Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
FARMACEUTIC
APLICAII PRACTICE
PARTEA I
CUPRINS
I. Organizarea i protecia muncii n laboratorul de biochimie..........5
II.Noiuni de analiz chimic....................................14
II.1.Noiunea de atom-gram, molecul-gram, echivalent-gram.......14
II.2. Soluii. Modul de exprimare a concentraiilor.15
II.3. Uniti i moduri de exprimare n laboratorul clinic....17
III.Sticlria i aparatura de laborator.........................18
IV.Metode analitice folosite n biochimia medical i farmaceutic.............21
IV.1. Metode volumetrice de analiz...............................21
IV.1.1. Volumetria acido-bazic......................................................21
IV.1.2. Determinri volumetrice prin reacii de precipitare.............36
IV.1.3. Determinri volumetrice prin reacii de oxido-reducere......37
IV.1.4. Volumetria prin reacii de complexare................................40
IV.2. Metode optice de analiz....................................................................41
IV.2.1. Metode spectroscopice de analiz.......................................41
IV.2.2. Metode flamfotometrice de analiz.....................................43
IV.3. Metode electrometrice....................45
Msurarea pH-ului...........................................................47
pH-ul izoelectric al aminoacizilor....................48
Determinarea punctului izoelectric al proteinelor............................50
IV. 4. Metode imunologice de analiz.........................................................52
Determinarea complexelor imune circulante...................................52
IV.5. Metode de separare.............................................................................54
IV.5.1. Centrifugarea.......................................................................54
IV.5.2. Ultracentrifugarea................................................................54
Viteza de sedimentarea a eritrocitelor
IV.5.3. Cromatografia......................................................................56
Separarea aminoacizilor din urin prin cromatografie pe
strat subire
IV.5.4. Electroforeza........................................................................57
Electroforeza n gel de agaroz
Electroforeza n gel de poliacrilamid
IV.6. Teste rapide de investigare.................................................................69
V. Analiza biochimic a vitaminelor....................................................................71
V.1. Reacii pentru carotinoide i vitamina A..............................................71
V.2. Reacii pentru provitaminele i vitaminele D......................................73
V.3. Dozarea vitaminei PP...........................................................................74
V.4. Reacii pentru identificarea i dozarea vitaminei C.............................75
V.5. Reacii de identificare i dozare a vitaminei B1...................................77
3
variaii analitice
variaii
biologice
Variaii analitice
Lucrrile recente ale lui Statland i Winkel au pus n eviden cele dou
componente principale ale variabilei analitice:
eroarea pre-instrumental
eroarea instrumental
Variabila analitic pre-istrumental depinde de toate sursele de variaii
cauzate de la recoltarea probei pn la determinare, cum sunt:
7
pregtirea bolnavului
recoltarea probelor la care trebuie s se in cont de ora recoltrii, de
felul sngelui (venos, arterial, capilar), de aplicarea garoului sau nu,
de poziia bolnavului, de anticoagulantul utilizat.
pregtirea probei pentru analiz: n acest caz trebuie s se in cont
de timpul de la prelevarea probei pn la centrifugare i de utilizarea
sau nu a conservanilor.
Variabila analitic instrumental este eroarea analitic datorat metodelor
de dozare. Ea poate fi separat n variaii analitice pe termen scurt (apreciat prin
repetabilitatea sau reproductibilitatea pe o zi) i pe termen lung (apreciat prin
reproductibilitatea de la o zi la alta). Variaiile analitice de la o zi la alta sunt n
general mai importante dect cele pe o zi. Cnd se efectueaz studii pe termen
lung este de preferat ca eantioanele s se congeleze i s fie analizate
simultan n aceeai serie i n aceeai zi.
Variaiile analitice trebuiesc meninute constante i la un nivel sczut
pentru a mri certitudinea n momentul evalurii unui rezultat individual n
intervalul de referin.
Variabila biologic intra-individual. Aceast noiune se refer la
variabilitatea datorat de-a lungul timpului individului nsui. Ea include deci
toate fenomenele de reglare, n particular toate ritmurile biologice i n primul
rnd procesul de mbtrnire. Dar acesta este dificil de izolat complet de ceilali
factori de variaie.
Pe plan experimental, variaiile intra-individuale pot fi abordate prin
msurarea succesiv, n cursul timpului, a unui parametru la acelai individ.
Alegerea intervalului de timp este foarte variabil, n funcie de obiectivele
urmrite. Aceast variabil este greu de urmrit deoarece este dificil s
constrngi numeroi subieci s participe la un asemenea program. Aceste
studii se efectueaz de obicei pe populaii restrnse de voluntari, care triesc n
instituii sociale, medicale etc.
Variabila biologic inter-individual. Aceast variabil reprezint
ansamblul variaiilor unei populaii. Dar o populaie este foarte heterogen. Dac
inem cont de acest lucru i de faptul c noiunea de omogenitate nu poate fi
definit la modul absolut, ea fiind relativ, este evident c acest numr de
factori pe care va fi necesar s-i controlm este indefinit i este practic
imposibil s fie studiai n totalitate.
Diferitele surse de variabilitate biologic
Clasificarea factorilor de variaie biologic se efectueaz cu greutate. S-a
propus clasificarea lor n variaii intra- i inter-individuale, n variaii genetice i
dobndite, n variaii datorate mediului, n variaii datorate factorilor exogeni i
endogeni.
unele diferene nu se observ dect la anumite grupe de vrst, cum este cazul
trigliceridelor care dup mas sunt mai crescute la persoane peste 40 de ani.
Efortul fizic
Crete concentraia albuminei i a altor enzime plasmatice. Dac efortul este
intens pot crete enzimele de origine celular: LDH, aldolaza, creatinkinaza, AST,
ALT i chiar ornitin-carbamil-transferaza. ntr-un efort de intensitate mic
crete uor fosfatul i proteinele plasmatice.
Stressul
Stressul este un factor important de care trebuie s se in cont mai ales n
momentul recoltrii probelor, deoarece acesta duce la creterea concentraiei
plasmatice a trigliceridelor, colesterolului, acidului uric, glucozei, hormonului de
cretere, noradrenalinei, hormonilor tiroidieni, a acizilor neesterificai.
Altitudinea
Albumina plasmatic scade dup 6 sptmni la o altitudine de 5400 m, la
fel i aldostenuria, efect mai pronunat mai ales la vrstnici.
Hemoglobina, hematocritul, acidul uric, noradrenalina plasmatic cresc. De
asemenea se produce o alcaloz respiratorie de efort datorat hiperventilaiei.
Absena gravitaiei
Provoac creterea catecolaminelor, nespecific, legat de stressul pe care l
reprezint lipsa gravitaiei. Se modific metabolismul fosfo-calcic, aprnd
osteoporoza, creia i-au fost victime cosmonauii americani.
Ortostatismul
Proteinele serice, albuminele i substanele legate de proteine (colesterolul,
calciul) cresc dup 15 minute de stat n picioare, datorit uoarei hipovolemii
indus de ortostatism. Aldosteronul plasmatic crete de 5-10 ori n ortostatism fa
de poziia culcat, la fel i hematocritul care crete cu 10%. n urin
noradrenalina crete de 3 ori.
Ritmurile circadiene
S-a constatat faptul c activitatea plasmatic a fosfatazei alcaline scade de
la 25% pn la 50% dimineaa. Concentraia plasmatic a aldosteronului crete
de la 6 dimineaa pn la 3 dup amiaza, secreia sa fiind mai sczut noaptea.
Probabil acest efect este datorat poziiei ortostatice.
Dar pentru
aldosteronemie exist un ritm circadian deoarece pentru o postur neschimbat
secreia maxim se observ la ora 8 i minima la ora 18.
Excreia noradrenalinei este mai crescut ziua dect noaptea.
11
12
13
NaOH
40,010
40,010
Este foarte important ca n calculul echivalentului s inem seama neaprat
de reacia chimic ce are loc, n caz contrar calcularea greit a echivalentului-gram
poate duce la erori foarte mari ale rezultatului analizei. Cantitile de substan care
reacioneaz sau se nlocuiesc ntr-un proces chimic sunt echivalente ntre ele.
Echivalentul-gram la acizi se calculeaz mprind molecula-gram la numrul
atomilor de hidrogen ai acidului, care particip la reacia respectiv.
Exemplu:
Eg HCl = 36,465/1 = 36,465
Eg H2SO4 = 98,08/ 2 = 49,04
Eg H3PO4 = 98,04/3 = 32,68
Echivalentul-gram la baze se calculeaz mprind molecula-gram la numrul de
grupri hidroxil care iau parte la reacia respectiv.
Exemplu:
EgNaOH = 40,005/1 = 40,005
EgCa(OH)2 = 74,1/2 = 37,05
Echivalentul gram la sruri se calculeaz mprind molecula-gram la cifra care
arat numrul de hidrogeni nlocuii de metal sau cifra obinut prin nmulirea
valenei maxime a ionului metalic prin numrul acestor ioni.
