TEODOR VAIDA

DIAGNOSTICUL
MICROBIOLOGIC
I
IMUNOLOGIC
N
LABORATORUL CLINIC
1. PRINCIPII I TEHNICI DE DIAGNOSTIC N
LABORATORUL CLINIC
1.1. STERILIZAREA I DEZINFECIA
Cele mai multe tehnici bacteriologice nu pot fi aplicate fr
certitudinea c se lucreaz n condiii de asepsie riguroas, cu
instrumente i medii de cultur ce nu conin nici un fel de
microorganisme viabile.
Sterilizarea este operaiunea prin care se realizeaz
distrugerea complet a tuturor microorganismelor vii de pe suprafaa
i din interiorul unor obiecte.
Dezinfecia este procedeul prin care se distrug doar unele
microorganisme, mai ales cele patogene, n principal, prin metode
chimice.
Alegerea procedeelor de sterilizare este n funcie de:
- natura obiectelor sau substanelor de sterilizare
- sensibilitatea microorganismelor fa de aciunea unor factori
de mediu e!tern.
"etodele mai importante sunt cele de sterilizare prin:
- cldur
- filtrare
- radiaii.
1.1.1.Sterili!re! "ri# $%l&'r%
"etodele de sterilizare prin cldur se bazeaz fie pe utilizarea
cldurii uscate, fie pe cea a cldurii umede.
"aterialele ce urmeaz a fi sterilizate vor fi pregtite # dup
curire, splare i uscare # n scopul de a se menine sterile un
anumit timp. $entru aceasta, unele obiecte %pipete, plci $etri, p&lnii,
mo'are etc.( vor fi mpachetate n h&rtie, iar altele %eprubete, baloane
etc.( vor fi prevzute cu dop de vat %fig. ) - *(.
1.1.1.1. Sterili!re! "ri# $%l&'r% '($!t%
nclzirea la incandescen i flambarea
+e realizeaz prin dou metode importante:
- nclzirea i flambarea direct, care const n meninerea
unui obiect n flacra unui bec ,unsen, p&n c&nd este adus la rou
%sterilizarea ansei bacteriologice # fig. -(. $entru alte obiecte %pipete,
orificiul baloanelor i al eprubetelor( se practic trecerea prin flacr
de . # * ori a acestora sau prile amintite.
Fi). *
- Flambarea n alcool %fig. /( permite realizarea unei sterilizri
rapide a unor obiecte contaminate.
Fig. 6
Sterilizarea cu aer supranclzit n cuptorul $asteur,
$oupinel, etuve etc. %fig. 0(.
1oate tipurile de aparate de acest gen sunt prevzute cu un
sistem de reglare a temperaturii interioare la )234C, necesara pentru
sterilizare, timp de o or, asigur&ndu-se astfel carbonizarea tuturor
microorganismelor.
"etoda se aplic pentru sterilizarea unor obiecte de sticl si
porelan. Nu se sterilizeaz astfel obiectele cu armtur metalic
%seringi, de e!emplu(, cele din cauciuc, plastic si nici lichidele.
Controlul sterilizrii se face prin urmrirea temperaturii interioare cu
a'utorul unui termometru, dar si prin culoarea h&rtiei cu care sunt
mpachetate aceste obiecte sau a dopurilor de vat care trebuie s fie
brun # glbui la terminarea sterilizrii. 5ac temperatura s-a ridicat
peste 6334C, h&rtia si vata se carbonizeaz, devin sfr&micioase si nu
mai asigur protecie obiectului. 5ac temperatura nu a depsit
)034C, h&rtia si vata rm&n albe, denot&nd o sterilizare incomplet.
Fi). +
1.1.1.,. Sterili!re! "ri# $%l&'r% '-e&%
$oate fi efectuat prin mai multe procedee, n funcie de natura
materialelor si, n principal, a soluiilor ce urmeaz a fi sterilizate.
$rincipalele metode de sterilizare prin vapori cureni sunt: fierberea,
pasteurizarea si tindalizarea.
Autoclavarea
Princiiul. 5estrucia total a germenilor este asigurat prin
vapori de ap sub presiune. Aceasta este mai penetrant i, de
aceea, reprezint cea mai sigur metod de sterilizare. 7 presiune a
vaporilor de ap din interiorul autoclavului de o atmosfera, realizeaza
o temperatura de )63
3
C i n .3 de minute distruge at&t formele
vegetative, c&t i sporii microorganismelor.
!omonentele autocla"ului %fig. 2(
). !orul reprezint un cazan de fier cu perei dubli, groi,
rezisteni la presiune.
6. !oul sau cmaa din metal, cu orificii, n interiorul cruia se
introduc materialele pentru sterilizat.
.. #rtarul sau suportul pe care se aeaz obiectele mari, cele
mici fiind introduse n couri de s&rm sau n glei de metal.
Fi). .
*. $obinetul de golire% fi!at la e!terior, la baza corpului
autoclavului, necesar pentru evacuarea apei n e!ces dintre
cele dou componente ale corpului %e!tern i intern(.
-. !aacul% care se nchide ermetic cu a'utorul unei garnituri de
cauciuc.
/. &uruburile servesc la str&ngerea capacului peste garnitura de
cauciuc i mpiedic ieirea vaporilor n timpul sterilizrii.
0. $obinetul de "aori pentru evacuarea aerului dintre pereii
autoclavului.
2. Suaa de siguran pentru mpiedicarea creterii presiunii
peste 6 atmosfere i evitarea e!ploziei.
8. 'anometrul care msoar presiunea din interiorul autoclavului.

(tilizarea autocla"ului
+e introduce n cazan apa distilat, puin sub nivelul grtarului.
7biectele se aeaz n aa fel ca s fie asigurat circulaia vaporilor
de ap. +e nchide capacul str&ng&nd uruburile dou c&te dou,
diametral opuse. 9obinetul de vapori se deschide i se pornete sursa
de cldur %gaz, sursa electric etc.(. :n 'et continuu de vapori de ap
indic momentul c&nd aerul a fost evacuat n ntregime. Acest
moment este important, pentru c urmele de aer dintre pereii
autoclavului denatureaz valorile indicate de manometru. +e nchide
robinetul de vapori i se las s se ridice presiunea la o atmosfer,
moment n care se regleaz sursa de cldur ca s menin aceast
presiune timp de minim .3 de minute. +e nltur sursa de cldur, se
ateapt ca acul manometrului s cad la zero. +e deschide capacul
i se scot obiectele sterilizate. 5eschiderea capacului nainte ca
presiunea s fi sczut la zero poate produce accidente. 5ac
obiectele se las n autoclav mai mult timp, dopurile se vor uda
datorit apei de condens. ;n mod obinuit, prin acest procedeu, o
sterilizare buna se realizeaza la )63
3
C %o atmosfera de vapori de ap(
timp de /3 de minute, pentru materialele infecioase, culturi bacteriene
etc.
n autocla" se sterilizeaz: lichidele care nu se altereaz la
temperatura mai mare de )33
3
C, mediile de cultura, materialul
chirurgical, materialele de prelevare %tuburi, ace, seringi(, obiectele din
cauciuc i materialul infecios.
Controlul sterilizrii se face prin: teste chimice, teste biologice
i prin termometre %termo-manometre(. 1estele chimice utilizeaz
tubuoare de sticl ce conin substane sub form de praf cu punct de
topire n 'ur de )63
3
C %sulf ))2
3
C, acid benzoic )6)
3
C(. Acestea se
aseaz n autoclav odat cu obiectele de sterilizat. 5ac n autoclav
s-a realizat temperatura de topire a acestor substane, la deschidere
se constat c acestea sunt solidificate n bloc. 1estele biologice
folosesc culturi sporulate de )acillus stearot*ermo*ilus cu care se
impregneaz fire de bumbac ce se introduc n tubuoare nchise la
flacr. 5ac s-a atins temperatura de )634C, sporii sunt distrui i
rensm&narea lor pe medii de cultur nu va fi urmat de dezvoltarea
culturii de bacili.
Sterilizarea prin vapori cureni
+e realizeaz cu a'utorul unei oale cu vapori cureni %fig. 8.a(
sau cu autoclave cu robinetul de vapori deschis %fig. 8.b(. <ste o
metod de sterilizare imperfect, prin care se distrug formele
vegetative ale bacteriilor, nu i toate formele sporulate. +e aplic la
sterilizarea lichidelor care nu sunt alterate la temperatura de peste
)334C .
Fierberea
<ste o metod de sterilizare rapid, dar incomplet. :tilizeaz
de obicei casolete %fig. )3(, n care se recomand introducerea de ap
demineralizat. 1impul de sterilizare este de minimum .3 de minute,
socotit din momentul c&nd ncepe fierberea. +unt sterilizate astfel
instrumentele ce se utilizeaz imediat %seringi, ace, pense etc.(.
Fi). 1/
Pasteurizarea
+e realizeaz prin nclzire ntr-o baie de ap la temperatura
de /3 - /-4C timp de .3 minute, la 03 - 0-4C timp de )- minute sau la
2- - 834C c&teva secunde. ;nclzirea este urmat de rcire brusc la
*4C. $rin acest metod sunt distruse doar formele vegetative %n
urma coagulrii proteinelor acestora( i are loc reducerea
considerabil a numrului microorganismelor, prin trecerea sporilor n
forme vegetative. <ste utilizabil pentru conservarea unor produse
alimentare %de e!emplu, laptele(.
Tindalizarea
<ste o sterilizare fracionat sau discontinu, care const n
nclzirea produselor la -/ - /34C n baia de ap consecutiv . # 0 zile,
timp de o or. ;n acest timp se distrug formele vegetative.
7peraiunea se repet dup 6* de ore, timp n care produsul a fost
inut la temperatura camerei pentru a permite trecerea sporilor n
forme vegetative, pe care noua nclzire le va distruge. "etoda este
aplicat n special pentru substanele termolabile nefiltrabile, care
peste )334C se altereaz %vaccinuri, unele medii de cultur etc(.
1.1.,. Sterili!re! "ri# 0iltr!re
Const n reinerea microorganismelor din lichidele de sterilizat
de ctre porii unor filtre sau ai unor membrane filtrante. +e realizeaz
la temperatura ambiant i se aplic unor lichide biologice sau soluii
in'ectabile, care se altereaz prin tratare termic %soluii hidrolizabile,
seruri etc(.
=iltrarea se face la presiune realizat cu a'utorul unei pompe
de vid sau trompe de ap, la care se ataeaz vasul n care se face
filtrarea %flacon >itasato(. 5up filtrare se face controlul produsului
fc&nd nsm&nri din filtrat pe medii de cultur adecvate. 5ac n .
# * zile de termostatare %la .04C( nu se dezvolt microorganisme,
filtratul este steril.
=iltrele cele mai des folosite sunt:
- filtrele !*amberland, denumite i filtre lum&nare,
confecionate din porelan poros de diferite dimensiuni
- filtrele de sticl %?( sunt discuri de sticl neutr
poroas, cu pori n 'ur de ) micrometru, care rein bacteriile
%dup dimensiunile porilor fiind notate cu ?
3
, ?
).....
?
-
(
- filtrele Seitz, din asbest, care se utilizeaz pentru
sterilizarea unor soluii proteice, a plasmei sanguine, a unor
lichide nlocuitoare de s&nge, n controlul bacteriologic al apei
etc
- membranele filtrante %filtrele milipore(, care sunt nite
discuri confecionate din nitrat de celuloz, acetat de celuloz,
policlorur de vinil, ce rein selectiv microparticulele solide i
microorganismele coninute n lichide, datorit unui numr
mare de pori %milioane de pori pe cm
6
( cu dimensiuni ntre 2 i
3,3) micrometri.
1.1.1. Sterili!re! 2i &ei#0e$3i! "ri# r!&i!3ii
1.1.1.1. R!&i!3iile i4#i!#te
5intre radiaiile ionizante, razele gamma sunt cele mai
penetrante i mai bactericide, ele atac&nd A5@-ul microorganismelor.
Aonizarea compuilor celulari prin e!pulzarea electronilor duce la
distrugerea microorganismelor. Aceste raze se obin dintr-o surs
radioactiv de cobalt # /3 sau cesiu # ).0. "etoda se utilizeaz
pentru produse medicamentoase, instrumente i materiale
degradabile prin cldur.
1.1.1.,. R!&i!3iile #ei4#i!#te 5'ltr!6i4lete7
:tilizarea unor astfel de radiaii neionizante cum sunt radiaiile
solare, se bazeaz pe observaiile c lumina solar are efect
microbicid, care variaz n raport cu specia microbian, cu
intensitatea luminii i, mai ales, cu coninutul luminii solare n radiaii
ultraviolete %:B(. Astfel, la lumina solar: +sc*eric*ia coli moare n
interval de o or, Salmonella t,*i n 6 # . ore, ',cobacterium
tuberculosis n - # 0 ore. +-a constatat, de asemenea, c :B sunt
penetrante i puternic bactericide n zona lungimilor de und de 6-33
# 6233 C. Aceasta provoac la nivelul A5@-ului reacii chimice care
distrug germenii patogeni.
:ltravioletele produse de Dlmpile bactericideE sunt folosite
pentru sterilizarea aerului din slile de operaie, laboratoare,
dezinfecia ncperilor din spital, mobilierului etc. ;n utilizarea acestora
trebuie inut seama ns de faptul c, alturi de activitatea bactericid,
radiaiile :B au i o mare activitate fotochimic asupra substanelor
chimice, medicamentelor, pe care le modific, le altereaz.
1.1.8. Dei#0e$3i! "ri# !)e#3i $9i-i$i
:nele substane chimice sunt utilizate ca antiseptice sau
dezinfectante.
Dezinfectant - este termenul prin care sunt cel mai adesea
desemnate substane puternic microbicide, capabile s omoare i
sporii, utilizate pentru decontaminarea %sterilizarea chimic( meselor
de lucru, instrumentarului, veselei de spital, bideurilor etc. i care, din
cauza efectelor iritante sau to!ice, se pot aplica numai pe suprafee
inerte.
-ntisetic - este substana antimicrobian %de obicei folosit n
concentraii reduse, ca soluii diluate( util pentru decontaminarea
tegumentelor %aseptizarea m&inilor, de e!emplu(, mucoaselor
%gargarisme, instilaiile con'unctivale etc.(, plgilor supurate i altele.
Antisepticele trebuie s fie c&t mai puin to!ice i neiritante
pentru mucoase, tegumente, plgi. :nele substane n concentraii
diferite pot fi folosite at&t ca antiseptice, c&t i ca dezinfectante.
Agenii chimici dezinfectani difer prin eficien antimicrobian,
ca i prin activitatea lor n prezena substanelor organice sau prin
to!icitate. Cele mai sensibile microorganisme, la ma'oritatea
dezinfectantelor, sunt cele sub form vegetativ, ca de e!emplu
bacteriile, fungii, protozoarele i virusurile cu nveli lipidic, n timp ce
sporii bacterieni i muli dintre cei fungici sunt rezisteni.
@umrul substanelor cu aciune antimicrobian este foarte
mare i de natur chimic foarte diferit: compui anorganici %acizi,
baze, sruri(, compui organici %detergeni, fenoli, alcooli, colorani,
spunuri etc.(. ;n raport cu mecanismul principal de aciune, aceste
substane pot fi mprite n trei categorii: ageni tensioactivi, ageni de
denaturare ai proteinelor, inhibitori enzimatici.
1.1.8.1. A)e#3i te#(i4!$ti6i
5in aceast categorie fac parte fenolii, detergenii i spunurile.
Fenolul %acidul fenic sau carbolic(, primul antiseptic folosit de F.
Gister %)2/0( este utilizat n diferite concentraii: soluia de fenol -H,
dezinfectant, omoar i spori soluia de fenol )H este util pentru
inactivarea to!inelor soluia de 3,6-H ca i conservant pentru
vaccinuri.
Detergenii au numeroase caliti: inodori, incolori, activi n
diluii mari, neto!ici i neiritani pentru piele, sunt substane
dezinfectante i antiseptice valoroase. $ot fi grupai n dou categorii
chimic diferite: detergeni anionici, cu aciune antibacterian mai
slab, activi n special asupra bacteriilor ?ram-pozitive n diluii de
)I)333 i detergeni cationici, compui de amoniu cuaternar n
numeroase formule, folosii ca dezinfectani n soluii apoase slab
diluate i ca antiseptici n diluii mari.
;n utilizarea detergenilor cationici se va ine seama de
incompatibilitatea acestora cu spunurile. ;n amestec, activitatea lor
antimicrobian dispare. 5e aceea, c&nd detergenii cationici urmeaz
s fie folosii pentru antiseptizarea pielii, spunul trebuie bine
ndeprtat n prealabil cu ap i apoi cu alcool.
1.1.8.,. A)e#3ii &e &e#!t'r!re !i "r4tei#el4r
+unt substane care modific starea fizico-chimic a celulei
bacteriene prin precipitarea proteinelor, suprim&nd astfel ntreaga
activitate metabolic. Astfel de activitate au acizii, bazele, alcoolii i
cloroformul.
-cizii sunt substane ionizante, aciunea lor bactericid fiind
proporional cu concentraia ionilor de hidrogen eliberai prin
disociere. +unt activi sub limita de pJ #-.
)azele, substane ionizante, au aciune microbicid datorit
concentraiei anionilor 7J
-
, uneori fiind to!ic i cationul. Ca
dezinfectant frecvent utilizat este hidro!idul de sodiu, care n soluie
-H distruge i spori, iar n cea de )3H omoar bacilul >och din sput.
-lcoolii, dintre care alcoolul etilic, produs neto!ic, n
concentraie de 8/H precipit repede proteinele bacteriene de
suprafa. Alcoolul sub 034 este folosit frecvent ca antiseptic pentru
tegumente.
1.1.8.1. I#9i:it4ri e#i-!ti$i
Ageni de interferare metabolic, inhibitorii enzimatici sunt
substane care reacioneaz cu grupri chimic-active ale proteinelor #
enzime %carbo!ilice, aminice, fenolice etc.(, determin&nd blocarea
funciei acestora.
Formolul diluat .3H este puternic sporulicid %omoar sporii n
)3 # .3 minute(. =ormolul -
o
I
oo
, transform to!inele n anato!ine.
.alogenii acioneaz ca ageni o!idani, pun&nd n libertate
o!igen n stare nsc&nd care produce o!idarea general a produilor
organici celulari, prin intermediul ionului mineral care se substituie n
structurile aminoacizilor, produc&nd denaturarea total a proteinelor.
Astfel, clorul se folosete sub variate forme:
- clor gazos 6 # . mg
o
I
oo
pentru potabilizarea apei,
- cloramina )H folosit n acelai scop
- hipocloritul de calciu sau clorura de var, folosit n dezinfecia
localurilor
- hipocloritul de sodiu, sub diferite denumiri, utilizat ca
dezinfectant al apelor sau ca antiseptic pentru splarea
plgilor.
<fectul bactericid al hipocloriilor este larg, acion&nd asupra
bacteriilor sub form vegetativ, inclusiv asupra micobacteriilor
%bacilul tuberculozei(, dar i a fungilor sau a sporilor unor bacterii.
Aceste substane se vor folosi ns cu precauie, din cauza efectelor
iritante %n funcie de concentraie( asupra pielii, ochilor i cilor
respiratorii.
/odul, sub form de tinctur de iod /H n alcool, este puternic
antiseptic pentru piele, iar n alcool iodat 3,- # ))H, un foarte bun
antiseptic neiritant pentru tegumente, n tratarea piodermitelor i a
altor infecii.
Ali ageni o!idani sunt:
- apa o!igenat .H, un foarte bun antiseptic pentru splarea
plgilor infectate
- permanganatul de potasiu .I)333 # )I)3333, un bun antiseptic
pentru mucoase i plgi, n concentraie de -H fiind un
dezinfectant eficace.
!oloranii bazici sau acizi altereaz proteinele bacteriene i au
aciune selectiv asupra microorganismelor. +e folosesc mai ales
pentru coloraiile necesare e!aminrilor microscopice n vederea
studiului morfologiei bacteriene, av&nd totodat proprieti bactericide.
Astfel de colorani sunt: albastrul de metilen, violetul de genian,
fu!ina bazic. Acetia sunt folosii i ca substane antiseptice pentru
piele i mucoase.
1.1.8.8. Dei#0e$t!#3ii )!42i
Formalde*ida sub form gazoas este indicat pentru
dezinfectarea suprafeelor, echipamentelor i a unor efecte care nu
pot fi udate.
5e un interes deosebit sunt dezinfectanii gazoi pentru
sterilizarea ncperilor i a echipamentului moale n spitale, a
articolelor din cauciuc, plastic etc., cel mai valoros dezinfectant gazos
alturi de formaldehid fiind o!idul de etilen. <ste un gaz incolor cu
miros plcut, folosit n amestecuri neinflamabile cu C7
6
sau alte gaze.
9eacioneaz cu gruprile sulfhidril, amino, carbo!il i hidro!il din
molecula de protein. +terilizarea se face n etuve cu vapori -3H, la
-*4C, timp de e!punere . # - ore. Are mare penetrabilitate chiar n
containere nchise din plastic, n pachete etc.

1.,. STUDIUL MORFOLOGIEI BACTERIENE
$unerea n eviden a formei, dimensiunilor i aezrii
bacteriilor prin e!amen microscopic n preparate native sau dup
colorare, constituie un criteriu de diagnostic.
1.,.1. E0e$t'!re! 2i e;!-i#!re! "re"!r!tel4r
-i$r4($4"i$e
"aterialele necesare:
- ansa bacteriologic %fig. ))(, un fir metalic format dintr-un
alia' de nichel i crom, fi!at pe un suport metalic i av&nd, n
partea terminal, o bucl cu diametrul de apro!imativ 6 mm
%ansa calibrat(
- lame de sticl splate i degresate cu un amestec de
alcool-eter
- lame de diferite dimensiuni: )2!)2 mm, 66!66 mm etc.
- bec ,unsen cu flacra reglabil.
Fi). 11
<!amenul microscopic se e!ecut fie direct din produsele
patologice %puroi, sput, sediment urinar, GC9 etc.(, fie direct din
culturi pure de bacterii. <!aminarea microscopic arat prezena
microorganismelor n preparat i ofer relaii asupra proprietilor
morfotinctoriale: forma %coci, bacili, spirili(, mrimea, mobilitatea,
e!istena eventual a unor formaiuni neobligatorii %cili, capsul,
spori(, aezarea n frotiu %lan, ciorchine, c&te doi etc.(, proprietile
tinctoriale %colorabilitatea(.
:neori, e!amenul microscopic efectuat direct din produsul
patologic permite stabilirea diagnosticului etiologic pentru unele infecii
%gonoree, sifilis, tuberculoz, stafilococii(.
1.,.1.1. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ !l '#'i "re"!r!t #!ti6
+0aminarea microscoic direct ntre lam i lamel a unei
suspensii de germeni vii %fig.)6(, ntr-o soluie salin fiziologic sau
mediu de cultur lichid, este utilizat n urmtoarele variante:
- preparate umede n lumin direct
- preparate umede n c&mp ntunecat
- preparate umede n contrast de faz.

Fig. 12
+0aminarea n lumin direct se face cu a'utorul unor obiective
uscate %63! sau *3!(. +e coboar condensatorul, p&n c&nd se obine
un contrast care s permit obinerea unei imagini clare. $unerea la
punct a imaginii se face astfel:
- se apropie obiectivul de preferat cu a'utorul vizei
macrometrice, privind lateral pentru a evita: atingerea lamei
cu obiectivul, spargerea lamelei, deteriorarea i infectarea
obiectivului
- se privete prin ocular n timp ce se ridic obiectivul cu viza
macrometric, p&n c&nd apare c&mpul microscopic
- se obin detaliile imaginii cu a'utorul vizei micrometrice.
Aceast e!aminare d indicaii orientative asupra numrului,
formei i mai ales asupra mobilitii germenilor.
+0aminarea n c3m ntunecat prin utilizarea unui condensator
de tip special %cardioid(, care realizeaz un c&mp microscopic
ntunecat, n care bacteriile apar ca imagini luminoase, observ&ndu-se
clar conturul i micrile acestora, se practic pentru a decela
4reonema allidum din serozitatea ancrului venerian i pentru
vizualizarea leptospirelor din s&nge sau urin. ;n sifilisul primar,
e!amenul secreiei recoltate din ulcerul luetic prin aceast metod
este hotr&tor pentru punerea diagnosticului.
+0aminarea n contrast de faz. $entru preparatele native,
rezultate foarte bune se obin cu a'utorul microscopiei n contrast de
faz. $entru obinerea contrastului ntre detaliile clare i cele
ntunecate, se utilizeaz condensatoare i obiective care deviaz
razele luminoase. $rin aceast metod se pot pune n eviden detalii
morfologice: sporii, capsula i se pot e!amina i protoplatii.
1.,.1.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ !l "re"!r!tel4r $4l4r!te
$roprietile morfotinctoriale ale bacteriilor se pot studia mai
detaliat pe rearate fi0ate i colorate% cu germeni omor&i, cunoscute
i sub denumirea de frotiuri. 7binerea unui preparat colorat se
realizeaz n mai muli timpi: etalarea, fi!area i colorarea.
Etalarea frotiurilor 50i).11.! < 11.&7
=rotiul se poate face dintr-un lichid cu ansa sterilizat prin
flambare %fig.)..a,b(, cu care se ia o pictur i se aaz pe o lam
degresat, pe care se ntinde lichidul prin rotirea ansei %fig. )..c,d(,
dup care ansa se sterilizeaz din nou prin flambare %aducere la
rou(. 5ac lichidul se preleveaz cu pipeta $asteur, dup aplicarea
picturii pe lam, se procedeaz la fel. :n frotiu corect etalat trebuie
s ndeplineasc urmtoarele condiii: s fie ntins subire i uniform,
ls&nd de la marginile lamei, un spaiu liber de )-6 cm. +e usuc
frotiul etalat la aer, la temperatura camerei %fig. )*(.

Fi). 18
Fixarea frotiurilor 50i).1*7
+e face prin nclzirea lamei, trec&nd-o rapid de 6-. ori prin
flacra unui bec de gaz, p&n c&nd primete o temperatur ce poate fi
suportat de partea dorsal a m&inii.
+copul fi!rii este multiplu. "icroorganismele sunt omor&te i
deci preparatul nu mai este infecios. $rin fi!are corect, preparatul
ader la lam i nu se detaeaz n timpul operaiilor de colorare i
splare. $rin omor&rea microorganismelor, se mrete
permeabilitatea peretelui celular i se produc modificri ale
citoplasmei, care cresc afinitatea fa de unii colorani.
Fi). 1*


olorarea frotiurilor
$entru colorarea bacteriilor se folosesc diferii colorani
organici, care pot fi: bazici, neutri sau indifereni. Cei mai des folosii
sunt: fu!ina bazic, violetul de genian, albastrul de metilen, albastrul
de toluidin, verdele de malachit, verdele metil. Coloranii se folosesc
sub form de soluii apoase, la care se adaug cantiti mici de alcool
sau fenol.
Coloraia este un proces fizico-chimic comple!, n care
coloranii se combin cu constituenii celulari, fc&ndu-i vizibili la
microscop. Colorantul se absoarbe, apoi se dizolv i difuzeaz n
coninutul celular, unde are loc formarea unei combinaii stabile.
Colorarea se e!ecut de obicei acoperind suprafaa frotiului fi!at cu
colorant, care este lsat s acioneze un timp limitat, la cald sau la
rece.
$reparatele colorate dau mai multe indicaii de structur
celular, asupra formei, dimensiunilor aezrii n frotiu, prezenei unor
structuri celulare %capsul, spori, cili(. Astfel, bacteriile pot fi
difereniate dup proprietile lor de colorabilitate.
5up scopul urmrit, se pot utiliza mai multe tipuri de coloraii:
- coloraia simpl, care se e!ecut cu un singur colorant
- coloraia combinat, care se realizeaz prin aciunea
succesiv sau simultan a mai multor colorani, fiecare
acion&nd independent, fi!&ndu-se pe anumite elemente
- coloraii speciale, pentru formaiuni morfologice celulare i
e!tracelulare: corpusculi, cili, spori, capsul.
+plarea frotiurilor colorate se face cu ap de robinet sau cu
ap distilat, p&n la ndeprtarea complet a e!cesului de colorant
de pe lam. :scarea frotiului colorat se face la temperatura camerei,
pun&nd lama ntr-un stativ, n poziie vertical.
1.,.,. E;!-i#!re! -i$r4($4"i$% ! 0r4ti'l'i $4l4r!t
$reparatele colorate se e!amineaz cu a'utorul microscopului
optic, ntotdeauna cu obiecti"ul de imersie. Amersia const n utilizarea
uleiului de cedru, care are un indice de refracie apropiat de cel al
sticlei. ;n acesta este introdus obiectivul 83!, iar condensatorul este
ridicat.
Amaginea microscopic se pune la punct n felul urmtor: se
ridic condensatorul la ma!imum i se fi!eaz lama pe care s-a depus
uleiul de cedru. Cu a'utorul vizei macrometrice se coboar obiectivul,
privind din lateral, p&n c&nd acesta intr n ulei. Apoi, privind prin
ocular, se ridic ncet viza macrometric p&n c&nd apare imaginea,
care se pune la punct cu a'utorul vizei micrometrice.
"icroscopul optic are o putere de mrire de p&n la )-33! i o
putere de rezoluie de 3,6 micrometri.
1.,.,.1. Met4&e &e $4l4r!re =# -i$r4:i4l4)ie

oloraia simpl
=rotiul fi!at este acoperit complet cu un singur colorant:
albastru de metilen sau fu!in diluat, timp de )-6 minute, apoi se
spal cu ap curent i se usuc.
Coloraia simpl permite stabilirea formei i mrimii bacteriilor,
aezrii i dispoziiei %intra sau e!tracelulare( acestora, precum i
e!istena n produsul patologic a unor elemente celulare. <ste util n
diagnosticul, prin e!amen direct, al gonoreei, meningitei
meningococice i al altor infecii.
oloraiile combinate
!oloraia #$-'
<ste larg utilizat n microbiologie, deoarece permite
deosebirea germenilor #ram-oziti"i, colorai n violet, de cei #ram-
negati"i, colorai n rou.
4imii coloraiei #ram %fig. )/.a-)/.d(
Fi). 1>.!< A$4"erire! "re"!r!t'l'i $' 6i4let &e )e#3i!#% 0iltr!t
e;te-"4r!#e'? ti-" &e , -i#'te? !"4i ($'r)ere! $4l4r!#t'l'i.
Fi). 1>.:< A$4"erire! $' (4l'3ie l')4l 5i4&<i4&'r% &e "4t!(i'7
"e#tr' -4r&!#(!re 5=#t%rire! $4l4r!3iei7? ti-" &e , -i#'te. Se
($'r)e -4r&!#t'l.
Fi). 1>.$< Se &e$4l4re!% "re"!r!t'l $' 4 (4l'3ie &e !l$44l<!$et4#% ti-"
&e ,/ &e (e$'#&e 2i (e ("!l% $' !"% $'re#t%. # !$e(t ti-" r%-@#
$4l4r!te &4!r :!$teriile Gr!-<"4iti6e 5=# 6i4let7
Fi). 1>.&< Se re$4l4re!% $' 0';i#% &il'!t%? ti-" &e , -i#'te? !"4i (e
("!l% $' !"% $'re#t% =# e;$e(? ti-" =# $!re (e $4l4re!% =# r42'
:!$teriile
Gr!-<#e)!ti6e.
5iferena de comportament a celor dou categorii de bacterii,
se e!plic prin structura i compoziia chimic diferit a peretelui
celular.
Aspectul morfologic i coloraia ?ram a principalelor specii
bacteriene de interes medical permit ncadrarea acestora n mai multe
grupe %tabelele A i AA (.
oci !ram"pozitivi
Stafilococii, bacterii sferice, dispuse n grmezi %ciorchine(,
aezare caracteristic.
Stretococii, bacterii sferice sau ovale, aezate n perechi,
lanuri scurte sau lungi.
Pneumococii, coci ovalari sau lanceolai, aezai n perechi,
av&nd capetele distale ale fiecrei perechi mai ascuite n produsul
patologic sunt adeseori capsulai i predominant intracelulari.
oci !ram"ne#ativi
#onococii %Neisseria gonorr*oeae( i meningococii %Neisseria
meningitidis( sunt coci ?ram-negativi aezai n perechi cu marginile
adiacente aplatizate. ;n produsele patologice sunt dispui
predominant intracelular.
Tabelul $
Princialele bacterii aerobe n form de coci i bacili

Tabelul $$
Principalele bacterii strict anaerobe
%acili !ram"pozitivi
#ermenii din gruul )acillus sunt bacili mari i groi %.-)3I)-
),.( cu spori dispui central sau paracentral, fr deformarea
conturului bacteriei.
5isteria s., bacili scuri sau cocobacili, necapsulai,
nesporulai. ;n frotiuri din produse apar intra sau e!tracelulari.
)acilii difterici %!or,nebacterium di*t*eriae( sunt bacili
pleomorfi variabili ca mrime i form. "a'oritatea sunt ncurbai i
aezai n perechi sau grmezi, form&nd unghiuri care imit diferite
litere. Caracteristic este prezena de granulaii metacromatice,
dispuse mai ales la poli.
-ctinomicetele apar n preparatele din unele produse %sput,
puroi, GC9 etc.( ca bacterii n form de filamente ramificate, cu
tendin de a se fragmenta n forme bacilare sau cocobacilare.
%acili !ram"ne#ativi
#ermenii din gruele +nterobacteriaceae% 6ersinia%
-eromonas% Pseudomonas se prezint ca bacili ?ram-negativi
nesporulai cu capete rotun'ite, de mrimi diferite.

7ibrio, bacili ?ram-negativi, nesporulai, uor ncurbai
%ma'oritatea(, cu aezare necaracteristic.
.aemo*ilus sunt bacili sau cocobacili, cu un pronunat
polimorfism.
Alte bacterii ?ram-negative cocobacilare, cu polimorfism, sunt:
Pasteurella% 'ora0ella% )rucella% )ordetella.
oloraia &$E'(")EE(SE)
Princiiul
)acilul tuberculozei 8 ',cobacterium tuberculosis, ca i alte
micobacterii acido-alcoolo-rezistente, se coloreaz n rou cu fu!in,
pstr&nd aceast culoare i dup tratarea frotiului cu alcool i acid, n
timp ce alte bacterii, mpreun cu celulele, se coloreaz n albastru
%cu albastru de metilen(.
4imii coloraiei 9ie*l-Neelsen %fig. )0.a-)0.f(

)0.a-)0.b- !olorarea cu fu0in fenicat tim de : minute la
cald:

