recunoatere a moleculelor nonself, neasociate cu moleculele CMH I. Fig. 61. Reprezentarea schematic a moleculelor CD4 i CD8.

Modelul

recunoaterii

antigenuluide

ctre

limfocitele

Recunoaterea antigenului de ctre limfocitele T este mediat n primul rnd, de receptorul de antigen (RCT). Secvenele hipervariabile ale lanurilor i formeaz regiunile determinante de comple-mentaritate (RDC 1 i RDC 2). Buclele RDC 1 i RDC 2 ale regiunilor variabile (V) i ale RCT, interacioneaz cu regiunea helical a moleculei CMH, iar cele dou secvene RDC 3, interacioneaz cu peptidul antigenic. Interaciunea limfocitului cu celula prezentatoare de antigen este mediat i de alte molecule. Limfocitele Tc prezint pe suprafaa lor, markerul CD 8 i recunosc antigenele asociate cu moleculele CMH I, iar limfocitele Th prezint markerul CD 4 i recunosc antigenele asociate cu moleculele CMH II. Moleculele CD 4 i CD8 sunt proteine membranare, monomorfe, participante la recunoaterea complexelor CMH-peptide, de pe suprafaa celulelor int. Domeniile lor extracelulare, prin secvena aminoacizilor, se aseamn cu domeniile imunoglobulinelor. Molecula CD4 este monomeric i este pliat n 4 domenii extracelulare, omologe cu ale moleculei de Ig, stabilizate prin puni S-S. CD8 este o protein dimeric, iar conformaia sa spaial prezint un domeniu asemntor domeniului variabil al moleculei de imunoglobulin.

n procesul recunoaterii antigenului, molecula CD 8 se asociaz cu domeniul constant -3, al moleculei CMH clasa I, iar molecula CD 4 se asociaz cu domeniile constante -2 sau -2 ale moleculei CMH clasa II-a. Moleculele CD8 i CD4 sunt importante nu numai pentru orientarea limfocitelor spre intele adecvate, dar au i rol n transducerea semnalului, deoarece cozile lor citosolice leag o tirozin-kinaz, cu rol esenial n transmiterea semnalului activator al limfocitului T. Receptorul de antigen al limfocitelor T recunoate fragmentele peptidice complexate cu moleculele CMH I sau II. Pentru fiecare organism, diversitatea moleculelor CMH este limitat, dar ele leag o larg varietate de peptide scurte (8-9 aminoacizi, pentru moleculele CMH I i circa 14 aminoacizi, pentru moleculele CMH II). Dei nu este o legare pe baza specificitii, interaciunea peptidului antigenic cu moleculele CMH este caracterizat de o afinitate nalt, deoarece se stabilete cu gruprile NH 2 i COOH de la extremitatea peptidului, restul secvenei de aminoacizi rmnnd disponibili pentru interaciunea cu RCT. Fig. 62. Diagrama domeniilor extracelulare ale moleculelor CMH clasa I (sus) i clasa II (jos). Situsurile de legare ale celor dou clase de molecule au configuraii tridimensionale asemntoare i sunt ocupate de peptidul rezident self sau nonself (dup Roitt, 1993).

Deoarece moleculele CMH I i II leag peptide scurte, epitopii celulelor T sunt alctuii din secvene peptidice lineare, adic configuraia epitopilor nu este dependent de conformaia proteinei native. Deoarece epitopii recunoscui de limfocitele T sunt peptide scurte, rezult c prelucrarea proteolitic a antigenelor este o etap obligatorie, care precede interaciunea lor cu limfocitele T. Prezentarea antigenelor asociate cu moleculele CD 1

Antigenele nepeptidice sunt prezentate celulelor T, prin alte mecanisme. Moleculele CD1 se aseamn structural cu moleculele CMH I. Ele prezint antigenele n asociaie cu domeniile hidrofobe, care formeaz caviti, capabile s lege antigenele lipidice i glicopeptidice. n aceast asociaie, antigenele sunt recunoscute de limfocitele T. Se cunosc 4 izo-forme distincte de molecule CD 1 (CD1a, -b, -c, -d), codificate de 5 gene situate pe cromosomul 1. Prezentarea antigenelor lipidice n asociaie cu moleculele CD 1 este sensibil la agenii de acidificare a endosomului (cloroquin, concana-micin A). Probabil, asocierea antigenelor lipidice cu cu CD1 se produce n compartimentul endo-somal acid. Moleculele CD1 sunt impor-tante pentru reaciile de aprare anti-infecioas, pentru c ele prezint antigenele de micobacterii (acidul micolic, lipoarabinomananul), celulelor T. Calea CD1 de prezentare a antigenelor se aseamn cu cile de prezentare a antigenelor peptidice n asociaie cu moleculele CMH I i II. CD 1 este asemntoare din punct de vedere structural, cu moleculele CMH I, dar asocierea cu antigenul are loc n endosomul lipidic. Prezentarea antigenelor n asociaie cu moleculele CD 1 este considerat ca o cale distinct.

Activarea

limfocitelor

Fig. 63. Moleculele CMH regleaz rspunsul imun. a. O celul T citotoxic (CD8) recunoate peptidul n asociaie cu o molecul CMH clasa I, pe suprafaa unei celule infectate cu un virus. b. O celul T helper (CD4) recunoate peptidul antigenic asociat cu o molecul CMH clasa II, pe suprafaa unei celule prezentatoare de antigen (CPA). Epitopii antigenici sunt recunoscui de RCT, dar la procesul recunoaterii particip i moleculele CD 8 i respectiv CD4. CD8 recunoate domeniul -3 al moleculei CMH I, iar CD4 se leag de domeniile -2--2 ale moleculei CMH II. Cel puin trei molecule distincte sau complexe moleculare, fizic independente, ale membranei au rol n transducerea eficient a semnalului activator al celulei T, fiecare fiind asociat cu o activitate enzimatic relevant: - RCT1 - i complexul CD3 (--). Partea invariant a RCT este asociat cu tirozinchinaza p59fyn; - coreceptorii CD4 sau CD8, asociai cu tirozin-chinaza p56lck; - CD45, cu activitate fosfatazic tirozin-specific. Limfocitele T mature cu RCT - sunt CD 4 sau CD8. Celulele TCD4 recunosc fragmentele peptidice legate de moleculele CMH II, iar celulele TCD 8 recunosc fragmentele peptidice legate de moleculele CMH I. Aceast specificitate a condus la sugestia c molecula CD4 poate s lege molecula CMH II, iar molecula CD 8 leag molecula CMH I, ambele avnd rol de coreceptori de antigen. Fig. 64. a. Suprafamilia genelor care codific imunoglobulinele i diferite alte molecule cu rol n recunoaterea intercelular. Toate aceste molecule au o structur asemntoare. Familia moleculelor multigenice, cu rol n recunoaterea antigenului cuprinde imunoglobulinele, RCT, moleculele CMH I i II. b. Familia moleculelor monogenice cuprinde molecula Thy (exprimat pe celulele T i pe neuroni), receptorii de poli-Ig (transport IgA prin epiteliul mucoaselor), N-CAM (o molecul de aderen a neuronilor), CD4, CD8, precum i alte proteine (o protein plasmatic uman, o protein neurocitoplasmatic) (dup Roitt, 1997). Coreceptorii CD4 i CD8 sunt glicoproteine trans-membranare. Fiecare este aso-ciat cu o molecul de tirozin-kinaz specific celulei T, p56 lck. In procesul activrii celulei T de ctre antigen, coreceptorul trebuie s se lege de aceiai molecul CMH ca i RCT, pentru transducerea optim a semnalului. Inter-aciunea faciliteaz transmi-terea semnalului activator cu o eficien de pn la 300 de ori mai mare. CD4 i CD8 sunt mem-bre ale suprafamiliei imuno-globulinelor. Dei ambele au rol de coreceptori i se asociaz cu aceiai tirozin-kinaz (p56 lck), nu au omologie structural.

Studiile de cristalografie cu raze X au artat c domeniul extern al moleculei CD 4 formeaz o protruzie pe faa lateral a moleculei, implicat n legarea moleculei CMH II. Molecula CD8 este format din dou catene diferite ( i ) i are un singur domeniu de omologie cu molecula de Ig, la captul amino. Acesta este urmat de o secven cu configuraie nedefinit i cuprinde resturile de cistein care permit legarea moleculelor n dimeri funcionali. Molecula CD 8 are rol de coreceptor, participnd la recunoaterea antigenului, prin asocierea cu domeniul -3 al moleculei CMH I. Fig. 65. Diferite aranjamente ale RCT i ale co-receptorilor si sunt determinate de izoformele lui CD45 exprimate pe celula T. Pe celulele neangajate, CD4, CD45 i RCT migreaz independent pe suprafaa celulei. Pe celulele T de memorie, cele trei molecule sunt asociate. Pe celulele Th2 clonate, o izoform de CD45 cu gr. mol mic, se leag de CD4, dar acest complex nu se asociaz cu RCT. Activarea optim a celulei are loc n cazul n care cele trei molecule sunt asociate strns pe suprafaa limfocitului (dup Janeway, 1997). Coreceptorii se asociaz fizic cu RCT n timpul activrii celulei T. Molecula CD45 este o fosfataz transmembranar tirozin-specific. Este un antigen leucocitar, prezent pe toate celulele de origine hematopoietic, alctuit dintr-un domeniu extern variabil i un domeniu citoplasmatic constant ce const din dou subdomenii cu activitate fosfatazic tirozin-specific. CD45 prezint mai multe izoforme, care variaz cu tipul celular. Varia-bilitatea rezult din clivarea alternativ a ARNm. Celulele T i schimb izoforma de CD 45 n timpul activrii i dup activare. Pe limfocitele T neangajate, izoformele de CD 45 sunt toate cu greutate molecular mare, iar celulele T activate sau de memorie exprim o variant a CD 45 cu greutate molecular mic. Izoformele distincte se asociaz n mod diferit cu celelalte componente ale complexului la celulele neangajate i la cele de memorie, modificnd eficiena transmiterii semnalului de activare. Limfocitele TCD4 recunosc com-plexul molecular CMH II-epitop, expus la suprafaa celulei prezentatoare de antigen (CPA) i se activeaz. Limfocitul activat secret IL-2, o interleuchin esenial pentru expansiunea clonal a limfocitelor TCD 4 i amplificarea rspunsului imun. Amplificarea rspunsului imun parcurge mai multe etape: Fig. 66. Mecanismul activrii celulei T. - dup legarea limfocitului TCD4 de CPA, ultima produce IL-1; - stimuleaz limfocitul TCD4 s produc IL-2. IL-2 acioneaz stimulator asupra celulelor care o produc (bucl autocrin) i asupra limfocitelor nvecinate, care au aceiai specificitate a receptorului de antigen (aciune paracrin), efectul fiind exprimarea intens a receptorilor pentru IL-2 pe suprafaa limfocitelor stimulate; - limfocitele TCD4 activate de IL-2 prolifereaz i genereaz o populaie de celule imunoreactive, Th1 i Th2, care la rndul lor, prin intermediul interleuchinelor pe care le

secret, au efecte activatoare asupra compartimentului imunitii celulare sau stimuleaz activarea i proliferarea limfocitelor B specifice, n funcie de natura antigenului. Fig. 67. Amplificarea rspunsului imun. Pentru ca epitopii s fie recunoscui, moleculele CMH trebuie s expun simultan pe suprafaa celulei, un numr mare de peptide nonself, pentru un interval suficient, astfel nct s permit limfocitelor T s controleze calitatea moleculelor CMH ale fiecrei celule. Timpul de generaie al unei celule T, dup stimularea antigenic poate fi de 4,5 ore, adic ntr-o sptmn, dintr-o singur celul T pot s rezulte 10 12 celule, ceea ce ar nsemna dublarea numrului de limfocite T n organism. O protein de dimensiuni medii, cu 2-10 epitopi, poate fi recunoscut de 10-1000 celule neangajate, n funcie de capacitatea moleculelor CMH de a prezenta epitopii peptidici. Consecutiv unei infecii virale, numrul celulelor CD8 cu specificitate fa de antigenele virale, la oarece poate s creasc de 10 ori. Durata de via a limfocitelor T este greu de evaluat, dar moartea lor prin apoptoz este declanat de IL-2 i de antigen. Dup stimularea ciclului celular sub aciunea antigenului, limfocitele T devin foarte sensibile la apoptoz. Proliferarea celulelor T este stimulat dup ce IL-2 se fixeaz pe receptorul specific. Dup unul sau cteva cicluri, limfocitele T n faza G 1 sau S, devin foarte sensibile la apoptoz. Aa se explic moartea hibridoamelor T ca rspuns la legarea ncruciat a RCT. Apoptoza celulelor T este declanat n dou situaii: sub aciunea stimulatoare a antigenului i n absena limfochinelor. Rspunsul celulelor T la antigen se desfoar n dou faze, cu evenimente moleculare distincte: faza de activare i cea de proliferare. Faza de activare const n inducerea genelor pentru sinteza IL-2 i a receptorului de mare afinitate pentru IL-2. In aceast faz, apoptoza este practic absent. Faza de proliferare a limfocitelor T este iniiat de fixarea IL-2 pe receptorul su. Dup ce celulele T au parcurs unul sau cteva cicluri celulare i intr n faza G 1 sau S, devin foarte sensibile la apoptoz. Factorul esenial al apoptozei este IL-2. Conceptul controlului feed-back al intensitii rspunsului imun prin fenomenul apoptozei (reglarea propriocid) s-a nscut din nevoia de a explica acest nou rol al IL-2, care contrasteaz cu proprietile sale proliferative. Teoria afirm c IL-2 confer celulelor T, sensibilitate la apoptoz. Gradul stimulrii antigenice determin inducerea apoptozei. Dup ncetarea stimulrii antigenice, sinteza IL-2 i a receptorului su scade. In absena IL-2, cu rol trofic pentru limfocitele T, se iniiaz apoptoza pasiv. Invers, dac celulele T intrate n ciclul diviziunii sunt intens stimulate de antigen, se produce apoptoza activ (indus de antigen). Apoptoza pasiv diminu expansiunea populaiei celulelor T, i o adapteaz la intensitatea unui rspuns fiziologic. Apoptoza activ este indus numai de activarea RCT. Ca rezultat al acestor dou forme de apoptoz, rspunsul feed-back elimin celulele T dac antigenul i IL-2 sunt n exces sau n deficit. O parte a celulelor T poate s scape morii apoptotice pasive sau active i s devin limfocite T de memorie, cu via lung.

SURSE DE GAMAGLOBULINE OMOGENE

Moleculele de anticorpi ale unui ser imun sunt foarte heterogene din punctul de vedere al specificitii lor de combinare cu epitopii antigenici inductori, deoarece, att antigenele moleculare, dar n special cele corpusculare (virusuri, celule), prezint o mare diversitate de epitopi. Chiar i antigenele moleculare cele mai simple sunt mozaicuri de epitopi. Specificitatea de combinare a moleculelor de anticorpi corespunde epitopilor fa de care s-au sintetizat. Diversitatea uria a specificitii de combinare a anticorpilor (evaluat la 10 8-109) genereaz o heterogenitate biochimic de acelai nivel, materializat n variaia secvenei de aminoacizi, ceea ce a constituit un obstacol major n calea studiului lor prin metode analitice, dei anticorpii se gsesc totdeauna n snge, cu excepia cazurilor patologice de agamaglobulinemie. Analiza biochimic a imunoglobulinelor a fost condiionat de existena unei surse omogene de molecule de anticorpi, cu o secven identic a aminoacizilor. Condiia identitii secvenei de aminoacizi este ndeplinit de anticorpii care au aceiai specificitate de legare, nu fa de un antigen, ci fa de un singur epitop.

Proteine

de

mielom

Sursa natural de molecule de imunoglobulin, omogene, identice din punct de vedere biochimic (monoclonale), este mielomul multiplu (plasmocitomul), o afeciune tumoral malign, iniiat n mduva osoas i rezultat prin proliferarea unui plasmablast. Plasmocitomul produce molecule de imunoglobuline identice din punct de vedere biochimic i al sarcinii electrice, denumite proteine de mielom, deoarece toate celulele tumorii sunt descendente ale unei singure celule productoare de anticorpi. Moleculele secretate de o tumor de mielom se numesc proteine M (Mielom) sau paraproteine i pot s reprezinte pn la 95% din totalul gamaglobulinelor plasmatice. Tumorile de mielom apar spontan cu o frecven mic la om, cine, cal, obolan, oarece sau se induc experimental la oarecii liniilor inbred NZB i BALB/c. Tumora este transplantabil n serie. Uneori, proteinele M au aceiai secven de aminoacizi ca i imunoglobulinele normale, dar adeseori, sinteza catenelor patologice este incomplet: lipsesc diferite secvene de aminoacizi, de diferite lungimi. Rareori, proteinele de mielom i pstreaz chiar proprietatea de a lega specific determinani antigenici cunoscui: de exemplu, 5% din proteinele M ale unei linii inbred de oarece, leag determinani antigenici ai suprafeei celulelor bacteriene enterice, ceea ce sugereaz c tumora i are originea n descendenii limfocitelor B, care prolifereaz ca rspuns la stimularea specific cu antigene ale microbiotei enterice. Tumorile de mielom, de cele mai multe ori, secret molecule incomplete sau fragmente de molecule imunoglobulinice.

n celulele tumorilor de mielom, rata sintezei catenelor H i L este dezechilibrat. De exemplu, mielomul Bence-Jones, sintetizeaz catenele L n mare exces. Proteinele Bence-Jones sunt dimeri de lanuri L (k sau ). Una din cele dou catene L are rolul catenei H i particip la formarea situsului de legare. Molecula patologic are activitate de anticorp fa de unele componente tisulare sau fa de antigene mici. Mielomul lanurilor grele sintetizeaz numai catenele H ale izotipurilor , sau , iar mielomul macroglobulinemiei Waldenstrom sintetizeaz molecule de IgM. Majoritatea mieloamelor produc proteine Bence-Jones. n laboratorul clinic, diagnosticul de mielom se pune dup detectarea n ser, prin electroforez, a unei cantiti mari de molecule ale unui izotip de imunoglobulin (circa 50 mg/ml). Proteinele de mielom precipit la 50-60o, la pH 4-6, se redizolv prin nclzire la 80-90 o i reprecipit prin rcire. La pacienii cu mielom, n special la cei cu macroglobulinemie Waldenstrom, vscozitatea sngelui crete mult, datorit cantitii excesive de proteine produse de mielom. Eliminarea proteinelor patologice se face prin procedeul plasmaferezei. Plasmafereza este tehnica de recoltare a unor volume mari de snge, urmat de reintroducerea n organism, a celulelor sanguine suspendate ntr-un nlocuitor de plasm.

Surse

artificiale

de

anticorpi

monoclonali.

Tehnologia

hibridomului

Metoda clasic de obinere a anticorpilor necesari studiilor clinice i de diagnostic, const n stimularea repetat, prin injectarea antigenului ntr-un organism cu reactivitate imunitar optim. Cnd titrul anticorpilor specifici este maxim, animalul este sngerat i se obine serul imun (antiserul), care este folosit n stare nativ sau este utilizat pentru purificarea anticorpilor. Metoda are cteva dezavantaje: - cantitatea i calitatea anticorpilor fa de un antigen variaz de la un organism la altul i chiar ntre sngerrile succesive ale aceluiai animal; - serul imun este un amestec foarte heterogen de molecule de anticorpi, chiar i n cazul n care imunizarea se face cu un antigen cu grad nalt de puritate; - orict de simplu ca structur molecular, un antigen are mai muli epitopi care stimuleaz mai multe clone de limfocite, ce produc anticorpi cu specificiti i afiniti diferite; - antigenele nalt purificate conin impuriti antigenice care induc sinteza anticorpilor specifici n cantiti disproporionat de mari; - chiar dup purificare proces costisitor antiserurile conin anticorpi cu afiniti diferite i cu reactivitate ncruciat.

Din aceste cauze, toate serurile imune sunt amestecuri de anticorpi policlonali, n cantiti variabile de la un organism la altul. Obinerea unor cantiti mari de anticorpi cu specificitate de legare fa de un epitop unic, prin metoda clasic este imposibil. Tehnologia modern de obinere a anticorpilor omogeni, denumit hibridoma (hibrid + mieloma) a fost propus de Khler i Milstein (1975), se bazeaz pe urmtoarele principii metodologice i teoretice: 1) Antigenul purificat se injecteaz animalelor de experien. 2) La momentul adecvat, din splin sau din ganglionii limfatici, se separ limfocitele. Fiecare limfocit i plasmocitele derivate sintetizeaz molecule omogene de anticorpi, cu specificitate unic de combinare pentru un singur epitop, denumii anticorpi monoclonali (AMC). 3) Limfocitele B triesc puin n afara organismului, iar plasmocitele care sintetizeaz cea mai mare cantitate de anticorpi, nu supravieuiesc in vitro i de aceea cultivarea sau clonarea lor nu este posibil. 4) Celulele de mielom sunt nemuritoare, datorit capacitii lor de a se menine un timp nelimitat n cultur. Fuziunea lor cu limfocitele B in vitro, le confer celor din urm proprietatea de nemurire, rezultnd o celul hibrid(hibridom), care sintetizeaz i secret anticorpi monoclonali (AMC). AMC sunt considerai ca varianta in vitro a proteinelor de mielom, pentru c n ambele cazuri, o clon de limfocite prolifereaz i secret anticorpi cu o anumit specificitate 5) Hibridomul productor de anticorpi motenete caracteristici att de la limfocit adic secret anticorpi cu specificitate fa de un antigen, ct i de la celula de mielom, adic este nemuritor. 6) Celulele hibridoma pot fi clonate individual i fiecare clon produce anticorpi specifici fa de un singur determinant antigenic. Ele pot fi meninute indefinit prin pasaje in vivo sau prin cultivare in vitro. Fig.91. Biotehnologia hibridomului de producere a anticorpilor monoclonali se bazeaz pe fuziunea limfocitului, cu celula tumoral de mielom de oarece. Antigenele membranare specifice ale celor dou celule, se distribuie n mozaic pe suprafaa celulei fuzionate heterocarion.

Etapele

obinerii

hibridomului

Metodologia obinerii unei linii celulare hibride, nemuritoare, productoare de AMC, parcurge mai multe etape. 1. Obinerea celulelor de mielom. Baza tehnologiei hibridomului a fost obinerea unei linii celulare mutante de mielom, care nu secret anticorpi i este deficient pentru hipoxantin-guanozinfosfo-ribozil-transferaz (HGPRT).

Mielomul (plasmocitomul) este rezultatul diviziunilor necontrolate ale unui singur plasmablast sau ale unui precursor al su din linia limfocitar B. Proliferarea necontrolat

este nsoit de sinteza unor cantiti mari de molecule omogene de imunoglobulin, cu proprieti biochimice uniforme. Moleculele sintetizate de tumorile de mielom se deosebesc de imunoglobulinele normale, prin aceea c nu prezint specificitate de legare cu antigenul.
Tumorile de mielom apar spontan la multe mamifere, iar la om, 1% din tumori sunt mieloame. Tumorile de mielom se induc experimental la mai multe linii de oarece (BALB/c i NZB), dup injectarea intraperitoneal a uleiurilor minerale, sau dup implantarea materialelor plastice, care produc o reacie inflamatorie cronic. Tumorile apar dup 120-130 de zile i se pot menine prin pasaje seriate la oareci din aceiai linie inbred sau prin cultivare in vitro i produc cantiti suficiente de imunoglobuline pentru analiza biochimic. Nu s-au obinut mieloame care s sintetizeze anticorpi cu specificitate de legare fa de un antigen. Hibridoamele se obin din linii speciale de mielom, care au dou particulariti mutaionale: - nu sintetizeaz propria molecul de imunoglobulin, astfel c celula hibrid va produce exclusiv molecule de imunoglobulin caracteristice limfocitului B normal; - sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, necesar sintezei acizilor nucleici. - Pentru hibridare sunt disponibile linii celulare de mielom de oarece, de obolan, de om, dar cea mai folosit este linia P3-X63-Ag8, izolat de la linia BALB/c, cu urmtoarele caracteristici: este HGPRT-; - este tumorigen pentru oarece; - are o frecven relativ nalt (1/105-106) de fuziune cu limfocitele de oarece; - nu sintetizeaz imunoglobulina proprie i nu represeaz genele pentru sinteza imunoglobulinei n hibridom; - are o eficien nalt de clonare in vitro. Deoarece sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, celulele sale nu detoxific efectul aminopterinei, care se adaug n mediul de cretere. Aminopterina, un antagonist al reductazei acidului folic, blocheaz calea sintezei ADN prin inhibiia sintezei purinelor (A, G) i a timidinei. In mediul cu aminopterin, celulele cu HGPRT- nu supravieuiesc. 2. Imunizarea. Obinerea unei populaii mari de limfocite B, prin fenomenul expansiunii clonale, angajate n sinteza anticorpilor specifici fa de un anumit epitop, se realizeaz prin imunizare. Antigenul stimuleaz mai multe clone de limfocite. Fiecare clon de limfocite activate, sintetizeaz anticorpi specifici fa de unul din epitopii antigenului. Procedura de imunizare (cantitatea de antigen, tipul de adjuvant, calea de administrare) este selectat empiric. Cea mai bun surs de limfocite rmne splina de oarece i de obolan, dar n special oarecele BALB/c, pentru c mielomul are aceiai origine i prin hibridare se evit incompatibilitatea CMH. Hibridoamele de obolan, obinute prin fuziunea limfocitelor splenice cu celule de mielom, sunt mai stabile i anticorpii pe care i sintetizeaz fixeaz complementul.

Cantitatea de antigen necesar pentru imunizare depinde de imunogenitatea acestuia. Antigenele celulare bacteriene sau ale celulei eucariote sunt foarte imunogene. Antigenele solubile (polipeptide, glucide, hormoni) sunt slab antigenice. Imunogenitatea lor crete dup cuplarea cu hemocianin de Limulus (KLH) sau cu albumina. Cea mai bun imunizare se obine prin injectare intravenoas sau intraperitoneal repetat, timp de cteva sptmni sau luni, a antigenului slab imunogen. Splina se recolteaz nainte de atingerea titrului maxim al anticorpilor serici. Blastele fuzioneaz mai uor dect celulele n repaus. O alternativ a imunizrii este stimularea limfocitelor in vitro, prin incubarea n prezena antigenului. 3. Fuziunea se realizeaz n scopul imortalizrii celulelor productoare de anticorpi i este esena biotehnologiei hibridomului. Scopul imortalizriieste pstrarea capacitii limfocitelor individuale de a secreta un singur tip de AMC, prin creterea nelimitat n timp, fr senescen, in vivo sau in vitro, ca o consecin a transformrii, indus cu celule de mielom. Limfocitele sau imortalizat pe trei ci: - prin fuziune cu celule tumorale de mielom - prin infecie cu un virus transformant ADN - prin transfecie cu ADN transformant din celulele maligne sau cu ADN al unui oncodnavirus. Cea mai utilizat metod de imortalizare este aceea a fuziunii cu o celul de mielom. Fuziunea limfocitelor viabile din splin, obinute prin dezagregare mecanic, cu celulele de mielom HGPRT- se realizeaz prin amestecul lor n proporie de 2-5 celule splenice/o celul de mielom. Procesul fuziunii este stimulat pe mai multe ci, dar cel mai adesea se folosete PEG cu gr. mol. de 4000 D. Amestecul de celule se menine 3 minute n 0,20-0,50 ml PEG 40%, la 37 0, pH 7,58,0. Frecvena fuziunii crete sub aciunea impulsurilor electrice scurte, de mare intensitate. Numrul i varietatea hibridoamelor obinute este mare, ceea ce impune selecia celor productoare de anticorpi cu specificitatea dorit. 4. Selecia celulelor de hibridom. Amestecul de fuziune conine celule splenice i celule de mielom nefuzionate, celule splenice fuzionate ntre ele, celule de mielom fuzionate ntre ele i celule hibridom, rezultate prin fuziunea splenocitelor cu celule de mielom. Selecia are ca scop, separarea celulelor de hibridom i eliminarea din amestec, a celorlalte tipuri celulare, nefuzionate sau fuzionate neutilizabile. In acest scop, amestecul de celule se cultiv pe mediul selectiv HAT (hipoxantin-aminopterin-timidin), n care splenocitele nefuzionate i fuzionaii splenocit x splenocit mor n 1-2 sptmni, copleite fiind numeric de celulele de hibridom, care se divid la fiecare 17-24 de ore. Mediul selectiv HAT permite supravieuirea numai a fuzionailor mielom x splenocit i este inhibitor pentru celulele de mielom, ca i pentru fuzionaii mielom x mielom. Aciunea sa selectiv se bazeaz pe urmtoarele condiii experimentale:

a) Aminopterina din mediul HAT blocheaz sinteza purinelor (A, G) pe calea inozinmonofosfatului i astfel blocheaz sinteza acizilor nucleici. In acest mediu, celulele HGPRT - devin dependente de surse externe de purine (A, G) i de timidin. Hipoxantina din mediul HAT poate fi convertit la inozin-monofosfat, de ctre enzima HGPRT i se formeaz adenozin-monofosfat i guanozin-monofosfat. Timidina poate fi fosforilat la timidin-monofosfat i timidin-trifosfat, de ctre enzima TK. Ambele enzime (HGPRT i TK) se gsesc n splenocitele normale. b) Celulele de mielom sunt HGPRT- i pe mediul selectiv HAT nu supravieuiesc nici celulele ca atare, nici fuzionaii mielom-mielom. Pe acest mediu supravieuiesc i se divid indefinit, celulele de hibridom, deoarece sunt HGPRT+ (codificat de genomul splenocitelor) i sunt nemuritoare, calitate conferit de celulele de mielom. 5. Clonarea. Clona este o populaie de celule identice, genetic stabile, derivate din diviziunea unei singure celule. Clonarea se face prin diseminarea suspensiei celulare diluate, pe medii nutritive agarizate. Fiecare celul de hibridom, prin diviziuni succesive, produce o colonie, adic o clon celular. Operaia de clonare se repet pentru a garanta o descenden omogen. Dintre sutele de hibridoame clonate, este necesar selectarea celor cu capacitate de sintez a anticorpilor specifici fa de antigenul cu care s-a fcut imunizarea. Fig.92. Ilustrarea schematic a etapelor producerii anticorpilor monoclonali (AMC). Animalele, de obicei oareci, sunt imunizate cu un antigen (de exemplu, un microorganism care conine 4 antigene de suprafa - a, b, c, d). Fiecare antigen conine un numr de epitopi, de exemplu molecula b conine epitopii b, b, b. Serul animalelor imunizate este policlonal i conine anticorpi A, B, B, B, C, D. Prima treapt n producerea AMC este obinerea suspensiilor de celule B i celule de mielom. In etapa urmtoare, cele dou populaii de celule (m i s) sunt puse n amestec, n prezena PEG, ca agent de fuziune. Suspensia se repartizeaz n godeurile unei plci pentru cultivarea celulelor, la o diluie adecvat astfel nct, fiecare godeu s nu conin mai mult dect o celul hibrid. Celulele se cultiv n mediu HAT pentru a inhiba creterea celulelor de mieloma nefuzionate. Celulele splenice nefuzionate nu se divid i mor dup cteva zile. In procesul de selecie mor i fuzionaii s - s i m - m. Supravieuiesc i prolifereaz fuzionaii am, bm, bm, dm i xm. Clonarea se repet. Hibridoamele se cultiv i se determin specificitatea anticorpilor sintetizai. Cele care sintetizeaz anticorpi cu specificitatea necesar se propag n recipiente mai mari n care se obin 1-10 l/ml. Celulele pot fi injectate n cavitatea peritoneal de oarece, unde se multiplic sub forma ascitei i produc 1 mg/ml anticorpi specifici.