Exemplu:
EgFeSO4.7H2O = 273,01 / 2 = 136,505
EgFe2(SO4)3 = 399,9 / 6 =66,66
Echivalentul-gram n reaciile de oxido-reducere reprezint cantitatea de
substan care reacioneaz cu un echivalent-gram n reacia respectiv.
Exemplu:
MnO4- n care Mn este heptavalent reacioneaz diferit n funcie de mediul
n care are loc reacia. Astfel n mediu puternic acid (acid sulfuric) Mn +7 primete
5e- trecnd n Mn+2 conform reaciei:
EgKMnO4
Mn+2
+4H2O
EgKMnO4
MnO2 +2H2O
MnO4-+ e-
MnO4-2
Factorul (F) unei soluii reprezint raportul dintre titrul real i titrul
teoretic.
Exemplu: factorul soluiei de NaOH cu T = 0,0380 este 0,95 deoarece:
F = 0,0380 /0,0400 = 0,95
Importana factorului const n simplificarea operaiunilor de calcul n
titrimetrie, prin corectarea valorilor aproximative normale sau decinormale la exact
normale sau decinormale.
Exemplu: Pentru titrarea unei soluii de HCL s-au consumat 7,2 ml de NaOH 0,1N
avnd F = 1,05. Acesta este echivalent cu a folosi 7,2 x 1,05, adic 7,56 ml NAOH
exact 0,1N (adic avnd F = 1,00).
Factorul poate avea valori supraunitare sau subunitare, dar cu ct soluiile
sunt preparate mai corect cu att valoarea lui tinde spre 1, deci titrul real se apropie
ca valoare numeric de titrul teoretic.
II.3. Uniti i moduri de exprimare n laboratorul clinic
Valorile diferitelor analize se raporteaz mai ales sub form de mg/dl pentru
snge, lichid cefalorahidian sau de mg (g) n 24 de ore pentru eliminarea urinar. n
ultimul timp se tinde ns spre un mod de exprimare uniform : mmol/l respectiv
mmol eliminai n 24 de ore.
De un interes deosebit n clinic sunt valorile concentraiilor principalilor
ioni: Na+, K+, Ca+2, Mg+2, Cl-, HCO3- . Exprimarea acestora se face face cel mai
adesea n mEg/l. O valoare util este i modul de exprimare osmoli, respectiv
mosmoli. Prin osmol se nelege presiunea osmotic generat de o soluie 1M a
unei substane neionizate la 00C la interfaa unei membrane impermeabile pentru
substana dizolvat. n cazul ionizrii se va face suma totalitii ionilor exprimai n
moli.
Pentru enzime i uneori pentru vitamine se utilizeaz nomenclatura de
unitate internaional (U.I. sau U).
Exprimarea rezultatelor obinute n urma diferitelor msurtori se face n
funcie de gradul de sensibilitate i precizie al instrumentelor de msur utilizate.
Un rezultat nu poate conine mai multe cifre dect permite gradul de sensibilitate i
precizie a aparatului utilizat.
17
18
20
21
= NaX + H2 O
MNaOH .....................................MHX
N x TNaOH..................................a
a = N x TNaOH x MHX / MNaOH = g HX / prob
10ml prob.................................... a g HX
100ml soluie.................................b
b = (10 x a) g HX%
O alt modalitate de calcul este cea n care intervine factorul soluiei
utilizate la titrare.
1 ml NaOH 0,1N..................................MHX / 1000 x 0,1 g HX
N x FNaOH.....................................................a
a = N x FNaOH x MHX /1000 x 0,1 g HX / prob
DOZAREA ACIZILOR SLABI
Pentru dozarea acizilor slabi se folosete tot o soluie de NaOH 0,1N dar ca
i indicator se folosete fenolftaleina. n mediu acid fenolftaleina este incolor, iar
punctul de viraj corespunde coloraiei roz. n mediu puternic alcalin fenolftaleina
este roie-violacee.
DETERMINAREA REZERVEI ALCALINE
Echilibrul acido-bazic sangvin este meninut de 3 sisteme:
- Hb.oxigenat- Hb.deoxigenat,
- proteine serice i
- cuplul: Na2CO3 /NaHCO3.
n laboratorul clinic explorarea se face printr-o metod laborioas, care
permite determinarea parametrilor principali i a echilibrului acido bazic. n scop
orientativ, servete ns o metod titrimetric de dozare a cuplului
carbonat/bicarbonat.
Dozarea cuplului carbonat/bicarbonat se face cu o soluie de HCl 0,1 N. ntro prim etap se dozeaz carbonatul n prezena fenolftaleinei, dup care se dozeaz
ntreaga cantitate de bicarbonat cu o soluie de HCl 0,1 N, n prezena
metiloranjului.
Na 2 CO 3 HCl
NaHCO 3 HCl
NaHCO 3 NaCl
NaCl CO 2 H 2 O
23
Tehnica de lucru
ntr-un pahar Erlenmeyer peste proba de analizat (10 ml) se adaug cteva
picturi de fenolftalein. Soluia colorat n roz- violet se titreaz cu HCl 0,1 N
pn la roz deschis. Se noteaz cu V1 ml de HCl 0,1 N utilizai. Se continu apoi
titrarea n prezen de metiloranj pn la culoarea rou portocaliu. Se noteaz cu
V2 - ml HCl 0,1 N utilizai.
V1 ml HCl utilizai la dozarea CO3-2
V = V2- V1 ml HCl utilizai la dozarea HCO3Calcul
1ml HCl 0,1N .........................0,008401g NaHCO 3
Vxf HCl ................................a
a 0,008401Vf g NaHCO 3
10 ml proba .........................b g CO 2
3
1000 ml................................ y
y 100b g CO 2 / l
3
Interpretarea rezultatelor
Bicarbonatul actual are valori cuprinse ntre 25 27 mEq/l, iar valoarea
carbonatului este de 1,2mEq. Rezult ca raportul bicarbonat/carbonat este de
aproximativ 20.
Sngele uman are n mod obinuit un pH n jur de 7,4. Valori ale pH-ului
sub 7,36 ntlnim n cazul acidozei, iar peste 7,44 n alcaloz. Ambele stri sunt
periculoase i se manifest clinic prin semne de afectare a sistemului nervos.
Meninerea unor limite de +/- 0,04 uniti de pH se face prin 3 mecanisme
principale :
24
anhidraza carbonic
H + HCO3
Primele 2 mecanisme intervin imediat, iar cel de-al treilea dup un interval
de timp mai lung. Principalul sistem tampon n hematii este sistemul
hemoglobin/hemoglin oxigenat, iar n plasm sistemul carbonat/bicarbonat.
Datorit ptrunderii ionului bicarbonat prin membrana hematiilor cele 2 sisteme
sunt legate funcional. n plus datorit reversibilitii reaciei catalizate de una din
cele mai active enzime (anhidraza carbonic), excesul de acid carbonic poate fi
eliminat prin respiraie.
Alcalozele i acidozele se mpart n metabolice i respiratorii.
Acidoza respiratorie apare n condiii de cretere a concentraiei CO2 ca urmare a
unei deficiene respiratorii (emfizem pulmonar, obstacole pe cile respiratorii, etc.)
i se compenseaz prin stimularea respiraiei.
Acidoza metabolic apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluii acide. Se
corecteaz n final prin eliminarea urinar sau prin neutralizarea din sucul gastric al
excesului de acizi.
Alcaloza respiratorie apare ca urmare a hiperventilaiei sau a ingestiei de
bicarbonat. Se corecteaz prin hipoventilaie sau, n clinici, prin respirarea unui
amestec bogat n CO2.
Alcaloza metabolic apare ca urmare a ingestiei accidentale de soluii sau sruri
bazice sau n cazul pierderii de acizi prin vrsturi. Se corecteaz prin mecanisme
renale.
Se nelege uor c datorit interveniei sistemelor de compensare n
practic se ntlnesc mai ales tipuri mixte de acidoze i alcaloze. Deoarece sistemul
carbonat/bicarbonat este primul care intervine i se modific relativ uor prin
respiraie, totalitatea CO2 coninut ca atare sau sub form de bicarbonai n 100
ml plasm exprimat ca ml CO2 la 00C i la 1 atm, formeaz rezerva alcalin (5570 ml n mod obinuit).
ECHILIBRUL ACIDOBAZIC
Concentraia ionilor de hidrogen
Reaciile enzimatice i implicit procesele biologice depind n mare msur
25
Relaia ntre H+ i pH
27
30
Acidoza metabolic
ntr-o acidoz metabolic principala problem este scderea concentraiei
de bicarbonat din spaiul extracelular (Fig. 3.). Aceasta se datoreaz:
1. Cantitii crescute de ioni de hidrogen.
2. Aport de ioni de hidrogen, sau medicamente, care sunt metabolizate la
acizi.