+e acoper complet lama cu fu!in filtrat, apoi cu un tampon
mbibat n alcool se nclzete lama p&n ies vapori, fr s fiarb. +e
repet operaiunea de 6 ori.
)0.c- Slarea frotiului cu a distilat, p&n c&nd apa de
splare rm&ne incolor.
Fig. 1;.c
)0.d- Decolorarea cu alcoolul acidifiat %alcool etilic i acid
clorhidric(: se acoper lama cu decolorant i se ateapt . minute.
Fi). 1+.&
)0.e- Slarea cu a de robinet, verific&nd dac decolorarea
este complet.
Fig. 1;.e
)0.f- $ecolorarea cu albastru de metilen
+e acoper frotiul cu colorant i dup .3 de secunde se spal
cu ap de robinet. +e usuc preparatul la temperatura camerei i se
e!amineaz la microscop.
Fi). 1+.0
+0aminarea frotiurilor
?ermenii acido-alcoolo-rezisteni cu aezare caracteristic
%fig.)2( apar colorai n rou, ceilali germeni i elemente celulare din
frotiu fiind colorati n albastru %plana A.6(.
Fig. 1< 8 'icobacterii foarte subiri% cu granulaii fine.
Coloraia Kiehl-@eelsen este caracteristic genului
',cobacterium i are o semnificaie diagnostic deosebit pentru
tuberculoz. $roprietatea de acido-alcoolo-rezisten a acestor
bacterii se datorete structurii particulare a peretelui celular, cantitii
mari de lipide pe care acestea le conin i, n special, acidului micolic
din peretele celular.
oloraii speciale
!oloraia entru casul prin metoda ,:99A modificat.
7 pictur din suspensia de bacterii se amestec cu o pictur
de tu de China. +e ntinde un frotiu subire i se las s se usuce,
apoi se fi!eaz. +e coloreaz cu fu!in diluat )I)3 timp de * minute.
+e spal, se usuc, apoi se e!amineaz la microscop %obiectivul cu
imersie(. $e fondul negru, bacteriile apar colorate n rou, cu o zon
clar, incolor, n 'ur. Aceast zon corespunde capsulei, care nu se
coloreaz.
!oloraia entru sori %coloraia "LGG<9(. =rotiul se fi!eaz cu
alcool etilic 8/H timp de 6 minute. +e mordanseaz cu acid cromic
-H timp de - minute. +e spal cu ap curent. +e e!ecut coloraia
Kiehl-@eelsen, elimin&nd operaiunea de decolorare cu alcool.
+e spal, se usuc i se e!amineaz cu imersia.
+porii apar colorai n rou, formele vegetative n albastru.
Alt metod de evideniere a sporilor este cea care utilizeaz
"erdele de malac*it:
- se acoper lama cu o soluie verde de malachit -H
- se nclzete ca la coloraia Kiehl-@eelsen
- se spal frotiul cu ap de robinet
- se acoper lama cu fu!in Kiehl diluat )I)3 # .3 secunde
- se spal bine cu ap de robinet.
Corpii bacterieni apar colorai n rou, iar sporii n verde.
Coloraia pentru corpusculii metacromatici %5<G B<CCJA7(
4e*nica=
=rotiul uscat i fi!at prin cldur este tratat astfel:
- albastru de metilen GMffler, timp de )3 minute
- splare cu ap de robinet
- soluie Gugol, timp de )3 minute
- splare cu ap de robinet.
Corpul microbian apare de culoare galben nchis, iar
corpusculii metacromatici n albastru verde.
1.1. MEDIILE DE CULTURA
"ultiplicarea Din vitroE a agenilor microbieni dintr-un produs #
culti"area # se realizeaz pe medii de cultur, formate din
amestecuri de substane necesare dezvoltrii acestora.
Cultura este efectuat n diverse scopuri:
- izolarea agenilor microbieni din produsele patologice i
obinerea unei culturi primare pe medii ce permit cultivarea
unei mari varieti de germeni, inclusiv a celor cu necesiti
nutritive speciale
- izolarea germenilor patogeni din produsele pluricontaminate
n cultur pur a unei bacterii cu potenial patologic
- identificarea bacteriilor patogene dup caracterul lor de
cultur pe medii care au o compoziie comple! i
potenialitate mare i pe medii de cultur selective
- obinerea de produse biologice pentru diagnosticul,
tratamentul sau prevenirea unor mbolnviri.
7rice mediu de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele
condiii:
- s asigure substanele nutritive necesare: sursa de carbon
i azot, donorul i acceptorul de hidrogen, minerale, factori
de cretere
- s asigure condiiile de desfurare optim a
metabolismului: pJ, potenial redo!, aerare i cantitate
necesar de C7
6
etc.
- s fie steril.
"a'oritatea bacteriilor de importan medical sunt heterotrofe,
relativ uor cultivabile, cu c&teva e!cepii: bacteriile cu dezvoltare
strict intracelular %n celule vii(, ricNettsiile i chlamOdiile, care nu se
pot dezvolta pe medii sintetice.
1.1.1. C4-"4i3i! -e&iil4r &e $'lt'r%
1.1.1.1. S':(t!#3e #'triti6e
C&teva dintre bacteriile de importan medical, printre care i
+sc*eric*ia coli, pot crete i pe medii care au ca singur surs de
carbon i energie, glucoza. "a'oritatea bacteriilor necesit un
amestec comple! de substane, utiliz&ndu-se n acest scop, e!tracte
din carne sau alte esuturi, amestecuri naturale de proteine etc.
Petonele se obin prin hidroliza acid, alcalin sau enzimatic.
<le conin aminoacizi, peptide, peptone alturi de zaharuri, vitamine,
sruri i altele. <!emple: peptona ,acto, proteazo-peptona.
+0tractele de carne conin substane hidrolizabile din carne sau
alte esuturi, fr adugare de enzime, macerat de carne sau autolizat
de dro'die.
Proteinele naturale= ser sangvin, s&nge defibrinat, lichid de
ascit, ou, lapte .a., pot fi adugate dup sterilizarea mediilor,
obin&ndu-se medii cu proteine native sau pot fi coagulate termic n
timpul preparrii mediului.
1.1.1.,. A)e#3i &e (4li&i0i$!re
Azolarea n cultur pur a unei bacterii dintr-un amestec natural
%produs patologic, ap, aer( se obine, de cele mai multe ori, pe
suprafaa mediilor de cultur solide. Ca ageni de solidificare a
mediilor de cultur se utilizeaz, de obicei, agarul i gelatina.
-gar-agar este un phOtocoloid de natur polizaharidic, obinut
din algele marine. @u are valoare nutritiv, iar utilizarea acestuia se
bazeaz pe dou proprieti fundamentale:
- nclzit la 23#83
3
C n ap, d o soluie care # dup rcire
sub *-
3
C # se solidific sub forma unui gel
- la cldur adsoarbe cantiti mari de ap %de -3 de ori
volumul su( necesar dezvoltrii bacteriilor.
Concentraia obinuit n mediile de cultur este 6-6,-H.
1.1.1.1. Alte $4-"4#e#te
/ndicatorii de .% ca: albastru de bromtimol, rou neutru,
purpura de bromcrezol, indicatorul Andrade .a., se utilizeaz mai ales
pentru demonstrarea producerii de acid din zaharurile din mediu, prin
utilizarea acestora de ctre bacterii.
-genii selecti"i sunt substane colorate sau nu, uneori
chimioterapice, introduse n mediile selective pentru dezvoltarea unor
bacterii i inhibarea creterii altora. 5intre aceti ageni se utilizeaz
mai frecvent: cristalul violet, azida de sodiu, verdele malachit, fu!ina,
selenitul de sodiu, teluritul de potasiu, citratul de sodiu etc. $entru
unele medii, substanele care cresc pJ-ul la 2-8 sau l scad la *--,
constituie factori selectivi. Clorura de sodiu este, de asemenea, un
astfel de factor.
-genii reductori se utilizeaz n mediile pentru cultivarea
bacteriilor anaerobe, care -alturi de lipsa o!igenului molecular- au
nevoie de un potenial de o!idoreducere sczut. Astfel sunt
thioglicolatul, cisteina etc.
Substanele entru teste bioc*imice se utilizeaz pentru
evidenierea unor proprieti metabolice necesare identificrii
bacteriilor n mediile n care s-au introdus unul sau mai multe
substraturi, ca -de e!emplu- zaharuri, polialcooli, aminoacizi etc.
:neori, evidenierea produilor rezultai din metabolismul bacterian se
face prin indicatorii e!isteni n mediu, alteori, indicatorul se adaug
ulterior.
1.1.,. Pre"!r!re! -e&iil4r &e $'lt'r%
+e face dup urmtoarea sc*em general:
- Amestecul ingredientelor n proporia i ordinea indicate n
reeta de preparare.
- A'ustarea pJ-ului. ;n general, mediile de diagnostic au un
pJ uor alcalin %0,6 # 0,2(. 5eterminarea acestuia se face
prin metode colorimetrice, iar corectarea la pJ-ul dorit are
loc fie cu acid clorhidric )3H, fie cu hidro!id de sodiu *H.
- 9epartizarea mediului de cultur n recipiente adecvate
%eprubete, baloane, cutii $etri(, dup ce a fost sterilizat i
dup controlul sterilizrii.
- Controlul calitii mediului de cultur prin nsm&narea
acestuia cu bacterii inute n laborator n acest scop.
5eoarece mica producie a fiecrui laborator sufer variaii n
calitatea mediilor, se tinde la nlocuirea acesteia cu producia pe scar
larg n laboratoarele specializate, actual, ma'oritatea mediilor de
baz fiind furnizate de Anstitutul DCantacuzinoE din ,ucureti.
"ediile de cultur pot fi lichide sau solide. 5up compoziia lor,
pot fi medii simple sau uzuale, care se folosesc separat sau mpreun
cu mediile comple!e: cu proteine native, medii selective, medii de
mbogire, pentru anaerobi etc.
1.1.,.1. Me&iile (i-"le
+unt medii de cultur care se prepar uor i au n compoziia
lor substane nutritive care permit multiplicarea unui numr mare de
specii bacteriene. Acestea se pot prezenta sub form de:
- a etonat, cel mai simplu mediu, conin&nd pepton
)H i @aCl 3,-H
- bulion nutriti", conin&nd n plus e!tract de carne, care
asigur o varietate de sruri i factori de cretere, pe l&ng
polipeptidele i aminoacizii din compoziia peptonei
- agar nutriti", un mediu solidificat ce conine bulion nutritiv i
agar-agar 6H, acesta constituind baza pentru diferite tipuri
de medii de cultur i put&ndu-se prepara n cutii $etri sau
n tuburi nclinate.
1.1.,.,. Me&ii =-:4)%3ite $' "r4tei#e #!ti6e
:nele bacterii se pot cultiva mai uor pe medii foarte bogate n
substane nutritive, cum sunt cele din s&nge, ser sau ou. 5intre aceste
medii fac parte: geloza-s&nge, geloza-chocolat, mediul "ueller-Jinton
etc.
#eloza - s3nge conine, pe l&ng agar nutritiv, )3H s&nge
defibrinat de berbec, cal sau s&nge uman. Amestecul gelozei cu
s&ngele defibrinat pe perle de sticl se face la temperatura de *-
3
C
%pentru a evita degradarea proteinelor din s&nge(, dup care se
toarn n plci $etri i, astfel, se obine un mediu care, pe l&ng
valoarea sa nutritiv mrit, permite stabilirea unor proprieti utile n
identificarea bacteriilor, prin aciunea lor hemolitic %realizat de
to!inele bacteriene eliberate, de e!emplu, de Sta*,lococcus aureus
i Stretococcus ,ogenes( %plana AAA.)(.
#eloza - c*ocolat este preparat asemntor cu geloza-
s&nge, dar se nclzete treptat dup amestecul agarului cu s&ngele,
p&n la temperatura de 0-
3
C # 23
3
C, mediul primind o culoare
chocolat prin eliberarea unor substane nutritive din hematii, necesare
dezvoltrii unor specii bacteriene, cum sunt cele din genurile
.aemo*ilus i Neisseria.
#eloza - s3nge 'ueller-.inton este un mediu selectiv pentru
Neisserii %meningococi, gonococi(, care are la baz geloza-s&nge
glucozat, la care se adaug lincomicin i colimicin.
1.1.,.1. Me&ii (ele$ti6e
Aceste medii conin substane care inhib multiplicarea unor
bacterii i, astfel, se va dezvolta un numr mic de specii bacteriene,
care pot fi identificate at&t prin proprietile lor nutritive, c&t i prin cele
biochimice, deoarece unele medii conin i indicatori pentru
difereniere. :nele medii selective au mai multe substane nutritive %n
principal: aminoacizi, glicerin, ou(, pe l&ng ageni inhibitori %de
e!emplu, mediile pentru ',cobacterii(.
5intre mediile selective fac parte i cele care permit:
- izolarea stafilococilor %mediul hiperclorurat Chapman(
- izolarea i identificarea enterobacteriilor
- medii selective pentru neisserii, corOnebacterii, vibrioni
holerici etc.
:nele bacterii prezente n produsele patologice se izoleaz pe
medii selective dup ce mai nt&i sunt nsm&nate pe -e&ii li$9i&e
&e =-:4)%3ire, cum sunt: aa etonat la pJ 2 pentru "ibrionul
*oleric mediul cu selenit acid de sodiu pentru Salmonella mediul
>.S.!.4. pentru !or,nebacterium di*t*eriae etc.
9edm mai 'os principalele medii selective i difereniale cu
indicatori, folosite n laboratoarele clinice.
#eloza 4insdale %mediu selectiv pentru bacili difterici(. <ste un
agar-s&nge cu telurit de potasiu i tiosulfat de sodiu, utilizat pentru
izolarea bacteriei !or,nebacterium di*t*eriae din secreiile
faringiene, conin&nd inhibitori pentru flora normal a tractului
respirator superior. Acest mediu permite i diferenierea bacililor
difterici de difteromorfi prin formarea de ctre !or,nebacterium
di*t*eriae a unor colonii de culoare neagr, n urma reducerii
teluritului %plana AAA. .(.
'ediul >.!.S.4. ?ou-cistein-ser-telurit@. <ste un mediu de
mbogire pentru bacilul difteric. Conine: ser normal de bou, bulion
glucozat, telurit de potasiu, cistein i ou.
'ediul )ordet 8 #engou. <ste un mediu selectiv pentru
bacteriile din genul )ordetella i conine un mediu de baz %macerat
de cartofi i glicerin n ap distilat(, la care se adaug s&nge
defibrinat de berbec. $entru inhibarea altor bacterii din tractul
respirator se adaug antibiotice %penicilin(.
'ediul 5ABenstein 8 Censen. <ste un mediu selectiv comple!,
mbogit cu substane nutritive, ou, sruri minerale i verde de
malachit, care inhib dezvoltarea altor bacterii n afar de cele din
genul ',cobacterium. "ediul este coagulat la 23
3
C n tuburi, iar
micobacteriile cresc pe aceste medii sub forma unor colonii de aspect
caracteristic %plana AAA.-(.
'ediul 'ac!onDe,. <ste utilizat pentru cultivarea i
identificarea enterobacteriilor, fiind compus din: pepton, agar,
lactoz, rou neutru %ca indicator( i sruri biliare %ca inhibitori ai altor
bacterii dec&t cele intestinale(.
Acest mediu poate diferenia dou grupe ma'ore de
enterobacterii %plana AAA.6(:
- lactozo 8 oziti"e, care fermenteaz lactoza i cresc pe
acest mediu sub form de colonii de culoare roz, incluz&nd
+sc*eric*ia coli i coliformii
- lactozo 8 negati"e, care nu fermenteaz lactoza i cresc pe
acest mediu sub forma unor colonii glbui, incluz&nd
enterobacteriile din genurile Salmonella i S*igella.
'ediul agar 4.S./. ?4rile 8 Sugar - /ron@ sau agar triplu zaharat
# sulfat feros, numit i mediu multitest, este folosit pentru identificarea
enterobacteriilor. ;n compoziia acestui mediu intr, pe l&ng e!tract
de carne, dro'die, pepton, o cantitate mic de agar i glucoz 3,)H,
lactoz )H, zaharoz )H, sulfat feros %pentru detectarea producerii
de J
6
+(, rou fenol %ca indicator(. "ediul se toarn n tuburi nclinate
astfel nc&t s se obin o parte dreapt %la fundul tubului( de circa 6,-
cm i alta nclinat %apro!imativ * cm(. @ensm&nat, la pJ 0,*,
mediul 1+A are culoare roz # portocalie %plana AB.)(.
;nsm&narea mediului se face prin neparea prii drepte i, n
continuare, prin efectuarea de striuri pe suprafaa nclinat. 5up
incubare timp de 6* de ore, se poate face citirea, a crei interpretare
depinde de modul n care vireaz culoarea mediului, care poate fi
dat de :
- acidifierea prii drepte %culoare galben(, care nseamn
fermentarea glucozei
- acidifierea prii drepte i a celei nclinate, care semnific
fermentarea glucozei, lactozei sauIi a zaharozei
- culoarea nemodificat arat c bacteria nu atac zaharurile
- producerea de gaz este marcat prin apariia bulelor de gaz
la fundul tubului i chiar deplasarea coloanei de mediu
- producerea de J
6
+ este evideniat de nnegrirea prii
drepte a mediului.
$entru e!emplificare, a se vedea plana AB. )--.
'ediul './.(. ?mobilitate% indol% uree@. <ste un mediu de cultur
multitest folosit pentru identificarea enterobacteriilor, av&nd n
compoziie peptone, agar, glucoz i rou fenol %ca indicator(, iar n
momentul folosirii, se adaug i o soluie de uree 63H. "ediul se
distribuie n tuburi i se solidific n poziie vertical, iar nsm&narea
se face numai prin nepare n lungul peretelui tubului.
5up 63 de ore de incubare la .0
3
C se face interpretarea:
- c&nd este atacat ureea %testul ureazei este pozitiv(, mediul
vireaz n rou %plana AB.6(
- mobilitatea se recunoate prin creterea culturii de-a lungul
traiectului de inoculare.
$entru determinarea indolului se pot folosi benzi de indol livrate
de Anstitutul DCantacuzinoE sau se poate utiliza un mediu asemntor
cu "A:, denumit !iloz # lizin # dezo!icolat %PG5(, n care formarea
indolului se traduce prin apariia unei culori roii pe o poriune din
band sau a unui inel rou la suprafaa mediului %plana AB..(.
1.1.,.8. Me&ii "e#tr' $'lti6!re! !#!er4:il4r
;n anaerobioz se cultiv bacteriile care nu se dezvolt n
prezena 7
6
, cum sunt cele din genul !lostridium sau flora Beillon
%anaerobi nesporulai(, care ncadreaz un numr foarte mare de
specii bacteriene, ca: peptococi, peptostreptococi, lactobacili,
actinomicete, fusobacterii, )acteroides, 7eillonella etc.
Anaerobioza poate fi obinut fie prin ndeprtarea o!igenului
prin combinare cu hidrogen n prezena catalizatorului de palladium
prin sistemul ?as $aN, fie prin adugare la mediul de cultur a unor
substane reductoare.
Fi). 1B. Si(te-'l !#!er4:i$ G!( P!C
Sistemul #as PaD anaerobic %fig.)8(. ;ntr-un recipient special
prevzut cu un capac cu garnitur, care se nchide ermetic, se
gsete un catalizator din aluminiu acoperit cu palladium. ;n acest
sistem se introduc mediile nsm&nate, iar hidrogenul este generat
nuntrul recipientului prin plasarea unui nveli comercial special ?as
$aN, care elibereaz hidrogen i bio!id de carbon. Jidrogenul se
combin cu o!igenul din interiorul recipientului i se creaz condiii
stricte de anaerobioz.
'etoda irogalolului alcalin este o metod care se bazeaz pe
utilizarea unui amestec de substane reductoare a cror baz o
constituie pirogalolul i carbonatul de potasiu. Aceste amestecuri se
introduc n plicuri mici de h&rtie de filtru confecionate n laborator.
$liculeul se lipete cu dou benzi de leucoplast pe capacul cutiei
$etri, peste care se pune partea de plac $etri cu mediul nsm&nat.
+e lipesc cele dou pri ale plcii cu parafin topit. $rin aceast
parafinare, ntre cele dou pri ale plcii se formeaz un spaiu nchis
ermetic. +e incubeaz la termostat, la .0
3
C.
'ediul 7eillon este un mediu semisolid format din agar nutritiv
moale, ce conine glucoz i care este turnat n tuburi nguste, n
coloan nalt %cultivarea se face n profunzime(. ,acteriile strict
anaerobe se vor dezvolta n partea inferioar a coloanei de mediu.
1.8. PRELEVAREA PRODUSELOR BIOLOGICE
"odul de prelevare i de transport al produselor biologice
destinate e!aminrii bacteriologice condiioneaz direct eficiena
etapelor ulterioare i, n final, obinerea unui rezultat fidel n ceea
ce privete diagnosticul etiologic al unei boli infecioase.
$relevatele sunt probe de material biologic n care se
bnuiete prezena microorganismelor. Acestea pot fi:
- produse normale, care prezint unele modificri n caz
de boal %s&nge, urin, materii fecale, lichid
cefalorahidian etc.(
- produse patologice care apar numai n mbolnviri
%puroi, lichid peritoneal, lichid articular(.
1.8.1.Re)'li )e#er!le &e re$4lt!re
$entru fiecare boal infecioas trebuie cunoscut: de unde,
c3nd, cum i c3t trebuie recoltat.
$relevatul trebuie obinut din acele locuri n care agenii
etiologici se pot gsi, n mod deosebit, n cursul bolii. +electarea
produsului se face deci n raport cu patogenia infeciei: poarta de
intrare a microorganismelor, cile de diseminare, cile de eliminare
etc. 5e pild, prelevatul trebuie obinut direct din leziune, n aa fel
nc&t s conin poriunile cele mai caracteristice ca semnificaie
etiologic.
"omentul cel mai potrivit pentru recoltare este n raport cu
perioada de evoluie a bolii. <ste necesar ca prelevarea s fie
e!ecutat naintea nceperii terapiei cu substane antimicrobiene
sau # dac aceasta a nceput # la *2 de ore de la ncetarea ei.
<ste indicat ca prelevarea s fie realizat n momentul optim
al evoluiei bolii, adic atunci c&nd agentul etiologic se gsete n
cantitate mai mare n produsul respectiv, aplic&nd tehnica cea mai
corect.
<ste necesar a se recolta cantiti suficiente de material,
pentru a face posibile toate e!aminrile de laborator necesare,
inclusiv cele care vor fi - eventual - indicate ulterior.
46
$relevarea oricrui produs pentru e!amenul
bacteriologic trebuie s se fac steril, n condiii de
riguroas asepsie i ntr-un recipient sterilizat prin
cldur, fr urme de substane.
9ecipientul care conine produsul va fi etic*etat
corespunztor %n lipsa unor etichete tip se vor folosi
f&ii de leucoplast care au avanta'ul c nu se
desprind uor de pe recipient(. $e etichete se va nota
%cite( numele bolnavului i, eventual, felul produsului.
7rice produs patologic va fi nsoit de un buletin de
analiz care s cuprind datele bolnavului: numele i
prenumele pacientului, v&rsta, diagnosticul prezumtiv,
natura produsului recoltat i e!aminrile solicitate,
precum i tratamentul antimicrobian care s-a fcut
%dac este cazul(.
$rodusul se va ambala corespunztor, n recipiente
bine nchise i prote'ate, n aa fel nc&t s fie evitat
alterarea lui, contaminarea mediului ncon'urtor sau
a persoanelor care l manevreaz. 5ac laboratorul
este la distan, se va nota pe etichet Q"aterial
infeciosE.
+e va asigura e!pedierea produsului imediat dup
recoltare. Cu c&t durata de timp ntre prelevare i
prelucrare este mai mare, cu at&t scade ansa
obinerii unui rezultat corect. ;nt&rzierea prelucrrii
scade posibilitatea izolrii agenilor etiologici,
permit&nd nmulirea celor care nu au potenial
infecios sau a celor care pot proveni din eventuala
contaminare a produsului.
;n funcie de natura prelevatului i a e!amenului
solicitat, se vor folosi medii sau soluii conservante.
:tilizarea lor este indicat, mai ales, n situaia n
care avem de-a face cu un produs pluricontaminat
care conine un numr redus de bacterii patogene. ;n
cursul e!pedierii la laborator se vor asigura condiii
de meninere a temperaturii la .0
3
C pentru bacteriile
care nu rezist la temperaturi mai sczute
%meningococi, gonococi(.
47
1ransportul se face numai de ctre personal sanitar instruit
n acest scop. @ici un produs infecios nu se e!pediaz prin pot.
Pentru bacteriile anaerobe, recoltarea se face prin
procedee care s asigure, pe c&t posibil, condiii de
anaerobioz %mai ales pentru lichidele de puncie #
care se recolteaz n seringi ce conin un strat de ulei
de parafin steril, iar v&rful acului se nfige, imediat
dup recoltare, ntr-un dop steril(. $entru alte
produse care nu pot fi ferite, prin natura lor, de
contactul cu aerul %de e!emplu: sputa(, prelucrarea
pentru izolarea germenilor anaerobi se va face
imediat dup recoltare, fapt ce implic o colaborare
perfect ntre clinician i diagnosticianul de laborator.
1.8.,.Re$4lt!re! "ri#$i"!lel4r "r4&'(e
"!t4l4)i$e
1.8.,.1. Re$4lt!re! &e l! #i6el'l tr!$t'l'i re("ir!t4r
+ecreiile din tractul respirator se recolteaz n raport cu
localizarea infeciei. ;n interpretarea rezultatelor se ine cont de
flora bacterian normal abundent i foarte variat din cile
respiratorii superioare.
Prelevarea secreiei farin#iene
+e face cu un tampon faringian steril, dimineaa pe
nem&ncate sau la cel puin * ore de la ingerarea de alimente.
$entru recoltare, se deschide gura pacientului la ma!imum i se
apas limba, pentru a evidenia peretele posterior al faringelui,
amigdalele i vlul palatin %fig. 63(. +e insist asupra zonelor cu
puroi, pseudomembranelor i asupra secreiei mucopurulente de
pe peretele posterior %av&nd gri', pe c&t posibil, s nu atingem
limba cu tamponul(. +e recolteaz cel puin 6 tampoane, iar n
cazul suspiciunii de difterie # . tampoane.
48
Fi). ,/
$entru prelevarea secreiilor nasofaringiene se recomand
tampoane lungi, ncurbate, n indicaiile acestor prelevri pornindu-
se de la constatarea c, n multe cazuri, o infecie trenant a cilor
respiratorii superioare poate fi ntreinut de un focar nasofaringian
sau nazal. C&nd leziunile sunt situate n fosele nazale, recoltarea
se face de ctre specialist.
Prelevarea sputei
+puta reprezint nsumarea secreiilor patologice ale
arborelui respirator %laringe, trahee, bronhii, pulmoni( i este
eliminat prin e!pectoraii n afeciuni cu manifestri clinice variate,
n funcie de localizare i felul agentului etiologic: traheobronite,
congestii pulmonare, pneumonii, bronhopneumonii, abcese
pulmonare etc.
;n toate aceste sindroame, e!amenul bacteriologic al sputei
reprezint singurul mi'loc de diagnostic etiologic, dar rezultatul
acestei e!aminri depinde n mare msur de respectarea
condiiilor de prelevare, transport i prelucrare corect.
9ecoltarea sputei se face din e!pectoraia de diminea,
c&nd bolnavul i face spontan Qtoaleta bronhiilorE. ;n prealabil,
49
pacientul va face o toalet bucal nsoit de gargar cu ser
fiziologic steril. +e va insista asupra obinerii sputei propriu-zise i
nu a salivei sau a secreiilor nazale %care ar contamina sputa i ar
duce la rezultate eronate(.
$rodusul este prelevat ntr-o plac $etri steril %c&nd
recoltarea se face n laborator sau n apropierea acestuia( sau n
flacoane cu g&t larg.
Alte metode mai laborioase, dar mai fidele, realizabile numai
n serviciile de specialitate, sunt:
- aspiraia bronic prelevat prin lumenul bronhoscopului
ndreptat direct spre locul leziunii
- puncia transtraheal etc.
1ransportul produselor la laborator trebuie s fie asigurat n
cel mult 6 ore de la recoltare, n condiii adecvate, pentru a evita
degradarea elementelor necesare diagnosticului etiologic.
1.8.,.,. Prele6!re! &e l! #i6el'l tr!$t'l'i &i)e(ti6
5e la acest nivel, produsul care permite cele mai multe
izolri de microorganisme patogene este scaunul proaspt #
materiile fecale emise spontan. $entru e!amenul bacteriologic #
corocultur # alturi de care se efectueaz, de obicei, i
e!amenul parazitologic # coroarazitologic # prelevarea se face
din scaunul emis spontan, cu sau fr administrare de purgativ, din
cel recoltat cu sonda @elaton sau cu tamponul rectal %la copiii
mici(. $entru aceste recoltri se folosesc recipiente numite
corocultoare, din sticl sau plastic, prevzute cu o spatul cu
a'utorul creia se prelev din scaun poriuni cu mucus i, eventual,
cu urme de s&nge. Cantitatea de materii fecale care va fi recoltat
este n 'ur de - grame, suficient pentru toate e!aminrile amintite.
Ga bolnavii cronici purttori de bacili tifici, prelevarea se face
timp de . zile consecutiv, dup o administrare unic de purgativ.
1ransportul prelevatelor destinate e!amenelor
microbiologice se face n cel mai scurt timp %n ma!imum 6 ore de
la prelevare(. ;n cazul n care acest interval nu poate fi asigurat,
este obligatorie folosirea unui lichid conservant sau mediu CarO-
,lair.
50
Alte produse din tractul digestiv, care pot fi utile e!amenului
bacteriologic sunt lichidele de vrstur %care se recolteaz n
to!iinfeciile alimentare( i bila, a crei e!aminare bacteriologic,
dup recoltarea cu sonda <inhorn, se numete bilicultur.
1.8.,.1. Re$4lt!re! &e l! #i6el'l tr!$t'l'i 'r4<)e#it!l
Prelevarea probei de urin
+e poate efectua la nivelul unei uniti sanitare sau chiar la
domiciliu, dac sunt respectate instruciunile de recoltare. +e
recolteaz prima urin de diminea.
;n acest scop, se face n prealabil o toalet a organelor
genitale e!terioare cu ap i spun. +e elimin prima poriune din
urin, apoi miciunea se ntrerupe i urmtoarea poriune, EFetul
miFlociuG, se recolteaz ntr-un vas steril %fig. 6)(.
Fig. 21
Bolumul necesar e!amenului bacteriologic obinuit este de
)- ml, iar pentru diagnosticul de tuberculoz urogenital este de
minimum -3 ml.
:rina trebuie trimis la laborator i prelucrat n decurs de o
or de la recoltare. ;nsm&natrea urinii pe medii, urocultura, se
face cu scopul izolrii microorganismelor n cazul infeciilor cilor
urinare: cistite, cisto-pielite, tuberculoz etc.
:rocultura, n sensul uzual al termenului, nseamn
51
determinarea cantitativ a numrului de bacterii pe ml %urocultura
cantitati"@. Astfel, se accept c prezena a peste )33.333
bacteriiIml este semnificativ pentru infecia urinar. 7 bacteriurie
mai 'oas de )33.333 bacteriiIml %).333 # )33.333( poate fi
semnificativ n unele situaii ca: tratament recent cu antibiotice,
hidratare masiv, pJ sub - sau prezena unor microorganisme
care se dezvolt mai greu % genul Stretococcus% .aemo*ilus
etc.(.
*ecoltarea secreiei uretrale
;n mod normal, uretra - at&t la brbat, c&t i la femeie - este
lipsit de flor bacterian, aa nc&t secreia uretral este
considerat ca fiind un produs patologic. ;n general, e!amenul
bacteriologic al organelor genitale e!terne este dificil i fidelitatea
rezultatelor este condiionat direct de modul corect de prelevare,
transport, e!aminare i interpretare a datelor.
Fi). ,, D Re$i"ie#te $' -e&i' (4li& "e#tr' $4#(er6!re! )4#4$4$il4r
2i -e#i#)4$4$il4r
52
Fi). ,1 D Re$i"ie#te $' -e&i' (e-i(4li& "e#tr' tr!#("4rt'l 2i
$4#(er6!re! )4#4$4$il4r
$relevarea secreiei uretrale la brbat se face dimineaa
nainte de miciune. $ictura de secreie care apare din meatul
uretral, se ia cu ansa, flambat i rcit, sau cu un tampon subire.
5up scopul urmrit, materialul obinut poate fi etalat direct pe
lam %lsat s se usuce i trimis astfel la laborator( pentru
e!amenul microscopic sauIi tamponul este utilizat la
nsm&narea imediat ori va fi plasat ntr-un recipient ce conine
mediu de transport adecvat %fig. 66 i 6.(.
Ga femeie, prelevarea secreiilor vaginale i uretrale se face
din urmtoarele locuri de elecie: orificiul glandelor ,artholin,
orificiul colului uterin i meatului urinar. Comportamentul ulterior
este identic cu cel descris mai sus n ceea ce privete descrcarea
ansei i a tamponului.
$entru cercetarea !*lam,diei sau virusurilor herpetice se
procedeaz la recoltarea materialului celular prin raclarea sau
brosa'ul %peria'ul( mucoaselor uretral %la brbat( i a endocolului
%la femeie(, cu scopul de a evidenia incluziunile intracelulare date
de aceste microorganisme cu dezvoltare strict intracelular.
1.8.,.8. Re$4lt!re! (@#)el'i "e#tr' e;!-e#'l
:!$teri4l4)i$
59e-4$'lt'r!7
Jemocultura este una dintre cele mai importante e!aminri
de microbiologie clinic. 9ezultatul corect al acestei probe este
esenial pentru orientarea sau reorientarea terapeutic n
septicemii. Jemocultura se practic ori de c&te ori semnele clinice
%frison, cretere brusc a febrei la .8
3
C-*3
3
C( indic posibilitatea
ptrunderii microorganismelor n circulaie %bacteriemie(.
Starea seticemic, clinic manifest, poate fi nt&lnit n
diferite situaii:
- boli infecioase cu bacteriemie constant %bruceloz,
febr tifoid etc.(
- complicaii ale unor infecii primare sau ale unor focare
53
de infecie %abcese, furunculoz, meningit, pneumonie
etc.(
- consecutiv unor intervenii sau manevre chirurgicale
- ptrunderea agenilor infecioi prin intermediul unor
vectori %tifos e!antematic, malarie(.
<!ist i o bacteriemie pasager la pacieni cu deficiene
importante n sistemul imunitar, dup terapie cu citoto!ice, n
cancer si alte situaii.
;n toate cazurile n care agentul patogen este reprezentat de
bacterii, independent de situaiile mai sus amintite, hemocultura se
e!ecut dup aceeai tehnic.
$racticarea hemoculturii n condiii speciale are loc n cazul
ptrunderii n s&nge a altor microorganisme %virusuri, ricNettsii,
mOcoplasme, parazii, levuri(.
'omentul i numrul recoltrilor depinde de bacteriemia
ma!im %prezena n s&nge a microorganismelor fiind pasager(,
care poate precede ascensiunea febril i frisonul, de aceea se vor
recolta 6-. probe n 6* de ore, ntotdeauna naintea tratamentului
antimicrobian.
$relevarea se practic, de obicei, dintr-o ven a plicii
cotului. Aseptizarea regiunii se realizeaz prin tergerea cu un
tampon mbibat cu alcool etilic %03-8-H( i apoi cu tinctur de iod.
+&ngele se recolteaz n condiii de absolut sterilitate de
ctre medic, la patul bolnavului, folosindu-se n acest scop o
sering Guer sau, de preferin, un set de transfer adaptat la un
balon de hemocultur care asigur un circuit nchis. Bolumul de
s&nge necesar este de )3 ml, adugat la )33 ml mediu lichid cu o
valoare nutritiv ridicat, care asigur dezvoltarea unor specii
bacteriene c&t mai variate.
,alonul de hemocultur se incubeaz, de preferin, ntr-un
container cu atmosfer de C7
6
sau, n lipsa acestuia, se realizeaz
o incubare aerob la .0
3
C, n medie 0 zile. <!aminarea vizual
macroscopic se face zilnic n primele - zile i la sf&ritul perioadei
de incubare. ;n cazul n care, ntre timp, apare turbiditate,
hemoliz, producere de gaz sau pelicul, se efectueaz e!aminri
microscopice, preparat nativ i colorat ?ram, precum i subculturi
pe medii adecvate: geloz-s&nge, geloz-chocolat, geloz-lactat,
n funcie de rezultatul e!amenului bacterioscopic. Anoculrile se
54
fac at&t n aerobioz, c&t i n anaerobioz, urm&nd s se identifice
microorganismele izolate.
1.8.,.*. Re$4lt!re! li$9i&'l'i $e0!l4r!9i&i!# 5LCR7
<!aminarea bacteriologic a lichidului cefalorahidian este
una din cele mai urgente probe de microbiologie clinic, dat fiind
gravitatea deosebit a meningitelor. Acest e!amen se practic ori
de c&te ori este prezent un sindrom meningian sau chiar o stare de
into!icaie grav.
Anfecia GC9 i a membranelor meningiene %meningita(, cu
interesarea eventual a creierului i a mduvei spinrii
%meningoencefalita(, apare ca o consecin a variate situaii:
invazia meningelui, pe cale hematogen, de ctre bacteriile,
virusurile sau fungii prezeni n diferite focare infecioase de
vecintate sau de la distan, ori introducerea din e!terior a
germenilor patogeni n mod accidental.
9ecoltarea se e!ecut la patul bolnavului %fig.6* a i b( de
ctre medicul clinician, n condiii de absolut sterilitate, dup
tehnica bine cunoscut. 5atorit presiunii crescute a GC9 n
meningite, acesta poate fi recoltat direct pe ac n eprubete sterile.
Aspectul lichidului orienteaz medicul clinician spre
operaiunile de urgen i spre cele ulterioare. Gichidul normal este
limpede ca Dapa de st&ncE.
55
Fi). ,8 !
Fi). ,8 :
;n afar de acest aspect, care nu nseamn neaprat
normalitate, se poate constata, n funcie de agentul etiologic,
aspectul de:
- lichid clar, incolor %fig. 6--A( tulbure %fig. 6--,(,
conin&nd s&nge %fig. 6--C(
- lichid hemoragic %fig. 6/(: al crui supernatant este
56
limpede %hemoragie prin atingere accidental a vaselor(
al crui supernatant este colorat %hemoragie
subarahnoidian(
- lichid !antocromic %colorat glbui( opalescent, tulbure
%purulent( %fig.60(.
Fi). ,*
Fi). ,>
57
Fi).,+
;n cazul unui lichid tulbure, se va proceda la o nsm&nare
la patul bolnavului a 3,6 # 3,- ml GC9 n tuburi cu diferite medii sau
se va transporta imediat flaconul cu GC9 la laborator, menin&ndu-
se la temperatura de .0
3
C. Gaboratorul va continua e!plorarea.
1.8.,.>. Re$4lt!re! e;('&!tel4r 2i tr!#(('&!tel4r &i#
(er4!(e
5li$9i&e "le'r!le? "erit4#e!le 2i !rti$'l!re7
<!sudatele i transsudatele cavitilor nchise reprezint
reacia de tip inflamator sau neinflamator a seroaselor respective
fa de anumii e!citani, duc&nd la acumularea de lichid ntre
membrana visceral i cea parietal.
$relevarea lichidelor amintite se efectueaz n mod
obligatoriu prin puncie cu seringa, n condiii de asepsie foarte
riguroas. ;ntruc&t n aceste produse se gsesc adeseori bacterii
anaerobe, se vor lua msuri ca lichidele s nu vin n contact cu
aerul %seringa s nu conin bule de aer(, iar pentru nsm&narea
n condiii anaerobe este indicat transportul acestora n seringa
folosit pentru recoltare, cu acul nfipt ntr-un dop de cauciuc steril.
1.8.,.+. Prele6!re! (e$re3iil4r "'r'le#te &i# $4le$3iile
&e($9i(e
+ecreiile purulente rezultate din infeciile pielii i din plgile
de diferite categorii %traumatice, chirurgicale, arsuri(, conin ageni
58
microbieni foarte diferii, adeseori, n asociere. Astfel, bolile pielii i
esuturilor subiacente sunt dominate de piodermitele stafilococice
%foliculite, hidrosadenite, panariii, furunculoze etc.( i streptococice
%impetigo, panariii, ectime etc.(, singulare sau n asociere. Alte
infecii, subacute sau cronice, ale pielii sunt cauzate de variate
bacterii patogene.
$relevarea se poate face n orice unitate sanitar dac
e!amenul se limiteaz la bacterioscopie. ;n general, recoltarea se
face, ns, n scop de cultivare. 5in coleciile purulente relativ
profunde, neabcedate, prelevarea se face prin puncie, dup
aseptizarea regiunii respective. ;n cazul plgilor profunde,
insuficient drenate, fistulizate, se recolteaz produsul de la baza
leziunii, n sering sau n tuburi. 5in leziunile cutanate superficiale
nchise %vezicule, pustule, furuncule( se indic prelevarea prin
puncionare cu pipeta $asteur %flambat i rcit(, dup
aseptizarea regiunii cu alcool i apoi splare cu ser fiziologic steril.
;n unele situaii, se iau msuri de recoltare n vederea izolrii
bacteriilor anaerobe.
1.8.,... Pr4:e &e e;ere% $9ir'r)i$!l% 2i #e$r4"ti$e
<!amenul microbiologic al acestor probe poate constitui, n
unele cazuri, singurul mi'loc de diagnostic etiologic al unei infecii.
<ficacitatea acestui e!amen depinde de respectarea unor condiii,
dintre care mai importante sunt: recoltarea unei probe din zona
implicat n procesul infecios evitarea contaminrii produsului n
cursul recoltrii efectuarea necropsiei n primele / ore dup
deces efectuarea nsm&nrilor pe o varietate mare de medii.
+e recolteaz prin puncie-biopsie: esut ganglionar,
medular, hepatic, pulmonar etc. ;n caz de necropsie, se recolteaz
s&nge din inim, organe, esuturi i colecii purulente. 5eoarece n
astfel de produse se gsesc frecvent bacterii anaerobe, este
recomandabil recoltarea pentru anaerobioz i, pe c&t posibil,
nsm&narea pe loc.
59
1.*. METODE DE IZOLARE I DE IDENTIFICARE A
BACTERIILOR
1.*.1. C'lti6!re!
<tap principal n stabilirea unui diagnostic etiologic,
cultivarea bacteriilor include:
- nsm&narea prelevatelor
- e!aminarea coloniilor %culturilor( i repicarea lor n
vederea identificrii.
1.*.1.1. #(%-@#3!re! "rele6!tel4r
Azolarea agenilor microbieni dintr-un prelevat sau a unei
bacterii cu potenial patogen dintr-un produs pluricontaminat #
izolare numit i cultur rimar # este hotr&toare pentru
diagnostic c&nd rezult din produse normal lipsite de
microorganisme %GC9, s&nge, lichide pleural, peritoneal, articular(
sau are valoare orientativ mare c&nd provine din produse n care
predomin flora bacterian comensal %tract respirator, digestiv
etc.(.
;n scopul izolrii bacteriilor, se practic nsm&narea
prelevatelor pe medii de cultur potrivite, la suprafaa sau n
profunzimea acestora.
;nsmnarea primar necesit medii cu potenialitate
deosebit, care s permit dezvoltarea unei mari varieti de
bacterii, iar inocularea trebuie e!ecutat n aa fel nc&t s obin o
cultur reprezentativ pe medii lichide i colonii izolate pe medii
solide.
7 colonie reprezint o populaie bacterian, omogen,
provenit dintr-o singur celul. ?enetic, aceast populaie
reprezint o clon. $relu&nd cu ansa bacteriologic o singur
colonie i nsm&n&nd-o pe un alt mediu de cultur adecvat #
repicare # se obine o cultur pur, care poate fi studiat n
continuare n vederea identificrii.
;nainte de inoculare, mediile se prenclzesc, operaie care
este absolut obligatorie pentru bacteriile termosensibile ca
neisseriile patogene, pneumococi, haemophili etc.
60
Anocularea se e!ecut cu ansa, tamponul sau cu pipeta
$asteur. Ansa este mai frecvent utilizat pentru inoculare. +e
depune inoculul pe un sector limitat al plcii $etri, cu ansa, cu
tamponul pe care s-a fcut prelevarea sau cu pipeta $asteur. Apoi,
cu ansa sterilizat i rcit # se disperseaz inoculul pe
apro!imativ o treime din suprafaa plcii %fig.62 # sector )(. +e
flambeaz ansa i apoi se fac striuri perpendiculare pe primele i
pornind de la aceasta %fig.62 # sector 6(, dup care se flambeaz
din nou i se continu dispersia n striuri pe restul suprafeei plcii
%fig. 62 # sector .(.
Fi). ,. D Se#('l -i2$%rii !#(ei 51? ,? 1? (e$t4!rele &e &i("er(ie7

5ac inoculul nu este prea bogat, se poate proceda la
dispersia continu n striuri perpendiculare, fr flambarea
intermediar a ansei, p&n la epuizarea inoculului. Astfel se vor
obine colonii izolate %fig. 68(.
61
Fi). ,B D C4l4#ii i4l!te &i# $!re (e 6! 0!$e re"i$!re! "e#tr'
(':$'lt'r%
;n afara depunerii inoculului pentru o ulterioar dispersie cu
ansa, nsm&narea cu pipeta $asteur este indicat pentru
inocularea n serie a tuburilor cu medii lichide sau solide nclinate.
;nsm&narea direct cu tamponul se practic pentru unele
produse, c&nd acestea se inoculeaz pe geloz nclinat %fig. .3(
sau pe medii de conservare %fig. .)(.
;nsm&narea n profunzime a mediilor solide se poate face
prin nepare cu o ans bacteriologic dreapt sau prin nglobare n
mediu topit, pentru: cercetarea mobilitii bacteriilor, a unor
proprieti biochimice, cultivarea anaerobilor %vezi diagnosticul
infeciilor cu anaerobi(.

Fi). 1/
62
=ig. .)
1.*.1.,. E;!-i#!re! $'lt'ril4r
"ediile de cultur nsm&nate, dup incubare la .0RC, se
e!amineaz sub aspectul dezvoltrii coloniilor pe mediile solide i
a caracterelor de cultur pe mediile lichide.
$erioada de incubare obinuit este Dpeste noapteE, dar n
cazul mediilor selective, se va prelungi la *2 ore i la - zile pentru
bacteriile cu dezvoltare lent %haemophil, meningococ, gonococ,
Oersinia etc.(. :rmrirea plcilor incubate anaerob, se va face la
6*-*2-86 ore pentru plcile +abouraud 6-- zile, iar pentru mediul
GMSenstein --2 sptm&ni.
+e noteaz aspectul culturii, numrul i felul coloniilor pe
diferite medii chiar i absena creterii pe un anumit mediu poate
s constituie un factor relevant.
aracterizarea culturilor n medii lic+ide
#radul dez"oltrii: absent, srac, moderat, abundent.
4urbiditatea - absent sau prezent: moderat, intens,
uniform, granulat, floconar ma'oritatea bacteriilor tulbur
uniform mediul altele se sedimenteaz i supernatantul rm&ne
limpede.
63
Deozitul - absent sau prezent: puin, abundent, granular,
floconar.
!reterea la surafa - absent sau prezent: cu inel sau
pelicul subire sau groas.
!uloarea - absent sau prezent: verde %pentru bacilul
piocianic(.
'irosul - absent sau prezent: aromat %piocianic(, fetid
%anaerobi(.

Aspectul culturilor pe medii solide
$entru descrierea aspectului culturii sau a coloniilor pe
plci, se vor nota cel puin o parte din urmtoarele caracteristici
%fig..6(:
- relieful: turtit sau bombat, redus, pronunat, ombilicat, cu
suprafa neted sau rugoas, mucoid
- conturul: bine delimitat, circular, dantelat, cu prelungiri
- oacitatea: transparente, translucide, opace
- culoarea: alb, pigmentare aurie, rou etc.
- consistena: mucoas, untoas, friabil, cremoas
- susendarea n ser fiziologic: omogen sau granular.

;n funcie de aceste caracteristici, se deosebesc dou tipuri
de colonii:
- colonii de ti S %smooth T neted( cu suprafa bombat,
neted, lucioas, contur bine delimitat, consisten
cremoas, uor emulsionabil
- colonii de ti $ %rough T rugos(, cu suprafaa turtit,
neregulat, contur crenelat, uscate, cu suspensii
granulare.

Amportana diagnostic a acestor aspecte este dat de
faptul c ma'oritatea speciilor patogene se dezvolt sub form de
colonii +. <!cepie fac bacilul difteric, crbunos i bacilul
tuberculozei, care se izoleaz de la bolnavi i sunt patogene n
forma 9.
64
Fi). 1, D A("e$t'l $4l4#iil4r "e -e&ii (4li&e 5-%ri-e #4r-!l%7.
5A7 Stap+,lococcus epidermidis "e !)!r #'triti6E 5B7 Streptococcus
faecalis "e !)!r l!$t4!t $' i#&i$!t4r r42' #e'tr' 5$4l4#ii
"'#$ti04r-e7E 5C7 S+i#ella sonnei "e !)!r #'triti6 5$4l4#ii S 2i R7E 5D7
-lebsiella pneumoniae "e !)!r #'triti6 l!$t4!t 5$4l4#ii -'$4i&e
&!t4r!te "r4&'$3iei 6i)'r4!(e &e "4li!9!ri&e $!"('l!re7.


Alte caracteristici
$e plcile de s&nge se urmrete tiul *emolizei: alpha,
beta i gamma precum i raportul dintre aria de hemoliz i
mrimea coloniei %plana AA-.(.
65
$e mediile difereniale i selectiv-difereniale se apreciaz
frecvena coloniilor lactozooziti"e sau lactozonegati"e %plana AA-
*(.
9epicarea coloniilor bacteriilor potenial patogene, dup
aspectul coloniei, natura prelevatului, rezultatele e!amenului
bacterioscopic, cu scopul de a obine culturi pure, este obligatorie.
Aceast repicare se recomand a fi fcut cu ansa n form de
bucl fin %sau fir de ans fr bucl(, astfel nc&t )I6 din colonie
s fie trecut pe mediul de repicare, iar cealalt 'umtate pe frotiu,
operaie necesar pentru antibiogram i, mai ales, pentru
identificare.
1.*.,. Pri#$i"!lele -et4&e &e i&e#ti0i$!re ! !)e#t'l'i
eti4l4)i$
+copul final al e!aminrii oricrui prelevat este identificarea
agentului etiologic, care n unele situaii se poate realiza pe baza
datelor oferite de caracterele morfotinctoriale i cultur. ;n cele mai
multe cazuri este nevoie de completarea informaiilor amintite cu
cele oferite de:
- caracterele metabolice generale %de gen( i particulare
%de specie(
- caracterele antigenice
- caracterele proprietilor de patogenitate ale bacteriei n
cauz.
1.*.,.1. Te(te -et!:4li$e &e i&e#ti0i$!re
;n investigarea proprietilor metabolice, accentul este pus
pe cele generale: catalaza, o!idaza, testele de fermentare-o!idare
%=-7( ale glucozei i producerea de gaz. $entru determinri
suplimentare se mai folosesc i alte teste.
atalaza
Catalazele sunt enzime care catalizeaz descompunerea
apei o!igenate n ap i o!igen:

66
6J
6
7
6
U catalaz 6J
6
7 U 7
6

1estul este pozitiv dac bacteriile au metabolism o!idativ, i
se e!ecut prin descompunerea pe suprafaa culturii a soluiei
reactiv %hidrogen pero!id # J676 # )-H(, fie n tubul cu cultur, fie
ntr-o suspensie de cultur pe lam. Apariia bulelor de gaz denot
un rezultat pozitiv.

Testul fermentare"oxidare .testul F"/0
Princiiul. "odul de degradare a glucozei sau altui substrat
de ctre bacterii: pe cale fermentativ %=( # prin fosforilare prin
o!idare direct %7( sau prin ambele modaliti %=U7(.
+e utilizeaz o geloz semimoale, tamponat i cu adaos
de glucoz sau alt substrat, i un indicator de pJ %albastru de
bromtimol(. "ediul repartizat n tuburi se nsm&neaz n toat
coloana. 5up incubare, prin degradarea substratului cu formare
de acizi, indicatorul va vira n galben.
,acteriile care degradeaz o!idativ glucoza, vireaz n
galben numai la suprafa. ,acteriile care degradeaz o!idativ i
fermentativ glucoza, vor vira n galben toat coloana mediului, iar
cele care degradeaz fermentativ substratul, vireaz coloana
mediului n galben numai n profunzime %anaerobii(.

/xidaza
<ste o enzim o!idativ prezent la unele specii bacteriene,
care acioneaz asupra unor amine aromate produc&nd compui
colorai. =iind pozitiv la grupul Neisseria, se folosete curent n
identificarea meningococilor i gonococilor.
$entru e!ecutarea testului sunt mai multe procedee, dintre
care metoda >ovacs este frecvent folosit. Aceasta const n
mbibarea unei f&ii de h&rtie de filtru n reactivul pentru o!idaz,
pe care se aplic o poriune din colonie, cu ansa. 1estul pozitiv se
traduce prin apariia culorii purpurii n decurs de )3 secunde.
Fermentarea +idrailor de carbon
67
:tilizeaz medii de cultur cu bulion de baz pentru
fermentaie, care conine unul din carbohidrai: glucoz, lactoz,
zaharoz, manit, dulcit.
"ediile cu pJ de 0,)-0,6 %indicatori: bromthOmol blau sau
bromcrezol purpur(, repartizate n tubuoare de fermentaie, se
inoculeaz cu o cantitate mic dintr-o cultur t&nr %)2-63 ore de
incubare(. Ancubate la .0RC, se e!amineaz zilnic *-- zile,
not&ndu-se producia de acid %prin virarea mediului( i volumul de
gaz produs de bacteriile aerogene. 1estul este util identificrii
grupurilor principale de +nterobacteriaceae.

Testul 1o#es"Pros2auer
:nii germeni au capacitatea ca prin fermentaia acetonic
s degradeze acidul piruvic %rezultat din desfacerea glucozei( i s
dea natere la acetilmetil carbinol, care este o!idat n prezena
aerului i n mediu alcalin pentru a forma diacetil, ce poate fi
evideniat printr-o reacie chimic.
Anstitutul DCantacuzinoE prepar o soluie de cupru
amoniacal pentru efectuarea testului. Ga ) ml cultur, se adaug
) ml soluie cupru amoniacal. Citire dup 63 de minute. 9ezultat
pozitiv: apariia unei culori roii.

Testul beta"#alactozidazei
$entru identificarea multor bacterii, degradarea lactozei prin
beta-galactozidaze are mare importan. $rezena enzimei se
deceleaz prin determinarea colorimetric a ortonitrofenolului
eliberat dintr-un substrat 7@$? %ortonitrofenil galactozid(, atunci
c&nd este pus n contact cu o suspensie bacterian dens.
Ga o suspensie n soluie salin fiziologic de cultur, se
adaug o rondel mbibat cu 7@?$. ;nclzind eprubeta n palm,
soluia devine galben %la testul pozitiv(, datorit formrii
ortonitrofenolului sub aciunea beta-galactozidazei. 1estul este
pozitiv pentru +sc*eric*ia coli.

Testul producerii de indol
68
:nele bacterii, prin enzima triptofanaz, catalizeaz
triptofanul, duc&nd la formarea de indol. Acest produs, n prezena
reactivului, duce la formarea de nitrozoindol de culoare roie %fig.
..(.
1estul se poate efectua uor prin folosirea de benzi pentru
reacia indolului, preparate de Anstitutul DCantacuzinoE. Acestea se
ataeaz la dopul tubului cu mediu %ap peptonat sau mediu
"A:(, astfel nc&t, captul poriunii impregnate cu reactiv s a'ung
la un cm deasupra mediului. ;n caz de pozitivare, apare o culoare
roie n 6* de ore. 1estul este pozitiv la +sc*eric*ia coli.
Testul decarboxilazelor
$rezena enzimelor care pot decarbo!ila aminoacizii, la
unele bacterii, face din acesta un test important pentru identificarea
enterobacteriilor.
+unt folosii ca substraturi urmtorii aminoacizi : lizina,
arginina i ornitina. =iecare din acetia, sunt decarbo!ilai de o
enzim specific, cu eliberare de C76 i a aminei
corespunztoare.

Producerea de +idro#en sulfurat
:nele microorganisme posed o enzim din grupul liazelor
%C-+-liaze(, care acioneaz pe substane organice derivate din
pepton, ca cisteina, cistina sau pe produi anorganici ca sulfurii-
tiosulfurii, d&nd natere la .
2
S %hidrogen sulfurat(, care intr n
combinaie cu srurile de fier sau de plumb, produc&nd sulfuri de
culoare neagr.
1ehnica de referin pentru testarea formrii de .
2
S, este
folosirea mediului 1+A, preparat de Anstitutul DCantacuzinoE.
69

Fi). 11 D Te(t'l "r4&'$erii &e i#&4l. T':'l &i# (t@#)! !r!t% '# te(t
"4iti6
5i#el r42'7. T':'l &i# &re!"t! $' te(t'l i#&4l #e)!ti6 5i#el )!l:e#7.

$entru efectuarea testului, mediul se nsm&neaz prin
depunerea culturii n striuri, pe partea nclinat, i prin neparea
prii drepte. ;n ma'oritatea cazurilor, reacia pozitiv apare n 6*
de ore, i se evideniaz prin nnegrirea coloanei drepte a mediului.
7 alt tehnic pentru folosirea formrii de J
6
+, const n
folosirea de benzi de h&rtie impregnate cu o soluie de acetat de
$b, care se depune n tubul de cultur.

Testul ureazei
<nzima ureaz, prezent la unele bacterii, are capacitatea
de a scinda ureea, cu eliberarea de C7
6
i @J
.
. $roducerea de
amoniac, se nsoete de virarea spre alcalin a mediului, decelabil
prin indicatorul rou fenol. 1estul este util n identificarea
germenilor din genurile Proteus i 6ersinia, i se e!ecut pe mediul
70
"A:, livrat de Anstitutul DCantacuzinoE. 9eacia pozitiv: virarea
spre rou %fig. .*(.
Fi). 18 D Te(t'l 're!ei. T':'l &i# (t@#)! $' te(t'l 're!ei "4iti6
5$'l4!re r42ie7. T':'l &i# &re!"t! $' te(t'l 're!ei #e)!ti6 5$'l4!re
)!l:e#%7.
Testul fenilalanindesaminazei
,acteriile din grupul Proteus, posed o enzim care
acioneaz pe substratul fenilalanin i duce la formarea de acid
beta-fenilpiruvic, iar acesta, n prezena ionilor de fier, formeaz
fenil-piruvat de fier, de culoare verde.
Anstitutul DCantacuzinoE prepar at&t mediul cu substratul
respectiv, c&t i reactivul clorur feric )3H.
"ediul se folosete n poziie nclinat, i se inoculeaz
bogat dintr-o cultur t&nr, pe geloz. Ancubare la .0RC, timp de *
ore picturi din reactiv, i, prin nclinare, se face contactul cu
cultura. 1estul pozitiv, se traduce prin apariia unei culori verzi a
lichidului i a gelozei nclinate.
71
3tilizarea citratului ca surs de carbon
;n acest scop, se folosete mediul D+immonsE, preparat de
Anstitutul DCantacuzinoE. $entru utilizare, mediul se topete, se
repartizeaz n tuburi i se rcete n poziie nclinat.
?ermenii care folosesc citratul, vor crete produc&nd # prin
metabolii alcalini # o virare n albastru a mediului.
"artor pozitiv: Salmonella% Hlebsiella.
"artor negativ: S*igella% +sc*eric*ia coli.
4ezvoltarea pe mediu cu acetat
+sc*eric*ia coli folosete acetatul ca unic surs de carbon
%prin ciclul glio!ilic( i se dezvolt pe un mediu minimal, care
conine acetat de sodiu i un indicator de pJ. $rin acest test poate
fi difereniat genul +sc*eric*ia de genul S*igella, care nu poate
utiliza acetatul ca unic surs de carbon.
Sisteme de ec+ipamente .2ituri0 comerciale

+istemele de identificare biochimic miniaturizate sunt
obinute din surse comerciale, de e!emplu sistemele A$A %fig. .-(.
Acestea sunt compuse dintr-o plac de plastic av&nd cupe mici
%miniaturizate( care conin substane deshidratate. =iecare cup
are un mic orificiu la v&rf. $entru efectuarea testului, o suspensie
salin %ser fiziologic( conin&nd cultur dintr-un microorganism este
introdus cu o pipet $asteur n orificiul cupelor p&n la umplere,
placa de plastic se acoper apoi cu un capac i se plaseaz ntr-o
camer umed din plastic, cu care se incubeaz la .0
3
C, pentru 6*
# *2 ore.
$rofilele biochimice se determin prin citirea modificrilor de
culoare, iar interpretarea se face conform unui grafic.
9ezultatele sunt convertite printr-un cod numeric care poate
fi citit, d&nd posibilitatea identificrii microorganismului izolat.
<!ist mai multe sisteme A$A pentru diferite grupe de
microorganisme, ca de e!emplu: A$A 63 < i A$A 63 @< pentru
enterobacterii A$A 63 +19<$ pentru streptococi etc.
72
Fi). 1* D D4'% "l%$i API $' re!$3ii :i4$9i-i$e "e#tr' &4'%
ti"'ri &i0erite &e -i$r44r)!#i(-e.
1.*.,.,. Te(te $4-"le-e#t!re &e i&e#ti0i$!re
Alturi de testele metabolice, se folosesc n mod curent i
alte proprieti ale bacteriilor, care faciliteaz identificarea
germenilor patogeni.