Hibridoamele productoare de anticorpi cu specificitatea dorit, se cultiv in vitro, n culturi cu perfuzie continu cu mediu proaspt sau n bioreactoare cu capacitate mare. Cea mai simpl tehnic este a cultivrii in vivo i const n inocularea intraperitoneal a circa 2 x 10 celule hibridoma, la organisme ale aceleai linii genetice (pentru evitarea fenomenului de incompatibilitate CMH). Hibridomul se dezvolt intraabdominal i lichidul de ascit care o nsoete, conine anticorpi n proporie de 50% din totalul proteinelor sale.
6

Randamentul producerii AMC in vivo este de 100-1000 de ori mai mare dect in vitro. Anticorpii din lichidul ascitic se purific prin fracionare cu sulfat de amoniu sau prin metoda cromatografiei cu schimb de ioni.

Avantajele

biotehnologiei

hibridomului

Producerea AMC prin tehnologia hibridomului are un avantaj net fa de metoda convenional a obinerii serului imun, deoarece se pot obine anticorpi specifici produi de cte un hibridom, pentru fiecare epitop al unui antigen natural. Clonarea individual a fiecrui hibridom, creeaz condiii ca fiecare clon celular s secrete anticorpi cu specificitate unic fa de un singur epitop al unui antigen. Celulele de hibridom prolifereaz rapid, ceea ce scurteaz timpul necesar obinerii AMC. Hibridoamele produc cantiti foarte mari de anticorpi, ce depesc de cteva ori concentraia anticorpilor din serul animalelor imunizate. Clonele de hibridom se menin indefinit prin cultivare in vitro sau in vivo. Hibridomul ofer posibilitatea obinerii AMC marcai, prin adugarea precursorilor marcai radioactiv (marcare intern). Anticorpii marcai in situ (n timpul sintezei) ofer un avantaj net n raport cu anticorpii marcai dup purificare (marcare extern). Marcarea extern cu I 125 implic purificarea imunoglobulinelor din antiserul convenional, dar presupune modificarea chimic i denaturarea parial, cu pierderea proporional a specificitii de legare. Pentru marcarea intern se folosesc elemente radioactive cu perioada de njumtire mai lung dect a I125 : C14, S35, H3. Marcajul radioactiv intern este net superior celui cu peroxidaz i feritin, utilizat n tehnicile convenionale. Tehnologia hibridomului este un model experimental care poate fi extins i la alte categorii de celule care sintetizeaz substane utile (interferon, insulin). Obinerea unor hibrizi dintre celula de mielom de oarece i un limfocit normal, de la aceiai specie, n scopul producerii AMC, a introdus un concept nou n biologia molecular - conceptul imortalizrii funciilor specifice difereniate.

Aplicaii

practice

ale

AMC

AMC reprezint un reactiv imunochimic bine definit i de aceea, rezultatele obinute prin utilizarea lor sunt reproductibile. AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate n cercetare, n diagnosticul clinic, n farmacologie pentru profilaxia i terapia unor infecii la om i animale, n tehnicile de biochimie analitic pentru purificarea unor molecule. n domeniul cercetrii imunocitochimice*, AMC sunt reactivi cu nalt specificitate, utilizai pentru identificarea unor proteine care se gsesc n cantiti foarte mici. De exemplu, AMC marcai cu fluorescein permit evidenierea moleculelor membranare, inaccesibile investigaiei cu metodele

clasice. AMC au fost markeri eficieni pentru identificarea diferitelor subpopulaii de limfocite T i B, a antigenelor membranare ale celulelor seriei mieloide i monocitare. Sistemul CD ( cluster differentiation) este definit n ntregime pe baza utilizrii AMC i cuprinde acum peste 200 de markeri de suprafa. AMC cu specificitate CD se folosesc pentru a detecta apariia sau absena populaiilor celulare n timpul stimulrii antigenice. Fig. 93 Structura fluoresceinei.

Datorit specificitii lor de legare, AMC se folosesc pentru a evidenia diferenele antigenice minore ntre diferite variante moleculare. Astfel sau identificat variaiile compoziiei n aminoacizi ale spiculelor glicoproteice, consecutive driftului antigenic la virusul influenza A. AMC se folosesc pentru identificarea moleculelor neurotransmitoare, a receptorilor sinaptici i a enzimelor de biosintez. S-au obinut AMC fa de receptorul de acetilcolin, dar dificultile sunt mari pentru c neurotransmitorii sunt antigene slabe. n diagnosticul serologic, serurile imune obinute prin metoda clasic au avut adeseori inconvenientul major al lipsei reproductibilitii rezultatelor. AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate pentru diagnosticul rabiei pe seciunile de esut nervos al animalelor infectate, Anticorpul este marcat cu o molecul generatoare de semnal (de exemplu, un fluorocrom, o enzim productoare de culoare prin aciunea sa asupra substratului specific, ori o particul metalic). Sensibilitatea metodei, adic puterea semnalului poate fi mrit prin creterea raportului dintre molecula indicator (anticorpul marcat) i antigen. Imunocitochimia necesit producerea anticorpilor specifici i tratamentul adecvat al esuturilor, adic fixarea i histoprepararea pentru a favoriza interaciunea optim ntre reactiv i molecula int a hepatitelor virale B, C, D, a infeciei cu HIV (prin determinarea prezenei antigenelor n ser) i a unor infecii bacteriene. Pentru diagnostic se folosesc anticorpi marcai cu fluorescein sau metodele ELISA sau RIA. AMC se folosesc pentru diagnosticul neoplaziilor, pe baza evidenierii antigenelor specifictumorale. n acest scop se utilizeaz AMC marcai cu izotopi radioactivi, cu specificitate fa de CEA, AFP etc. AMC se folosesc pentru detectarea hormonilor polipeptidici: TSH, FSH, HCG. Hormonii sunt molecule cu un numr mic de epitopi. Subunitile ale diferiilor hormoni sunt foarte asemntoare, dar difer n special prin catenele . Exist AMC specifici pentru ambele subuniti i AMC care recunosc epitopii conformaionali ai moleculei native. AMC se folosesc n farmacologie. In scop profilactic se fac imunizri pasive fa de infeciile bacteriene care nu beneficiaz de preparate vaccinale i sunt rezistente la antibiotice: Pseudomonas, Clostridium. n scop terapeutic, AMC se folosesc pentru tratamentul rabiei, pentru neutralizarea endotoxinelor (LPS) produse de infeciile cu bacterii Gram negative, consecutive arsurilor. Septicemiile sunt cauzate de o larg varietate de bacterii Gram negative, toate avnd n comun lipidul A n structura chimic a LPS. Pentru tratamentul majoritii infeciilor bacteriene se utilizeaz antibiotice, la un pre de cost inferior n raport cu AMC.

AMC se folosesc n controlul fertilitii: AMC anti-HCG i anti-zona pelucida sunt folosii pentru imunizarea pasiv a femeilor fertile. Sperana utilizrii AMC n tratamentul tumorilor s-a nruit. Una din cauze este c majoritatea tumorilor umane i au originea n celulele epiteliale ale colonului, snului, plmnului i prostatei, iar oncogenele activate codific proteine intracelulare, inaccesibile terapiei cu AMC. Frecvena acestor tumori nu crete la persoanele imunosupresate, ceea ce este un argument n favoarea codificrii antigenelor intracelulare, inaccesibile sistemului imunitar. Chimioterapia ofer mult mai multe anse de succes, la un pre de cost inferior. n sistemul hematopoietic i imunitar, AMC se folosesc pentru a distruge toate populaiile celulare, cu excepia celulelor stem, cu scopul eliminrii celulelor malignizate i a precursorilor ei care poart oncogena activat. AMC se folosesc pentru neutralizarea nivelelor toxice ale unor medicamente (digoxina). AMC se folosesc ca ageni imunosupresori. Receptorilor de gref li se administreaz AMC specifici fa de complexul antigenic membranar CD 3, n cazurile n care imunosupresia chimic (cu ciclosporin) nu reuete. n maladiile autoimune, AMC se administreaz pentru a realiza o imunosupresie parial, care s permit aprarea fa de infeciile cu ageni oportuniti. AMC se folosesc pentru producerea imunotoxinelor (conjugate AMC-medicamente). Medicamentele utilizate sunt ageni citotoxici, care, prin intermediul situsului de legare a AMC, sunt destinate s se lege specific de celulele int(de exemplu, celulele maligne). In acest scop sunt necesari AMC cu o afinitate nalt a specificitii de legare fa de antigene specific tumorale. AMC se cupleaz cu toxine (difteric, ricin, abrin), cu medicamente citostatice sau cu radionuclizi. AMC se folosesc n tehnicile de biochimie analitic, n scopul purificrii proteinelor, sub forma coloanelor de afinitate imunoabsorbante. AMC sunt imobilizai pe suporturi n coloane solide (imunosorbeni), prin care este trecut amestecul de proteine. In coloan sunt reinute specific, moleculele care se leag cu AMC. Astfel se purific proteine care se gsesc n amestec, n concentraii foarte mici (IFN).

*Imunocitochimia este o tehnic de laborator care permite identificarea vizual a moleculelor int n esuturi i celule, prin interaciunea specific a anticorpilor marcai, cu antigenul.

MECANISME DE APRARE ANTIINFECIOAS

Sistemul imunitar a evoluat i s-a complexat structural i funcional, n condiiile presiunii selective permanente pe care o exercit agenii infecioi, ce tind s invadeze, s colonizeze i s se multiplice n esuturi. Structura sistemului imunitar este o reflectare direct a interaciunilor sale cu diversitatea agenilor infecioi care-l stimuleaz. Cele dou fore opozante s-au modelat reciproc, ntr-un conflict constant. Gazdele care nu neutralizeaz agentul infecios sunt sortite morii, iar cele care supravieuiesc sunt mai bine adaptate s reziste infeciilor ulterioare. Problema heterogenitii antigenice a virusurilor i bacteriilor patogene este important nu numai din punct de vedere teoretic, ci este esenial pentru aspectul practic al vaccinrii, deoarece exist riscul stimulrii rspunsului imun fr eficien protectoare. Consecina stimulrii unui rspuns imun ineficient poate fi agravarea maladiei infecioase sau chiar activarea mecanismelor patogenitii autoimune. Evaluarea imunogenitii moleculelor structurilor suprafeei virusurilor i bacteriilor este dificil, deoarece o molecul n soluie poate avea o alt configuraie a epitopilor dect n ansamblul structural nativ. Diferena deriv din raporturile sale spaiale cu moleculele vecine, pe suprafaa agentului infecios. Din aceast cauz, rspunsul imun al organismului, la stimularea cu un agent patogen, rmne un domeniu de studiu practic nelimitat. O alt complicaie este consecina faptului c specificitatea antigenic a unor molecule este, uneori, variabil de la o tulpin la alta, att la virusuri ct i la bacterii. Rspunsul imun trebuie s contracareze nu numai diversitatea antigenelor la care este expus, ci trebuie s gseasc soluia de rspuns, pentru variaia biochimic a unei structuri, la diferite tulpini de microorganisme. RSPUNSUL IMUN SPECIFIC ANTIINFECIOS Rspunsul imun antibacterian i antiviral are att o component humoral ct i una celular. Prevalena unuia sau altuia dintre cele dou compartimente este diferit n funcie de natura agentului infecios. De cele mai multe ori, predomin rspunsul imun mediat humoral, iar n cazuri mai rare (de exemplu, infecia cu M. tuberculosis sau cu M. leprae) este preponderent rspunsul imun mediat celular. Rspunsul imun fa de diferite antigene ale agenilor patogeni are grade variate de protecie antiinfecioas, n funcie de natura agentului, de gradul su de virulen i de natura rspunsului imun pe care-l iniiaz. Uneori, rspunsul imun antiinfecios este puin benefic pentru gazd sau este chiar detrimental, din diferite cauze: - rspunsul imun este orientat fa de componente moleculare neeseniale ale agentului infecios. Stimularea antigenic activeaz un rspuns imun ineficient. Anticorpii nu au efect

neutralizant al infeciozitii, pentru c structurile de care se leag specific nu constituie situsuri critice ale agentului patogen (de exemplu, anticorpii antiflagelari, care in vitro determin aglutinarea, in vivo au o eficien mai sczut, limitat la imobilizarea celulelor bacteriene); - rspunsul imun poate produce leziuni mai puternice i mai extinse dect nsui agentul infecios. Infecia propriu-zis produce leziuni minime, dar activarea imunitii mediate celular amplific leziunile tisulare i grbete evoluia procesului infecios (de exemplu, leziunile consecutive infeciei cu virusul corio-meningitei limfocitare la oarece i liza hepatocitelor infectate cu virusul hepatiei B umane). Componentele structurale antigenice ale unui agent infecios, care stimuleaz un rspuns imun protector se numesc situsuri critice sau structuri imunodominante. Un rspuns imun eficient (protector) trebuie s aib ca rezultat final, lezarea structurii peretelui bacterian, fungic sau a nveliului viral, prin aciunea combinat a anticorpilor i a proteinelor complementului. Structura antigenic a celulei bacteriene Multe molecule bacteriene moduleaz activitatea sistemului imunitar, avnd ori un efect stimulator (adjuvant), ori diminu reactivitatea imunitar. Ele modific rspunsul celulelor imunitare competente, prin mecanisme de semnalizare. De aceea se numesc molecule imunomodulatoare. Efectele lor realizeaz un echilibru complex ntre mecanismele de recunoatere i neutralizare a antigenelor i virulena bacterian. Imunomodulatorii pot avea efecte asupra limfocitelor T, B i asupra macrofagelor, similare cu cele produse de citochine. Imunomodulatorii cu activitate mitogenic, induc activarea policlonal a limfocitelor T i B, care se deosebete de activarea specific. Rezultatul este sinteza anticorpilor cu specificiti multiple, dintre care, o fracie sunt specifici fa de agentul infecios. Dei fr specificitate, sinteza rapid a anticorpilor poate fi suficient pentru stoparea infeciei. Moleculele imunomodulatoare modific nu numai reactivitatea imunitar, ci i mobilitatea celulelor, n special a fagocitelor (de exemplu, pot inhiba migrarea macrofagelor din focarul inflamator). Dac moleculele imunomodulatoare persist n esuturi, stimuleaz cronic sistemul imunitar, cu efecte patologice autoimune, cea mai cunoscut fiind artrita de adjuvant. Multe molecule imunomodulatoare de origine bacterian au efecte mai generale, care se extind asupra altor sisteme: ele produc febr, influeneaz sistemul de coagulare sanguin, concentraia ionilor, a Fe etc. Moleculele bacteriene cu rol imunomodulator sunt localizate pe suprafaa celulei. Ele sunt polimeri ai nveliului, dar i molecule excretate, cu efect toxic. Pe de alt parte, eficiena rspunsului imun antibacterian, depinde de raportul dintre reactivitatea sistemului imunitar i mecanismele de autoprotecie ale bacteriei, menite s devieze rspunsul imun. Din punct de vedere antigenic, bacteriile interacioneaz cu gazda prin modaliti diverse. La o extremitate sunt cele lipsite de atributul invazivitii, care produc cantiti mici de toxine, iar la cealalt, sunt bacteriile care cresc cu o rat nalt n esuturi sau n snge i produc septicemii. Unele bacterii prezint determinani antigenici asemntori ca structur chimic, moleculelor self ale organismului gazd. Rspunsul imun specific va fi absent ori

nesemnificativ, sau efectorii imunitari dau reacii ncruciate cu moleculele self. Alteori, suprafaa bacterian posed determinani antigenici de natur proteic sau polizaharidic, inductori ai rspunsului imun. Cele mai semnificative structuri bacteriene din punct de vedere antigenic sunt cele parietale: peptidoglicanul din peretele Gram pozitiv i Gram negativ, peptidoglicolipidele din peretele complex al micobacteriilor i structurile parietale ale spirochetelor. Toate tipurile structurale de perete conin murein (peptidoglican), dar se deosebesc prin alte numeroase componente chimice cu semnificaie antigenic. Unitatea minim a peptidoglicanului care pstreaz activitatea imunostimulatoare este N-acetil-muramil-L-alanina-D-izoglutamina ( muramil dipeptid- MDP). Att componenta glucidic ct i aminoacizii MDP au funcie imunomodulatoare. A II-a clas de polimeri imunomodulatori sunt acizii teichoici i lipoteichoici ai bacteriilor Gram pozitive. Proteinele de suprafa asociate peretelui celular au, uneori, semnificaie antigenic. Cea mai cunoscut este proteina M de la Str. pyogenes (grup A), care confer specificitate de tip. S-au identificat peste 80 de variante antigenice, cu rol de factor de virulen. Componentele antigenice eseniale ale membranei externe a bacteriilor Gram negative sunt lipopolizaharidele (LPS), a cror specificitate este conferit de polizaharidul O, o structur imunodominant care cuprinde pn la 40 de uniti glucidice. Numeroasele variaii structurale ale catenei glucidice determin existena unui numr corespunztor de variante antigenice bacteriene. LPS este componentul principal al bacteriilor Gram negative, activator al rspunsului imun nscut, prin componentul su lipidic. Termenii LPS i endotoxin sunt frecvent utilizai cu acelai sens. LPS trebuie s desemneze moleculele purificate, iar termenul de endotoxin semnific LPS i proteinele asociate din membrana extern, eliberate din suprafaa celulei. LPS sunt molecule amfifile, ceea ce condiioneaz interaciunea lor cu celulele organismului. Ele au o regiune hidrofob, capabil s stabileasc legturi cu lipidele membranare i o parte hidrofil, care poate rmne n faza apoas. O prim modalitate de interaciune este cea direct, dintre molecula amfifil i suprafaa celulei. Molecula LPS poate fi inserat n membrana celulei, prin jumtatea hidrofob sau se leag de receptorii membranari prin jumtatea hidrofil. A II-a modalitate de interaciune a moleculei LPS cu celulele este indirect, mediat de proteina care leag (binding) LPS (LBP). Molecula de LPS este recunoscut i legat de o glicoprotein plasmatic de 60 kD, din categoria proteinelor de faz acut. Este sintetizat de hepatocite i are un situs de legare pentru lipidul A. Polizaharidele capsulare ale unor bacterii patogene Gram pozitive i negative, libere n supernatant sau legate de perete, sunt foarte imunogene dac conin lipide sau proteine terminale. Variaia lor biochimic deriv nu numai din schimbarea ordinii unitilor glucidice componente, ci, n primul rnd, din posibilitatea legrii monozaharidelor de oricare din cei 6 atomi ai hexozei adiacente. Diferenele de secven a monozaharidelor genereaz determinani antigenici care nu reacioneaz ncruciat cu anticorpii specifici fa de un alt determinant cu aceiai compoziie.

Toxinele de natur proteic sunt imunogene i stimuleaz rspunsul imun cu efect protector. Peretele celular al micobacteriilor este foarte rezistent la aciunea factorilor litici. In alctuirea sa intr glicolipide, formate din resturi de acid micolic, legai covalent de resturile de arabino-galactan (lipoarabinogalactan) i arabinomanan (lipoarabinomanan). Complexul glicolipidic se leag de peptidoglican, prin puni fosfat. Membrana extern a spirochetelor este bogat n lipide i lipopeptide, stimulatoare ale rspunsului imun i ale reaciilor de hipersensibilitate. Bacteriile toxigene, lipsite de invazivitate ( C. diphteriae, C. tetani , clostridiile enterice) stimuleaz rspunsul imun humoral antitoxic. Bacteriile invazive determin infecii regionale sau generalizate (sistemice). Majoritatea se multiplic n spaiile extracelulare, unele au localizare facultativ intracelular, iar altele sunt obligat intracelulare. Bacterii cu localizare extracelular Bacterii facultativ intracelulare, Bacterii obligat intracelulare Mycobacterium Rickettsia tuberculosis Staphylococcus sp M. leprae Chlamydia Neisseria sp Brucella sp. Listeria Escherichia coli monocytogenes Klebsiella sp. Yersinia sp. Proteus sp. Salmonella typhi Pseudomonas sp. S. paratyphi Bacteroides fragilis Treponema pallidum Haemophilus influenzae Actinomyces sp. Streptococcus sp

Bacteriile cu localizare extracelular induc un rspuns imun mediat humoral . Activarea limfocitelor B este rezultatul cooperrilor celulare macrofag-limfocit B-limfocit Th. In focarul de inflamaie, bacteriile cu localizare extracelular determin formarea abcesului, n care predomin polimorfonuclearele Bacteriile cu localizare intracelular induc, preponderent, un rspuns imun mediat celular. Persistena lor n celulele fagocitare are ca rezultat final, formarea granulomului. Cele mai tipice pentru natura lor imunitar sunt granuloamele care se formeaz n infeciile cu M. tuberculosis i cu M. leprae. Mecanisme prin care microorganismele evit aprarea gazdei

Infeciozitatea microorganismelor patogene este dependent de capacitatea lor de a coloniza esuturile gazdei i de a contracara mecanismele de aprare ale gazdei. Capacitatea de variaie rapid a moleculelor de suprafa este o trstur evolutiv comun n tot spectrul patogenilor. Se cunosc exemple de bacterii patogene care au elaborat mecanisme ce permit variaia antigenic rapid i eficient. Moleculele de suprafa prezint regiuni bine conservate, ancorate n membran, dar nu sunt niciodat expuse contactului cu sistemul imunitar al gazdei. Rata nalt de mutaie produce un numr mare de variante antigenice. Astfel, n patogeneza gonoreii i meningitei, cauzate de Neisseria sp, rolul fimbriilor este esenial pentru ataarea de celulele epiteliale. Moleculele de fimbrilin evideniaz secvene constante, semivariabile i hipervariabile. Regiunile hipervariabile determin antigenitatea acestor structuri i tropismul fa de celulele epiteliale ale tractului urogenital uman. N. meningitidis este capsulat i numai fimbriile proemin dincolo de limitele stratului polizaharidic. De aceea, pierderea fimbriilor inhib proprietatea de aderen. Polizaharidul capsular este repelent pentru fagocite, deoarece celulele fagocitare nu au receptori pentru polizaharidele capsulare. Uneori, acestea sunt asemntoare oligozaharidelor din moleculele glicoproteice proprii organismului, ceea ce explic slaba lor imunogenitate. Tulpinile variante, necapsulate sunt mai puin virulente, dar au avantajul c nu sunt recunoscute de anticorpii specifici fa de antigenele capsulare. Absena capsulei, la Haemophilus influenzae, confer celulei o capacitate sporit de a se ataa i de a invada celulele epiteliale ale gazdei. La Str. pyogenes s-au identificat peste 80 de serotipuri diferite, ce rezult din mutaiile punctiforme ale genei ce codific proteina M, component a peretelui celular. LPS protejeaz fizic celula bacterian de aciunea complementului i a fagocitelor, constituind un strat protector, iar diversitatea glucidelor din oligozaharidul terminal, confer o variaie antigenic extrem de larg. La. S. typhimurium s-au identificat peste 2000 de variante antigenice, cu tot attea specificiti serologice. La spirocheta Borrelia hermsii (agentul febrei recurente, caracterizat prin crize febrile, separate de intervale asimptomatice), episoadele febrile semnific apariia i multiplicarea unei noi variante antigenice. Antigenul variant este o protein abundent a membranei externe (VMP = variable major protein). Unul dintre cele mai bine studiate exemple de variaie antigenic i rolul ei n infecie, este al tripanosomelor africane care produc boala somnului. T. brucei produce o parazitemie, care crete i descrete, deoarece genereaz subpopulaii care sunt variante antigenice ale unei glicoproteine specifice (VSG variant-specific glycoprotein) a suprafeei celulei. Undele de parazitemie constituie trstura principal a infeciei cronice, care persist pn cnd individul tratat se vindec, ori netratat, moare. In stadiile terminale, agentul patogen invadeaz alte esuturi i capacitatea de aprare este depit. n cursul infeciei, numrul mare de parazii, d natere la o subpopulaie care poart o VSG modificat biochimic i antigenic, ce scap controlului imediat al rspunsului imun. Ulterior, aceast variant nou este recunoscut de sistemul imunitar, dar generarea rapid a noilor VSG mpiedic eliminarea infeciei. Capacitatea parazitului de a se comuta la diferite VSG duce la epuizarea forelor de aprare ale gazdei n fazele terminale ale bolii.

Infecia cu Plasmodium falciparum este persistent, recurent i se caracterizeaz printr-un tablou foarte variabil al manifestrilor clinice. Imunitatea specific se dezvolt lent i numai dup infecii ample i repetate, se consolideaz un rspuns imun protector fa de infecia sever, dar este o imunitate incomplet i incapabil s sterilizeze organismul. In ariile geografice cu o rat nalt de transmitere a parazitului, apar complicaii severe, cu mortalitate crescut, la copiii sub 5 ani. Copiii care depesc 5 ani, au imunitate adecvat pentru a controla infecia. Starea de protecie persist tot restul vieii, n condiiile inoculrii continue a sporozoiilor de la narii infectai. Rspunsul imun fa de antigenele parazitului este mediat de anticorpi (IgG). La pacienii cu SIDA (care exacerbeaz dramatic evoluia tuberculozei sau infeciile oportuniste), malaria nu are o evoluie mai sever, ceea se nseamn c sinteza IgG este independent de celulele T. Eritrocitele infectate sunt ingerate de macrofage, independent de IFN. Diversitatea antigenic a tulpinilor de Plasmodium este argumentat de miniepidemiile de malarie sever, care apar n zonele endemice mari. Tulpinile mai virulente au proprieti antigenice i de citoaderen modificate. Diferenele proprietilor de aderen produc manifestri severe, inclusiv malarie cerebral, iar modificrile de antigenitate permit parazitului s persiste i s produc infecii repetate. Moleculele de suprafa ale eritrocitelor infectate cu P. falciparum prezint variaie antigenic, ceea ce condiioneaz citoaderena. Aderena eritrocitelor infectate, de esutul cerebral, renal sau hepatic, este cauza malariei severe. Generarea continu a diferitelor populaii variante antigenice de parazii, cu diferite specificiti de aderen, este cauza infeciilor persistente caracterizate prin unde de parazitemie i manifestri clinice specifice malariei. Diversitatea fenotipic corespunztoare variaiei antigenice este o strategie foarte eficient pentru adaptarea la presiunea selectiv pe care o exercit efectorii rspunsului imun i la diversitatea de particulariti structurale i funcionale ale esuturilor gazdei. Mecanismele de variaie sunt deosebit de importante pentru succesul diseminrii unei infecii n populaia gazd. RSPUNSUL IMUN N INFECIILE VIRALE Infeciile virale constituie, nc, o cauz major a morbiditii i mortalitii, dei vaccinarea a redus incidena infeciilor severe (polio, oreion, rujeol, rubeol) i a eradicat variola. Cunoaterea mecanismelor rspunsului imun antiviral este important pentru evaluarea problemelor clinice de fond (de exemplu, dinamica rspunsului imun) i pentru cutarea unor noi metode de obinere a vaccinurilor. Interaciunea virusurilor cu organismele, este modulat de sistemele de aprare nscute i dobndite. Pentru a se perpetua ntr-o populaie, virusul trebuie s fie virulent, dar suficient de flexibil n modularea virulenei, pentru a se pstra n populaia sensibil. In perspectiv evolutiv, interaciunea virusului cu organismul sensibil trebuie s confere superioritate virusului. Dac este prea virulent i nu poate fi controlat de imunitatea gazdei, rezultatul poate fi moartea i n final dispariia gazdei. Dac este lipsit de virulen, virusul va fi eliminat prea rapid de sistemul imunitar al gazdei i poate s dispar prin incapacitatea de a se perpetua.

Adeseori, virulena viral este diminuat prin mutaie i n acelai timp se selecteaz gazde mai bine adaptate imunitar, rezultnd un echilibru fluctuant, n care coexist att gazda ct i virusul. Proteinele virale, componente ale capsidei i peplosului, sunt imunogene i induc un rspuns imun intens n organismul infectat. Rspunsul imun antiviral este orientat att fa de antigenele exprimate pe suprafaa virionilor, ct i fa de antigenele prezentate pe suprafaa celulei infectate. Antigenele expuse pe suprafaa celulei infectate, difer n funcie de natura virusului (nud sau acoperit) i de mecanismul maturrii virionilor. Celulele infectate cu virusuri nude (adeno-, reo-, enterovirusuri) expun pe suprafaa lor proteine virale asociate cu moleculele CMH I, iar cele infectate cu virusuri nvelite, n special cu virusuri care se matureaz prin nmugurire la nivelul membranei, expun glicoproteinele peplosului, inserate n arii limitate ale membranei. In ambele cazuri, celula infectat devine inta mecanismelor de recunoatere imunitar. Antigenele expuse pe suprafaa virionului sau a celulei infectate, stimulatoare ale rspunsului imun, se numesc antigene protectoare. Antigenele intrinseci ale virionului, au rol protector nesemnificativ, deoarece nu vin n contact cu sistemul imunitar, dect n cazul n care se sintetizeaz n exces i se elimin din celula infectat. Antigenele virale libere sau asociate virionului, stimuleaz rspunsul imun humoral, iar cele prezentate pe suprafaa celulelor infectate, stimuleaz rspunsul imun celular. Activarea unuia sau altuia dintre compartimentele imunitii, depinde de mai muli factori: de tipul de infecie (primar sau secundar), de rezultatul interaciunii virus-celul (liz sau infecie persistent) etc. Virusurile care produc infecii acute, determin o competiie ntre replicarea viral i efectorii rspunsului imun. Rezultatul este nsntoirea sau moartea gazdei. Pentru virusurile care produc infecii cronice, scara de timp este mai lung. Virionii sau antigenele virale din snge sau din alte fluide, determin formarea complexelor Ag-Ac, cu manifestri patologice secundare. Alteori, anticorpii antivirali i celulele T activate, pot produce leziuni ale celulelor infectate. Majoritatea manifestrilor clinice care nsoesc infeciile virale cronice, sunt consecina rspunsului imun al gazdei, stimulat de antigenele virale. Rspunsul imun primar Mecanismele de aprare nespecific (interferonul, aciunea celulelor NK, rspunsul mucociliar) pot influena rezultatul infeciei. Dup infecia viral primar sau dup administrarea vaccinului inactivat, se stimuleaz rspunsul imun mediat celular(citotoxic) i humoral. Rspunsul humoral, cu sinteza anticorpilor, are o dinamic lent. In stadiul acut al infeciei, titrul anticorpilor specifici este abia detectabil, dar atinge valoarea maxim la 2-4 sptmni i persist sptmni sau luni, n funcie de gazd, virus etc. Pentru virusul febrei galbene i cel rujeolic, nivelul detectabil al anticorpilor persist tot restul vieii.