3. Diminuarea excreiei de ioni de hidrogen pe cale renal.
4. Pierderea de bicarbonai pe cale gastrointestinal sau urinar.
31
Alcaloza metabolic
Cauzele alcalozei
1. Pierderea de ioni de hidrogen n cursul vrsturilor este ntlnit n cazul
pacienilor cu stenoz piloric. Obstrucia dintre stomac i duoden face ca
pierderile de H+ s nu fie nsoite de o pierdere de bicarbonai, iar dac nu survine o
eliminare rapid a acestora la nivelul rinichilor se va instala o alcaloz metabolic
(Fig. 3)
2. Administrarea terapeutic a unei cantiti mari de bicarbonat sub form
de infuzii intravenoase sau chiar pe cale oral, poate depi capacitatea de
eliminare renal.
3. Pierderi de potasiu. n pierderile severe de potasiu, adesea o consecin a
terapiei cu diuretice, ionii de hidrogen sunt reinui n celule pentru a nlocui lipsa
ionilor de potasiu. La nivelul tubului renal sunt eliminai mai muli ioni de
hidrogen dect de potasiu. Sodiul nu poate ptrunde n celule ca s nlocuiasc
deficitul de potasiu. n ciuda alcalozei, urina este acid. Aceasta este aciduria
paradoxal.
Manifestrile clinice ale alcalozei
Efectele clinice ale alcalozei includ hipoventilaie, pierderea contienei i
n cele din urm com. Crampele musculare, tetania i paresteziile pot fi o
consecin a scderii concentraiei de calciu plasmatic, care este o consecin a
alcalozei.
Acidoza respiratorie
n tulburrile echilibrului acidobazic de cauz respiratorie apar modificri
datorate pCO2 n snge (Fig. 4.).
Tulburrile funciei respiratorii sunt n legtur cu schimbrile ventilaiei
pulmonare, sau modificrile funciei alveolare care afecteaz transportul CO 2 sau
O2 la nivelul membranei alveolare (schimbul de gaze). n ambele cazuri pCO2 se
modific i concentraia de acid carbonic crete sau scade.
Acidoza respiratorie poate s fie acut sau cronic.
33
34
Alcaloza respiratorie
Alcaloza respiratorie este mai puin frecvent dect acidoza. Poate s apar
ca urmare a unei respiraii accelerate i cnd efortul compensator renal are o
eficien limitat.
Tratamentul are drept scop nlturarea cauzei care a determinat
hiperventilaia cu revenirea la normal a echilibrului acidobazic. Exemple sunt:
- criza de isterie,
- respiraia asistat,
- leziuni tumorale
- intoxicaii
- afeciuni cardiace etc.
Tulburri acidobazice mixte
O tulburare acidobazic este considerat mixt cnd este produs de
intervenia a cel puin doi factori etiologici ce acioneaz concomitent.
Unii bolnavi pot s aib ambele tipuri de dezechilibre: acidoz metabolic
35
AgCl + NaNO3
Ag2CrO4 + 2KNO3
Reactivi :
1. AgNO3 0,1 N
2. K2CrO4 10%
Tehnica determinrii :
ntr-un vas Erlenmeyer se pipeteaz 10 ml urin i 1 ml indicator. Se titreaz
din biuret cu o soluie de AgNO3 0,1 N pn la culoare crmizie. Se noteaz cu
N numrul de ml de azotat de argint folosit la titrare.
Calcul: concentraia clorurilor n urin se exprim n grame NaCl la litru.
1ml AgNO 3 0,1N .........................0.058g NaCl
N .f AgNO 3 ...................................x
Interpretarea rezultatelor
Valori normale: n cazul unei diete obinuite, la subiecii sntoi,
cantitatea de cloruri eliminat n 24 de ore, este cuprins ntre 10-15g.
Variaii fiziologice: dup cteva zile de regim hipoclorurat, cantitatea
clorurilor urinare scade la valori sub 1g/24 de ore i invers, n cazul unui regim
hiperclorurat, crete peste valorile normale.
37
2NH4Cl + (COO)2Ca
CaSO4 + HOOC - COOH
2MnSO 4 + K2SO 4 + 8H2O + 10CO2
Tehnica de lucru:
Se pipeteaz ntr-o eprubet 2 ml urin i se adaug 5 ml soluie saturat de
oxalat de amoniu. Se omogenizeaz bine i se las n repaus la temperatura camerei
timp de 30 de minute. Dup aceasta se centrifugheaz i se ndeprteaz lichidul
38
V V1 V2
Valorile normale ale calciului urinar sunt cuprinse ntre 0,14 0,20 g/24 de ore.
Variaii patologice :
Valori crescute apar n: - hiperparatiroidism,
- osteoporoze,
- metastaze osoase,
- acidoze tubulare,
- intoxicaii cu vitamina D,
- hipercalcemie.
Valori sczute se ntlnesc n: - insuficiene renale avansate,
- hiperparatiroidie,
- sarcin,
- anumite osteopatii.
DETERMINAREA INDICELUI DE IOD AL GRSIMILOR
Indicele de iod (Hubl) reprezint cantitatea (n g) de iod care se adiioneaz
la 100 g grsime.
Determinarea indicelui de iod se face lsnd s acioneze asupra unei
cantiti de grsime cunoscut o cantitate definit de halogen i titrnd excesul de
halogen nereacionat.
39
BrI + KI
I2 + KBr
I2 + 2 N 2S2O3
2NaI + Na2S4O 6
Reactivi:
1. ulei sau grsime;
2. Reactiv Hanus (BrI) : se dizolv 13 g iod pulverizat n puin acid acetic
glacial, se adaug 8 g brom i se completeaz cu
acid acetic glacial la 1000 ml;
3. Na2S2O3 0,1 N;
4. KI (cristale sau soluie 10% n ap distilat);
5. Soluie de amidon 1% n ap distilat;
6. Solveni organici, de ex.: cloroform;
Tehnica de lucru :
ntr-un vas Erlenmeyer se cntresc aproximativ 0,15 1g grsime. n cazul
uleiului se pipeteaz 0,1 ml i se adaug 5 ml cloroform i 5 ml reactiv Hanus. Se
recomand nchiderea balonului cu un dop de sticl rodat, plut sau vat i se las n
repaus timp de 15 min, agitnd din cnd n cnd. Se adaug 5 ml soluie de KI 10%
i se titreaz cu tiosulfat de sodiu n prezena amidonului ca indicator, pn la
dispariia coloraiei albastre i se noteaz numrul de ml cu n.
n paralel se efectueaz i o prob martor care conine 5 ml reactiv Hannus,
5 ml soluie KI 10% i amidon care se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1 N pn la
dispariia culorii albastre a indicatorului i n care se noteaz cu N numrul de ml
de tiosulfat utilizai la titrare.
Calcul:
0,0127 echivalentul n iod pentru solutia de Na2S2O3 0,1 N
Indice I 2
N n .0,0127.100
g
40
CH2-COO
CH2
N
CH2-COO
CH2-COO
CH2
N
CH2-COO
CH2-COO
CH2
Ca
N
CH2-COO
+2
Ca
CH2-COO
CH2
N
CH2-COO
Reactivi:
1. EDTA 0,01 M
2. NaOH 0,1N
3. Murexid
Tehnica de lucru
ntr-un pahar Erlenmeyer se introduc 10 ml urin deproteinizat, 10 ml
NaOH 0,1 N i cteva cristale de murexid. Soluia colorat n roz se titreaz cu
EDTA 0,01 M pn la virajul soluiei de la roz la violet. Se noteaz cu N- numrul
de ml de EDTA folosii la titrare.
Calcul
1mlEDTA 0,01M ..................0,0004008gCa
N .f EDTA ............................x
x N.f EDTA .0.0004008 g Ca / proba
10
ml proba ...........................x g Ca
1000
ml................................... y
41
Interpretarea rezultatelor
Cantitatea de calciu urinar eliminat n 24 de ore este cuprins ntre 0,07
0,3 g/24 de ore.
Cantiti crescute apar n: - hiperviatminoza D,
- hiperparatiroidism,
- osteoporoz
- dup fracturi.
Cantiti sczute ale calciului urinar apar n: - rahitism,
- hipoparatiroidism,
- spasmofilie etc.
IV.2. METODE OPTICE DE ANALIZ
IV.2.1.METODE SPECTROSCOPICE DE ANALIZ
Metodele spectroscopice de analiz se bazeaz pe determinarea i
interpretarea spectrelor de absorbie i de emisie.
Legea absorbiei radiaiilor
Analiza spectroscopic care urmrete determinarea de concentraii are la
baz dou legi fundamentale. Aceste legi se aplic n cazul modificrii puterii
radiante a unei radiaii monocromatice odat cu modificarea grosimii stratului
strbtut de radiaie i modificarea concentraiei.