Testul mobilitii
+e e!ecut n mod obinuit, nsm&n&nd prin nepare, pe o
ad&ncime de - mm, un tub cu geloz dreapt 3,*H. +e incubeaz
la .0RC. <ste indicat ca inoculul s provin de pe un mediu care
favorizeaz dezvoltarea flagelilor %bulion sau geloz 3,6H(.
"artor pozitiv: +sc*eric*ia coli% Proteus.
"artor negativ: S*igella.
Testul la bacitracin
+e bazeaz pe proprietatea streptococilor -hemolitici de
grup A de a fi inhibai de o anumit concentraie din acest
antibiotic. Acest test servete la separarea preliminar a
streptococilor de grup A, considerai ca av&nd un potenial
patogenic deosebit.
73
+e utilizeaz discuri de bacitracin # difereniale, care conin
3,3* :Idisc # in&nd seama de faptul c discurile antibiograme, cu
o concentraie de )3 :Idisc, nu sunt adecvate pentru acest test.
1estul se efectueaz prin inocularea unei culturi de
streptococi, pornind de la colonii izolate din cultura primar, pe
plci cu geloz-s&nge, peste care se depune discul de bacitracin.
7binerea unei zone de inhibaie de cel puin 2 mm diametru,
caracterizeaz streptococii de grup A. +e supun acestui test numai
streptococii cu -hemoliz cert, in&nd seama de faptul c i unii
streptococi -hemolitici, inclusiv pneumococii, pot fi sensibili la
bacitracin.

Testul la optoc+in
+ervete la separarea pneumococilor de streptococii
hemolitici, folosind discuri impregnate cu - mcg optochin.
Culturi pure de pneumococi de pe mediul lichid sau colonii
de pe geloz-s&nge, se etaleaz n strat subire pe geloz-s&nge,
peste care se depune discul cu optochin. +e incubeaz la .0RC,
aerob.
:n test pozitiv este dat de o zon de inhibiie de minimum 8
mm diametru.

1.*.,.1. I&e#ti0i$!re! &'"% $!r!$terele !#ti)e#i$e
5efinirea caracterelor antigenice are o valoare diferit, de la
o bacterie la alta. Astfel, n identificarea germenilor din grupurile:
Salmonella, S*igella i 7ibrio c*olerae, procedeul este
indispensabil. ;n alte cazuri, determinarea structurilor antigenice
are valoare mai redus %meningococi, streptococi, pneumococi,
grupurile )rucella i )ordetella(, n comparaie cu proprietile
morfologice, culturale i metabolice pe care aceste determinri le
completeaz. :neori, procedeul se folosete pentru precizarea
caracterelor de subspecie %serotip(, nu ntotdeauna necesare
pentru orientarea terapeutic.
Cercetarea caracterelor antigenice se efectueaz n mod
predilect prin reacia de aglutinare pe lam sau n tuburi, cu seruri
imune %seruri de animale imunizate cu antigene # bacterii #
74
cunoscute(, de unde i denumirea de identificare serologic. ;n
unele cazuri se folosesc i alte reacii antigen-anticorp pentru
identificarea bacteriilor patogene. Astfel, pentru definirea grupului
Stretococcus, se utilizeaz reacii de precipitare.

1.*.,.8. Deter-i#!re! $!r!$terel4r &e "!t4)e#it!te
Cercetarea proprietilor de patogenitate in "i"o sau in "itro,
prin reproducerea infeciei e!perimentale la animale de laborator
%oareci albi, cobai, iepuri( sau evidenierea to!inogenezei
%eliberri de to!ine(, c&t i a unor produi e!tracelulari neto!ici,
ofer posibiliti de identificare sigur pentru un numr redus de
germeni, al cror diagnostic de certitudine este ns deosebit de
important, dat fiind gravitatea bolii.

Testele de pato#enitate in vivo
+e face apel la determinare caracterelor de patogenitate ale
bacteriilor, prin inoculri la animale de laborator, pentru germenii
care dau antra!ul, tetanosul, tuberculoza etc.
/nocularea la animale a unei suspensii dintr-o cultur de
bulion, subcutan, la oarecele alb:
- n caz de infecie cu bacil crbunos %)acillus ant*racis(,
determin septicemie i moartea animalului n 6*-*2 ore
- n infecia tetanic %!lostridium tetani(, dup 8-)3 zile se
instaleaz boala cu simptomatologie caracteristic.
5emonstrarea patogenitii reprezint deci un test
obligatoriu pentru identificarea bacilului crbunos i testul cel mai
sigur de identificare a bacilului tetanic.
Anocularea subcutanat, la cobai, a unei suspensii de cultur
sau filtrat al unei culturi de bacil difteric, duce la moartea animalului
neprote'at cu ser antidifteric, n 6*-8/ ore. Anocularea to!inei la
aceste animale, permite stabilirea unitilor de msur in "i"o a
to!inei, care este doza limit mortal.
4estul Derato-conFuncti"itei la cobai, demonstreaz
proprietile invazive ale bacteriilor din grupul +sc*eric*ia coli
%tulpini invazive(, i a bacililor dizenterici # S*igella %amnunte n
capitolele urmtoare(.
75
Dermatonecroza la ieure %testul =raser(, dup inocularea
intradermic a unui filtrat de cultur de bacil difteric to!igen
%!or,nebacterium di*t*eriae(, evideniaz proprietatea de
patogenitate a germenilor din acest grup.
4estul ansei ligaturate la ieure, evideniaz enteroto!ina
tulpinilor enteroto!igene de +sc*eric*ia coli, 7ibrio c*olerae%
Pseudomonas etc.
4estul Dolman, pentru evidenierea enteroto!inei
termorezistente a stafilococului patogen, responsabil de
producerea to!infeciilor alimentare stafilococice.

Teste de pato#enitate in vitro
5ei izolarea dintr-un produs, a unui agent etiologic, confer
acestuia atribut de germen patogen, frecvent se utilizeaz teste de
patogenitate n vitro, n vederea identificrii unora din aceste
bacterii, pun&nd n eviden: to!igeneza %testul <leN( coagulaza
fibrinoliza lizotipia etc. %descrise n capitolele urmtoare(.
1.*.,.*. I&e#ti0i$!re! r!"i&% ! -i$r44r)!#i(-el4r "ri#
-et4&e !le :i4l4)iei -4le$'l!re
Adentificarea microorganismelor prin metode de biologie
molecular este posibil la ora actual prin sonde de A5@ i prin
amplificarea genic a acizilor nucleici, metode de depistare i
identificare rapid a unor microorganisme care se cultiv lent sau
nu se pot cultiva.
Sondele moleculare A4)
+ondele A5@ sunt utile at&t pentru detectarea rapid a unor
microorganisme n prelevatele patologice, c&t i pentru
identificarea unor bacterii sau fungi cultivate n medii lichide i
pentru care sunt comercializate aceste sonde.
"etodele de utilizare a sondelor A5@ sunt standardizate i
permit detectarea direct a unor bacterii n produsele patologice,
76
cum sunt: !*lam,dia trac*omatis% #ardnerella "aginalis% Neisseria
gonorr*oeae% Stretococcus ,ogenes de grup A etc. 5e
asemenea, se pot detecta protozoare %4ric*omonas "aginalis(,
fungi %!andida s.( i virusuri %$apillomavirusuri umane(. :n
numr mare de specii bacteriene i fungi pot fi identificate rapid din
culturi prin aceast tehnic de hibridare cu sonde A5@.
;n prezent, trei metode de hibridare cu sonde A5@ sunt mai
frecvent folosite: hibridarea n faz solid, n soluie i in situ.
.ibridarea n faz solid este mai mult utilizat n cercetare
i n unele laboratoare clinice ca o metod slot blot sau dot blot, n
care celulele intacte sunt lizate, A5@-ul denaturat i aspirat de o
membran de nOlon, sub form de dot %pictur( i apoi fi!at pe
membran, astfel nc&t membrana de nOlon particip la reacia de
hibridare, fiind imersat ntr-o soluie care conine sonda A5@-
receptor. +ondele receptor nelegate sunt eliminate prin splare i
astfel poate fi detectat numai sonda legat.
Dot blot poate fi folosit ca i o variant sandSich, care
utilizeaz dou sonde ce se leag la situsuri diferite pe acidul
nucleic int. Acest sistem este uneori mai sensibil dec&t hibridarea
standard pe membran i utilizeaz de obicei, truse comercializate
pentru identificarea unor tulpini de $apillomavirusuri umane. Alte
variante de hibridare n faz solid sunt: sout*ern-blot, care
permite determinarea mrimii fragmentelor A5@ legate la zona
receptor i nort*ern-blot, n care sonda receptor este folosit
pentru detectarea A9@-ului.
.ibridarea n soluie utilizeaz mai multe surse i truse de
sonde A5@, n care at&t acidul nucleic, c&t i sonda sunt libere i
reacioneaz n mediul lichid. "etoda uzual este hibridarea de
protecie - hObridization protection assaO %J$A( # n care sonda
A5@ marcat cu un ester de acridin este hibridat cu A5@ int i
apoi tratat cu alcali, astfel c dup adugarea pero!izilor, esterul
de acridin emite lumina detectabil.
77
.ibridarea in situ apare pe esuturi infectate i utilizeaz
seciuni histopatologice fi!ate cu formaldehid i parafinate, dup
care are loc procesarea esutului n aa fel nc&t morfologia tisular
s fie pstrat, dar n acelai timp s aib loc denaturarea acizilor
nucleici din celule pentru a-i face accesibili sondelor, care sunt
relativ mici %cu .33 baze(, pentru a avea accesibilitate mai mare n
celul.
Te+nici de amplificare a acizilor nucleici
<!ist mai multe metode de amplificare a acizilor nucleici in
"itro, procesul amplificrii fiind oarecum analog cu cultivarea unui
microorganism, prin amplificare reuindu-se dublarea enzimatic i
a secvenelor specifice de acizi nucleici a unui microorganism sau
a unei game variate de microorganisme. Aceste procedee au un
avanta' selectiv fa de cultivare, n sensul c nu sunt limitate de
capacitatea de cretere a microorganismului pe medii artificiale.
P!$ ?Pol,merase !*ain $eaction@ este metoda cea mai
cunoscut i mai frecvent utilizat, fiind o tehnic bazat pe
capacitatea A5@-polimerazei de a copia o caten de A5@ i astfel
fiecare ciclu de reacie dubleaz cantitatea de A5@ int.
Princiiul metodei const n: amplificarea unei matrie de
A5@ %secvena de amplificat( prin polimerizri succesive doi
oligomeri de sintez servesc drept amors i confer specificitatea
reaciei dup denaturare, fiecare lan nou sintetizat servete drept
matri.
1ehnica pentru amplificarea acizilor nucleici are nc o
aplicare limitat la laboratoarele mari de referin i de cercetare,
deoarece metoda poate da rezultate fals pozitive datorate
contaminrii, iar pe de alt parte, automatizarea acestor tehnici
este foarte scump i laborioas. Cu toate acestea, laboratoarele
clinice beneficiaz de metode de amplificare genic pentru
detectarea n produse patologice a micobacteriilor, meningococilor,
gonococilor, chlamOdiilor, treponemelor, a virusurilor hepatitei C,
78
virusului citomegalic etc., cu posibiliti de lrgire a acestei liste n
diagnosticul infeciilor bacteriene i virale, dar i a unor boli
datorate mutaiilor genetice sau n tipizarea JGA n transplantul de
organe, prin multiplele variante ale $C9 e!istente la ora actual.
1.*.1. Te(t!re! (e#(i:ilit%3ii :!$teriil4r "!t4)e#e l!
!#ti:i4ti$e<!#ti:i4)r!-!
Antibiograma sau testarea sensibilitii unei tulpini
bacteriene la chimioterapice, se bazeaz pe capacitatea acestor
ageni de a opri multiplicarea bacterian # efect bacteriostatic #
sau de a omor bacteriile # efect bactericid.
Antroducerea n terapie a unui antibiotic sau chimioterapic,
fiind o operaie de mare responsabilitate medical, cere
respectarea unor condiii:
- antibiograma se face dup izolarea n cultur pur i
identificarea agentului patogen
- n cazuri de urgen, tratamentul se instituie fr
antibiogram, numai dup recoltarea produselor
patologice necesare
- antibiograma trebuie repetat dac tratamentul cu
antibiotice este de durat mai lung, deoarece agentul
patogen poate s c&tige rezisten fa de antibioticul
utilizat.
5intre multiplele metode, procedee i variante, pentru
laboratorul clinic s-a produs standardizarea antibiogramei,
recomand&ndu-se metoda difuzimetric, varianta >irbO-,auer ca
metod de rutin, alturi de tehnici prin diluii n medii lichide
folosite n cercetare.

1.*.1.1. Met4&! &i0'i-etri$%
Principiul
$rin depunerea discurilor %microcomprimate( cu antibiotice
79
pe suprafaa unui mediu solid, nsm&nat cu o cultur bacterian,
substana antimicrobian activ va difuza n mediu. 5up un timp
de incubaie la .0RC - perioada critic # se vor contura 6 zone
distincte: una n care creterea bacterian este inhibat, i o zon
de cretere n care concentraia de antibiotic este mai mic sau
bacteria este rezistent la antibioticul respectiv.
Cu c&t diametrul zonei de inhibiie este mai mare cu at&t
germenul este mai sensibil, iar cantitatea de antibiotic necesar
inhibiiei este mai mic %concentraia minim inhibitorie T C"A(.
Compar&nd C"A-ul cu nivelul de antibiotic care se poate obine n
organism n timpul tratamentului, s-a putut formula care sunt
diametrele %i implicit nivelurile( critice pentru fiecare antibiotic,
permi&nd clasificarea germenilor studiai n sensibili %+(, rezisteni
%9( i intermediari %A( fa de antibioticul n cauz.

Te+nica
Condiiile tehnice care concur la efectuarea antibiogramei,
pot influena diametrul de inhibiie, astfel c mediul de cultur
%compoziia, pJ-ul(, inoculul, felul discurilor %microcomprimatelor(
sunt standardizate.
'ediul de cultur este geloza "ueller-Jinton, care are o
valoare nutritiv mare, permite dezvoltarea optim a unei varieti
de germeni, i nu conine inhibitori. $entru testarea sensibilitii
streptococilor beta-hemolitici, pneumococilor, neisseriilor, a unor
enterococi, geloza "ueller-Jinton se suplimenteaz cu s&nge de
oaie %-H(.
/noculul preparat din cultur se face din *-/ colonii identice,
pentru a cuprinde un numr c&t mai mare de germeni din populaia
bacterian ce poate prezenta variaii de rezisten %inoculul
reprezentativ(. "rimea inoculului este standardizat prin metoda
nefelometric, i este corespunztoare opacitii dintr-un tub cu
sulfat de bariu care corespunde la un coninut de apro!imativ -!)3-
8!)3 germeni I ml, n funcie de specia microbian.
Substanele antimicrobiene pentru antibiogram, sunt livrate
sub form de Dmicrocomprimate pentru antibiogramE de ctre
Anstitutul DCantacuzinoE. =iecare disc sau microcomprimat # de /
mm diametru # are notat simbolul antibioticului.
80
5epunerea inoculului pe suprafaa mediului de cultur, se
face cu pipete $asteur, cu care apoi se va acoperi uniform ntreaga
suprafa a plcii $etri, dup care se ndeprteaz e!cesul. +e
las s se usuce suprafaa mediului, capacul plcii rm&n&nd uor
ridicat. +e depun microcomprimatele, ls&nd ntre ele o distan
corespunztoare i se incubeaz la .0RC, timp de )2 ore.

itirea i interpretarea rezultatelor
Citirea se face cu ochiul liber, msur&nd diametrul zonei de
inhibiie n mm, cu a'utorul unei rigle sau pe o schem grafic %fig.
./(.
+e apreciaz inhibiia complet a creterii, aa cum se
observ cu ochiul liber. +e iau n considerare i eventualele colonii
izolate, bine dezvoltate, aprute n interiorul zonei de inhibiie,
deoarece acestea pot reprezenta mutante rezistente, n cadrul unei
populaii microbiene predominant sensibile.
Gectura se face pentru fiecare antibiotic, msur&nd
diametrul de inhibiie, i compar&nd acest diametru cu standardele
diametrelor critice stabilite prin folosirea unor tulpini de referin cu
C"A precizat, i trecute ntr-un tabel interpretativ ntocmit conform
unor standarde, n funcie de familia de antibiotice i specia
bacterian izolat, supus testrii.

81
Fi). 1> D A#ti:i4)r!-% "ri# -et4&! &i0'i'#ii =# )el4% 5A?B?C?D?EF
&i($'ri $' !#ti:i4ti$e &i0erite7
<!primarea rezultatelor antibiogramei n buletinul de
analiz, se face prin notarea direct de: + %sensibil(, 9 %rezistent(
sau A %intermediar(, trecut n dreptul simbolului sau al denumirii
antibioticului %fig. .0(.
;n interpretarea rezultatelor, se ine seama de faptul c, prin
antibiogram, se ofer medicului clinician numai unele indicaii
privind C"A-ul pentru germenul n cauz, care poate fi corelat
difuzimetric cu nivelul concentraiei sanguine, urinare etc. <ste
obligaia clinicianului de a seleciona # pe baza rezultatului
antibiogramei # antibioticul cel mai adecvat pentru terapie, n
funcie de caracterele de sensibilitate ale germenului patogen, de
proprietile farmacologice ale antibioticului, de modul de aciune i
de to!icitatea medicamentului.
1.*.1.,. Te9#i$i "ri# &il'3ii =# -e&i'l li$9i&
"etoda diluiilor n medii lichide, permite determinarea
sensibilitii microorganismelor la antibiotice, i mai ales C"A-ul,
permi&nd o confruntare ntre nivelul acestuia cu nivelul de
antibiotic care se poate obine n organism %la nivelul focarelor
infecioase(.
82
Fi). 1+ D I#ter"ret!re! !#ti:i4)r!-eiF :!$teri! te(t!t% e(te (e#(i:il%
l! $l4r!-0e#i$4l 5&i($'l ,7 2i )e#t!-i$i#% 5&i($'l 87? i#ter-e&i!r l!
!-"i$ili#% 5&i($'l 17 2i rei(te#t% l! eritr4-i$i#% 5&i($'l 17
;n plus, aceste tehnici permit dozarea nivelelor de antibiotice
din umorile organismului, teste necesare monitorizrii tratamentului
antibacterian, mai ales n infecii severe %endocardite, septicemii,
meningite,
osteomielite etc.(, c&nd se testeaz efectul bactericid sau nivelul
de eficien bactericid din serul sangvin sau alt lichid biologic
%<!.: cea mai mare diluie de ser sangvin care omoar cel puin
88,8H din bacteriile testate(.
Actual, diferite sisteme automatizate, fac apel la mediile de
cultur lichide ce conin antibiotice, permi&nd evidenierea
efectului inhibitor al antibioticului dat asupra creterii bacteriene.
Aceast apreciere poate fi direct %turbidimetric, nefelometricV(
sau indirect %activitate enzimatic, producie de C7
6
etc.(.
:nele sisteme automatizate i unitile de msur utilizate,
83
fac apel la metode matematice pentru compararea rezultatelor
numerice obinute, e!primate n mgIl. Astfel s-a a'uns la
e!aminarea DConcentraiei "inimale AnhibitoriiE %C"A( a
antibioticului la 6mgIl # *mgIl, put&ndu-se trasa curbe de cretere
a diferitelor specii bacteriene n prezena unor concentraii variabile
dintr-un antibiotic, i totodat fc&nd posibil trasarea limitei dintre
efectul bacteriostatic i bactericid.

1.*.8. Te(t!re! 6!ri!:ilit%3il4r )e#eti$e l! :!$terii
Bariabilitatea genetic reprezint o proprietate fundamental
a microorganismelor %ca de altfel a tuturor organismelor vii(, care
asigur generarea de noi genotipuri. +e cunosc dou mecanisme
care au rol n generarea variabilitilor= mutaiile i recombinarea.

1.*.8.1. C!r!$ter'l ("4#t!# !l -'t!3iei
"utaiile se traduc prin modificri n secvena nucleotidelor
din moleculele de A5@ cromozomial i care se transmit la
descendeni. Caracterul spontan al mutaiilor la bacterii,
nedirecionate de factorii de mediu, dar care au rol de selecie a
mutantelor prin e!periena convingtoare, sunt: testul fluctuaiei i
testul nsm&nrii repicative.
84
Testul fluctuaiei .(uria i 4elbruc27
$une n eviden apariia, ntr-o celul de +sc*eric*ia coli
sensibil la bacteriofag, mutantele rezistente la virusul respectiv.
$entru aceasta, se inoculeaz bacilul coli ntr-un mediu de cultur,
ntr-o diluie calculat astfel ca s a'ung la )333 celuleIml mediu,
dup care aceasta se repartizeaz:
- ntr-o eprubet, )3ml din acest mediu
- n alte )6 eprubete mici, c&te 3,-ml mediu
5up )2 ore de incubare, se nsm&neaz pe plci $etri cu
geloz, care conin bacteriofag, astfel:
- din eprubeta cu )3 ml mediu, se nsm&neaz )6 plci
cu geloz cu bacteriofag
- din fiecare eprubet mic, se nsm&neaz c&te o plac
ce conine geloz cu bacteriofag.
Apariia variantelor rezistente la bacteriofag, se evideniaz
n raport cu dou posibiliti:
- rezistena poate aprea n urma adaptrii la bacteriofag
%considerat ca factor de mediu(, i n acest caz, n cele 6* de
plci $etri, numrul coloniilor va fi egal sau variaz n limite
restr&nse
- rezistena la bacteriofag poate aprea prin mutaie
%independent de factorul de mediu(, i atunci pe plcile
nsm&nate din cultura unic %de )3 ml(, se va dezvolta un
numr egal de colonii rezistente %clonele mutante fiind
repartizate egal n mediul lichid(. $e plcile nsm&nate din
cele )6 eprubete mici, numrul de colonii va fi variat,
deoarece mutantele rezistente se dezvolt diferit n fiecare
eprubet. ;n acest caz, n unele eprubete nu apare nici o
clon mutant, iar n altele, mutantele rezistente aprute sunt
n numr variabil.

Testul nsm5nrii repicative .(ederber#0
Cu a'utorul unei tampile din lemn, acoperit cu material din
catifea %ale crei fire 'oac rol de anse de nsm&nare(, aplicat
pe suprafaa unei plci $etri pe care s-au dezvoltat colonii izolate,
85
se transpune cultura din aceast plac pe un mediu proaspt.
=iecare colonie va fi astfel transpus pe mediul nou i se va obine
o dezvoltare n copie a culturii de pornire.
Cu aceast tehnic, se nsm&neaz un numr de plci
$etri %cu geloz simpl(, cu o cultur de +. coli sensibil, de
e!emplu, la streptomicin, i apoi se fac nsm&nrile repicative
pe plci cu geloz n care s-a nglobat streptomicin. $e multe
copii nu se va dezvolta nici o colonie. 5ac pe una dintre plci se
va dezvolta chiar i o singur colonie rezistent, aceasta
nsm&nat pe un mediu fr antibiotic i repet&nd nsm&narea
repicativ, se obine o cultur pur de +. coli rezistent la
streptomicin %demonstr&nd rolul selectiv al factorului de mediu
streptomicina(.

1.*.8.,. Tr!#(0er'l &e rei(te#3% l! !#ti:i4ti$e "ri#
"l!(-i&e R
$rincipalele mecanisme de transfer genetic i recombinare
sunt: transformarea, transducia i con'ugarea, aceasta din urm
put&nd fi mediat de urmtoarele plasmide:
- plasmida sau factorul = # de fertilitate
- unele plasmide 9 # de rezisten la antibiotice
- unele plasmide sau factori colicinogeni %Col(.
$lasmidele 9 au importan medical deosebit, av&nd
capacitatea de a transfera rezistena n bloc la mai multe
antibiotice. Acest transfer de la o tulpin bacterian donatoare la
alta receptoare, prin mecanismul principal de c&tigare a
rezistenei, este nepenit la bacteriile ?ram negative.
:tiliz&nd o tulpin test cunoscut, receptoare de plasmide
9, care are marNeri de rezisten cromozomial, se poate urmri
rezistena la antibiotice a unei bacterii izolate de la bolnav, datorate
unei plasmide 9 con'ugate.
$entru efectuarea transferului prin con'ugare, se utilizeaz:
- 4ulina donatoare - # S*igella # izolat de la bolnav, care
este rezistent la sulfamid, streptomicin i
cloramfenicol
- 4ulina recetoare ) # +. coli # care are marNerul de
rezisten cromozomial la acid nalidi!ic, dar este
86
sensibil la alte antibiotice.
5in fiecare tulpin, se face o inoculare cu ansa a c&te - ml,
n bulion nutritiv special, i ambele culturi se incubeaz )2-63 ore
la .0RC, dup care se va rensm&na n bulion, obin&ndu-se
culturi tinere pentru produsul de con'ugare. 5up aducerea
ambelor culturi la o densitate bacterian bine determinat, se
amestec o parte din tulpina donatoare %A(, cu patru pri din
tulpina receptoare %,(. +e incubeaz amestecul de con'ugare la
.0RC timp de * ore, dup care se nsm&neaz c&te 3,)ml pe
urmtoarele medii de selecie:
- geloz simpl, n care s-a inclus: sulfamid, streptomicin i
cloramfenicol
- geloz simpl, n care s-a introdus acid nalidi!ic
- geloz simpl cu sulfamid, streptomicin, cloramfenicol i acid
nalidi!ic.
5up incubare la .0RC, 6* de ore, se remarc dezvoltarea
tulpinii donatoare A, numai pe mediul cu primele trei antibiotice, a
tulpinii receptoare ,, numai pe mediul cu acid nalidi!ic i a
transcon'ugaiilor pe toate trei mediile. <!plicaia fenomenului este
posibil prin transferul plasmidelor 9 de la tulpina donatoare la cea
receptoare, demonstr&nd posibilitatea transmiterii plasmidelor 9
ntr-o populaie bacterian, i permi&nd nelegerea modului de
c&tigare a rezistenei la antibiotice a unor bacterii.
87
1.>. REACII ANTIGEN DANTICORP
UTILE DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC
9eaciile antigen-anticorp practicabile n scop de diagnostic
etiologic se e!ecut cu produsele biologice %seruri i antigene(
standardizabile, n dou situaii:
- pentru identificarea unui agent bacterian izolat din
produsele patologice cu aFutorul serurilor imune standard %seruri de
animale imunizate cu antigene purificate, cunoscute(
- pentru evidenierea anticorpilor specifici n serul bolnavilor
cu aFutorul antigenelor standardizate %diagnostic serologic(.
-ntigen nseamn orice substan sau particul, vie sau
inert, pe care organismul o recunoate ca nefiind a lui proprie -
nonself - i care odat recunoscut conduce la un rspuns imun,
cu formare de anticorpi specifici.
5in punct de vedere tehnic -in "itro- serurile i antigenele de
diagnostic se utilizeaz n cadrul mai multor sisteme antigen-
anticorp i anume:
- reacii de aglutinare - n care antigenul este particulat %de
tip corpuscular(
- reacii de reciitare - cu antigen solubil ce reacioneaz
cu anticorpul, form&nd un precipitat vizibil
- reacii de fi0are a comlementului de ctre comple!ul
antigen-anticorp, fi!are pus n eviden cu un al doilea
sistem antigen-anticorp, cunoscut %format din hematii i
anticorpi antihematie(
- reacii de imunofluorescen %direct sau indirect( n care
antigenul formeaz comple!ul cu un anticorp marcat cu o
substan fluorescent, reacie vizibil la microscopul cu
fluorescen
- reacii de neutralizare %in vitro sau in vivo( bazate pe
neutralizarea de ctre anticorp a unei proprieti
%infectante, to!ice,...( a antigenului %e!.: neutralizarea
to!inelor(
- intradermoreacii %in vivo( # A.5.9.
88
1.>.1. Re!$3ii &e !)l'ti#!re
1.>.1.1. Re!$3i! &e !)l'ti#!re =# i&e#ti0i$!re! !)e#t'l'i
"!t4)e#
Aglutinarea bacterian este o reacie antigen-anticorp %Ag-
Ac( de agregare n care antigenul este reprezentat de celule
bacteriene %antigen particulat(. +ub aciunea anticorpilor din
serurile standard %seruri aglutinante( apar agregate bacteriene
vizibile macroscopic, n urma formrii comple!elor Ag-Ac. 9eacia
de aglutinare direct - macroscopic - se poate efectua pe lam
sauIi n tuburi.
A#lutinarea pe lam
$entru aceast metod serurile de diagnostic se dilueaz cu
soluie salin fiziologic conform indicaiei de pe etichet %obinuit
la diluie de )I)3(.
4e*nica. $e o lam de sticl degresat, se depune c&te o
pictur din serurile aglutinante i, n imediata apropiere, o
cantitate mic din cultura de cercetat. +e omogenizeaz, treptat,
p&n c&nd ntreaga cultur este suspendat n serul aglutinant.
+e consider aglutinare pozitiv atunci c&nd apar agregate
vizibile %dup un timp de )-* minute(. $entru comparaie, se poate
folosi o suspensie din aceeai cultur n ser fiziologic %fr ser
aglutinant( %fig..2(.
89
Fi).1. D Te(t'l !)l'ti#%rii "e l!-%F =# (t@#)!? te(t'l "4iti6
5('("e#(i! :!$teri!#% ! 04(t !)l'ti#!t% &e $%tre !#ti$4r"ii
("e$i0i$i &i# (er'l (t!#&!r&7E =# &re!"t!? te(t'l #e)!ti6
5('("e#(i! :!$teri!#% #' ! 04(t !)l'ti#!t%? te(t -!rt4r7.
90
A#lutinarea n tuburi
+e practic atunci c&nd este necesar o confirmare a unei
aglutinri pozitive pe lam sau n cazul c&nd aglutinarea pe lam
este incert.
+chema reaciei de aglutinare n tuburi
E"r':et! #r. 1 , 1 8 * >
+oluie salin
fiziologic %ml.( 3,- 3,- 3,- 3,- 3,- 3,-
+er standard diluat
)I)3 %ml.( 3,- 3,- 3,- 3,- 3,- 3,-
Antigen %suspensie
bact.(%ml( 3,- 3,- 3,- 3,- 3,- 3,-
5iluiile finale )I*3 )I2
3
)I)/
3
)I.63 )I/*
3
martor
$ractic, reacia se efectueaz de obicei n / tuburi %conform
schemei(, n care se realizeaz diluii cresc3nde din serul standard
la care se adaug aceeai cantitate de antigen # 3,- ml dintr-o
suspensie omogen de cultur bacterian de 233 milioane
germeni Iml.
;n fiecare eprubet se pune cu pipeta gradat o cantitate de
3,- ml soluie salin fiziologic. Apoi, n prima eprubet se adaug
3,- ml ser standard diluat )I)3 %c&nd reacia se folosete pentru
dozarea anticorpilor n s&ngele bolnavilor - diagnostic indirect -
atunci se adaug ser de bolnav n aceeai diluie(. +e
omogenizeaz, prin aspirare-respingere, cu pipeta, dup care se
trec 3,- ml din prima eprubet %- inclusiv( # din care se arunc 3,-
ml %eprubeta nr./ nu conine anticorp martor(. ;n toate cele /
eprubete se adaug 3,- ml antigen %suspensie bacterian(. +e
incubeaz la .0 C, timp necesar %variabil dup tipul de bacterie -
de antigen( formrii comple!elor Ag-Ac:
91
- pentru antigene D7E sistemul se incubeaz timp de 63 de
ore
- pentru antigene DJE # *-- ore la .0 C
- pentru antigene de suprafa B
i
, > # 6 ore sau peste
noapte.
!itirea reaciei se face apreciind caracterul aglutinrii
%floconar sau granular(. Gimita de aglutinabilitate a tulpinii
bacteriene supus identificrii reprezint diluia de ser standard la
care se mai poate observa o aglutinare vizibil cu ochiul liber,
not&ndu-se aceast diluie, care reprezint titrul reaciei. %e!.
)I)/3( %fig. .8(.
;n aglutinarea bacterian, dup natura i localizarea
antigenului care particip la reacie, se distinge:
- aglutinarea E>G sau somatic este dat de antigenul
care intr n constituia peretelui celular al unor bacterii fiind n
general identic cu endoto!ina i av&nd natura glucido-liido-
olietidic% termostabil% apr&nd sub forma unor grun'i fini
- aglutinarea E.G sau flagelar dat de antigenul DJE ,
prezent la bacteriile mobile, antigen de natur roteic% termolabil,
apare sub forma unor flocoane care formeaz un sediment
abundent, la!, care dispare la agitare energic.
9eacia de aglutinare se utilizeaz n identificarea diferitelor
genuri% secii i tiuri de bacterii.
Fi). 1B D Re!$3i! &e !)l'ti#!re =# t':'riF "4iti6% "@#% l!
1G1>/5l! 1G8/ "r4"4r3i! &i#tre A) 2i A$ e(te 4"ti-%7.
92
1.>.,.1. Re!$3i! &e !)l'ti#!re =# &i!)#4(ti$'l (er4l4)i$
<videnierea anticorpilor serici i a strii de sensibilizare se
poate face cu a'utorul unor antigene purificate, cunoscute sub
denumirea de antigene pentru diagnosticul serologic al infeciilor
bacteriene. 5eci, diagnosticul serologic este orientat spre
decelarea anticorpilor n serul bolnavilor cu a'utorul unor antigene
cunoscute, care pot fi de tip aglutinant, hemaglutinant, fi!atori de
complement i neutralizani.
Re!$3i! &e !)l'ti#!re "e#tr' e6i&e#3iere! !)l'ti#i#el4r
(eri$e %anticorpi serici aglutinani(, ca mi'loc de diagnostic, se
practic la noi n ar pentru urmtoarele infecii bacteriene: febr
tifoid i aratifoid # reacia IidalJ bruceloz # reacia Irig*t i
reacia .uddlesonJ tifos e0antematic # reacia Ieil-Feli0J tularemia
i ,ersinioza # prin tehnica standard.
4e*nica general ?standard( const n: diluarea serului de
bolnav cu soluie fiziologic tamponat pJ 0 adugare de antigen
standard %diluat dup
indicaiile productorului( n cantitate fi! incubare variabil n
funcie de antigen i citirea reaciei prin notarea caracterului
aglutinatelor %7 - granular, J - floconar(.
4itrul reaciei este dat de ultima diluie a serului, n care se
constat o aglutinare vizibil cu ochiul liber.
5e reinut c tehnicile pentru febrele tifoparatifoide i cea
pentru bruceloz sunt adaptate diagnosticului acestor afeciuni.
*eacia de +ema#lutinare pasiv .pe suport0
Acest tip de reacie este standardizat pentru diagnosticul
tifosului e!antematic al crui agent etiologic este $icDettsia
roBazeDi.
9eacia de aglutinare pasiv sau aglutinare pe suport se
utilizeaz atunci c&nd antigenul este o soluie, iar n urma fi!rii pe
un suport particulat %late!, polistiren, hematii etc.( devine
aglutinabil. ;n cazul hemaglutinrii pasive amintite antigenul este
93
un e!tract din culturi to!igene %o to!in de $. roBazeDi cultivat n
oul embrionat de gin(, cu care sunt sensibilizate hematiile de
berbec.
;n diagnosticul poliartritei reumatoide, reacia de
hemaglutinare pasiv Waaler-9ose este util, alturi de reacia
late! %reacia de aglutinare pe particule de late! ca suport(, fiind
deosebit de sensibil. $rincipiul acestui test const n capacitatea
pe care o au eritrocitele de berbec sensibilizate cu anticorpi
antihematii de berbec %hemolizin( de a fi aglutinate de seruri care
conin factor reumatoid %imunoglobuline-anticorpi ce apar fa de
imunoglobulinele proprii(.
1.>.,. Re!$3ii &e "re$i"it!re
+unt reacii n care antigenul este reprezentat de
macromolecule n soluie coloidal. $unerea n contact a
antigenului solubil cu anticorpul corespunztor duce la formarea
unor comple!e antigen-anticorp %Ag-Ac( care precipit. Xin&nd cont
de faptul c n reacia de precipitare antigenul, ca soluie coloidal,
poate fi bine caracterizat chimic %polizaharizi bacterieni purificai,
proteine bacteriene etc.(, aceasta confer reaciei un mare grad de
specificitate i sensibilitate.
;n principiu, n reaciile de precipitare antigenul este o
macromolecul solubil, iar mediul de reacie cu seruri imune de
referin poate fi lichid sau sub form de gel.
1.>.,.1. Re!$3i! &e "re$i"it!re i#el!r%
Antigenul i serul imun sunt puse n contact n tuburi
cailare, n aa fel nc&t cele dou componente s nu se
amestece, iar la locul de contact s se poat forma un inel de
precipitare, dup )--63 de minute.
9eacia este foarte sensibil put&nd evidenia cantiti mici
de antigen i se utilizeaz n:
- industria alimentar pentru a diferenia originea crnii sau
a preparatelor din carne
- medicina legal pentru a identifica originea petelor de
s&nge %specia de la care provin(
94
- diagnosticul bolilor infecioase prin identificare unor
antigene, cum sunt cele bacteriene de grup sau tip.
*eacia Ascoli utilizat n diagnosticul retrospectiv al
infeciilor crbunoase la animalele moarte. 5in organele animalului
suspectat de moarte prin infecie crbunoas se prepar antigenul,
deoarece bacilul crbunos conine o fraciune antigenic
termostabil care are proprietatea de a rezista timp ndelungat
chiar n materialele intrate n putrefacie. Antigenul obinut prin
fierbere este folosit n reacie: ntr-un tub capilar se introduce, cu o
pipet $asteur, 3,-ml ser ce conine anticorpi antibacil crbunos.
+e prelinge apoi pe peretele eprubetei aceeai cantitate de antigen
Ascoli, aa nc&t s nu se amestece, ci s se produc o interfa
de contact. ;n cazul unei reacii pozitive, dup --)3 minute, la limita
de separare dintre cele dou lichide, apare un inel opalescent, de
precipitare.
*eacia 1incent"%ellot care se folosete n diagnosticul meningitei cerebro-
spinale epidemice. G.C.9.-ul recoltat de la bolnav constituie
antigenul %conine fraciuni antigenice provenite din liza
meningococului( care este pus n contact cu serul
antimeningococic. 9eacia pozitiv apare sub forma inelului de
precipitare la interfaa dintre cele dou lichide. "etoda este
nlocuit n prezent n mare msur cu contraimunoelectroforeza.
*eaciile pentru identificarea de #rup a streptococilor6
$entru identificarea de grup a streptococilor A, C, 5 i ? prin reacii
de precipitare se procedeaz la precipitarea e!tractelor ce conin
substana hidrocarbonat DCE, dup metoda Gancefield specific de
grup. Carbohidratul se pune n contact cu seruri standard %anti-A,
,, C, 5 etc.( preparate pe iepure. +erul cu care se obine o reacie
pozitiv indic grupul antigenic la care aparine tulpina izolat.
Evidenierea proteinei "reactive .P*0 n tub capilar6
"etoda n tub capilar pentru evidenierea proteinei C-reactive se
efectueaz n tuburi cu diametrul de 3,0 mm i o lungime de 03-83
mm, n care se antreneaz prin capilaritate ser antiprotein C-
95
reactiv p&n la nlimea de apro!imativ 6- mm i apoi un volum
egal de ser de cercetat. $rin nclinare lent se amestec coninutul
dup care tubul se introduce vertical ntr-un bloc de plastilin lipit
pe lame de microscop. ;n mod similar se monteaz un tub ce
conine martorul pozitiv %ser de referin furnizat de Anstitutul
DCantacuzinoE mpreun cu antiserul(.
9ezultatele se citesc dup 6* de ore de meninere la
temperatura laboratorului. =ormarea unui precipitat ce se depune
n partea inferioar a coloanei de lichid indic prezena $C9,
nlimea precipitatului not&ndu-se dup caz cu U, UU, UUU.
$entru determinri semicantitative se indic compararea
nlimii precipitatului obinut la prob cu cea a precipitatului produs
de serul de referin $C9 cu o concentraie cunoscut.
$entru determinarea cantitativ a proteinei C-reactive sunt
utile imunoplci ce conin ser monospecific antiprotein C nglobat
n gel de agar %vezi metoda "ancini(.
1.>.,.,. Re!$3i! &e 0l4$'l!re
<ste o reacie de precipitare care apare, prin amestecul cu
seruri imune, sub form de flocoane. Aceasta se utilizeaz n
principal pentru titrarea to!inelor i a serurilor antito!ice pornindu-
se de la observaia c flocularea apare prima dat n eprubeta n
care e!ist proporie optim de antigen i anticorp. ;n felul acesta,
cunosc&nd titrul serului se determin valoarea antigenic a to!inei
i invers.
+ lum ca e!emplu titrarea valorii antigenice a to!inei
difterice, care se face dup schema de mai 'os.
E"r':et! #r. ) 6 . *
-
+er antidifteric )33 :.A.%ml( 3,) 3,6 3,. 3,*
3,-
+oluie salin fiziologic 3,8 3,2 3,0
3,/ 3,-
1o!in de titrat %ml( ) ) ) )
)
96
:niti antito!ice )3 63 .3 *3
-3

<prubetele se pun n baie la -6 C i se urmrete %la
interval de - minute( n care eprubet apare prima dat flocularea.
5ac reacia apare iniial n tubul . care conine 3,. ml ser
antito!ic, deci .3 uniti antito!ice, to!ina de cercetat va conine .3
de uniti antigenice. Ga fel se poate titra i o anato!in,
cunosc&nd valoarea to!inei.
:n alt tip de reacie de floculare este cel aplicat n testul
B59G %Beneral 5iseases 9esearch GaboratorO( pentru diagnosticul
sifilisului ca test de tria'.
$rincipiul reaciei B59G const n utilizarea unui antigen
cardiolipin furnizat de Anstitutul Cantacuzino pentru a pune n
eviden anticorpii antilipoidici din serul sangvin al bolnavilor de
sifilis, testul put&nd fi calitativ sau cantitativ i are ca rezultat
apariia unor grun'i ce pot fi observai cu ochiul liber pe fond negru,
sau cu lupa, cu mrirea de )33 !. ;n funcie de mrimea
flocoanelor reacia se noteaz cu: U, UU, UUU sau UUUU.
1.>.,.1. Re!$3ii &e "re$i"it!re =# )el
9eaciile de precipitare n gel de agarIagaroz sau
imunoprecipitrile n gel au intrat n domeniul e!plorrii
imunochimice ca metode calitative i cantitative de determinare a
proteinelor care particip la o reacie imunologic i la diagnosticul
indirect n unele boli infecioase.
$rincipalele tehnici n gel de agar sau de agaroz, folosite n
laboratorul clinic %fig. *3( sunt utile pentru:
- determinarea cantitativ a fraciunilor proteice %Ag?, AgA,
Ag", fraciunea C. a complementului, -macroglobulina, transferina
etc.(
- decelarea de fraciuni proteice %componenta ", proteina C-
reactiv, -fetoproteina etc.(
- decelarea de antigene solubile i de anticorpi n diverse
infecii %e!. antigenul hepatitei ,(.
-garul iKsau agaroza n care se desfoar reaciile de
acest tip sunt preparate n amestecuri de substane tamponate la
97
pJ 0,6 n concentraii variabile, dup scopul urmrit.
Antiserurile folosite n tehnicile respective sunt seruri imune
antiprotein uman care conin anticorpi fa de alte fraciuni
proteice. Aceste antiseruri sunt livrate la noi n ar de Anstitutul
DCantacuzinoE n stare liofilizat ca:
- antiser antiprotein uman %ser polivalent(
- antiseruri monospecifice %Ag?, AgA, Ag", transferin,
fibrinogen, protein C-reactiv, -fetoprotein etc.(.
Serul de cercetat - ser de bolnav - n care se caut anticorpii
ca i lichidele biologice %GC9, lichid pleural, lichid de ascit( este
necesar s fie proaspt, mai rar n stare conservat.
98
Fi). 8/ D Pri#$i"!lele te9#i$i =# )el &e !)!r (!' !)!r4% 2i
-et4&ele &e 2t!#3!re.
$munodifuzia radial 7ancini
"etoda imunodifuziei radiale %9A5(, imaginat de "ancini,
Carbonara i Jeremans n )8/-, urmrete n principiu
determinarea cantitativ a diverselor fraciuni proteice cu a'utorul
antiserurilor monospecifice nglobate ntr-un strat de gel de agar, n
care se practic godeuri de dimensiuni mici pentru introducerea n
acestea a serurilor de studiat.
9eacia pozitiv apare ca un inel de precipitare n 'urul
godeului, acest inel av&nd un diametru proporional cu concentraia
fraciunilor proteice din serul de cercetat %fig. *)(. Amunodifuzia
radial "ancini permite deci determinarea cantitati" a
imunoglobulinelor i a unor proteine patologice.
99
Fi).81 D Deter-i#!re! i-'#4)l4:'li#ei G 5I)G7 =# -!i -'lte (er'ri
(!#)6i#e.
A#ti$4r"ii !#ti<I)G !' 04(t =#$4r"4r!3i =# )el'l &e !)!r? i!r =# )4&e'ri
(<!' "l!(!t (er'rile &e $er$et!t. D'"% -i)r!re! (er'ril4r =# !)!r (e
-%(4!r% &i!-etr'l i#elel4r &e "re$i"it!re 2i (e &eter-i#%
$4#$e#tr!3i! I)G "e :!!
&i!)r!-ei.
5ozarea imunoglobulinelor: Ag?, AgA, Ag" constituie
imunograma, pentru care se fac calcule pe baza unor curbe de
referin, comparativ cu valorile din seruri martor %seruri normale(,
n imunoplci livrate laboratoarelor de Anstitutul DCantacuzinoE.
<!primarea rezultatelor, bazate pe msurarea diametrului
fiecrui inel de precipitare cu un ablon i calculul concentraiei
fraciunilor cercetate se face cu a'utorul curbei de referin, iar
e!primarea se face n mgI)33ml - dac se folosete ca martor ser
standard ,ehring - i n uniti internaionale %:.A.(, dac se
folosete serul standard preparat de Anstitutul DCantacuzinoE.
Alte dozri prin metoda "ancini sunt cele care msoar
concentraia pentru C., principala component a sistemului
complement i, prin analogie, orice fraciune proteic pentru care
dispunem de ser imun monospecific.
4ubla difuziune ./uc+terlon,0
5ac ntr-un gel de agar sau agaroz turnat pe o lam, se
100
taie dou godeuri alturate i n unul se pune un antigen solubil, iar
n cellalt antiser omonim, proteinele difuzeaz una ctre cealalt
i precipit la locul de nt&lnire sub forma unei linii albicioase %fig.
*6(.
Fi). 8,. D':l! &i0'ie =# )el &e !)!r "e#tr' te(t!re! )r'"el4r
(tre"t4$4$'l'i H<9e-4liti$. # )4&e'l &i# -iIl4$ (! i#tr4&'( '#
e;tr!$t "r4tei$ &i# :!$terie? i!r =# $ele "eri0eri$e !#ti(er'ri
"e#tr' )r'"ele A?B?C?D 2i G. Li#i! &e "re$i"it!re ! !"%r't =#
&re"t'l )4&e'l'i $' !#ti(er !#ti<A.
9eactanii se pot introduce n orificii rotunde sau
dreptunghiulare la o distan corespunztoare, liniile de precipitare
form&ndu-se la unghiuri i la distane constante pentru fiecare
sistem Ag-Ac.
Ga sistemul 7uchterlonO cu orificiile aezate la )23 n
rozet cu *-/ godeuri periferice n 'urul unui godeu central, se
descriu patru tipuri de reacie %fig.*.(: reacia de identitate
complet %A( reacia de neidentitate %AA( reacia de identitate
parial a liniilor %AAA( i reacia de interferen cu inhibiie fr
devierea fuziunii %AB(.
"etoda este utilizat i pentru decelarea produilor de
degradare a fibrinogenului i a altor proteine patologice care apar
101
n diferite infecii: proteina C-reactiv, -fetoproteina, precum este
util pentru decelarea de antigene bacteriene, virale etc., solubile
%e!emplu antigenul J,s(.
Fig. LM- Dubla difuziune >utc*terlon,. 4iuri de reacie
5!?!
1
?: D !#ti)e#eE A? A
1
? B < !#ti$4r"i7
4ifuzia n c5mp electric8 imunoelectroforeza si
contraimunoelectroforeza
+lectroforeza este o metod prin care proteinele serice
migreaz n c&mp electric datorit ncrcturii electrice a fiecrui
tip de protein din serul sangvin i astfel se pot separa cel puin
cinci tipuri de proteine dintr-un ser uman normal %fig. **(: albumine,
)-globuline, 6-globuline, -globuline i -globuline. Aceast
tehnic ofer date importante referitoare la raportul proteinelor din
s&ngele uman %n primul r&nd cel dintre albumine i globuline(,
precum i modificrile acestor proteine n diferite afeciuni.
102
Fi). 88. Ele$tr404re! "r4tei#el4r (eri$e =#tr<'# (er '-!#
#4r-!l
/munoelectroforeza %fig.*-( permite vizualizarea, n arcuri de
precipitare, a unui mare numr de fraciuni proteice din s&nge i
alte lichide biologice. "etoda combin electroforeza cu
precipitarea n gel de agar, folosind antiser total antiproteine
umane sau antiseruri pentru fraciuni proteice %antiseruri
monospecifice(. <ste o metod ce ofer informaii pentru
diagnostic, folosindu-se n special n studiul araroteinemiilor, a
agammaglobulinemiilor totale sau pariale, mai mult ca un
procedeu ilustrator al datelor obinute prin electroforeza n gel de
agar i prin metoda "ancini.
103
Fi). 8*< I-'#4ele$tr404re!. Te9#i$! 2!#3'l'i ($'rt!t.
Amunoelectroforeza permite:
- separarea i determinarea numrului de constitueni
dintr-un amestec de antigene
- definirea antigenelor pe baza mobilitii electroforetice i
a proprietilor specifice
- izolarea din gel a antigenului urmrit pentru a realiza o
analiz imunochimic mai amnunit.
!ontraimunoelectroforeza %fig.*/( poate fi folosit pentru
determinarea de proteine %antigene( a cror migrare n c&mpul
electric se face spre anod %e!. antigenul J,s, -fetoproteina(. Ga
nt&lnirea antigenului cu anticorpul corespunztor care se
deplaseaz prin electroendosmoz ctre catod - se produce n gel
o linie de precipitare.
104
Fi). 8> D C4#tr!i-'#4ele$tr404re!. P
1
D P
>
J "r4:ele &e (er
e;!-i#!te.
K J -!rt4r "4iti6
;n comparaie cu metoda 7uchterlonO,
contraimunoelectroforeza este mai rapid, av&nd sensibilitatea
mare, fr a avea ns o strict specificitate. <ste utilizat n
serologia bolilor transmisibile deoarece evideniaz unele antigene
bacteriene sau virale. 7 astfel de aplicare este util n laboratorul
clinic pentru detectarea antigenelor virusului hepatitei , i se
bazeaz pe faptul c antigenul J,s # antigen de suprafa al
virusului hepatitei , numit i antigen Australia, apare n serul
bolnavilor cronici cu hepatit ,.
Alte indicaii ale metodei, pe l&ng cele artate mai sus, se
refer la identificarea unor proteine serice patologice i a
antigenelor bacteriene: meningococice, pneumococice,
streptococice etc.
Electroimunodifuzia .E$40
Amaginat de Gaurell %)8/-(, are o sensibilitate mai mare
dec&t imunodifuzia radial simpl fapt pentru care este utilizat
pentru determinarea cantitativ a concentraiilor mici de protein
%e!. din lichidul cefalorahidian, lichide pleurale, secreii etc.(.
105
Fi) . 8+ D Ele$tr4i-'#4&i0'i!. G4&e'rile 1? , 2i 1 $4#3i# &il'3ii !le
!#ti)e#'l'i (t!#&!r&? i!r )4&e'rile 8? *? > 2i + $4#3i# "r4:ele.
Princiiul. <lectroforeza antigenului %probelor( ntr-un strat
de gel ce conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici
determin formarea unor conuri de precipitare, a cror nlime
%sau arie( este direct proporional cu concentraia antigenului %fig.
*0(. $lcile pot fi citite ca atare la o surs luminoas i, de
preferin, prin colorarea lor, msur&ndu-se nlimea conurilor.
Concentraia proteinelor se apreciaz pe o curb de referin
realizat cu . diluii ale unui antigen cu coninut proteic cunoscut.
1.>.1. Re!$3ii !#ti)e#<!#ti$4r" $' "!rti$i"!re!
$4-"le-e#t'l'i
!omlementul %C ( sau Esistemul comlementE sau ale0ina
este un comple! de )) factori prezeni n orice ser normal.
Complementul - C - reprezint principalul sistem de amplificare a
reaciilor imune prin fi!area pe comple!e antigen-anticorp i, ca
urmare, activarea Dn lanE a tuturor celorlalte componente C)-C8(.
5intre multiplele roluri ale sistemului complement,
activitatea bacteriolitic, efectul bactericid al acestuia i
proprietatea de a se fi!a pe comple!ul antigen-anticorp %n reacia
de fi!are a complementului( sunt proprieti utile n diagnostic.
1.>.1.1. Re!$3i! &e :!$teri4li% 2i e0e$t'l :!$teri$i& !l
$4-"le-e#t'l'i
106
)acterioliza se traduce printr-o serie de modificri ale celulei
bacteriene sub aciunea anticorpului specific i a complementului,
care n final duc la liza celulei. $rima observaie de acest fel a fost
fcut asupra vibrionului holeric, fenomenul fiind denumit "ibrioliz
# fenomenul lui $feiffer. <fectul de bacterioliz poate fi demonstrat
in "i"o # prin inoculare la cobai imunizai antiholeric, comparativ cu
efectul asupra animalelor neimunizate # i in "itro, prin punerea n
contact a unei suspensii de vibrioni cu ser imun proaspt recoltat
%n care se gsesc anticorpi specifici, iar complementul este activ(.
/n "itro amestecul de bacterii cu serul imun se menine la
.0 C i la intervale de )3-)- minute se fac preparate native, n
care se pot urmri la microscop fazele succesive de: imobilizare,
aglutinare, granulare %bacteriile se rotun'esc( i liz.
,ordet a artat c dac serul imun este nclzit .3 de
minute la -/ C %c&nd se inactiveaz complementul( reacia se
oprete la stadiul de aglutinare %datorit aciunii anticorpilor(. 5ac
apoi se adaug ser proaspt de cobai %care conine complement
activ( se a'unge la liza vibrionilor.
=enomenul de bacterioliz se poate demonstra i pentru ali
bacili ?ram-negativi: bacilul dizenteric, bacilul piocianic etc., n
interpretarea acestuia fiind necesar s se in seama de activarea
i participarea tuturor componentelor complementului.
+fectul bactericid al comlementului poate fi demonstrat
asupra unor bacterii la care particip complementul activat i pe
cale alternativ n aciune combinat cu lizozimul asupra peretelui
celular bacterian. An vitro, aciunea bactericid a complementului
poate fi urmrit pe o suspensie de +. coli, de e!emplu, din care:
- o parte rm&ne ca suspensie celular netratat
- o alt parte se pune n contact cu anticorpi specifici i
C , incub&ndu-se o or la .0 C.
+e determin apoi, pentru ambele probe, numrul de
bacterii viiIml. ;n acest scop, se prepar din cele dou probe
c&teva diluii, din care se nsm&neaz c&te 3,) ml pe plci $etri
cu geloz. 5up incubare 6* de ore la .0 C, se numr coloniile.
Cunosc&nd c o colonie se dezvolt dintr-o celul bacterian, se
reporteaz numrul de colonii la diluie i la cantitatea
nsm&nat, rezult&nd numrul de colonii, deci numrul de bacterii
107
vii la ml.
1.>.1.,. Fe#4-e#'l &e i-'#49e-4li%
;n prezena anticorpilor antihematie %anticorpi cunoscui i
sub numele de hemolizin( i a complementului hematiile sunt
lizate, n urma formrii comple!ului *ematii-ser anti*ematie, pe
care se fi!eaz C , duc&nd la imunohemoliz. Acest fenomen de
hemoliz imun st la baza determinrii activitii C prezent n
ser sau alte lichide biologice.
;n titrarea activitii hemolitice a C se ia n considerare
diluia cea mai mare de ser ce conine complement, care lizeaz
-3H din hematii n prezena unei cantiti optime de anticorpi
antihematie, not&ndu-se 5J
-3
%doz hemolitic pentru -3H din
hematii(.
5ozarea complementului C i a fraciunii C.