Dup infecia primar sau dup vaccinarea cu preparatul viral atenuat sau inactivat, se sintetizeaz anticorpi din clasele IgM, IgA i IgG. Sinteza anticorpilor este indus de marea majoritate a virusurilor, dar rolul protector al imunoglobulinelor este variabil de la un virus la altul, n funcie de sediul multiplicrii, care la rndul su condiioneaz manifestrile patologice ale infeciei. n funcie de mecanismul patogenezei, se disting trei tipuri de virusuri: - virusurile care infecteaz mucoasele tractului respirator i digestiv i rmn la poarta de intrare: rinovirusuri, influenza, parainfluenza, virusul respirator sinciial, enterovirusuri; - virusuri care infecteaz i se multiplic la nivelul mucoaselor, iar ulterior se disemineaz pe cale sanguin, limfatic sau axonal, pentru a infecta viscerele sau sistemul nervos central: virusul poliomielitei, rujeolic, al oreionului, herpes simplex, pox, virusul hepatitei A; - virusuri inoculate direct n snge, prin muctur, neptur, prin traume, iar de aici se rspndesc la organele int: HIV, virusul hepatitei B, virusul rabic, virusurile encefalitogene(alfai flavivirusuri). Rolul anticorpilor n imunitatea antiviral Cei mai importani anticorpi cu rol protector antiviral sunt cei care au specificitate de combinare fa de epitopii critici ai suprafeei virionilor. Legarea anticorpilor cu virionul se face dup modelul complementaritii spaiale ntre epitopii antigenelor suprafeei virale i situsul de combinare al anticorpilor. Efectul principal al interaciunii anticorpilor cu particulele virale, n faza fluid, este neutralizarea, adic pierderea infeciozitii virionilor. Pentru producerea efectului neutralizant, este necesar legarea mai multor molecule de anticorpi, care trebuie s recunoasc o structur esenial a virionului, denumit situs critic. De exemplu, fagii din seria T-par au un singur situs critic i infeciozitatea lor este anulat de legarea anticorpilor specifici la nivelul fibrelor cozii. Virionul gripal are situsuri critice multiple: anticorpii anti-HA sunt neutralizani, cei specifici anti-NA au efect neutralizant minim, iar anticorpii anti-protein M sunt total ineficieni. La adenovirusuri, situsurile critice sunt capsomerele hexonice i fibra pentonic . Anticorpii specifici fa de aceste structuri sunt neutralizani, iar anticorpii anti-penton nu diminu infeciozitatea. Pentru HIV, situsul critic este zona prin care virionul se ataeaz de moleculele CD4 ale limfocitului Th. Anticorpii specifici fa de situsul de legare al virusului Epstein-Barr de receptorul pentru C3b al limfocitului B, au efect neutralizant. Moleculele de anticorpi legate pe suprafaa virionului nvelit formeaz complexe, care, in vivo sau in vitro, iniiaz fixarea complementului. Rezultatul final este liza virionilor nvelii. Un alt efect al interaciunii anticorpilor cu virionii, in vitro, este agregarea. Fenomenul este dependent de un prag limit a densitii virionilor/unitate de volum. Agregarea virionilor este nsoit de diminuarea infeciozitii, deoarece chiar n cazul unui mare exces al moleculelor de anticorpi, unele particule virale din interiorul agregatului, rmn n afara contactului cu anticorpii neutralizani i i pstreaz infeciozitatea, denumit infeciozitate rezidual sau persistent. Agregarea viral fiind dependent de un prag al densitii

virionilor, este un fenomen care se manifest numai in vitro. In vivo nu se realizeaz niciodat o densitate limit a virionilor care s produc acest efect. Anticorpii antivirali ce se sintetizeaz n cursul rspunsului imun primar, au energie mic (afinitate) de legare cu situsurile antigenice ale virionilor i se disociaz uor, lsnd o infeciozitate rezidual. Alteori, moleculele de anticorpi nu acoper situsurile critice ale virionilor, care condiioneaz iniierea procesului infecios. Efectul protector al anticorpilor circulani este demonstrat pentru infeciile cu faz viremic, avnd o contribuie esenial la ncheierea procesului infecios. Anticorpii reduc ncrctura de virus i diminu infeciozitatea viral, consecina fiind scderea numrului de celule infectate, uurnd astfel sarcina celulelor Tc de a elimina celulele infectate. n cursul infeciei secundare, anticorpii se sintetizeaz rapid, la titru nalt. Anticorpii se folosesc pentru profilaxia i terapia infeciilor virale. Imunizarea pasiv cu ser imun, diminu riscul infeciei virale i se folosete n tratamentul infeciilor stabilizate. Protecia mucoaselor. La nivelul mucoaselor, imunitatea antiviral este dependent, n primul rnd de IgA. Sinteza local de anticorpi (n special IgA) dup stimularea viral este relativ independent de rspunsul imun sistemic. Anticorpii sintetizai la nivelul mucoaselor au efect protector, n absena anticorpilor sistemici. Anticorpii din secreiile mucoaselor ndeplinesc dou funcii majore fa de agenii patogeni virali: excluderea imun i neutralizarea infeciozitii virale. Excluderea imun este un mecanism protector foarte important la nivelul mucoasei respiratorii i pare a fi dependent nu numai de imunoglobuline, ci i de stratul de mucus care acoper epiteliul. Absena activitii ciliare este asociat cu infecii severe ale tractului superior, sugernd importana barierei mucoase. sIgA neutralizeaz infeciozitatea virionilor, iar secreia mucoas este n primul rnd o barier mecanic ce blocheaz adsorbia virionilor pe membrana celulelor epiteliale. IgA din secreii are rol esenial n rezistena la reinfecia cu virusurile care se multiplic exclusiv n celulele epiteliale ale mucoaselor digestive i respiratorii. Vaccinarea oral cu virus polio inactivat are ca scop stimularea imunitii mucoasei. Dac au titru crescut, anticorpii serici (IgM) difuzeaz n mucoase. Nu se tie n ce msur anticorpii din secreii sau din snge protejeaz epiteliul tractului respirator inferior. Fig. 94. Mecanismele protectoare ale mucoasei tractului respirator, fa de infecia viral. Dup inoculare, particulele virale sunt neutralizate (1) de anticorpi, care ajung la suprafaa mucoasei prin transport transepitelial (IgA polimeric), prin difuzie (IgG) sau prin administrare artificial (pictur spray, aerosol). Alt mecanism este excluderea imun (2) i se produce cnd particulele virale sunt legate de anticorpi, incluse n mucus i ndeprtate prin activitate mucociliar. Anticorpii pot difuza prin mucus pentru a neutraliza virusul progen i particulele care trec prin stratul de mucus. Neutralizarea viral poate s se produc intracelular (3), n timpul transportului intracelular al IgA polimeric. La suprafaa bazolateral a

celulelor epiteliale infectate, IgG se poate fixa specific de proteinele membranare codificate de virus i mediaz liza celulei (4) dup fixarea complementului sau prin fenomenul ADCC. Celulele infectate de virus pot fi lizate sub aciunea limfocitelor Tc specifice. Liza celulelor epiteliale uureaz trecerea efectorilor imunitari n ambele direcii (dup Weltzin, 1999). n tractul respirator inferior, n secreia mucoas, se gsesc concentraii mari de IgA i IgG. Anticorpii ajung n secreii, n mare parte, prin difuzia printre celule sau prin ruperi ale epiteliului. Dei vaccinurile gripale se administreaz parenteral, este clar c anticorpii din secreii (sIgA) au rol major n protecia antiinfecioas. sIgA confer o mai bun protecie ncruciat fa de variante antigenice rezultate prin drift antigenic, comparativ cu IgG circulant. Pentru antigenele virale expuse pe suprafaa celulelor infectate, studiile in vitro au evideniat c anticorpii antivirali i complementul se leag specific i pot s produc citoliza. Complementul poate acoperi complexul Ag-Ac, blocnd eventualii receptori disponibili. Complexele sunt fagocitate de celule care au receptori pentru C3. Complementul poate liza virionii nvelii. Retravirusurile sunt lizate de complement, chiar n absena anticorpilor. Complementul pare s aib rol n faza timpurie a infeciei, cnd titrul anticorpilor este foarte sczut i au afinitate mic. Proteinele complementului sunt importante ca mecanism efector humoral fa de infeciile bacteriene, dar rezistena celor cu deficit al complementului, fa de infeciile virale este normal. Imunizarea pasiv a mucoasei respiratorii poate fi folosit n scop profilactic sau terapuetic. Are avantajul c efectul protector este imediat, iar efectele colaterale sunt rare. Anticorpii sunt mai eficieni fa de infeciile virale, cnd se administreaz profilactic. Anticorpii administrai prin imunizare pasiv, n secreiile tractului respirator, pot s previn, s diminueze sau s vindece infecile virale. Imunizrile s-au fcut n special cu IgG pentru c este mai uor de obinut. IgA are avantajul de a fi polimeric i teoretic, are activitate aglutinant superioar fa de IgG i pentru c nu fixeaz complementul, probabil nu stimuleaz reaciile inflamatorii. Are o perioad de activitate mai lung, deoarece componenta secretoare (CS) l protejeaz de aciunea proteazelor. n concluzie, imunitatea mediat humoral reprezint modalitatea tactic, de neutralizare a virusurilor n faza extracelular. Anticorpii se sintetizeaz n rspunsul imun primar i secundar antiviral, dar activitatea lor protectoare este neesenial pentru controlul multor infecii primare sau secundare. Copiii cu agamaglobulinemie nscut de tip Bruton, nu au sensibilitate crescut fa de infeciile virale, cu excepia meningitei enterovirale, produs de echovirusurile 9 sau 11. Anticorpii sunt activi fa de antigenele virale din umorile organismului, dar nu penetreaz n celulele infectate.

Imunitatea antiviral mediat celular n ciclul infecios al multor virusuri, antigenele sunt expuse trziu pe suprafaa celulei. In aceste cazuri, rolul protector al anticorpilor este secundar. Imunitatea mediat celular (IMC) constituie mecanismul major al aprrii specifice antivirale. Dup infecia primar sau dup administrarea vaccinului viral atenuat, se activeaz rspunsul celulelor Tc, care are activitate maxim la 7-10 zile i scade la 2-3 sptmni dup infecie. Pentru controlul infeciei virale, celulele Tc sunt eseniale. La pacienii cu sindrom Di George (cu aplazie timic congenital), la pacienii SIDA, la cei leucemici sau la cei supui terapiei imunosupresoare prelungite, frecvena i severitatea infeciilor virale cresc semnificativ. Rolul IMC n protecia antiviral este elocvent n cazul infeciei cu virusul rujeolic. La copiii normali, infecia produce erupia tegumentar caracteristic i ulterior virusul este eliminat. La copiii cu deficien a celulelor T, boala este adeseori fatal. Manifestrile eruptive sunt mediate de celulele T i la copiii imunosupresai nu se produc. Apariia erupiei este indicatorul evoluiei favorabile. La copiii agamaglobulinemici, erupia se produce i evoluia infeciei este nealterat de absena anticorpilor. Se instaleaz imunitatea de memorie. IMC precede sinteza anticorpilor n toate infeciile virale, dar n special n cazul infeciilor citolitice n care virusul se multiplic rapid. IMC are rol important n aprarea fa de infeciile virale primare, deoarece se activeaz ntr-un timp scurt i rspunde nevoilor de aprare rapid fa de infeciile virale, nainte de edificarea rspunsului imun mediat humoral. In focarul inflamator indus de infecia viral se acumuleaz celule efectoare ale IMC, care ating valoarea maxim la dou zile de la nceputul replicrii virale. IMC se activeaz dup ce virusul a ptruns n celul i aceasta expune pe suprafaa ei, antigene virale. Efectul su este liza celulelor infectate i are rolul de a limita diseminarea virusului n mediul extracelular. Liza celulelelor infectate cu virusuri citocide este protectoare numai dac se produce rapid, nainte de asamblarea virionilor progeni. Liza tardiv are efect opus, deoarece favorizeaz diseminarea virusului. Pentru virusurile care produc infecii persistente, citoliza timpurie sau tardiv are efect protector. Fig. 95. Controlul infeciilor virale citocide i necitocide de ctre celulele Tc. Liza celulei infectate poate s se produc n faza de eclips, nainte de asamblarea virionilor maturi sau n faza de mijloc, cnd numai o parte a virionilor s-a asamblat. In ambele cazuri, liza este protectoare fa de infecia cu virusuri citocide i necitocide. In contrast, liza relativ trzie n timpul ciclului de replicare viral este protectoare numai fa de virusurile necitocide. Dac celulele Tc nu produc liza, celulele infectate pot s supravieuiasc i s elibereze virioni infecioi perioade lungi de timp. In cazul infeciei citocide, liza tardiv nu diminu diseminarea virusului, deoarece asamblarea s-a ncheiat i virionii vor fi eliberai prin citoliza produs de efectorii imunitar (dup Kagi, 1996).

IMC constituie modalitatea strategic de protecie antiviral, al crei efect este liza celulei nainte de ncheierea ciclului de replicare viral. Efectorii imunitii mediate celular detecteaz celulele a cror suprafa este modificat din punct de vedere antigenic (celule infectate cu virus, celule transformate malign, celule mbtrnite sau celule nonself). Orice protein structural a virionului sau existent numai n celula infectat (protein nestructural) poate fi prelucrat de celulele infectate sau de celulele accesorii ale rspunsului imun. Moleculele nonself prelucrate sunt asociate cu moleculele CMH I (sau CMH II) i sunt expuse pe suprafaa celulei. Complexele moleculare devin inte pentru aciunea limfocitelor Tc. Celula infectat este lizat sub aciunea factorilor litici eliberai de limfocitul Tc. Celulele Tc recunosc orice protein viral, structural sau nestructural, asociat cu moleculele CMH. Limfocitele Tc activate sunt specifice fa de virusul infectant. De exemplu, limfocitele Tc sensibilizate fa de virusul variolei, lizeaz numai celulele infectate cu acest virus. Nu lizeaz celulele normale i nici celule alogenice infectate cu virusul variolei. Zinckernagel i Doherty (1974) au demonstrat experimental specificitatea aciunii limfocitelor fa de antigenele virale, dar i fenomenul de limitare (restricie) a interaciunilor celulei efectoare cu celula int, de identitatea moleculelor CMH. Celulele care prezint antigenul i cele care l recunosc trebuie s fie histocompatibile, adic s poarte pe suprafaa lor, molecule CMH I i II identice. n infecia secundar, rspunsul celulelor Tc este rapid, mediat de celulele Tc de memorie. Celulele de memorie pot s persiste n absena antigenului specific, probabil datorit stimulrii sporadice nespecifice, de citochinele eliberate local n timpul reaciilor fa de antigenele nenrudite. Celulele NK nu au specificitate fa de antigen i nu produc memorie imunitar. Celulele NK se activeaz rapid i la 2-3 zile dup infecie ating activitatea maxim, dup care diminu rapid. Deficienele pentru celulele NK sunt rare, dar sunt nsoite de infecii severe cu virusul varicela zoster, cu virusul citomegalic, herpes simplex virus 1. Mecanismul interaciunii celulei NK cu celula infectat nu se cunoate. Celulele NK lizeaz celulele care au pierdut moleculele CMH i astfel au devenit anormale. Activitatea celulelor NK este stimulat de interferon. Celulele infectate cu virusuri pot fi lizate prin fenomenul ADCC (antibody dependent cell citoxicity), prin aciunea limfocitelor Tc sau NK. Ele lizeaz celulele tapetate cu anticorpi. Fagocitele mononucleare (monocitul sanguin, macrofagul tisular, celula dendritic) au rol important pentru eliminarea virusului dintr-un proces infecios. Fagocitele mononucleare fagociteaz virionii inoculai prin neptur. Macrofagele au i activitate ADCC. Mecanisme prin care celulele infectate evit efectorii rspunsului imun n mediul extern, virusurile sunt instabile, datorit sensibilitii la factorii de mediu. De aceea, pentru a se perpetua ntr-o populaie de organisme sensibile, virusul trebuie s rmn ct mai mult n gazda infectat, ori s se transmit ct mai eficient de la o gazd la alta. Pe de alt parte, efectorii rspunsului imun humoral i celular nu sunt totdeauna eficieni

n recunoaterea i eliminarea celulelor infectate cu virus, iar virusul eliberat din celul, trebuie s evite contactul cu efectorii rspunsului imun. n majoritatea infeciilor persistente, virusurile infecteaz celulele sistemului imunitar: virusul hepatitei B, papovavirus, herpes, virusul Epstein-Barr, virusul citomegalic, rubela, rujeola, oreion, influenza, parainfluenza, HTLV I, II, HIV, diminund potenialul reactiv al imunitii. O celul infectat care expune pe suprafaa ei un numr mic de situsuri antigenice poate s scape lizei, deoarece situsurile antigenice distanate nu permit legarea celor dou situsuri de combinare ale moleculei de anticorp, necesar activrii complementului. Celulele infectate persistent exprim o cantitate limitat de antigene virale pe suprafaa lor, comparativ cu celulele n care ciclul de replicare viral este litic. Acesta pare a fi mecanismul de supravieuire a celulelor infectate cu virusul coriomeningitei limfocitare (LCM), cu virusul rujeolei sau cu virusul hepatitei B. Antigenele virusului hepatitei B se sintetizeaz n mare exces i se elimin din hepatocite, sub forma unor particule fr genom. Se consider c excesul cantitativ de antigene virale determin fenomenul de toleran imunitar. Celulele infectate persistent manifest fenomenul de fluctuaie cantitativ a antigenului viral, expus pe suprafaa lor. Celulele infectate cu virusul rujeolic trec succesiv prin cicluri de dispariie i reapariie a antigenelor virale, asociate membranei citoplasmatice, n timp ce moleculele normale ale celulei nu au variaii cantitative semnificative. Fenomenul se numete modulaie antigenic. Anticorpii necitolitici pot masca antigenele virale expuse la suprafaa celulei, devenind astfel inaccesibile celulelor efectoare litice (limfocite Tc, NK). Uneori, virusurile infecteaz celule care nu exprim molecule CMH I. Neuronii exprim puin sau de loc moleculele CMH I i reprezint un situs preferenial al persistenei virale. Herpesvirusurile infecteaz latent neuronii, iar virusul rujeolic, virusul LCM i alfavirusurile pot infecta aceste celule. Adenovirusurile codific o protein de 19 kD, care se asociaz cu moleculele CMH I i blocheaz transportul lor spre suprafaa celulei i astfel celula infectat care nu exprim molecule CMH I nu este recunoscut de limfocitele T. Virusul influenza evit efectul neutralizant al anticorpilor specifici, prin rata nalt de mutaie a ARN-polimerazei, genernd noi variante biochimice ale hemaglutininei (HA) i ntro msur limitat, ale neuraminidazei (NA). Noile variante antigenice ale HA i NA trebuie s-i pstreze funcia, adic virionul trebuie s fie infecios, dar scap detectrii de anticorpii preexisteni. Fenomenul variaiei antigenice limitate se numete drift antigenic. Shiftul antigenic corespunde unei noi variante genetice a virusului influenza i este rezultatul unei reasortri a genomului, care are loc cel mai probabil la psri, unde se produce co-infecia cu un virus uman (ce infecteaz rareori psrile) i cu o linie de virus aviar. Virusurile contracareaz aciunea citochinelor. Virusurile sunt att inductori ai sintezei interferonilor (IFN), ct i inta principal a aciunii lor. Un virus care induce sinteza IFN i este foarte sensibil la aciunea sa inhibitorie nu se poate propaga. Evoluia a favorizat

virusurile care contracareaz efectele inhibitorii ale IFN asupra ciclului de replicare viral. Virusurile cu virulen nalt, inhib sinteza ARN celular i sinteza proteinelor (efect de ntrerupere), ceea ce interfer cu capacitatea celulei de a produce IFN i de a rspunde la aciunea lui. Multe virusuri sunt rezistente la aciunea IFN. Unele dezoxiribovirusuri codific proteine ce inhib cile majore de transducere a semnalelor induse de IFN. De exemplu, proteina E 1 a adenovirusurilor inhib semnalul indus de IFN , sau . Poxvirusurile codific sinteza unor receptori solubili pentru citochine (pentru TNF i IL-1), denumii virochine. TIPURILE DE IMUNITATE DOBNDIT (ADAPTATIV) Homeostazia organismului uman i animal este asigurat de sisteme complexe de aprare, ale cror particulariti funcionale au fost definite n primul rnd, n raport cu modul de aciune fa de agenii infecioi. Organismele dispun de dou categorii de mecanisme de aprare: - mecanisme de aprare specific, reprezentate de sistemul imunitar; - mecanisme de aprare nespecific sau nscut, adic cele care asigur rezistena sau imunitatea natural. Prin imunitate natural sau nscut se nelege rezistena unui organism fa de un agent infecios sau fa de un parazit, n absena unui rspuns imun evident. Cele dou sisteme de aprare, specific i nespecific, se condiioneaz reciproc. Nu se poate evalua gradul n care mecanismele de rezisten natural sunt influenate dup expunerea la contactul cu agenii infecioi, dar rspunsul imun detectabil sau chiar subliminal produce modificri ale strii de activitate a sistemului fagocitar mononuclear i a celulelor killer. Mecanismele de aprare antiinfecioas sunt att specifice (adaptative, dobndite) ct i nespecifice (nscute). Imunitatea dobndit are un caracter specific i se definete ca o stare de rezisten antiinfecioas, cu caracter individual, condiionat de contactul anterior al organismului, ntrun proces infecios natural, cu agentul infecios virulent, cu toxinele sale native sau cu agentul atenuat i anatoxinele sale administrate ca vaccin. Imunitatea dobndit, denumit i inductibil, este relativ, n sensul c, dei n general este foarte solid, poate fi nvins prin agresiunea exercitat de o cantitate mare de ageni infecioi sau de infecia cu o tulpin deosebit de virulent. n funcie de originea i modul de instalare, imunitatea dobndit este de dou tipuri: dobndit pe cale natural i pe cale artificial. In ambele cazuri, imunitatea poate fi dobndit att activ, prin rspunsul imun la stimulul antigenic, ct i pasiv, prin transferul de anticorpi exogeni.

Imunitatea dobndit natural activ se instaleaz dup trecerea organismului printr-o stare de infecie aparent (decelabil clinic) sau inaparent. Durata strii de imunitate este variabil. Trecerea prin unele infecii asigur o protecie specific pentru tot restul vieii (rujeola, variola, varicela, oreionul). Alte infecii (difteria, scarlatina, tusea convulsiv etc.) confer o protecie mai puin solid, astfel nct la o nou expunere(dup civa ani), organismul poate face din nou boala ntr-o form mai uoar dect prima mbolnvire. Imunitatea dobndit natural pasiv este rezultatul transferului transplacentar i prin secreia lactat, al anticorpilor de la mam la ft. Aceast form de imunitate este variabil din punct de vedere cantitativ i calitativ, n funcie de complexitatea structural a barierei placentare i diversitatea antigenelor la care a fost expus organismul matern. Trecerea imunoglobulinelor prin filtrul placentar depinde de structura placentei, adic de numrul de straturi celulare ce se interpun ntre circulaia matern i cea fetal. Tranzitul anticorpilor este restrictiv la speciile de bovine, cabaline, porcine, canine, care au placent de tip epiteliocorial, cu 4 straturi tisulare: endoteliul capilar matern, epiteliul corionic, esutul conjunctiv fetal, endoteliul capilar fetal. Nou-nscutul este protejat de imunoglobulinele din colostru. In primele 24 de ore, aparatul gastrointestinal este imatur din punct de vedere funcional i digestia proteic nu are loc. Imunoglobulinele din colostru rmn intacte i sunt transportate n mediul intern prin celulele epiteliului intestinal. Transferul placentar al imunoglobulinelor este foarte intens la speciile cu placent hemocorial (om, maimue, roztoare), la care stratul endoteliului capilar matern lipsete i sngele matern scald esutul placentar fetal. Nou-nscutul uman primete anticorpi materni i dup natere, prin colostrul bogat n imunoglobuline, provenite din circulaia matern. Imunitatea dobndit natural i pasiv asigur noului nscut o stare de nereceptivitate fa de agenii infecioi pentru care organismul matern este imun. Aceast imunitate scade treptat dup natere, pe msura catabolismului anticorpilor de origine matern, astfel nct, dup o perioad de 3-6 luni copilul devine sensibil fa de agenii infecioi. Imunitatea transplacentar explic raritatea maladiilor infecioase la copii, n primele luni de via. Imunitatea dobndit artificial activ Imunitatea dobndit artificial activ este consecutiv administrrii vaccinurilor. Denumirea de vaccin vine vine de la cuvntul latin vaca i semnific originea primului preparat pe care E. Jenner (1798) l-a utilizat pentru controlul variolei.

REACII IMUNITARE IN VIVO

De cele mai multe ori, n special n procesele infecioase, reaciile imunitare au o finalitate benefic, avnd un rol determinant n eliminarea agenilor patogeni. Uneori, dup contactul cu antigenele (n special moleculare), activarea funciei imunitare are rol prejudiciant, defavorabil asupra organismului, deoarece rspunsul imun se instituie drept cauz i mecanism pentru producerea diferitelor maladii (alergii, boli autoimune). Reaciile Ag-Ac in vivo, cu consecine defavorabile pentru organism, fac obiectul de studiu al unui domeniu bine conturat, denumit Imunopatologie. Activarea neadecvat a funciei imunitare determin dou categorii de manifestri clinice: a) strile de hipersensibilitate b) maladiile autoimune Diminuarea activitii sistemului imunitar, genereaz o categorie special de manifestri clinice, cunoscute sub denumirea generic de imunodeficiene. Ele pot fi nscute (primare) sau dobndite (secundare).

Imunopatologia studiaz reactivitatea funciei imunitare n strile neoplazice, reactivitatea consecutiv transplantului de esuturi i organe, n maladiile infecioase virale, bacteriene, fungice i n maladiile parazitare. 1. STRILE (REACIILE) DE HIPERSENSIBILITATE Strile de hipersensibilitate sunt reacii teriare, consecutive reaciilor Ag-Ac in vivo. Ele sunt o consecin a faptului c procesul de imunizare dup contactul primar cu antigenul i generarea efectorilor imunitari (anticorpi i limfocite efectoare) nu confer totdeauna o stare favorabil, de rezisten a organismului. Contactul primar cu antigenul creeaz, uneori, o stare de sensibilizare fa de antigenul respectiv. Sensibilizarea este o stare fiziologic duntoare organismului i se manifest, n special dup contactul organismului cu antigene proteice (din ou, din ser), cu antigenele din polen i mai rar dup contactul cu antigenele corpusculare (hematii de berbec). La contactul secundar cu antigenul sensibilizant, organismul rspunde prin strile patologice de hipersensibilitate. Strile de hipersensibilitate sunt consecina unui rspuns de intensitate prea mare sau a unui rspuns imun neadecvat, care st la originea leziunilor tisulare. Echivalentul termenului de hipersensibilitate, folosit n mod curent, este cel de alergie (allos, ergon = alt energie). Termenul de alergie a fost introdus de von Pirquet (1906) i semnific o reacie imunitar care se exprim cu energie diferit de cea normal, dup expunerea secundar la un antigen. Ambele denumiri se refer la o reactivitate imunitar de intensitate anormal crescut, fa de un antigen. In sens tiinific, noiunea de alergie include toate manifestrile care decurg din reactivitatea imunitar, cu o alt energie dect cea fiziologic: reaciile hiperergice, hipoergice i anergice. n mod curent, alergia se definete ca o stare de hipersensibilitate, ce rezult din expunerea la un alergen i se distinge prin supraproducia componentelor imunitare. Clasificarea strilor de hipersensibilitate Strile de hipersensibilitate au fost clasificate n raport cu promptitudinea cu care se manifest: - reaciile de hipersensibilitate imediat au o dinamic rapid. Se declaneaz n cteva secunde sau minute de la contactul secundar cu alergenul i diminu rapid, n cteva ore, fr semne vizibile, cu excepia celor foarte grave. esutul suport al reaciei este diferit de la o specie la alta. Aproape totdeauna va rezulta distrugerea celulei int. Reaciile imediate se desfoar n esuturi vascularizate i, de obicei, se manifest local, dar pot produce i efecte sistemice. Hipersensibilitatea imediat este cea mai rspndit dezordine imunitar la om. Este cea mai frecvent maladie cronic, ce afecteaz circa 25% din populaie n rile dezvoltate, cu severitate variabil, de la o simpl iritare, pn la periclitarea vieii; - reaciile de hipersensibilitate subacut sunt acelea care ncep s se manifeste dup 1-3 ore de la contactul secundar cu antigenul i nceteaz dup 10-15 ore. Sunt mediate de IgG sau IgM; - reaciile de hipersensibilitate ntrziat se evideniaz la 1-2 zile dup contactul secundar cu alergenul. Persist un interval de cteva zile, pn la cteva sptmni. Aceste reacii sunt mediate de limfocitele T i de macrofage. Nu sunt dependente de factori humorali circulani i de aceea se pot produce i ntr-un esut nevascularizat. Singura condiie este ca esutul s fie situat n apropiere de sistemul vascular, pentru ca limfocitele i macrofagele s poat migra spre locul unde a fost injectat antigenul. Reaciile de hipersensibilitate imediat i ntrziat se deosebesc prin urmtoarele trsturi: - mecanismul inducerii (humoral sau celular) - dinamica desfurrii n timp - particularitile manifestrilor patologice - posibilitatea combaterii. Gell i Coombs au definit 4 tipuri de reacii de hipersensibilitate: - reacii de tip I: reaciile de anafilaxie (anafilaxia generalizat, reaciile de anafilaxie local, denumite i stri atopice1 : astmul bronic alergic, febra de fn, urticaria, reacia Arthus, maladia serului). - reacii de tip II: reacii de citotoxicitate mediate de anticorpi - reacii de tip III: reaciile de hipersensibilitate induse de complexele imune - reacii de tip IV: reaciile de hipersensibilitate ntrziat, mediate de limfocitele T(reacia la tuberculin, brucelin, lepromin etc; dermatitele de contact, reacia de respingere a grefei). Reaciile de tip I, II i III sunt mediate de anticorpi, iar cele de tip IV sunt mediate de celule. Dovezi pentru natura imunitar a reaciilor de hipersensibiltate: - reaciile de hipersensibilitate necesit stimularea prealabil (sensibilizarea) organismului uman sau animal cu antigenul inductor (alergenul); - ntre momentul contactului cu doza sensibilizant i momentul administrrii dozei declanatoare este necesar o perioad de timp (5-10 zile), pentru sinteza efectorilor reaciei (anticorpi) sau pentru expansiunea clonelor de limfocite. Dup acest interval, organismul devine sensibil la declanarea strii de hipersensibilitate, numai la contactul cu acelai alergen care a creat starea de sensibilizare sau cu un antigen nrudit, care d reacie serologic ncruciat cu alergenul inductor. Intre antigenul sensibilizant, cel declanator i starea de hipersensibilitate este o relaie specific;

- organismele sensibilizate prezint un rspuns imun de tip humoral sau celular. Starea de hipersensibilitate este mediat de efectorii rspunsului imun; - reaciile de hipersensibilitate imediat se transfer prin ser de la un organism hipersensibil la unul sntos. Pentru ca reacia de hipersensibilitate s se manifeste, serul trebuie s se injecteze ntr-un esut vascularizat. Reaciile de hipersensibilitate ntrziat se transfer prin intermediul limfocitelor viabile. Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip I Reaciile de hipersensibilitate de tip I, denumite i reacii anafilactice au cea mai mare frecven i se manifest foarte diferit, att n ceea ce privete intensitatea, ct i a organului int al reactivitii.

Fig. 115. Reprezentare schematic a particularitilor de evoluie a celor patru tipuri de reacii de hipersensibilitate.