Prima din legile absorbiei radiaiilor este atribuit lui Bouguer-Lambert i
afirm c pe msur ce crete grosimea unei probe absorbante, intensitatea radiaiei
transmise prin prob descrete.
Dependena absorbiei de concentraie se exprim prin legea lui Beer:
coeficientul de extincie este proporional cu concentraia.
Din combinarea celor dou legi rezult legea lui Bouguer-Lambert-Beer.
A = a x c x b, unde:
a = absorbitivitatea
c = concentraia
b = grosimea stratului
A = absorbana
Absorbitivitatea reprezint extincia unei soluii avnd concentraia de
1gram/litru la o grosime de strat de 1 centimetru.
Msurtorile de absorbie de radiaie se utilizeaz pentru determinri de
concentraii. Determinarea concentraiei substanelor pe baza absorbiei n vizibil,
n particular (reacii de culoare) se poate practica n urmtoarele situaii:
- substana de cercetat are o absorbie (culoare) proprie
- substana n urma unei sau a unor reacii conduce la un compus care
absoarbe (colorat)
42
43
44
K (mEg/l)
3,5-5,1
3,9-4,7
3,8-5,1
4,1-5,3
3,8-5,3
3,8-5,4
3,5-4,7
3,4-5,4
[baza conjugata]
[baza conjugata]
HB
[acid conjugat]
Concepia de pH i pOH
pH este o exprimare foarte scurt care desemneaz activitatea ionilor de
hidrogen. Prin definiie pH-ul este logaritmul negativ al activitii ionilor de
hidrogen. n mod similar se calculeaz logaritmul negativ al activitii ionilor de
hidroxil, exprimat sub form de pOH.
pH log a H log
1
aH
log H [H ] log
1
a OH
1
H [H ]
1
OH [OH ]
47
Prin logaritmare:
log[ H ] log[OH ] log K p
log[ H ] log[OH ] log K p
log[ H ] pH
log[ HO ] pOH
log K p pK p
pH pOH pK p
K p 10 14
pK p log 10 14 14
Dac una dintre aceste valori este cunoscut se pot calcula i celelalte.
Msurarea pH-ului
Determinarea pH-ului se poate realiza cu indicatori colorai sau cu pHmetru (determinare electrometric).
Exemple de indicatori de pH:
Indicator
Albastru de timol
Rou de Congo
Albastru de bromfenol
Metiloranj
Verde de bromcrezol
Turnesol
Rou de fenol
Fenolftalein
Timolftalein
Galben de alizarin R
sunt combinai ntr-un singur electrod). nainte de a efectua o determinare, pHmetrul trebuie etalonat cu o soluie tampon.
pH-ul izoelectric al aminoacizilor
Determinarea pHi al glicocolului prin trasarea curbei de titrare
Principiu
Fiecare aminoacid are cel puin dou grupri ionizabile legate la atomul de
C: una acid (carboxilul) i alta bazic (gruparea amino). Pentru cazul cel mai
simplu, acela al unui aminoacid monoaminomonocarboxilic, cum este glicocolul,
exist cele dou trepte de disociere, fiecare cu pKa care pot fi scrise astfel:
+
pK a 1 log
[ H 3 N CH 2 COO ][ H ]
[H 3 N CH 2 COOH]
+
pK a 2 log
[sare formata ]
[acid ramas]
Reactivi:
1. Glicocol (pulbere)
2. NaOH 2N
3. H2SO4 2N
49
Tehnica de lucru:
Se cntresc 375 mg glicocol, se dizolv n 50 ml ap bidistilat. Pentru a
vedea ce volume de acid (i baz) consum de fapt glicocolul este necesar s se
titreze n prealabil 50 ml ap distilat, adic volumul de solvent utilizat. n acest
scop se iau 50 ml ap distilat i se adaug volume cunoscute de acid sulfuric,
notnd pH-ul indicat de aparat pentru fiecare adugare de acid. Menionm c
aparatul de msur utilizat, pH-metrul, indic pH-ul soluiei datorit diferenei de
potenial ce se creeaz ntre concentraiile ionilor de H + n interiorul electrodului de
sticl, fa de exterior, adic fa de soluia de titrare.
Se reprezint grafic pe hrtie milimetric lund pe ordonat cte 1 mm
pentru fiecare unitate de pH i pe abscis cte 3 cm pentru fiecare ml de H2SO4 2N.
Se procedeaz identic cu cei 50 ml soluie de glicocol, notnd volumele de
H2SO4 consumat pentru fiecare valoare de pH. Se aleg apoi mai multe valori de pH,
de preferat 10 valori, i se noteaz ntr-un tabel ce volume corespund pentru fiecare
valoare a pH, pentru ap i soluia de glicocol. Se noteaz ntr-o rubric separat
diferena n ml ce corespunde acidului sulfuric necesar strict pentru titrarea
glicocolului. Cu aceste valori difereniale se construiete apoi curba corectat de
titrare a glicocolului indicnd pe ordonat 1 cm o unitate de pH i pe abscis pentru
1cm, mEq acid (1 ml H2SO4 2N = 2mEg ).
Se procedeaz similar pentru domeniul alcalin, adugnd volume crescnde
de NaOH 2N la 50 ml ap i apoi la 50 ml soluie ce conine 375mg glicocol. Se
construiete curba necorectat, se fac diferenele cu care se traseaz n mod similar,
curba corectat de titrare a glicocolului, reprezentnd pH-ul fa de mEq de baz
adugai. Se stabilete jumtatea domeniului de inflexiune att pe curba de titrare
cu acid, ct i pe cea de titrare cu baz. Proiecia acestor puncte pe axa pH-ului
indic cele 2 valori pKa ale glicocolului.
50
Ap + alcool
0,103
0,355
0,667
0,063
1,425
Ap
0,003
0,020
0,032
0,063
0,200
Diferena
0,100
0,515
0,635
1,00
1,225
(H2N)m - R - (COO )n + nH
R - NH3 + OH
R - NH3]OH
52
1
0,6
8,4
1
5,9
2
1,25
7,75
1
5,6
3
2,5
6,5
1
5,3
4
5,0
4,0
1
5,0
5
1
8,0
1
4,7
6
2
7,0
1
4,4
7
4
5,0
1
4,1
8
8
1,0
1
3,8
9
1,6
7,4
1,0
1,5
54
55
Tehnica
1. Se repartizeaz cte 0,4ml soluie izotonic de citrat trisodic n tuburi
gradate. Se pregtesc numai attea tuburi cte sunt necesare pentru ziua
respectiv. Tuburile se in nchise cu dopuri de cauciuc.
2. Peste soluia de citrat trisodic se recolteaz cu o sering sau preferabil direct
pe ac 1,6 ml snge venos (pn la nivelul de 2 ml). Se amestec.
3. Se aspir sngele citratat n pipet Westergreen pn la diviziunea 0mm.
Aceast operaie se execut pentru toate probele din ziua respectiv, dup
terminarea recoltrii.
4. Se aaz pipetele Westergreen n stativ, n poziie perfect vertical timp de o
or.
5. Dup o or se face citirea. Rezultatul este reprezentat de distana pn la
care a cobort coloana de eritrocite exprimat n mm.
Stabilitatea produsului este de 4-5 ore din momentul amestecrii sngelui
cu soluie de citrat trisodic.
Valori normale:
- nou-nscui
1-2mm
- sugari
7-10mm
- copii mici
7-11mm
- brbai
3-8mm
- femei
6-11mm
VSE este o reacie de disproteinemie, ntruct modificrile sale sunt
condiionate de modificrile cantitative ale fibrinogenului i -globulinelor.
Creterea VSE se observ n:
- infecii acute i cronice,
- tumori maligne,
- nefroze,
- boli de colagen
- unele hemopatii (n special n plasmocitom, macroglobulinemie,
leucemie
acut,
anemii
hemolitice
autoimune
i
limfogranulomatoz).
- scderea numrului de eritrocite
- sarcin.
ncetinirea VSE este semnalat n:
- policitemie,
- unele boli de ficat de staz, prin insuficien cardiac.
- administrare de medicamente (corticoizi, salicilatul i
tiosemicarbazona).
Determinarea VSE ne poate furniza uneori informaii suplimentare:
- plasma foarte deschis la culoare indic lipsa de fier,
- plasma de culoare galben-portocalie - bilirubinemie crescut,
- un aspect tulbure lptos al plasmei - o stare de hiperlipidemie
- prezena unui strat opac albicios la partea superioar a coloanei de
eritrocite - indicaie orientativ asupra creterii numrului de leucocite
56
IV.5.3.Cromatografia
Cromatografia este o metod fizico-chimic modern de separare,
identificare i determinare cantitativ a componentelor dintr-un amestec complex.