n serul
sanguin este important datorit multiplelor implicaii ale acestui
sistem n rezistena natural a organismului, n imunitate i n
reaciile biologice favorabile sau nefavorabile. Astfel, variaiile C
seric %ca i n alte umori( pot duce la precizri importante n unele
mbolnviri. 5e pild, aceasta scade n lupusul eritematos sistemic,
glomerulonefrita acut, n anemiile hemolitice etc., cresc&nd n
unele infecii i n tumorile maligne %a'ung&nd la valori foarte mari
n cancerul hepatic primitiv(.
7 alt aplicare practic, deosebit de important a
fenomenului de imunohemoliz, este folosirea acestuia ca indicator
al reaciei imune %de formare a comple!ului Ag-Ac(.
1.>.1.1. Re!$3i! &e 0i;!re ! $4-"le-e#t'l'i 5RFC7
<ste o reacie in vitro util pentru identificarea unui antigen
necunoscut cu a'utorul serurilor standard cunoscute, dar mai ales
n scopul testrii anticorpilor din serul sanguin al bolnavilor folosind
antigene standard cunoscute %diagnostic serologic(.
Principiul reaciei
;n reaciile Ag-Ac, complementul se fi!eaz pe comple!ul
imun format, fi!are ce poate fi pus n eviden indirect prin
108
fenomenul de imunohemoliz # utiliz&nd deci un comple! antigen-
anticorp cunoscut, format din hematii i anticorpi antihematie
%specifici(. Astfel, dac n serul unui bolnav se caut anticorpi cu
a'utorul unui antigen cunoscut, n cazul unui rezultat pozitiv CY se
va fi!a pe comple!ul Ag-Ac format, fr a produce modificri
vizibile n tubul de reacie. 5e aceea, pentru evidenierea fi!rii CZ
se adaug n reacie comple!ul imun format din hematii i
hemolizin %ser antihematii( - numit i sistem indicator deoarece,
dac nu s-a format primul comple! %anticorpii lipsind din serul
bolnavului( CZ se va fi!a pe acest comple! i va produce ruperea
hematiilor %imunohemoliza T rezultat negativ(. ;n cazul n care n
serul cercetat e!ist anticorpi fa de antigenul cunoscut introdus
n reacie nu se va produce hemoliza, CZ fiind fi!at pe acest
comple! %9=C T pozitiv(.
Acest principiu este reprezentat n urmtoarea schem:
Si(te-
&e
$er$et!
t
C4-"le-e
#t
Si(te-
i#&i$!t4r
Re'lt!t
Antigen ! ! hematii Gipsa hemolizei
!
Anticorp ! ! hemolizin

9=C T pozitiv
Antigen ! hematii imunohemoliz
!
Anticorp ! hemolizin

9=C Tnegativ
9=C poate fi lucrat n tuburi sau pe plci de material plastic
cu godeuri. <!ist mai multe tehnici pentru efectuarea reaciei de
fi!are a complementului, din care se desprind dou metode mai
importante: metoda clasic Wassemann, practicat n diagnosticul
sifilisului, brucelozei, tusei convulsive etc. i metoda ,engston care
109
titreaz anticorpii fi!atori de complement pentru diagnosticul
tifosului e!antematic, ricNettsiozelor, al ornitozei i al leptospirozei
pe l&ng diagnosticul serologic al unor viroze(.
*eacia %ordet 9 :assermann
+e lucreaz n trei eprubete, cu dou cantiti diferite de ser
de bolnav.
Sc+ema
<prubeta ) 6
. %martor(
-ser de bolnav %ml( 3,) 3,6 3,6
-antigen ,-W %ml( 3,. 3,. --
-complement %ml( 3,. 3,. 3,.
-soluie sal.fiziol. %ml( 3,2 3,0 )
Ancubare *- de minute la
.04C
-sistem indicator
%hemolitic( %ml( ),3 ),3
),3
Ancubare .3 min. la .04 C
Citirea se face urmrind apariia hemolizei %rezultat negativ(
sau lipsa ei %rezultat pozitiv(.
Te+nica $da %en#ston
"etoda ,engston, adoptat n ara noastr pentru
diagnosticul serologic, titreaz anticorpii fi!atori de complement
pentru diagnosticul leptospirozelor, ricNettsiozelor, infeciilor cu
chlamOdii etc.
1ehnica ,engston, n care fiecare din componentele ce intr
n reacie este folosit n volum de 3,6 ml, este aceeai pentru
toate afeciunile amintite diferind doar felul antigenului i modul de
interpretare, de aceea se va descrie doar principiul reaciei pentru
110
diagnosticul serologic al tifosului e0antematic% al crui factor
etiologic l constituie bacterii din grupul $icDettsia.
Serul de cercetat recoltat de la bolnav trebuie s fie steril,
limpede, fr hematii, se va inactiva .3 de minute n baie de ap la
-/
3
C.
-ntigenul ricDettsian se va dilua conform indicaiei de pe
etichet, astfel nc&t diluia de lucru s cuprind * uniti antigenice
n cei 3,6 ml.
.emolizina va fi ntotdeauna titrat pentru fiecare reacie
astfel ca n 3,6 ml din aceast diluie s se afle 6 uniti hemolitice.
Susensia de *ematii de berbec 6H proaspt splate.
-le0ina ?comlementul@ titrat n aceeai zi n prezena
antigenului, este diluat astfel nc&t 3,6 ml s conin 6 uniti
ale!ice.
$entru o prim comparaie se recomand folosirea unui set
martor sigur pozitiv i altul sigur negativ.
$egul. ;n toate cazurile reaciile serologice se efectueaz
pe robe de ser sanguin erec*i. Astfel, de la fiecare bolnav se va
recolta s&nge n primele zile de boal %proba nr. )(, se va separa
serul i se va ine la -634C p&n n ziua prelucrrii, iar dup
apro!imativ )* zile se va recolta a doua prob de s&nge. Cele
dou probe se vor lucra concomitent, urmrindu-se creterea n
dinamic a titrului de anticorpi %put&nd fi utilizate reacii serologice
cu mai multe tipuri de antigene bacteriene sau virale pe probele
perechi de seruri(.
/nterretare: creterea titrului de anticorpi, de cel puin patru
ori, n proba a doua de ser este semnificativ pentru diagnostic.
1itrul reaciei este dat de diluia cea mai mare de ser de bolnav
unde se constat absena total a hemolizei.
Particulariti ale te+nicii *F
;n diagnosticul serologic al febrei N antigenul reprezint o
suspensie purificat de !o0iella burneti, cultivat pe sacul vitelin al
embrionului de gin, suspensie din care se face diluie de lucru
conform indicaiei de pe etichet.
;n diagnosticul serologic al infeciei cu !*lam,dia antigenul
111
este un e!tract purificat obinut dintr-o cultur de ChlamOdia pe
sacul vitelin al oului embrionat.
$entru diagnosticul letosirozei este necesar antigenul
5etosira bifle0a # suspensie concentrat preparat dintr-o
tulpin nepatogen de leptospira.
Te+nica %radstreet i Ta,lor, larg aplicat n ultimul timp
n infeciile virale, infecii cu ',colasma, febra [ etc. # ca metod
standard dup tehnica Qla receE. Aceasta utilizeaz titrarea
complementului n prezena diluiilor de hemolizin Qn tabl de
ahE. 9=C este efectuat n plci sau microplci cu godeuri.
1.>.8. Re!$3i! &e #e'tr!li!re
Acest tip de reacie se bazeaz pe proprietatea anticorpilor
de a anihila %neutraliza( efectele antigenelor to!ice, litice, infectante
prin combinarea Ag-Ac specific, in "itro i in "i"o. Astfel, n
reaciile de neutralizare Ag este reprezentat de to!ine, enzime,
virusuri pe care anticorpii specifici le pot neutraliza. ;n laboratorul
clinic, acest tip de reacii se utilizeaz pentru determinarea
anticorpilor antistreptolizin Q7E %reacia A+G7(, dar i pentru
identificarea infeciilor bacteriene sau virale.
1.>.8.1. Re!$3i! ASLO
<ste o reacie de neutralizare pentru determinarea
antistreptolizinelor Q7E, anticorpi fa de streptolizina Q7E # antigen
de virulen al streptococilor. <ste reacia serologic frecvent
folosit pentru diagnosticul retrospectiv al infeciei streptococice cu
streptococ -hemolitic.
Princiiul reaciei. +erul de cercetat, n diluii succesive, este
tratat cu o cantitate standard de streptolizin Q7E %antigenul( i
dup o scurt incubare, necesar combinrii specifice, se
repartizeaz suspensia de eritrocite ca mi'loc revelator. ;n tuburile
n care diluiile de ser conin o cantitate suficient de
antistreptolizine Q7E %anticorpi(, efectul litic al antigenului va fi
inhibat, ceea ce se traduce prin lipsa hemolizei, iar n diluiile de
112
ser n care anticorpii sunt insuficieni pentru a putea neutraliza
streptolizina, efectul litic al acesteia se observ prin prezena
hemolizei.
$nterpretarea rezultatelor
<!ist o schem de lucru standard n care se obin prin
diluii succesive ale serului i dup adugarea tuturor
componentelor: )33, )6-, )//, 6-3, ..., -33, /6-, 2.., )6-3,
6-33 uniti A+G7Iml.
1itrurile normale de antistreptolizin Q7E ating valori p&n la
)//-6-3 :Iml. 1itrurile peste aceast limit indic, n
antecedentele recente ale pacientului, e!istena unei afeciuni
streptococice sau poststreptococice: scarlatin, angin,
glomerulonefrit, reumatism articular acut. Aceste titruri crescute
pot fi nt&lnite i la purttorii de streptococ -hemolitic la nivel
amigdalian. 1itrul A+G7 crete semnificativ n reumatismul articular
acut %9AA(, a'ung&nd la valori ma!ime ntre sptm&na a .-a i a
/-a de la debutul articular, dar rm&ne crescut timp de /-)6 luni
dup puseul reumatismal. 1itrul A+G7 poate fi la valori normale i
n anginele streptococice dac determinarea s-a fcut mai
devreme de )- zile de la debutul anginei.
1.>.8.,. Te(t!re! (t%rii &e ('($e"ti:ilit!te D i# 6i64
+usceptibilitatea fa de difterie %reacia +chicN( i fa de
scarlatin %reacie 5icN( se testeaz prin urmrirea neutralizrii de
ctre anticorpii specifici din s&ngele bolnavilor %antito!ine( a unei
doze cunoscute din to!ina difteric, respectiv din to!ina eritrogen
streptococic, inoculate intradermic. Aceste reacii vor fi descrise la
capitolele care vor trata diagnosticul n difterie i respectiv n
infeciile streptococice.
1.>.*. Te(te $!re 'tilie!% 6i'!li!re!
$4-"le;el4r
!#ti)e#<!#ti$4r" "ri# !rti0i$ii te9#i$e
113
+ensibilitatea reaciilor antigen-anticorp utilizate n
diagnostic poate fi mrit leg&nd de anticorp, mai rar de antigen,
un marNer uor de identificat, care s nu interfereze cu proprietile
imunologice ale reactanilor. Acest marNer poate fi:
- o substan fluorescent %izotiocianat de fluorescein,
rhodamin etc.(, n tehnica de imunofluorescen
- izotoi radioacti"i %de obicei
)6-
A(, n metoda
radioimunotestrii %9AA(
- o enzim %pero!idaz, fosfataz alcalin(, n testele
imunoenzimatice.
1.>.*.1. I-'#40l'4re($e#3!
$rin cuplarea unei substane fluorescente cu anticorpii se
obin anticorpi fluoresceni care, fi!&ndu-se pe antigenul omolog,
induc comple!e imunofluorescente observabile prin e!aminarea la
microscopul cu fluorescen n lumina ultraviolet %:B(.
9eacia de imunofluorescen %A=( se poate efectua prin
metoda direct sau indirect.
7etoda direct
Anticorpii monospecifici sunt con'ugai cu substana
fluorescent. "aterialul testat pentru prezena antigenului se
etaleaz pe lam, dup care se incubeaz cu anticorpii marcai.
<!cesul de anticorpi se ndeprteaz prin splare, preparatul uscat
fiind apoi e!aminat la microscopul cu fluorescen, unde
comple!ele Ag-Ac formate apar ca zone fluorescente, uor vizibile
%fig. *2(.
114
Fi). 8. D I-'#40l'4re($e#3! &ire$t%
7etoda indirect
<ste frecvent utilizat i comport doi timpi %fig. *8(:
- preparatul care conine antigen se incubeaz cu
anticorpul specific, nemarcat
- vizualizarea comple!ului imun format se face prin
adugarea unui indicator fluorescent, care este serul
antiimunoglobulin %corespunztor anticorpului adugat
n reacie( marcat.
115
Fi). 8B< I-'#40l'4re($e#3! i#&ire$t%
Amunofluorescena indirect are o larg aplicare permi&nd:
- evidenierea antigenelor ntr-un produs, prin aciunea
succesiv a anticorpilor specifici nemarcai, apoi a
serului globulinic marcat
- detectarea anticorpilor ntr-un ser necunoscut, utiliz&nd
antigene cunoscute i ser fluorescent antiglobulinic.
Amunofluorescena se aplic n bacteriologie pentru
identificarea unor germeni patogeni, de e!emplu pentru +. coli
serotipurile enteropatogene, )ordetella ertussis, !*lam,dia
trac*omatis, 4reonema allidum, ca i a unor virusuri implicate n
infecii respiratorii.
$robele care se testeaz prin imunofluorescen sunt de
obicei e!sudate sau raclate de la nivelul unor leziuni cutanate sau
din mucoase, ca i probe bioptice, amprente din esuturi, culturi de
celule infectate, sput, aspirat bronic, secreii genitale etc.
$entru depistarea de anticorpi, metodele imunofluorescente
sunt utile n infecii virale sau n cele bacteriene cu ',colasma
neumoniae% .el,cobacter ,lori% 4reonema allidum etc., dar i
n infeciile parazitare %malarie, tripanosomiaz, to!oplasmoz,
pneumocistoz etc.(.
1.>.*.,. R!&i4i-'#4te(t!re! 5RIA7
Aniial aplicat pentru testri de hormoni i enzime, 9AA s-a
e!tins i n diagnosticul bolilor infecioase, fiind una din cele mai
sensibile i precise metode de detectare i dozare a antigenelor i
116
anticorpilor, prin izotopi radioactivi %
)6-
A,
.
J etc.(.
+e practic fie marcarea unuia din reactani %antigenul sau
anticorpul(, fie marcarea unui ser antiglobulinic care reacioneaz
cu comple!ul imun primar. 9adioactivitatea comple!ului format se
msoar fie n faz lichid, fie n faz solid i este utilizat n
principal pentru detectarea enteroto!inei stafilococice, a to!inei
botulinice, pentru evidenierea polizaharidului capsular la
pneumococi etc.
;n infeciile virale cunoate de asemenea o larg aplicare n:
diagnosticul gripei, infeciilor hepatice i n diagnosticul hepatitelor
cu virus , %AgJ,s, anticorpi anti-J,s(.
+uccint, etapele unei dozri radioimunologice %fig.-3( sunt
urmtoarele:
- peste o cantitate de anticorp de testat, fi!at pe un suport
se adaug o cantitate variabil de antigen
- dup o etap de preincubare %i apoi splare( pentru
formarea comple!elor Ag-Ac, se adaug o cantitate fi!
de anticorp marcat cu radioizoto #
)6-

A.
117
Fi). */ D Pri#$i"i'l -et4&ei =# L0!% &':l%M
;n acest sens, este ilustrat i tehnica radioimunologic
pentru detectarea antigenului de suprafa al hepatitei ,% -g.)s
%fig.-)(, pentru care se folosete principiul DsandSichE, o tehnic n
faz solid pentru msurarea cantitilor de -g.)s din ser sau
plasm.
118
Fi). *1 D Pri#$i"i'l te9#i$ii &e &ete$t!re ! A)HB(
,ile din material plastic, acoperite cu anticorp antiJ,s, sunt
incubate cu eantioane de ser de testat. AgJ,s, dac este
prezent, se fi!eaz pe anticorp. +e adaug anticorp antiJ,s
marcat
)6-
A, i n timpul celei de-a doua incubri, aceasta se fi!eaz
pe AgJ,s, form&nd comple!ul anticorp-antigen-anticorp marcat
radioactiv. 5up splarea bilei, se msoar radioactivitatea, care
este cu at&t mai ridicat, cu c&t cantitatea de AgJ,s este mai
mare.


1.>.*.1. Te(te i-'#4e#i-!ti$e
Princiiul. Antigenul sau anticorpul se cupleaz cu o enzim
care are o mare afinitate, rezult&nd at&t activitatea imunologic c&t
i cea enzimatic.
Comple!ul imun va fi detectat prin aprecierea activitii
enzimatice fa de un substrat specific.

Testul E($SA .enzime"lin2ed"immuno"sorbent"assa,0
+e cunosc diverse tehnici imunoenzimatice, dintre care n
diagnosticul bolilor infecioase se aplic preferenial testul <GA+A
cu diferite variante:
- tehnica direct pentru determinarea antigenelor %fig.-6(
- tehnica dublu sandSich pentru determinarea antigenelor
sau anticorpilor %fig.-.(.
119
Fi). *, D ELISA &ire$t%. AB D !#ti$4r"'l ("e$i0i$ !#ti)e#'l'i &i#
"r4:! &e $er$et!tE A D !#ti)e#'l &e &eter-i#!tE AB<E D $4#I')!t
!#ti$4r" ("e$i0i$ !#ti)e#'l'i A? $' e#i-! 5E7
Fi). *1 D ELISA &':l' L(!#&Ni$9M. AB D !#ti$4r"'l ("e$i0i$
!#ti)e#'l'i &i# "r4:! &e $er$et!tE A D !#ti)e#'l &i# "r4:%E AB
1
D
!#ti$4r" ("e$i0i$ !#ti)e#'l'iE AB
,
<E D $4#I')!t !#tii-'#4)l4:'li#%
AB
1
? $' e#i-! 5E7
+uccesiunea etapelor pentru efectuarea testului <GA+A este:
- alegerea unui suport solid convenabil
120
- imobilizarea antigenului sau anticorpului pe acest suport
- legarea prin reacie imunospecific a anticorpului sau
antigenului din proba de testat pe antigenul i respectiv
anticorpul imobilizat pe suportul solid
- legarea prin reacie specific antigen-anticorp a
reactantului marcat enzimatic, de comple!ul format
anterior, i fi!at pe suport
- adugarea n final, a substratului specific enzimei folosite
drept marNer, produc&ndu-se o reacie de culoare a
enzimei cu substratul, aceasta fiind citit colorimetric.
<GA+A se utilizeaz:
- pentru detectri de antigene bacteriene sau virale, pentru
evidenierea to!inelor: to!ina difteric, to!inele bacteriilor
din speciile <. coli to!igene, to!inele stafilococice
detectarea brucelelor, treponemelor, ricNettsiilor etc.
- pentru detectri de anticorpi antibacterieni %n
salmoneloze, bruceloze, ricNettsioze etc.( sau antivirali
- pentru identificarea i determinarea cantitativ a
anticorpilor antinucleari, antiA5@, comple!elor imune
circulante i urmririi tratamentului n boli cu component
autoimun.
1.+. TESTAREA REZISTENEI NATURALE
ANTIINFECIOASE
Aprarea fa de infecie se realizeaz prin:
- mecanisme nesecifice de rezisten natural ca:
barierele cutanate i mucoase, factorii umorali, tisulari i
celulari, microbiocenozele, febra, fagocitoza i inflamaia
- mecanisme imunitare secifice: umorale %prin anticorpi( i
celulare %prin limfocite, celule citoto!ice i citoNine(.
Aria de investigaii a acestor parametri este tot mai larg,
interes&nd at&t statusul normal, c&t mai ales, definirea strilor
patologice.

121
1.+.1. Te(te &e !"re$iere ! rei(te#3ei
#!t'r!le

1.+.1.1. Deter-i#!re! $!#tit!ti6% ! $4-"le-e#t'l'i (eri$
5ozarea CY se bazeaz pe proprietatea acestuia de a
hemoliza eritrocitele sensibilizate %eritrocite nvelite cu anticorpi
specifici(. ;n laborator, folosim eritrocite de berbec sensibilizate cu
ser hemolitic %ser antieritrocite de berbec(.
"ultiplele implicaii ale sistemului C i ale componentelor
sale n rezistena natural a organismului uman, c&t i n reaciile
biologice favorabile sau nefavorabile, au dus la introducerea unor
tehnici de laborator care s determine valoarea CY total i a C. n
serul sanguin.
Ca punct final al reaciei se ia hemoliza -3H, pentru c
aceasta d o precizie mult mai mare dozrii comple!ului dec&t
hemoliza )33H.
9eacia necesit prepararea reactivilor dup reguli stricte.
Acestea sunt:
- diluentul # tampon la pJ 0,. diluat ):- cu ap distilat
- eritrocitele de berbec # recoltate pe soluie Alsever,
splate cu ser fiziologic, se suspend ):/3 n ser
fiziologic
- serul *emolitic # ntr-o diluie stoc ):-3, se pregtete
nainte de utilizare
- sistemul *emolitic # rezult din amestecul n pri egale a
suspensiei de eritrocite i ser hemolitic
- serul de bolna" # n care se face dozarea
complementului, se va recolta proaspt.
$eacia
$entru fiecare ser studiat, se pipeteaz n c&te / tuburi,
diluent, ser de bolnav i sistem hemolitic, dup urmtoarea
schem:
1ub nr. ) 6 . * - /
5iluent %ml( ),.3 ),6- ),63 ),)3 ),33 3,03
+er bolnav dil. )I*3 %ml( 3,63 3,6- 3,.3 3,*3 3,-3 3,23
122
+istem hemolitic %ml( ) ) ) ) ) )
Bolumul total de reacie T 6,- ml
Ancubarea la termostat .0RC, timp de .3 de minute.
Centrifugare la .333 ture, timp de . minute.
!itire la fotometru fa de un martor de hemoliz )33H %6,-
ml ap amoniacal 3,*H U ) ml sistem hemolitic(. +e msoar
e!tincia probelor, apoi se face un calcul pentru transformarea n
procente i stabilirea hemolizei -3H.
+e poate aplica i o procedur direct, prin care se
determin direct procentul de hemoliz n tubul de reacie, prin
comparare cu o scar de hemoliz, cuprins ntre )3H i 83H.
5ozarea complementului seric, aduce informaii importante
n boli renale, boli hepatice, colagenoze i boli alergice. Astfel,
scade n glomerulonefrita acut, n lupusul eritematos i n ciroza
hepatic, i crete n unele infecii i boli neoplazice.

1.+.1.,. Te(t!re! li4i-'l'i
Gizozimul, factor umoral bactericid din s&nge, lichide
biologice, mucus etc., acioneaz alturi de polipeptidele bazice,
proteazele lizozomale, interferoni, prin mecanisme neo!idative
asupra microorganismelor patogene.
<fectul lizozimului asupra peretelui bacterian, se poate
evidenia pe culturi de 'icrococcus l,sodeiDticus n medii lichide
sau solide.
1ehnica mai frecvent utilizat este cea pe medii solide %fig.
-*(, n care se face o suspensie de 'icrococcus, av&nd o
densitate de )3 germeniIml, n agar bacteriologic la pJ 0,6 i la o
concentraie de 6,-H. +uspensia se introduce n agar c&nd acesta
are o temperatur de *-RC. +e toarn n plci $etri i, dup
solidificare, se practic godeuri n masa agarului. ;n patru din
aceste godeuri se introduc urmtoarele concentraii de lizozim
%soluie martor, preparat e!temporaneu(: 6-\g -3\g )33\g i
633\g. $robele martor i cele de cercetat %ser sanguin, saliv etc.(
se introduc n godeuri n cantiti identice, astfel ca lichidele s nu
se rsp&ndeasc n afara godeurilor. 5up 6* de ore se msoar
diametrele de inhibiie a soluiilor martor i se traseaz curba
123
standard %fig. --( i totodat diametrele de inhibiie ale probelor
%unde se face media(.


Fi). *8 D Met4&! &e &eter-i#!re $!#tit!ti6% ! li4i-'l'i =# "l!$!
Petri? =# 0'#$3ie &e &i!-etr'l &e li% :!$teri!#% 5&i# $4le$3i!
!'t4r'l'i7.
,*? */? 1//? ,// J $4#$e#tr!3iile &e li4i- (t!#&!r& i#tr4&'(e =#
)4&e'ri.
! 2i : J "r4:ele &e $er$et!t.
Concentraiile lizozimului n lichidele biologice, se e!prim
conform curbei standard, n \gIml. Alturi de reacia de fi!are a
complementului %vezi cap. )./....(, aceast tehnic poate fi
utilizat fie pentru identificarea antigenelor specifice de grup, fie
pentru serodiagnosticul unor infecii respiratorii acute %pneumonii,
grip(, a ricNettsiozelor sau leptospirozelor.

1.+.1.1. F!)4$it4!

Evidenierea fa#ocitozei
124
=agocitoza este definit ca proprietatea unor celule de a
ngloba i digera particule strine %fagein T a m&nca( sau
macromolecule %inocin T a bea(. 5eoarece endocitoza
%nglobarea n celula fagocitar( nu este urmat obligatoriu de
omor&rea i digerarea bacteriilor, n testele de laborator se
urmresc separat cele dou procese.
+unt preferate testele in "i"o, deoarece: permit folosirea
unor populaii omogene de celule fagocitare %polimorfonucleare,
macrofage( este eliminat intervenia n procesul fagocitar a unor
ali factori %serici( i se poate studia separat nglobarea i efectul
bacteriilor intracelular.

Fi). ** D Re"ree#t!re! )r!0i$% ! $4#$e#tr!3iei &e li4i-
(t!#&!r&
/n "itro, pentru determinarea rocentului de fagocite care au
nglobat bacterii, se pune n contact suspensia de $"@ cu o
125
suspensie de cultur bacterian, n mai multe eprubete. 5up
incubarea acestui amestec la .0RC, la diferite intervale de timp %)-,
.3, /3, )63 minute(, se fac frotiuri care se coloreaz cu coloraia
?iemsa i se e!amineaz la microscop, not&nd:
- numrul mediu de microorganisme nglobate pe fagocit
- procentul de fagocite care au nglobat bacterii.
;n vederea cunoaterii caacitii de distrugere intracelular
a microorganismelor n procesul de fagocitoz, se determin
numrul de bacterii viabile intracelulare.
$entru aceasta, dup incubarea amestecului de celule
fagocitare i microorganisme timp de )- minute la .0RC %perioad
n care are loc nglobarea(, se oprete fagocitoza prin plasarea
eprubetelor la ghea. 5up o uoar centrifugare timp de *
minute, fagocitele sedimentare se spal n soluie JanNs, i se
incubeaz la .0RC. 5up fiecare )-, .3, /3, )63 minute, se ia 3,-
ml din suspensie i se amestec cu 3,- ml soluie JanNs. 5up o
nou centrifugare, se elimin supernatantul i se lizeaz fagocitele
cu ap distilat steril, de la ghea, care conine i albumin
bovin. 5eterminarea numrului de bacterii viabile se face prin
cultivarea pe medii de cultur adecvate. 5atele statistice arat c
neutrofilele ucid n /3 minute 8-,2H din stafilococii albi i 2/H din
stafilococii aurei hemolitici.
$entru aprecierea indicelui fagocitar %numrul mediu de
particule fagocitate de un granulocit sau monocit( se pot aplica
metode cantitative, mai obiective i mai rapide, cum este utilizarea
unor particule colorate, ca de e!emplu, picturile de ulei 7 rou,
acoperite cu G$+ %lipopolizaharide bacteriene(, care face posibil
determinarea spectrofotometric a fagocitozei. Alte metode se
bazeaz pe marcarea bacteriilor cu izotopi radioactivi sau pe
citometria n flu! %c&nd bacteriile sunt marcate cu fluorocromi(.
oloidopexia
"icroorganismele sau diferite particule inerte inoculate
intravenos la animalele de laborator %oareci, cobai(, sunt uor
fagocitate de ctre fagocitele circulante sau fi!e. <!perienele mai
frecvent fcute au fost cele cu tu de China. 5up diferite intervale
de timp %.3, /3, )63 minute(, sacrificarea animalului i efectuarea
126
de seciuni histologice, au demonstrat care sunt organele mai
bogate n macrofage %ganglionii limfatici, splina, ficatul etc.(,
cuprinse n sistemul mononuclear fagocitar.
Testul )%T .)itrobluetetrazolium0
<ste un test frecvent utilizat pentru a evidenia activitatea
enzimatic a fagocitelor, mai ales a $"@, celule generatoare de
pero!izi de hidrogen i radicali activi ai o!igenului.
Princiiul. $roprietatea fagocitelor de a ngloba colorantul n
vacuole fagocitare, unde sub influena unor nucleotid-o!idaze are
loc reducerea acestora ntr-un precipitat insolubil de formazan
%albastru-negru(, evideniabil prin coloraia ?iemsa.
'etoda cu s3nge integral% se practic recolt&nd )-6 ml
s&nge ntr-o sticlu cu anticoagulant %6 mg @a <51A # uscat(. ;ntr-
o eprubet se amestec:
- 3,32 ml soluie tampon "ichaelis pJ 0,*
- 3,36 ml soluie @,1 )H
- 3,) ml s&nge recoltat pe anticoagulant.
5up incubarea amestecului la .0RC, timp de .3 de minute,
se agit i se fac frotiuri: uscate, fi!ate cu alcool metilic i colorate
?iemsa.
+e e!amineaz cel puin )33 $"@ i se difereniaz
procentual celulele cu depozite de formazan %@,1 # pozitive(.
Ga o persoan sntoas, fagocitele @,1-pozitive,
reprezint 0-)*H. 7dat cu creterea metabolismului o!idativ al
neutrofilelor stimulate prin infecii bacteriene, procentul lor crete
mult. ;n infeciile virale sau stri febrile de origine neinfecioas,
valorile se menin n limite normale.
+emiluminiscena
7 metod alternativ de apreciere a metabolismului o!idativ
al $"@ este cea prin care se evideniaz fenomenul de
chemiluminiscen cu a'utorul unor aparate %chemiluminometre(.
9adiaiile luminoase %chemiluminiscena( generate n timpul
fagocitozei sunt amplificate prin utilizarea unei substane
intermediare # luminol iIsau lucigenin # care prin o!idare emit
127
unde luminoase i acestea pot fi convertite de aparate, n semnale
electrice, msurate n milivoli.
$rin aceste metode de apreciere a activitii $"@ i a
capacitii bactericide a acestor celule se pot evidenia deficienele
funcionale ale fagocitelor, n principal deficitul activitii
bactericide, care se traduce clinic prin infecii repetate, rebele la
tratament, care afecteaz mai ales esuturile profunde,
determin&nd modificri cu aspect de infiltrate granulocitare %boli
cronice granulomatoase(.
1.+.,. Te(te &e i-'#it!te $el'l!r%
9ealizarea rspunsului imun celular are la baz eliberarea
mai multor categorii de factori solubili: limfoNine, factori a'uttori i
supresori, factori mitogeni, factori de transfer, factorul de inhibare a
migrrii macrofagelor %"A=( i muli alii.
$entru e!plorarea imunitii celulare se folosesc at&t teste
Din vitroE c&t i Din vivoE.
1.+.,.1. E;"l4r!re! i-'#it%3ii $el'l!re i# 6itr4
<!ist mai multe metode e!perimentale care utilizeaz
limfocite din s&nge.
Evaluarea numrului absolut al limfocitelor i
monocitelor
@ormal, numrul absolut al limfocitelor sanguine este de
)-33-.333Imm], iar al monocitelor %macrofage tinere( de .33-
/33Imm].
Cunosc&nd procentul acestora n tabloul sanguin, se poate uor
calcula numrul absolut, raportat la numrul total al
leucocitelorImm].
Actual, identificarea i evaluarea subpopulaiilor limfocitare
1, , i a celulelor @> din s&ngele periferic i din esuturi, apeleaz
la anticorpii monoclonali i la metode de citometrie n flu! care pot
identifica aceste celule pe baza marNerilor i a receptorilor specifici
128
fiecrei populaii i subpopulaii limfocitare.
Fenotiizarea sau imunofenotipizarea limfocitelor 1 i , se
poate face pe suspensii unicelulare din s&nge, cu a'utorul
anticorpilor monoclonali, fa de marNerii: C5 6, C5 ., C5 *, C5
)8, C5 63 etc. $entru celulele @> se testeaz marNerii: C5 )/ i
C5 -/.
7etodele de separare a limfocitelor i macrofa#elor
$entru cercetarea in "itro a unor mecanisme care intervin n
cooperarea celular i reglarea rspunsului imun este necesar
obinerea claselor i subclaselor de celule. $entru acest scop, au
fost imaginate diverse metode de separare a celulelor, dintre care
se desprind:
- tehnicile de separare a celulelor bazate pe diferene de
sedimentare
- separarea celulelor pe baza unor atribute biologice
particulare
- metode de separare pe baza unor receptori de membran
i a moleculelor marNer specifice subpopulaiilor
limfocitare i altor celule cu rol n rspunsul imun.
1ehnicile de separare prin centrifugare n medii cu diferite
densiti %gradient de densitate(, folosesc substane care cresc rata
de sedimentare a eritrocitelor: 5e!tran, =icoll-7diston etc.

Seararea de Ficoll-'etrizoat %7diston(, se face prin
centrifugare, n care se introduc: o parte din s&ngele recoltat pe
anticoagulant i dou pri =icoll-"etrizoat %fig. -/(. Centrifugarea
timp de 63 de minute la *33 turaii, duce la separarea a patru
straturi principale, precis delimitate:
a- mediu de cultur i plasm sanguin
b- strat de forma unui inel alb, format din limfocite i
monocite
c- stratul de =icoll-"etrizoat
d- sedimentul de hematii i celule moarte.
129
Fi). *> D A("e$t'l $4l4!#ei =#!i#te 2i &'"% $e#tri0')!reF 1 D =#!i#te
&e $e#tri0')!re ('#t &4'% (tr!t'riF '#'l ('"eri4r 5S7? re"ree#t!t &e
(@#)ele &il'!t =# -e&i'? 2i !lt'l i#0eri4r 5I7? 04r-!t &e $%tre (4l'3i! &e
Fi$4ll<Metri4!tE , D &'"% $e#tri0')!re !"!r $el "'3i# 8 (tr!t'riF !<
(tr!t'l ('"eri4r 5-e&i' 2i "l!(-% (!#)'i#%7E :< (tr!t'l (': 04r-% &e
i#el $' li-04$ite 2i -4#4$iteE $< (4l'3i! (': 04r-% &e Fi$4ll<
Metri4!tE &< (e&i-e#t'l &e 9e-!tii 2i $el'le -4!rte.
Cu a'utorul unei pipete $asteur sau a unei pipete cu bul
%prelungit cu un tub de cauciuc pentru a se putea urmri cu
uurin toate operaiunile(, se elimin stratul superior, pentru
DdecopertareaE inelului limfocitar. Celulele care formeaz inelul alb
sunt aspirate cu a'utorul pipetei bine efilate i introduse ntr-o
eprubet de centrifug, care conine mediu de cultur pentru
limfocite. +e vor spla celulele de . ori, prin centrifugare %)3
minute la 633 turaiiIs(, n mediu de cultur, dup ultima splare
aduc&ndu-se la concentraia dorit. $rin aceast metod se obine
o populaie celular format din apro!imativ 83H limfocite i
monocite, iar restul este format din trombocite i rare hematii.
Alte metode de separare sunt utilizate n scop de cercetare
i se refer la:
- separarea macrofagelor i monocitelor prin aderarea la
sticl
- separarea macrofagelor dup fagocitarea fierului coloidal,
cu a'utorul unui magnet
- separarea prin fi!area liganzilor la receptorii de pe
130
membran ai limfocitelor, cu formare de rozete,etc.
$entru celulele din esuturi, mai ales cele limfatice,
fenotipizarea se face cu a'utorul anticorpilor monoclonali cuplai cu
substane fluorescente, iar evidenierea celulelor astfel marcate se
realizeaz prin citometrie n flu! sau cu microscopul de
fluorescen.
$rin tehnicile cu anticorpi monoclonali se pot stabili at&t
proporiile, c&t i numrul de celule din s&nge. Astfel au putut fi
stabilite valorile normale ale unor marNeri mai frecvent cercetai,
din care fac parte C5 6 i C5 . pentru limfocitele 1 totale %pan 1(
C5 * pentru limfocitele 1-helper C5 2 pentru limfocitele 1-
citoto!iceI1-supresoare i raportul C5 *:C5 2 C5 )8 i C5 63
pentru limfocitele , totale C5 )/ i C5 -/ pentru celulele @>
totale. $entru caracterizarea imunitii celulare, evaluarea acestor
subpopulaii celulare ma'ore are o importan deosebit at&t pentru
diagnosticul, c&t i pentru prognosticul unor afeciuni virale sau
maligne.
Teste cu formare de rozete
Princiiul.
Gimfocitele, monocitele i macrofagele au receptori de
membran capabili s lege specific diferite structuri care se gsesc
fie pe membrana unor hematii, fie a unor bacterii. Ataarea
hematiilor, prin liganzii lor, n 'urul limfocitelor care posed receptori
pentru acetia iau forma unor rozete, de unde denumirea de
QrozetareE dat procesului respectiv.
;n funcie de natura liganzilor, rozetele pot fi: <, <A, <AC,
<+.
$ozetele +
Gimfocitele 4 umane au capacitatea de a lega hematiile de
oaie prin receptori Q<E form&nd Qrozete + totale Q, de mare sau mic
afinitate.
;n vederea obinerii unor rezultate comparabile, Comisia
@aional de Amunologie a precizat condiiile standard de rozetare
a limfocitului 1 uman cu hematiile de oaie.
+e lucreaz pe s&nge venos uman recoltat pe heparin %)33
:AIml s&nge(, urmat de separarea limfocitelor pe amestec =icoll-
131
7diston %.ml amestec i 2ml s&nge diluat ^ n 1=+ T tampon
fosfat salin(, conform tehnicii descrise la 0.6.).6.
4e*nica rozetrii
9ozetarea se face n mediu AC, n tuburi de hemoliz cu
diametrul de )3m, n dulicat. +e introduc -3\l suspensie de
limfocite umane i )33\l suspensie hematii de oaie. +e adaug
)33\l ser fetal de viel inactivat i adsorbit cu hematii. Centrifugare
- minute la )33 turaii, incubare /3 minute ntr-o baie de ap la
68
3
C %pentru rozetele de mare afinitate( sau )/-6* ore la U*
3
C
%pentru rozetele totale(.
!itirea i interretarea rezultatelor.
+e face o resuspendare bl&nd a suspensiei %prin aspirri
uoare cu o pipet $asteur cu tetin(. +uspendarea se ntinde pe o
lam de microscop, se usuc rapid prin nclinare, apoi fi!are cu
alcool metilic i colorare cu ?iemsa. +e citesc minimum 6-3 celule
limfoide rozetate i nerozetate i se calculeaz procentul de
rozetare. +e consider rozete numai acelea care au minimum .
eritrocite aezate la un limfocit.
+e determin procentul de rozete totale %incubare la U*
3
C(,
cel de mare afinitate %incubare la 68
3
C( i cel de mic afinitate %prin
scderea din procentul de rozete totale a procentului de rozete de
mare afinitate(.
Ga om, media valorilor normale este urmtoarea: rozete <
totale %limfocite 1 totale( T /2 _ 6H, din care rozete < de mare
afinitate T *. _ 6H i de mic afinitate T 6- _ 6H.
$ozetele +-
Gimfocitele sau monocitele au receptori =c care leag
imunoglobulinele Ag? iIsau Ag" %prin fragmentul lor =c(. 5ac
imunoglobulina are funcie de anticorp pentru hematia de oaie,
atunci se leag prin fragmentul =ab de hematie i prin fragmentul
=c de limfocit. Astfel se formeaz rozete prin intermediul
anticorpilor %rozete <A(. =olosind eritrocite de bou i ser
antieritrocite de bou, se pot identifica toate limfocitele cu receptori
=c.
$ozetele +-!
5imfocitele )% n principal, au receptori pentru fraciunile
132
complementului, mai ales pentru C.b, astfel, eritrocitele
sensibilizate la Ag" i C.b se leag de aceti receptori, form&nd
rozete <AC %eritrocite U anticorpi U complement(, doza de
complement fiind calculat astfel ca s nu fie hemolitic.
$rocentul de celule formatoare de rozete <AC este de 6) _
6H.
5egarea stafilococului !oBan la /g# i rozetele +S
Princiiul. $roteina A din peretele stafilococului aureu
CoSan, se leag la fragmentul =c al moleculei de Ag?. ;n cazul n
care molecula de Ag? este fi!at specific prin =ab la antigenele de
membran ale limfocitului, stafilococul se leag de fragmentul =c al
imunoglobulinei %fig. -0.a(. C&nd molecula de Ag? se fi!eaz
nespecific de receptorul =c al membranei limfocitare %=c9(,
stafilococul se va ataa prin proteina A la fragmentul =c al
imunoglobulinei %fig. -0.b.(. <!aminat la microscop, limfocitul apare
ncon'urat de bacterii. "arcarea stafilococului CoSan cu
izotiocianat de fluorescen i e!aminarea rozetelor n lumin :B,
permite obinerea de imagini mult mai clare.
!itirea. +e numr minim 633 de celule rozetate %limfocite
rozetate( i nerozetate. +e face procentul de rozetare.