Declanatorii Antigenele care induc manifestrile reaciilor anafilactice se numesc alergene. Ele se gsesc n polenul unor plante, n praful de cas, n veninul insectelor sau n produse alimentare. Alergenele sunt un set de antigene, stimulatoare ale sintezei de IgE. Natura lor chimic este foarte heterogen. Un studiu german recent, relev c organismul uman vine n contact cu circa 14000 de substane chimice: unele sunt substane alimentare, altele sunt ingerate odat cu alimentele, fiind adugate n procesul industrial al prelucrrii. O categorie larg o formeaz substanele poluante. Din punct de vedere chimic, alergenele sunt glicoproteine i polizaharide de origine vegetal sau animal sau molecule mici, cu rol de haptene. Haptenele sunt molecule organice sau anorganice, cu greutate mic, insuficient pentru a fi antigene, dar devin alergene dup cuplarea lor cu macromoleculele tisulare. De cele mai multe ori, haptenele alergice sunt substane de uz farmaceutic, de 500-1000 D. Dup legarea covalent ireversibil cu proteinele serice, rezult un conjugat hapten-protein, cu specificitate antigenic modificat i adeseori alergic. Toate medicamentele n stare nativ, dar i derivaii lor de degradare parial pot s se comporte ca haptene i s devin alergene. Intensitatea reaciilor de hipersensibilitate este dependent de calea de ptrundere n organism, de doz, de frecvena expunerii i de caracteristicile moleculare ale alergenului. Cel mai adesea, alergenele se clasific n funcie de calea de ptrundere n organism. In raport cu calea de ptrundere a alergenelor, se disting: - alergene inhalate - alergene ingerate - alergene inoculate Alergenele inhalate sunt glicoproteine din polen, din fungi, din praful animalelor de cas. Greutatea molecular nu depete 50 kD, deoarece moleculele mai mari nu strbat membranele mucoase ale tractului respirator. Un alergen inhalat poate determina simptome respiratorii: rinit, astm. Crizele se produc numai n prezena alergenului. Unele alergene sunt sezoniere (polen), altele sunt perene (praful de cas). Polenul este, din punct de vedere cantitativ, cea mai important surs de alergene. Plantele din familiile Gramineae, Compozitae, Betulaceae, Fagaceae produc polen alergic. Toate polenurile alergice provin de la plante polenizate de vnt (anemofile). Ele produc cantiti mult mai mari de polen dect plantele entomofile i n perioada nfloririi l elibereaz n atmosfer. Alergenele din polen sunt glicoproteine nrudite chimic i dau reacii ncruciate. Serul imun de iepure, fa de un alergen din polen precipit o diversitate de alergene polenice. Sporii fungilor se gsesc n aer, n cantitate de circa 5 ori mai mare dect granulele de polen, dar produc mai puine stri alergice. In regiunile temperate, numrul sporilor fungici este maxim n timpul verii i scade n sezonul rece. Alergiile sunt produse de sporii a peste 80 de genuri de fungi: Alternaria, Penicillium, Aspergillus. Singura substan alergic de origine fungic, izolat n stare pur, este penicilina.

Cantitile de alergene care ptrund pe cale respiratorie, sunt foarte mici: sub 1 g/an.
Reaciile alergice la alergenele fungice apar la 30 de minute de la expunere, iar cele toxice, la 6-8 ore dup ingestie. Reaciile toxice nu au substrat imunologic. Micotoxinele au greutate molecular mic (sub 1 kD) i pot fi eliminate din extractele de alergene fungice, prin dializ.

Cele mai multe particule inhalate (mai mari de 10 m), ca de exemplu, polenul i sporii mari sunt depozitate n nazofaringe i sunt asociate cu manifestri locale, nazale i/sau oculare, denumite generic febr de fn. Particulele mai mici de 10 m (dar n special cele mai mici de 5 m) sunt

antrenate cu curentul de aer inspirat, n cile inferioare, unde reaciile alergice tind s se manifeste sub form de astm. Sporii fungici difer ca dimensiuni i determin reacii alergice ale tractului respirator superior i inferior.
Alergenele ingerate se gsesc n compoziia unor alimente: n ou, ciocolat, cpuni, ciree, uleiul de ficat de pete, n seminele de Glycine max (soia), n fina unor cereale (gru, orz), n seminele de Arachys hypogea (alun de pmnt) etc. La copii, laptele de vac i soia sunt cauzele majore ale reaciilor alergice, urmate de cereale, ou i pete. Vrsta manifestrilor este variabil: dup primele zile de via(fa de laptele de vac), pn la doi ani. La 90% din cazuri, intolerana dispare dup trei ani. Cele mai comune manifestri sunt voma, diareea, colicile abdominale, ce apar ntr-un interval variabil, de la cteva minute, pn la 1-2 ore dup ingestie. Alergia la laptele de vac i la pete este mai frecvent la populaiile care consum cantiti mari ale acestor produse. Alergenele alimentare traverseaz lumenul intestinal, la nivelul mucoaselor digestive. Bariera mucoasei gastrointestinale este expus la un grup heterogen de antigene. Experienele cu molecule marcate cu peroxidaz de hrean sau cu feritin, au evideniat c unele antigene intacte i fragmente de antigene particulate din tubul digestiv, dobndesc accesul la esuturile limfoide ale gazdei, n special la persoanele cu deficit al sintezei de IgA. Antigenele ce ajung n contact cu structurile limfoide ale mucoaselor, stimuleaz rspunsul imun al gazdei. Penetrarea antigenelor la nivelul tractului digestiv se face pe dou ci: - prin endocitoz de ctre celulele intestinale absorbante, la polul luminal. Se formeaz fagosomi, n interiorul crora se produce digestia materialului endocitat, dar cantiti mici rmn nedigerate i sunt exocitate n spaiul extracelular, la polul bazal. Strile de hipo- sau aclorhidrie favorizeaz tranzitul proteinelor prin mucoasa intestinal. - ptrunderea antigenelor alimentare la nivelul celulelor epiteliale M, ce acoper plcile Peyer, foarte numeroase n regiunea distal a intestinului subire. Aceste celule funcioneaz ca adevrate sonde de antigen, adic au capacitatea de a ngloba antigenele derivate n special din microorganisme i ntr-o msur mai mic, antigene de origine alimentar.

Celulele M reprezint un sistem de avertizare timpurie pentru sistemul imunitar al organismului. Ele sunt acoperite de un strat subire de mucus, au microvili scuri, dar au capacitatea de a endocita antigene luminale, prin mecanismul pinocitozei. Celulele M sunt difereniate, conin lizosomi i nu degradeaz antigenele pe care le pinociteaz, dar le transfer macrofagelor din foliculii subiaceni. Dei au evoluat ca o modalitate strategic protectoare fa de antigenele luminale, totui celulele M reprezint poarta de intrare pentru microorganismele patogene, care la acest nivel i dobndesc accesul la esuturile subiacente mucoasei. Studiile electrono-optice cu molecule marcate cu peroxidaz de hrean, au artat c acestea sunt transportate din lumenul intestinal i ajung n spaiul subiacent celulelor M, unde se gsesc limfocite i macrofage. Se stimuleaz astfel rspunsul imun local. Structurile limfoide asociate mucoaselor constituie prima barier de protecie fa de antigenele tractului digestiv. Uneori, cantitile relativ mari de antigene de origine bacterian i alimentar, nu sunt anihilate local, de structurile limfoide ale mucoaselor i trec n mediul intern, ajungnd la cea de a II-a barier major de protecie fa de antigene, care este ficatul. Circa 30% din numrul total de celule ale ficatului au capacitatea de a fagocita i epureaz sngele adus de vena port din teritoriul digestiv. Antigenele inoculate sunt proteine din veninul de insecte, n special Hymenoptere (albin, viespe), care conine 7-10 antigene. Alergenele din venin sunt diferite forme ale fosfolipazei A. Veninul de albin conine fosfataz acid, hialuronidaz, dopamin i norepinefrin i un peptid care produce degranularea mastocitelor. Serurile imune obinute pe diferite specii de animale (heteroantiseruri), dup injectare la om, adeseori activeaz rspunsul imun al organismului receptor. Muli diabetici tratai cu insulin de origine animal sau cu insulin sintetizat n celule reprogramate prin metodele ingineriei genice, sintetizeaz anticorpi anti-insulin. Agenii farmacologici, administrai n scop terapeutic sau diagnostic, pot cauza o varietate de dezordini imunitare, deoarece acioneaz ca haptene care se cupleaz cu diferite proteine tisulare,

conferindu-le imunogenitate. Legarea covalent a unui medicament ori a unui metabolit reactiv derivat prin metabolizarea lui, de o macromolecul, creeaz un conjugat hapten-macromolecul, inductoare a rspunsului imun specific. Legarea covalent a celor dou molecule se numete haptenare. Se descriu dou tipuri de haptenare:
- haptenarea direct a celulelor (a moleculelor membranare) i a moleculelor extracelulare, sub aciunea compuilor chimici cu reactivitate nativ (intrinsec). De exemplu, penicilinele de semisintez (benzil-penicilina, cefalosporinele), dar i alte medicamente se cupleaz cu diferite proteine serice, formnd conjugate cu funcie de alergene. Circa 10% din moleculele de penicilin injectat, se leag covalent prin gruparea NH2, de proteine plasmatice sau membranare. Celula poate lega mii de haptene -lactamice, n cteva minute dup tratament.

- haptenarea indirect a moleculelor membranare sau libere, cu derivaii rezultai din catabolizarea parial a unor molecule, care n stare nativ sunt puin reactive sau areactive. Metabolizarea are loc n hepatocite, cheratinocite (i n alte celule) i poate crea intermediari reactivi ce formeaz legturi covalente cu molecule carrier. Uneori, catabolismul medicamentelor este concomitent cu sinteza proteic. Se produce haptenarea moleculelor n cursul sintezei (haptenare intern) i pot fi expuse ca antigene pe suprafaa celulei.

a = inel -lactamic b = inel tiazolidinic

Dup fisiunea inelului -lactamic rezult gruparea peniciloil, principalul inductor al reaciilor anafilactice la om.
Metaboliii reactivi pot fi secretai n spaiul extracelular i se leag cu proteine extracelulare. Unii indivizi sunt predispui la reaciile alergice fa de diverse medicamente, n special antiinfecioase. Dac un individ manifest fenomene alergice fa de un compus antimicrobian, riscul alergiei fa de o alt clas de compui farmacologici crete de 9 ori. Circa 10% dintre aduli sunt alergici fa de o clas de compui i intr n categoria celor cu risc crescut fa de ali compui farmacologici. Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1, induse de medicamente, se manifest variat: anafilaxie, urticarie, angioedem. Unele substane pot produce mai mult de un tip de reacie, la un organism sensibil. De exemplu, penicilina poate cauza o reacie anafilactic de tip I, o anemie hemolitic datorat reaciei citotoxice de tip II, dezordini funcionale de tip III cu complexe imune sau o reacie de hipersensibilitate ntrziat. Reaciile de hipersensibilitate apar, de cele mai multe ori, n esuturile bogate n mastocite: tegument, mucoase, mucoasa lingual, plmn, tractul gastrointestinal. Dac reacia de hipersensibilitate imediat este localizat n mucoasa nazal i n conjunctiva ocular, simptomele includ rinoree, lcrimare, strnut, congestie nazal, creterea numrului eozinofilelor n snge. Titrul IgE seric poate s creasc sau s rmn sczut. Dac reacia de hipersensibilitate imediat este localizat n bronhii, manifestarea clinic este astmul alergic, caracterizat prin scurtarea i ngreunarea respiraiei. Mediatorii reaciei de hipersensibilitate imediat de tip I

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1 se datoreaz sintezei unor izotipuri de anticorpi cu proprieti particulare. Din punct de vedere funcional, anticorpii sunt convenionali i citofili. Anticorpii convenionali (Ig A, IgG, IgM) din ser se detecteaz in vitro, prin reacia de aglutinare, precipitare sau de fixare a complementului. In vivo, anticorpii convenionali se combin cu antigenul i l neutralizeaz. Reaciile de hipersensibilitate de tip 1 se datoreaz sintezei anticorpilor citofili, cu proprieti funcionale particulare. Anticorpii citofili au proprietatea de a se fixa pe suprafaa unor celule care au receptori pentru regiunea Fc i n primul rnd pe mastocite, dar i pe bazofile, eozinofile, macrofage. Nu produc reacii secundare de aglutinare, precipitare sau de fixare a complementului. Anticorpii citofili declanatori ai reaciilor de hipersensibilitate imediat se numesc reagine, deoarece produc modificri ale reactivitii tisulare: mresc permeabilitatea vascular prin intermediul histaminei, eliberat din mastocite. La om, reaginele majore sunt IgE i IgG 4. IgE este termolabil (se inactiveaz la 56o, timp de 30 de minute), iar IgG 4 este termostabil. Ambele izotipuri se sintetizeaz dup imunizri naturale. IgE nu traverseaz bariera placentar. Timpul de njumtire este de dou zile. Sinteza lor se face dup mecanismul clasic: dup ce alergenul vine n contact cu mucoasele (respiratorie sau digestiv), penetreaz pelicula de mucus i celulele epiteliale, este fagocitat de macrofage, prelucrat i prezentat n asociaie cu moleculele CMH II, limfocitelor Th. Limfocitele Th sintetizeaz IL-2 care produce expansiunea clonal a limfocitelor B. Sub aciunea stimulatoare a IL-2, limfocitele B se transform n plasmocite ce sintetizeaz IgE. La persoanele normale, sinteza IgE este supresat de limfocitele Ts, iar concentraia de IgE seric variaz ntre 17-450 ng/ml, adic 0,002% din totalul cantitii de imunoglobuline serice. La indivizii atopici (cu predispoziie genetic pentru manifestarea reaciilor alergice), dup contactul cu o doz mic de alergen, aproape totdeauna se sintetizeaz IgE, iar titrul seric crete de 1000 de ori. Nivelul seric crescut al IgE este o modalitate de diagnostic al strilor alergice, dar nivelul normal al IgE nu exclude starea alergic. IgE se sintetizeaz local, n structurile limfoide, la poarta de intrare a antigenului, n plasmocitele din corionul mucoasei. Excesul de IgE trece n circulaie i se leag pe receptorii pentru Fc de mare afinitate ai bazofilelor, neutrofilelor, ai celulelor endoteliului vascular, ai celulelor epiteliale alveolare pulmonare. Sngele transport IgE la masocitele tisulare din tot organismul. IgE fixat pe celule reprezint o proporie important din IgE total. Dei IgE liber (din ser) are timpul de njumtire de dou zile, IgE fixat pe suprafaa celulelor este foarte stabil. Mastocitele rmn sensibilizate luni de zile, datorit afinitii foarte nalte a receptorilor lor pentru Fc al IgE. n stare legat, IgE este protejat de atacul proteazelor.
Celulele mediatoare ale reaciilor de hipersensibilitate imediat sunt n primul rnd mastocitele i bazofilele. Bazofilele sunt celule circulante, dar pot ptrunde n focarul inflamator. Mastocitele sunt celule mononucleate i au dou localizri principale: - n esutul conjunctiv, n special n jurul vaselor sanguine din ficat, rinichi, splin; - n mucoasele digestive i cea respiratorie.

n creierul uman sunt dou surse de histamin: mastocitele i neuronii histamiergici. Mastocitele se gsesc n zonele cele mai vascularizate (eminena median, glanda pineal, meninge) i controleaz circulaia sngelui i permeabilitatea vaselor SNC. Neuronii histaminergici sunt limitai exclusiv la nivelul nucleului tuberomamilar din hipotalamusul posterior. Colateralele axonale se proiecteaz n toate zonele cortexului. Astfel, sistemul histaminergic central controleaz activitatea ntregului creier. Localizarea strategic a mastocitelor se coreleaz cu alterrile patologice care se produc la nivel vascular gastrointestinal, bronic, cutanat, cerebral, ocular. n citoplasma bazofilelor i mastocitelor, la microscopul electronic se observ granule electrono-dense, ce reprezint pn la 40% din volumul celular. Ele conin mediatori preformai, cei mai importani fiind aminele biogene (histamina i serotonina). Mastocitele conin histamin (amina tisular), detectat iniial n tegument. In vivo, histamina se sintetizeaz prin decarboxilarea histidinei, reacie catalizat de histidin-decarboxilaz (o enzim citoplasmatic) i este depozitat n granule. O celul uman conine 23 pg de histamin. Histamina este larg distribuit n esuturile organismului uman. La om, neuronii histaminergici ai SNC reprezint o surs nemastocitar de histamin. Histamina acioneaz asupra unei varieti largi de tipuri celulare: celule musculare netede, neuroni, celule endocrine, exocrine, celule sanguine, celulele sistemului imunitar. Efectele variate se produc prin receptori distinci: H 1, H2, H3. Serotonina (5-hidroxi-triptamina) se formeaz prin decarboxilarea moleculei de triptofan hidroxilat. Mastocitele umane nu conin serotonin. Serotonina s-a izolat iniial din ser (tonina din ser), deoarece are efect vasoconstrictor. Produce edem i are rol important n reaciile anafilactice.

Histidina Histamina Serotonina (5-hidroxi-triptamina) Mecanismul celular i molecular al reaciilor de hipersensibilitate imediat de tip I

Reaciile de hipersensibilitate imediat de tip 1 se desfoar n mai multe stadii. Faza I a este legarea anticorpilor citofili (IgE, care s-a sintetizat dup contactul primar cu antigenul), de receptorii pentru Fc ai mastocitelor locale. Ali factori activatori ai mastocitelor sunt:
- alergenul specific sau unul nrudit cu cel inductor al sintezei IgE; - diferite lectine - anticorpi anti-IgE, anticorpi anti-idiotipici, anticorpi anti-receptor Fc ;

Fig. 116. Activarea masto-citelor este mediat de legarea ncruciat a recep-torului Fc . Aceasta poate fi realizat de legarea antigenului de IgE fixat pe receptorii pentru Fc , de anticorpii bivaleni care recunosc determinanii izo-tipici ai regiunii Fc a IgE, de anticorpii anti-idiotipici ai regiunii Fab ai IgE, de anticorpii anti-receptor care se fixeaz direct pe recep-torul pentru Fc , de dimerii bivaleni de IgE obinui cu ageni chimici de polime-rizare sau de lectinele care se leag de resturile glu-cidice ale IgE. Antigenele i anticorpii monovaleni nu activeaz mastocitele, deoarece nu realizeaz legarea ncruciat a receptorilor (dup Roitt, 1993). - neuropeptide endogene, fapt care explic alergia determinat de stimularea sistemului nervos
- anafilatoxinele C3a i C5a

- peptidele bacteriene ce conin formil-metionin - ageni fizici (de exemplu, temperatura sczut) - diferite medicamente.

n faza a II-a se produce activarea mastocitelor i degranularea lor. Alergenul declanator trebuie s fie multivalent pentru a lega ncruciat dou molecule de IgE fixate pe celula efectoare. Dup legarea ncruciat a receptorilor pentru Fc , membrana granulelor fuzioneaz cu membrana citoplasmatic i elibereaz coninutul. Fig. 117. Ali stimuli activatori ai mastocitelor. Anafilatoxinele C3a, C5a sau substanele medica-mentoase (ionoforii de Ca2+, codeina, morfina, ACTH sintetic) activeaz mastocitele pe o cale direct. Toate aceste substane induc ptrun-derea Ca2+ n mastocit, declanatoare a fenome-nelor biochimice care duc la degranularea i eliberarea mediatorilor.

Eliberarea mediatorilor preformai - histamina - triptaza - activeaz C3 - heparina

Moleculele de IgE pot fi legate ncruciat de lectine (PHA, Con A), prin asocierea lor cu resturile glucidice ale regiunii Fc. Astfel se explic urticaria produs de cpuni i ciree, care conin cantiti mari de lectine. Stimulul activator al mastocitelor este transmis prin receptorii pentru IgE. Activarea se datoreaz legrii ncruciate a dou situsuri Fab, printr-o molecul de alergen. Mastocitele au i receptori pentru Fc , care leag IgG cu afinitate mult mai mic. Degranularea mastocitelor este precedat de influxul masiv de Ca2+. Granulele pline cu mediatori preformai, migreaz la periferia celulei, fuzioneaz cu membrana extern i elibereaz coninutul: histamina, proteaze neutre(triptaz, chimaz, carboxipeptidaz), proteoglicani (heparina, condroitin-sulfatul).

Fig. 118. Inducerea i mecanismele efectoare ale hipersensibilitii de tip I. Prelucrarea antigenului se face la nivelul mucoaselor. Reexpunerea la alergen declaneaz degranularea mastocitelor i producerea mediatorilor ce determin simptome alergice (dup Mirakian, 1998).
Triptaza (prezent n mastocite, dar absent n bazofile) produce constricia muchilor netezi ai bronhiilor, iar chimaza stimuleaz secreia mucoasei bronice. Proteoglicanii din granulele mastocitelor au rol n mpachetarea mediatorilor preformai n granule.

Heparina este proteoglicanul predominant n mastocitele pulmonare umane. Mastocitul este singura surs endogen de heparin la om i la roztoare. Heparina are efect anticoagulant. Mastocitele conin SOD i peroxidaz. Degranularea activeaz o lipaz care mobilizeaz acidul arachidonic din membrana mastocitului. Prin metabolizarea acestuia se sintetizeaz mediatori noi ai reaciei de hipersensibilitate imediat. Astfel, din acidul arachidonic, pe calea lipooxigenazei se sintetizeaz leucotriene, iar pe calea ciclooxigenazei se formeaz prostaglandine i tromboxan. Efectele mediatorilor mastocitari Manifestrile reaciilor alergice, inclusiv alergia respiratorie, pot s se produc n dou faze: faza timpurie, care se desfoar n cteva minute, datorit eliberrii mediatorilor preformai; faza tardiv se produce la 3-4 ore dup expunerea la alergen, datorit infiltratului celular, ca rspuns la mediatorii fazei timpurii. n prima etap, aciunea histaminei const n contracia muchilor netezi ai tractului respirator i digestiv. Histamina produce constricia celulelor endoteliale i crete permeabilitatea vaselor mici. Acelai efect l are serotonina. Prin constricia celulelor endoteliale i creterea permeabilitii capilare, se produce edemul tisular. n etapa a II-a, histamina produce dilatarea vaselor periferice i rezultatul este scderea brutal a tensiunii arteriale. ocul hipotensiv este una din manifestrile dramatice ale anafilaxiei generalizate. Ali mediatori ai fazei a II-a sunt chininele. Ele se formeaz din chininogenul plasmatic i sunt polipeptide mici: metionilchinina (Met-Lys-Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) bradichinina(Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) calidina (lisil-bradichinina): Lys-Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Chininogenul este alctuit din 11 aminoacizi i (acid sialic)n, la una sau la ambele extremiti. Este o -globulin (2 mg/ml ser). Chininele au efect vasodilatator i mresc permeabilitatea capilar, producnd edem. n faza a III-a se sintetizeaz ali mediatori, care ntrein n timp diferitele efecte iniiate de mediatorii eliberai din mastocite, prin efectul chimiotactic fa de celulele sanguine: ECF (eozinofil-chemotactic factor) determin afluxul de eozinofile NCF (neutrofil-chemotactic factor) PAF (factorul activator al plachetelor). Leucotrienele (LC4, LD4, LB4, LE4) determin contracia de durat a muchilor netezi, edem al mucoaselor i stimularea secreiei lor. Exemple de reacii de hipersensibilitate de tip I Prima reacie de hipersensibilitate imediat a fost descris de Prausnitz i Kustner. Reaciile de hipersensibilitate imediat pot s se produc la orice organism al unei specii i se numesc reacii anafilactice sau se manifest numai la anumii indivizi predispui genetic i se numesc atopii (stri atopice). Reaciile anafilactice (ana = opus; phylaxis = protecie) se caracterizeaz printr-o dinamic exploziv a manifestrilor, n decurs de 3-4 minute. Clinic, termenul de anafilaxie semnific sindromul care rezult din eliberarea unor mediatori preformai i generai de novo n mastocite, care determin o stare opus celei de protecie. Manifestrile clinice ale reaciilor de hipersensibilitate sunt dependente de calea de ptrundere a alergenului i de cantitatea de histamin eliberat. Reaciile cutanate medii, cu eritem, urticarie, prurit, dureri de cap, sunt asociate cu un nivel sczut al histaminei plasmatice (sub 1 ng/ml).

Dac alergenul este injectat intravenos, rspunsul este sistemic, adic are loc o anafilaxie generalizat, care poate duce la oc vascular hipotensiv i asfixie secundar prin constricie bronic i laringian. Dac sfritul nu este letal, recuperarea funcional se poate face ntr-o or. ocul vascular se datoreaz ieirii plasmei n spaiul extravascular, rezultnd scderea volumului sanguin. Scderea debitului cardiac duce la hipoxie i acidifierea mediului intern, antrennd i insuficiena respiratorie. Dac alergenul este injectat n piele, reacia este limitat la locul injeciei i se numete anafilaxie cutanat, nsoit de eritem (urticarie), angioedem, edem laringian, bronhoconstricie, hipotensiune, aritmie cardiac.

Anafilaxia generalizat (sistemic) este forma cea mai grav a hipersensibilitii imediate. Mult timp s-a considerat c anafilaxia generalizat este o manifestare patologic, indus numai n condiii experimentale la animalele de laborator. In realitate, att la om ct i la animale se produc ambele tipuri de reacii anafilactice, att generalizate, ct i locale. Prima reacie de anafilaxie generalizat a fost descris la cine. n 1902, Richt i Portier studiau biologia meduzelor i toxicitatea extractelor apoase i glicerinate din celenterate, asupra mamiferelor. Administrate n doze mari, extractele produc moartea imediat a cinelui, datorit ocului toxic, dar dozele mici sunt suportate. O injecie secundar la cteva sptmni mai trziu, produce o reacie anafilactic generalizat, cu paralizia muchilor respiratori i ocul fatal. Instalarea strii de oc este accelerat de injectarea intravenoas a dozei secundare. La autopsie se observ edemul mucoasei intestinale, a esutului pulmonar, congestia ficatului. La cobai, anafilaxia se induce prin injectarea intravenoas a unei doze mici (1mg) de albumin seric bovin. La 8 zile dup injectarea dozei sensibilizante, animalul devine sensibil la ocul anafilactic i are sensibilitate maxim la 21 de zile. Doza declanatoare a ocului este mai mare. Rspunsul anafilactic este prompt i manifestrile ncep n primele zeci de secunde: piloerecie dorsal, agitaie motorie, strnut, tuse zgomotoas, cianozarea mucoaselor, pierderea reflexelor de miciune i defecaie, blocaj respirator, convulsie, moarte. Tabloul acestor modificri patologice se succede n cteva minute. Muchii netezi bronici ai cobaiului sunt foarte sensibili la histamin i bronhoconstricia fatal este caracteristica anafilaxiei la aceast specie.
Reaciile anafilactice generalizate la om se manifest n primul rnd fa de alimente i se exteriorizeaz prin urticarie generalizat. Urticaria afecteaz 15-23% din populaie Suportul manifestrilor patologice care nsoesc aceste reacii, este tegumentul.

Anafilaxia generalizat la om, este declanat i de ali factori: penicilin, aloseruri, heteroseruri, veninul insectelor (albin, viespe) i se manifest prin urticarie generalizat, spasmul muchilor bronici, edem laringian, dispnee sever, cianoz, oc hipotensiv. Intensitatea manifestrilor este dependent de gradul de sensibilitate. Sensibilitatea alergic a pacienilor variaz n limita a circa 1/1000. Rspunsul sistemic cu reacii tegumentare generalizate, tulburri gastrointestinale, tahicardie, aritmie cardiac, hipotensiune medie, este asociat cu creterea concentraiei plasmatice a histaminei peste nivelul de baz. Reacia ampl care pericliteaz viaa, cu hipotensiune sever, fibrilaie ventricular, spasmul muchilor bronici, stop cardiac i respirator, este asociat cu nivelul crescut al histaminei, de 12 ng/ml. La om, histamina are efect vasodilatator asupra vaselor periferice, cu scderea presiunii vasculare. Hipersensibilitatea imediat la penicilin produce circa 500 decese/an/glob. Reacia este declanat de penicilina nativ sau de derivaii rezultai din degradarea ei (acidul peniciloic, acidul penicilenic). Anticorpii anti-penicilin aparin izotipurilor IgE i IgG4 i se gsesc chiar n serul persoanelor netratate cu penicilin. Probabil c sinteza lor a fost indus de penicilina din carne. Originea penicilinei este n masa micelian de la fabricile de antibiotice, care se adaug n hrana animalelor, ca stimulator al creterii. Alergenele inhalate produc manifestri locale, la poarta de intrare.

Reacii atopice. Termenul de atopie definete strile de hipersensibilitate imediat cu substrat ereditar, limitate la om. Strile atopice se manifest la 10-20% din populaie, sub forme variate. Reaciile atopice au un tablou clinic mai simplu i se produc atunci cnd reacia alergenului cu anticorpii specifici are loc pe suprafaa unei mucoase sau n epiteliul tegumentar. Rinita alergic sau febra de fn este forma cea mai simpl a atopiei i se manifest prin secreie abundent a glandelor epiteliului nazal, iar astmul bronic, prin contracia muchilor cilor respiratorii. Cele dou forme extreme de manifestri alergice sunt determinate de alergenele inhalate, care se gsesc n polen, n praful de cas(ce conine alergene de acarieni), n prul animalelor. Foarte rspndite sunt alergiile la polenul de Ambrozia, o plant care rspndete o cantitate mare de polen (100 kg/plant/an). Gruncioarele de polen vin n contact cu mucoasa nazal i respiratorie, cu conjunctiva ocular i determin o stare de sensibilizare a aparatului respirator. Reexpunerea la polen n sezonul urmtor, declaneaz reacia alergic, cu urmtoarele manifestri: eritemul conjunctivei oculare, edemul mucoasei nazale i secreia apoas abundent, strnut.
Intensitatea simptomelor depinde de nivelul cantitativ al expunerii la polen, dar i de reactivitatea organismului. Exist situaii grave, inexplicabile, cu crize ample, dup o expunere minimal. Dac rinita are caracter sezonier sau este dependent de condiiile de mediu, aproape sigur are caracter alergic. Rinita alergic peren se datoreaz contactului cu praful de cas i de animale. Mecanismul rinitei alergice este diferit de al altor manifestri alergice. In primul rnd, exist diferene funcionale ntre mastocitele mucoaselor i ale esutului conjunctiv. Mastocitele mucoasei nazale(denumite MC T) conin histamin i triptaz, iar dup stimularea alergenic, se degranuleaz, dar concentraia plasmatic a histaminei nu se modific. Mediatorii mastocitari produc o hiperemie a mucoasei nazale, edem i transudarea lichid. Inflamaia nazal se datoreaz transudrii, n care albumina este un marker mult mai stabil dect mediatorii din categoria citochinelor.

Fig. 119. Mecanismul rinitei alergice (dup Frankland, 1998).

n al II-lea rnd, manifestrile rinitei sunt dependente de particularitile unice ale vascularizaiei nazale, conferite de esutul venos erectil. Variaiile volumului sanguin din esutul venos erectil regleaz rezistena tractului nazal la coloana de aer. Umplerea cu snge a acestui esut produce congestia mucoasei. Curgerea sngelui este controlat de fibrele nervoase vegetative. Inervaia simpatic este vasoconstrictoare i diminu fluxul sanguin, iar tonusul simpatic are activitate ciclic. De aceea, mucoasa nazal are o perioad de repaus la fiecare 2-4 ore, iar cile nazale se pot obtura alternativ.