Cromatografia pe strat subire (CSS) este o metod care permite separarea
componentelor unui amestec pe baza diferenei lor de deplasare de-a lungul unui
strat adsorbant (faza staionar) sub aciunea unui sistem de solveni (faza mobil).
Separarea aminoacizilor din urin prin cromatografie pe strat subire
Separarea aminoacizilor din urin se face prin cromatografie pe strat subire
bidimensional, cu scopul de a diagnostica aminoaciduriile determinate de
defectele enzimatice la nivelul metabolismului aminoacizilor.
Reactivi
1. Faza staionar: silicagel G depus n strat subire pe o plac de sticl
2. Faza mobil:
a. prima migrare: developantul I (butanol: ap: piridin = 1:1:1)
b. a doua migrare: developantul II (soluie apoas de fenol i amoniac
0,5%).
3. Reactiv de culoare: soluie acetonic de ninhidrin
Tehnica de lucru
Proba de urin se pregtete prin trecerea unui volum de 10ml urin peste o
rin schimbtoare de ioni. Proba prelucrat anterior se aplic pe o plac
cromatografic cu ajutorul unei pipete Pasteur la 0,5cm fa de marginea plcii. Se
aplic volume mici i dup fiecare aplicare se ateapt evaporarea dizolvantului,
astfel ca pata s nu depeasc 5mm n diametru. Se usuc 5 minute la etuv, la 70
0
C.
Developarea plcii
I. Prima migrare
Se introduce placa cromatografic n camera cromatografic ce
conine developantul I, astfel ca stratul de lichid s nu depeasc 34mm. Se acoper camera i se las placa pn cnd frontul de migrare al
developantului a ajuns la 0,5cm distan fa de extremitatea superioar
a plcii. Se scoate placa i se usuc timp de 5 minute la 70 0C.
II. A doua migrare
Se introduce placa n camera cromatografic ce conine
developantul II astfel ca migrarea s se fac n direcie perpendicular
pe direcia primei migrri. Dup ce developantul a migrat se scoate
placa, se usuc 5 minute la 70 0C i apoi se reveleaz spoturile prin
pulverizarea peste plac a reactivului de culoare. Se usuc 5 minute la
700C pn la apariia spoturilor colorate.
57
Interpretarea rezultatelor
Pentru interpretare se compar cromatogramele obinute cu urina patologic
cu cromatograma obinut cu urina normal. Cromatograma obinut cu urina
normal prezint 5 spoturi intense corespunztoare glicocolului, serinei, alaninei,
glutaminei i histidinei.
Tipul i cantitatea aminoacizilor sunt modificate n aminoaciduriile
ereditare. Exist 5 categorii de aminoacidurii:
1. Aminoacidurii determinate de defecte enzimatice la nivelul metabolismului
unui aminoacid.
Exemplu: fenilcetonuria, tirozinemia, urina cu miros de arar (val, leu, ile),
histidinemie, hiperprolinemie, hiperlizinemie.
Denumirea bolii
Enzima deficitar
Aminoacizi provenii
din urin
Fenilcetonurie
Fenilalaninhidroxilaza
Fenilalanina
hepatic
Tirozinemie
Oxidaza acidului
Tirozina
hidroxifenilpiruvic
Urina cu miros de arar Decarboxilazele
Valina, leucina,
aminoacizilor ramificai
izoleucina
Histidinemie
Histidinaza
Histidina
Hiperprolinemia
Prolinoxidaza
Prolina, hidroxiprolina
Hiperlizinemie
Lizin NAD- oxidoreductaza Lizina
2. Aminoacidurii determinate de boala nespecific generalizat a tubilor renali
proximali.
3. Aminoacidurii determinate de transportul defectuos de la nivelul celulelor
jejunale i a tubilor renali proximali.
4. Aminoacidurii determinate de producerea excesiv a unor metabolii
nefrotoxici (ex: galactozo-1P n galactozemie).
5. Aminoacidurii ce nsoesc bolile dobndite: necroza hepatic, distrofia
muscular, hipovitaminoza B, C, D, endocrinopatii, intoxicaii cu metale
grele i compui organici.
IV.5.4.Electroforeza
Electroforeza este metoda cea mai accesibil clinic pentru separarea
macromoleculelor ncrcate electric pe baza mobilitii lor n cmp electric. n
astfel de cmp, particulele ncrcate pozitiv vor migra spre electrodul ncrcat
negativ (catod), iar cele ncrcate negativ spre anod. Viteza de migrare este invers
proporional cu dimensiunea (greutatea) particulelor i direct proportional cu
sarcina lor electric. Deci particulele cele mai uoare i mai puternic ncrcate vor
migra cel mai repede.
Utilizarea principal a electroforezei este separarea proteinelor, posibil
datorit gruprilor reziduale -COOH i -NH2 ale aminoacizilor. Aceste grupri au
58
1
C i .Z i , unde Ci este concentraia unui ion, iar Zi, sarcina ionului.
2
60
0,7%
1,0%
2,0%
Agaroz
20X TAE
Ap distilat
EtBr(5mg/ml)
Volumul total
1,05 g
7,5 ml
142,5 ml
25 l
150 ml
1,5 g
7,5 ml
142,5 ml
25 l
150 ml
3,0 g
7,5 ml
142,5 ml
25 l
150 ml
63
64
ADN ( pb )
100-1000
80-500
60-400
40-200
25-150
6-100
- Cea mai sensibil metod const n imersia gelului timp de 15 minute ntro soluie de bromur de etidiu (0,5 g/ml), dup care se examineaz gelul n lumina
ultraviolet produs de o lamp special.
- A doua metod mai puin sensibil este colorarea cu albastru de toluidin,
n acest caz gelul se imerseaz 30 de minute ntr-o baie de 0,2% albastru de
toluidin. Excesul de colorant se ndeprteaz prin splare cu ap.
- Evaluarea masei moleculare:
O dat localizate benzile acizilor nucleici se vor msura distanele migrate
(de la start), de ctre moleculele cu mas molecular cunoscut (markeri) i de
ctre moleculele cu mas molecular necunoscut. Se reprezint grafic
logaritmul masei moleculare n funcie de mobilitatea acizilor nucleici de
referin (markeri), iar din acest grafic se va determina masa molecular a unui
acid nucleic necunoscut.
Identificarea ADN plasmidial aflat n diferite conformaii moleculare prin
metoda electroforezei n gel de agaroz
Principiul metodei:
Plasmidele sunt elemente genetice extranucleare i extracromozomiale,
prezente att n celula procariot ct i n cea eucariot. Ele se utilizeaz mai ales
ca vectori de clonare.
Moleculele de ADN plasmidial aflate n conformaie molecular de tip I sau
de cerc covalent nchis (CCI) au o activitate electroforetic mai mare dect cele
aflate n conformaie liniar, de tip III sau de cerc deschis (CD), de tip II. Prin
urmare mobilitatea moleculelor n funcie de conformaia molecular variaz n
ordinea:
CCI > liniar > CD.
4. Tampon de migrare: Tris 89 mM, EDTA 2,4 mM, H3BO3 89 mM, pH=8
5. Soluie de bromur de etidiu 0,5 mg/ml
Prepararea gelului de agaroz:
Se cntrete agaroza pentru a obine 30 ml soluie de 0,6 %. Agaroza se
introduce ntr-un pahar Erlenmeyer i se adaug 30 ml soluie tampon. Amestecul
se nclzete pe baia de ap pn se topete agaroza.
Soluia se rcete la 45-50C i se introduce ntr-o celul special avnd
dimensiunile de 120 x 80 x 2,5 mm. Pentru o bun gelificare, celula coninnd
soluia de agaroz se las la 4C timp de 30 de minute.
Migrarea electroforetic:
ADN plasmidial se introduce ntr-un godeu de gel, n celelalte godeuri se pun
probe de ADN cu conformaie molecular cunoscut. Se pornete circuitul electric
la 8V/cm (cm = distana msurat ntre cei doi electrozi) i se las probele s
migreze timp de 2 ore.
Examinarea ADN
Dup terminarea electroforezei gelul se introduce n soluia de bromur de
etidiu, timp de 15 minute. Dup acest timp probele se examineaz n lumin
ultraviolet, folosind filtre adecvate (fig.11.).
ADN apare sub forma unui spot colorat n rou, datorit complexului ce se
realizeaz ntre ADN i bromura de etidiu. Se msoar distana de la start pn la
diferitele molecule, astfel determinnd masele moleculare ale diferitelor molecule
de ADN.
a.
b.
c.
70
71
72
73
Reacia Liebermann-Burchard
Principiu
Soluia cloroformic de vit.D n prezena anhidridei acetice i a acidului
sulfuric concentrat d natere unei culori, care vireaz de la roz-violaceu la albastru
i apoi la verde.
Reactivi:
1. Soluie cloroformic de provitamina D sau de vitamina D: 0,5 g la 100 ml;
2. Anhidrid acetic;
3. Acid sulfuric concentrat
Tehnica de lucru
La 1 ml soluie de vitamina sau provitamina D se adaug 1 ml anhidrid
acetic i 5 picturi de acid sulfuric; se observ o coloraie roie care trece n final
n verde.