Fi). *+ D P4(i:ilit%3i &e !t!2!re ! St!0il4$4$'l'i !'re'( l! $el'l!
li-04i&%F
!< -4le$'l! &e I)G !re 0'#$3ie &e !#ti$4r"? "ri# F!: 0i;@#&'<(e
("e$i0i$ l! re$e"t4rii &e -e-:r!#% 5!#ti$4r"i7? i!r
(t!0il4$4$'l (e !t!2e!% !"4i l! &4-e#i'l CH<, !l F$.
:< M4le$'l! &e I)G (e 0i;e!% #e("e$i0i$? "ri# 0r!)-e#t'l F$? l!
133
re$e"t4r'l D F$R D !l -e-:r!#ei $el'l!re? i!r (t!0il4$4$'l (e
6! !t!2! "ri# "r4tei#! A l! &4-e#i'l CH<, !l F$.

Testul transformrii limfoblastice .TT(0
Princiiul metodei
Gimfocitele, sub aciunea unor stimuli, i activeaz in "itro,
procesele metabolice care preced multiplicarea lor. Bolumul celulei
crete, nucleul se coloreaz mai puin intens, nucleolii sunt mai
vizibili, etc. Acest stadiu al multiplicrii celulare este cunoscut sub
denumirea de DblastE, iar procesul n sine de Dtransformare
blasticE.
+timulii care induc transformarea blastic in "itro, pot fi de
natur diferit: mitogenic% antigenic sau allogenic.
1ransformarea blastic a limfocitelor stimulate mitogenic,
utilizeaz frecvent fitohemaglutinina, concavalina, dar i
lipopolizaharidele %G$+( bacteriene. Gimfocitele pot fi obinute din
s&ngele periferic i cultivate fie ca populaii purificate prin separare
n gradient de densitate, fie n cultur de Ds&nge totalE.
+e adaug substanele mitogene, dozele optime n cazul
limfocitelor umane fiind n 'urul valorilor de )H n cultur pentru
fitohemaglutinin %$JA-"(, i de )-6g pentru concavalina A %Con
A(. +e folosesc i culturi de celule martor, fr factori stimulatori.
5up *2 de ore, n fiecare cultur se introduce c&te 3,) ml
din soluia de lucru, ce conine .J-1d %timidin tritiat(, i se
reincubeaz culturile timp de 6* de ore la .0RC. =iecare cultur
este filtrat pe c&te o membran de sticl "illipore adecvat, care
antreneaz n timpul traversrii membranei, urmele rmase de
timidin trinitat nencorporat. Celulele rmase pe membrana
filtrat se spal de . ori cu c&te )3 ml 1=+. Celulele cultivate sunt
fi!ate pe rondele de h&rtie de filtru, mprit prin linii, n ptrate cu
latura de *I* cm %numerotate(. =iecare rondel, reprezent&nd o
cultur de limfocite, este introdus n vasul de scintilaie numerotat,
n care se introduce lichidul de scintilaie. +e face o citire la aparat,
not&ndu-se impulsurile emise de fiecare prob.
9ezultatele sunt e!primate n DAndice de stimulareE,
calcul&ndu-se mediana.
;n lipsa aparatului de scintilaie, se poate calcula procentul
134
de limfoblati, pe frotiu colorat cu metoda ?iemsa, aceasta
neoferind ns rezultate reproductibile.
1ransformarea blastic prin stimuli antigenici in "itro, are
principii i tehnici de lucru identice, dar, n acest caz, limfocitele
cultivate trebuie s provin de la un organism care a venit n
contact cu antigenul %deci stimul in "i"o (.
;ntr-o cultur mi!t limfocitar, limfocitele provenite de la doi
subieci sub raportul antigenelor de histocompatibilitate, se
stimuleaz reciproc dac sunt cultivate in "itro mpreun. 5irecia
de stimulare poate fi:
- bidirecional %double SaO(, n cazul n care populaiile
limfocitare provenite de la subiecii A i , se stimuleaz
reciproc i se transform blastic
- unidirecional %one SaO(, n cazul n care numai o
populaie este stimulat i se poate transforma blastic %A(,
iar cealalt %,(, poate stimula dar nu se poate transforma
blastic, fiind blocat sinteza A5@-ului celular, ca urmare a
iradierii sau a tratamentului cu "itomicin.
5omeniile de aplicare a transformrii limfoblastice este tot
mai larg, n special n cercetarea imunitii celulare, put&nd
informa asupra unor eventuale depleii sau alterrii funcionale a
celulelor 1. Cultura mi!t limfocitar este un instrument util n
determinarea gradului de competen sau incompeten e!istent
ntre doi subieci, donator i receptor de grefon, sub raportul
antigenelor de histocompatibilitate.
$n+ibiia mi#rrii macrofa#elor sau leucocitelor
Princiiul metodei. "acrofagele i leucocitele, meninute n
condiii corespunztoare in "itro, prsesc locul n care se afl,
migr&nd n diferite direcii. @ormal, ntr-o cultur, limfocitele
migreaz omogen form&nd o pla' rotund.
:nele limfoNine, cum este factorul de inhibiie al migrrii
macrofagelor -"A=- sau al limfocitelor -GA=-, sunt citoNine eliberate
de ctre limfocitele activate de un anumit antigen, inhib migrarea
macrofagelor i leucocitelor.
1ehnica inhibiiei migrrii, permite detectarea prezenei
limfocitelor sensibilizate fa de un anumit antigen sau identificarea
135
antigenului sensibilizat, responsabil de reaciile imune mediate
celular. Aceast tehnic poate fi efectuat prin dou metode
diferite:
- metoda direct% n care limfocitele sunt cultivate mpreun
cu celulele care migreaz, n prezena antigenului # "A=-
ul sau GA=-ul # secretat n mediu i inhib&nd migrarea
- metoda indirect% n care limfocitele i macrofagele sunt
cultivate mpreun cu antigenul, dup care mediul de
cultur # n care s-au eliberat factorii de inhibiie # este
folosit la determinarea inhibiiei migrrii.
1ehnicile de lucru sunt diverse: tehnica inhibiiei migrrii din
capilar %cea mai utilizat(, din coagul de s&nge, din fragment de
organ, din pictur de agaroz, etc.
Anhibiia migrrii leucocitelor din tubul capilar de sticl %fig.
-2(, se e!ecut pe s&nge venos, recoltat pe heparin. +e
recolteaz de obicei *3 ml s&nge, care se amestec cu 63 ml
soluie 5e!tran -H, pentru separarea celulelor seriei albe %prin
sedimentare spontan, hematiile sedimenteaz, iar plasma din
stratul superior, ce conine leucocitele, se va prelucra mai departe(.
Fi). *. D I#9i:i3i! -i)r%rii -!$r40!)el4r =# t': $!"il!r.
!< -!rt4r? 0%r% !#ti)e#E
:< "r4:! &e $er$et!t? 0!3% &e !#ti)e#'l (e#(i:ili!t.

;n final, se va obine un sediment de leucocite, care se va
suspenda n mediu pentru culturi celulare, apro!imativ -!)3
celuleIml. +uspensia celular este introdus, prin capilaritate, n
tuburi care se nchid la un capt cu plastelin, dup care se
centrifugheaz %* minute la ).33 rotaiiIminut(. 5up sedimentare,
se secioneaz tubul de sticl deasupra sedimentului, apoi partea
136
nchis este fi!at n camera de migrare, astfel ca tubul s adere la
lama de sticl %o lam de microscop(. 5up incubare, n poziie
orizontal, 6* de ore la .0RC, se citesc rezultatele prin msurarea
coloanei de migrare i raportarea la un martor fr antigen.
5up aceast tehnic se poate cerceta migrarea i
inhibarea migrrii pentru macrofagele alveolare sau pentru
macrofagele peritoneale.
$rincipalele domenii de aplicare a inhibiiei migrrii
macrofagelor sau leucocitelor, privesc n principal, evaluarea
hipersensibilitii de tip nt&rziat sau a unor reacii autoimune, n
aprecierea gradului de imunizare fa de unele antigene virale,
bacteriene sau tisulare prin testri ale activitilor biologice ale
citoNinelor, alturi de alte tehnici care pot evalua efectul diferitelor
citoNine asupra diferitelor celule imunocompetente.
;n prezent, e!ist diferite Nituri comerciale care se utilizeaz
pentru evidenierea sau cuantificarea producerii de citoNine, at&t n
serul sanguin, c&t i n supernatantele culturilor de limfocite i
monocite stimulate in "itro, dar n aceste cazuri, analizele apeleaz
la metode de tip <GA+A.
-cti"itatea citoto0ic
Activitatea celulelor citoto!ice %limfocitele 1-citoto!ice,
celulele >iller i @atural >iller( se poate aprecia in "itro prin
incubarea celulelor mononucleare, izolate din s&nge sau esuturi
limfoide, cu diverse celule int marcate n prealabil cu crom
radioactiv %
-)
Cr (.
Celulele omor&te de ctre cele citoto!ice, elibereaz cromul
radioactiv, care poate fi msurat cu un aparat de msurat gamma
i care reflect activitatea citoto!ic a celulelor. 1estarea activitii
citoto!ice se poate face pe celule int allogene %celule provenind
de la alt individ din aceeai specie(, celule tumorale sau infectate
viral %pentru testarea capacitii citoto!ice a limfocitelor 1-C5 2(.
;n cazul testrii activitii celulelor @> se utilizeaz de obicei
ca int o linie celular tumoral. 5ac se urmrete testarea
citoto!icitii celulare anticorpodependent %A5CC( a celulelor
>iller, celulele int sunt tratate n prealabil cu concentraii mici
%subaglutinante( de anticorpi %ser imun anticelul int( i apoi sunt
incubate cu celule >, care devin celule GA> %lOmphoNine-activated
137
Niller(.

,. DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC
,.1. SCHEMA DIAGNOSTICULUI ETIOLOGIC N
BOLILE INFECIOASE
"etodele folosite n diagnosticul etiologic sunt grupate n
dou mari categorii:
- metode de diagnostic direct sau bacteriologic
- metode de diagnostic indirect # serologic i biologic.
,.1.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t D :!$teri4l4)i$
Cuprinde toate etapele care urmresc evidenierea
agentului patogen din produsul patologic, izolarea i identificarea
lui. $rincipalele etape ale diagnosticului bacteriologic sunt:
recoltarea produselor, e!amenul microscopic, nsm&narea i
izolarea bacteriilor identificarea agentului etiologic i determinarea
sensibilitii la antibiotice a acestuia, n vederea instituirii unei
terapii corecte, eficiente.
,.1.1.1. Re$4lt!re! "r4&'(el4r :i4l4)i$e
$relevarea corect a produselor destinate e!aminrii
bacteriologice condiioneaz direct eficiena etapelor urmtoare i,
n final, obinerea unui rezultat fidel %vezi prelevarea produselor la
cap. ).*(.
138
,.1.1.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
+e face din produsul patologic sau biologic, prin efectuarea
i e!aminarea preparatului nativ i a frotiului colorat ?ram, Kiehl-
@eelsen, coloraii pentru capsul, spori i # uneori # prin coloraia
?iemsa. +e obin informaii utile legate de prezena bacteriilor, care
orienteaz spre abordarea n continuare a celor mai potrivite
tehnici de diagnostic. ;n unele cazuri, bacterioscopia direct poate
fi hotr&toare pentru stabilirea diagnosticului, cum este cazul n
sifilisul primar, n gonoree la brbai, n tuberculoz etc.
,.1.1.1. #(%-@#3!re! "rele6!tel4r 2i i4l!re! !)e#t'l'i
"!t4)e#
$ermite, pe l&ng evidenierea populaiei bacteriene dintr-un
produs, izolarea agenilor patogeni din produsele pluricontaminate,
etap necesar identificrii ma'oritii bacteriilor cu potenial
patogen.
,.1.1.8. I&e#ti0i$!re! !)e#t'l'i "!t4)e#
5up izolarea n cultur pur, bacteriile sunt supuse
identificrii, fc&ndu-se apel la proprietile morfotinctoriale, de
cultur, biochimice i de patogenitate ale acestora.
ercetarea proprietilor morfotinctoriale ale germenilor
din cultura
pur se face folosind aceleai metode de e!aminare, n raport cu
aspectul coloniei pe mediul de cultur, ca i pentru bacterioscopia
direct %mobilitate, form, dimensiuni, aezare, colorabilitate etc.(.
Proprietile de cultur permit identificarea prezumtiv a
agentului cauzal i selecionarea de colonii pentru repicat n
vederea altor teste de identificare. $entru descrierea aspectului pe
medii solide se vor lua n considerare mai ales: forma coloniilor,
mrimea, consistena, culoarea, mirosul, tipul hemolizei %dac este
cazul(, creterea pe mediile selectiv-difereniale lactozonegative
sau lactozopozitive, caractere importante pentru orientarea
139
terapeutic, dar n cele mai multe cazuri fiind necesar
completarea informaiilor cu caracterele metabolice, de structur
antigenic i de patogenitate ale bacteriei n cauz.
$nvesti#area proprietilor metabolice .bioc+imice0, n
care accentul trebuie pus pe cele generale: catalaza, o!idaza,
modul de degradare a glucozei %=I7( i producerea de gaz,
permite ncadrarea unor bacterii n familii, genuri sau specii. ;n
situaiile n care identificarea nu poate fi realizat prin acest set de
teste metabolice se va proceda la determinri suplimentare,
limit&ndu-se ns la strictul necesar.
4efinirea caracterelor anti#enice are o valoare diferit.
Astfel, n unele situaii, de e!emplu n identificarea speciilor din
genurile Salmonella, S*igella, 7ibrio, procedeul este indispensabil.
;n alte cazuri, determinarea structurii antigenice are o valoare mai
redus %pentru meningococ, pneumococ, )rucella, )ordetella,
streptococ( n comparaie cu proprietile morfologice, culturale i
metabolice, pe care le completeaz. :neori, procedeul acesta se
folosete pentru precizarea subspeciei %serotipului(, nu
ntotdeauna necesar pentru orientarea terapeutic.
Cercetarea caracterelor antigenice se efectueaz n mod
predilect prin reacia de aglutinare pe lam i n tuburi, cu seruri
imune standard. ;n unele cazuri %de e!emplu pentru streptococ( se
folosete reacia de precipitare.
ercetarea caracterelor de pato#enitate in "i"o sau in
"itro se face prin reproducerea infeciei e!perimentale la animale
de laborator, evidenierea eliberrii de to!ine sau produi celulari
neto!ici %coagulaz, fibrinolizin, hialuronidaz, hemolizin etc.(.
,.1.1.*. Deter-i#!re! (e#(i:ilit%3ii l! !#ti:i4ti$e
Antibiograma este o etap obligatorie dup identificare, n
primul r&nd din motive clinicoterapeutice, dar i ca investigaie
epidemiologic. Aceasta se efectueaz pe subcultur bacterian
pur i nu pe amestec de bacterii.
140
,.1.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t D (er4l4)i$
+e bazeaz pe aariia anticorilor secifici n s3ngele
bolna"ilor, a cror prezen poate fi evideniat cu aFutorul
antigenelor standardizate. 5ar reaciile serologice de diagnostic se
folosesc, pe l&ng decelarea anticorpilor serici, i n scopul
determinrii unei stri de imunitate sau a unei alergii.
,.1.,.1. Met4&ele &e &i!)#4(ti$ (er4l4)i$
Acestea utilizeaz reaciile de: aglutinare, precipitare, fi!are
a complementului, seroneutralizare, imunofluorescen etc. ;n
diagnosticul serologic, antigenele standard necesare decelrii
anticorpilor serici sunt deci de tip aglutinant, hemaglutinant, fi!atori
de complement i neutralizani.
Andiferent de felul reaciei antigen-anticorp, n e!ecutarea
serologiei de diagnostic trebuie respectate unele reguli generale:
- interpretarea corect a reaciilor serologice este posibil,
n general, numai pe seruri duble, recoltate n diferite
faze ale bolii, cu urmrirea n dinamic a titrului
anticorpilor
- dac nu este disponibil dec&t o singur prob de ser,
rezultatul nu poate fi considerat pozitiv dec&t n cazul n
care titrul anticorpilor depete de cel puin 6 ori pragul
de specificitate, corelat cu un suport clinic adecvat
- serul trebuie s fie limpede, nehemolizat, neinfectat i
decomplementat %inactivarea complementului prin
nclzire la -/
3
C, timp de .3 de minute(.
,.1.,.,. Met4&ele &e &i!)#4(ti$ :i4l4)i$
$rin inocularea intradermic a antigenului se poate stabili
apariia unei:
- reacii de neutralizare a to!inei prin antito!inele din
141
s&ngele bolnavilor, n cazul testrii n difterie %reacia
+hicN( i n scarlatin %reacia 5icN(
- reacii entru decelarea strii de *iersensibilitate
tardi" ce nsoete unele infecii: reacia la tuberculin
%reacia "antou! n tuberculoz(, la brucelin %reacia
,urnet n bruceloz(, la tularin %n tularemie( etc.
$rocedeul i tehnica reaciilor intradermice, precum i
interpretarea lor sunt descrise la capitolele de diagnostic etiologic
respective.
142
,.,.DIAGNOSTICUL INFECIILOR STAFILOCOCICE
?enul Sta*,lococcus face parte din familia 'icrococaceae,
care cuprinde mai multe specii diferite, din care unele ot fi
atogene pentru om i animale.
+tafilococii sunt coci ?ram-pozitivi, aero-anaerobi facultativi,
dintre care semnificaie clinic au:
- Sta*,lococcus aureus, coagulazo-pozitiv, n general
patogen
- Sta*,lococcus eidermidis ?albus@, coagulazo-negativ,
specie lipsit n mod obinuit de patogenitate sau condiionat
patogen, av&nd mai multe serotipuri.
.abitat. S. eidermidis face parte din microbiocenoza
nazal i cutanat. S. aureus poate fi nt&lnit la purttorii sntoi
n cavitatea nazal, faringe, pe tegumente, n colon %deci, simpla
prezen a acestuia n organism nu nseamn infecie
stafilococic(.
/nfecii stafilococice
+tafilococii, bacterii oportuniste %care produc mbolnviri
numai n anumite condiii(, produc infecii diverse ca localizare,
manifestri clinice i evoluie.
5in gama larg de infecii, sunt caracteristice infeciile
cutanate ca: furunculul %care are punctul de plecare foliculul pilos,
cu e!tindere n profunzime( carbunculul panariiul %infecia
periunghial( hidrosadenita %infecia glandelor sudoripare a!ilare(
mastita %infecia glandelor mamare( abcese profunde.
Alte localizri ale infeciei sunt: osteoarticulare
%osteomielita( resiratorii %sinuzite, otite, pneumonii secundare
etc.( urogenitale ale seroaselor %meningite, pleurezii, peritonite(
to0iinfecii alimentare i seticemii %cu punct de plecare, frecvent
din leziuni cutanate(.

:nele serotipuri produc enteroto!ine de tip A, ,, C
)
, C
6
, 5 i
<, care ingerate, determin to!iinfecii alimentare, sursa fiind de
143
obicei la nivel cutanat %furuncul, mastit, panariiu etc.(.
Sta*,lococcus aureus cauzeaz i sindromul de oc to!ic,
prin to!ina de sindrom to!ic de tip ) %1++1-)(.
,.,.1. Di!)#4(ti$'l &e l!:4r!t4r
<ste numai direct %bacteriologic(.
,.,.1.1. Re$4lt!re! "r4&'(el4r
$relevarea se face n funcie de localizarea infeciei : uroi
n infeciile cutanate s3nge pentru hemocultur n septicemie
e0sudat faringian urin n infeciile urinare etc.
,.,.1.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
5in prelevate se ntind frotiuri care se coloreaz ?ram. ;n
cazul unui puroi stafilococic se evideniaz coci ?ram-pozitivi,
aezai n ciorchine, e!tracelular, pe un fond colorat n rou,
reprezentat de celule, detritusuri celulare i fibrin %fig. -8(.
Fi). *B. D St!0il4$4$i =# "'r4i? !2e!3i =# $i4r$9i#e? =#tre re(t'ri
144
$el'l!re.
,.,.1.1. I4l!re!
+e bazeaz pe capacitatea stafilococilor de a crete pe
medii simple i pe medii hiperclorurate %ca mediul Chapman(. $e
geloz-s&nge se dezvolt colonii cu diametrul de 6-. mm, de
consisten cremoas, de obicei, cu -hemoliz % plana AAA-)(. $e
mediul selectiv Chapman se difereniaz colonii manitol-pozitive
%vireaz mediul n galben(. 5e pe aceste medii, pornind de la o
colonie, se izoleaz germenul n cultur pur, pe geloz-s&nge.
,.,.1.8. I&e#ti0i$!re!
Proprietile morfotinctoriale
+tafilococii sunt coci ?ram-pozitivi, aezai n ciorchine, mai
rar n diplo sau izolai. ;n culturile tinere de * ore, la unele tipuri de
stafilococ, se poate evidenia i capsula. +unt imobili, nesporulai.
Proprieti de cultur
+tafilococul crete pe medii simple, fiind aerob-anaerob
facultativ. $e medii lichide, tulbur uniform mediul. $e mediile
solide crete sub form de colonii rotunde, cu marginile regulate,
bombate i de culoare alb sau galben-citrin-auriu. ;n raport cu
pigmentaia, se pot nt&lni deci: stafilococi cu pigment auriu, cu
pigment alb i cu pigment citrin. +tafilococul auriu produce o
hemoliz total, iar cel alb produce mai rar hemoliza.
1ipurile de hemoliz produse de stafilococi sunt:
- O - *emoliza% care apare dup o incubare la .0
3
C
%hemoliza de tip cald( ca un halou clar de liz complet,
cu marginile nebuloase n 'urul coloniei
- O - *emoliza% care apare dup o incubare la .0
3
C ca o
hemoliz incomplet, dar care se intensific la *
3
C
%hemoliz de tip cald-rece(. ;n situaiile n care n frotiul
145
direct se observ coci ?ram-pozitivi dispui n diplo sau
n grmezi, iar culturile rm&n negative, este posibil
implicarea cocilor anaerobi %Petococcus(.
Proprieti bioc+imice
$rezena catalazei este caracteristic genului
Sta*,lococcus i 'icrococcus, pentru identificarea acestora
fc&ndu-se apel la testul =-7 %fermentare-o!idare( care este =U %la
stafilococi( i o!idativ %7( sau inert %A( la micrococi.
Sta*,lococcus aureus degradeaz o0idati" i fermentati"
manitolul i este coagulazo-oziti" %caracter de patogenitate(.
Sta*,lococcus eidermidis degradeaz numai o0idati"
manitolul i este coagulazo-negati".
Structura anti#enic
$eretele stafilococilor aurei hemolitici conin numeroase
antigene de ti ce pot fi puse n eviden i utilizate n
epidemiologie %determinarea serotipului(. <!ist, de asemenea, pe
suprafaa stafilococilor, receptori pentru bacteriofagi %virusuri ale
bacteriilor(, utilizai pentru determinarea tipului de stafilococ prin
fenomenul de lizotiie, util n anchetele epidemiologice.
1ipizarea cu a'utorul bacteriofagilor specifici se bazeaz pe
sensibilitatea sau rezistena unui gen sau a unor specii fa de un
set de bacteriofagi, ncadr&nd tipuri fagice, lizotiuri.
1ehnica utilizat pentru lizotipie %fig. /3( se bazeaz pe
folosirea Dspotului de bacteriofagieE, n care, pe o cultur de
stafilococ %tehnica se aplic i pentru alte bacterii(, nsm&nat n
p&nz pe suprafaa unei plci $etri cu mediu de cultur solid, se
pune o pictur din suspensia de bacteriofag %n fiecare ptrel alt
fag(. 5ac bacteria este sensibil, n ptrelul cu fagul respectiv
nu se dezvolt cultura.
Cei mai utilizai bacteriofagi ai stafilococilor, n numr de 6),
au fost mprii n patru grupe:
- grupa A: 68, -6, -6A, 08, 23, 2)
146
- grupa a AA-a: .A, .,, .C, --, 0)
- grupa a AAA-a: /, 0, *6<, *0, -., -*, --, 00
- grupa a AB-a: *65.
$recizarea tipurilor fagice este de mare a'utor n ancheta
epidemiologic, pentru depistarea sursei de infecie.
Fi). >/ D Li4ti"i! '#ei t'l"i#i &e Stap+,lococcus aureus
aractere de pato#enitate
$atogenitatea stafilococului poate fi evideniat prin teste in
"i"o i in "itro, bazate pe proprietatea acestor bacterii de a elabora
produi e!tracelulari neto!ici i e!oto!ine.
/n "itro pot fi evideniate: coagulaza, fibrinolizina i
dezo!iribonucleaza.
!oagulaza %fig. /)( este considerat proprietatea cea mai
util i mai constant de apreciere a patogenitii unei tulpini de
stafilococ.
147
Fi). >1< Te(t'l $4!)'l!ei =# t':. S'"eri4r te(t'l $4!)'l!ei #e)!ti6
5$4#3i#'t'l e(te li$9i&7. I#0eri4r? te(t'l "4iti6 5"l!(-! ! 04(t
$4!)'l!t%7
Aceasta poate e!ista sub form de :
- coagulaz liber # care se evideniaz pun&nd ) ml de
plasm mpreun cu o pictur din cultur n bulion, iar
dup * ore la .0
3
C %e!aminare din .3 n .3 de minute(
se formeaz %la culturile cu coagulaz pozitiv( un
coagul de fibrin
- coagulaza legat care se determin fc&nd cu ansa o
suspensie din cultura de pe mediul solid ntr-o pictur
de plasm uman, pe o lam de sticl %se evideniaz
precipitate de fibrin n plasm, n timp de apro!imativ
)- secunde(.
Anterpretare : Sta*,lococcus aureus este coagulazo-pozitiv
i are caractere de patogenitate, iar Sta*,lococcus eidermidis i
Sta*,lococcus saro*iticus sunt coagulazo-negativi.
Fibrinolizina reprezint proprietatea unor tulpini de stafilococ
de a liza fibrina i se evideniaz nsm&n&nd punctiform
suprafaa unui mediu, n care a fost ncorporat fibrin, a unei
tulpini de stafilococ. $rin eliberarea de fibrinolizin se pune n
eviden un halou clar n 'urul culturii.
Dezo0iribonucleaza se pune n eviden prin nsm&nri
punctiforme pe geloz a unei tulpini de stafilococ, geloza conin&nd
acid dezo0iribonucleic. 5up dezvoltarea culturii, se acoper
suprafaa plcii $etri cu acid clorhidric ),- @. ;n aceste condiii, n
'urul coloniilor care posed dezo!iribonucleaz apar zone clare,
148
transparente, restul mediului devenind opalescent.
/n "i"o, testele de patogenitate in de proprietatea
stafilococului patogen de a produce e0oto0ine. Princialele teste in
"i"o se bazeaz pe:
- acti"itatea dermonecrotic, aceasta const&nd n apariia
necrozei uscate, cu escar detaabil, dup *2-06 de
ore de la inocularea intradermic a filtratului de cultur la
iepure
- e0folierea tegumentar produs de e!oto!ina e!foliativ
dintr-un filtrat de cultur inoculat subcutanat la oarecele
nou-nscut
- efectele enteroto0inei %e!oto!in termorezistent
eliberat n intestin( produs de tulpinile de stafilococ
patogen, aceasta fiind responsabil de producerea
to!iinfeciilor alimentare stafilococice. $rezena
enteroto!inei este evideniat prin testul Dolman,
inocul&nd filtratul culturii, fiert 63 de minute,
intraperitoneal, la pisoi tineri. 5up )3-/3 de minute,
animalul devine agitat, prezint sialoree, contracturi
musculare abdominale, vrsturi n 'et i diaree. 5up
apro!imativ o or, animalul revine la stare normal.
<nteroto!ina poate fi evideniat i prin reacia de dubl
precipitare n gel de agar.
5up identificarea stafilococilor patogeni, este obligatorie
efectuarea antibiogramei n vederea unei terapii corecte, dat fiind
frecvena tot mai mare cu care se izoleaz surse de stafilococi
rezisteni la antibiotice.
149
,.1. DIAGNOSTICUL INFECIILOR
STREPTOCOCICE
=amilia Stretococcaceae este format din mai multe
genuri, dintre care, de interes medical sunt:
- genul Stretococcus, inclusiv Stretococcus
neumoniae %pneumococul(
- genul +nterococcus, germeni frecvent recunoscui ca
ageni patogeni
- genul Petostretococcus, streptococi anaerobi
obligatorii.
!lasificarea stretococilor interesai n patologia uman s-a
fcut dup un ansamblu de caractere metabolice %capacitatea de a
liza hematiile, natura hemolizei(, rorietile bioc*imice, c&t i
dup rorietile antigenice: ma'oritatea speciilor patogene
posed&nd n peretele bacterian un polizaharid cu rol antigenic
%poliozidul C(, a crui specificitate permite mprirea acestora n
aa-zii stretococi gruabili n )8 grupe %clasificarea Gancefield(,
notate cu A,,,C,...,:. Ali streptococi care nu posed acest poliozid
C, denumii stretococi nongruabili, sunt considerai ca fiind
comensali.
5up proprietile hemolitice # tipul de hemoliz # pot fi
relevate . aspecte:
- hemoliz total sau O- *emoliz , care se traduce printr-
un halou clar, perfect transparent n 'urul coloanei,
corespunz&nd unei lize totale a hematiilor, cu distrucia
stromei globulare %Stretococcus ,ogenes de gru -,
Stretococcus de gru )% !% # etc.(%plana AAA-6(
- o hemoliz incomplet sau O- *emoliz , care se prezint
ca un halou mai puin clar, cu marginile zonei de culoare
150
verzuie neregulate %Stretococcus "iridans, S. mutans,
S. sanguis, S. faecalis, S. neumoniae etc.(
- absena *emolizei %Stretococcus de gru D, fr
enterococ(.
,.1.1. I#0e$3iile (tre"t4$4$i$e
,acterii cu mare diversitate i rsp&ndire, streptococii pot fi
nt&lnii ca fiind comensali la om, la nivelul tegumentelor i
mucoaselor, sau ca germeni patogeni.
Stretococcus ,ogenes sau streptococul O- *emolitic de
gru -, cu localizare preferenial la nivelul amigdalelor i
faringelui, este o bacterie responsabil de numeroase infecii acute
secifice %scarlatina i erizielul( sau nesecifice %angine
bacteriene eritematoase i eritematopultacee, deseori complicate
cu abcese periamigdaliene(. Acesta poate cauza de asemenea:
rinite urulente, sinuzite, otite medii suurate, infecii cutanate
%impetigo, piodermite(, infecii genitale %salpingite( etc.
Complicaiile ost-stretococice sunt: reumatismul oliarticular
acut i glomerulonefrita acut.
Stretococii din gruul ) colonizeaz intestinul i tractul
genital feminin, fiind reprezentativ Stretococcus agalactiae,
considerat actual ca agent etiologic al seticemiilor i meningitelor
neonatale. Anfeciile la adult sunt mult mai rare, descriindu-se
complicaii dup avort sau natere %endometrite urmate de
septicemie( sau infecii variate la subieci cu mecanisme de
aprare deficitare.
Stretococii din gruele ! i #, prin caracterele lor
bacteriologice i potenialul patogen, apropie aceti streptococi -
hemolitici de cei din grupul A, particip&nd la rspunsul imunitar.
+treptococii din grupul C sunt cei mai muli de origine animal i
provoac ocazional infecii umane. +treptococii grupului ? sunt, n
general, comensali ai pielii i mucoaselor, dar pot produce angine
i infecii cutanate.
Stretococii din gruul D. $&n n urm cu c&iva ani, n
genul +treptococcus de grup 5 erau inclui i enterococii, dup
separarea crora au rmas n acest grup: S. bo"is% S. ePuinus% S.
151
suis% care pot fi considerai ca bacterii condiionat patogene, unele
fiind comensale n cadrul florei intestinale umane, ele fiind rar
responsabile de septicemii sau endocardite.
+nterococii, considerai ca bacterii comensale, cu localizare
n tubul digestiv, dar put&nd coloniza i cile urogenitale, sunt
responsabili de infecii urinare% infecii biliare% seticemii i
endocardite, dar semnificaia lor patologic trebuie interpretat cu
pruden, strict comparabil cu cea streptococic i in&nd seama
de multirezistena enterococilor la antibiotice.
Stretococii din celelalte grue sunt frecvent comensali,
prezeni predominant n cavitatea bucal i faringe: S. "iridans% S.
mutans% S. sanguis, care pot fi izolai de la cazuri cu endocardit.
,.1.,. Di!)#4(ti$'l &ire$t
,.1.,.1. Prele6!re!
5atorit localizrii predilecte a streptococilor n faringe,
principalul produs care se va recolta pentru diagnostic este
e!sudatul faringian. Acesta va fi recoltat dimineaa, folosind
tampoane faringiene sterile, cu precauii pentru a se evita
mbibarea tamponului cu saliv, urmrindu-se numai tamponarea
faringelui i a amigdalelor. ;n infecii cu alt localizare se va recolta
produsul adecvat.
,.1.,.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
5eoarece n faringe e!ist ntotdeauna streptococi
comensali, e!amenul microscopic al secreiei faringiene este lipsit
de semnificaie, dar prezint importan raportul dintre aceti
germeni i alii care se gsesc obinuit n cavitatea bucal i
faringe %fig. /6(, descriindu-se n detaliu germenii observai,
cantitatea, aspectul dup coloraia ?ram etc.
5ac produsul provine din puroi sau lichide biologice,
prezena streptococilor %coci ?ram-pozitivi dispui n lanuri( are
valoare orientativ %fig. /.(.
152
Fi). >,< A-e(te$ &e &i0erite ("e$ii &e :!$terii $4-e#(!le $e "4t 0i
)%(ite =# e;('&!t'l 0!ri#)i!#F (tre"t4$4$i 5!7E "#e'-4$4$i 5:7E
&i"l4$4$i Gr!-<#e)!ti6i 5Nei((erii $4-e#(!le7 5$7E :!$ili Gr!-<
#e)!ti6i 5&7E (t!0il4$4$i 5e7
,.1.,.1. I4l!re!
+e face prin cultivare pe geloz - s&nge, bulion glucozat
3,6H cu cristal violet i azid AAA de sodiu %mediul $icNe(, eventual
replicarea coloniilor din cultura primar pe medii: agar-bil-esculin
%A,<( pentru streptococii de grup 5 i pe A,< U bulion salin pentru
enterococi.
153
Fig. 6M. Stretococi aezai n lanuri% ntr-un frotiu din uroi
,.1.,.8. I&e#ti0i$!re!
Proprieti morfotinctoriale
+unt coci ?ram-pozitivi, aezai n lanuri, uneori foarte
lungi, rar izolai sau n diplo %fig. /*(.
Fig. 6L. Stretococi ntr-un frotiu din cultur
154
Proprieti de cultur
+treptococii sunt germeni aerobi-anaerobi facultativi. ;n
cultura primar %a produsului( unele tulpini de streptococi cresc
bine pe medii n anaerobioz. Acestea sunt surse anaerobe
prefereniale, aero-tolerante graie unui sistem flavoproteinic.
+treptococii patogeni necesit pentru dezvoltare medii de cultur
cu adaus de proteine native: s&nge, ser, lichid de ascit. $e medii
lichide nu tulbur mediul, form&nd un sediment redus ca volum,
care prin agitare se disperseaz sub form de grun'i %dezvoltare
granular(. $e bulion cu s&nge, cultura se dezvolt cu eliminarea
hemoglobinei n urma hemolizei, sub aciunea streptolizinelor.
$e geloz-s&nge apar colonii mici, cu zon complet sau
incomplet de hemoliz %descriere la nceputul acestui capitol(.
Structura anti#enic
+tructura cea mai superficial a streptococului de grup A
este o capsul a crei compoziie i ofer proprieti antigenice,
alturi de cele ale structurilor peretelui celular: polizaharidul C i
proteinele ", 9 i 1. %fig. /-(.
Poliza*aridul ! caracterizeaz, prin compoziia sa chimic
i proprietile sale antigenice, fiecare grup streptococic.
Aceasta st la baza clasificrii lui Gancefield n cele )8 grupe
antigenice ale streptococilor DgrupabiliE. Adentificarea streptococului
-hemolitic de grup A ca i a celorlali se face prin e!tragerea
carbohidratului C %prin tratare la cald cu acid clorhidric sau prin
tratare enzimatic( i utilizarea lui n reacii imune cu seruri
standard de grup A, ,, C, 5, = i ?, grupe care se nt&lnesc la om.
;n acest scop se folosesc reacii de precipitare inelar sau reacii
de aglutinare pe lam a particulelor de late! sensibilizate sau prin
tehnica de coaglutinare a tulpinii CoSan A pe care se leag, prin
=c-ul lor, Ag? din serurile de grup.
155
Fi). >*. Str'$t'r! "eretel'i Stre"t4$4$'l'i H<9e-4liti$ &e )r'" A
Proteinele '% $ i 4 ale streptococilor de grup A permit
diferenierea mai multor serotipuri. Proteina ', fiind specific de
tip, ofer posibilitatea separrii a peste /3 de serotipuri,
constituind, n acelai timp, factorul maFor de "irulen a
streptococului de grup A, prote'&nd bacteria de fagocitoz.
4estul la bacitracin permite identificarea rapid a
streptococilor de grup A, uniform sensibili la acest antibiotic, iar cei
non-grup A sunt rezisteni. 5ar sensibilitatea la bacitracin poate fi
detectat i la unele tulpini de streptococi `-hemolitici de grup C, ?
i < i astfel testul pozitiv la bacitracin poate fi comunicat ca
streptococ `-hemolitic prezumtiv de grup A.
4estul !-'P realizeaz o ncadrare provizorie a unei tulpini
n grupul ,. $e o geloz cu s&nge se inoculeaz un striu dintr-o
cultur de stafilococ -hemolitic i perpendicular pe acesta, dar
oprindu-se la o distan de ) cm, se nsm&neaz n striu cultura
de streptococ. +treptococii din grupul , produc factorul CA"$ care
mrete zona de hemoliz a stafilococului, astfel c la nt&lnirea
celor dou striuri apare o zon de hemoliz mai intens.
"a'oritatea streptococilor de grup , produc proteina
difuzabil %factorul CA"$( care acioneaz sinergic cu `#
hemolizina stafilococic i determin liza complet a hematiilor n
mediul de cultur.
Proprieti de pato#enitate
+treptococii patogeni elaboreaz peste 63 de produi
156
e!tracelulari to!ici i neto!ici rspunztori de marea varietate a
infeciilor provocate de acetia. :nele dintre aceste produse sunt
puternic antigenice i determin apariia de anticorpi specifici utili
pentru diagnostic.
4o0inele eritrogene sau e!oto!inele pirogene streptococice
sunt responsabile de erupia scarlatinoas %e!antemul i
enantemul(. <le sunt sintetizate de streptococi din grupul A care
sunt supui unei conversii lizogenice de ctre un bacteriofag
specific.
Stretolizina > este o hemolizin o!igeno-sensibil cu efect
cardioto!ic i antigenic. ;n urma unei infecii cu streptococ de grupa
A, creterea titrului de antistreptolizin 7 %A+G7( permite un
diagnostic serologic retrospectiv utilizat, mai ales, pentru
diagnosticul complicaiilor post-streptococice.
Stretolizina S este o hemolizin citoto!ic neantigenic.
$roduce hemoliza beta din 'urul coloniilor de streptococi din
grupurile A, C, ?, G.
Stretodornaza ) %dezo!iribonucleaza de tip ,( este o
enzim specific ale crei proprieti antigenice sunt utilizate
pentru diagnosticul serologic al complicaiilor post-streptococice.
Antistreptodornazele i A+G7 sunt anticorpii cei mai frecvent
cercetai.
StretoDinaza %fibrinolizina( este o protein antigenic ce
induce apariia antistreptoNinazei %A+>( i este sintetizat de
streptococii de grup A, C i ?.
.ialuronidaza este o protein antigenic ce polimerizeaz
substana fundamental a esutului con'unctiv. Cercetarea
antistreptohialuronidazei %A+J( poate fi util pentru un diagnostic
de complicaie post-streptococic neacompaniat de creterea
altor anticorpi.
,.1.1. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
,.1.1.1. Di!)#4(ti$'l (er4l4)i$
*eacia AS(/ evideniaz anticorpii antistreptolizin 7 din
serul bolnavilor. $entru titrarea anticorpilor se pune n contact
streptolizina 7 standard cu o serie de diluii din serul de cercetat.
157
5up incubare )- minute la .0
3
C %pentru a permite eventualilor
anticorpi s neutralizeze streptolizina( se adaug o suspensie de
hematii i se incubeaz din nou *- de minute la .0
3
C %acolo unde
streptolizina nu a fost neutralizat, se produce liza hematiilor(.
1itrul reaciei, e!primat n uniti A+G7, este dat de diluia din
ultima eprubet n care hematiile au rmas nelizate. $entru tehnica
standardizat diluiile se fac astfel nc&t s se realizeze
urmtoarele uniti: )6, -3, )33, )6-, )//, 6-3, ..., -33, /6-,...,
)6-3. 9eacia este pozitiv %semnificativ( peste 6-3 de uniti
A+G7. 7 cretere semnificativ a titrului de anticorpi n dou seruri
prelevate la 0 i )- zile interval are o mare valoare diagnostic.
5etectarea simultan a creterii titrului A+G7 i a anticorpilor
antistreptodornaz , este considerat, de asemenea, important
n diagnosticul serologic al complicaiilor post-streptococice %vezi i
)./.*.).(.
+e mai consider util cercetarea antistreptoNinazelor i
antistreptohialuronidazelor. +e semnaleaz e!istena unui test ce
ar permite evaluarea global a nivelelor de anticorpi serici
antistreptococici, test de mare interes ce va permite o depistare
rapid.
,.1.1.,. Di!)#4(ti$'l :i4l4)i$
+e utilizeaz n diagnosticul scarlatinei: boal general
caracterizat printr-o erupie cutaneo-mucoas, urm&nd primei
faringite cu un streptococ de grup A %lizogenizat( productor de
eritroto!in. Amunitatea antito!ic %cu nivele crescute de anticorpi
specifici( poate fi de durat mai lung sau mai scurt. <a poate fi
testat prin teste intradermice al cror principiu se bazeaz pe
proprietatea eritroto!inei %5icN( de a produce erupie cutanat i pe
capacitatea anticorpilor %antito!inei( de a neutraliza to!ina i a
mpiedica producerea efectului eritrogen al acesteia.
*eacia Sc+ultz"+arlton %fenomenul de stingere a
erupiei( are dou variante:
- rocedeul direct # ntr-o erupie suspect de scarlatin
se inoculeaz intradermic 3,6 ml ser de convalescent %cu
certitudine trecut prin infecia scarlatinoas(. Antito!ina
158
%anticorpii antito!ici( din serul inoculat provoac n )2-6*
de ore dispariia local a eritemului scarlatinos i las
nemodificat un eritem de alt etiologie
- rocedeul indirect # ntr-un eritem sigur scarlatinos se
inoculeaz intradermic 3,6 ml ser de la convalescentul
unei boli eruptive fr diagnostic precizat.
*eacia 4ic2
<ste o reacie de neutralizare to0in 8 antito0in in vivo i
se efectueaz in'ect&nd intradermic pe faa anterioar a
antebraului, n volum de 3,) ml, o doz reactiv cutanat %) +15(
de to!in 5icN, iar la antebraul opus to!in fiart %martor T to!in
inactiv(. 7 doz # ) +15 # de to!in 5icN produce un eritem cu
un diametru de cel puin )3 mm n absena anticorpilor %reacie
5icN pozitiv(. Gipsa eritemului la locul de inoculare a to!inei arat
e!istena anticorpilor n s&ngele bolnavului testat. 5ac eritemul
apare la ambele antebrae, se interpreteaz fie ca o reacie
alergic la antigenele streptococice, fie ca o reacie combinat #
reacie 5icN pozitiv %lipsa anticorpilor i susceptibilitate fa de
infecia scarlatinoas( i reacie alergic.
,.1.8. I#0e$3i! "#e'-4$4$i$% 5Stre"t4$4$$'(
"#e'-4#i!e7
$neumococul, Stretococcus neumoniae, aparine genului
+treptococcus, fiind coc aero-anaerob, #ram-oziti". <ste o
bacterie comensal n rinofaringe, dar n numr mic la om.
$neumococul are un rol etiologic aparte n infecii variate, uneori
grave i chiar mortale.
/nfeciile neumococice mai importante sunt:
- infecii bron*oulmonare # responsabili n peste -3H din
pneumoniile bacteriene, pneumococii fiind ageni
etiologici ai pneumoniei france lobare acute, dar i a
bronhopneumopatiilor, bronitelor i pleureziilor, precum
i a complicaiilor septicemice n peste .3H din cazuri
- infecii >$5: otite acute susceptibile de complicaii ca
159
mastoidite, sinuzite i meningite
- meningite primitive %infecie primar( sau secundare, cu
prognostic sever
- infecii mai rare: artrite% endocardite% eritonite etc.
$rezeni la numeroi purttori sntoi, pneumococii sunt
considerai ca bacterii cu transmitere interuman neepidemic i
care produc boala acolo unde gsesc teren favorabil.
,.1.8.1. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
Prelevarea produselor
$relevarea se face n funcie de localizarea infeciei:
e0ectorate sau recoltri diri'ate din cile bronice inferioare n
cazul infeciilor pulmonare, secreie otic, 5!$, s3nge etc., n
celelalte localizri. Jemoculturile pot fi pozitive la cazurile cu
pneumonie sau meningit.
Examenul microscopic direct
<!amenul microscopic din produsul patologic, pe frotiuri
colorate ?ram, are o importan ma'or datorit morfologiei
caracteristice a pneumococilor: dilococi #ram-oziti"i lanceolai
ncasulai. ;n e!pectorate se evideniaz diplococi capsulai cu
morfologie caracteristic, alturi de alte elemente prezente, iar n
puroi se vd pneumococi i numeroase leucocite
polimorfonucleare %fig. //(. 5ac pneumococii sunt n numr mare,
se poate completa e!aminarea cu testul de umflare a capsulei al
lui @eufeld, bazat pe proprietile antigenice ale pneumococilor
%vezi identificarea(.
160
Fi). >>. Streptococcus pneumoniae =#$!"('l!3i? "e '# 0r4ti'
e0e$t'!t &i# 0i$!t &e 24!re$e i#0e$t!t e;"eri-e#t!l.
$zolarea
+e face prin nsm&narea pe medii cu proteine native
%geloz-s&nge, geloz-ascit( i pe geloz-chocolat cu incubare n
atmosfer de C7
6
)3H. $e geloz-s&nge, pneumococul se
dezvolt sub forma unor colonii mici %) mm diametru(, ncon'urate
de o zon de hemoliz alpha %verzuie(, iar pe geloz-chocolat
colonia este delimitat de o zon galben-verzuie.
9ezultate bune se pot obine prin inocularea produsului
patologic intraperitoneal la oarecele alb. 5ac este prezent un
pneumococ virulent, n 6*-*2 ore oarecele moare prin septicemie.
5ac se cultiv s&ngele recoltat din cordul animalului, se va obine
cultur pur de pneumococ. ;n frotiurile fcute din amprente de
splin sau ficat se evideniaz numeroi diplococi ?ram-pozitivi cu
capsul %fig. //(.
$dentificarea
Prorietile morfotinctoriale. $neumococii sunt germeni
?ram-pozitivi, lanceolai, aezai n diplo, cu capsul, mai ales n
161
produsul patologic i mai puin n cultur.
Prorietile de cultur. $e medii adecvate, coloniile sunt
mici, transparente, plate, cu alpha#hemoliz. Cultivai pe bulion
1iem, se poate evidenia proprietatea de bilioliz a pneumococului.
:n test valoros de identificare a pneumococilor l constituie
sensibilitatea lui la otoc*in cultura fiind inhibat n 'urul rondelelor
mbibate cu aceast substan %fig. /0(.
Prorieti bioc*imice. $neumococul fermenteaz inulina pe
mediul
Jiss.
Fi). >+. Te(t'l &e (e#(i:ilit!te l! 4"t4$9i#. S'"eri4r? te(t'l "4iti6
5"#e'-4$4$i7. I#0eri4r? te(t'l #e)!ti6 5!lte ("e$ii &e (tre"t4$4$i7.
Prorieti antigenice. Adentificarea serologic a tulpinilor de
pneumococ # prin reacia de umflare a capsulei sau prin recia de
aglutinare # este posibil n ara noastr pentru serotipurile ), 6 i
..
4estul de umflare a casulei %testul @eufeld( se realizeaz
pun&nd n contact pe lama de sticl c&te o pictur din cultura de
pneumococ cu seruri antipneumococice de tip, precum i o
pictur dintr-o soluie de albastru de metilen. +e e!amineaz la
microscop ntre lam i lamel i se constat o mrire de volum a
capsulei, acolo unde e!ist coresponden ntre tulpina de cercetat
i tipul serului standard.
<videnierea antigenelor capsulare solubile poate fi realizat
n GC9, lichidele peritoneale i s&ngele bolnavilor, fiind de mare
162
interes pentru un diagnostic rapid i n caz de infecii decapitate
prin antibioterapie.