Faza primar a rinitei (strnut, rinoree, obstrucie nazal) este dependent de histamina din mastocite, de leucotriene i prostaglandine, iar faza tardiv (obstrucie nazal ampl prin hiperreactivitate i anosmie) este dependent de bazofile. Astmul alergic, o variant complex a reaciilor atopice, este o maladie cronic inflamatorie a plmnului, cu o prevalen crescnd a morbiditii i mortalitii n ultimele dou decenii. Dei s-a considerat c este o boal a muchilor netezi ai cilor respiratorii, n ultima decad s-a acceptat c astmul este, n primul rnd, o boal inflamatorie. Structural, cile aeriene ale astmaticilor se caracterizeaz prin inflamaie cronic, cu infiltrarea intens a mucoasei bronice, cu limfocite, eozinofile i mastocite, cu descuamarea epiteliului, hiperplazia celulelor mucoase, ngroarea submucoasei. Aceste modificri se asociaz cu manifestrile clinice, care includ obstrucia cilor aeriene i hiperreactivitatea cilor aeriene. Astmul bronic alergic are determinism multifactorial, atopia (predispoziia genetic de a sintetiza IgE ca rspuns la aeroalergenele comune) fiind cel mai comun factor predispozant. Dup expuneri repetate la doze mici de alergene, indivizii atopici sintetizeaz IgE. Expunerea secundar la alergene iniiaz rspunsul imun humoral. Evenimentele reaciei alergice, consecutive expunerii la alergen, se desfoar n dou faze: faza timpurie, de ordinul minutelor, const n rspunsul bronhospastic i faza tardiv, de ordinul orelor, ce const n rspunsul inflamator.

Rspunsul rapid se caracterizeaz prin edemul mucoasei, creterea tonusului muchilor netezi i ngustarea cilor respiratorii, asociat cu degranularea mastocitelor. Manifestrile astmatice imediate sunt dependente de eliberarea histaminei din mastocite. Pacienii cu astm alergic au o concentraie de IgE de 6 ori mai mare dect astmaticii nealergici, ceea ce confirm relaia dintre concentraia IgE i starea patologic. Unii astmatici alergici dezvolt rspunsul de faz tardiv, la 3-6 ore dup stimularea cu alergenul, care, n absena terapiei, poate s persiste cteva zile. Rspunsul tardiv, este asociat cu migrarea eozinofilelor, dar i a neutrofilelor i limfocitelor din snge, n parenchimul pulmonar. Limfocitele TCD4 au rol esenial n patogeneza astmului. In plmnul astmatic, alergenul este nglobat, prelucrat i prezentat de macrofagul alveolar, de celulele epiteliale ale mucoasei i de celulele dendritice. Limfocitele Th-2 secret IL-4, 5, 6, 9, 10, 13, stimulatoare ale sintezei de IgE. Alergiile la alimente formeaz o categorie de stri atopice foarte comune la copii i se manifest fa de alergene din lapte, ou, ulei de pete, ciocolat, cpuni, ciree, portocale. Manifestrile reaciilor alergice la alimente pot fi locale sau generalizate.
Reaciile alergice locale se caracterizeaz prin erupii urticariene (pustule eritematoase) la nivelul mucoasei bucale, nsoite uneori de tulburri digestive (colici abdominale, diaree). La vrsta adult, subiecii vor manifesta reacii alergice respiratorii.

Nu toate urticariile tegumentare sunt determinate de reacii alergice. Urticaria neimun de contact poate fi declanat de ageni chimici (salicilai, sulfii, acidul benzoic, acidul sorbic, acidul nicotinic i esterii si din alimente, din guma de mestecat, din ampoane, din parfum, din unguente) sau de ageni fizici (traumatisme, frigul). Acetia stimuleaz eliberarea factorilor chimici inductori ai urticariei. Mecanismele ei nu se cunosc, dar efectele se manifest asupra endoteliului vascular. Simptomele sunt arsura, usturimea, pruritul, edemul i eritemul. Urticaria este acut sau cronic. Cea cronic se manifest prin apariia zilnic sau aproape zilnic a leziunilor tegumentare, pentru un interval de cel puin 6 sptmni, cauzat de stimuli fizici. n toate cazurile de urticarie, imun sau neimun, pe tegument apar leziuni eritematoase (macule) i edematoase, nsoite de prurit. Urticaria implic dermul superficial. Leziunea cutanat eruptiv este datorat creterii permeabilitii capilarelor i dilatrii venulelor. Plasma prsete patul vascular i determin formarea pustulei tegumentare pruriginoase, nconjurat de o zon de culoare roie intens. Lichidul veziculelor eruptive este infiltrat cu limfocite i PMNN. Erupia tegumentar dispare la 24-48 ore, fr urme n cazul reaciilor acute sau persist mai multe zile la cele cronice. n manifestrile cu angioedem, edemul se extinde subcutan sau submucos i leziunile pustulare sunt mai mari i pot s dureze 72 de ore. Se manifest la nivelul buzelor, limbii, pleoapelor, dar poate fi afectat orice zon corporal. Pseudoalergii. Simptomele clinice ale alergiilor (urticarie, rinit, astm, ocul anafilactic) apar adeseori din cauze nealergice. Numrul lor depete pe acela al alergiilor. Iat principalele cauze: - histamina se gsete n cantiti mari n unele alimente i activeaz mediatorii specifici ai reaciilor alergice; - histidina din alimente este precursorul histaminei;

- tiramina de origine alimentar determin dureri de cap pulsatile i hipertensiune; - feniletilamina produce migren; - benzoatul de origine alimentar i din acidul benzoic produce astm i rinit; - bisulfitul de sodiu, bioxidul de sulf i metabisulfiii (conservani) produc simptome ale tractului gastrointestinal, distrug vitaminele B, produc dureri de cap, astm; - glutamatul monosodic (agent de aromatizare) produce astm;
- coloranii alimentari (n special culoarea galben) produc astm i alte reacii alergice; - aspirina induce astm, urticarie, angioedem (Girard, 1998). Testarea strilor atopice Pentru prevenirea accidentelor provocate de reaciile de hipersensibilitate imediat, n clinic, nainte de administrarea unor medicamente, se testeaz eventualele manifestri de hipersensibilitate. O problem esenial pentru diagnosticul i tratamentul alergiilor, este gradul nalt de variabilitate biochimic a alergenelor, de la un lot la altul. Preparatele de alergene sunt foarte heterogene, iar cantitatea de alergen specific, din cele mai multe extracte comerciale, variaz de la cteva procente pn la 50% din proteina total. Extractele sunt amestecuri complexe, cu cantiti variabile de alergene majore, alergene minore i proteine irelevante. Extractele fungice conin proteine, glucide, enzime proteolitice, enzime glicolitice, n cantiti variabile. De aceea, efortul major s-a orientat n direcia clonrii alergenelor de importan clinic major. Majoritatea alergenelor s-a clonat i unele sunt disponibile la un nivel moderat sau chiar nalt de puritate. Disponibilitatea preparatelor antigenice omogene, cu puritate i activitate biologic definite, va avea un impact major asupra diagnosticului i probabil, asupra terapiei dezordinilor alergice. Multe alergene, n special cele de natur proteic, se prezint ntr-o multitudine de izoforme naturale. Ele sunt rezultatul variaiei alelice a numeroaselor proteine vegetale i fungice, foarte asemntoare ca secven a aminoacizilor, dar au proprieti distincte de combinare cu anticorpii sau de activare a clonelor de limfocite T specifice. Existena numeroaselor izoforme ale aceleiai molecule de alergen, este probabil, asociat cu grade diferite de recunoatere a epitopilor si, de ctre limfocitelor T i B i, ca o consecin, cu grade diferite de sensibilitate. Ca dovad, anticorpii de la diferii pacieni alergici, leag numai unele izoforme ale alergenului. Preparatele de alergene pentru diagnostic sunt heterogene i deriv din surse naturale care conin majoritatea sau toate izoformele de alergen. Inlocuirea acestor alergene cu cele clonate, pentru diagnostic, va rezolva unele probleme, dar va crea altele. Unii cercettori apreciaz c majoritatea indivizilor rspund la un numr limitat de epitopi ai oricrui alergen. De aceea se consider c un numr mic de alergene (circa 40) ar putea s fie suficiente pentru a identifica majoritatea indivizilor alergici. Testele cutanate constau n injectarea subcutan a alergenelor la diferite diluii. La organismul alergic, reacia de hipersensibilitate se manifest n cteva minute, prin apariia la locul injectrii, a unei reacii inflamatorii pruriginoase, nconjurat de o zon mai extins de eritem. Reacia de hipersensibilitate la proteinele salivei de nar are acelai aspect. Alergenul injectat (sau inoculat) se leag specific de IgE fixat pe mastocitele din piele. Mastocitele elibereaz histamina n cteva minute, cauznd edemul localizat, eritem (vasodilataie) i prurit. Leziunile locale ale reaciei de hipersensibilitate imediat se reproduc prin injectarea unei cantiti mici de histamin.

Determinarea cantitativ a IgE seric al pacientului, rmne cel mai bun criteriu de diagnostic. IgE se dozeaz prin metoda RIA: - alergenul (de exemplu, penicilina) se fixeaz pe suportul inert (dextran); - proba de ser de cercetat se pune n contact cu alergenul fixat pe suport. IgE din ser se fixeaz pe alergenul imobilizat; - se adaug ser imun de iepure, care conine IgG marcat radioactiv, anti-IgE uman; - se msoar indirect cantitatea de IgE fixat pe suport, prin msurarea cantitii de IgG radioactiv legat specific.

Combaterea strilor de hipersensibilitate imediat de tip I se face prin evitarea alergenelor, prin terapie medicamentoas i prin imunoterapie. Msurile de evitare a alergenelor sunt ideale pentru prevenirea reaciilor: evitarea alimentelor, medicamentelor, controlul prafului de cas, evitarea contactului cu animalele al cror praf este alergic, combaterea mucegaiului din ncperile locuite. Medicamentele antihistaminice au efect antagonic fa de histamin, deoarece intr n competiie cu receptorii pentru histamin ai celulelor int. Astfel, se poate bloca creterea permeabilitii vasculare, vasodilataia, contracia muchilor bronhiilor i ai mucoasei gastrointestinale. Rinita alergic necesit terapie antihistaminic local. Cromoglicatul de sodiu protejeaz pacienii astmatici. Teofilina(o metilxantin) relaxeaz muchii netezi bronici. Imunoterapia sau hiposensibilizarea const n administrarea planificat a alergenului la un pacient pentru a diminua sinteza IgE. Rinita alergic, astmul bronic i anafilaxia la veninul de insecte pot rspunde la aceast terapie. Alergenul este injectat sptmnal, n doze gradat crescnde. Dup o cretere iniial a IgE circulant, se produce declinul. Locul IgE este luat de IgG care fixeaz alergenul i-l mpiedic s stimuleze mastocitele, blocnd reacia alergic.

1 Atopia definete o stare de hipersensibilitate imediat local, ce se manifest la persoane cu predispoziie ereditar.

IMUNODEFICIENELE

Organismele imunodeficitare reprezint, din punct de vedere clinic, adevrate experiene ale naturii, care, alturi de studiile experimentale, au contribuit decisiv la fundamentarea concepiei actuale cu privire la organizarea i funcionarea sistemului imunitar. Analiza cazurilor clinice ale indivizilor imunodeficieni, a evideniat faptul c cele dou compartimente celulare ale sistemului limfoid sunt semiautonome, deoarece ntre ele exist multiple interdependene funcionale. Maladiile cu substrat imunitar (imunodeficienele) sunt heterogene, att n expresia lor imunologic-clinic, ct i n privina mecanismelor celulare i moleculare implicate. Imunodeficienele pot fi nscute (primare) sau dobndite (secundare) i se datoreaz mai multor cauze: - pot fi rezultatul unor defecte genetice intrinsece ale celulelor limfoide, care se manifest prin erori ale diferitelor trepte de maturare, care se succed de la celula stem pluripotent, pn la celula T matur i respectiv, pn la plasmocit. Deficiena poate fi datorat lipsei unor enzime eseniale pentru metabolismul celulei (de exemplu, metabolismul purinelor). Consecina este absena limfocitelor din organele limfoide i din circulaie; - alteori se produc deleii ale genelor care codific unele izotipuri de lan greu (H). Astfel, apar deficienele selective ale claselor de imunoglobuline; imunodeficienele se pot datora slabei dezvoltrii a mediului necesar diferenierii i maturrii celulelor limfoide (timus, GALT); - imunodeficienele pot fi rezultatul perturbrii mecanismelor reglatoare ale celulelor Th i Ts, care controleaz rspunsul imun mediat celular i humoral; - imunodeficienele pot surveni ca rezultat al catabolizrii imunoglobulinelor cu o rat excesiv, sau chiar datorit pierderii imunoglobulinelor din snge i din secreii, dei celulele limfoide i imunoglobulinele sunt normale sub aspect numeric i respectiv, cantitativ; Circa 50% din imunodeficiene se datoreaz sintezei deficitare a anticorpilor, 10% sunt imunodeficiene celulare, 20% sunt imunodeficiene combinate, 18% sunt deficiene ale fagocitelor i 2% sunt deficiene ale proteinelor complementului.

Imunodeficienele nnscute Imunodeficienele nnscute (primare) au fost descoperite de O. Bruton (1952), odat cu descrierea agamaglobulinemiei i hipogamaglobulinemiei infantile sex-lincat. Maladia afecteaz bieii i se transmite prin cromosomul X. Pacienii rmn asimptomatici n primele luni de via, deoarece n aceast perioad imunoglobulinele materne asigur protecia antiinfecioas. Dup vrsta de 5-6 luni, pacienii devin foarte sensibili la infeciile tegumentare cu bacterii piogene i la infecii ale tractului respirator cu streptococi, meningococi, H. influenzae. Pacienii sunt lipsii de reactivitatea imunitar mediat humoral. In esuturile limfoide lipsesc plasmocitele, iar foliculii limfoizi nu se formeaz nici dup stimularea antigenic repetat. La electroforez, serul pacienilor nu relev fracia gamaglobulinic. IgG are concentraia de 1/10 (1 mg/ml fa de 10 mg/ml), iar IgM are concentraia de 1/100 din valorile normale. Lipsete IgA, dar lipsesc i hemaglutininele i . n mod normal limfocitele B reprezint 5-18% din totalul limfocitelor circulante, dar la aceti pacieni, proporia lor este foarte mic (mai puin de 0,1%). Absena limfocitelor B mature se datoreaz defectelor de maturare, determinate de tirozin-kinaza nefuncional, codificat de gena mutant. Pacienii au reactivitate normal a imunitii mediate celular: testul hipersensibilitii ntrziate la tuberculin este pozitiv, resping alogregele, limiteaz infeciile virale, cu excepia hepatitei B (care evolueaz rapid spre ciroz) i a celor cu enterovirusuri. Limfocitele T au valori numerice normale. Vaccinurile virale atenuate sunt bine suportate i nu produc infecii clinice. Disgamaglobulinemiile selective se caracterizeaz prin incapacitatea sintezei unui anumit izotip imunoglobulinic. Se cunosc deficiene selective ale IgM, IgA sau ale IgM i IgA, IgA i IgG, IgM i IgG. Deficienele IgA se asociaz cu o frecven crescut a infeciilor tractului digestiv i respirator, iar deficienele sintezei IgG i IgM se nsoesc cu creterea sensibilitii fa de infeciile tegumentare cu bacterii piogene: Streptococcus, Staphylococcus. Agama-, hipogama- i disgamaglobulinemiile selective se amelioreaz net, prin administrarea intravenoas a gamaglobulinelor. Sindromul Di George este consecina hipoplaziei sau ageneziei timice. In cursul vieii embrionare se produce o perturbare a dezvoltrii structurilor derivate din perechile a 3-a i a 4-a de pungi faringiene. Agenezia timic este nsoit de absena paratiroidelor i de aceea, pacienii, iniial, prezint alte simptome: hipocalcemie, malformaii cardiace. Timusul este foarte redus ca dimensiuni sau chiar lipsete la 1/3 dintre pacieni. Adeseori, timusul exist sub forma glandelor ectopice. Imunitatea mediat humoral este normal, reflectat n valorile normale ale concentaiei imunoglobulinelor. Dac supravieuiesc, la civa ani, pacienii manifest sensibilitate nalt fa de infeciile virale, fa de bacteriile intracelulare sau fa de infecia fungic cu Pneumocystis carinii. Imunodeficiena sever combinat (SCID) se caracterizeaz prin deficitul ambelor compartimente ale imunitii, att celular, ct i cel humoral. Deficiena se datoreaz absenei celulelor stem de origine a limfocitelor. Lipsesc limfocitele T, B i granulocitele, datorit hipoplaziei generalizate a esutului reticular hematopoetic. Organele limfoide secundare sunt hipoplazice, iar timusul este absent. Lipsesc imunoglobulinele serice. Pentru restabilirea funciei imunitare se impune transplantul mduvei osoase.

Imunodeficienele dobndite

Imunodeficienele dobndite (secundare) cuprind diverse maladii, datorate unor cauze patologice care interfer direct sau indirect cu funcia imunitar. Imunodeficienele dobndite pot fi cauzate de hipercatabolismul imunoglobulinelor. Concentraiile serice ale imunoglobulinelor reflect raportul dintre rata sintezei i rata catabolismului acestor molecule. Creterea ratei catabolismului poate s conduc la o deficien selectiv a unei clase de imunoglobuline, ce se manifest prin hipoproteinemie. Imunodeficienele dobndite se pot datora pierderii excesive a imunoglobulinelor, la nivelul tractului urinar sau gastrointestnal. Pierderea urinar este consecina defectelor renale glomerulare, a unor disfuncii tubulare sau unor defecte combinate. Deficienele glomerulare sunt asociate cu pierderea proprietilor de sit ale endoteliului capilarelor glomerulare. Moleculele imunoglobulinice mici (IgG) trec n urin cu o rat superioar fa de moleculele mari (IgM). Totui, IgG 3 i IgG4 rmn normale, ceea ce sugereaz c, n afara greutii moleculare, sunt importani i ali factori care condiioneaz funcia filtrului renal. Nivelul seric al IgG scade, proporional cu gradul perturbrii funciei de sit a endoteliului glomerular, iar IgM rmne normal. A II-a cale major a pierderii majore a imunoglobulinelor este tractul gastrointestinal, la nivelul vaselor limfatice. Cele mai multe situaii patologice la acest nivel nu induc hipogamaglobulinemie, cu excepia limfangiectaziei intestinale. Aceasta se caracterizeaz prin dilatarea excesiv a canalelor limfatice i este nsoit de pierderea masiv de proteine i chiar a limfocitelor. Dilatarea vaselor limfatice este cauzat de obstrucia limfatic, datorit unei infecii (de exemplu, tuberculoza), unei maligniti (limfom) sau datorit creterii presiunii hidrostatice n insuficiena cardiac sever congestiv. Rata sintezei imunoglobulinelor este normal sau crescut, dar turnover-ul este rapid, datorit pierderii excesive a proteinelor la nivel intestinal. Imunodeficiene datorate micronutrienilor. Deficiena fierului creeaz condiii predispozante pentru candidoza mucocutanat cronic. Deficiena zincului supreseaz funcia celulelor T i predispune la infecii oportuniste. Seleniul este important pentru funcia celulelor T. Deficiena parial la copii, predispune la infecii. Imunodeficiene induse de medicamente. Cele mai multe medicamente citotoxice i imunosupresoare, utilizate n tratamentul malignitilor, al inflamaiilor i n imunosupresia pacienilor cu transplant de organe, deprim funcia imunitar celular i humoral, iar

neutropenia predispune la infecii cu bacterii Gram negative i la infecii fungice. Compuii steroidici utilizai n tratamentul maladiei reumatismale, ciclofosfamida i azatioprina, folosite n tratamentul neoplaziilor, dup administrare prelungit, deprim imunitatea mediat celular, dar i nivelul seric al imunoglobulinelor. Unele imunodeficiene sunt consecutive altor procese patologice, care interfer cu efectorii sistemului imunitar: deficiena renal sau hepatic are ca efect acumularea substanelor toxice n organism, cu efect supresor asupra reactivitii imunitare. Dezechilibrul endocrin, cu producerea n exces a cortizonului suprarenalian (n maladia Cushing) este asociat cu imunodeficiena. Cortizonul lizeaz limfocitele T i B circulante i diminu monocitele periferice. Strile neoplazice, n special cele care afecteaz sistemul imunocitar, monocitar sau granulocitar induc un deficit al funciei imunitare. In maladia Hodgkin neoplazia liniei monocitare a ganglionilor limfatici se instaleaz deficiena imunitii mediate celular, dar imunitatea humoral este normal. In alte maligniti, efectele neoplaziei asupra sistemului imunitar, nu s-au putut disocia de efectele provocate de caexie. Mielomul multiplu (tumor plasmocitar localizat n mduva osoas) este nsoit de scderea cantitativ sever a tuturor claselor de imunoglobuline normale i de aici, deficiene ample ale imunitii humorale, dar imunitatea celular rmne normal.

Imunodeficiena consecutiv infeciei cu HIV

Imunodeficiena consecutiv infeciei cu virusul HIV este, n esen, expresia incapacitii organismului uman de a neutraliza virionii, n timpul fazei acute a infeciei. Dup contactul primar cu antigenele HIV, organismul se apr prin mecanisme imunitare specifice. Se sintetizeaz anticorpi specifici, la un titru crescut. Testul ELISA pentru diagnosticul infeciei cu HIV se bazeaz pe detectarea anticorpilor anti-HIV. Titrul maxim al anticorpilor se coreleaz n timp, cu nivelul viremiei. Imunitatea mediat celular anti-HIV se detecteaz foarte timpuriu dup infecie i este dominat de numrul mare de limfocite TCD8, al cror numr crete de 10-20 de ori fa de valorile normale (200-600/l). Ele manifest activitate citotoxic specific anti-HIV i lizeaz limfocitele infectate, care expun pe suprafaa lor, proteinele env (SU i TM). Limfocitele TCD8 diminu viremia primar, att prin efect citotoxic direct asupra celulelor n care virusul se replic, ct i prin efect represor asupra replicrii virale, mediat de citochine. Celulele NK lizeaz celulele infectate prin mecanismul ADCC. Rspunsul imun primar, humoral i celular represeaz replicarea viral dup infecie. Dei foarte energic, rspunsul imun primar nu elimin complet virusul i nici celulele infectate. Organismul nu se sterilizeaz deoarece anticorpii specifici anti-HIV, produi n timpul infeciei primare, nu au activitate neutralizant optim. Anticorpii rspunsului imun primar, n esen, nu au efect protector, deoarece rspunsul imun este neadecvat, fie cantitativ, fie calitativ. O proporie important a virionilor nu este neutralizat, pstrndu-i infeciozitatea. Rmn de asemenea, multe celule infectate cu virus, n special n ganglionii limfatici, att limfocite ct i celule foliculare dendritice. Anticorpii neutralizani se detecteaz mai trziu, dup trecerea de la faza acut a infeciei, la faza cronic. Probabil c anticorpii neutralizani sunt specifici fa de epitopii care nu sunt expui pe virionii asamblai n cursul infeciei primare sau anticorpii rspunsului imun secundar sufer fenomenul maturrii de afinitate i se leag mai eficient de epitopi. Pe msur ce infecia progreseaz, anticorpii neutralizani sunt nlocuii cu anticorpi stimulatori (enhancing) ai infeciei. Anticorpii stimulatori favorizeaz infecia celulelor, prin intermediul receptorului pentu C3 sau pentru Fc. Ineficiena anticorpilor este explicat prin aceea c una din glicoproteinele de nveli al virionilor este foarte glicozilat (circa 24 de situsuri de glicozilare), pe o secven de 481 aminoacizi. Gruprile glucidice mascheaz epitopii antigenici i mpiedic neutralizarea virusului. Imunodeficiena grav este consecina direct a scderii dramatice a numrului de limfocite TCD4 circulante, de la circa 1000 la 100/l. Dac n stadiul preclinic, proporia limfocitelor productoare de virus este de 1/40, n stadiile avansate, proporia este 1/10. Cauza principal a scderii numrului de limfocite TCD4 este liza consecutiv infeciei cu HIV. Proteinele virale sintetizate n celul au efect toxic. Legarea HIV de membran i penetrarea n celul, este asociat cu creterea volumului celular. Celula pierde controlul influxului ionilor i al apei. Aceste modificri s-au reprodus in vitro cu glicoproteina 120 de HIV. Efectul toxic al glicoproteinelor virale este reversat de antagonitii canalelor de Ca2+, utilizai n clinic pentru a atenua anomaliile neurologice consecutive infeciei cu HIV. La pacienii infectai cu HIV, o proporie semnificativ de limfocite, dup stimularea cu antigenele virale, n loc s se activeze i s se divid, se sinucid prin apoptoz, adic prin activarea programului genetic al morii. O alt cauz a imunodeficienei o constituie anergia limfocitelor. Cele dou glicoproteine (120 i 41)rezult prin clivajul enzimatic al proteinei precursoare 160. Clivajul proteinei 160 este esenial pentru infeciozitatea viral. Glicoproteina 120 asociat necovalent cu gp 41pe suprafaa nveliului viral, este uor eliberat de pe suprafaa celulei i a nveliului. Glicoproteina 120 sintetizat n exces, se gsete liber(solubil) n snge i se leag de receptorul CD4, producnd perturbri ale reactivitii imunitare, prin blocarea reactivitii limfocitelor. Afinitatea interaciunii gp 120 cu CD 4 este conferit de resturile sale glucidice. Starea de anergie poate fi reversat sub aciunea stimulatoare a IL-2. Complexele imune gp 120-anti gp 120 s-au identificat pe suprafaa limfocitelor, la pacienii infectai cu HIV. HIV-1 infecteaz limfocitele TCD4, dar i monocitele, macrofagele, celulele dendritice, celulele Langerhans, celulele trofoblastice placentare, neuronii. Scderea ampl a numrului de limfocite TCD4, detectabil n testul transformrii blastice cu mitogene, anuleaz funcia lor reglatoare asupra funciei imunitare. Limfocitele viabile asigur persistena infeciei. Diminuarea sintezei IL-2 ncetinete proliferarea i

diferenierea limfocitelor Tc. In absena celulelor Tc activate, multiplicarea viral este necontrolat. Consecutiv scderii sintezei IL-2, diminu activitatea macrofagelor i a celulelor NK. La organismele infectate cu HIV, numrul limfocitelor B este normal, iar concentraia imunoglobulinelor este de circa 10 ori mai mare dect la persoanele sntoase. Explicaia creterii titrului anticorpilor este c, n absena limfocitelor TCD 4, celulele Ts nu-i ndeplinesc rolul fiziologic de a supresa activarea limfocitelor B, diferenierea lor i sinteza Ig. Limfocitele B se activeaz nespecific, policlonal. Se sintetizeaz anticorpi la un titru crescut, dar nu au specificitate anti-HIV i nu sunt protectori nici fa de ali ageni patogeni sau potenial patogeni. Dat fiind specificitatea interaciunii gp 120 cu receptorul limfocitar CD 4, s-a ncercat utilizarea CD4 solubil ca agent imunoterapeutic. Tulpinile virale de laborator au fost neutralizate eficient de preparatele CD 4, dar izolatele primare de HIV-1 sunt relativ rezistente. Absena neutralizrii infeciozitii s-a atribuit mecanismelor complexe de intrare a virusului n celul. CD 4 solubil stimuleaz eliberarea gp 120 din nveliul viral, ceea ce determin creterea infeciozitii. Grupurile cu risc major de mbolnvire sunt cele ale homosexualilor i ale consumatorilor de droguri. Virusul se transmite i pe cale heterosexual, mai ales la femei, care transmit infecia ftului.

IMUNOLOGIE TUMORAL

Dup malignizare, membrana citoplasmatic este cea mai modificat structur celular. Semnalele reglatoare de control al creterii i multiplicrii, care acioneaz n primul rnd prin intermediul receptorilor membranari, nu-i mai gsesc inta structural. Incapacitatea celulelor de a recepiona semnalele reglatoare ale creterii i diviziunii sau de a rspunde adecvat acestor semnale, este cauza principal a comportamentului invaziv al celulelor maligne. Pierderea inhibiiei de contact este reflectarea modificrilor suprafeei celulare.
Adeseori, malignizarea este nsoit de sinteza unor molecule noi, localizate n oricare din compartimentele celulei i care se comport ca antigene tumorale. Orice structur chimic a celulei maligne, absent n sau pe celulele normale ale esutului de origine a tumorii, susceptibil de a induce o reacie imunitar la gazda primar sau dup injectare la o nou gazd, poate fi considerat ca antigen tumoral.

ANTIGENE TUMORALE

Se disting urmtoarele categorii de antigene tumorale: 1. Antigenele tumorale de difereniere, denumite i antigene oncofetale, deoarece se gsesc att pe suprafaa celulelor unor tumori, dar sunt prezente i n timpul unei faze de difereniere embrionar. Ele lipsesc pe suprafaa celulelor organismului adult sau se gsesc n cantiti foarte mici, nedectabile. a) Antigenul carcinoembrionar (CEA) s-a izolat din sngele unui pacient cu cancer de colon (1965). Este o glicoprotein de 180-200 kD, localizat pe membrana celulelor normale ale tractului digestiv la ft, dar se gsete n cantiti foarte mici la subiecii normali aduli.

La ft, CEA este sintetizat n celulele mucoasei gastro-intestinale i este concentrat n glicocalix, pe suprafaa luminal a acestor celule. In celulele embrionare normale, CEA pare a avea rol n aderena celular, dar probabil favorizeaz metastazarea celor maligne. CEA este un grup foarte heterogen de molecule, cu o cantitate foarte variabil de glucide. Raportul proteine/glucide variaz ntre 1/1 i 1/5. Componenta glucidic este reprezentat, n primul rnd, de acidul sialic. Imunogenitatea moleculei este conferit de componenta proteic. La adult, CEA se gsete n cantiti mici pe mucoasa colonului, n plmn, n esutul mamar, dar reapare n cantiti mari pe celulele maligne ale tractului digestiv uman (intestin subire, pancreas, ficat, stomac, colon, rect). CEA se gsete nu numai asociat suprafeei celulelor maligne, dar trece i n sngele a 60-80% dintre pacienii cu cancer de colon. Nu se cunoate mecanismul prin care CEA ajunge n snge. Din sngele pacienilor neoplazici, CEA sintetizat de celulele maligne, este epurat la nivelul ficatului. De aceea, cele mai mari concentraii de CEA apar la neoplazicii cu insuficien hepatic (metastaze hepatice, ciroze). CEA este un antigen nespecific, deoarece poate s apar, n concentraii mici (10 ng/ml), n sngele unor pacieni cu maladii nemaligne: la cei cu ciroz alcoolic a ficatului sau cu insuficien renal, astfel c sperana detectrii cancerului prin depistarea CEA n snge, s-a nruit. Leziunile de orice natur ale mucoasei tractului gastrointestinal sunt nsoite de creterea sintezei i secreiei CEA, care trece i n snge: n maladia inflamatorie a intestinului, n colita ulcerativ, polipi ai tractului digestiv, tumori ale tractului gastrointestinal. Unele tumori secret CEA, mai ales dup o metastazare hepatic (adenocarcinomul colonului, tumorile de pancreas, ficat, plmn). Nivelul CEA foarte crescut, reflect o evoluie rapid a tumorii. b) Alfafetoproteina (AFP) este o glicoprotein major a ftului timpuriu, o globulin normal (69 kD)a sngelui fetal uman i a celorlalte mamifere, descoperit n 1956. Coninutul glucidic este de 3,5%. Din punct de vedere structural, AFP este asemntoare albuminei. Genele codificatoare ale celor dou proteine au organizare similar. AFP se detecteaz n plasm la embrionul de 4 sptmni i crete rapid n primul trimestru de sarcin. Nivelul maxim (2-3 mg/ml) se gsete la ftul de 14 sptmni i scade la valorile caracteristice adultului, la vrsta de 6-10 luni. AFP se gsete nu numai n plasm, ci i n fluidele fetale: lichidul amniotic, lichidul cerebrospinal, urin. Cantiti mici de AFP (500 ng/ml) strbat placenta i se gsesc n serul femeilor gravide. n timpul vieii fetale, AFP se sintetizeaz n ficat, n celulele gastrointestinale. La adultul normal, concentraia sa este nedetectabil prin metodele imunochimice obinuite, dar crete n neoplaziile de carcinom hepatic. Circa 70% din cancerele hepatice primare sunt nsoite de creterea nivelului seric al AFP. AFP crete i n alte neoplazii: testiculare, ovariene. Nu toate hepatoamele i tumorile testiculare produc AFP, dar cele care sintetizeaz aceast glicoprotein, o produc n cantiti foarte mari. Creterea concentraiei AFP n snge nu este totdeauna asociat cu malignitatea: AFP crete n strile patologice de hepatit viral, hepatit cronic, ciroz, fapt ce reflect regenerarea celular.