Reacia nu este specific, deoarece este dat i de compuii sterolici.
Reacia cu anilina HCl
Vitaminele din grupul D, n prezena anilinei i a HCl dau o coloraie roie.
ntr-o eprubet se ia 1 ml soluie de vitamina D sau ulei de pete i se adaug
cteva picturi de soluie anilin-HCl (pri egale de anilin i HCl) i se observ
apariia unei coloraii roii.
Reacia CARR-PRICE
1ml soluie cloroformic de vitamina D 0,5% se trateaz cu 4 ml soluie
cloroformic de clorur de stibiu i se obine o culoare galben-portocalie, diferit
de culoarea albastr pe care o d vitamina A n aceleai condiii.
Identificarea vitaminelor D cu aldehide aromatice
Vitaminele D n prezena aldehidelor aromatice (vanilina, furfurol, aldehida
anisdinic) i n prezena acidului percloric d compui colorai. Reacia efectuat
n condiii bine specificate permite i determinarea cantitativ a vitaminelor D.
Reactivi:
1. Soluie de vit.D n benzen
2. Soluie de aldehid aromatic 0,1 g% n benzen
3. Acid acetic glacial
4. Reactiv percloric: 2 ml aldehid acetic, 2,5 ml acid acetic glacial i 0,5
ml soluie 70% de acid percloric se nclzesc la 95-1000C timp de or.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se pipeteaz 1 ml soluie benzenic de vitamina D i 1 ml
soluie aromatic n benzen i se nclzesc la fierbere n baie de ap. Se adaug 2
picturi reactiv percloric i se fierbe nc 1 minut, apoi se las s se rceasc la
74
temperatura camerei. La soluia tulbure verde se adaug 1,5 ml acid acetic glacial
i se urmrete culoarea format.
O
O
Cu
precipitat albastru
Tehnica de lucru
Se pipeteaz ntr-o eprubet 2,5 ml soluie de vitamina PP de dozat i n alt
eprubet (martor) 2,5 ml ap. n fiecare eprubet se adaug NaOH 0,1N, cu
pictura, pn la virajul indicatorului fenolftalein n roz-pal i apoi cte 2 ml
soluie de sulfat de cupru 1%. Dup 30 de minute de repaus se filtreaz prin filtru
de hrtie, splnd de 2-3 ori fiecare eprubet cu cte 2 ml ap i adunnd filtratele
n 2 flacoane Erlenmeyer. n fiecare se adaug 1 ml HCl 10% i 2 ml KI 10%.
Iodul eliberat se titreaz cu tiosulfat 0,01 N, n prezen de amidon pn la incolor.
Calcul
N ml folosii la titrarea martorului
75
76
77
H3C
CH3
NH2
CH2CH2OH
CH3
K3[Fe(CN)6]
tiamina
N
H3C
N
N
CH2CH2OH
S
tiocrom
Reactivi:
1. soluie de tiamin 1%
2. hexacianoferat de potasiu 5%
3. NaOH 10%
4. HCl 10%
5. alcool butilic sau amilic
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se trateaz 1 ml soluie vitamin B1 cu 0,5ml NaOH i 0,5ml
hexacianoferat de potasiu. Se adaug apoi 1ml butanol i se agit puternic. n
stratul alcoolic apare o fluorescen albastr care dispare prin acidulare i reapare la
alcalinizare.
Dozarea vitaminei B1 prin diazotare
Metoda se bazeaz pe reacia de diazotare-cuplare pe care vitamina B1 o d
cu acidul diazo-benzensulfonic, cu formarea unui compus colorimetrabil. Adausul
de aldehid formic sau alcool butilic stabilizeaz culoarea, n timp ce substanele
reductoare (cisteina, ionii de cupru, mercur, argint) deranjeaz reacia.
Reactivi:
1. Soluie de vitamin B1
2. Soluie etalon de vitamin B1 : 0,2mg/ml
3. Reactivul diazobenzensulfonic:
Soluia A: 0,45g acid sulfanilic se trateaz cu 4,5ml HCl concentrat
i aproximativ 40ml ap distilat. Se nclzete pe baie de ap pn la
dizolvare, iar dup rcire se aduce la un volum de 50ml.
Soluia B: se prepar extemporaneu prin dizolvarea a 0,9g NaNO2 n
20ml ap distilat.
78
P
0,5
3
7
0,2
S
0,5
3
7
0,2
M
0,5
3
7
0,2
79
O
OH
OH
O
OH
+ R - CH = O + CO2 + NH3
O
O
O
OH
80
OH
NH3 +
+ R - CH - COO -
+ NH3 +
OH
O
HO
N
2 R - CH - NH2 + Cu
H2N
COO
HC - R
Cu
R - CH
NH2
OOC
Tehnica de lucru
Peste soluia unui aminoacid se adaug NaOH pentru alcalinizare, dup care
se adaug o soluie de CuSO4. Se observ apariia unei coloraii albastre. Aceast
reacie este utilizat i la dozarea spectrofotometric a unui aminoacid.
DETERMINAREA CONCENTRAIEI UNEI SOLUII DE AMINOACID
Aminoacizii formeaz cu ionii de cupru bivaleni, n mediu alcalin un
complex chelat albastru care prezint maxim de extincie la o lungime de und de
620 nm.
Reactivi :
1. Soluie de aminoacid de concentraie necunoscut;
2. Soluie standard de alanin ( 40 nM );
3. Suspensie Cu3(PO4)2.
Tehnica de lucru
Deoarece reactivul de culoare este el nsui colorat este necesar prepararea
unui martor. Conversia extinciei n concentraie se va face pe seama unei curbe de
etalonare efectuate cu o soluie standard de alanin.
Reactivi
1
2
3
4
5
P
M
Soluie
de 5
aminoacid
Soluie
1 ml
2 ml
3 ml
4 ml
5 ml standard de
alanin
Ap distilat 4 ml
3 ml
2 ml
1 ml
5 ml
Concentraia 8
16
24
32
40
?
0
n
mM
alanin
Se agit eprubetele i dup 5 minute se centrifugheaz 5 minute la 4000
rpm. Se citesc extinciile la 620 nm n cuva de 1 cm. Extincia probei se va converti
n concentraie prin interpolare grafic.
Aceast metod se poate folosi la urmrirea vitezei de hidroliz a unei
proteine sau gradului de conversie a unui aminoacid.
81
REACIA XANTOPROTEIC
Aceast reacie este specific pentru aminoacizii aromatici, cum ar fi:
tirozina, fenilalanina i triptofanul.
Proteinele care conin aminoacizi aromatici dau n prezena HNO 3 i
alcalinizare ulterioar o culoare galben portocalie, datorit formrii de
nitroderivai.
O2N
HO
CH2 - CH - COOH
NH2
2HNO3
2H2O
HO
O2N
CH2 - CH - COOH
NH2
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. HNO3 conc.
3. NH4OH conc.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 3 ml soluie proteic la care se adaug aproximativ
1 ml HNO3 conc. Se constat apariia unui precipitat alb. Se fierbe 1 2 minute, se
rcete i se adaug NH4OH (2ml) pn la apariia unui precipitat galben portocaliu.
REACIA MILLON este specific pentru tirozin. n prezena reactivului
Millon (azotat i azotit de mercur n mediu de HNO 3), soluia de tirozin d prin
nclzire o culoare roie. Proteinele dau n aceste condiii un precipitat alb, care prin
nclzire uoar (600C) devine roz.
ON
HO
CH2 - CH - COOH
NH2
CH2 - CH - COOH
NH2
reactiv
Millon
HO - N
Hg
O
HO
CH2 - CH - COOH
NH2
CH2 - CH - COOH
NH2
Reactivi:
1. Soluie de tirozin 1 g% sau soluie apoas de proteine;
2. Reactiv Millon (5g Hg + 10ml HNO3 + 30 ml ap distilat).
82
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 ml soluie proteic i se adaug 0,5 ml reactiv
Millon. Se observ apariia unui precipitat alb. Se nclzete eprubeta la 50 600C
dup care precipitatul devine roz.
REACIA ADAMKIEWICZ-HOPKINS este specific pentru triptofan.
Proteinele coninnd triptofan reacioneaz cu acidul glioxilic n mediu de
H2SO4 conc. i formeaz o culoare violet. Reacia are aplicabilitate la
evidenierea triptofanului din lichidul cefalo-rahidian.
HOOC
COOH
CH - NH2
H2N - CH
CH2
- CH2 - CH - COOH
N
H
H2O
CO2
CH2
N
H
N
H
Reactivi :
1. Soluie proteic concentrat
2. Acid acetic glacial
3. H2SO4 conc.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 1 2 ml soluie proteic concentrat, se adaug 0,5 ml
acid acetic glacial i se las s se preling pe pereii eprubetei 0,5 1 ml H 2SO4
conc. La limita de separare apare un inel violaceu.