,.8. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
NEISSERII
?enul Neisseria cuprinde coci ?ram-negativi, strict aerobi,
diplococi uniformi, catalazopozitivi i o!idazopozitivi, din care se
disting:
163
- dou secii atogene specifice pentru om: Neisseria
gonorr*oeae %gonococul( i Neisseria meningitidis
%meningococul(
- numeroase secii comensale: N. fla"a% N. sicca% N.
lactamica etc., bacterii ce se comport din punct de
vedere al patogenitii ca oportuniste %produc boala
numai n anumite condiii, favorizante(.
- Neisseria catarr*alis a fost reclasificat n genul
)ran*amella.

,.8.1. Di!)#4(ti$'l i#0e$3iil4r )4#4$4$i$e

?onococul este o bacterie patogen strict uman, agent
etiologic al gonoreei %blenoragiei(, boal veneric frecvent nt&lnit
sub form de infecie acut local care, netratat corect, se
cronicizeaz duc&nd la complicaii. Cea mai frecvent este uretrita
gonococic %anterioar - n faza acut( la brbat "ul"o"aginita i
cer"icita gonococic la femeie. $rin infectarea ftului, n timpul
travaliului, de la mama blenoragic, se poate produce oftalmia
gonococic a noului nscut.
:retrita gonococic anterioar, acompaniat de secreie
purulent %de obicei verzuie(, cu dureri la miciune, dup o
perioad de incubaie de .-- zile, uneori mai multe zile, se poate
complica dac nu este tratat, propag&ndu-se n cile genitale,
d&nd infecii ale epididimului, prostatei i testiculelor.
,lenoragia la femei, contrar celei de la brbat, debuteaz
asimtomatic, pentru a deveni evident dup e!tinderea infeciei la
nivelul uretrei, de obicei nsoit de bartholinit %c&nd se poate
recolta secreie purulent de la nivelul glandelor ,artholin(, dar -
cel mai frecvent - bolnava se prezint la consultaie pentru
leucoree, n acest caz constat&ndu-se de regul i o recidiv, ce
se poate complica mai t&rziu cu peritonit.
De reinut: gonococul fiind foarte fragil, nu supravieuiete n
164
mediul e!tern, de aceea, contaminarea are loc prin contact direct
%n raporturile se!uale(. 5epistarea i tratarea unui bolnav nu are
deplin utilitate dec&t dac este completat cu depistarea i
tratarea partenerului.
,.8.1.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
;n diagnosticul acestor afeciuni se apeleaz numai la
diagnosticul bacteriologic %direct(, deoarece nu dispunem la ora
actual de reacii imunologice sensibile, fiabile i specifice.
*ecoltarea produselor patolo#ice
5a brbat, n cazul uretritelor acute, se recolteaz puroi
uretral, cu ansa ori cu un tampon subire, iar n formele subacute,
dac secreia uretral este minim i intermitent, se face o
recoltare matinal %pictura matinal(, naintea primei miciuni. ;n
leziuni e!tinse, se practic recoltarea secreiei prostatice dup
masa' prostatic concomitent cu efectuarea unei spermoculturi.
5a femeie, se fac sistematic, mai multe prelevri: de la
nivelul uretrei, orificiilor glandelor )art*olin% endocolului.
<ste preferabil ca recoltarea s se fac n laborator, iar -
dac produsele se vor transporta - este necesar folosirea mediilor
de transport.
Examenul microscopic direct
$rezint un interes deosebit pentru diagnostic n uretritele
acute ale brbatului, n care %dup etalarea frotiului i colorarea cu
albastru de metilen i coloraie ?ram( se pun n eviden diplococii,
reniformi, intracelulari, #ram-negati"i %fig./2(.
165
Fi).>. D )eisseria #onorr+oeae =#tr<'# 0r4ti' &i# (e$re3ie 'retr!l%
5"'r4i )4#4$4$i$7. M!I4rit!te! )4#4$4$il4r ('#t i#tr!$el'l!ri? =#
PMN.
;n celelalte forme de gonoree, n particular n uretritele
cronice la brbat i infeciile genitale la femeie, germenii specifici
sunt rari sau predomin flora bacterian asociat, fapt pentru care
e!amenul microscopic este puin relevant, iar cultivarea produselor
este un mi'loc mai eficient de diagnostic bacteriologic.
ultivarea #onococilor
Cultivarea produselor pentru izolarea gonococilor este
delicat i necesit nsm&narea imediat dup prelevare pe medii
%prenclzite( "ueller-Jinton cu s&nge sau pe medii chocolat.
"ediile nsm&nate se incubeaz *2 ore la .0
3
C n atmosfer de
bio!id de carbon )3H.
$dentificarea
166
!riterii morfologice: coci ?ram-negativi n diplo %aspectul
boabelor de cafea(.
!riterii de cultur: colonii opace, gri, granulare, conve!e,
strlucitoare, de )-6 mm diametru.
!aractere bioc*imice: sunt germeni catalazo-pozitivi testul
o!idazelor este pozitiv i fermenteaz glucoza.
Antibiograma este obligatorie deoarece frecvena tulpinilor
rezistente la antibiotice este n continu cretere.
,.8.,. Di!)#4(ti$'l i#0e$3iil4r $' -e#i#)4$4$i
Neisseria meningitidis, agentul cauzal al meningitelor
meningococice, este o bacterie cu patogenitate specific, adaptat
strict speciei umane, av&nd habitatul pe mucoasa cilor respiratorii
superioare, astfel c poate fi gsit n rinofaringele purttorilor
sntoi sau al bolnavilor cu rinofaringite manifeste clinic. ;n
condiii de scdere a rezistenei naturale iIsau a imunitii, prin
traversarea barierei mucoase, a'unge n curentul sanguin i, prin
acesta, n sistemul meningeal, unde poate produce dou tablouri
clinice principale:
- meningita cerebro-sinal, n care sindromul meningeal
are un debut brutal i care, n lipsa tratamentului,
provoac coma i moartea bolnavului
- forma seticemic sau meningococemia grav %cu febr
mare, DrashE cutanat etc.(, uneori mortal prin oc
endoto!ic.
;n afara acestor forme clinice grave, se pot observa
rinofaringite acute, otite, con'unctivite, pericardite, infecii
respiratorii etc.
Diagnosticul este numai direct -bacteriologic- e!aminarea
167
GC9-ului fiind una dintre cele mai urgente probe de microbiologie.
,.8.,.1. Re$4lt!re! "r4&'(el4r
GC9-ul se recolteaz n condiii de absolut sterilitate, c&t
mai aproape de debutul bolii i, de preferat, naintea nceperii
tratamentului cu antibiotice. ;n cazul meningitelor, de regul, GC9-
ul este opalescent sau purulent. ;n cazul n care aspectul lichidului
sugereaz o etiologie bacterian %lichid tulbure( se procedeaz la
nsm&nare la patul bolnavului a 3,6-3,- ml GC9 n tuburi cu:
bulion 1iem, geloz-s&nge i geloz-chocolat, iar transortul
flaconului cu GC9 i a tuburilor cu medii se face imediat i la
temperatur c&t mai apropiat de .0
3
C. Concomitent se recolteaz
i e!sudatul faringian, iar n cazurile cu debut sugestiv pentru
atingerea meningeal # hemocultura este obligatorie.
,.8.,.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
Anclude e!aminarea citologic pentru orientare i cea
bacteriologic dup coloraiile ?ram, Kiehl-@eelsen i coloraia
?iemsa.
;n meningitele acute bacteriene, pe l&ng prezena unui
lichid purulent, hipertensiv, se observ la e!amenul microscopic,
sute sau mii de elemente celulare pe mm
.
, cu predominana net a
polinuclearelor. ,acterioscopia evideniaz coci #ram-negati"i, n
diplo, deseori intracelulari.
,.8.,.1. I4l!re!
+e face %n afara mediilor amintite mai sus( pe geloz-s&nge
"ueller-Jinton glucozat, cu ageni selectivi %lincomicin i
colimicin( care inhib dezvoltarea florei comensale %de e!emplu,
neisseriile comensale oro-faringiene(. "ediile de cultur se
168
incubeaz n atmosfer de bio!id de carbon, la .0
3
C. 5up )2-6*
de ore, meningococii se dezvolt sub forma unor colonii +,
rotunde, nepigmentate, nehemolitice, Dasemeni picturilor de rouE.
,.8.,.8. I&e#ti0i$!re!
aracterele morfotinctoriale ale germenilor izolai prin
cultivare arat, la e!amenul microscopic al culturii, diplococi ?ram-
negativi sau ?ram-labili, cu frec"ente elemente celulare
%bacteriene( lizate.
Proprietile de cultur sunt, n primul r&nd, legate de
creterea pe mediile selective fiind strict aerob, crete numai la
temperatura de .0
3
C i incubat n atmosfer de C7
6
)3H. 5up 6*
de ore, coloniile sunt translucide, lenticulare, de aspect cenuiu.
aracterele bioc+imice de mare importan sunt date de
reacia o!idazei %dup metoda >ovacs(, pozitiv la grupul
Neisseria, la meningococ fiind nsoit de fermentarea glucozei i
maltozei, fr producere de gaz.
aracterele anti#enice se bazeaz pe prezena unui
poliozid capsular antigenic i a unor proteine din membrana
e!tern, ambele av&nd specificitate ce permite definirea mai multor
serogruuri: A, ,, C, P, a, K, 68<, W).- etc., precum i a
diverselor serotiuri cu importan epidemiologic.
$ractic, ncadrarea n aceste grupe se face cu a'utorul
serurilor standard. 9eacia de precipitare Bincent-,ellot utilizeaz
GC9 n care se gsesc antigene de natur polizaharidic eliberate
prin autoliza meningococilor, care - n contact cu serul
antimeningococic - formeaz un inel de precipitare. 9eacia
amintit se poate realiza i prin tehnici de imunofluorescen i
contraimunoelectroforez, permit&nd identificarea antigenelor
169
meningococice, direct n GC9.



,.*. DIAGNOSTICUL DIFTERIEI
Agentul etiologic al difteriei, !or,nebacterium di*t*eriae,
este reprezentantul %specia tip( genului !or,nebacterium, n care
sunt reunite numeroase alte specii bacteriene, dintre care se cer
amintite cele comensale, prezente n microbiocenoza faringian i
cutanat: !. 0erosis, !. *offmani etc., cunoscute sub denumirea
de pseudodifterici sau difteromorfi, cu care bacilul difteric se poate
confunda n cadrul e!amenului de laborator.
Difteria se datoreaz to0iinfeciei, caracterizat prin:
- angin seudomembranoas %crup difteric(, dat de
false membrane ce pot acoperi amigdalele, pilierii i
170
vlul palatin, ntinz&ndu-se spre faringe i produc&nd
asfi!ie prin obstrucie laringian
- efectele to0ice %to!emia( la distan, date de e0oto0ina
difteric care difuzeaz n organism n timp ce bacilul
difteric rm&ne localizat i se nmulete n faringe.
-lte localizri=
- pe mucoase, produc&nd: rinita difteric, con'unctivit
etc.
- pe tegumente, unde bacilul difteric poate infecta leziuni
cutanate pree!istente, d&nd ulceraii profunde, cu stare
general alterat.
;n cadrul speciei !or,nebacterium di*t*eriae au fost
separate, pe baza unor proprieti patogenice, trei tipuri: gra"is,
izolat iniial din forme grave de boal mitis, izolat n general din
forme clinice mai uoare, i tipul intermedius.
,.*.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
5iagnosticul de laborator urmrete izolarea bacililor difterici
de la bolnavi sau de la purttori i identificarea lor.
,.*.1.1. Prele6!re! "r4&'(el4r "!t4l4)i$e
;n angina difteric se recolteaz e!udat faringian -trei
tamoane- urmrind detaarea unor poriuni din falsa membran
sau din depozitele aderente de pe amigdale. $entru depistarea
purttorilor, se recolteaz un tampon faringian i unul nazal. ;n alte
forme clinice, se prelev secreia purulent din leziune,
concomitent cu investigarea cavitii nazale i a faringelui.
171
,.*.1.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
5in primul tampon recoltat de la bolnav se fac dou frotiuri:
unul pentru coloraia ?ram, cellalt pentru coloraia special del
7ecc*io # prin care se evideniaz corpusculii metacromatici
,abe-<rnst. <!amenul microscopic al frotiului evideniaz bacili
#ram-oziti"i de form caracteristic %fig./8(: drepi sau uor
ncurbai, cu una sau ambele e!tremiti umflate %corOne T
mciuc(, datorit corpusculilor metacromatici. Aezarea n frotiu
sugereaz litere chinezeti.
Fi). >B D A("e$te !le :!$ilil4r &i0teri$iF
!< &i("'2i =# r@#&'riE :< &i("er(!3iE $< =# 04r-% &e V.
,.*.1.1. I4l!re!
Al doilea tampon recoltat de la bolnav sau tamponul de la
purttor se introduce n mediul de mbogire 7C+1 %ou-cistein-
172
ser-telurit de >( i se incubeaz )2-6* ore la .0
3
C, dup care se
fac treceri din acest mediu, pe un mediu selectiv # mediul 1insdale.
Al treilea tampon de la bolnav este nsm&nat pe:
- mediul GMffler, mediu de elecie, care permite o
dezvoltare mai rapid %)6 ore( a bacilului difteric
- mediul 1insdale cu telurit de >, pe care bacilul difteric d
colonii mici, negre, cu halou brun, iar difteromorfii
prezint colonii negre, lucioase, fr halou %plana AAA-.(
- mediul geloz-s&nge, pe care se va face izolarea
eventualilor streptococi -hemolitici, cu care bacilul
difteric poate coe!ista.
,.*.1.8. I&e#ti0i$!re!
Proprieti morfotinctoriale
+e fac de obicei frotiuri din culturile izolate pe mediul GMffler.
Coloraia ?ram permite evidenierea bacililor ?ram-pozitivi
caracteristici, iar coloraia del Becchio evideniaz corpusculii
metacromatici care apar colorai n brun #verzui, iar corpul
bacterian n galben.
aracterele de cultur
,acilul difteric este aerob, microaerofil, creterea lui este
favorizat de adugarea cisteinei i a proteinelor native.
5up aspectul culturii pe medii solide, ?bndel-1ietz i
GMffler, precum i n mediile lichide, se recunosc cele trei tipuri de
bacil difteric:
- gra"is: pe mediu solid crete sub form de colonii
rugoase al cror aspect a fost comparat cu o floare de
margaret mediul lichid este limpede, cu pelicul
granular i depozit
- mitis: colonii de tip +, netede, untoase, bine delimitate
173
tulbur uniform mediul
- intermedius: colonii rotunde cu suprafa neregulat
medii lichide limpezi, cu depozit.
aracterele bioc+imice
<!ist teste care urmresc definirea speciilor din genul
!or,nebacterium i a tipului %gravis i nongravis( n cadrul speciei.
Astfel, !or,nebacterium di*t*eriae fermenteaz glucoza i
maltoza, produc&nd hidrogen sulfurat %test negativ la difteromorfi,
care fermenteaz mai multe zaharuri(. 1ipul gravis descompune
de!trina, amidonul i glicogenul, spre deosebire de celelalte dou
tipuri.
1estele biochimice convenionale se fac pe medii de cultur,
cum este mediul Jiss n care s-au ncorporat substanele mai sus
amintite i un indicator de pJ, indicatorul Andrade.
DCorOnetestulE este un test miniaturizat destinat identificrii
biochimice la corOnebacterii. +ubstratul este reprezentat de
microdiscuri impregnate cu zaharuri, av&nd ca indicator albastru de
bromtimol. <ste un test rapid i se efectueaz n plci din plastic cu
godeuri. ;n fiecare godeu se repartizeaz c&te 6 discuri din fiecare
zahar, n ordinea cunoscut: glucoz, zaharoz, de!trin, glicogen,
peste care se adaug c&te - picturi dintr-o suspensie dens de
cultur n ser fiziologic. +e incubeaz placa %acoperit cu un
capac( la .0
3
C, timp de * ore, dup care se citete reacia.
Anterpretare: galben T pozitiv %UU( galben-verde T slab pozitiv %U(
albastru T negativ.
Teste de pato#enitate
+e utilizeaz pentru evidenierea proprietii de
to!inogenez.
4estul de to0inogenez in "itro <leN-7uchterlonO permite
determinarea elaborrii de e!oto!in difteric, prin metoda de
precipitare n gel %fig.03(.
174
Fi). +/ D Te(t'l EleC "e#tr' e6i&e#3iere! t'l"i#il4r t4;i)e#e
&e or,nebacterium dip+t+eriae
4e*nica. ;n plci $etri cu geloz preparat cu ser de bou, se
depune o band de h&rtie de filtru %steril( mbibat cu ser antito!ic
%ser antidifteric ce conine anticorpi antito!in(. $erpendicular pe
banda de h&rtie de filtru se nsm&neaz: tulpinile de cercetat un
martor sigur to!igen i un martor neto!igen. 5up 6* de ore de
incubare la .0
3
C, tulpinile to!igene vor prezenta linii de precipitare
la locul de nt&lnire dintre to!in i anticorp %!or,nebacterium
di*t*eriae to!igen(.
4estele de atogenitate in "i"o se efectueaz prin:
- inoculare intradermic la iepure %testul =raser( a unui
filtrat din cultur de bacili difterici to!igeni i urmrirea
reaciei dermatonecrotice %necroza esuturilor dermice(
care apare la 6 # . zile la locul inoculrii %reacia nu
apare dac animalul este prote'at cu ser antidifteric(
- inoculare subcutanat la cobai a unui filtrat de cultur
pentru testat. ;n cazul unei tulpini to!inigene, cobaiul
175
moare n urmtoarele 6* # *2 de ore, prezent&nd semne
specifice de into!icaie difteric. ;n schimb, cobaii
prote'ai cu ser antidifteric nu vor prezenta semne de
boal.
Anocularea to!inei la cobai a permis stabilirea unitii de
msur #in vivo- a dozei limit mortale # 5G". 7 doz limit
mortal %) 5G"( de to!in difteric este cantitatea de to!in care
omoar un cobai de 6-3 g n patru zile.
5izotiia se practic n scop epidemiologic, fiind util
identificrii tulpinilor de !or,nebacterium di*t*eriae cu a'utorul
unui set de )8 bacteriofagi.
,.*.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
<ste util pentru testarea imunitii antidifterice n colectiviti
i pentru controlul eficienei vaccinurilor.
$entru investigarea nivelului de imunitate al populaiei se
utilizeaz testul intradermic Sc*icD, test de neutralizare to!in #
antito!in. $rin acesta se stabilete dac un individ este susceptibil
de a face boala sau este imun.
1estul +chicN se practic prin inocularea intradermic la
antebraul drept a 3,6 ml to!in difteric cu un coninut de )I-3 din
5G", iar la antebraul st&ng se inoculeaz martorul +chicN
%aceeai to!in nclzit la 23
3
C, timp de 63 de minute(. Citirea
reaciei se face la *2 de ore: lipsa anticorpilor antito!ici circulani
se traduce prin apariia unei reacii eritematoase, care poate varia
ca mrime i intensitate, lu&ndu-se ca reacie pozitiv cea indicat
de un eritem cu diametrul de minimum )3 mm. 9eacia negativ
arat c n s&ngele individului e!ist peste 3,3. :AIml antito!in
difteric, cantitate numit i titru minim protector.
Apariia eritemului i la antebraul st&ng %pseudo-reacie(
arat o alergizare la proteinele to!ice difterice.
Ga persoanele cu reacie +chicN pozitiv %care nu au
anticorpi la titrul minim protector( se practic vaccinarea cu
176
anato0in difteric # vaccin puternic ce confer o imunitate solid.
Baccinarea antidifteric presupune un program de aplicare
riguroas cu vaccinuri asociate, ca de e!emplu: trivaccinul # cu
respectarea dozelor i intervalelor, fapt ce poate duce la o reacie
+chicN negativ la cel puin 8-H din persoanele vaccinate.
,.>. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
BACILLUS I LISTERIA
,acilii ?ram-pozitivi, alii dec&t cei din genul
!or,nebacterium, cu pondere mai redus n patologia infecioas,
au caractere morfologice i de cultur asemntoare, fiind prezeni
n cadrul florei bacteriene a unor caviti deschise. ;n funcie de
dezvoltarea pe medii de cultur au fost mprii n dou grupe:
- bacili ?ram-pozitivi cu dezvoltare rapid: )acillus%
5isteria% +r,sielot*ri0 i 5actobacillusJ
- bacili ?ram-pozitivi cu dezvoltare lent: -ctinom,ces%
Nocardia i unele specii din genul ',cobacterium.
,.>.1. B!$ill'( !#t9r!$i(
177
?ermenii genului )acillus, cu o singur specie care are
semnificaie clinic deosebit # )acillus ant*racis sau bacteria
crbunoas # se pot separa uor prin caracterul lor morfologic
principal # prezena sporilor. =iind bacterii aerobe sau aerob-
anaerobe facultative, sporii pot lipsi n culturi tinere i n unele
produse patologice.
;n acest gen sunt cuprinse i specii bacteriene saprofite: ).
subtilis% ). cereus% ). olimi0a etc., care, datorit rezistenei
sporilor, pot contamina uor materialele medico-chirurgicale,
alimentele, mediile de cultur etc.
+ingura specie patogen la om, )acillus ant*racis %bacteria
crbunoas( produce crbunele la animale %ovine, bovine( #
antropozoonoz ce poate contamina omul prin contact cu animalul
bolnav sau cu produsele provenite de la acesta. ,acilii pot penetra
pielea la nivelul leziunilor acesteia i se nmulesc local, la poarta
de intrare, form&nd Eustula malignG ce se dezvolt, trec&nd prin
diferite stadii, p&n la acoperirea de o crust neagr %de unde i
numele de crbune(. 7 parte dintre bacili pot a'unge n s&nge,
produc&nd septicemie i localizri viscerale %intestinale, pulmonare
etc.(.
,.>.1.1. Di!)#4(ti$'l &e l!:4r!t4r
<ste direct i urmrete izolarea agentului etiologic din
produsele patologice.
*ecoltarea produselor
$rincipalul produs, serozitatea din ustul, se recolteaz cu
o pipet $asteur steril. ;n formele pulmonare se recolteaz sput,
178
iar n cele intestinale, materii fecale. ;n toate cazurile cu
septicemie, se recolteaz s&nge pentru hemocultur.
Examenul microscopic direct
$e frotiul colorat ?ram se vd bacili lungi ?ram-pozitivi,
ncapsulai %capsula apr&nd ca o zon clar n 'urul fiecrui bacil(,
aezai n lanuri %streptobacili( %fig.0)(. ;n lichidul din pustul, n
preparat nativ, se vd numeroi bacili lungi, imobili.
Fi). +1 D Pre"!r!t &i# $'lt'r% &e %acillus ant+racis? $' ("4ri 46!li
=# $e#tr'l :!$teriei.
$zolarea
)acillus ant*racis crete pe medii simple i pe geloz-s&nge
n condiii de aerobioz. $entru diagnosticul de laborator al
crbunelui este necesar i inocularea subcutan la oarecele alb
a produsului patologic, testul patogenitii pentru cobai oferind un
179
diagnostic de certitudine, deoarece inocularea este urmat, n
cazul infeciei crbunoase, de septicemie mortal.
$dentificarea
Prorietile morfotinctoriale: bacili lungi, groi, drepi, cu
capetele tiate drept, aezai n lanuri asemntor trestiei de
bambus %fig. 06(. +unt bacili capsulai, imobili i sporulai %cu sporul
situat central, mai mic dec&t diametrul celulei(.

Fi). +, D Pre"!r!t &i# $'lt'r% &e %acillus ant+racis
5(tre"t4:!$ili l'#)i? $' $!"etele t%i!te &re"t 2i $' !2e!re
$!r!$teri(ti$%7
Prorietile de cultur: sunt bacterii nepretenioase i cresc
pe medii simple, sub form de colonii uscate -de tip 9- glbui, cu
marginile dantelate, care emit filamente subiri, vizibile cu lupa,
comparate cu o coam de leu sau un cap de meduz. $e gelatin,
nsm&nat prin nepare, crete sub forma unui brad inversat,
lichefiind mediul n poriunea superioar. =iind proteolitic, cultura
se nsm&neaz pe plci cu gelatin, iar fenomenul apare dup 6-
. zile. $e ser coagulat apar colonii albicioase, care lichefiaz
mediul.
180
Prorietile bioc*imice: ). ant*racis este zaharolitic,
proteolitic i lichefiaz lent gelatina.
Prorietile antigenice: are un antigen capsular de natur
polipeptidic, un antigen proteic i altul polizaharidic, legai de
peretele celular. $rin e!tracie la cald, antigenul polizaharidic este
folosit n reacia Ascoli # pentru diagnosticul retrospectiv la
animalele moarte de infecie crbunoas.
!aracterele de atogenitate: inocularea subcutanat la
oarece determin septicemie i moartea animalului n 6*-*2 ore,
iar n amprentele din splin, colorate ?ram, se observ numeroi
bacili ?ram-pozitivi capsulai. Anfecia e!perimental la oarecele
alb este prob obligatorie pentru identificarea ). ant*racis.
,.>.,. Li(teri! -4#4$Ot4)e#e(
,acterie larg rsp&ndit n natur, poate contamina
produsele alimentare, iar la om poate fi nt&lnit la purttori
sntoi cu localizare digestiv tranzitorie, de aceea este
considerat ca un germen patogen oportunist. $entru e!plicarea
invaziei organismului i gravitatea bolii au fost invocate modificrile
date de imunodepresii, neoplazii, pacieni sub chimioterapie
ndelungat etc. Ga adult poate produce: meningite, meningo-
encefalite, septicemii i, mai rar, afeciuni cu localizare ocular,
79G, endocardite etc. +-au descris i forme materno-fetale date
de 5isteria monoc,togenes prin transmiterea de la mama aparent
sntoas la ft, produc&nd frecvent avort.
,.>.,.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
Prelevarea. $rodusele contaminate natural, ca: secreii
vaginale, esuturi, materii fecale, se recolteaz cu scopul de a fi
nsm&nate direct pe medii selective, iar cele necontaminate:
GC9, s&nge, avortoni, se e!amineaz microscopic i se trec pe
medii selective.
Examenul microscopic evideniaz bacili mici #ram-
oziti"i, mobili la 66
3
C. "a'oritatea acestora sunt intracelulari, n
monocite.
ultivarea se face pe un bulion cu tiogliconat de sodiu i,
181
din aceasta, se fac treceri pe geloz triptozat sau pe alte medii
comple!e, n primele zile acestea fiind incubate la *
3
C, apoi la
.0
3
C, c&nd se e!amineaz coloniile prin tehnica iluminrii oblice,
care permite evidenierea coloniilor cu irizaie albstruie de 5isteria
monoc,togenes.
$dentificarea se face prin teste biochimice: sunt catalazo-
pozitivi, produc fermentarea glucozei etc. mobilitatea la 66
3
C.
Adentificarea serologic se face cu ser polivalent i cu seruri de tip
n cadrul reaciilor de aglutinare.
,.>.,.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
5iagnosticul indirect se poate practica prin reacii de
hemaglutinare, 9=C etc., dar acesta ridic probleme, n primul
r&nd, legate de producia inconstant de anticorpi.
,.+. DIAGNOSTICUL TUBERCULOZEI
1uberculoza este o afeciune specific dat de bacterii din
genul ',cobacterium care cuprinde bacili acido-alcoolo-rezisteni,
aerobi, imobili, nesporulai, av&nd un perete celular glicolipidic
comple! care confer proprietile de acido-rezisten i caracterul
granulomatos al infeciei tuberculoase.
+e distinge un numr mare de specii de micobacterii, unele
fiind patogene pentru om i animale, altele saprofite # prezente n
ap, n sol, dar i n unele produse patologice.
"icobacteriile patogene care produc tuberculoza la om sunt:
- ',cobacterium tuberculosis %bacilul >och de tip uman(,
principalul agent cauzal al tuberculozei umane
- ',cobacterium bo"is # produce tuberculoza bovideelor,
dar i a omului
- ',cobacterium africanum # patogen pentru om %are
caractere intermediare ntre bacilul >och de tip uman i
cel de tip bovin(.
182
;n marea ma'oritate a cazurilor, tuberculoza are o localizare
ulmonar, put&ndu-se distinge:
- prima infecie tuberculoas
- tuberculoza pulmonar infiltrativ sau cavitar %forma
puternic contaminant(
- tuberculoza ganglio-mediastinal
- pleureziile tuberculoase
- tuberculoza miliar pulmonar.
5ocalizri e0traulmonare: meningeal, osoas, articular,
ganglionar, renal, suprarenalian, digestiv etc.
'icobacteriile zise atiice, pe l&ng cele saprofite sau
comensale umane, cuprind un numr important de bacterii
patogene oportuniste, responsabile de infecii numite
micobacterioze, cu localizare pulmonar, ganglionar sau
cutanat. 5iagnosticul de micobacterioz se bazeaz pe o serie de
criterii, dintre care izolarea repetat a aceleai specii de
micobacterie atipic, n absena bacililor tuberculoi, este condiia
esenial. =recvena mbolnvirilor cu micobacterii atipice este n
cretere, mai ales n rile n care tuberculoza este n scdere,
acest fapt dator&ndu-se i sindromului imuno-deficienei dob&ndite
%+A5A(, la aceti subieci nt&lnindu-se frecvente infecii
generalizate cu micobacterii.
<!ist mai multe clasificri ale micobacteriilor atipice, dintre
care cea mai frecvent acceptat este aceea care descrie patru
grupe principale de micobacterii.
#rua / sau micobacterii fotocromogene, ale cror
colonii se pigmenteaz dup e!punere la lumin:
- '. Dansasii # produce infecii pulmonare i
osteoarticulare, uneori ganglionare
- '. marinum # determin infecii cutanate.
#rua // sau micobacterii scotocromogene, ale cror
colonii se pigmenteaz n galben # oran'. Aceast
grup cuprinde specii saprofite gsite de obicei n
ap, dar i dou specii cu potenial de patogenitate:
- '. scrofulaceum # produce infecii ganglionare la copii
- '. szulgai # specie ce determin e!cepional infecii
183
pulmonare ganglionare sau cutanate.
#rua /// sau micobacterii necromogene, ale cror
colonii sunt, n general, nepigmentate:
- '. a"ium intracelulare # produce infecii pulmonare mai
ales ganglionare, osoase i articulare. <ste agentul
esenial al infeciilor generalizate cu micobacterii atipice
care se observ la bolnavii de +A5A
- '. 0enoi - specie mai frecvent gsit printre
micobacteriile responsabile de infecii pulmonare
- '. ulcerans - determin infecii cutanate.
#rua /7 8 cu cretere raid # ce se dezvolt n . #
- zile:
- '. fortuitum 8 c*elonei # produce abcese locale, n
principal la drogai.
,.+.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t !l t':er$'l4ei
,.+.1.1. Prele6!re!
$entru precizarea diagnosticului tuberculozei pulmonare se
recolteaz: e!pectoraia spontan sau provocat, suc gastric i
lichid pleural. $entru diagnosticul tuberculozei e!trapulmonare,
prelevarea depinde de localizarea infeciei.
<!pectoraia %sputa( const din fragmente mucopurulente
provenite din eta'ul bronhopulmonar i nu din rinofaringe, care
trebuie s conin c&t mai puin saliv. $entru bolnavii care nu
e!pectoreaz se utilizeaz metode de provocare a tusei prin
atingerea luetei cu un tampon laringian, spltura bronic cu
a'utorul unei seringi laringiene %cu soluie fiziologic steril( sau
prin aerosolizare cu o soluie de clorur de sodiu 2-)3H, care
produce o uoar iritare a cilor bronice i un refle! de tuse cu
e!pectoraie.
+e recomand recoltarea matinal de la acelai bolnav a
minimum trei eantioane de sput, la interval de o zi %n zile
diferite(. =iecare eantion se recolteaz ntr-un colector din plastic
cu capac %cu o singur utilizare(, iar prelucrarea produsului pentru
diagnostic se va face n ziua prelevrii.
184
+ucul gastric se recolteaz de la copii %sugar i copilul mic(,
care nu e!pectoreaz, ci nghit sputa. 9ecoltarea se face
dimineaa i se prelucreaz ntr-un timp c&t mai scurt posibil.
;n cazul suspiciunii de tuberculoz urinar se recolteaz
urina , din 'etul mi'lociu, n cantitate de -3-)33 ml %deoarece se
prelucreaz ntreaga cantitate prin centrifugare, diagnosticul
fc&ndu-se din sedimentul obinut(. +e recomand recoltarea a cel
puin / probe, fiecare dintre acestea prelucr&ndu-se n dimineaa
recoltrii.
$entru elucidarea diagnosticului de tuberculoz genital, la
brbat se recolteaz lichidul spermatic, iar la femeie s&ngele
menstrual %cu a'utorul unor aparate numite pesare ocluzive(.
;n alte forme clinice se recolteaz: GC9, lichid pleural,
peritoneal, articular, puroi etc.
,.+.1.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
=rotiul, efectuat direct din prelevat se coloreaz Kiehl-
@eelsen i se e!amineaz la microscopul cu imersie, unde apar
bacili acido-alcoolo-rezisteni %de culoare roie( pe un fond albastru
%format din elemente celulare i alte bacterii prezente n sput #
flora asociat(. ,acilii tuberculozei sunt drepi sau uor ncurbai,
subiri i, de obicei, granulai, dispui izolat sau n grmezi %plana
A-6(.
<!primarea rezultatului e!amenului bacteriologic se face
dup e!aminarea a cel puin )33 de c&mpuri microscopice, n
raport cu numrul de bacili acido-alcoolo-rezisteni ?b.a.a.r.@=
- negativcccccccccccccccc3 baciliI)33 c&mpuri
e!aminate
- dubioscccccccccccccc )-. baciliI)33 c&mpuri
e!aminate
- slab pozitiv %U(ccccccc *-8 baciliI)33 c&mpuri
e!aminate
- moderat pozitiv %UU(cc)3-)33 baciliI)33 c&mpuri
e!aminate
- intens pozitiv %UUU(ccccpeste )33 baciliI)33 c&mpuri
e!aminate.
Aceast e!primare cantitativ indic gradul de
185
contagiozitate al bolnavului.
!oloraia fluorescent a frotiului se e!ecut n laboratoare
specializate pentru diagnosticul tuberculozei, dotate cu
microscoape cu fluorescen. Aceast coloraie este efectuat cu
auramin-rhodamin %n locul fu!inei(, iar e!aminarea frotiului, cu
un obiectiv 63!, evideniaz bacili de culoare galben-portocaliu,
strlucitori. ;n aceste condiii, c&mpul microscopic acoper o
suprafa mare, ceea ce scurteaz timpul de e!aminare.
,.+.1.1. I4l!re!
Cultivarea produselor pentru diagnosticul de tuberculoz
este important deoarece: ofer rezultate pozitive n plus fa de
e!amenul microscopic permite izolarea n cultur pur a
micobacteriilor i identificarea acestora ofer posibilitatea testrii
sensibilitii micobacteriilor la antibiotice %antibiograma la
tuberculostatice(.
+peciile de micobacterii difer mult ntre ele n ce privete
viteza de multiplicare i necesitile nutriionale. Astfel se e!plic
dezvoltarea unor micobacterii atipice n --)6 zile de la nsm&nare
i a altora, ca '. ulcerans care se dezvolt, n condiii similare,
dup o incubare de c&teva luni. ;n aceast ierarhie, '.
tuberculosis se situeaz ctre zona micobacteriilor pretenioase din
punct de vedere nutritiv i cu dezvoltare lent %ntre .-2 sptm&ni
de la nsm&nare(.
"ediile de cultur pentru micobacterii sunt comple!e i
deosebit de variate. Actual, pentru diagnostic se utilizeaz doar
mediul cu ou GMSenstein-Fensen i varianta acestuia, mediul
1ebeglut.
$e aceste medii, produsele care nu conin alte bacterii %e!.:
GC9(, pot fi nsm&nate ca atare. Celelalte produse, fiind n
general contaminate cu ali germeni %flora bacterian nespecific(,
se trateaz cu o soluie de hidro!id de sodiu *H i dup .3 de
minute la .0
3
C se neutralizeaz cu JCl 2-)3H pentru obinerea
unui pJ de 0. Ancubarea mediilor nsm&nate, dup acoperirea
eprubetelor cu mediu cu dopuri de cauciuc sau prin parafinare, se
face la .0
3
C i se e!amineaz la fiecare a treia sptm&n. 5ac
pe medii nu se dezvolt bacterii, dup 2 sptm&ni, se d
186
rezultatul negativ i culturile se scot din lucru.
;n cazul culturilor pozitive, notarea rezultatelor se face
cantitativ, preciz&nd numrul coloniilor sau intensitatea pozitivrii.
+e utilizeaz urmtoarea notaie: UUU T cretere confluent UU T
colonii izolate U T 63-)33 colonii izolate sub 63 de colonii se
consemneaz numrul acestora 3 T cultur negativ.
,.+.1.8. I&e#ti0i$!re! ti"'l'i &e -i$4:!$terie
$entru identificarea micobacteriilor au fost propuse teste
privind:
- aspectele morfologice
- formarea de pigment la lumin i ntuneric
- timpul de cretere la .0
3
C
- patogenitatea pentru diverse animale de laborator
- teste enzimatice %punerea n eviden a niacinei, a
catalazei, a lipazei, a nitrat-reductazei etc.(
- compararea structurii antigenice prin teste imunologice
- sensibilitatea fa de chimioterapice sau alte substane.
5at fiind numrul e!trem de mare de teste propuse, s-a
simit nevoia unor scheme simplificate pentru a putea fi utilizate n
practic. ;n mod obligatoriu, din bateria de teste trebuie s fac
parte determinarea sensibilitii fa de tuberculostatice, n primul
r&nd pentru c un anumit spectru al chimiorezistenei este
caracteristic pentru micobacterii atipice, dar i pentru faptul c, prin
instalarea chimiorezistenei, micobacteriile tipice i modific unele
caractere biochimice i de patogenitate.
Proprietile morfolo#ice i de cultur
$e mediul GMSenstein i variantele sale, micobacteriile
tuberculoase de tip uman se dezvolt n 6)-/3 zile de la
nsm&nare, sub forma unor colonii rugoase, bine dezvoltate,
proeminente, conopidiforme: cretere de tip eugonic %fig.0.(.
"icobacteriile de tip bovin cresc sub forma unor colonii mrunte,
plate, uniforme, comparate cu creterea Dn gazonE, cunoscut sub
denumirea de cretere disgonic.
"icobacteriile atipice cresc pe mediile amintite n --)6 zile,
sub forma unor colonii de tip +, pentru unele specii cromogene
187
%grupa AA a lui 9union - galben portocaliu intens # scotocromogene,
de e!emplu(, sau necromogene %grupa AAA # avium - intracelulare(.
Fi). +1 D C4l4#ii "r4e-i#e#te? $4#4"i&i04r-e 5e')4#i$e7
&e 7,cobacterium tuberculosis "e -e&i'l LPNe#(tei#<
Qe#(e#.
!aractere bioc*imice
4estul niacinei %>onno( are valoare deosebit, fiind un test
de triere a tulpinilor de tip uman # care au proprietatea de a
produce niacin %o enzim bacterian( - comparativ cu
micobacteriile de tip bovin i cele atipice la care testul este negativ.
1estul se efectueaz n eprubete cu culturi de testat, n care se
adaug 3,- ml ap distilat, se nclin astfel ca s fie acoperit
cultura de bacili i se nclzete p&n la fierbere pentru a e!trage
niacina liber. Gichidul este transvazat ntr-o eprubet de hemoliz
sau ntr-o plac cu godeuri pentru efectuarea reaciei de culoare.
9eacia se obine prin adugare la lichidul cu e!tract a 6-. picturi
de anilin *H n alcool etilic %preparat e!temporaneu( i 6-.
picturi de bromur de cianogen )3H. 7peraiunea se face sub
ni prevzut cu e!haustor. ;n cazul prezenei niacinei, lichidul se
coloreaz n galben, indic&nd testul pozitiv %'. tuberculosis "ar.
*ominis(.
4estul nitratreductazei este util pentru a diferenia '.
tuberculosis de tip uman %test pozitiv( de '. bo"is %test negativ(,
micobacteriile atipice comport&ndu-se diferit n funcie de specie.
9eacia se e!ecut pe cultur de patru sptm&ni. Cu o
ans bacteriologic calibrat se racleaz cultura %apro!imativ -
188
mg( i se suspend n soluie de nitrat de sodiu tamponat la pJ 0.
+uspensia se incubeaz la .0
3
C timp de * ore, dup care se
acidifiaz cu JCl diluat ^, apoi se pun dou picturi de soluie
apoas de sulfanilamid 3,6H i dou picturi de diclorur de
naftil-etil-diamin 3,)H. 5ac cultura conine enzima
nitratreductaz, apare imediat culoarea roie %rou deschis(.
4estul acti"itii catalazice
9eacia se bazeaz pe aprecierea intensitii de formare a
bulelor de o!igen ce se dega' la contactul culturilor de
micobacterii cu apa o!igenat sub aciunea catalazei. +e poate
face o apreciere vizual apro!imativ efectu&nd reacia direct pe
tuburi cu cultur de micobacterii sau dup raclarea unei anse de
cultur %- mg( n dou tuburi de hemoliz care conin 3,- ml dintr-o
soluie apoas de )3H de 1Seen 23. :nul din tuburi va fi nclzit
)- minute la 03
3
C n baia de ap pentru inactivare. ;n ambele
tuburi se adaug 3,- ml perhidrol )-H. 5ac tulpina elibereaz
catalaz, n tuburi se formeaz numeroase bule de aer %test
pozitiv(. 5ac n tubul care conine cultura inactiv nu este
evideniat activitatea catalazic, iar n cellalt reacia este
pozitiv, se identific '. tuberculosis "ar. *ominis sau bo"is. 5ac
ambele tuburi au catalaz se identific micobacterii atipice
%catalaz termo-rezistent(. Ambele tuburi catalazo-negative indic
bacili >och cu rezisten secundar sau primar la izoniazid.
aractere anti#enice
Antigenele de suprafa ale unor micobacterii au fost
utilizate n cadrul unor cercetri de imunologie %serotipa'(,
apel&ndu-se la metode complicate i costisitoare care ns nu s-au
dovedit a fi deosebit de utile pentru identificare.
5in punct de vedere practic sunt importante antigenele
e!trase din culturi de micobacterii, numite senzitine i utilizate
pentru evidenierea, in vivo, a hipersensibilitii de tip nt&rziat.
Tipizarea cu a;utorul bacteriofa#ilor .lizotipia0
<ste o metod de identificare relativ nou %aplicat n scop
de cercetare(. Au fost izolai un numr de )6 fagi, desemnai cu
codul "1$J %D"Ocobacterial 1Oping $hage JumanE( i numerotai
189
de la ) la )6. 5in punct de vedere al sensibilitii la fagi, '.
tuberculosis a fost divizat n trei tipuri fagice: A, , i C. +-au
ntocmit scheme de fagotipa' pentru diferite micobacterii cu
potenial crescut de patogenitate, n scopul urmririi surselor de
infecie, n cadrul anchetelor epidemiologice.
Testele de sensibilitate la tuberculostatice
+unt utile at&t pentru identificarea unor specii de
micobacterii, c&t i pentru instituirea tratamentului cu
tuberculostatice.
4estul de rezisten la *idraza acidului tiofen-2-carbo0ilic
?4.!@. $e medii de cultur ce conin aceast substan, se
dezvolt numai '. tuberculosis varietatea european, n timp ce
'. bo"is% '. africanum i '. asiaticum nu se dezvolt.
9ezistena la pirazinamid constituie un criteriu de
difereniere ntre tipurile umane, care sunt sensibile, i cele bovine,
inclusiv ,C?, care sunt rezistente.
Constatarea chimiorezistenei la mai multe tuberculostatice,
inclusiv $A+, ndreptete suspiciunea c tulpina testat este o
micobacterie atipic.
Antibiograma pentru micobacterii poate fi fcut prin variate
metode, cea mai frecvent utilizat fiind metoda concentraiilor
absolute care const n inocularea tulpinii de testat pe mediu cu
anumite concentraii de tuberculostatice, denumite concentraii
critice% alese pentru fiecare antibiotic n funcie de concentraia
minim inhibitorie a acestuia %C"A(. ;n alegerea C"A e!ist o
relaie direct ntre sensibilitatea germenilor i concentraiile
obinuite realizate n organismul uman.
5in cultura pur de bacili obinut pe medii de izolare se fac
suspensii ce se inoculeaz pe medii cu tuberculostatice %de obicei,
cu 6 concentraii pentru fiecare antibiotic( i pe tuburi martor %fr
antibiotice(.
$rin aceast metod se e!prim rezistena la concentraia
tuberculostaticului n tubul pe care s-a observat creterea
micobacteriilor, comparativ cu tuburile martor.
$nfecia experimental micobacterian
Cobaiul este animalul cel mai sensibil la infecia cu '.
190
tuberculosis, iar iepurele este foarte sensibil la infecia cu '. bo"is
i '. a"ium.
Anocularea subcutanat la cobai a unei suspensii dintr-o
cultur de bacili >och este urmat, dup )3-)- zile, de fistulizare la
locul de inoculare, apare un abces cazeos numit ancru de
inoculare, care va dura p&n la moartea animalului. +imultan, au
loc reacii inflamatorii ale ganglionilor regionali, leziuni ale
suprarenalelor, splinei, ficatului i apoi ale plm&nilor. "oartea
animalelor are loc la / p&n la 2 sptm&ni de la inoculare.
Fenomenul Hoc* arat c, dac la cobaiul aflat n plin
infecie tuberculoas se inoculeaz intradermic o nou doz de
bacili, se produce o reacie precoce de necroz la locul inoculrii,
e!plicat printr-o stare de reactivitate specific de sensibilizare de
tip imun, demonstrat prin metode moderne ca fiind deosebit de
comple!.
,.+.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
;n diagnosticul tuberculozei nu e!ist metode serologice
care s aduc un aport important, fapt e!plicabil prin suportul
celular al imunitii antituberculoase. ;n schimb, diagnosticul
biologic are importan n evidenierea stadiului hipersensibilizrii
vis-a-vis de proteinele purificate ale bacilului >och %A59 la
tuberculin(, alturi de testarea imunitii celulare prin inhibiia
migrrii macrofagelor i alte metode.
1uberculina sau senzitina bacililor tuberculozei este un
preparat purificat #$$5 %derivat proteic purificat(, conin&nd 6 sau
)3 uniti I3,) ml.
/ntradermoreacia la tuberculin %tehnica "antou!( se
practic prin inocularea strict intradermic pe faa anterioar a
antebraului a 3,) ml din soluia de $$5. Citirea se face la 06 de
ore, lu&nd n considerare induraia palpabil a crui diametru este
peste )3 mm n cazul unei reacii de hipersensibilitate tardiv
pozitiv. Apariia unei reacii pozitive se interpreteaz n raport cu
v&rsta subiectului. Ga copii mari i la aduli, rspunsurile pozitive au
semnificaie c&nd sunt foarte intense, suger&nd infecia cu bacilul
tuberculozei.
191
9eacia negativ este nt&lnit la persoane neinfectate,
nevaccinate ,C? sau la cele care sunt lipsite de reactivitate de tip
tardiv.
:tilizarea n scop epidemiologic a reaciilor la tuberculin
servete la selecionarea subiecilor neinfectai i care urmeaz s
fie vaccinai cu ,C?.
Baccinul ,C? provine dintr-o surs de '. bo"is pe care
Calmette i ?uerin au obinut-o dup numeroase repica'e pe medii
cu cartof, bil i glicerin p&n c&nd virulena acesteia s-a atenuat
at&t de mult, nc&t nu mai produce infecia tuberculoas, dar
stimuleaz imunitatea celular, prote'&nd organismul de infecie.
,.. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
ENTEROBACTERIACEAE
,...1. C!r!$terele )e#er!le !le e#ter4:!$teriil4r
@umele de enterobacterii este dat acelor bacterii care sunt
n general localizate, normal sau patologic, n tubul digestiv al
omului i animalelor.
$rezena enterobacteriilor n mediul e!terior prezint
importan n igiena alimentar, deoarece se nt&lnesc unele specii
%ca +. coli( frecvent contaminante, indic&nd o poluare fecal a
elementelor din mediu.
@atural, enterobacteriile pot fi gsite i pe mucoase i
tegumente.
$e planul patologiei umane se disting mai multe specii
bacteriene:
- )acterii atogene secifice, cu patogenitate cert, care
mbolnvesc omul datorit contaminrii, fie prin contact
direct, fie prin intermediul alimentelor sau animalelor:
Salmonella% S*igella i 6ersinia estis.
- )acterii atogene oortuniste, aparin&nd florei digestive
comensale, Dcondiionat patogeneE cum sunt:
+sc*eric*ia% Proteus% Hlebsiella etc., care prezint o
importan deosebit prin mbolnviri i uneori prin
e!tinderea lor n mediul spitalicesc.
192
,...1.1. M4r04l4)i!
+unt bacili #ram-negati"i nesporulai, mobili datorit cililor
peritrichi sau imobili %Hlebsiella% S*igella(. :nele pot poseda
capsul %Hlebsiella(, altele au microcapsul %aceasta prezint
antigene de suprafa(.
,...1.,. C'lti6!re!
<nterobacteriile se dezvolt uor pe medii simple i sunt
aero-anaerobe facultativ. ;n mediile nutritive simple, formele + se
dezvolt omogen tulbur&nd uniform mediul. =ormele 9 determin o
turbiditate redus, culturile prezent&nd depozit i pelicul
incomplet. $e geloz simpl, e!cept&nd bacteriile din genul
Proteus, formele + dezvolt colonii rotunde de )-. mm diametru,
bombate, semitransparente, cu marginile regulate, n timp ce
formele 9 cresc sub form de colonii plate, cu suprafaa i
marginile neregulate. Hlebsiella dezvolt colonii mari bombate,
lucioase, mucoide, cu tendin de confluen.
$entru izolarea enterobacteriilor din produsele patologice
%materii fecale, urin, puroi din plgi deschise etc.( se utilizeaz o
gam larg de medii selective care inhib dezvoltarea fungilor i
bacteriilor ?ram-pozitive.
,...1.1. C!r!$teri(ti$i -et!:4li$e
$entru a ncadra o tulpin ca enterobacterie, precum i ntr-
un gen sau specie, sunt utile o serie de teste biochimice:
- degradarea o!idativ i fermentativ a glucozei
- reducerea nitrailor la nitrii %nitratreductaza(
- citocromo!idaza se evideniaz pe geloz nclinat
- testul indol evideniaz prezena triptofanazei
- testul rou-metil %fermentaia mi!t a glucozei(
- testul Boges-$rosNauer %fermentaia acetonic(
193
- ntrebuinarea citratului %pe mediul +immons(.
:ltimele patru teste sunt de mare valoare n identificarea
enterobacteriilor i sunt notate ca A"BAC.
;n afara testelor mai sus amintite se utilizeaz i altele, care
evideniaz: scindarea ureei %ureaza(, decarbo!ilarea aminoacizilor
i, mai ales, testele de fermentare a carbohidrailor %glucoz,
lactoz, manitol, zaharoz etc.(.
7 tulpin poate fi ncadrat n familia +nterobacteriaceelor
dac, alturi de proprietile morfotinctoriale i de cultur, are
urmtoarele caracteristici:
- degradeaz o!idativ i fermentativ glucoza
- reduce nitraii la nitrii
- este citocromo!idazo-negativ.
Aceste teste difereniaz enterobacteriile de alte bacterii
#ram-negati"e %Pseudomonas% -lcaligenes% 'ora0ella etc.(.
+tudiul caracterelor biochimice a permis ncadrarea
enterobacteriilor n mai multe genuri, fiecare gen cuprinz&nd specii
diferite. $rincipalele genuri recunoscute la om sunt:
- +sc*eric*ia
- Hlebsiella - +nterobacter - .afnia 8 Serratia
- Proteus 8 'organella 8 Pro"idencia
- !itrobacter
- +dBarsiella
- Salmonella
- S*igella
- 6ersinia.
Alte caractere biochimice iIsau imunologice, pe l&ng
caracterele de cultur, au condus la noiunea de specie i
serotipuri.
,...1.8. Str'$t'r! !#ti)e#i$%
Ga enterobacterii se pot distinge:
- antigenul somatic -de perete- sau antigenul D7E,
totdeauna prezent, comun mai multor serotipuri,
194
constituindu-se pe aceast baz grupe antigenice
%Salmonella% +sc*eric*ia% Hlebsiella etc.(
- antigenul flagelar sau antigenul DJE, cu importan mare
n definirea tipurilor antigenice %Salmonella(
- antigenul de surafa %capsular sau de nveli( numit
antigen D>E %Hlebsiella% +sc*eric*ia(.
-ntigenele E>G coninute n peretele bacterian, prezint o
structur comple! de natur lipozaharidic, cuprinz&nd:
- fraciunea lipidic, lipidul A, care este responsabil de
to!icitate
- fraciunea poliozidic care, prin natura sa, determin
specificitate.
Acest antigen D7E este o endoto0in, care n cursul infeciei
provoac la om ocul endoto!inic. ,acteriile care posed acest
antigen, n prezena anticorpilor specifici # aglutinina D7E # vor
aglutina bacteriile corp la corp sub forma unor formaiuni granulare
mici, dificil de a fi disociate prin agitare.
-ntigenulG E.G, flagelar, este constituit dintr-o substan
proteic. ,acteriile care posed acest antigen, n prezena
aglutininei DJE %anticorp specific( ce leag bacteriile prin flagelii lor,
produc&nd o aglutinare floconoas, uor de disociat prin agitare.
+tudiul diferitelor antigene permite stabilirea serotipurilor,
acestea av&nd importan n descoperirea surselor de infecie.
;n prezena unei infecii cu o enterobacterie, instituirea
tratamentului cu antibiotice se face n funcie de rezultatul
antibiogramei i de localizarea infeciei.
195
,...,. Di!)#4(ti$'l i#0e$3iil4r $' S!l-4#ell!
?enul Salmonella cuprinde bacterii larg rsp&ndite n
natur, toate serotipurile cunoscute fiind patogene pentru om i
animale. Cele dou rezervoare naturale mari, animalele i omul
%bolnavi sau purttori sntoi( se afl la polii unui lan ale crui
verigi eseniale sunt alimentele, apele de suprafa i fura'ele.
<!ist salmonelle adaptate strict la om %S. t,*i% S.
arat,*i -(, altele nt&lnite la animale cu spectru restr&ns de
gazd i altele cu spectru larg de gazd %S. t,*imurium% S.
enteritidis etc.( care pot da infecii i la om. Aceste bacterii cu
patogenitate specific, a'ung&nd din tubul digestiv al omului iIsau
animalelor, bolnave sau sntoase, n mediul e!terior i provoac
mbolnvirea prin ingerare de ap sau alimente contaminate.
+almonellele sunt agenii etiologici ai salmonelozelor,
maladii ce pot mbrca diferite aspecte clinice.
Febrele tifoaratifoide -enterice- forme septicemice,
datorate unei contaminri orale, caracterizate printr-o evoluie
febril, determinat n mod frecvent de S. t,*i %febra tifoid(, S.
arat,*i -% S. arat,*i ) i S. arat,*i ! %febrele paratifoide(.
;n patogenia febrelor enterice a fost descris o faz iniial c&nd
Salmonella se multiplic activ n submucoas i formaiunile
limfoide ale intestinului %plcile $eOer( i apoi trece n ganglionii
mezenterici. 5e aici, prin canalul toracic, determin bacteriemia de
debut i invadarea formaiunilor limfatice, splinei, ficatului etc.
"ultiplicarea n aceste organe determin bacteriemie masiv cu
eliminarea germenilor prin bil i urin. 5in foliculii intestinali,
necrozai i abcedai, precum i din bil, la sf&ritul primei
sptm&ni de boal, eliminarea se face prin materiile fecale.
4o0iinfecia alimentar salmonelozic - gastroenterita - este
forma comun de boal dat de toate celelalte serotipuri %mai
frecvent S. t,*imurium% S. enteritidis% S. anama etc.( i se
datorete ingestiei unei cantiti mari de bacterii vii, de regul prin
intermediul unui aliment contaminat. +imptomatologia digestiv
brutal apare dup /-*2 ore %spre deosebire de cea dat de
to!iinfecia stafilococic ce apare n 6-/ ore( de la consumul
196
alimentului contaminat i const n: diaree, vrsturi nsoite de
febr, cefalee i alterarea strii generale n formele severe put&nd
apare fenomene grave de deshidratare i oc to!iinfecios. 5up
remisiunea strii acute, unii indivizi rm&n purttori de Salmonella
pe timp de mai multe luni.
Seticemia sau determinrile setico-iemice la copii i la
aduli cu rezisten sczut sau imunitate deprimat, apare n
cursul to!iinfeciei alimentare, dar i n situaii n care nu se
manifest o interesare a tractului digestiv. Acestea pot determina
localizri ale unor focare piemice din cele mai variate
%osteoarticulare, pulmonare, meningeale etc.( i sunt cauzate cel
mai frecvent de S. arat,*i ! i S. c*olerae suis.
-lte salmoneloze sunt mai rare: meningite, osteite, infecii
urinare etc.
,...,.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
:rmrete izolarea i identificarea agentului patogen,
studiul caracterelor biochimice eseniale i stabilirea serotipurilor.
*ecoltarea produselor biolo#ice i izolarea
Salmonellelor sunt dependente de etapele de evoluie a febrelor
enterice, e!amenele de elecie fiind: hemocultura, coprocultura,
urocultura i bilicultura. ;n gastroenteritele salmonelozice, pe toat
durata bolii, n convalescen i la purttori, izolarea se face prin
coprocultur. ;n perioada de debut se fac e!aminri i din
vomismente i resturile alimentare incriminate. Ga purttori,
e!amenul de rutin este coprocultura, iar la fotii bolnavi i
bilicultura.
'emocultura se practic nsm&n&nd )3 ml de s&nge,
recoltat steril, n 63 de ml bil de bou %salmonellele cresc bine pe
acest mediu, iar efectul inhibant al eventualilor anticorpi prezeni n
s&nge este anihilat(. 5up 6* de ore de incubare la .0
3
C, i apoi
zilnic, se face izolarea pe un mediu pentru germeni intestinali
%5rigalsNi, Astrate, Geifson(. +e dezvolt colonii lactozo-negative
caracteristice, care se izoleaz n cultur pur pe geloz nclinat.
197
;n cursul febrelor tifoide netratate cu antibiotice, procenta'ul de
pozitivitate a hemoculturii este de peste 83H, n prima sptm&n,
de peste 0-H n a doua, scz&nd semnificativ n urmtoarele
sptm&ni.
oprocultura, practicat n paralel cu hemocultura c&nd se
suspecteaz o febr tifoid sau paratifoid, este singura metod ce
permite confirmarea rapid a etiologiei unei to!iinfecii alimentare
cu Salmonella i, totodat, singura metod ce permite confirmarea
purttorilor.
;nsm&narea materiilor fecale din scaun spontan, dup
omogenizare n ser fiziologic steril, se face pe mediu de transport
CarO-,lair, medii de mbogire "bller->auffman i cu selenit acid
de sodiu.
3rocultura, din sedimentul obinut prin centrifugare a --)3
ml de urin, se face direct pe mediul Wilson-,lair i pe medii de
mbogire, dup care se procedeaz ca la coprocultur.
%ilicultura se face pe medii de mbogire i pe medii
selective pe care coloniile de Salmonella se izoleaz n cultur
pur. 7 parte din bila recoltat cu sonda se incubeaz la .0
3
C, bila
fiind un mediu propice multiplicrii salmonellelor.
$dentificarea
;n vederea identificrii, se recomand repicarea coloniilor pe
mediul multitest 1+A %1riple +ugar Aron( i pe mediul "A:
%mobilitate, indol, uree( care permite trierea culturilor i ncadrarea
prezumtiv de gen. ;n continuare se face apel la identificarea
biochimic, serologic i efectuarea antibiogramei.
4estele bioc*imice pentru ncadrarea n genul Salmonella:
producere de hidrogen sulfurat i lizindecarbo!ilaz, dezvoltare pe
mediul cu citrat %+immons(, reacia rou metil pozitiv. @u produc
indol i nu au fenilalanindezaminaz. +unt lactozo-negati"e.
$entru diferenieri n cadrul genului, >auffman a preconizat
o schem de biotipie care este un au!iliar preios al serotipiei.
/dentificarea serologic se face pe baza schemei >auffman-
198
White raportat la structura antigenic, folosind antiseruri standard
%seruri ce conin anticorpi anti-Salmonella, at&t seruriE7E, c&t i
seruri DJE(.
Ga noi n ar, se folosete un singur ser polivalent D7E care
cuprinde grupele Dma'oreE: A7, ,7, C
)
7...C
*
7, 5
)
7, <
)
7...<
*
7. Cu
a'utorul serurilor monovalente D7E corespunztoare grupelor DJE se
asigur identificarea urmtoarelor serotipuri: S. arat,*i -% S.
arat,*i )% S. t,*imurium% S. arat,*i !% S. infantis% S. t,*i% S.
enteritidis, semnalate ca fiind cele mai frecvente.
Aglutinarea se face pe lam sau n tuburi, urmrindu-se
apariia aglutinrii de tip D7E i a celei de tip DJE.
5izotiia% ca metod de difereniere n cadrul serotipurilor la
Salmonella, cunoate o larg aplicaie, impus de cerinele
epidemiologice, deoarece permite, pe l&ng urmrirea purttorilor,
precizarea filiaiunii cazurilor n to!iinfeciile alimentare, n infeciile
de spital etc.
,...,.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t D (er4l4)i$
+e practic n febrele tifo-paratifoide, pe serul bolnavilor sau
convalescenilor i const n evidenierea prin reacii de aglutinare
a anticorpilor specifici anti D7E i anti DJE cu antigene standard,
pentru S. t,*i% S. arat,*i - i S. arat,*i ).
Serodiagnosticul rin reacia Iidal se efectueaz cu
antigenele D7E i DJE separate pentru fiecare din speciile amintite,
pe suspensii de culturi inactivate, livrate de Anstitutul
DCantacuzinoE.
4e*nica reaciei
+e folosesc / serii a 0 eprubete, c&te o serie pentru fiecare
tip de antigen: 17, 1J, A7, AJ, ,7, ,J, diluia pentru fiecare serie
fc&ndu-se conform schemei urmtoare.
/ncubarea se face la -6
3
C timp de 6 ore pentru antigenele
DJE i )2-63 ore la -6
3
C pentru antigenele D7E.
/nterretare: se noteaz diluia cea mai mare la care se
observ aglutinarea %titrul aglutininelor(.
199
7aloarea diagnostic a titrurilor este diferit=
- la bolnavi fr antecedente vaccinale, titrul D7E este
semnificativ peste )I6-3, titrul DJE peste )I-33, dar o
cretere la dublu dup 0 zile, confirm suspiciunea de
febr tifoid sau paratifoid
- la bolnavii cu antecedente vaccinale recente, n primele
6-. luni analiza seric calitativ nu furnizeaz informaii
utile diagnosticului. Aglutininele DJE se menin la valori
ridicate dup 0-)6 luni de la vaccinare.
;n toate cazurile, ns, certitudinea diagnosticului o confer
izolarea agentului etiologic.
E"r':et! 1 , 1 8 * >
+
-soluie salin fiziologic --- 3,6 3,. --- 3,6 3,. 3,*
%ml(
-ser de bolnav %ml(
-diluie )I)3 3,* 3,6 3,) --- --- --- ---
-diluie )I)33 --- --- --- 3,* 3,6 3,) ---
-antigen %ml( 3,/ 3,/ 3,/ 3,/ 3,/ 3,/ 3,/
Dil'3ii 0i#!le 1G,* 1G*/ 1G1// 1G,*/ 1G*// 1G1/// -!rt4r
,...1. Di!)#4(ti$'l &ie#teriei :!$il!re D )e#'l
S9i)ell!
?enul S*igella cuprinde bacterii cunoscute sub denumirea
200
de bacili dizenterici, agenii etiologici ai dizenteriei bacilare acute,
boal infecioas a omului, caracterizat prin scaune frecvente
muco-sanguinolente, tenesme, colici abdominale i fenomene
generale ca febr i deshidratare. :n tablou sever al bolii, cu
fenomene tipice, stare to!ic, deseori cu sf&rit letal, este
caracteristic pentru dizenteria determinat de S*. d,senteriae ti 1
%bacilul +higa(.
$e baza structurii antigenice D7E-somatice i a unor
caractere biochimice, genul S*igella a fost mprit %de
+ubcomitetul Anternaional pentru <nterobacteriaceae - )82/( n
patru grupe:
+ubgrupa A sau S*igella d,senteriae% cu 12 tiuri
antigenice=
- S*igella d,senteriae A sau bacilul +higa care se
deosebete de toate celelalte prin producia de e!oto!in cu
aciune predominant neurotrop
- S*igella d,senteriae sc*mitzi% de ti 2J
- )acilii dizenterici din grua 5arge-Sac*s, tipurile .-)3.
+ubgrupa , # S*igella fle0neri, cu / serotipuri
+ubgrupa C # S*igella bo,di, cu )2 serotipuri
+ubgrupa 5 # S*igella sonnei, cu ) serotip.
?enele localizate pe o plasmid sunt responsabile pentru
potenialul invaziv al shigellelor n celulele epiteliale ale mucoasei
colice. Caracterul invaziv este condiionat de aderarea la mucoasa
colic, apoi penetrarea i multiplicarea intracelular a bacteriilor.
Anflamaia intens, microabcesele i ulceraiile determin aspectul
mucopurulent i sanguinolent al diareei.
,acilii dizenterici sunt eliminai prin materiile fecale de ctre
subiecii infectai sau purttorii sntoi, contamin&nd alimentele
sau apa.
,...1.1. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
oprocultura este singura metod de diagnostic, n faza
acut izolarea tulpinilor de S*igella fiind uor de realizat.
Prele"area se face din scaune emise spontan sau recoltate
cu sonda @elaton ori cu tampon rectal. ;nsm&narea se face n cel
201
mult 6 ore, iar dac aceasta nu este posibil se face o nsm&nare
pe mediul CarO-,lair.
/zolarea se face pe medii selective: mediul Geifson, Astrate-
"eitert, mediul +higella-+almonella. $e aceste medii se dezvolt
colonii lactozo-negati"e, din care se izoleaz culturi pure pentru
testele de identificare.
/dentificarea=
- bacili ?ram-negativi, imobili, fr capsul
- rou-metil pozitiv reacia Boges-$rosNauer,
ntrebuinarea citratului i J
6
+ #negative
- n cadrul genului, S*. fle0neri% S*. bo,di i S*. sonnei
fermenteaz manitolul, iar S*.d,senteriae nu-l
fermenteaz
- identifiarea antigenic se realizeaz practic prin
aglutinare pe lam a culturii cu serurile anti-shigae, anti-
+h.schmitzi i anti-Garge-+achs-oli"alente %c&nd
bacteria este manitol negativ( i cu antiserul +h.
fle!neri, +h. boOdi etc. %pentru bacteriile manitol-
pozitive(
- aglutinri pe lam cu seruri de tip, c&nd se obine
rezultat pozitiv cu serul polivalent.
$roprietile invazive se evideniaz prin testul Nerato-
con'unctivitei la cobai.
Xin&nd seama de prezena plasmidelor de transfer al
rezistenei multiple fa de antibiotice, diagnosticul se completeaz
cu efectuarea antibiogramei.
202
,...8. Di!)#4(ti$'l i#0e$3iil4r $' e#ter4:!$terii
$4-e#(!le
?enurile: +sc*eric*ia% !itrobacter-+dBarsiella% Hlebsiella-
+nterobacter% Proteus-'organella i Pro"idencia% ca i 6ersinia,
fac parte din microbiocenoza de tip colon, fiind considerate ca
enterobacterii patogene oportuniste.
Acestea determin o mare varietate de infecii:
- cu punct de plecare endogen, ce poate fi e!plicat prin
comensalismul lor i care apar mai ales ca i complicaii
ale infeciilor virale, interveniilor chirurgicale,
manoperelor de terapie intensiv etc
- cu punct de plecare e0ogen, n general cunoscute ca
infecii nosocomiale %de spital, n colectiviti( sau ca
infecii transmise prin contaminarea mediului, prin
bolnavi.
<liminate n natur, aceste enterobacterii sunt un semnal al
contaminrii fecale, evideniind igiena defectuoas.
At&t pentru diagnosticul clinic, c&t i pentru investigaiile
epidemiologice, identificarea de gen i specie este obligatorie.
,...8.1. E($9eri$9i! $4li
+sc*eric*ia coli sau colibacilii populeaz normal intestinul
203
%colonul(, reprezent&nd peste 23H din flora aerob a colonului. $ot
fi gsite deasemenea n numr redus la nivelul mucoaselor.
$rezena lor n mediul ncon'urtor sau n alimente semnific o
contaminare fecal.
;n medicina uman, +.coli poate fi deci o banal bacterie
comensal sau un indiscutabil agent patogen, put&nd determina
diverse tipuri de infecie.
$nfecii enterale .#r6 <enteron= > intestin0
+e consider c mai ales unele tipuri de +. coli produc
asemenea infecii.
+. coli enteroto0igen elibereaz enteroto!ine i
determin enterite cu scaune muco-aoase ca urmare a
legrii cu un receptor specific i interferrii cu
metabolismul celular. 1o!ina legat de celulele sensibile
acioneaz ca i to!ina holeric prin activarea
adenilciclazei intestinale cresc&nd nivelul de cA"$
%cOclic-adenosine---monophosphate( care acioneaz
prin pierdere de ap
i electrolii..