AFP crete n maladiile inflamatorii ale intestinului: boala Crohn, colita ulcerativ. AFP este un marker util pentru depistarea cancerului hepatic la populaiile cu risc nalt (chinezi, japonezi, eschimoi din Alaska), dar este inutil pentru celelalte populaii, datorit creterii nivelului su n afeciuni nemaligne. n lichidul amniotic, nivelul crescut al AFP este asociat cu defecte ale tubului neural (spina bifida). 2. Antigenele de transplantare a tumorilor (TATA = tumor associated transplantation antigen). a) Antigenele specifice de organ se exprim la un nivel nalt pe celulele tumorale, n timp ce exprimarea lor pe celulele normale este foarte sczut sau este limitat la un anumit stadiu al dezvoltrii esutului. Antigenul specific prostatei (PSA) este fosfataza acid prostatic, o glicoprotein cu activitate proteolitic asupra gelului seminal, pe care-l hidrolizeaz. PSA se gsete n esutul prostatic normal, n adenomul benign i n carcinomul malign. Este produs de celulele acinare ale prostatei. n ser, PSA este legat cu 1-antichimiotripsina, ceea ce influeneaz valorile furnizate de determinarea sa cantitativ. PSA crete mult n cancerul prostatic, cel mai comun cancer la vrsta de peste 75 se ani, dar crete i n hipertrofia prostatic benign. Concentraia sa se coreleaz cu volumul prostatei, cu stadiul cancerului prostatic, cu rspunsul la terapie. Glicoproteinele mucinoase sunt antigene de suprafa celular, cu greutate molecular mare. Sunt formate dintr-o ax polipeptidic, de care se ataeaz numeroase catene oligozaharidice. Glucidele reprezint 60-80% din greutatea lor molecular. Sinteza glicoproteinelor mucinoase este consecina pierderii controlului metabolismului celulei neoplazice. Uneori, celula malign pierde capacitatea de sintez a unor glicoproteine de suprafa, ca de exemplu antigenul de grup sanguin A i sintetizeaz molecule absente n celulele normale. Glicoproteinele mucinoase se exprim pe suprafaa celulelor epiteliale i se detecteaz n ser, saliv, ori sunt adsorbite pe eritrocite. Ele s-au identificat odat cu disponibilitatea anticorpilor monoclonali: CA 15-3, CA 125, asociate cu cancerele ovariene, CA 19-9, identificat ntr-o tumor colorectal (CA = cancer associated). Modificarea cantitativ a glucidelor membranare poate modifica dramatic malignitatea, influennd potenialul de metastazare. Markerii tumorali imunoglobulinici se identific prin electroforeza serului sau a urinii. Aparin izotipurilor IgG, A, M, E sau sunt catene k sau libere. Aproximativ, 1% din aduli au proteine serice M (monoclonale), iar din acestea 25% au semnificaie nedeterminat. 50% din totalul proteinelor serice M sunt datorate mielomului multiplu. Determinarea proteinelor M n snge sau urin este util pentru monitorizarea rspunsului la terapie. b) Antigenele specifice fiecrei tumori sunt antigene individuale (TSTA = tumor specific transplantation antigen), proprii fiecrei tumori. Sunt exprimate numai n celulele tumorale i nu sunt niciodat detectabile n esuturile normale. Sunt caracteristice tumorilor induse chimic (L. Gross, 1953). Chiar tumorile multiple induse de acelai agent chimic (metilcolantren), n acelai esut (tegument) al unui organism, sunt diferite n ceea ce privete specificitatea antigenelor de

transplantare. Aceasta semnific faptul c informaia genetic declanatoare a malignizrii, rezid n gene diferite, care sufer mutaie sub aciunea agentului chimic. Fig. 131. Tumorile tegumentare induse de un agent chimic (de exemplu, metilcolantrenul) posed antigene tumorale strict individuale.

Toate celulele unei tumori induse de metilcolantren sunt identice din punct de vedere antigenic, fapt demonstrat experimental: oarecele imunizat cu mojarat de celule tumorale, respinge ulterior o gref de celule vii ale aceleiai tumori.
Datorit unicitii lor antigenice, fiecare tumor indus chimic, stimuleaz imunitatea fa de antigenele proprii, iar reaciile ncruciate sunt absente totdeauna. Antigenele tumorale specifice de transplantare sunt complexe glicoproteice sintetizate n celul i inserate n membrana citoplasmatic. Celulele maligne pot s prezinte simultan, att antigene tumorale comune, ct i antigene specifice. Tumorile care apar n mod natural sunt slab sau deloc antigenice. Nu se tie dac antigenele tumorale sunt prezente de la nceput pe toate celulele tumorale sau dac celula devine malign, fr s dobndeasc markerii distinctivi de malignitate. Antigenele tumorilor induse de ageni chimici pot fi stabile i se transmit de la o generaie celular la alta, dar majoritatea tumorilor induse de ageni chimici, trebuie considerate heterogene din punct de vedere antigenic, datorit instabilitii genetice. Antigenele suprafeei celulelor maligne sunt supuse modificrilor cantitative i calitative. La om, 90% din tumori sunt induse de ageni chimici. 3. Antigenele de origine viral sunt comune i se gsesc la toate tumorile induse de acelai virus, chiar la specii diferite. Antigenele tumorilor induse de oncodnavirusuri sunt codificate de programul timpuriu al informaiei genetice virale. De exemplu, virusurile polioma i SV 40 induc tumori la animalele de experien, iar virusul papiloma este implicat n geneza tumorilor de cervix uterin uman. Virusurile oncogene ADN induc sinteza antigenelor tumorale cu localizare nuclear i membranar. Sunt proteine nestructurale, care se disting de antigenele capsidei virale. In celulele transformate cu oncodnavirusuri, nu se detecteaz antigene capsidale, deoarece programul tardiv al genomului viral nu este transcris i virusul progen nu este asamblat. SV40 codific sinteza a dou proteine virale (antigene tumorale), de 94 i respectiv 17 kD, iar virusul polioma codific sinteza a trei antigene, de 100, 55 i respectiv de 22 kD. Antigenul T de 100 kD are o localizare aproape exclusiv nuclear i se sintetizeaz att n celulele infectate productiv, ct i n cele transformate. Antigenul de 55 kD este o protein fosforilat ce se asociaz cu oncoproteina Src, o chinaz tirozin-specific, codificat de protooncogena c-src. Interaciunea cu

antigenul viral produce o stimulare de circa 50 de ori a activitii chinazice a oncoproteinei celulare Src. Antigenele T sunt comune i pentru alte virusuri ale grupului. Toate tumorile induse de un virus, au antigene comune, chiar la specii diferite. Imunizarea organismului receptor de gref de esut tumoral cu celule tumorale iradiate sau cu mojarat de celule tumorale de acelai tip este protectoare fa de dezvoltarea tumorii transplantate. Antigenele T, codificate de oncodnavirusuri nu se gsesc n structura virionului (proteine nestructurale). De aceea, virionii inactivai nu imunizeaz i nu protejeaz organismul fa de suspensia de celule tumorale omologe (transformate de acelai virus). Antigenele tumorale codificate de oncornavirusuri sunt comune pentru toate tumorile induse de un virus, indiferent de specificitatea antigenic a celulei. Majoritatea sunt antigene proteice virale structurale, adic se regsesc n structura virionului, ceea ce le deosebete net de antigenele codificate de oncodnavirusuri. Antigenele tumorilor induse de oncornavirusuri sunt codificate de gena env i au specificitate de grup. Multiplicarea oncornavirusurilor nu interfer cu capacitatea celulelor de a crete i de a se divide. Deoarece antigenele tumorale sunt proteine structurale ale virionilor, imunizarea organismului cu o suspensie viral inactivat, confer protecie fa de celulele transformate de virusul omolog. Spre deosebire de antigenele induse chimic, care pot fi tari sau slabe, antigenele codificate de virusurile oncogene sunt foarte imunogene. La om, circa 10% din totalul tumorilor sunt cauzate de virusuri: - carcinomul hepatocelular (indus de virusul hepatitei B) - cancerul de col uterin (indus de papilomavirusuri HPV16, HPV18) - limfomul Burkitt i carcinomul nazofaringian (induse de virusul Epstein-Barr) - leucemia celulelor T mature (indus de HTLV-1). 4. Antigenele tumorale codificate de protooncogene. Mutaiile punctiforme ale oncogenelor genele ce regleaz creterea normal i diferenierea - i mutaiile genelor supresoare ale oncogenelor, ca de exemplu, p53 i Rb, produc substituii ale unui singur aminoacid n catena polipeptidic codificat, care le transform n antigene tumorale, codificate de genom. Ele au localizare nuclear, citoplasmatic sau membranar. S-au descris peste 10 antioncogene (supresoare ale oncogenelor) i circa 100 de oncogene (de exemplu, genele ras), ale cror mutaii punctiforme determin sinteza unor molecule cu substituii punctiforme de aminoacizi, unice sau multiple i care se deosebesc de moleculele normale. Antioncogena p53 codific o protein nuclear, reglatoare a diviziunii celulare. In celulele maligne, p53 se sintetizeaz n exces. Dup localizare, antigenele tumorale sunt: - antigene expuse la suprafaa celulei. Sunt cele mai importante, deoarece sunt accesibile efectorilor rspunsului imun (TSTA, TATA);

- antigene intracelulare, localizate n nucleu sau n citoplasm. Ambele categorii de antigene, se pot elibera fie din celulele vii, fie dup necroz i se gsesc n circulaie, la distan de tumor. Eliberarea lor poate stimula rspunsul imun sau are un efect de blocare a reactivitii imunitare, prin fenomenul de inundare antigenic. Anticorpii antitumorali se obin prin injectarea celulelor tumorale viabile, ori a mojaratului tumoral, la organismele altei linii genetice sau altei specii, care poart alte molecule CMH. Celulele vor fi respinse ca o gref alogenic. Antiserul conine anticorpi anti-antigene tumorale, dar i anticorpi anti-antigene CMH. De aceea, serul imun trebuie absorbit cu antigene tisulare normale. Astfel s-a evideniat CEA la pacienii cu tumori de colon i AFP la cei cu hepatoame. Antigenul evideniat de anticorpi n serul absorbit poate fi un antigen tumoral sau un antigen normal, exprimat abundent pe celulele tumorale. Fig. 132. Modificri ale suprafeei celulei, asociate cu transformarea malign (dup Roitt, 1997).

Procesul dezvoltrii tumorii are loc n cteva trepte: - transformarea celulei normale n celul malign - creterea exponenial a celulei maligne i constituirea tumorii primare - angiogeneza - invazia esutului nconjurtor - intravazarea i eliberarea celulelor tumorale individuale, n vasele sanguine i limfatice, unde trebuie s supravieuiasc - oprirea celulelor tumorale n diferite localizri (ficat, plmn etc.) - extravazarea celulelor tumorale i invazia acestor esuturi - creterea tumorii la noile situsuri de metastazare i angiogeneza. Fiecare etap a dezvoltrii tumorii este influenat de factori imunologici i neimunologici. De exemplu, integrinele condiioneaz interaciunile dintre celule. Cu ct aderena celulelor maligne este mai bine exprimat, cu att tendina ei de metastazare este mai limitat. Celulele maligne elibereaz unele componente membranare, ca de exemplu, fibronectina. Pierderea fibronectinei pare s determine scderea aderenei majoritii tipurilor de celule maligne i precede metastazarea. Componentele glicocalixului sunt eliberate sub aciunea proteazelor, pe care le secret celulele tumorale. Proteazele (din categoria metaloproteazelor) modific consistena substanei fundamentale a esutului conjunctiv, degradeaz colagenul i proteoglicanii, uurnd metastazarea i invazia.

RSPUNSUL IMUN ANTITUMORAL

Creterea anormal este prevenit prin diferite mecanisme de control: mecanisme de reparare a ADN, aciunea genelor supresoare ale oncogenelor (antioncogene) sau prin apoptoza celulelor care au suferit leziuni ireversibile. Dac aceste mecanisme nu mai sunt operative, celula continu s prolifereze. Celula malign se afl ntr-o interaciune dinamic cu micromediul, ce determin supravieuirea sau moartea ei.
Imunogenitatea tumorilor pentru gazd i stimularea timpurie a rspunsului imun antitumoral a condus la formularea conceptului imunosupravegherii, n acord cu care, organismele elimin celulele potenial canceroase care apar n cursul vieii individuale. Conform acestui concept, cancerul clinic este consecina scprii celulelor maligne, de aciunea mecanismelor protectoare. De aceea, factorii care interfer cu reactivitatea imunitar, predispun la malignitate. In concepia actual, malignizarea este rezultatul activrii oncogenelor sau pierderii funciei genelor supresoare ale oncogenelor (antioncogene). Teoria supravegherii imune afirm c sistemul imunitar, monitorizeaz constant organismul, pentru apariia celulelor tumorale i c majoritatea acestor celule aberante suntdetectate i lizate de sistemul imunitar, nainte de a produce tumori clinice. Aa se ntmpl cu celulele tumorale intens imunogene. Majoritatea (sau toate) celulele tumorale care apar spontan, sunt imunogene i rspunsul imun inhib creterea tumorii. Argumentele n favoarea sau contra acestei teorii sunt greu de obinut. Ele sunt extrapolate din observaii asupra tumorilor clinice. Dispariia spontan a tumorilor i recuperarea complet a pacienilor cu cancer diseminat, este rar, dar exist i este explicat prin insuficiena vascularizaiei, prin procese de difereniere a celulelor tumorale, prin mecanisme psihosomatice. O explicaie imunologic, este c raportul dintre creterea tumorii i rspunsul imun antitumoral este n favoarea rspunsului imun. Exist dovezi care sugereaz c organismul uman rspunde la prezena tumorilor, prin mecanisme imunitare: - regresia spontan, n special a meloanoamelor maligne, a carcinoamelor renale, a neuroblastomului i retinoblastomului, semnalat n peste 100 de cazuri publicate; - unele tumori evolueaz latent, o lung perioad, adic cresc foarte ncet sau sunt complet inactive i apoi brusc metastazeaz. Latena se poate explica prin echilibrul dintre tumor i sistemul imunitar; - frecvent tumorile sunt infiltrate cu celule mononucleare: limfocite, monocite, puine plasmocite. Celulele T i macrofagele sunt prezente abundent n tumorile umane, sugernd un rspuns imun antitumoral. Celulele T activate fa de tumora autolog, s-au izolat din cteva tipuri de tumori(melanom malign, carcinom renal, cervical). Ele recunosc peptide asociate cu moleculele CMH I, care sunt represate n celulele normale sau peptide derivate din proteinele mutante; - carcinoamele asociate cu reacie inflamatorie evolueaz mai lent dect cele care nu manifest un rspuns inflamator; - tumorile sunt mai frecvente la organismele foarte tinere (datorit imaturitii sistemului imunitar) i la cele vrstnice (datorit senescenei sistemului imunitar); - anumite categorii de tumori (cancerele de piele cu papiloma virus, limfoamele pozitive pentru antigenele EBV) au o inciden crescut la pacienii cu transplant, supui imunosupresiei.

Imunosupresia prelungit (20 de ani), este asociat cu creterea incidenei tumorilor de origine viral, n timp ce incidena celorlalte categorii de tumori, crete foarte puin. Dovezile clinice sugereaz c rspunsul imun este orientat predominant fa de infecia cu virusuri oncogene i neoncogene, iar rata apariiei altor tumori este relativ nemodificat. Aceasta arat, indirect, c supravegherea antitumoral este relativ ineficient. Datele experimentale sprijin ideia c supravegherea imun este orientat, n primul rnd, fa de virusuri oncogene ADN i nu fa de oncorna- sau fa de tumorile induse de agenii chimici carcinogeni.; - celulele metastatice sunt comune la pacienii cu cancer, dar frecvena implantrii lor i creterea tumorilor secundare este mic.

Efectorii rspunsului imun antitumoral Dac sunt prezente, multe antigene tumorale stimuleaz rspunsul imun la animalele de experien i pot induce o stare de rezisten antitumoral fa de celulele transplantate. Rspunsul imun antitumoral are o eficien foarte variabil, n funcie de natura antigenelor. Astfel, antigenele induse de virusurile oncogene sau ale tumorilor induse de radiaiile UV, sunt foarte imunogene i stimuleaz rspunsul imun protector, iar antigenele de transplantare ale tumorilor induse chimic sunt slabe. Tumorile care apar spontan la animale i la om sunt puin antigenice i induc un rspuns imun de mic intensitate.
Antigenele asociate celulelor tumorale sunt recunoscute ca nonself, de sistemul imunitar al gazdei, dar tumorile secret antigene solubile, care tind s produc fenomenul de inundare antigenic i paralizie imunitar. Rspunsul imun antitumoral este humoral i celular. Anticorpii specifici, de cele mai multe ori, nu au eficien antitumoral. Cel mai adesea, celulele tumorale supravieuiesc aciunii factorilor humorali i se multiplic. Ineficiena aciunii lor s-a demonstrat n experiene cu celule maligne nchise n camere poroase, permeabile numai pentru molecule, amplasate n cavitatea abdominal a unor organisme imunizate cu mojarat de esut tumoral. Anticorpii sunt efectori eficieni fa de celulele maligne de origine limfoid (leucemii, limfoame). Dup activarea complementului, se produce liza celulei int. Efectorii imunitii antitumorale sunt celulele. Rolul lor s-a demonstrat cu acelai gen de experimente, cu celule maligne plasate n camere poroase, care permit trecerea celulelor efectoare ale rspunsului imun. Rezultatul aciunii celulelor imunitare este liza celulei int. Fig. 133. Antigenul tumoral poate fi prezentat celulelor T, pe diferite ci: direct, n absena co-stimulilor necesari, rezultatul fiind anergia; direct de celula tumoral care exprim molecule co-stimulatoare, rezultnd activarea celulelor Tc; direct de celulele tumorale i indirect via CPA, producnd activarea limfocitelor Tc i Th (dup Roitt, 1997).

Imunitatea celular antitumoral este mediat de celule capabile s lizeze celulele int, prin interaciune specific sau de celule care nu necesit procese de recunoatere specific. Rolul celulelor NK

Celulele NK sunt cei mai importani efectori ai imunitii antitumorale. Aciunea lor nu este limitat de identitatea moleculelor CMH i i exercit efectul prin contact direct. Celulele NK nu necesit prezentarea antigenului de ctre celulele accesorii. Mecanismul molecular al interaciunii lor cu celula int nu este cunoscut. Activitatea celulelor NK se modific cu vrsta: are nivel sczut la natere, atinge maximum la pubertate i scade gradat cu vrsta. Activitatea lor fa de celulele maligne, in vitro, este invers proporional cu nivelul moleculelor CMH I, exprimate pe suprafaa celulelor maligne. Exprimarea moleculelor CMH I poate duce chiar la scparea celulelor tumorale de a fi recunoscute de celulele NK, in vivo. Se presupune c celulele NK controleaz celulele pentru nivelul expresiei CMH I. Celulele care au pierdut total sau parial moleculele CMH I, par a fi recunoscute ca inte i lizate. Deoarece aciunea celulelor NK nu este restrictiv n raport cu moleculele CMH, ele sunt active fa de celulele tumorale singenice, alogenice i chiar xenogenice. Importana funcional a celulelor NK pentru protecia antitumoral este argumentat de faptul c liniile de oareci congenital atimici sau cei timectomizai neonatal au un numr mare de celule NK Celulele K interacioneaz cu celula int prin intermediul receptorilor pentru Fc . Celula tumoral tapetat cu IgG este astfel uor recunoscut de celulele K. Ele se activeaz i lizeaz celula int prin fenomenul ADCC. Activitatea celulelor NK i K din snge, testat in vitro, scade odat cu progresia tumorii. La contactul cu celula malign, direct sau mediat de anticorpi, celula efectoare elibereaz factori citotoxici solubili: perforina, proteaze, TNF-, limfotoxina (TNF-). Mecanismul eliberrii factorilor litici este acelai, descris pentru limfocitulTc. Celulele NK, activate in vitro de IFN- i de IL-2, se numesc LAK (celule killer activate de limfochine).

Activarea celulelor NK i K nu produce memorie imun. Nu exist diferene ntre rspunsul imun primar i secundar.
Citotoxicitatea mediat de macrofage Macrofagul neactivat (de la indivizi normali) exprim un nivel minim de citotoxicitate antitumoral. Macrofagul activat distinge celulele tumorale de celulele normale i poate s omoare selectiv, celulele tumorale. Activitatea sa citotoxic este independent de moleculele CMH, dar este dependent de factori genetici.Macrofagul se activeaz n urmtoarele situaii: - dup ce leag prin receptorul pentru Fc, moleculele de imunoglobulin fixate pe determinanii antigenici ai celulei maligne sau complexele IgAg tumoral solubil; - sub aciunea factorilor eliberai de celulele T sensibilizate (IFN ) - sub aciunea endotoxinelor bacteriene - sub aciunea antigenelor de Mycobacterium, Listeria, Toxoplasma sau dup infecia cu aceste microorganisme intracelulare.

Activarea const n amplificarea ratei metabolice i macrofagul devine killer potenial al celulelor tumorale. Macrofagul activat nu interacioneaz cu antigenele tumorale specifice, dar ca i celulele NK, pare s disting ntre celulele maligne i cele normale, prin mecanisme moleculare necunoscute. Macrofagele activate secret diferite molecule antitumorale: - enzime hidrolitice care degradeaz esutul conjunctiv - IFN-, activator al celulelor NK - TNF- (caectina) cu efect stimulator asupra altor celule care elibereaz IL - H2O2 i produi de oxidare a glucozei, cu efect toxic direct asupra celulei int, prin perturbri membranare - oxidul nitric (NO), toxic pentru celulele maligne. NO se formeaz prin combinarea oxigenului cu azotul derivat din dezaminarea enzimatic oxidativ a L-argininei. Reacia este catalizat de nitricoxid-sintaz. NO mediaz citotoxicitatea macrofagului, dependent de L-arginin. Una din cauzele primare ale patologiei maligne este metastazarea, adic eliberarea celulelor din situsul tumorii primare, pentru a iniia la distan, creterea unei noi tumori. Celulele metastazate au aceleai antigene de suprafa, ca i tumora primar. Principalele situsuri de metastazare sunt ganglionii limfatici, plmnul, ficatul. n studiile experimentale, macrofagele activate s-au dovedit a fi foarte eficiente n reducerea incidenei metastazelor unor tumori. Imunitatea mediat de celulele T Imunitatea antitumoral mediat de celulele T, ca mecanism, este analog rspunsului imun fa de alte antigene T-dependente (de exemplu, antigenele CMH). Experienele in vitro au evideniat c antigenele tumorale stimuleaz proliferarea tuturor subpopulaiilor de limfocite T (Th, Ts, Tc). Funciile efectoare ale limfocitelor T sunt stimulate de limfochine i monochine (IL-1 i TNF- ), sintetizate i secretate de macrofagele care prezint antigenele tumorale solubile. IL-1 stimuleaz proliferarea celulelor B, T i NK. IL-1 produce i rspunsul febril n reacia inflamatorie, iar TNF- determin necroza celulelor tumorale. Limfocitele TCD4 (i NK) secret IL-2, cu efect stimulator asupra celulelor care o secret. IFN este secretat de celulele TCD4 (i NK) i activeaz macrofagele i celulele NK. Interferonul are efect antitumoral direct, dar este i imunomodulator. Limfocitele Tc au rol important n liza celulelor tumorale, dac acestea exprim molecule CMH I. Interaciunea limfocitului Tc cu celula malign este specific. Limfotoxina produs de limfocitul Tc are efect litic direct asupra celulelor tumorale. Celula tumoral expune pe suprafaa ei, antigene asociate cu moleculele CMH I, dar elimin i molecule solubile, care sunt preluate de CPA i prezentate limfocitelor Th. Acestea secret IL-2, activatoare pentru toate tipurile de celule cu funcie imunitar, specific sau nespecific.

n concluzie, reacia imun fa de celulele tumorale are dou trepte. In prima etap sunt activate celulele efectoare nespecifice (macrofage, eozinofile, neutrofile, celule NK) i se produce o reacie inflamatorie local. Reacia nespecific uureaz reacia imun specific, prin diminuarea ratei de cretere a tumorii i creterea nivelului de prezentare a antigenelor tumorale de ctre celulele maligne, prin modularea exprimrii moleculelor CMH. In faza a II-a, celulele Tc asigur protecia imun fa de creterea tumorii. Celulele efectoare ale imunitii mediate celular, specific i nespecific, sunt eficiente n detectarea i liza celulelor tumorale izolate i transplantate. Deoarece detecteaz celulele tumorale izolate, ele sunt eficiente n prevenirea metastazelor, dar sunt ineficiente fa de celulele care constituie o microtumor. Mecanisme de scpare a celulelor tumorale

Antigenele tumorale se gsesc pe suprafaa celulelor tumorale. Ele sunt antigene TSTA, mai concentrate sau mai diluate. Antigenele CMH normale nu dispar, dar diminu cantitativ.
Creterea tumorilor, n condiiile activrii rspunsului imun, nu este explicat satisfctor. S-au propus mai multe mecanisme prin care celulele tumorale evit recunoaterea de ctre efectorii rspunsului imun. Cnd sistemul imunitar este alertat, esutul tumoral este prea dezvoltat i nu mai poate fi nlturat. De cele mai multe ori, tumora nu este imunogen. Lipsa imunogenitii nu se datoreaz absenei antigenelor tumorale, ci faptului c celulele tumorale nu sunt eficiente n prezentarea antigenului. Cel mai surprinztor i cel mai studiat mecanism de evitare a rspunsului imun este modularea antigenic. Fenomenul modulrii antigenice definete capacitatea tumorii de a masca sau de pierde antigenele, n prezena efectorilor imunitari. De exemplu, celulele leucemice transplantate la oarecele imunizat cu mojaratul celulelor leucemice care conin antigenul TL, au pierdut antigenul TL, dar antigenul reapare dup transplantul celulelor leucemice la oarecii care nu au anticorpi serici antiTL. Imunoselecia. Antigenele exprimate pe suprafaa celulelor tumorale activeaz rspunsul imun mediat celular, iar antigenele solubile stimuleaz sinteza anticorpilor. Unele celule tumorale, ca rezultat al instabilitii genetice, pierd antigenele iniiale i astfel evit efectorii rspunsului imun specific. Ele devin dominante n masa tumorii. Noile variante antigenice induc rspunsul imun specific, dar fenomenul schimbrii specificitii antigenice se repet. Rspunsul imun nu induce schimbarea specificitii antigenice a suprafeei celulei maligne, ci selecteaz celulele care au suferit modificarea antigenic i astfel au devenit rezistente la aciunea efectorilor imunitari. Diminuarea reactivitii imunitare pe cale natural sau artificial este nsoit de creterea incidenei neoplaziilor. Imunosupresia natural este mediat de limfocitele Ts. Antigenele tumorale par s activeze mai uor celulele Ts dect limfocitele Th. Limfocitele Ts sunt mai numeroase la pacienii neoplazici i pot s represeze rspunsul imun pn la ineficien total.

Celulele tumorale secret citochine cu aciune imunosupresoare, prin efectul lor inhibitor asupra interleuchinelor. Celulele maligne produc IL-10, detectat n lichidul peritoneal i n serul pacientelor cu cancer ovarian sau cu alte neoplasme intraperitoneale.

IL-10 inhib exprimarea moleculelor CMH II pe suprafaa monocitelor i macrofagelor i diminu reactivitatea imunitar prin efectele sale multiple asupra limfocitelor, monocitelor, celulelor NK i celulelor dendritice.
Reactivitatea imunitar poate s diminue datorit mascrii antigenelor tumorale. De exemplu, sialomucina, abundent pe suprafaa celulelor unor tumori, mascheaz antigenele tumorale i le face inaccesibile recunoaterii imunitare i efectorilor imunitari. Sialomucina poate fi ndeprtat, in vitro, prin tratamentul celulelor cu neuraminidaz de Vibrio cholerae i celulele i dobdesc sensibilitatea la aciunea litic a efectorilor imunitari. Diminuarea reactivitii imunitare se poate datora inundrii organismului cu antigenele tumorii. Fiind o celul foarte activ din punct de vedere metabolic, componentele membranei sale au un turnover ridicat. Antigenele eliberate se complexeaz cu anticorpii specifici sau cu receptorii specifici ai limfocitelor, fcndu-i ineficieni n recunoaterea celulelor maligne. Efectul imunosupresor al antigenelor tumorale este proporional cu dimensiunile tumorii i dependent de existena metastazelor. Efectul de inundare cu antigenele tumorii este argumentat de experienele de transplant tumoral. Numrul celulelor transplantate este determinant pentru dezvoltarea tumorii. Grefarea unui numr mic de celule (prin injectarea suspensiei) este urmat de respingere, iar grefarea unui numr mare de celule este urmat totdeauna de creterea tumorii. Dup ce organismul a respins un numr mic de celule maligne transplantate, se va apra fa de un numr progresiv crescnd de celule de acelai tip. Imunitatea de transplantare fa de antigenele tumorale poate fi depit de un numr de 100-10 000 mai mare de celule tumorale, dect numrul de celule necesar grefei tumorii la animalele neimunizate. Efectul imunosupresor al tumorii. Pacienii purttori de tumori mari nu rspund la antigenele tumorale, iar limfocitele lor in vitro, au o slab activitate citotoxic fa de celulele tumorale autologe. Antigenele tumorale exercit un efect imunosupresor n gradient. La un situs ndeprtat de tumor, efectul imunosupresor diminu i inoculul mic de celule tumorale este respins. Dup ce tumora a dobndit dimensiuni importante, efectul imunosupresor este sistemic. Antigenele tumorale circulante se asociaz cu celulele efectoare ale sistemului imunitar, chiar n sngele circulant, producnd paralizia rspunsului imun. Creterea tumorii poate fi stimulat prin fenomenul de enhancement imunitar. Fenomenul de enhancement, descoperit experimental, se definete ca un proces de intensificare a creterii tumorii, n prezena anticorpilor specifici. Tumorile au fost transplantate la organisme imunizate cu mojarat celular al aceleiai tumori, pentru sinteza anticorpilor specifici. Anticorpii nu numai c nu resping celulele grefate, ci determin un efect invers, de stimulare a creterii tumorii, comparativ cu creterea sa la animalele neimunizate. Anticorpii cu efect de enhancement sunt IgG, la titru mic. Fenomenul de enhancement se explic astfel: - anticorpii ar putea induce un efect imunosupresor, deoarece prin feed-back inhib sinteza anticorpilor potenial citolitici; - anticorpii de enhancement sunt citofili, adic se leag specific pe suprafaa celulelor tumorale, formndu-se complexe Ag-Ac, care blocheaz fizic ataarea efectorilor humorali sau celulari.