REACIA SAKAGUCHI este specific pentru arginin.
Arginina datorita restului guanidinic reacioneaz cu alfa-naftolul n prezena
hipobromitului de sodiu i formeaz o coloraie roie.
O
HN = C - NH2
NH
(CH2)3
HN = C - N
OH
+ 2
NaOBr
NH
Br
(CH2)3
CHNH2
CHNH2
COOH
COOH
83
Reactivi:
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie de hipobromit de sodiu (1 ml NaOH 33% + 2 picturi de brom);
3. Soluie alfa-naftol 0,1 N;
4. NaOH 10%
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se ia 1 ml soluie proteic diluat, se alcalinizeaz cu 1 ml
NaOH 10%, apoi se adaug 1 ml alfa-naftol i hipobromit de sodiu, pictur cu
pictur, pn la apariia unei coloraii viinii, care indic prezena argininei sau a
compuilor cu grupri guanidinice. La nclzire culoarea dispare.
REACIA ERLICH-PAULI este specific pentru histidin.
Histidina i tirozina n prezena acidului diazobenzensulfonic dau o coloraie
roie-portocalie. Reacia este dat i de fenoli i amine.
N
CH2 - CH - COOH
+
+ 2[N
NH2
N
H
SO 3H + N 2CO3
N
NH2
CH2 - CH - COOH
N
NaO 3S
N =N
N
H
N =N
SO 3Na
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Acid sulfanilic (5 g la 1000 ml ap distilat);
3. Na2CO3 5 g%;
4. NaNO2 2-3 g%.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se trateaz 1 ml acid sulfanilic cu 2 ml NaNO 2 pentru a
forma acid diazobenzensulfonic. Se adaug 1 ml soluie proteic diluat i 3-4 ml
Na2CO3. Se obine o culoare portocalie care se intensific la nclzire.
REACII SPECIFICE AMINOACIZILOR CU SULF. Aminoacizii cu sulf din
proteine, prin nclzire cu hidroxizi alcalini formeaz sulfura de sodiu, care n
prezena srurilor de plumb formeaz un precipitat negru de sulfur de plumb.
84
CH2SH
CH2OH
CH - NH2 + 2NaOH
COOH
COOH
Na2S + Pb(OOCCH3)2
PbS + 2CH3COOH
Reactivi :
1. Soluie proteic concentrat;
2. NaOH 10%;
3. (CH3-COO)2Pb soluie saturat.
Tehnica de lucru.
ntr-o eprubet se iau 3 ml soluie proteic concentrat i acelai volum de
NaOH 10%. Dup o fierbere de 3 5 minute se adaug acetat de plumb i se fierb
din nou. Se obine un precipitat de sulfur de plumb de culoare neagr.
Aminoacizii care conin n molecul grupri SH se pot doza
spectrofotometric cu acid 5,5 ditio-bis-2-nitrobenzoic (DTNB). Cisteina datorit
grupei SH pe care o conine, reacioneaz cu DTNB-ul, formnd un produs colorat
n galben care se determin spectrofotometric la 412 nm.
HOOC
S
O 2N
+ HS - CH2 - CH - COOH
NH2
O 2N
HOOC
HOOC
S - S - CH2 - CH - COOH
O 2N
O 2N
NH2
SH
HOOC
Reactivi :
1. Soluie cistein hidrocloridic 0,2 mM n tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4;
2. Soluie DTNB ( 0,0149 g DTNB se dizolv n 130 ml tampon fosfat
0,05 M pH=7,4 i se completeaz la 250 ml cu etanol 95% );
3. Tampon fosfat 0,05 M, pH=7,4;
4. Soluie proteic de analizat sau ser sanguin.
Tehnica de lucru
Se pregtesc o serie de eprubete conform tabelului :
Reactivi (ml)
Cistein 0,2 mN
Protein
Tampon fosfat
DTNB
1
0,1
0,9
1,0
2
0,2
0.8
1,0
3
0,3
0,7
1,0
4
0,4
0,6
1,0
5
0,5
0,5
1,0
6
0,1
0,9
1,0
7
1,0
1,0
R - CH - COOH + H2O
N = CH2
R - CH - COOH + NaOH
N = CH2
R - CH - COONa + H2O
N = CH2
Reactivi :
1. Soluie de aminoacid de concentraie necunoscut
2. Soluie aldehid formic 10% neutralizat cu NaOH n prezena
fenolftaleinei;
3. HCl 1%;
4. NaOH 0,1N;
Tehnica de lucru
a) Pregtirea martorului;
Deoarece aminoacizii formolizai sunt acizi slabi, srurile lor cu
hidroxizii alcalini hidroliznd puternic, pentru a putea fi dozai se mpiedic
hidroliza prin titrare la un pH alcalin (9-9,5). Din aceast cauz este
necesar pregtirea unui martor i supratitrarea probei pn la culoarea
martorului. Astfel, ntr-un pahar Erlenmeyer se fierb 20 ml ap distilat, se
adaug 10 ml aldehid formic neutralizat, 10 picturi fenolftalein i 0,4
ml NaOH 0,1 N, msurai cu biureta. Se obine o culoare violet.
b) Dozarea solutiei de aminoacid
ntr-un pahar Erlenmeyer se pipeteaz 10 ml soluie de aminoacid, se
adaug NaOH 0,1 N ( sau HCl 1%) pn se obine o culoare slab roz. Se
adaug 10 ml aldehid formic neutralizat i se titreaz cu NaOH 0,1 N
pn cnd se obine intensitatea de culoarea martorului. Se noteaz cu N
numrul de mililitri de NaOH utilizai la titrare.
Calcul.
C concentraia aminoacidului exprimat n mg glicocol/l soluie
7,5 echivalentul glicocolului
0,4 reprezint ml NaOH 0,1 N adugai martorului i respectiv mililitri
NaOH 0,1 N cu care s-a supratitrat proba.
c
86
( N 0,4).7,5.1000
mg glicocol / 1000ml solutie
10
NO2
NO2
+ H2N - CH - R
COOH
NO2
O2N
NH - CH - R
COOH
Reactivi :
1. Indicator: 100 mg fenolftalein se dizolv n 100 ml etanol.
2. NaOH 200 mmol/l
3. Reactiv 2,4dinitrofluorbenzen. Se dizolv 650 l reactiv n 50 ml
aceton. Se poate pstra 2 luni la 40C.
4. Na2B4O7 132 mmol/l (50 g Na2B4O7x 10 H2O se dizolv ntr-un litru ap).
Se prepar nainte de utilizare.
5. Soluie de 2,4dinitrofluorbenzen de lucru. nainte de utilizare se prepar
o soluie de 2,4dinitrofluorbenzen prin diluarea soluiei stoc. Astfel un
volum din soluia stoc se dilueaz cu 9 volume de tetraborat de sodiu.
6. HCl n dioxan. 2 ml acid clorhidric concentrat se dilueaz cu 100 ml
dioxan.
87
O
H2N
H
N
COOH
R1
OH
H2 N
2
R3
R2
N
COOH
4NaOH
Cu(OH)2
N
OH
R1
R3
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat
2. Uree cristalizat
3. Soluie CuSO4 1g%
4. Soluie NaOH 10%
NaOOC
O
R3
R3-CH CH-COONa
O
N
N
C
C
Cu
N
R1
NaO-C
R2
N
R1
C-ONa
R2
proteinat de cupru
Tehnica de lucru
Reacia se efectueaz comparativ pe 3 probe: soluie proteic, biuret i un
martor.
ntr-o eprubet uscat se iau aproximativ 0,2 g de uree i se nclzesc pn
la topirea cristalelor, cu emanare de amoniac, ceea ce denot transformarea ureei n
89
OH
R
COO
OH
OH
+
+ HC - NH2
-
N - CH - COO
R
90
91
Tehnica de lucru
Peste 2-3 ml soluie proteic se adaug 0,5 1 ml soluie acid tricloracetic
cu apariia unui precipitat alb abundent.
b) Precipitarea proteinelor cu acid sulfosalicilic
Aceast metod este una din cele mai utilizate reacii pentru depistarea
proteinelor din urin. Se presupune c acidul sulfosalicilic reacioneaz cu ambele
grupri acide formnd compui de tipul urmtor:
+........ O 3S
+........ O 3S
COO ........+
sau
-
+........ O 3S
OH
LP
LP
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie acid sulfosalicilic 15-20 g la 100 ml ap bidistilat;
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 1-2 ml soluie proteic peste care se adaug cu
pictura aproximativ 0,5 ml soluie de acid sulfosalicilic. Apare un precipitat alb,
sub forma unui nor, care permite urmrirea mersului picturii de reactiv. Aceast
metod are o mare sensibilitate, fapt care o recomand la analiza urinii.