+. coli enteroin"azi" care produce enterite cu scaune
mucoase sau muco-sanguinolente, printr-un mecanism
asemntor cu cel prin care shigellele produc dizenteria.
+. coli enteroatogen responsabil de episoade diareice
la cazuri sporadice i de gravitate mai redus, fiind
reprezentate ns i de tipuri antigenice izolate din
epidemii de enterit a nou-nscuilor i copiilor.
+. coli entero*emoragic productor de citoto!ine
%veroto!ine( i determin diaree hemoragic %colite
hemoragice severe(.
$nfecii extraenterale .extraintestinale0
/nfecii urogenitale6 +. coli reprezint agentul etiologic al
ma'oritii infeciilor urinare. Cile urinare sunt infectate la femeie,
204
ascendent, de +. coli de origine fecal produc&nd cistite,
cistopielite i uneori infecii renale. Aceleai tipuri de bacterii sunt
responsabile de uretrite, prostatite, vaginite i salpingite %inflamaia
trompelor uterine(.
/nfecii *eato-biliare sau digesti"e. +. coli poate fi izolat la
cazuri cu colecistit acut sau cronic, n icterele infecioase i n
peritonite.
'eningite, rare, nt&lnite la sugari, dar care sunt grave.
Seticemii. +.coli a fost izolat n 63H din cazurile cu
septicemii date de bacilii ?ram-negativi.
,...8.,. Rle:(iell!<E#ter4:!$ter
Aceste bacterii pot fi gsite n cadrul florei bacteriene
comensale din tubul digestiv i cavitile naturale, n particular n
cile respiratorii superioare. =iecare din cele dou genuri- cu care
mai sunt nrudite i genurile: Serratia i .afnia # au mai multe
specii cu potenial patogen pentru om:
- genul Hlebsiella: H. neumoniae% H. ozaenae i H.
r*inoscleromatis
- genul +nterobacter: +. aerogenes% +. agglomerans %sau
+dBinia( etc.
1ablourile infecioase sunt:
- infecii urinare, frecvente n serviciile de urologie,
survenind frecvent i n urma seleciei la antibiotice
- surainfecii resiratorii dup manopere chirurgicale sau
suprainfecii n sfera 79G
- meningiteJ
- surainfecii biliareJ
- surainfecii genitale etc.
,...8.1. Pr4te'(<M4r)!#ell! 2i Pr46i&e#$i!
+unt bacterii saprofite n mediul e!tern, dar i n colon, pe
tegumente i n caviti.
;n situaia n care se constat o cretere a seleciei tulpinilor
rezistente
la antibiotice, rolul lor n declanarea infeciilor este n cretere i
205
aceste infecii au tot mai mult un caracter nosocomial, produc&nd:
- infecii urinare %Proteus mirabilis% P."ulgaris ocup un loc
important n cadrul acestor afeciuni, dup +. coli(
- infecii secundare # tot mai frecvente n mediul
spitalicesc.
,...8.8. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
Prelevarea materiilor fecale %coprocultura(, urinii
%urocultura(, s&ngelui %hemocultura(, GC9, puroiului, sputei etc. #
se va face cu mare atenie, deoarece enterobacteriile din mediul
spitalicesc pot contamina produsele recoltate de la bolnav.
Examenul microscopic direct are valoare orientativ doar
n unele produse %e!emplu: bacili ?ram-negativi capsulai n sput
presupune o infecie cu Hlebsiella(, iar numrul mare de bacili
?ram-negativi n urin pledeaz pentru infecie urinar.
$zolarea se face pe medii pentru intestinali, puin inhibante:
"cConNeO, Gevin, Geifson i pe mediu neinhibant 5rigalsNi sau pe
geloz-s&nge.
$dentificarea
Caracterul comun: bacili ?ram-negativi # +. coli, mobili, iar
cele de cultur sunt comune enterobacteriilor. $e mediul "A:,
genul +sc*eric*ia prezint mobilitate, este indol-pozitiv i are
lizindecarbo!ilaz.
Particulariti de cultur: caracterul mucos al culturilor la
Hlebsiella, iar la Proteus proprietatea de crare i de invazie pe
toat suprafaa mediilor neinhibante. $e mediul /strate% coloniile
de Proteus au centrul negru %colonii n ochi de pisic(. +. coli i
Hlebsiella neumoniae fermenteaz lactoza %sunt lactozo-pozitive(,
caracter ce le deosebete de alte +nterobacteriaceae ?Salmonella%
S*igella% Proteus etc.(%plana AAA-* i AAA--(.
$entru genul Hlebsiella sunt caracteristice reacia Boges-
$rosNauer pozitiv i creterea pe mediul +immons, iar pentru
Proteus - testul fenilalanindezaminazei.
206
Structura antigenic este util pentru identificarea grupelor
i tipurilor antigenice. +. coli posed antigenele 7, > i J. "ulte din
tulpinile izolate pot fi identificate pe baza acestor antigene i
ncadrate ntr-un grup antigenic, ca de e!emplu tipurile
enteropatogene: 7
)))
,
*
, 7
--
,
-,
7
6/
,
/
etc., ncadrate prin teste de
aglutinare.
4estele de atogenitate se practic n laboratoarele de
specialitate i sunt bazate pe caracterul invaziv %testul
Neratocon'unctivitei la cobai( i pe evidenierea enteroto!inei
%identific&nd tulpinile enteroto!igene( prin : testul ansei ligaturate la
iepure efectul citopatogen pe culturi de celule sau prin teste
imunologice ca <GA+A, 9AA, coaglutinarea stafilococului cu
proteina A etc.
Alturi de proprietatea de enteroto!igenez, pentru ca o
tulpin s produc enterit trebuie s posede i factori de
colonizare %pili( care favorizeaz ataarea de epiteliul intestinal i
ptrunderea n celulele acestuia.
7 semnificaie ma'or pentru diagnosticul enteritelor o are
determinarea cantitativ a bacteriilor din sucul 'e'unal, un numr de
peste )3 bacteriiIml e!plic&nd apariia sindromului diareic.
207
,.B. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
PSEUDOMONAS I ALI BACILI GRAM<NEGATIVI
?rup foarte heterogen de bacili ?ram-negativi, dein,
mpreun cu enterobacteriile comensale, un rol important n
patologia infecioas cu bacterii endogene, ocup&nd un loc
important n cadrul infeciilor de spital.
5up comportamentul lor fa de zaharuri pot fi etichetate
ca:
- fermentati"e # degrad&nd glucoza i ali hidrai de
carbon, at&t fermentativ, c&t i o!idativ, cum sunt unii din
reprezentanii genurilor: !am,lobacter% Pasteurella%
Francisella% -eromonas etc.
- nefermentati"e # care nu degradeaz fermentativ
glucoza i care cuprind genurile: -lcaligenes%
-cinetobacter% 'ora0ella i Pseudomonas.
,.B.1. I#0e$3ii $' :!$ili Gr!- #e)!ti6i
0er-e#t!ti6i
,.B.1.1. Ge#'l C!-"Ol4:!$ter
Cuprinde bacterii ?ram-negative responsabile de infecii
intestinale i septicemii la subiecii imuno-deprimai: !. FeFuni, !.
fetus etc. i .elicobacter ,lori %responsabil de gastrite i ulcer
duodenal(.
,.B.1.,. P!(te'rell! ("".
208
Cuprinde mai multe specii patogene pentru om i animale,
responsabile de producerea asteurelozelor. 5intre acestea,
Pasteurella multocida, care reprezint specia tip, este comensal a
cilor aero-digestive, frecvent izolat de la animale n
antropozoonoze, poate produce accidental la om inflamaii loco-
regionale e!trem de dureroase, foarte rar forme generalizate sau
cu localizri pleuropulmonare i n alte organe, la bolnavi
imunodeprimai.
,.B.1.1. Fr!#$i(ell! t'r!le#(i(
+ingura specie a acestui gen, agentul etiologic al turalemiei,
este un bacil ?ram-negativ foarte mic, la limita de vizibilitate a
microscopului optic. $roduce o antropozoonoz ce poate
contamina omul, determin&nd inflamaii loco-regionale, cutanate i
ganglionare %ulcerative(, nsoite de forme clinice: pulmonare,
digestive, con'unctivale, cu adenopatii satelite.
,.B.1.8. Aer4-4#!( ("".
,acili ?ram-negativi flagelai, prezeni n mediul acvatic, sol,
produse alimentare i e!cepional n tubul digestiv al omului.
7cazional, pot infecta omul produc&nd: seticemii la bolnavii cu
leucemii ciroz diaree acut etc.
,.B.,. I#0e$3ii $' :!$ili Gr!-<#e)!ti6i
#e0er-e#t!ti6i
,.B.,.1. Al$!li)e#e( ("".
Bast ansamblu de specii microbiene diverse, gsite n
mediu i ocazional la om ca bacterii comensale condiionat
patogene pe teren deficitar, ele pot fi cauza unor infecii
nosocomiale. +pecii tip: -lcaligenes faecalis, -c*romobacter
0,loso0idans, Fla"obacterium meningoseticum %agent etiologic al
unor forme de meningit la prematuri(.
,.B.,.,. A$i#et4:!$ter ("".
209
Acest gen, ce cuprinde mai multe specii %trei dintre acestea
fiind frecvent gsite n mediul de spital(, saprofite %n ap, sol(, pot
constitui elemente ale florei bacteriene normale a omului.
9ezistena lor la antibioticele uzuale face ca acestea s ocupe un
loc important n cadrul agenilor cu rol n infeciile nosocomiale %de
spital(, cum sunt: supuraiile pleuropulmonare, infeciile urinare,
meningitele etc.
,.B.,.1. M4r!;ell! 2i Br!#9!-ell!
?enurile 'ora0ella, cu / specii, i )ran*amella, cu * specii,
au fost regrupate recent n familia )ran*amaceae. +unt bacterii
comensale, la om fiind gsite pe mucoase, n principal n tractul
respirator superior. +unt bacterii patogene oportuniste,
responsabile de infecii variate:
'. lacunata, este considerat un agent ma'or al
con'unctivitelor i Neratitelor %inflamaia corneei( la om, c&t i un
agent de suprainfecie a bronhiilor. Alte specii din genul 'ora0ella
au un potenial patogen discutabil.
)ran*amella catarr*alis %nt&lnit i sub denumirea de
'ora0ella catarr*alis, dup ce mult timp a fost numit Neisseria
catarr*alis( este frecvent izolat din cavitatea bucal, faringe,
sinusuri, secreii bronho-pulmonare, c&t i n infecii generalizate,
dar fiind considerat ca un important agent etiologic al infeciilor
respiratorii.
,.B.,.8. I#0e$3iile $' P(e'&4-4#!( !er')i#4(!
?enul Pseudomonas cuprinde un numr foarte mare de
specii %peste 6/3(, din care numai un numr foarte redus prezint
interes medical, restul speciilor fiind gsite n mediu i frecvent
a'unse n tractul digestiv uman.
Pseudomonas aeruginosa, specia tip, cunoscut i sub
denumirea de bacil iocianic, este nt&lnit foarte frecvent n
mediul spitalicesc i este responsabil de infecii ce pun grave
probleme terapeutice. $e l&ng aceasta, mai pot fi nt&lnite i
Pseudomonas fluorescens% Pseudomonas utida etc.
210
Anfeciile cu bacili piocianici survin de obicei din mediul
spitalicesc, infecii nosocomiale, cauzele eseniale fiind:
- prescripia de antibiotice, care antreneaz selecia de
bacili piocianici rezisteni
- tratamente cu corticoizi i imunosupresoare, care
diminu rezistena organismului la infecii
- n cadrul e!plorrilor organismului cu sonde, catetere
%urologie, reanimare(, put&nd antrena bacterii n caviti
i organe.
=iind bacterii puin virulente pe teren normal, infeciile, mai
ales la imunodeprimai, pot fi de origine endogen sau e!ogen i
produc:
- infecii locale: oculare, cutanate, urinare, meningeale,
bronhopulmonare %broniectazii( etc.
- seticemii, care survin n urma unor infecii localizate.
4ia#nosticul bacteriolo#ic al infeciilor cu
Pseudomonas
Prele"area se face n funcie de localizarea infeciei: puroi,
urin, sput, GC9, probe din mediu etc.
+0amenul microscoic direct are o slab valoare orientativ
%bacili mobili, ?ram-negativi(.
/zolarea se face pe medii simple uzuale.
/dentificarea apeleaz la proprietile de cultur, mai ales,
precum i la celelalte teste din schema de identificare %plana AB-
)(.
Astfel, bacilul piocianic crete abundent pe mediile simple.
$e mediile cu pepton produce un pigment verde, tulbur&nd
uniform mediile lichide i form&nd o pelicul. $e mediile solide se
dezvolt sub forma unor colonii transparente, ce produc hemoliz
pe geloz-s&nge. 5atorit produciei de iocianin # pigment
albastru i fluoresceina # pigment verzui, fluorescent, coloniile sunt
uor de recunoscut pe mediile de cultur.
$roprietile biochimice sunt utile pentru identificarea
tulpinilor de bacil piocianic care nu produc pigment: strict aerob,
o!idazo-pozitiv i sunt lactozo-negativi. Au puternic activitate
proteolitic i lipolitic.
211
$roprietile antigenice, dup care s-au conturat tipuri
antigenice, sunt caracterizate prin prezena antigenelor D7E i DJE.
:nele tulpini produc e!oto!in cu efect dermonecrotic i
enteroto!in testabil pe ansa izolat de intestin de iepure.
Antibiograma este obligatorie, ma'oritatea tulpinilor fiind
polirezistente la antibiotice.
212
,.1/. DIAGNOSTICUL HOLEREI
7ibrio c*olerae >=1 # vibrionul holeric # agentul etiologic al
holerei face parte din genul 7ibrio, care ncadreaz, pe l&ng
bacteria patogen amintit, mai multe specii de vibrioni cu
rsp&ndire larg n mediu i care pot determina sindroame
*oleriforme fr gra"itate sau unele infecii intestinale, acetia fiind
cunoscui ca "ibrioni neaglutinabili cu seruri 7:) %@A?( sau "ibrioni
non-*olerici.
7ibrionii *olerici sunt sue de 7ibrio c*olerae recunoscute
prin antiserul 7:), n care sunt descrise dou biotipuri:
- 7ibrio c*olerae c*olerae %clasic(
- 7ibrio c*olerae +l 4or, cu trei serotipuri %7gaSa, Anaba i
JiNo'ima(.
Aceti vibrioni sunt ageni ai holerei epidemice, o to!iinfecie
intestinal acut, n cadrul creia se individualizeaz dou etape:
- ingestia bacteriilor prin consum de ap sau alimente
contaminate de e!crementele bolnavilor sau ale
purttorilor aparent sntoi # forme asimptomatice
aderarea la enterocite i apoi penetrarea n celulele
mucoasei, urmat de multiplicarea rapid i colonizare
- efectele to0inei roteice ?enteroto0in@, cu rol esenial n
fiziopatologia holerei, prin activarea adenil-ciclazei,
creterea concentraiei de A"$-ciclic intracelular
%cA"$(, ce are ca efect stimularea secreiei de anioni
%Cl
-
( i antrenarea n lumenul intestinal a apei i
electroliilor %@a
U
i >
U
(, produc&nd un dezechilibru ionic,
deshidratare e!tracelular intens cu hemoconcentraie,
oc hipovolemic %scderea volumului total de s&nge
circulant( i acidoz metabolic. ;n absena
tratamentului, n c&teva ore poate surveni un sindrom de
deshidratare acut ce poate deveni mortal.
<!ist i forme clinice intermediare ntre cele descrise i
formele inaparente depistate doar prin coprocultur.
,.1/.1. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
213
Prele"area materiilor fecale, concomitent cu lichidele de
vrstur, se face n recipiente din plastic cu o singur utilizare,
prin sonda @elaton sau cu un tampon rectal. Ga persoanele
suspecte de a fi purttoare se practic o prealabil purgaie salin.
Amediat dup recoltare, prelevatul se trece pe mediul conservant i
de transport, CarO-,lair.
+0amenul microscoic direct, n preparatul nativ, se observ
vibrionii %form de virgul( cu mobilitate caracteristic graie
singurului flagel polar, iar n frotiurile colorate ?ram apar ca
bastonae ncurbate, ?ram-negative %fig. 0*(.
Fi). +8 D Fr4ti' &i# $'lt'r% &e 1ibrio c+olerae 5:!$ili Gr!-<#e)!ti6i
=#$'r:!3i7
/zolarea se face prin nsm&nare pe ap peptonat alcalin
%pJ T 8 # 8,6(, cu rol de mediu de mbogire. 5in pelicula care se
formeaz la suprafaa acestui mediu, se fac dou treceri succesive
din / n / ore, n alte eprubete cu ap peptonat i pe medii
speciale cu sruri biliare, cum este mediul ,+A.
/dentificarea se face din culturi suspecte pe medii selective.
214
Astfel pe mediile ,+A apar colonii transparente, circulare, cu
marginile regulate i suprafa neted %plana AB-6(.
1estul indolfeno!idazei este pozitiv i difereniaz vibrionii
holerici de alte bacterii intestinale. $roduc indol i reduc nitraii la
nitrii, av&nd lizin- i ornitin-decarbo!ilaz.
;n interiorul genului 7ibrio% 7ibrio c*olerae i +l 4or se
determin prin aglutinarea cu ser 3:), reacia pozitiv separ&ndu-i
de speciile @A? i de vibrionii halofilici %nonholerici(, care sunt
ageni poteniali ai unor enterite umane. $entru identificarea
speciei 7ibrio c*olerae se poate utiliza i fenomenul de vibrioliz.
1estele de patogenitate se bazeaz pe evidenierea
enteroto!inei i factorului de colonizare.
+erodiagnosticul este fr interes n perioada acut, n
cazul c&nd holera evolueaz rapid, dar poate fi utilizat ntr-o
anchet epidemiologic pentru un diagnostic retrospectiv,
aglutininele apr&nd dup )3-)- zile.
Serotiia permite identificarea pentru 7ibrio c*olerae 7:),
care are . serotipuri cu factori antigenici a,b i c i astfel se pot
defini servovarurile: 7gaSa %a,b(, Anaba %a,c( i JiNo'ima %a,b,c(,
primele dou fiind mai frecvent izolate i cu rsp&ndire endemic
iar ultimul este rar nt&lnit.
215
,.11. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
HAEMOPHILUS? BORDETELLA I BRUCELLA
,acteriile care fac parte din aceste genuri au comun faptul
c sunt cocobacili ?ram-negativi.
,.11.1. Ge#'l H!e-4"9il'(
Cuprinde cocobacili #ram-negati"i, cu polimorfism
accentuat, uneori capsulai %caracter de virulen(. +peciile mai
importante sunt:
- .aemo*ilus influenzae i .aemo*ilus arainfluenzae,
care se gsesc frecvent ca bacterii comensale
bucofaringiene, alturi de alte specii care fac parte din
microbiocenoza plcii dentare
- .aemo*ilus ducre,i, agent etiologic al ancrului moale
%boal veneric(.
.aemo*ilus influenzae este responsabil de numeroase
infecii.
216
/nfecii rimare=
- rinofaringit, sinuzit, otit, con'unctivite
- meningit acut purulent
- mai rar septicemie, pericardit, osteomielit etc.
Surainfecii secundare, complicaii ale unor maladii
virale de'a instalate, fiind de asemenea, principalul agent
al puseelor purulente ale bronitelor acute i cronice.
,.11.1.1. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
Prele"area produselor monomicrobiene: puroi, GC9, s&nge
%pentru hemocultur( i a celor polimicrobiene, ca secreiile
bronice, se practic respect&nd regulile cunoscute.
+0amenul microscoic direct aduce informaii preioase n
meningitele acute cu .. influenzae, n care frotiurile obinute din
sedimentul GC9-ului i colorate ?ram evideniaz cocobacili ?ram-
negativi, ncapsulai %tip antigenic b(. $rin imunofluorescen pe
frotiuri din sediment, cu antiser de tip b se poate evidenia ..
influenzae.
<!amenul microscopic direct pe frotiuri colorate ?ram, din
secreia de ancru moale, pune n eviden .. ducre,i, important
pentru diagnostic dac inem seama de faptul c aceste bacterii se
cultiv dificil.
/zolarea se face pe geloz-s&nge i pe geloz-chocolat, pe
care se recomand ca, dup nsm&narea produsului patologic,
s se fac o nsm&nare n spoturi de stafilococ, acesta eliber&nd
factorul B i, astfel, favorizeaz dezvoltarea de .aem*ilus n 'urul
spoturilor %fenomenul de satelitism(.
/dentificarea
Prorieti morfotinctoriale: cocobacili ?ram-negativi, cu
polimorfism accentuat
Prorieti de cultur: pe mediile solide se dezvolt sub
form de colonii mici, asemntoare picturilor de rou,
prezent&nd fenomenul de satelitism amintit.
Prorieti bioc*imice: testele indol i ureaz pozitive.
Caracterele antigenice sunt determinate de antigenele
solubile capsulare %tip b( a cror cercetare efectuat direct n
prelevate arat pe l&ng tipul antigenic i aportul lor indiscutabil n
217
infeciile grave. Antigenele capsulare de natur polizaharidic,
specifice de tip, au permis individulizarea a ase tipuri capsulare:
a, b, c, d, e i f %tipul b fiind cel mai rsp&ndit(.
,.11.,. Ge#'l B4r&etell!
9eprezentantul principal al genului, )ordetella ertussis,
este agentul etiologic al tusei con"ulsi"e, numit i bacilul ,ordet-
?engou. Alte specii care pot determina infecii benigne ale cilor
respiratorii superioare, cu simptomatologie asemntoare tusei
convulsive, sunt ). araertussis i ). bronc*isetica.
1usea convulsiv este o infecie acuta a cilor respiratorii cu
evoluie n trei faze distincte: Dfaza cataralE %2 # )3 zile(, cu
rinoree i tuse seac, corespunz&nd unei perioade de ma!im
contagiozitate Dstadiul paro!isticE caracterizat prin accese de tuse
spastic, tipice %6 # * sptm&ni( convalescena %6 # .
sptm&ni(.
,.11.,.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
Prele"area secreiilor traheobronice se face n timpul unui
acces de tuse n recipiente sterile i se nsm&neaz imediat. ;n
perioadele de acalmie se recolteaz aspirat traheobronic sau
lichid de spltur rinofaringian. 9ecoltarea prin metoda Dplcii
tuiteEs-a dovedit a fi eficient n perioada de contagiozitate
ma!im. ,olnavul tuete direct ntr-o plac $etri n care se afl
mediul ,ordet-?engou.
/zolarea se face prin nsm&nare imediat %e!amenul
microscopic fiind lipsit de importan( pe mediul ,ordet-?engou i
medii cu s&nge.
/dentificarea se face dup aspectul coloniilor, asemntor
picturilor de rou, din care se fac frotiuri i se constat prezena
de cocobacili ?ram-negativi, capsulai n culturi tinere.
Prorietile bioc*imice nu sunt semnificative pentru
identificare.
218
!aracterele antigenice sunt comple!e i se disting: antigene
capsulare poliozidice aglutinogene proteice de suprafa
hemaglutinine imunogene piliare lipopolizaharide i un antigen
proteic parietal sau Dfactor pertusigenE, responsabil de efectele
biologice ale acestor bacterii.
,.11.,.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
5iagnosticul serologic nu este eficient n practic, deoarece
anticorpii aglutinai apar tardiv %la 6-. sptm&ni dup faza acut(,
dar este important pentru controlul strii de imunitate dup
mbolnvire sau vaccinare cu trivaccin diftero-tetano-pertusis.
5ecelarea aglutininelor specifice la populaia infantil vaccinat
sau cu o tuse convulsiv atipic n antecedente, are o valoare
diagnostic numai prin punerea n eviden a creterii de * ori a
titrurilor aglutinante, n proba a doua de ser recoltat la interval de .
sptm&ni de la prima recoltare.
,.11.1. Ge#'l Br'$ell!
,acteriile acestui gen sunt agenii etiologici ai brucelozelor,
infecii ale animalelor, transmisibile la om %antropozoonoze(.
?enul )rucella cuprinde trei specii principale:
). melitensis, adaptat la ovine
). suis, la porcine
). abortus bo"is, la bovidee.
Ga om, boala este determinat de contactul direct cu
animalul bolnav sau cu produsele contaminate ale acestuia.
Ga animale, bruceloza se caracterizeaz prin infecii ale
aparatului genital, orhite la masculi i avort la femele, dar frecvent
boala evolueaz fr semne clinice aparente.
Ga om, dup o incubaie de 6-* sptm&ni, boala poate
mbrca trei aspecte:
- bruceloz acut seticemic cu febr ondulant
219
- bruceloz subacut localizat: osteo-articular, genital,
rar neuromeningeal i cu localizri pulmonare sau
cardiovasculare e!cepionale
- bruceloz cronic cu infecii latente n organe diverse:
hepatice, articulare, nervoase, cu simptomatologie
variat.
,.11.1.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
Prele"atele pentru e!amenul bacteriologic sunt: s&ngele
%pentru hemocultur( i mduva osoas iar n raport cu
localizarea: diverse secreii, e!sudate, puroi, urin, bil, lichid
articular sau cefalorahidian, sperm, puncii biopsii, piese de
e!erez sau necroptice etc.
+0amenul microscoic direct i prin imunofluorescen
direct este de mic valoare n bruceloza uman, datorit densitii
reduse a germenilor n produse.
/zolarea agentului patogen prin cultivare este dificil n afara
stadiului acut al bolii. Chiar n perioada febril, hemoculturile
trebuie repetate datorit bacteriemiei trectoare.
Jemocultura se practic pe medii bifazice %lichide i solide
mbogite cu e!tract de ficat de viel( # geloz = i bulion = # dup
procedeul Castaneda: s&ngele recoltat steril, introdus n balonul cu
cele 6 medii i incubat la .0
3
C o dat la .-- zile suprafaa agarului
va fi inundat cu bulion din balon i se va urmri dezvoltarea
bacteriilor. ;n paralel, se nsm&neaz i un balon cu mediu lichid
care se ine n atmosfer de dio!id de carbon )3H. $roba se
consider negativ numai dac la o lun de la nsm&nare pe
geloz = nu s-au dezvoltat colonii caracteristice.
/dentificarea=
Cocobacili, imobili, ?ram-negativi, nesporulai, necapsulai.
$e mediile lichide tulbur uniform mediul, iar pe cele solide cresc
colonii mici, transparente la nceput i care devin apoi brune.
Antigenic, brucelele conin dou compe!e A i ".
Adentificarea dup aceste caractere se face printr-o aglutinare pe
lam a tulpinii izolate cu ser antibrucela.
$atogenitatea e!periental la cobaiul inoculat subcutanat
220
sau intraperitoneal evideniaz o stare septicemic a animalului,
cu hipertrofie ganglionar i leziuni articulare.
,.11.1.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
*eacii serolo#ice
$eaciile de aglutinare se practic de obicei pe lam sau
plci cu godeuri %reacia rapid Juddleson( n care se folosete
serul bolnavului i antigen brucelic concentrat i colorat. 5up
amestecul picturilor de ser n diluii diferite cu antigen, placa se
nclzete la .0
3
C c&teva minute, dup care se citete reacia,
apreciind apariia i mrimea grun'ilor colorai albastru-violet
%reacie pozitiv(.
$eacia Irig*t, de aglutinare lent, folosete un antigen
brucelic corpuscular inactiv, care se adaug unor diluii de ser
%conform schemei de la reaciile de aglutinare n tuburi(. 5up 6*
de ore se citete reacia, apreciind titrul anticorpilor %un titru mai
mare de )I)33 este semnificativ(.
9eacia de aglutinare are o valoare ma!im n stadiile
evolutive %form acut primar(, c&nd titrul poate crete de peste *
ori.
9eacia de aglutinare poate fi negativ sau dubioas n
formele cronice i n infeciile latente, cu rspuns umoral slab. 7
reacie negativ nu e!clude infecia, nici e!istena anticorpilor
specifici, datorit eventualei blocri a acestora. <!ist diferite
procedee de blocare.
4estul antiglobulinic !oombs pune n eviden anticorpi
specifici Ag? neaglutinai, ce s-au fi!at pe bacterii mpiedic&nd
aglutinarea n reacia Wright. 5up splarea antigenului brucelic
capsular, prin centrifugare, se suspend n final sedimentul de
bacterii %)rucella( la care se adaug ser antiglobulinic, iar dup 6*
de ore se citete reacia. 1estul pozitiv T bruceloz.
$eacia de fi0area a comlementului persist pozitiv timp
ndelungat i pune n eviden Ag?.
4estul de imunofluorescen indirect este util n depistarea
brucelozelor cronice.
4estele imunoenzimatice de ti +5/S- permit s se fac
221
distincie ntre brucelozele acute i cele cronice.
/munitatea mediat celular are n bruceloz, ca i n alte
infecii cu localizare intracelular, un rol principal n aprarea
organismului infectat.
Determinarea indicelui osonocitofagic ?/>!@ permite
stabilirea intensitii fagocitozei bacteriilor din suspensia antigenic
de )rucella de ctre polinucleare. ;n cursul infeciei cu )rucella,
capacitatea fagocitar a leucocitelor crete semnificativ fa de cea
din s&ngele persoanelor sntoase. 9eacia poate aduce informaii
asupra aprrii organismului infectat sau chiar a eficacitii
tratamentului, prin intensitatea fagocitozei.
4este de e0lorare a *iersensibilitii secifice=
- in "itro= testul de in*ibare a migrrii leucocitelor i testul
de transformare blastic n prezena antigenelor
brucelice. Aceste teste aduc informaii utile n bruceloza
cronic, cu serologie negativ
- in "i"o= testarea rsunsului alergic rin /D$.
Antradermoreacia la brucelin atest starea de
hipersensibilitate de tip tardiv, gradul acesteia fiind apreciat dup
intensitatea reaciei i diametrul eritemului aprut, o reacie cu un
eritem mai mare de 2 mm fiind considerat pozitiv.
,.1,. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU BACTERII
ANAEROBE
,acteriile anaerobe # caracterizate prin i#$!"!$it!te! lor
de a se dezvolta n prezena o!igenului atmosferic # sunt
incriminate n etiologia a cel puin un sfert din infeciile bacteriene.
$e de alt parte, acestea asigur meninerea echilibrului ecologic
n cadrul florei comensale a organismului uman.
;n cadrul laboratoarelor de microbiologie clinic, diagnosticul
pentru infeciile cu anaerobi se poate referi la dou situaii
distincte:
- izolarea de anaerobi sporulai # genul !lostridium, care
determin infecii specifice, constituii din flor e!ogen
de origine teluric
- izolarea de bacterii anaerobe nesporulate, n afara unor
infecii specifice, practic din variate produse biologice,
222
fc&nd parte din flora endogen comensal sau flora
Beillon.
223
,.1,.1. I#0e$3ii $' !#!er4:i ("4r'l!3i D )e#'l
Cl4(tri&i'-
5iferitele specii aparin&nd genului !lostridium au n comun:
- morfologia microscoic= bacili #ram-oziti"i cu sori
terminali sau subterminali
- tiul de metabolism= strict anaerob
- marea rezisten a sorilor la factori fizico-chimici
- rezena de to0ine roteice care le confer o patologie
specific
- ma'oritatea de origine e!ogen, rar endogen, sunt
bacterii patogene specifice, c&nd li se asigur condiii de
anaerobioz.
+peciile cu importan medical sunt:
- !lostridium tetani% ce determin to!iinfecia tetanic sau
tetanosul
- !lostridium botulinum, agent etiologic al botulinismului
%to!iinfecie alimentar grav(
- !lostridium erfringens i alte specii de !lostridium ale
gangrenei gazoase.
Anfeciile apar dup ce se creeaz n organism condiii
speciale de anaerobioz, acestea doar oferindu-le posibilitatea de
nmulire i de elaborare de to!ine n esuturi.
,.1,.1.1. T4;ii#0e$3i! tet!#i$%
224
1etanosul este o to!iinfecie produs de to!ina bacteriei !l.
tetani. ,oala apare n urma infeciei unor plgi ad&nci i zdrobite
sau n urma unor nepturi murdrite cu impuriti provenite din
pm&nt, resturi de mbrcminte infectate etc. plgi n care
ptrund spori ai bacililor tetanici, care germineaz n condiii de
anaerobioz i de la acest nivel elaboreaz to!ine responsabile de
producerea sindromului tetanic, caracterizat prin contracii tonico-
clonice %puternice, de lung durat i repetate(, datorit aciunii
to!inei asupra plcii motorii neuro-musculare. $rimul semn al
tetanosului este apariia de trismus %contractur dureroas a
muchilor masticatori(, acompaniat de an!ietate, pentru a culmina
%n lipsa tratamentului( cu moarte prin spasm laringian %asfi!ie(.
4ia#nosticul bacteriolo#ic
5iagnosticul de laborator nu prezint interes dec&t n mic
msur, deoarece izolarea agenilor etiologici este lung i dificil,
n timp ce semnele clinice sunt suficient de evocatoare pentru
afirmarea diagnosticului. 5e aceea, atenia trebuie ndreptat spre
administrarea terapeutic a serului antitetanic i profila!ia plgilor
tetanice, fr a atepta rezultatul e!amenului bacteriologic.
$entru confirmarea diagnosticului clinic se recolteaz: puroi
i esuturi din plag, pansamente etc. <!amenul microscopic nu d
rezultate pentru c bacilii tetanici pot fi puini la numr i se pot
confunda cu bacilii asemntori %tetanomorfi(.
/zolarea se face pe medii pentru anaerobi, cu o concentraie
crescut.
/dentificarea din cultura pe medii pentru anaerobi. <!amenul
microscopic evideniaz bacili ?ram-pozitivi, n form de b de
toboar %spor terminal( %fig. 0-(.
225
Fi). +* D Fr4ti' $' lostridium tetani (': 04r-% &e
:!$ili $' ("4ri ter-i#!li
!aracterele de atogenitate: se inoculeaz o suspensie din
produsul patologic sau din cultur n mediu lichid, la cobai dup 8-
)3 zile apar semnele caracteristice de boal. Anocularea de to!in
produce simptomatologie caracteristic evideniat cu proba de
neutralizare in vivo cu antiser specific.
,.1,.1.,. T4;ii#0e$3i! :4t'li#i$%
!lostridium botulinum, agentul etiologic al botulinismului,
into!icaie de origine alimentar, este o bacterie prezent n
pm&nt, ap i pe vegetalele poluate cu spori. Alimentele
contaminate sunt semiconservate sau conservate
necorespunztor, de origine animal: conserve, mezeluri, unc
etc., n care s-a dezvoltat bacilul botulinic i a eliberat e!oto!ina ce
va produce o into!icaie grav. <!oto!ina acioneaz asupra
sistemului nervos periferic la nivelul plcilor neuromusculare,
inhib&nd sinteza de acetilcolin, fapt ce e!plic manifestrile
paralitice, mai ales oculare, apoi ale muchilor bucofaringieni. ;n
lipsa tratamentului, decesul survine n ./-*2 de ore, prin paralizia
centrilor vitali.
226
Diagnosticul de laborator
@ecesit ma!imum de urgen i pentru aceasta se
recolteaz: probe din alimentul incriminat, lichid de vrstur,
materii fecale, urin i s&nge pentru cutarea to!inei n ser. 5e
regul, diagnosticul into!icaiei i determinarea tipului acesteia se
face prin testul numit to!inotipie.
1o!ina se caut n lichidul de spltur gastric, n ser
sangvin, n alimentul incriminat etc. 5ac produsele nu sunt
limpezi, se filtreaz prin h&rtie de filtru, apoi se efectueaz testul
prin inoculare la animale: oareci albi sau cobai, pentru efectuarea
reaciei de neutralizare in vivo. doarecii prote'ai cu seruri
antibotulinice %antito!ine tip( supravieuiesc, cei care nu sunt
prote'ai mor, la fel oarecii la care nu corespund antito!inele cu
tipul antigenic al bacilului botulinic. Ga noi n ar, ma'oritatea
cazurilor diagnosticate au prezentat to!ina de tip ,.
,.1,.1.1. Cl4(tri&i'- "er0ri#)e#( 2i !lte $l4(tri&ii !le
)!#)re#el4r
)!4!(e
Cele mai multe specii din genul !lostridium sunt agenii
etiologici ai unor infecii particulare numite gangrene, caracterizate
prin necroz i
putrefacia esuturilor datorit degradrii prin enzimele acestor
bacterii, acompaniate de o important producie de gaz.
?angrena gazoas apare ca o complicaie a plgilor %de
rzboi sau accidentale( prin contactul cu pm&ntul i prin zdrobirea
esuturilor, n care se creaz condiii de anaerobioz prin
devitalizare i formare de cheaguri de s&nge. !l. erfringens poate
provoca i infecii endogene %aceasta fiind gsit i n colon(, n
urma unor manopere instrumentale %avort, intervenii chirurgicale
sau in'ecii cu substane ischemiante care reduc sau anuleaz
o!igenarea esutului(. +peciile anaerobe care particip mai
frecvent la acest proces sunt: !l. erfringens %prezent totdeauna(,
!l. oedematiens% !l. seticum% !l. *istoliticum %cu participare
227
inegal(. ;n multe cazuri, n aceste plgi se dezvolt i alte bacterii
aerobe cu potenial patogen.
Anfecia se caracterizeaz printr-o culoare livid a esuturilor,
edem care crete rapid, infiltrare cu gaze, miros putrid, necroz.
!l. erfringens poate provoca septicemie, iar prin consum
de alimente infectate - printr-o enteroto!in - i into!icaii
alimentare.
Diagnosticul de laborator
<ste direct i de urgen. 1ehnica de izolare - prin metodele
ce stau la ndem&n - este laborioas i de durat i de aceea nu
se ateapt confirmarea de laborator, ci se trece la tratamentul cu
antibiotice i cu ser antigangrenos polivalent imediat dup
recoltarea fragmentelor de esuturi, s&nge, urin, lichid de serozit
etc.
+0amenul microscoic al prelevatelor din puroi sau
serozitate poate arta, dup coloraia ?ram, bacili ?ram-pozitivi #
mari i groi # cu spori centrali %brcu, fus(, subterminali %rachet
de tenis( sau fr spori.
/zolarea se face n anaerobioz pe agar-s&nge sau pe agar-
glbenu-lactoz pentru obinerea de cultur pur. ;n fiecare plac
se include, ntr-o 'umtate, c&te o antito!in specific, fapt ce
permite - pe l&ng izolare - i determinarea serologic rapid a
tipurilor de clostridii prezente.
/dentificarea se bazeaz mai ales pe unele caractere:
- bioc*imic: unele specii sunt proteolitice %!l. *istoliticum
i !l. seticum(, diger&nd serul coagulat, fragmente de
organe, laptele turnesolat etc.
- antigenice: prin antigenele D7E i DJE, identificate prin
reacii de aglutinare pe lam cu seruri monovalente.
!aracterele de atogenitate entru oarece i ieure. $rin
inoculare subcutanat sau intramuscular fiecare specie cauzeaz
moartea animalelor, provoc&nd leziuni caracteristice.
,.1,.,. A#!er4:i #e("4r'l!3i
228
+unt bacterii comensale ale tegumentelor i mucoaselor,
cunoscute sub denumirea de flor endogen strict anaerob,
nesporulat %flor Beillon(, care nu invadeaz esuturile dec&t n
urma unor traumatisme, a unor manipulri chirurgicale %chirurgie
abdominal, de e!.(, precum i a scderii rezistenei naturale la
imunodeprimai.
Anaerobii nesporulai sunt responsabili de septicemii i
supuraii:
- cele mai frecvente sunt supuraiile abdominale:
peritonite, apendicite, supuraii post-operatorii
abdominale, abcese subfrenice etc.
- supuraii n micul bazin: abcese perirectale, supuraii
urogenitale etc.
- supuraii pleuro-pulmonare, bucale %abcese dentare( i
79G %otite cronice(
- abcese ale creierului i meningit purulent.
Anaerobii nesporulai aparin mai multor genuri i specii,
dintre care principalii patogeni sunt:
Coci ?ram-pozitivi: Petococcus i Petostretococcus,
genuri capabile s produc: abcese dentare, amigdalite, sinuzite,
abcese pulmonare, infecii postabortum cu septicemii i diseminare
n alte teritorii, apendicite etc.
Coci ?ram-negativi: genurile 7eillonella i
-cidaminococcus, componeni ai microbiocenozelor, e!cepional
implicai n patologie.
,acili ?ram-pozitivi: +ubacterium i )ifidobacterium
%comensale( Proionibacterium i -ctinom,ces cu specia -.
israeli care se gsete n microbiocenoza bucofaringian i este
responsabil de producerea abceselor dentare, infeciilor tractului
respirator, actinomicozelor, abceselor cerebrale, hepatice etc.
,acili ?ram-negativi: din genul )acteroides i genul
Fusobacterium cu F. nucleatum i F. necro*orus care determin
faringite necrozate, abcese cerebrale i hepatice etc.
Cocobacili ?ram-negativi, ca: Por*,romonas% Pre"otella i
-ctinobacillus actinom,cetemcomitans.
,.1,.,.1. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
229
Prele"area trebuie s se fac e"it3nd total contactul
rodusului cu aerul. $uncia se face cu o sering etan, al crei
ac, dup aspirarea produsului, este nfipt ntr-un dop din plastic
steril i se e!pediaz imediat la laborator, pentru a fi prelucrat c&t
mai rapid posibil. Alte produse se recolteaz prin tehnici adecvate,
n funcie de felul produsului.
<!amenul microscopic, dup coloraia ?ram, poate
diferenia dou situaii:
- evidenierea unei singure specii, a crei dezvoltare pe
medii n anaerobioz permite diagnosticul etiologic,
identificarea i antibiograma
- punerea n eviden a unui polimorfism microbian care
poate fi util n cazul n care alturi de bacili ?ram-
negativi apar i bacterii fusiforme sau filamente cu
ramificaii care sugereaz o etiologie actinomicotic.
!ulti"area se recomand a se face direct pe medii solide i
lichide, at&t n anaerobioz c&t i n aerobioz, pentru a diferenia
anaerobii veritabili de bacteriile aerobe-anaerobe facultative.
$lcile cultivate n anaerobioz se vor deschide dup *2 ore, c&nd
se e!amineaz cu lupa, not&ndu-se aspectul coloniilor i fc&ndu-
se frotiuri.
$rezena unei bacterii anaerobe este sugerat de:
- cultura pozitiv n plcile incubate anaerob i absent n
plcile aerobe
- pe mediile n anaerobioz se constat colonii diferite, cu
germeni morfologic diferii fa de cei din aerobioz.
/dentificarea speciilor este dificil i accesibil laboratoarelor
de specialitate, unde se apeleaz la teste biochimice, inclusiv
analiza cromatografic.
230
,.11. DIAGNOSTICUL SIFILISULUI
Agentul etiologic al sifilisului sau luesului, boal veneric
specific uman, este 4reonema allidum. Contaminarea se face
prin contact direct: contact se!ual sau pe cale congenital %de la
mam la ft( # sifilisul congenital.
-lte treonematoze sunt: )eFenelul sau sifilisul endemic dat
de 4reonema allidum n bazinul mediteraneean i n unele zone
din Africa, caracterizat prin leziuni cutanate Pianul, o boal data
de 4reonema ertenue, observat n regiunile tropicale i Pinta
sau Carate, determinat de 4reonema carateum n America
Central i de +ud.
Ga adult, transmiterea sifilisului se face aproape e!clusiv pe
cale se!ual, dat fiind fragilitatea treponemelor implicate i
distrugerea lor n afara organismului.
5up contactul infectant, incubaia sifilisului este n medie
de trei sptm&ni. Clinic, boala evolueaz n trei perioade:
Sifilisul rimar # dureaz 6-* sptm&ni i se caracterizeaz
prin apariia unei leziuni unice, ulcerativ i indurat, numit
ancru dur, localizat genital n peste 88H din cazuri i numai
rar n regiunea bucal sau anal. <roziunea indurat a
ancrului, acoperit cu o crust, are o serozitate foarte bogat
n treponeme %spirochete(, constituind principala surs de
contagiune. 5up apro!imativ 6-* sptm&ni, ancrul se
vindec sontan cu sau fr cicatrice.
231
Sifilisul secundar apare la 6-. luni de la contaminare %*---3 zile
de la producerea ancrului( sub forma unor leziuni
caracteristice, care reprezint faza de infecie generalizat,
treponemele fiind prezente n umori i unele esuturi
%contagiozitate mare(. Geziunile secundare apar ca rozeole
cutanate i aule umede %mucoase(. 5up c&teva luni %mai rar
)-. ani( leziunile secundare se QvindecE spontan, urm&nd o
perioad lung de sifilis latent care poate dura ani sau zeci de
ani.
Sifilisul teriar apare %la bolnavii netratai sau tratai insuficient(,
dup faza de laten, sub forma unor manifestri teriare:
leziuni gomatoase %gome(, tegumentare i osoase modificri
degenerati"e ale sistemului ner"os central %tabes, paralizie(
leziuni cardio"asculare %aortite, anevrisme( *eatice etc.
Actual se descriu frecvent cazuri de sifilis QdecapitatE la
persoane infectate i tratate cu antibiotice n doze insuficiente
%e!emplu: infecia mi!t sifilis-gonoree(.
,.11.1. Di!)#4(ti$'l :!$teri4l4)i$
5iagnosticul de laborator urmrete:
- punerea n eviden a agentului etiologic, 4reonema
allidum, prin e!amen microscopic direct
- punerea n eviden a anticorpilor antitreponema
%diagnosticul serologic(.
,.11.1.1. Prele6!re! "r4&'(el4r "e#tr' e;!-e#'l
:!$teri4l4)i$
+e rezum la serozitate # ce poate fi recoltat de la nivelul
ancrului dur %rar din cea a rozeolelor cutanate sau plcilor
mucoase(.
$entru obinerea unui produs patologic bogat n treponeme,
leziunea se spal %prin tamponare( cu o soluie salin fiziologic
steril, dup care se ndeprteaz parial crusta i cu o pipet
$asteur, prevzut cu o tetin, se aspir serozitatea din leziune.
232
,.11.1.,. E;!-e#'l -i$r4($4"i$ &ire$t
$relevatul se e!amineaz nativ i pe frotiuri colorate
?iemsa, =ontana-1ribondeau sau prin imunofluorescen.
Prele"atul nati" e!aminat la microscopul cu fond ntunecat
evideniaz, pe fondul negru al preparatului, treponemele albe,
strlucitoare, refringente, cu )3-63 spire regulate, egale i dispuse
n acelai plan %fig.0/(.
Fi). +> D Treponema pallidum =# (er4it!te! &i# 2!#$r'l &'r
5e;!-i#!re =# $@-" =#t'#e$!t7
4reonema allidum se deosebete de treponemele
saprofite i de alte spirochete %fig.00(, at&t prin form c&t i prin
micrile vii, caracteristice: rotaie, nurubare, fle!iune
%treponemele saprofite av&nd micri mult mai lente(. Caracterul
de mobilitate poate fi util n diagnostic c&nd e!amenul direct se
practic naintea aplicrii unui tratament local sau general.
233
Fi). ++ D A("e$te -4r04l4)i$e !le &i0eritel4r )e#'ri &i# 0!-ili!
Spiroc+etaceae 5&'"% Aele Ferr4#7
1reponemele saprofite pot fi nt&lnite pe mucoasa genital
%e!.: 4reonema genitalis( i, prin prezena lor, pot perturba
diagnosticul direct, n cazul n care s-au aplicat tratamente ce pot
duce la inhibarea mobilitii treponemelor patogene.
4e*nica imunofluorescenei directe prin care prelevatul se
trateaz cu ser specific antitreponema pallidum marcat fluorescent.
<!amenul microscopic n :.B. relev treponemele fluorescente cu
morfologia tipic, permi&nd diferenierea 4. allidum de cele
saprofite.
Frotiurile colorate cu metoda ?iemsa, coloraia ,urri prin
impregnarea argentic %coloraia =ontana-1ribondeau( permit, de
asemenea, evidenierea treponemelor n microscopia direct.
,.11.1.1. I4l!re!
,
234
4reonema allidum nu poate fi cultivat in vitro, dar # fiind
patogen pentru unele animale de laborator - se poate izola prin
inoculare intratesticular la iepure, care face o orhit. "etoda este
folosit pentru obinerea tulpinilor patogene, din care face parte i
tulpina Nic*ols %surs de antigene pentru serodiagnostic(.
,.11.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t < (er4l4)i$
4reonema allidum are trei principale antigene n structura
sa: lipidic, polizaharidic i proteic. Antigenul lipidic are o structur
identic cu a altor lipide din structuri animale sau umane, cum este
i lipidul din cord de bou %antigenul cardiolipidic(, folosit ca antigen
netreponemic pentru decelarea anticorpilor n diagnosticul
serologic al sifilisului.
Anticorpii antitreponemici apar n serul bolnavilor n cursul
fazei primare, n medie la 63-*3 zile de la contaminare.
,.11.,.1. Re!$3ii (er4l4)i$e
;n diagnosticul serologic al sifilisului se aplic dou grupe de
reacii serologice:
- reacii cu antigene cardiolipidice
- reacii cu antigene treponemice.
*eacii cu anti#ene cardiolipidice
Antigenul prin care se evideniaz prezena anticorpilor
anticardiolipidici %reagine( este un e!tract lipidic nespecific
%deoarece nu provine din treponeme, dar are structur identic(,
cel mai frecvent, un e!tract alcoolic purificat, din cord de bou,
numit cardiolipin.
$ot fi folosite diverse reacii, fiecare prezent&nd ns
avanta'e i dezavanta'e, de aceea n diagnosticul sifilisului se
utilizeaz mai multe teste serologice.
$eacia 7D$5 %Beneral 5isease 9esearch GaboratorO( se
e!ecut prin tehnici uor reproductibile, prin micrometode, cu mare
sensibilitate, dar cu o slab specificitate, d&nd cel mai mare
235
procent de rezultate fals pozitive %reacii pozitive la persoane care
nu au sifilis(.
<ste o reacie de aglutinare pasiv, microcristalele de
colesterol %din componena antigenului(, ncrcate cu cardiolipin
fiind aglutinate cu anticorpii antilipoidici din serul bolnavului.
'icroreacia 7D$5, efectuat n plci de polistiren cu
godeuri, n care se depun 3,) ml ser de cercetat i o pictur de
antigen B59G %diluat dup indicaiile productorului # Anstitutul
DCantacuzinoE(. +e agit circular placa timp de * minute. 9eacia
se citete cu lupa, urmrindu-se apariia flocoanelor n lichidul care
se va clarifica %rezultat pozitiv(. Absena anticorpilor n serul
cercetat se traduce prin lichid tulbure, fr flocoane. "icroreacia
este un test de tria', care se completeaz cu tehnica n tuburi %3,6-
ml ser de cercetat inactiv 3,6- ml antigen B59G diluat # agitare -
minute i apoi centrifugare )3 minute la 6333 rpm(. +e noteaz
intensitatea reaciei slab pozitiv %U( pozitiv mediu %UU( pozitiv %UUU
sau UUUU( # flocoane mari n lichid clarificat.
$eacia de fi0are a comlementului ?$F!@ cu fi!are la cald
%.0
3
C(, 9,W clasic, are mare specificitate, dar cu o sensibilitate
mai redus dec&t B59G %put&nd da rezultate negative la bolnavi de
sifilis, mai ales teriar(. $entru creterea sensibilitii se practic
9=C la rece %U*
3
- U 2
3
( prin tehnica 9=C Holmer sau microreacia
,radstreet i 1aOlor.
;n diagnosticul de rutin al sifilisului se recomand s se
foloseasc concomitent un test B59G %de floculare( i un test 9=C.
*eacii cu anti#ene treponemice
Aceste teste utilizeaz antigene provenite din 4reonema
allidum patogen, vie, omor&t sau e!tractele acesteia,
evideniind anticorpi antitreponemici de mare valoare diagnostic.
Cu rezultate mai slabe este folosit i 4reonema $eiter ca surs
de antigen.
4estul de imunofluorescen cu antigen treponemic din
tulpina @ichols # testul =1A-A,+ %=luorescent 1reponemal
AntibodO Absorbtion 1est( se practic recent, ca o prob de nalt
valoare, at&t ca specificitate, c&t i ca sensibilitate.
4estul 4P.- %1reponema $allidum Jemagglutination
236
AssaO(, bazat pe o reacie de hemaglutinare pasiv, utilizeaz un
lizat de 4. allidum fi!at pe hematii. :n test simplu, uor de
efectuat n laboratoarele de serologie, av&nd o specificitate i
sensibilitate mare.
4estul 4P/ %1reponema $allidum Amobilization( T 1estul lui
@elson. 1reponemele vii sunt imobilizate prin anticorpii %Ag?(
subiecilor cu treponematoze.
,.11.,.,. I#ter"ret!re! re!$3iil4r 2i e64l'3i! !#ti$4r"il4r
9eacia =1A i reacia B59G se pozitiveaz odat cu
apariia ancrului, n perioada primar, c&nd devine pozitiv i
9=C, fiind urmate de pozitivarea 1$JA # reacia @elson av&nd
valoare mare n perioada secundar.
;n absena tratamentului, nivelul anticorpilor ncepe s
scad lent i progresiv dup /-6* de luni de evoluie, c&nd poate
s se negativeze complet, n timp ce alte reacii rm&n pozitive
mult timp.
5up tratament, dac sifilisul este tratat corect, dup / luni
se vor negativa toate reaciile. 9econtaminrile se traduc printr-o
ascensiune accelerat a nivelului de anticorpi.
<!ist relativ numeroase cazuri c&nd se obin rezultate
pozitive la persoane la care este e!clus posibilitatea unei infecii
treponemice %rezultate fals pozitive(. 7 parte se datoresc unor
greeli de recoltare, conservare sau transport al s&ngelui starea
fiziologic a pacienilor n momentul recoltrii %oboseal, ingestie
de alcool, graviditate etc.(. Alte rezultate fals pozitive se datoreaz
unor infecii bacteriene, virale sau unor parazitoze, care au n
structura lor factori antigenici comuni cu ai treponemelor %factor
lipidic(, acestea fiind pasagere.
237
,.18. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
LEPTOSPIRA I BORRELIA
,acterii spiralate, fle!ibile, cu un aparat locomotor
intracelular, aparin&nd familiei Siroc*aetaceae %alturi de cele din
genul 4reonema(, produc mbolnviri umane: leptospiroze i,
respectiv, febrele recurente %al cror agent etiologic principal este
)orrelia recurrentis(.
,.18.1. Di!)#4(ti$'l le"t4("ir4el4r
=oarte rsp&ndite n natur, leptospirele sunt bacterii care
pot infecta numeroase specii animale %produc&nd zoonoze( i
determin&nd accidental, la om, infecii dintre care cea mai grav
este leptospiroza ictero-*emoragic.
<!ist dou specii de leptospire:
- 5etosira interrogans, patogen pentru om i animale
- 5etosira bifle0a, specie saprofit.
Geptospirele patogene cuprind mai multe subspecii sau
serogrupuri, clasificate n funcie de patogenitatea pentru om i de
animalul care reprezint rezervorul %obolan, oarece, porc, c&ine
etc(: 5. interrogans ictero*aemorr*agiae% 5. i. canicola% 5. i.
238
omona etc.
;n diferitele leptospiroze patogenia este asemntoare:
bacteriile ptrund n organism prin piele sau mucoase %leptospirele
fiind capabile s strpung pielea i mucoasele(, disemineaz pe
cale sanguin i se localizeaz n rinichi, ficat, meninge etc.
Anfecia uman tipic, cea mai sever, este dat de 5.
ictero*aemorr*agiae, care produce icterul infecios cu
recrudescen febril, cu semne de atingere renal i meningeal.
:n numr mic de cazuri pot prezenta o evoluie anicteric, febril,
pseudogripal, acompaniat de semne meningeale.
,.18.1.1 Di!)#4(ti$'l &ire$t
;n cursul fazei acute febrile %n primele )6 zile( bacteriile se
gsesc n s&nge i GC9. +unt necesare mai multe hemoculturi,
pentru care s&ngele se va recolta pe anticoagulant %o!alat de
sodiu(.
n ractic=
-cutarea leptospirelor la microscopul optic pe fond ntunecat %mai
ales n GC9( este rar nsoit de succes
-prin nsm&narea pe medii speciale %cu ser de iepure )3H(, la
temperatura de .3
3
C, culturile se pot pozitiva n a --a zi, pan la a
)--a zi de la incubare
-inocularea la cobai poate da rezultate pozitive %din organele
animalului put&nd fi izolate leptospirele(.
5up )--63 zile leptospirele sunt eliminate prin urin i pot fi
evideniate prin e!amen microscopic %fond negru(, ca i prin
cultivare sau inoculare la cobai.
Ga e!amenul microscopic %preparat nativ( se vd filamente
foarte subiri, helicoidale, cu spire fine i regulate %n dini de
fierstru(, cu capetele ndoite n form de c&rlig, mobile. =rotiurile
se e!amineaz dup coloraie ?iemsa, ,urri sau =ontana-
1robondeau.
,.18.1., Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
239
;n leptospiroze anticorpii pot fi detectai ncep&nd cu a
asea zi de boal i ating nivelul ma!im la .-* sptm&ni.
+e folosesc o serie de teste serologice, dintre care n
practica de diagnostic sunt mai frecvente: reacia de aglutinare-
liz, reacia de fi!are a complementului i reacia de
imunofluorescen .
*eacia de a#lutinare"liz
Antigenul este reprezentat de culturi n mediu lichid, cu
tulpini cunoscute de leptospire. +e fac diluii cresc&nde din serul
bolnavului i din fiecare diluie se practic aglutinri pe lam. 5up
un contact scurt al serului diluat cu antigenul cunoscut se
e!amineaz lichidul la microscopul cu fond ntunecat. 5ac reacia
este pozitiv se observ fenomenul de aglutinare-liz
%ngrmdirea leptospirelor cu aspect caracteristic(. 1ipul de
leptospir fa de care se nregistreaz titrul cel mai mare,
constituie agentul etiologic al infeciei.
*eacia de fixare a complementului - se face dup
tehnica Ada-,engston. Antigenul se prepar dintr-o leptospir
saprofit care conine antigene de grup, comun cu toate speciile
patogene %permite diagnosticul de leptospiroz(.
,.18.,. Ge#'l B4rreli!
@umeroase specii de ,orrelia se gsesc la artropode,
roztoare, psri i mamifere, put&nd determina mbolnviri la om,
cea mai cunoscut fiind febra recurent transmis prin cpu sau
prin Pediculus *ominis %pduche( . 5intre numeroasele specii, au
fost mai frecvent descrise ca specii patogene:
- )orrelia recurrentis, agent etiologic al febrei recurente
- )orrelia burgdorferi %descris n )826 de ctre
,urgdorfer(, agentul boreliozei de GOma.
240
,oala se manifest n trei faze:
- faza primar, cu localizare la locul de inoculare
- faza secundar, cu septicemie n care agentul patogen
este prezent n s&nge i GC9
- faza teriar care poate dura mai muli ani de la
contaminare %cu semne articulare, nervoase i
cardiovasculare( risc de transmitere prin transfuzii.
<!istena boreliozei de GOma este azi recunoscut n
mai multe ri din <uropa.
Diagnosticul direct al boreliozelor este dificil. <!amenul GC9
la microscop, pe fond ntunecat, arat o spirochet lung, fle!ibil,
foarte mobil. Cultivarea necesit medii comple!e, cu ingrediente
folosite i la culturile de celule. ,acteriile pot fi izolate din s&nge,
GC9 i din lichide articulare %fig.02(.
Diagnosticul indirect, serologic, se efectueaz prin
imunofluorescen indirect. @ivelul anticorpilor peste )I6-/ este
considerat ca semnificativ.
Fi). +. D %orrelia recurrentis =#tr<'# 0r4ti' &e (@#)e
$4l4r!t Gie-(!.
241
,.1*. DIAGNOSTICUL RICRETTSIOZELOR
9icNettsiile sunt bacterii care se multiplic numai n celule vii
%cu e!cepia $. Puintana(. +unt larg rsp&ndite n natur %la
insecte, psri, mamifere( i transmise la om prin artropode
%pduche, cpue(, rar pe cale aerogen %febra [( , produc&nd
mbolnviri cu caracter epidemiogen:
4ifosul e0antematic eidemic, maladie febril al crui vector
este pduchele i av&nd ca ageni etiologici:
- $icDettsia roBazeDii, provoac tifosul e!antematic
- $icDettsia t,*i ?mooseri@% determin tifosul e!antematic
endemic sau murin
- $icDettsia canada, recent introdus, av&nd ca principal
vector cpua.
Ga fotii bolnavi de tifos e!antematic pot apare reactivri de
infecii cu $. roBazeDii, boala ,rill.
Febrele tate, boli febrile cu evoluie grav: febra ptat a
munilor st&ncoi %$. ricDettsii( febra butunoas %$.
conorii( ricNettsiozele de cpue etc.
Febra N% determinat de !o0iella burnetti, manifestat prin
simptome pulmonare %cu numeroi vectori( .