Evoluia tumorii este condiionat, ntr-o oarecare msur, de tipul anticorpilor care se sintetizeaz. Tolerana imunitar este un mecanism eficient de scpare a celulelor tumorale de aciunea efectorilor sistemului imunitar. Tolerana se datoreaz lipsei de reactivitate a limfocitelor Tc i B, care la contactul cu antigenele tumorale nu se sensibilizeaz i nu genereaz rspunsul imun, dei fa de alte antigene, reactivitatea imunitar este normal. Tolerana survine datorit stimulrii repetate cu cantiti mici de antigene, dar un rol esenial n inducerea toleranei imunitare pare s revin raportului dintre limfocitele Th i Ts. Diferite produse tumorale, altele dect antigenele, pot s interfere cu funcia imunitar i s favorizeze instalarea toleranei imunitare. De exemplu, prostaglandinele diminu nivelul exprimrii moleculelor CMH II pe suprafaa celulelor prezentatoare de antigen i pot de asemenea s suprime activitatea celulelor NK. Factorii genetici, neidentificai, influeneaz evoluia tumorii. Unele neoplazii sunt asociate cu incapacitatea limfocitelor T de a activa rspunsul imun, probabil datorit incapacitii lor de a recunoate antigenul. n concluzie, micile acumulri de celule tumorale, stimuleaz rspunsul imun. Dar, chiar tumorile imunogene continu s creasc la gazdele imunocompetente, datorit eficienei sczute a rspunsului imun antitumoral in vivo. Tumorile evit aciunea distructiv a efectorilor imunitari sau blocheaz chiar rspunsul imun. Abordri terapeutice ale neoplaziilor Terapia neoplaziilor este abordat pe urmtoarele ci: chirurgical, radioterapia, chimioterapia i imunoterapia. Oricare ar fi modalitatea de tratament, este necesar reducerea prealabil a masei tumorale prin rejecie chirurgical. Terapia chirurgical are ca scop reducerea dimensiunilor tumorilor solide, n stadiile timpurii ale neoplasmelor de sn, colon, plmn, prostat - cele 4 maligniti majore la om, ce reprezint peste 50% din totalul tumorilor solide. Radioterapia poate fi primar sau secundar. Cea primar se practic n cancerele capului, gtului i n maladia Hodgkin (neoplazie a ganglionilor limfatici, din diferite regiuni ale corpului). Radioterapia este mai eficient pentru esuturile moi, n arii adiacente maxilarelor i cilor nazale. Iradierea total se practic nainte de transplantul mduvei osoase i este foarte eficient pentru anumite leucemii acute, refractare la chimioterapie i pentru tratamentul unor tumori solide (cancer de sn), care au revenit dup civa ani de remisiune. Chimioterapia const n tratamentul cu medicamente citotoxice, majoritatea fiind produse de sintez chimic. Scopul chimioterapiei este de a omor selectiv celulele maligne, deoarece au o rat superioar de cretere i diviziune. Cele mai sensibile la chimioterapie sunt leucemiile. Efectul medicamentelor citotoxice este dependent de doz. Dozele prea mici nu produc efect, iar cele mari au efecte toxice asupra organismului, n special asupra mduvei osoase i asupra celulelor cu o rat mare de diviziune. Doza se calculeaz la aria de suprafa corporal, preferabil raportrii la greutate. Majoritatea agenilor citotoxici se administreaz intravenos, calea oral fiind adecvat pentru ciclofosfamid (i pentru tamoxifen).

Agenii chimioterapeutici, n funcie de mecanismul aciunii lor, aparin mai multor clase. Agenii alchilani induc formarea legturilor transversale stabile ntre cele dou catene ale AND (prin legarea de N7 a guaninei) i inhib replicarea moleculei de ADN. Interaciunea poate s se produc cu una sau cu ambele catene ADN. Alchilarea guaninei induce mperecherea anormal cu timina sau depurinarea prin excizia resturilor de guanin. Consecina este ruperea catenei de ADN. Dac legtura transversal se face ntre resturile de guanin ale celor dou catene, excizia reparatorie poate s rup molecula de ADN i s rezulte o mutaie letal pentru celul. Agenii alchilani reacioneaz chimic cu gruprile sulfhidril, amino, hidroxil i fosfat. Aciunea lor nu are specificitate de faz a ciclului celular, dar celulele sunt mai sensibile n faza G 1 i S. Efectul se manifest prin blocarea ciclului celular dup faza G2. Mecanismul rezistenei dobndite la agenii alchilani poate s conste ntr-o retenie sczut a agentului n celul, n creterea sintezei compuilor sulfhidril cu greutate mic i n creterea capacitii de reparare a leziunilor ADN. Dei au mecanisme asemntoare de aciune, diferenele structurii moleculare reduc gradul rezistenei ncruciate ntre compuii subclaselor majore. Efectele secundare sunt gastrointestinale (grea, vom) i hematologice (mielosupresie). Ciclofosfamida este cel mai folosit agent alchilant, n tratamentul malignitilor hematologice i a tumorilor solide. Este convertit la forma activ n ficat Compuii platinei (cisplatin, carboplatin) nu sunt ageni alchilani, dar acioneaz printr-un mecanism similar, adic se leag de N7 al guaninei i realizeaz legarea ncruciat a catenelor de ADN. Se leag i cu alte molecule: adenina, citozina, ARN, proteine. Antimetaboliii (citarabina, fluorouracil, metotrexat, mercaptopurina, hidroxiureea) sunt analogi ai bazelor azotate i inhib sinteza ADN, ARN sau sinteza proteinelor. Sunt ageni cu specificitate de faz a ciclului celular. Antagonitii pirimidinelor. Citarabina (Ara-C) este un compus cu specificitate de faz S. Este metabolizat n celul la forma activ, ara-CTP, inhibitor al ADN-polimerazei i al sintezei ADN. AraC este ncorporat n ADN i blocheaz alungirea catenei, ca i legarea fragmentelor n molecula de ADN nou sintetizat. Antagonitii purinelor. 6-mercaptopurina i 6-tioguanina sunt convertite la forma nucleotidic de hipoxantin-guanin fosforibozil transferaz (HGPRT). Metaboliii lor inhib unele enzime ale cii purinice. Unii metabolii ai 6-tioguaninei sunt ncorporai n ADN i n ARN. Fludarabina este analog al adeninei. Derivatul su, fludarabin-trifosfat, acioneaz prin inhibiia ADN-polimerazei i ribonucleotid-reductazei i prin ncorporarea n ADN Antagonitii acidului folic (metotrexat, aminopterina) sunt analogi structurali ai acidului folic. Alcaloizii din plante (vincristina i vinblastina, izolai din Vinca rosea), produc agregarea tubulinei i dezorganizarea microtubulilor celulari. Vinblastina este toxic pentru mduva hematopoetic, iar vincristina are efecte toxice majore asupra terminaiilor nervoase periferice, producnd neuropatii senzoriale (parestezie, adic lipsa senzaiei de durere) i motorii, n degete.

Pentru un numr mare de categorii de tumori, chimioterapia determin o citoreducere important. Dar, la cteva luni sau la civa ani, creterea tumoral este reluat i continu chiar n condiiile reinstituirii tratamentului. Creterea reflect dobndirea rezistenei specifice la medicamentele administrate. n general, dezvoltarea rezistenei la un medicament este considerat ca rezultat al unei rate nalte a mutaiilor celulelor maligne, consecina fiind apariia unor subpopulaii heterogene, din care unele sunt rezistente la diferite medicamente. Cea mai important mutant este cea cu rezisten medicamentoas multipl, mediat de glicoproteina P, o glicoprotein membranar, care funcioneaz ca o pomp de eflux, dependent de energie. Pompa elimin activ din celul, o varietate de ageni citotoxici: alcaloizii din plante, antibioticele (dactinomicina, doxorubicina, daunorubicina) i unii ageni sintetici (melphalan). Celulele maligne mutante, care exprim gena codificatoare a glicoproteinei P, sunt rezistente la o larg varietate de medicamente anticanceroase. Imunoterapia ncearc s distrug celulele maligne, prin manipulri de stimulare a reactivitii a sistemului imunitar. Injectarea citochinelor sau stimularea in vitro, cu IL-2, a limfocitelor autologe, obinute din sngele pacientului, are efecte stimulatoare asupra rspunsului imun. Rareori s-a produs remisiunea complet a neuroblastomului, a carcinomului renal sau a melanomului malign, ceea ce evideniaz c rspunsul imun fa de aceste neoplazii poate fi stimulat. Fig. 134. Modelul unei celule maligne care exprim glico-proteina P, o protein transmembranar care funcio-neaz ca o pomp de efluaturale sau artifi-ciale), dup care sunt pompate la exteriorul celulei. Funcia glicoproteinei P poate fi inhibat cx. Ea are situsuri acceptoare la care se leag diferite medicamente anti-canceroase (nompetitiv de ageni chimiosensibilizatori ca verapamil.

Cea mai obinuit form de terapie imun a neoplaziilor este utilizarea anticorpilor monoclonali (AMC) cu specificitate tumoral, cuplai cu toxine (toxina difteric, toxina de ricin) sau cuplai cu ageni chimici (I131, medicamente citotoxice), ce suprim proliferarea celular. In ansamblu, terapia cu AMC nu a reuit. Cele mai frecvente tumori (de colon, de sn, de plmn, de prostat) poart antigene proteice intracelulare, inaccesibile AMC. Strategiile chimioterapeutice au progresat mult i ofer mai multe anse de reuit, la un pre de cost inferior. n tratamentul limfoamelor celulelor B se folosesc AMC anti-idiotipici fa de imunoglobulina membranar a limfomului. Stimularea nespecific a esutului limfoid este o metod terapeutic introdus de G. Math. El a administrat BCG pentru terapia leucemiilor limfoblastice la copii. Remisiunile se prelungesc ca durat. Celulele de Corynebacterium parvum au efecte antitumorale, n asociere cu chimioterapia, iar celule de C. parvum i BCG injectate direct n masa tumorii, inhib creterea tumorii. Antigenele bacteriene stimuleaz imunitatea mediat celular. Celulele limfoide sunt atrase n numr mare la locul injectrii i aciunea lor este orientat asupra celulelor tumorale. Macrofagele se activeaz la contactul cu antigenele bacteriene i dobndesc proprieti citotoxice fa de celulele tumorale, evideniate in vitro. Interferonul (produs de leucocite) se utilizeaz n tratamentul unor leucemii i n tratamentul limfoamelor, dar este toxic, ceea ce impune limitarea dozei. Majoritatea pacienilor, dup

administrarea interferonului, fac un sindrom al strii gripale: febr, senzaie de frig, dureri de cap, dureri musculare. Aceste simptome diminu pe parcursul terapiei i sunt controlate, parial, cu diferii ageni farmacologici. Imunoprofilaxia cu vaccinuri, pentru anumite virusuri, a avut succes la animale. Boala lui Marek, produs de un herpesvirus, este o maladie limfoproliferativ la puii de gin. Incidena leucemiei felinelor a sczut, ca rezultat al unui program de vaccinare. Nu exist vaccinuri protectoare fa de neoplaziile umane.

IMUNITATEA N TRANSPLANTUL DE ESUTURI I ORGANE

Chirurgia transplantului a depit dificultile de ordin tehnic. Reuita transplantului depinde exclusiv de reactivitatea imunitar, care declaneaz un rspuns de respingere. Ideia nlocuirii unui organ lezat, cu unul sntos, a preocupat medicina din timpuri foarte ndeprtate. n mitologia greac se vorbea de organisme himere, pstrate i astzi n reprezentrile sculpturale sub forma montrilor fabuloi, a cror origine sugereaz o tripl heterogref: leu-capr-coad de dragon sau leu-capr-arpe. Combinaia este interpretat ca o materializare pe plan abstract, a ideii de a asocia organisme foarte diferite. Sirenele (jumtate femeie-jumtate pete) i minotaurii (jumtate om, jumtate taur) exprimau ideia de asociere a acestor organisme foarte diferite. Perioada tiinific a transplantului ncepe cu Alexis Carrel (medic american, care a lucrat n Frana, autorul lucrrii Omul fiin necunoscut), cel care a pus bazele cultivrii celulelor i esuturilor. In 1902, Carrel a fcut grefe de rinichi la animale. In 1906, a grefat plmni la pisic i a fcut primul transplant de inim la cine, legnd inima de vasele regiunii cervicale. Animalul a trit 21 de ore. K. Landsteiner, unul din promotorii perioadei tiinifice, a descris grupele sanguine i condiiile de compatibilitate major ntre donor i receptor. In 1944, Medawar a conchis c respingerea grefelor de esuturi i organe are cauze imunitare, iar curnd dup aceea, Billingham, Brent i Medawar au descris fenomenul de toleran imunitar. G. Math (hematolog francez) a creat himerele biologice. El a pornit de la ideia c fenomenele de respingere a grefelor de esuturi i organe sunt datorate stimulrii activitii sistemului imunitar. In lucrrile sale experimentale, a recurs la metoda paralizrii reactivitii imunitare. In acest scop, puii nou-nscui de obolan au fost supui iradierii totale, cu doza de 800 de razi. Rezultatul iradierii este desfiinarea barierelor imunitare, adic anihilarea reactivitii imunitare fa de gref. La animalele iradiate a inoculat cteva milioane de celule din mduva osoas de oarece. Autorul a creat astfel, himera biologic oarece-obolan (obolan cu elemente figurate sanguine de oarece). Himera este sensibil la infecia cu virusul leucemiei oarecelui i face leucemia, n timp ce obolanii convenionali sunt rezisteni la infecia cu acest virus. Himera biologic este orice organism dotat n mod artificial cu componente celulare, cu esuturi sau organe, care provin de la alte organisme. Ulterior, tehnicile de inginerie genetic

au creat molecule de ADN himere i chiar microorganisme himere, ce poart informaie genetic provenit de la dou specii diferite. n 1967, Christian Barnard a realizat primul transplant de cord la om. Denumirea de gref, folosit curent pentru esutul implantat n organismul strin, vine de cuvntul grecesc grafion, care desemneaz un instrument de scriere prin gravur. Denumirea a fost ulterior folosit cu nelesul de altoi la plante. Denumirea de transplant a fost folosit de Paracelsus i nseamn a transfera, a muta. Noiunea de transplant are un sens mai larg. Ea include fecundarea ovulului de ctre spermatozoid, ca transplant natural. Ftul este o alogref natural, ce poart informaia genetic de origine patern, dar este protejat prin mecanisme cu aciune placentar, de fenomenele de respingere. Terminologie.Terminologia modern referitoare la gref are trei origini: chirurgical, imunologic i genetic. Uniformizarea ei a fost cerut de OMS. Relaia genetic i antigenic ntre organismul donor receptor Identitate i Gref autolog Individul este att esut autogenic Autogref (autohton, donor ct autogen) i receptor Organisme Izogref identice ale unei Singref esut singenic (Gref izogen linii inbred. (Homogref singenic) (congenic) Gref izolog) Pentru om, gemeni univitelini. Allos = altul Organisme Alogref Gref ale aceleiai esut alogenic (Homogref alogenic) homolog specii dar cu variante alelice diferite. Xenos = strin Heterogref Indivzii aparin Xenogref (Gref esut xenogenic unor specii diferite heterolog) (cine - iepure).

Tipul de gref (Denumire nou)

Denumire veche

Tipul de esut

Observaii

Identitate

Diferite

Foarte diferite

Autogrefele se practic cu o frecven mare: n cazuri de arsuri, intervenii chirurgicale estetice. Pielea dintr-o regiune a corpului este implantat ntr-o zon compromis.

Alte denumiri se refer la particularitile esutului transplantat: -> grefele homovitale se fac pentru asigurarea viabilitii esutului transplantat -> grefele homostatice sunt acelea n care esutul grefat are rolul numai de suport structural, pe care se poate dezvolta esutul gazdei, pentru restabilirea arhitecturii iniiale. Astfel de grefe sunt lipsite de orice urm de esut antigenic, se practic pentru a nlocui un fragment de vas sau de os. n raport cu locul de unde esutul a fost luat i locul unde se reimplanteaz, se disting grefe ortotopice (esutul grefat este aezat la receptor n aceiai poziie) i grefe heterotopice (esutul grefat este implantat n alt situs anatomic al organismului receptor). Dup 1956, primul succes al grefei de rinichi ntre gemeni univitelini, transplantul de organe a devenit o practic curent. Interesul pentru transplant s-a deplasat de la actul chirurgical, la aspectele imunologice. Argumente ale rolului reactivitii imunitare n respingerea grefei Respingerea grefei este rezultatul activrii mecanismelor imunitare, datorit diferenelor antigenice ntre moleculele CMH I i II ale donorului i receptorului. In favoarea acestei afirmaii argumenteaz mai multe fapte de observaie: -> autogrefele i singrefele sunt acceptate totdeauna, dac sunt respectate condiiile de asepsie; -> grefa ntre indivizi diferii este respins cu att mai brutal, cu ct diferenele antigenice(biochimice) dintre moleculele CMH ale donorului i receptorului sunt mai mari;

D R A ---------------- A ----- O Grefa prinde. B ---------------- A ---- 0 Grefa este respins, pentru c organismele difer prin moleculele CMH. B --------------- AxB ---- O Grefa este acceptat. Capacitatea de a accepta o gref depinde de existena la organismul receptor, a tuturor genelor de histocompatibilitate ale donorului. Dac receptorul are un antigen suplimentar, grefa este acceptat. AxB ----------- B ------ 0 Dac donorul posed un antigen suplimentar fa de receptor, grefa este respins. -> din punct de vedere histologic, esutul grefat respins este infiltrat cu celule efectoare ale rspunsului imun: limfocite, macrofage, plasmocite; -> animalele timetomizate au o capacitate sczut de respingere a grefelor de esuturi i organe, care se restabilete dup grefarea timusului;

-> debutul fenomenelor de respingere este foarte mult ntrziat, dac organismului receptor de gref i se administreaz ser antilimfocitar (SAL); -> fenomenele de respingere sunt mai intense la copii, datorit abundenei esutului limfoid, dar sunt mult atenuate la btrni. Argumente indirecte n favoarea respingerii imunitare: -> organele grefate rapid dup recoltare sunt suportate mult mai bine dect cele care au fost pstrate o perioad mai lung de timp n afara organismului. esutul transplantat dup o perioad de pstrare, conine mai multe celule lezate i lizate, din care se elibereaz molecule nonself, care amplific rspunsul imun; -> conservarea n condiii optime mrete gradul de toleran fa de esutul grefat, iar pstrarea neadecvat are efecte defavorabile; -> organele i esuturile sntoase sunt tolerate mai bine dect cele care prezint o stare de uzur biologic.

EVOLUIA RESPINGERII GREFEI DE PIELE

n raport cu dinamica desfurrii, se disting trei modaliti de respingere a grefei de piele. Respingerea acut sau hiperacut este foarte rar ntlnit i se datoreaz incompatibilitii totale ntre donor i receptor, care nu aparin aceluiai grup sanguin n sistemul ABO. In organismul receptor de gref, exist anticorpi circulani preformai (aglutininele i ) fa de antigenele esutului transplantat. Lor li se adaug efectele imediate produse de macrofagele i neutrofilele activate, de anafilatoxinele eliberate din fixarea complementului. Vasele din organul grefat se obtureaz prin formarea trombilor de coagulare. Grefa nu se vascularizeaz, rmne alb i n cteva ore este respins. Respingerea dup dinamica rspunsului imun primar survine n cazul n care, ntre donor i receptor este o incompatibilitate relativ. Grefa se vascularizeaz, dobndete o culoare normal (roz), dar dup 10-12 zile, culoarea se nchide, devine purpurie, apar fenomene de respingere i grefa este eliminat. Respingerea dup dinamica rspunsului imun secundar este de tip accelerat i are loc la organismele la care grefa s-a repetat dup o alt gref cu esut de la acelai organism donor sau de la un organism al aceleiai linii inbred. Rspunsul este accelerat, n sensul c fenomenele de infiltraie cu macrofage, neutrofile i limfocite T sensibilizate, se produc foarte repede i n 3-4 zile, grefa este respins. Respingerea grefei de rinichi Respingerea hiperacut se produce foarte repede dup ce s-au stabilit conexiunile vasculare cu organul grefat i se datoreaz incompatibilitii totale ntre donor i receptor,

care nu aparin aceluiai grup sanguin n sistemul ABO. In primele ore dup stabilirea conexiunilor vasculare se produce ncetinirea fluxului sanguin, urmat de o staz circulatorie n organul grefat. Rinichiul se ncarc cu o cantitate mare de snge i dobndete culoarea roie, fenomen denumit hepatizare. Oprirea circulaiei sanguine iniiaz procesul de coagulare la nivelul capilarelor sanguine. Cauzele respingerii hiperacute . In sngele organismului receptor se gsesc anticorpi preformai (aglutinine), specifici fa de antigenele din organul grefat. Antigenele de grup sanguin n sistemul ABO se gsesc nu numai pe eritrocite, ci i pe celulele endoteliale ale capilarelor sanguine. Aglutininele i ale receptorului de gref ajung n rinichiul grefat imediat dup realizarea anastomozelor vasculare. Se formeaz complexe antigen-anticorp care iniiaz fixarea complementului. Endoteliul capilar sufer mici leziuni, suficiente pentru a determina apariia suprafeelor rugoase, de care ader PMNN. La acest nivel, celulele endoteliale exprim selectinele, prin intermediul crora leucocitele ader de endoteliu i prsesc circulaia. La nivelul suprafeei rugoase se acumuleaz trombocitele, care se agreg treptat i mpreun cu factorii plasmatici, formeaz trombi care obtureaz lumenul capilar. n 48 de ore, arteriolele i capilarele se trombozeaz. Respingerea hiperacut este o reacie de activare endotelial i grefa este respins ca o xenogref. Pentru a elimina anticorpii naturali, se practic plasmafereza sngelui receptorului i absorbia anticorpilor pe coloan. Complementul este eliminat prin administrarea veninului de cobr. Respingerea acut se produce n dou variante dinamice: -> respingerea acut precoce, n 10-14 zile de la transplantare -> respingerea acut tardiv, n circa 4 luni. Dup grefarea esutului, o parte a antigenelor tisulare se elibereaz din rinichi i trec n circulaie, ajungnd n ganglionii limfatici regionali. Antigenele declanatoare ale respingerii grefei Moleculele CMH ale esutului grefat stimuleaz un rspuns imun intens al organismului receptor, a crui finalitate este respingerea grefei. Moleculele CMH I se gsesc pe toate celulele nucleate, dar au un nivel variabil de exprimare. Moleculele CMH II au o distribuie limitat: pe macrofage, pe limfocitele B, pe unele celule epiteliale i endoteliale, pe celulele dendritice. Nivelul de exprimare a moleculelor CMH I i II este modulat de citochine (IFN i TNF ). Polimorfismul extensiv al moleculelor CMH limiteaz posibilitatea transplantului numai ntre parteneri compatibili CMH. Chiar n aceste condiii, grefa poate fi respins, datorit diferenelor ntre antigenele minore ale donorului i receptorului. Antigenele din gref au urmtoarele origini: -> antigenele libere (antigene solubile) provin din liza eritrocitelor i din membrana bazal; -> antigenele CMH exprimate pe celulele dendritice existente n esutul grefat;

-> antigene CMH asociate membranelor rezultate din liza celulelor organului, n perioada de conservare. Antigenele CMH ale donorului pot fi recunoscute pe suprafaa celulelor prezentatoare (prezentare direct) sau ca fragmente prelucrate i asociate cu moleculele CMH ale receptorului (prezentare indirect). Antigenele eliberate din gref, ajung n ganglionii regionali ai gazdei i activeaz limfocitele T i B. Cele mai importante antigene aduse de organul grefat, cu rol esenial n declanarea conflictului imun, sunt moleculele CMH I i II. Un rol deosebit se atribuie celulelor dendritice din esutul grefat. Ele exprim molecule CMH II la densitate foarte nalt, care determin stimularea iniial a limfocitelor gazdei. Moleculele CMH I i II libere se comport ca antigene tari, intens imunogene i nu necesit prezentarea n asociaie cu moleculele CMH proprii organismului, pentru a stimula limfocitele T, dar sunt mult mai imunogene dac sunt prezentate de alte celule, n special de celulele dendritice i de celulele endoteliale. Rspunsul imun fa de esutul grefat este mediat n primul rnd de limfocitele T. Ca dovad, oarecii atimici (nuzi) nu resping grefele alogenice de piele i tolereaz chiar grefe xenogenice. La examenul histologic al unei grefe de piele, n cursul respingerii, se observ infiltratul cu mononucleare, multe fiind limfocite. Acumularea lor n esutul grefat precede respingerea, care survine n cteva zile. In organul grefat, raportul dintre limfocitele TCD 4 i TCD8 este 1/3, adic predomin net limfocitele Tc, iar n mod normal, acest raport este 2/1. Limfocitele T stimulate de antigenele CMH sintetizeaz interferon , activator al macofagelor din focarul conflictului. Macrofagele devin citotoxice fa de esutul grefat, ca i limfocitele Tc. Macrofagele secret IL-1, care produce febra ce nsoete reacia de respingere a grefei. Limfocitele ptrunse n esutul grefat sunt pasagere. Ele prsesc grefa, trec n limf i ajung n ganglioni, unde ncepe proliferarea, elibereaz citochine, care activeaz limfocitele ganglionare. Acestea devin limfocite efectoare. Celulele NK nu necesit activarea prealabil pentru a liza diferite celule tumorale. Ele sunt implicate n respingerea alogrefelor de organe. Capacitatea de a respinge grefa poate fi uor transferat prin intermediul limfocitelor de la organismul imunizat prin contactul anterior cu antigenele grefei. Surprinztor, n esutul grefat nu migreaz limfocitele transferate, ci migreaz limfocitele organismului gazd, activate de IL secretate de limfocitele transferate. Rolul anticorpilor. Ca rspuns fa de antigenele esutului grefat, se sintetizeaz anticorpi specifici fa de antigenele de transplantare. Anticorpii au rol secundar n reacia de respingere a grefelor de esuturi i organe. Anticorpii au rol foarte important n respingerea grefei, n situaiile n care, anticorpii anti-CMH preexist la un titru crescut n momentul transplantrii. Sinteza lor este indus de sarcinile multiple, de transfuzii repetate sau de o gref anterioar. Grefa este respins imediat.

Anticorpii au rol important n respingerea grefelor cu incompatibilitate grav ntre donor i receptor, deoarece fixeaz complementul i produc fenomenul de citoliz. Dac nu fixeaz complementul, anticorpii au rol de opsonine, adic sensibilizeaz celulele grefate fa de aciunea macrofagelor i neutrofilelor. Anticorpii sintetizai n esutul grefat, determin eliberarea mediatorilor reaciei de hipersensibilitate imediat (de exemplu, histamina), care produc modificri circulatorii n vasele grefei. Anticorpii fa de antigenele eritrocitare sunt singurii efectori imunitari eficieni n transfuzia incompatibil. Efectul lor const n aglutinarea i liza eritrocitelor. Dup grefarea unui organ sntos ntr-un organism uzat, din punct de vedere funcional, organul grefat se aliniaz repede la starea general de uzur a gazdei. Transplantarea mduvei osoase se realizeaz pentru tratamentul pacienilor cu maladii imunodeficitare, anemie aplazic sever, leucemie, limfom, iar mai recent, pentru dezordinile hematopoetice cu substrat genetic. La pacienii imunodeficitari, transplantul mduvei osoase este destinat s furnizeze celule stem pentru a restabili sistemul imunitar al receptorului, fr s nlocuiasc n mod necesar compartimentul mieloid. Datorit strii nefuncionale a sistemului imunitar, transplantul mduvei osoase poate fi fcut fr tratamentul imunosupresor al gazdei. Mduva este recoltat prin aspiraie din crestele iliace anterioare i posterioare, de la donorul anesteziat. Amestecul de mduv osoas i snge este plasat n mediu de cultivare cu heparin, ntr-o pung hematologic i se administreaz fr ntrziere organismului receptor, prin infuzie intravenoas, n cantitatea de 2 x 10 8 - 6 x 108 celule medulare/kg. Infuzia se face la 1-24 ore dup ultima iradiere total a corpului sau la 36 de ore dup ultima doz de ciclofosfamid. Celulele stem circul n snge, nsmneaz cavitatea medular i ncep s se divid. n 2-4 sptmni, crete populaia celular a mduvei i n acelai timp crete numrul celulelor sanguine periferice. La donor, mduva se reface repede. Prevenirea respingerii grefelor de organe este posibil printr-o mperechere ct mai adecvat a donorului i receptorului din punctul de vedere al asemnrii moleculelor CMH i, ulterior, prin instituirea tratamentului imunosupresor. Dar, spre deosebire de alte celule, cele din mduva osoas sunt foarte antigenice (au o mare densitate a moleculelor CMH I) i din aceast cauz, receptorul trebuie s fie supus unui tratament radio-chimioterapeutic intens, pn la limita suportabilitii, pentru ca transplantul de mduv s aib succes. Chiar astfel, la pacienii leucemici, respingerea mduvei osoase poate s aib loc, n cazul unei mperecheri antigenice neadecvate. Transplantul de mduv osoas ridic o problem special: celulele transplantate fiind imunocompetente, pot s iniieze reacia gref contra gazd, fa de antigenele receptorului. Reacia este iniiat fa de antigenele tegumentare, ale ficatului i intestinului i este letal la 10-15% dintre receptorii de mduv osoas cu molecule HLA identice i la 40% dintre receptorii cu molecule HLA neidentice. Teste de histocompatibilitate n transplantul de esuturi i organe, esenial este asemnarea ct mai accentuat a moleculelor CMH ale donorului i receptorului. Pentru testul gradului de asemnare, se analizeaz comportamentul limfocitelor celor doi parteneri, n amestec (reacia de amestec limfocitar, RAL). Testul evideniaz diferenele antigenice dintre donor i receptor, n ceea ce

privete moleculele CMH II. Pentru reuita grefei, este obligatorie identitatea acestor molecule. Perechea donor-receptor care produce cel mai uor rspuns n RAL, ofer cea mai bun ans de acceptare a grefei. Cel mai adesea se folosesc limfocitele din snge. Celulele trebuie s fie viabile i n mediu se adaug ser de viel (1-10%) i 2-mercaptoetanol. Limfocitele donorului se cultiv n amestec cu limfocitele receptorului, n prezena timidinei H 3. Se msoar nivelul radioactivitii limfocitelor, consecutiv ncorporrii timidinei H 3 pentru sinteza ADN. RAL reflect rspunsul proliferativ al celulelor T, cu puine sau fr celule B. Transformarea blastic nu se produce n RAL a gemenilor monozigoi. Intr-un amestec celular a x b + a x c, rspunsul este bidirecional. Cea mai ampl reacie are loc ntre limfocitele care se deosebesc prin moleculele CMH. Cel mai puternic stimul n RAL l reprezint aloantigenele CMH II, cu un polimorfism foarte nalt, iar aloantigenele clasa I au un rol stimulator limitat. Moleculele CMH II se gsesc pe limfocitele B, pe macrofage, pe celulele dendritice, iar pe limfocitele T, numai dup activare. Se pare c rspunsul n RAL nu este orientat fa de epitopii CMH propriu-zii, ci fa de o larg varietate de peptide self legate de moleculele CMH, rezultate probabil prin degradarea diferitelor proteine celulare. Dat fiind polimorfismul deosebit al moleculelor CMH, probabil c marea majoritate a limfocitelor T din amestec manifest aloreactivitate fa de cel puin unul din aloantigenele CMH ale speciei. Pentru rspunsul unidirecional, una din cele dou populaii celulare (de obicei a donorului) se inactiveaz prin tratament cu mitomicin C (pentru inhibiia sintezei ADN) sau se supun iradierii. Tratamentul inactiveaz celulele T, dar nu interfer cu imunogenitatea lor. In RAL se activeaz numai limfocitele receptorului de gref, ca rspuns la aloantigenele donorului. n cazul grefei unui organ imunocompetent la o gazd imunodeficitar, n RAL se inactiveaz limfocitele receptorului, pentru a evalua reactivitatea limfocitelor donorului, care ar putea iniia o reacie gref contra gazd. Compatibilitatea donor-receptor pentru antigenele CMH I se testeaz cu seruri imune anti- CMH I. Se analizeaz reacia limfocitelor celor doi parteneri, fa de un numr ct mai mare de seruri anti CMH I. In laboratorul de profil exist seturi de seruri anti-CMH I, recoltate de la persoane care au o bogat experien antigenic HLA: -> persoane care suferit transfuzii sanguine multiple i astfel s-au imunizat fa de antigenele HLA; -> femei multipare, care au avut sarcini multiple cu parteneri diferii. Serurile anti-CMH se pun n contact cu limfocitele donorului i cu ale receptorului de gref. Anticorpii anti-CMH se fixeaz pe suprafaa limfocitelor i astfel este iniiat transformarea blastic. Se determin un coeficient de reactivitate (coeficient de transformare blastic), pe baza numrului de limfocite transformate. Dac limfocitele donorului i receptorului se comport asemntor fa de un numr mare de seruri, concluzia este c cele dou populaii de limfocite sunt asemntoare. Dac titrul anticorpilor anti-CMH n ser este crescut, se poate produce nu numai activarea limfocitelor, ci chiar aglutinarea imun sau, dup fixarea complementului, citoliza.