,.1*.1 Di!)#4(ti$'l &ire$t
Are o utilitate redus deoarece prezint un risc de
contaminare, prin manipularea materialelor infectate %transmitere la
om prin aerosoli( , de aceea izolarea acestor bacterii se face n
laboratoare de specialitate, cu precauii deosebite.
,.1*.1.1. I4l!re! 2i i&e#ti0i$!re! ri$Cett(iil4r
+e recolteaz= s&ngele, urina, materiile fecale, GC9, lichide
242
pleurale etc. Artropodele pot fi recoltate dup gsirea lor pe un
pacient febril suspect de ricNettsioz %febr [- cpu, tifos
e!antematic- pduche( .
/zolarea se face numai n celule vii, prin:
- inocularea n oul embrionat %un embrion de --0 zile(, n
sacul vitelin
- inocularea la cobai intraperitoneal, urmat de declanarea
unei boli febrile
- inocularea n culturi de esuturi neproliferative, n celulele
crora $.. roBazeDii se dezvolt n citoplasm, iar
celelalte ricNettsii n citoplasm i nucleu.
/dentificarea
5in oul embrionat se fac frotiuri %amprente( din sacul vitelin,
care se coloreaz ?iemsa iar la e!amenul microscopic se vd
cocobacili. 5in sacul vitelin se mai pot prepara antigene care se
identific cu seruri standard, prin 9=C.
,.1*., Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
Are o utilizare mult mai mare i se practic prin:
$eacia Ieil-Feli0, de aglutinare n tuburi, prin diluii
succesive a serului de bolnav care se pun n contact cu antigen
$roteus 7P-)8 %datorit comunitii antigenice a acestuia cu
9icNettsia(. 5up incubare 6* ore la .04C se citete reacia al
crui titru este dat de diluia cea mai mare la care apare
aglutinarea. 1itrul semnificativ este considerat cel de peste )I633.
$F! - dup metoda Ada-,engston, pe probe perechi de
seruri.
/munofluorescena cu antigene purificate din sacul vitelin U
ser de bolnav i antiglobulin uman marcat.
4estele +5/S- i $/- sunt tot mai des utilizate pentru
evidenierea anticorpilor fa de toate tipurile de ricNettsii amintite.
243
,.1>. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
CHLAMSDIA
,acteriile din genul !*lam,dia, patogene pentru om i
animale, sunt parazite obligatoriu, intracelulare, multiplic&ndu-se
numai n celula gazd. Acest gen cuprinde trei specii patogene:
!*lam,dia trac*omatis% care paraziteaz omul i este
agentul etiologic al: trahomului, con'unctivitei cu incluziuni,
al unor boli cu transmitere se!ual %uretrite, cervicite i
limfogranulomatoza benign inghinal venerian(
!*lam,dia sittaci %ca rezervor de bacterii fiind psrile i
mamiferele( poate mbolnvi omul, determin&nd pneumonii
atipice i alte infecii respiratorii pseudogripale
!*lam,dia neumoniae, o nou specie regrupat n acest
gen, care provoac: pneumonii atipice, bronite, sinuzite i
faringite, diferena esenial fa de !. sittaci fiind absena
unui rezervor animal, transmisia fiind e!clusiv interuman.
"aladiile se!uale transmisibile determinate de ChlamOdii
prezint o importan deosebit prin frecvena lor %apro!imativ -3H
din uretritele i cervicitele diagnosticate n ultimii ani(, c&t i
244
numrul mare de complicaii, alturi de problemele de diagnostic i
tratament pe care le ridic.
Astfel, la brbat infecia se manifest iniial ca o uretrit
trenant ce se poate complica n cele mai frecvente cazuri cu
epididimit. Ga femei, cervicita se complic, prin transmitere
ascendent, cu salpingit, put&nd antrena o sterilitate secundar.
,.1>.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
,.1>.1.1. Prele6!re! "r4&'(el4r
<ste necesar ca prelevarea s se fac corect i produsele
s se conserve n mediu de transport pentru !. trac*omatis,
aceasta fiind de o mare fragilitate.
5a brbat, prelevatul trebuie s fie recoltat din uretr.
+ecreiile sunt recoltate cu o chiuret sau un tampon subire,
introduse .-* cm n uretr. $rintr-o rotaie uoar se antreneaz
celulele uretrale care pot conine !*lam,dia.
5a femei% prelevatele se obin de la nivelul canalului
endocervical, celulele vaginale neav&nd receptori pentru !.
trac*omatis.
$entru prelevatele con'unctivale se folosesc tampoane
sterile, cu a'utorul crora se recolteaz secreia purulent i
celulele con'unctivale.
;n pneumonii se vor recolta: secreii naso-faringiene, sput
i aspirate bronice.

,.1>.1.,. Te9#i$i r!"i&e &e &i!)#4(ti$
5intre tehnicile care ne stau la dispoziie se recomand cele
care:
- pun n eviden incluziuni intracelulare caracteristice
- pun n eviden bacteriile prin cultivare.
Coloraia ?iemsa relev prezena incluziunilor, dar poate
furniza multe rezultate fals pozitive, fiind puin sensibil, astfel c n
245
infeciile genitale se prefer izolarea pe culturi.
/munofluorescena% at&t direct c&t i indirect, este
sensibil i frecvent folosit n diagnosticul trahomului, uretritelor,
cervicitelor i con'unctivitelor cu ChlamOdia. Amunofluorescena
direct relev specific prezena corpilor elementari bacterieni prin
utilizarea anticorpilor monoclonali antichlamOdia.
Amunofluorescena indirect accesibil unui numr mare de
laboratoare, utilizeaz seruri imune cu spectru de reactivitate
mare, obinute prin hiperimunizarea iepurilor. Acestea puse n
contact cu materialul din frotiuri se coloreaz cu antiseruri
con'ugate cu izotiocianat de fluorescein. Ancluziunile tipice apar ca
o mas bine definit n interiorul celulelor epiteliale, prezent&nd o
fluorescen galben-verzuie.
4e*nica colorrii cu iod. =rotiurile de racla' uscate la aer i
fi!ate cu metanol absolut se coloreaz cu Gugol, .-- minute. +e
e!amineaz imediat la mrime 633!, iar incluziunile apar ca mase
brun-rocate, n interiorul celulelor epiteliale.
,.1>.1.1. I4l!re! 2i $'lti6!re!
/zolarea e oarece
+e folosesc linii sensibile la infeciile cu ChlamOdii:
- inocularea intraeritoneal a 3,- ml produs diluat )3-63H
produce moartea animalelor la .-)3 zile de la infectare
- inocularea intracerebral a 3,3. ml de suspensie )3H
duce la paralizie n 6*-*2 ore
- inocularea intranazal a 3,3.-3,3- ml suspensie )3H sub
anestezie cu eter determin apariia unor semne de
infectare i moartea animalelor n 6-63 zile.
/zolarea i culti"area e sacul "itelin al oului embrionat de
gin.
+e inoculeaz ou cu embrion de /-0 zile. 5up ). zile de
la inoculare se separ sacul vitelin din care se fac frotiuri care se
246
coloreaz ?iemsa. ChlamOdiile apar colorate n rou strlucitor,
celulele sacului vitelin n verde.
/zolarea n culturi de celule
Giniile celulare sensibile sunt: "cCoO, JeGa 668, ,J>-6)
etc. Culturile de celule infectate apar colorate galben-verzui,
strlucitor, cu form semilunar.
,.1>.,. Di!)#4(ti$'l i#&ire$t
;n diagnosticul serologic, cele mai utilizate reacii sunt:
$eacia de fi0are a comlementului ?$F!@ pune n eviden
anticorpii fa de antigenul vitelin al embrionului. "etodele utilizate
sunt Ada ,engston, pentru care se ia n considerare ca titru minim
)I.6 pentru evidenierea anticorpilor n proba unic.
4estul de microimunofluorescen este mai sensibil i
specific pentru titrarea anticorpilor antichlamOdia, permi&nd un
diagnostic de specie. "area sensibilitate a acestui test se traduce
prin probele pozitive n 23-83H din cazurile cu infecii genitale date
de ChlamOdii.
4estul +5/S- se practic de obicei n microplci n care
antigenul speciilor de ChlamOdia, preparat n culturi de celule
"cCoO este absorbit la suprafaa godeurilor. "etoda d rezultate
bune n ornitoz, psitacoz i n limfogranulomatoza venerian.
Conduita diagnosticului de laborator al acestor infecii n
corelaie cu manifestrile clinice se poate rezuma astfel:
- n prezena unei infecii de suprafa %uretr, endocol,
con'unctiv(, accesibil, etiologia chlamOdian se confirm prin
evidenierea incluziunilor caracteristice ale acestor bacterii
- n infeciile profunde %epididimite, salpingite, pneumopatii(
nivelul crescut al anticorpilor antichlamOdieni este evocator pentru
etiologia chlamOdian.
247
,.1+. DIAGNOSTICUL INFECIILOR CU
MSCOPLASMA
"Ocoplasmele sunt bacterii lipsite de perete celular, ceea ce
e!plic polimorfismul lor. ?enul ',colasma cuprinde un numr
mare de specii, dintre care puine sunt patogene pentru om:
- ',colasma neumoniae% mOcoplasm respiratorie al
crui potenial patogen este foarte mare
- ',colasma *ominis% cu localizare genital
- ',colasma genitalium% specie nc puin cunoscut,
izolat iniial din tractul genital, dar care s-a dovedit a fi o
mOcolasm respiratorie
- (realasma ureal,ticum, mOcoplasm genital.
,.1+.1. MO$4"l!(-! "#e'-4#i!e
<ste o bacterie polimorf, care prezint o e!tremitate efilat
capabil de a se fi!a pe mucoasele cilor respiratorii printr-o
adezin %unul din antigenele de natur proteic( .
'. neumoniae provoac infecii respiratorii benigne, de
tipul traheobronitelor i mai rar pneumonia atipic primar, mai
ales la subiecii tineri, care se traduce printr-un tablou clinic
polimorf i anomalii radiologice sub forma infiltratelor
limfoplasmocitare peribronice. Aceast specie bacterian mai
poate provoca i alte manifestri: 79G, cutanate, hematologice,
neurologice, cardiace etc.
248
,.1+.1.1. Di!)#4(ti$'l &ire$t
+0amenul microscoic al prelevatelor: e!pectoraii, lichide
de lava' bronho-alveolar, nu aduce informaii utile.
Amunofluorescena poate evidenia '. neumoniae n macrofagele
din prelevate.
/zolarea se face pe medii speciale, prelevatele fiind
nsm&nate pe aceste medii la patul bolnavului sau n medii de
transport, dat fiind fragilitatea acestor bacterii.
/dentificarea se bazeaz pe e!amenul microscopic al
coloniilor prelevate din mediul de cultur, dup coloraie ?iemsa,
coloraie cu acridin-orange etc., evideniind formaiuni e!trem de
polimorfe.
Caracterele de cultur pe medii acelulare %cu colesterol,
fosfolipide, e!tracte din dro'die de bere( i pe medii cu s&nge, pot
orienta spre diagnosticul de infecie cu ',colasma, dup
aplicarea unor teste biochimice i, mai ales, antigenice
%imunofluorescen, inhibarea dezvoltrii coloniilor n medii cu ser
imun specific etc.( .
,.1+.1.,. Di!)#4(ti$'l (er4l4)i$
<ste esenial n diagnosticul infeciilor cu '. neumoniae.
$unerea n eviden a aglutininelor la rece n serul bolnav %reacia
de crio*emaglutinare@ este posibil n ma'oritatea cazurilor.
/munofluorescena utilizeaz ser antimOcoplasm preparat
pe iepure i antigamm aglobulin de iepure marcat cu substan
fluorescent %metoda indirect( .
$F!-ul se practic folosind diferite antigene, n dou probe
de ser, recoltate la interval de 0-)3 zile. +e consider reacie
pozitiv dac, n serul al doilea, titrul anticorpilor este de cel puin *
ori mai mare dec&t primul.
Alte reacii serologice: +5/S-% reacia de *emaglutinare
asi" etc., sunt disponibile dar mai puin utilizate.
,.1+.,. MO$4"l!(-e )e#it!le
5ou specii de mOcolasme sunt responsabile de infecii
249
genitale: '. *ominis i (realasma ureal,ticum %mOcolasm
posed&nd ureaz( .
$rezena acestor specii ca i comensale la indivizii sntoi
face dificil aprecierea potenialului lor patogen.
(. ureal,ticum este responsabil de apro!imativ )-H din
cazurile de uretrite negonococice, put&nd 'uca rol n sterilitatea de
cauz necunoscut, precum i de avorturi spontane.
'. *ominis este rar izolat n cazuri de salpingite. 9olul su
n vaginitele nespecifice nu este cert.
5iagnosticul de laborator este doar direct. Cultivarea
prelevatelor din vagin, cervi!, biopsie de endometru etc., pe medii
de cretere lichide sau solide %nsm&nare imediat dup recoltare(
permite o izolare n )2-*2 de ore. Adentificarea se face dup
caracterul de cultur %colonii foarte mici, circulare( i dup
caracterele biochimice.
5iagnosticul serologic nu d rezultate, rspunsul n anticorpi
fiind foarte slab.
"Ocoplasmele, ca i chlamOdiile, sunt sensibile la
antibioticele din grupul tetraciclinelor i macrolidelor %eritromicina(,
totui este indicat efectuarea antibiogramei.
250