Xenotransplantarea Termenul semnific transplantul de esuturi i organe ntre organismele unor specii diferite. Interesul clinic pentru xenotransplantare a fost determinat de lipsa organelor umane. Succesul alotransplantului a creat un necesar care depete disponibilul. In 1963, transplantul de rinichi de cimpanzeu la om, a prelungit supravieuirea cu 9 luni i moartea a survenit dup complicaiile provocate de imunosupresie. In 1984, inima de babuin a fost transplantat la om. A urmat transplantul de ficat de maimu, transplantul de celule neurale de embrion de porc, la un pacient cu boal Parkinson, transplantul de mduv osoas de la babuin, la un pacient cu SIDA. Barierele xenotransplantrii sunt multiple: unele organe de la alte specii nu funcioneaz adecvat n noul mediu. Rinichiul de cimpanzeu este funcional n organismul uman. Persoanele transplantate cu rinichi de porc devin anemice, probabil pentru c eritropoetina nu este activ, iar cele cu ficat de babuin au nivele mai mici de colesterol (echivalente cu cele de babuin) i nivele foarte sczute de acid uric (pentru c ficatul de babuin nu produce acid uric). Grefarea celulelor sanguine stem xenogenice este limitat de absena factorului de cretere specific celulelor stem transplantate. Xenogrefele pot fi neconcordante (de la porc) sau concordante (de la cimpanzeu, babuin). La perechile neconcordante, titrul anticorpilor preformai este detectabil i xenogrefele sunt respinse hiperacut (n cteva minute), prin reacia de activare a endoteliului. Pentru respingerea hiperacut a grefelor neconcordante, un alt factor critic (alturi de anticorpii preformai) al producerii leziunilor endoteliale este complementul i proteinele sale reglatoare. In combinaia porc-om, anticorpii preformai se leag la nivelul determinanilor antigenici de galactoz (1,3)-galactoz ai endoteliului grefei, deoarece omul a pierdut gena pentru enzima alfa-galactozil-transferaz i nu posed acest epitop. Activarea complementului se face pe calea clasic, iar n absena anticorpilor preformai, pe calea altern. In esen, respingerea hiperacut se datoreaz reaciei endoteliale la activarea complementului, mediat de anticorpii preformai (IgG anti--gal). Incompatibilitatea combinaiei porc-om se datoreaz faptului c porcul exprim un nou antigen de grup sanguin, -gal(gal- 1,3-gal) (la om, specificitatea antigenic a grupului 0 este conferit de L-fucoz, a grupuluiA, de N-acetil-galactozamin, galactoz i L-fucoz , iar a grupului B, de D-galactoz i L-fucoz). -gal nu este singurul determinant recunoscut de anticorpii naturali umani. Alte heteroantigene pot deveni importante, dup transplantul organului. Anticorpii xenoreactivi, specifici fa de epitopii 1,3-gal i complementul sunt factorii majori ai respingerii hiperacute. inta respingerii hiperacute este endoteliul vascular. Activarea endoteliului produce cele mai evidente manifestri ale respingerii hiperacute: tromboza intravascular, hemoragia extravascular i edemul. n asocierile concordante, titrul anticorpilor preformai nu este detectabil i respinerea este acut, datorit aceluiai fenomen de activare a endoteliului vascular. Respingerea ntrziat (acut) a xenogrefelor concordante se face n 2-3 zile (mult mai repede dect a alogrefelor). Din punct de vedere histologic, respingerea acut relev mai puin hemoragie, dar cu tromboz intravascular semnificativ, ca i n reacia hiperacut, deoarece inta este endoteliul vascular. Respingerea acut a xenogrefei se datoreaz anticorpilor a cror sintez este indus de antigenele xenogrefei. Se sintetizeaz preponderent IgG anti--gal, al cror titru crete rapid.

Progresul n xenotransplantare s-a fcut n sensul prevenirii respingerii hiperacute: imunosupresia receptorului de gref i ingineria genic a donorului pentru a elimina marile diferene antigenice dintre xenogrefe i alogrefe. La oarece s-a reuit eliminarea genei galactozil-transferazei prin recombinare homolog, dar tehnologia nu este adecvat pentru alte specii. Eliminarea antigenului -gal, expune un nou determinant glucidic, fa de care omul are un nivel sczut de anticorpi preformai. Imunosupresia Variantele alelice multiple codificatoare ale moleculelor CMH fac cu totul improbabil posibilitatea ca dou organisme s fie identice pentru moleculele CMH, cu excepia gemenilor monozigoi. Natura determinismului genetic al moleculelor CMH nu este favorabil transplantului de esuturi i organe. Amplitudinea procesului de respingere a grefei este parial dependent de gradul de incompatibilitate al antigenelor CMH, dintre donor i receptor. Scopul imunosupresiei selective este de a menine funcionalitatea mecanismelor de aprare a organismului, fa de infeciile virale, bacteriene, fungice i fa de parazii, de a pstra capacitatea SFM de a fagocita celulele mbtrnite i de a proteja mecanismele de imunosupraveghere care elimin celulele maligne. Pe de alt parte, se urmrete inducerea strii de toleran fa de antigenele organului grefat (rinichi, ficat, inim). n cazul maladiilor autoimune, dezideratul imunosupesiei este inhibiia selectiv a reactivitii imunitare autoagresive fa de antigenele retinei (n uveit)sau fa de antigenele colonului (n boala Crohn). Un medicament imunosupresor trebuie s ntruneasc urmtoarele criterii: -> s inhibe activarea rspunsului imun i s fie eficient fa de procesele imunitare n curs de desfurare; -> s aib aciune selectiv, adic s produc deleia clonal sau s inactiveze numai anumite subpopulaii de celule imunocompetente; -> s aib un index terapeutic bun, adic un raport favorabil ntre doza terapeutic i cea toxic. Pentru supravieuirea grefei, transfuziile de snge cu specificitatea antigenic a donorului sau transfuziile nespecifice, ca i testele de histocompatibilitate sunt importante numai dac se asociaz cu imunosupresia, cu scopul diminurii reactivitii imunitare. Terapia imunosupresoare este foarte complex, pentru c nici un agent chimic nu are aciune strict selectiv asupra esutului limfoid. Imunosupresia se realizeaz prin: -> iradierea x -> terapia imunosupresoare -> metode imunologice. Terapia imunosupresoare. Medicamentele imunosupresoare inhib nespecific reactivitatea imunitar i se administreaz att dup grefa tisular, ct i pacienilor cu maladii reumatice, caracterizate prin reactivitate imunitar excesiv.

Imunosupresia s-a realizat cu o varietate de ageni terapeutici: hormoni corticosteroizi, medicamente citotoxice. Cele mai multe metode convenionale de imunosupresie i realizeaz efectul n mod neselectiv. Medicamentele citotoxice au fost iniial folosite n tratamentul neoplaziilor, dar reprezint o modalitate important de imunosupresie pentru tratamentul maladiilor autoimune. Chimioterapia administrat pacienilor neoplazici produce, uneori, o imunosupresie profund. Medicamentele citotoxice sunt imunosupresoare deoarece distrug celulele imunocompetente sau blocheaz proliferarea lor. Agenii citotoxici folosii pentru imunosupresie(dar i n tratamentul neoplaziilor) sunt: -> ageni alchilani -> antimetabolii: analogi ai purinelor (6-mercaptopurina i azatioprina); analogi pirimidinici (citozin-arabinozida); -> antagonitii acidului folic (methotrexatul). Ciclofosfamida este compusul prototip al agenilor alchilani. Aciunea sa este nespecific, asupra tuturor subpopulaiilor de limfocite i a celulelor nelimfoide care intr n faza S. Agenii din categoriile menionate, au aciune nespecific, adic aciunea lor nu este limitat la celulele imunocompetente. Ei produc leziuni asupra tuturor celulelor aflate n mitoz, inclusiv asupra celulelor hematopoetice. Respingerea grefei poate fi blocat, dar aciunea neselectiv a acestor ageni produce efecte secundare toxice prea severe i rezultatele au fost considerate ca nesatisfctoare. Ciclosporina este un peptid ciclic lipofil, izolat din culturi de microorganisme i acioneaz specific asupra limfocitelor, inhibnd transcrierea genic pe o cale dependent de Ca, adic blocheaz progresia ciclului celular de la G 0 la G1. Este un agent imunosupresor mai selectiv, deoarece acioneaz asupra celulelor Th, fr efecte notabile asupra altor subpopulaii de limfocite T, asupra limfocitelor B, granulocitelor sau macrofagelor. Efectul major pare a fi inhibiia sintezei IL-2. Imunosupresia cu ciclosporin este o modalitate imunofarmacologic, datorit aciunii sale selective fa de celulele imunocompetente. n ultimii ani s-au identificat civa compui chimici naturali, izolai ca i ciclosporina, din culturi de microorganisme: tacrolimus, sirolimus (rapamycin), mizoribine i spergualin. Tacrolimus este o lacton macrociclic lipofil, cu mecanism de aciune asemntor cu al ciclosporinei. Sirolimus este un macrolid care inhib proliferarea celulelor T, prin blocarea trecerii de la faza G1 la faza S. Imunosupresorul ideal va media inducerea toleranei, n special n transplant, adic va permite sistemului imunitar s adopte ca self, moleculele CMH specifice esutului grefat. Radiaia ionizant x i gama produce ionizarea atomilor i genereaz radicali liberi, n special radicalul OH., foarte reactiv, principalul agent ce mediaz moartea celulelor iradiate.

Efectele radiaiilor ionizante sunt dependente de doz. Celulele stem i celulele imature sunt foarte sensibile. Limfocitele T sunt mai rezistente dect limfocitele B, iar monocitele i macrofagele sunt relativ rezistente. Corticosteroizii sunt cele mai folosite medicamente, cu efect inhibitor asupra rspunsului imun, dar i al proceselor inflamatorii. S-a propus mecanismul limfolizei, dar la om acest efect nu se produce. Timp de 4-6 ore dup administrare, corticosteroizii reduc numrul de leucocite circulante (limfocite, monocite, eozinofile), dar crete semnificativ numrul neutrofilelor. Valorile leucocitelor revin la normal n 24 de ore. Limfocitele T, precum i monocitele prsesc circulaia i migreaz n mduva osoas, iar limfocitele B sunt relativ rezistente la corticosteroizi. Eozinopenia, dup injectarea corticosteroizilor, explic efectele benefice ale acestor hormoni la persoanele alergice. Serul antilimfocitar (SAL) i globulina antitimocitar se obin prin injectarea limfocitelor, respectiv a timocitelor, la o specie xenogen. Se folosesc celulele ductului toracic sau timocitele pentru imunizarea iepurelui sau calului. Din serul heterolog se separ fracia imunoglobulinic, ce se administreaz intravenos pentru depirea unei stri critice dup grefare. Anticorpii policlonali din SAL au fost nlocuii cu AMC specifici fa de antigene celulare de suprafa: AMC anti-receptor de IL-2 i anti CD 4. Deoarece citochinele sunt molecule foarte importante n reacia imunitar, s-a ncercat neutralizarea lor cu receptori solubili. Deleia specific a populaiilor de limfocite este posibil cu preparatele denumite imunotoxine. Acestea sunt complexe ce constau din dou componente: un anticorp monoclonal care asigur recunoaterea specific a intei celulare i o component toxic (ricina, toxina difteric).

INTERACIUNILE SISTEMULUI IMUNITAR CU SISTEMUL NEUROENDOCRIN

Sistemele imunitar, nervos i endocrin sunt interconectate structural (anatomic) i funcional, ceea ce a condus la conturarea unor noi domenii interdisciplinare, ca neuroimunoendocrinologia, neuroimuno-modularea i psihoneuroimunologia. Sistemele enumerate au n comun capacitatea de rspuns la un numr de stimuli comuni (hormoni steroizi, citochine, neuropeptide), care furnizeaz baza molecular a integrrii bidirecionale. Starea psihic influeneaz reactivitatea imunitar i intensitatea rspunsului inflamator a organismului. Exist dovezi certe c anomaliile neuroendocrine au rol important n inducerea disfunciilor imunitare, materializate, n primul rnd, n manifestrile autoimune. Pe de alt parte, vrsta, genul i ali factori genetici regleaz interaciunile imuno-neuroendocrine. Cele mai pregnante interaciuni neuroendocrinoimunitare se produc n starea de stress. Stressul este definit ca o condiie dinamic n cursul creia homeostazia normal (starea de echilibru a mediului intern) este perturbat sau periclitat. Starea de dezechilibru este indus de factori de stress, fizici sau psihologici. Factorii de stress, fizici sau mentali, declaneaz un rspuns complex adaptativ, denumit rspunsul de stress sau de alarm, menit s

contracareze efectele factorului de stress. Intensitatea rspunsului adaptativ este dependent de vrst, gen, starea hormonal i de ali factori genetici. Fig. 135. Interaciuni neuro-endocrino-imunitare. Stressul presupune n primul rnd, modificarea unor componente mentale i comportamentale. Crete brusc activitatea sistemului nervos central ce controleaz starea de veghe, alerta, starea psihic, atenia, concentrarea ateniei i este inhibat activitatea vegetativ care controleaz hrnirea i reproducerea. In rspunsul la stress se produc modificri fizice ale sistemului circulator, care redirecioneaz nutrienii spre organele activate. O reactivitate prea mare sau prea mic la stress poate produce sau poate contribui indirect la manifestri patologice. Rspunsul la factorii de stress este mediat de factorul (hormonul) de eliberare a corticotropinei (CRH), de axa hipotalamo-hipofizo-corticosu-prarenal i de sistemul nervos simpatic. CRH este produs n primul rnd n hipotalamus, dar i n alte arii ale creierului i n sistemul nervos periferic i are urmtoarele funcii: controleaz starea de veghe, starea psihic i integreaz sistemele de rspuns la stress; activeaz axa hipofizo-corticosuprarenal, stimulnd secreia ACTH i a corticosteroizilor; activeaz sistemul nervos simpatic, cu stimularea epinefrinei i norepinefrinei. CRH este activatorul strii de alarm, manifestat prin creterea glicemiei, a ritmului cardiac, a tensiunii arteriale, dar inhib funcia imunitar i rspunsul inflamator. Efectul activator al CRH asupra sistemului nervos simpatic este mediat de locus ceruleus, care i proiecteaz axonii n trunchiul cerebral i n hipotalamus, ceea ce contribuie direct la eliberarea mediatorilor simpatici (epinefrina i norepinefrina) n arii foarte largi ale SNC. Activarea sistemului nervos simpatic stimuleaz eliberarea CRH din neuronii nucleilor paraventriculari sub aciunea impulsurilor cu originea n locus ceruleus. Sistemul de rspuns la stress funcioneaz ca o bucl feedback pozitiv, bidirecional. Activarea unui component al sistemului, activeaz pe cellalt. Serotonina i acetilcolina activeaz rspunsul la factorii de stress, iar MSH (hormonul stimulator al melanocitelor) i acidul gama aminobutiric sunt inhibitori. Corticosteroizii sunt componentele majore ale sistemului de rspuns la stress i inhib cele dou componente majore ale rspunsului (secreia CRH i sistemul nervos vegetativ), dar i reactivitatea imunitar i rspunsul inflamator. Rspunsul activator la stress influeneaz axa hipotalamo-hipofizar cu componentele ei: hipotalamus-hipofiz-tiroid (HHT) i respectiv, hipotalamo-hipofizo-gonadal (HHG). Chiar dac stressul acut stimuleaz secreia hipofizar a hormonului de cretere, stressul cronic, prin intermediul CRH, stimuleaz secreia hipofizar a somatostatinei (inhibitor al creterii). Somatostatina, a crei secreie este stimulat de CRH, inhib secreia de TSH, iar glucocorticoizii inhib conversia tiroxinei, relativ inactiv, la triiodotiroxin. Aceste rspunsuri sunt adaptative i se coreleaz cu necesitatea limitrii pierderii energiei.

Activarea rspunsului la stress inhib axa HHG, la mai multe nivele. CRH inhib sinteza factorului eliberator al hormonului luteinizant din nucleul arcuat hipotalamic, fie direct, fie prin intermediul corticosteroizilor. Corticosteroizii inhib secreia hormonului luteinizant (LH) hipofizar i concomitent, producia hormonilor gonadali: estrogeni, progesterona, testosteronul. Hormonii tiroidieni i sexosteroizi influeneaz activitatea axei hipotalamo-hipofizocorticosuprarenale (HHC). Hipotiroidismul inhib axa HHC. La organismele de sex feminin (oarece, obolan, om), axa HHC este mai activ dect la masculi, adic stressul induce un rspuns mai amplu, msurabil prin nivelul mai nalt al corticosteroizilor. Ovarectomia diminu eliberarea corticosteroizilor, iar orhiectomia mrete rata sintezei corticosteroizilor la stress. Rspunsul integrat neuro-imuno-endocrin este mediat nu numai de hormoni, ci i de interleuchine, cele mai cunoscute fiind IL-1 i IL-6. IL-1 activeaz axa hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenal, stimulnd eliberarea ACTH hipofizar, iar sinteza ei este inhibat de glucocorticoizi. Endotoxinele stimuleaz producerea IL-1 n hipofiz i astfel secreia ACTH este reglat local, n hipofiz. IL-1 este sintetizat local, n arii discrete ale SNC (hipotalamus, hipocamp). Aceste arii regleaz rspunsul la stress. Rolul corticosteroizilor n reglarea funciei imunitare Asemnarea dintre hormoni i imunoglobuline rezult din similitudinea structural i funcional a celor dou categorii de molecule: ambele conin o regiune de legare la un receptor celular i o secven cu rolul de a transmite semnale specifice la un sistem efector. Exist dovezi c moleculele CMH I, implicate n prezentarea antigenelor, au rol de receptor pentru insulin. Corticosteroizii regleaz toate componentele rspunsului imunitar i inflamator, chiar i creterea i diferenierea timocitelor. Nivelul corticosteroizilor crete ntr-un interval de ordinul minutelor, dup expunerea la factorul de stress. Rolul lor este de a limita extensia rspunsului i a procesului inflamator. Amplitudinea lor prea mare poate s produc leziuni, inclusiv maladii autoimune. Administrarea corticosteroizilor, la roztoare, produce moartea apoptotic a limfocitelor timice. Limfocitele T mature (periferice) umane sunt rezistente la corticosteroizi, dar cele timice sunt sensibile. Creterea nivelului plasmatic al corticosteroizilor, produs de stress, induce apoptoza timocitelor. Corticosteroizii par a fi implicai n selecia timocitelor cu specificitate fa de antigenele nonself. Concepia dominant presupune c timocitele sunt selectate pentru apoptoz sau supravieuire, n funcie de capacitatea lor de a se asocia cu moleculele CMH. Timocitele cu receptori (RCT) de mare afinitate pentru moleculele CMH, sunt potenial generatoare ale maladiilor autoimune i sufer moartea apoptotic. Cele cu receptori de mic afinitate pentru moleculele CMH mor de asemenea prin apoptoz, sub aciunea corticosteroizilor. Supravieuiesc numai timocitele cu receptori de aviditate medie pentru moleculele CMH. Selecia limfocitelor n timus este controlat de hormonii sintetizai local. Astfel, timusul exprim activiti neuroendocrine multiple, inclusiv sinteza CRH i ACTH. CRH stimuleaz secreia ACTH, iar ACTH induce producerea corticosteroizilor n celulele corticosuprarenalelor. Sinteza neuropeptidelor (CRH) n timus este deosebit de interesant,

avnd n vedere rezultatele care susin c celulele timice epiteliale conin enzime steroidogene i sintetizeaz corticosteroizi, n special n perioada fetal i neonatal. Astfel, timusul poate s sintetizeze toi hormonii produi prin activarea axei HHC. Corticosteroizii regleaz dezvoltarea subpopulaiilor Th1 i Th2 de limfocite, inhibnd sinteza citochinelor Th1 (IL-2, IFN ). Rolul sexosteroizilor Hormonii steroizi sexuali influeneaz maturarea i diferenierea timocitelor. Timusul sufer modificri profunde n timpul sarcinii, dup gonadectomie sau dup administrarea exogen a hormonilor sexuali. Dup gonadectomie, masa timusului crete, iar administrarea hormonilor sexuali (estrogen, testosteron) are efecte inverse. Factorul hipotalamic de eliberare a hormonului luteinizant (RFLH), regleaz att funcia de reproducere, ct i funcia imunitar. Acest hormon se sintetizeaz nu numai n creier, ci i n gonade, n glandele mamare, n placent, splin i timus, avnd rol integrator al funciei neuro-endocrine reproductoare i al funciei imunitare. In timus, limfocitele T sintetizeaz RFLH i au receptori specifici pentru acest hormon. Îmbtrnirea sistemului imunitar, la om, ncepe dup 30 de ani i se caracterizeaz prin creterea produciei de autoanticorpi i diminuarea capacitii de a produce anticorpi fa de antigenele nonself. Diminu sinteza IL-2, dar crete rata sintezei IL4, IL-5 i IL-6. Aceste schimbri sugereaz o cretere numeric a subpopulaiei de limfocite Th2, n raport cu subpopulaia Th1. Diminu funcia citotoxic. Crete nivelul plasmatic al IL6, cu rol reglator al sintezei anticorpilor, dar i cu rol n progresia maladiilor autoimune sau a altor procese patologice, ca osteoporoza. Un rol important n procesul de mbtrnire se atribuie dehidroepiandrosteronului (DHEA), secretat de corticosuprarenale, sub controlul ACTH. Este un intermediar al biosintezei altor hormoni (testosteronul i estradiolul). DHEA circul n form inactiv, de sulfat. Hormonul se activeaz numai n esuturile care au DHEA-sulfataz, cu distribuie diferenial n organele limfoide. Nivelul plasmatic al sulfatazei scade odat cu mbtrnirea sistemului imunitar i scade brusc n diferite boli cronice, inclusiv maladiile autoimune. Administrarea DHEA la roztoare i om, restabilete funcia imunitar la organismele vrstnice i are efect antagonic corticosteroizilor, care produc atrofia timic. Fig. 136. Organele i celulele influenate de hor-monii steroizi sexuali. Aceti hormoni pot aciona n timpul dezvoltrii celulelor imunitare, dar i direct asupra celulelor mature efectoare. Hormonul de cretere, prolactina i hormonul tiroidian stimuleaz maturarea i diferenierea timocitelor. Hipofizectomia sau hiposecreia acestor hormoni hipofizari duce la imunodeficien i hipoplazia timusului. Hormonul de cretere stimuleaz intens proliferarea celulelor precursoare ale timocitelor n mduva osoas. Prolactina stimuleaz diferenierea celulelor T cu specificitate de antigen n organele limfoide periferice. Hormonul tiroidian stimuleaz creterea timusului i a splinei. oarecii hipotiroidieni au timus i splin hipoplazic, numr redus de celule TCD8. Interaciunile neuro-imuno-endocrine sunt bidirecionale. esuturile i celulele sistemului imunitar sintetizeaz un spectru larg de hormoni neuro-endocrini. Foarte

important este sinteza CRH, un reglator esenial al rspunsului la stress, n timus, splin, hipofiza anterioar, corticosuprarenale, ovar, testicul, intestin, inim, plmn. In timus i splin, CRH este sintetizat de celulele T, unde exercit efecte reglatoare autocrine sau paracrine. CRH este de asemenea sintetizat local n focarele inflamatorii acute sau cronice, inclusiv n lichidul sinovial al pacienilor cu artrit reumatoid. Factori neuroendocrini favorizani ai maladiilor autoimune umane Diferenele funcionale cu privire la intensitatea rspunsului axelor hipotalamo-hipofizocorticosuprarenaliene (HHC) i hipotalamo-hipofizo-gonadale (HHG) sunt importante pentru nelegerea manifestrilor autoimune. Maladiile autoimune sunt mult mai frecvente la femei dect la brbai. De exemplu, raportul pe sexe al tiroiditei autoimune este de 19/1, al lupusului de 9/1, iar al artritei reumatoide, de 3-4/1. Mai mult, maladiile autoimune tind s se dezvolte, s aib intensitate maxim ori s diminue, n perioadele de schimbare a activitii axei HHG (pubertate, menstruaie, sarcin, perioada postpartum, menopauz sau n timpul unui stress psihologic de amploare). Toate aceste perioade sunt asociate cu modificri ale secreiei factorului hipotalamic de eliberare a LH, a LH hipofizar, a hormonilor sexuali i a altor hormoni. Frecvena fenomenelor autoimune crete cu vrsta, corelat cu schimbrile neuroendocrine. Artrita reumatoid este asociat cu o insuficien a sintezei corticosteroizilor. Nivelul corticosteroizilor plasmatici tinde s se coreleze cu severitatea inflamaiei, dar pacienii cu afeciune de intensitate medie au nivele inferioare ale corticosteroizilor comparativ cu indivizii normali. Nivelul testosteronului la pacienii cu artrit reumatoid, n special la brbai, tinde s aib valori sczute, iar nivelul estrogenului este nemodificat. Terapia cu testosteron amelioreaz maladia. Estrogenii nu par s produc o exacerbare a artritei reumatoide, iar contraceptivele orale ncetinesc evoluia maladiei. Odat cu scderea brusc a nivelului estrogenilor (perioada postpartum, intervalul care precede menstruaia, menopauza), artrita reumatoid se intensific. In acelai timp diminu secreia de corticosteroizi, deoarece estrogenii influeneaz axa HHC. Nivelul prolactinei la pacienii cu artrit reumatoid este variabil(crescut, normal sau sczut). Artrita reumatoid se remite frecvent n timpul sarcinii i se reactiveaz sau se declaneaz n perioada postpartum, ndeosebi la femeile care alpteaz. Alptarea este nsoit cu creterea marcat a secreiei de prolactin i cu supresia funciei axei HHC. Lupusul sistemic eritematos are o dominan net la femei, ceea ce denot rolul hormonilor sexuali n declanarea i evoluia acestei maladii. În plasma pacienilor s-a relevat un dezechilibru ntre nivelul androgenilor i estrogenilor. Dezechilibrul poate fi primar sau secundar, datorat unei enzime care convertete androgenii la estrogeni. Brbaii cu lupus sunt prevalent hipoandrogenici. Nivelul sczut al androgenilor favorizeaz imunitatea mediat humoral, iar estrogenii favorizeaz autoimunitatea, prin stimularea producerii de prolactin, care are efect activator asupra funciei imunitare. Pacienii cu lupus se caracterizeaz prin hiperprolactinemie. In timpul sarcinii, maladia se intensific. Tiroidita autoimun se declaneaz frecvent n perioada postpartum, caracterizat prin hipocortisolemie. Perioada sarcinii se caracterizeaz prin supresia imunitii mediate celular i meninerea sau chiar creterea imunitii humorale. Setul de citochine sintetizate de celulele Th1 diminu (IL-2 i IFN ), ceea ce elimin riscul avortului imunitar. Diminuarea sintezei IFN este esenial pentru pstrarea sarcinii, deoarece cantitile mari favorizeaz avortul. Nivelul plasmatic al corticosteroizilor, estrogenilor i progesteronei crete. Starea hormonal

complex n timpul sarcinii pare s condiioneze remisia maladiilor autoimune dependente de imunitatea celular, ca de exemplu artrita reumatoid i agravarea maladiilor dependente de procese ale imunitii humorale, ca de exemplu, glomerulonefrita n lupusul eritematos. Postpartum, starea hormonal se modific brusc. Corticosteroizii, estrogenii i progesterona scad la nivele subnormale, iar imunitatea mediat celular se restabilete, ceea ce permite declanarea sau activarea unor maladii autoimune, aa cum este artrita reumatoid, datorit creterii secreiei de prolactin. Perioadele de sarcin i postpartum se caracterizeaz prin modificri ample ale strii hormonale i sunt asociate frecvent cu declanarea sau activarea unor maladii autoimune, ceea ce ilustreaz rolul mecanismelor endocrine n reglarea funciei imunitare.

BIBLIOGRAFIE

Coninutul acestei cri a fost redactat pe baza consultrii unui numr mare de articole aprute n diferite periodice i a unor capitole speciale sau volume de Imunologie, publicate n tratate de Microbiologie sau de Virologie. Sintezele aprute n Annual Review of Immunology au constituit o surs informaional de o valoare deosebit.

Periodice

Annual Reviews Biochemistry Annual Reviews Immunology Annual Reviews Microbiology Bulletin dInstitut Pasteur Cancer Immunology Cell Clinical Microbiology Reviews EMBO Journal Immunology Today

Journal of Immunology Mediators of inflamation Microbiology and Molecular Biology Reviews Nature Scientific American Science

Cri

Delves P.J,RoittI. M. Encyclopedia of Immunology, vol. 1-4, sec. ed., 1998, Acad. Press. Fields B. N., Knipe D. M., Howley P. M. Fields Virology, 3rd edition, Lippincot Raven Publishers, Philadelphia, 1996 Male D., Champion B., Anne Cook Advanced Immunology, J.B. Lippincot Company, 1987. Patrick S. adn Larkin M. J. - Immunological and molecular aspects of bacterial virulence , J. Wiley & Sons, 1995. Roitt I. M. Essential Immunology, ninth edition, 1997, Blackwell Science Samter M, Talmage D. W., Frank M. M., Austen K. F., Claman H. N. Immunological diseases, vol. I, II, fourth ed., Boston, Toronto. Serhan C. N., Ward P. A. - Molecular and Celular basis of Inflamation, 1999, Humana Press. Sheehan Catherine Clinical Immunology, Principles and Laboratory Diagnosis, sec. edition, 1997, Lippincot, Philadelphia, New York Topley and Wilsons Principles of Bacteriology, Virology and Immunity , 8th Ed. M. Tom Parker, Lesslie H. Collier, 1990 Topley and Wilsons Microbiology and Microbial Infections, vol. IV Immunology, Ed. Lesslie Collier, A. Balows, M. Sussman, 1998. Weir D. M., Stewart J. Immunology , seventh edition, Longman Group, UK, 1993. Zarnea G. Tratat de Microbiologie, vol. IV Imunobiologie, Ed. Academiei Romne, 1990. Zarnea G., Mihescu Gr. Imunologie, Ed. Universitii Bucureti, 1995.

Zwilling B. S., Eisenstein T. K. Macrophage- Pathogen Interactions, 1994, New York, Basel, Hong Kong.