5. Precipitarea proteinelor prin nclzire
Majoritatea proteinelor prin nclzire la diferite temperaturi coaguleaz i se
produce o precipitare ireversibil. Precipitarea este maxim la punctul izoelectric al
proteinei, i, n consecin, la acest tip de precipitare un rol deosebit l are pH i.
Prezena diferitelor sruri favorizeaz de asemenea precipitarea.
Reactivi :
1. Soluie proteic diluat;
2. Soluie acid acetic 1% si 10%;
3. Soluie NaCl saturat;
4. Soluie NaOH 10%.
Tehnica de lucru
n 5 eprubete se iau cte 2 ml soluie proteic.
- n prima nu se adaug nici un reactiv, ci se nclzete direct n
flacar. Se observ apariia unui precipitat.
93
94
CH2OH
O
HOH2C
OH
HO
OH
OH
HO
CH2OH
OH
OH OH
95
H2SO4
CH - CHO
-3H2O
OH
OH
OH
+ 2
-H2O
OH
OH
ox
CH
CHO
Reactivi :
1. Glucoz 1%, zaharoz 1% , etc.
2. Soluie de -naftol n alcool etilic (proaspt preparat).
3. H2SO4 concentrat
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 2-3 picturi soluie de glucoz 1%, se adaug 5
picturi soluie de -naftol i se agit coninutul eprubetei. Se toarn ncet, cu
atenie, pe peretele interior al eprubetei aproximativ 1 ml H 2SO4 conc. La nivelul
de separare a celor dou lichide se formeaz un inel violet, ceea ce denot o reacie
pozitiv (+).
Observaii :
Reacia este dat i de produii care conin n molecul lor oze, cum sunt de
ex. nucleoproteidele, mucoproteidele, etc.
Inelul de culoare violet (caracteristic) poate fi nsoit sau s fie substituit
cu inele de culori diferite, de ex.:
- inel verde, cauzat de aciunea acidului asupra -naftolului;
- inel alb, n cazul prezenei proteinelor care precipit n mediu acid;
- inel rou, datorat unor substane organice cu alte structuri.
96
HO
ALDOZA
CH=O + 2
OH
OH
-H2O
OH
Reactivi :
1. Reactiv Selivanoff: se dizolv 0,1g rezorcin n 100 ml HCl dil.1:1 cu
ap distilat;
2. Fructoz 1% sau zaharoz 1%;
3. Glucoz 1%, arabinoz 1%.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se pun 2 picturi soluie de glucoz 1% i n alta 2 picturi
soluie de fructoz sau zaharoz. Se adaug n ambele eprubete cte 2 ml reactiv
Selivanoff i se aeaz ntr-o baie de ap la 30-600C timp de 15 minute sau se
nclzete uor direct n flacar.
n eprubeta cu aldoz apare o coloraie slab roz, galben sau soluia rmne
incolor, n timp ce n eprubeta cu cetoz se produce o coloraie roie. Reacia este
pozitiv cu cetozele: de culoare roie i este negativ cu aldozele: incolor sau
culori slabe.
VII.3. REACII DE DIFERENIERE A PENTOZELOR DE HEXOZE
Reacia cu orcina (Reacia BIAL)
Pentozele n prezena acizilor concentrai se transform n furfural care n
prezena orcinei (metil-rezorcin) formeaz produi de condensare colorai n
97
HCl (conc)
CHO + 2
HO
OH
HO
CH3
R
HO
CH
HO
CH3
HO
Reactivi :
1. Reactiv Bial: 1 g orcin n 1000 ml HCl;
2. Soluii de arabinoz 1%, riboz 1% ,etc.
3. Soluii de glucoz 1%, galactoz 1%, fructoz 1%, etc.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 5 picturi soluie pentoz i n alta 5 picturi soluie de
hexoz i se adaug n ambele cte 3 ml reactiv Bial. Eprubetele se in pe baie de
ap n fierbere sau se nclzesc uor n flacr.
n eprubeta cu pentoz se obine o culoare violet (reacie pozitiv), iar n
eprubeta cu hexoz se obine o culoare nedefinit, portocalie-brun (reacie
negativ).
Reacia BIAL modificat
Datorit faptului c reactivul Bial nu se pstreaz dect cel mult o
sptmn, se folosete reactivul Bial modificat, care are o mai bun
conservabilitate (6 luni). n cazul reactivului Bial modificat orcina este dizolvat n
alcool etilic i se adaug i FeCl3.
Reactivi :
1. Reactiv Bial modificat: se dizolv 6 g orcin n 200 ml alcool etilic i se
adaug 2 ml FeCl3 1%;
2. Soluii de pentoze si hexoze 1-2 %;
3. HCl concentrat.
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 2 ml soluie de pentoz i n alta 2 ml soluie de
hexoz. n ambele se adaug cte 10 picturi reactiv Bial modificat i cte 2 ml HCl
98
PENTOZ
-2H2O
CH=N
CH=O + H2N
NH2
N=HC
Reactivi :
1. Soluie de benzidin pur: 4p. benzidin n 100p. acid acetic glacial;
2. Soluii 2% de oze: aldopentoze (riboz), hexoze (glucoz, fructoz).
Tehnica de lucru
La 0,5 ml reactiv se adaug o pictur din soluia de oz. Eprubeta
coninnd acest amestec se fierbe 3-4 min. i apoi se rcete.
Aldopentozele libere dau o coloraie de la roz la rou, n timp ce hexozele i
cetopentozele nu dau reacia.
99
CH=N-HN-C6H5
CH=N-HN-C6H5
C =O
H - C - OH
C6H 5-NH-NH2
-H2O
HO - C - H
H - C - OH
H - C - OH
H - C - OH
CH2OH
CH2OH
C6H5-NH-NH2
C6H5-NH2 + NH3
HO - C - H
H - C - OH
H - C - OH
CH2OH
CH=N-HN-C6H5
C = N-HN-C6H5
C6H5-NH-NH2
-H2O
HN-C6H5
N
H
HO - C - H
H - C - OH
H - C - OH
CH2OH
HOH2C-(CHOH)3
osazon
(formul chelatic)
100
H - C - OH
H- C =O
C - OH
HO - C - H
endiol
aldoza II
D-manoza (2,5%)
CH2OH
C=O
cetoza
fructoza (21%)
Reactivi:
1. Soluie de glucoz 1%;
2. NaOH 0,1N i 10%;
3. HCl 0,1 N, cu adaus de 1 ml FeCl3 10%.
Tehnica de lucru
a) Dac se urmrete numai evidenierea caramelului se trateaz 5 ml
soluie glucoz 1% cu 2 ml NaOH 10% i se nclzete la fierbere. Soluia devine
galben i culoarea vireaz spre brun, concomitent cu apariia unui miros de
caramel, care se accentueaz prin acidularea soluiei. Dac acidularea se face cu
H2SO4 este necesar o rcire prealabil a eprubetei.
b) Dac se urmrete evidenierea compuilor cu grupare en-diol se iau
ntr-o eprubet 2 ml soluie glucoz 1% i exact 5 ml NaOH 0,1 N. Se fierbe i se
obine o culoare galben datorit caramelului. Se rcete soluia i se adaug exact
5 ml HCl 0,1 N (care conine FeCl3). n cazul prezenei formei en-diol se observ
o coloraie violet (reacie pozitiv), care nu apare cu soluia de glucoz, ca atare
(care nu a fost nclzit cu baze).
101
OH
Cu
OH
OH
Cu
OH
Cu
H2O
OH
O
Cu
OH
Reactivi:
1. Soluie de CuSO4 10%;
2. Soluie de NaOH 10%;
102
RCHO
Cu - OH
RCOOH
Cu - OH
Cu
H2O
Cu
103
Reactivi :
1. Reactiv Benedict: 173g citrat de sodiu.2H2O
100g Na2CO3 anhidru
800 ml ap distilat
Se dizolv prin nclzire, se filtreaz i se aduce la 850 ml. Separat
se dizolv 17,3g CuSO4 pur, cristalizat, n 100-150 ml ap distilat i se
adaug, sub agitare n poriuni mici la soluia precedent i se completeaz
cu ap distilat la volumul final de 1000 ml. Reactivul se poate pstra un
timp destul de lung;
2. Glucoz 5%;
3. Zaharoz 5%.
Tehnica de lucru
n 2 eprubete se iau cte 5 ml reactiv Benedict. n prima se adaug 0,5 ml
glucoz, iar n a doua aceeai cantitate de zaharoz. Se fierb ambele eprubete direct
la flacr timp de 2 minute i se rcesc. n prima eprubet se va forma un precipitat
rou, reacie pozitiv, iar n a doua nu se produc modificri semnificative, reacie
negativ.
Dup culoarea obinut se poate aprecia, cu aproximaie concentraia
glucozei i anume:
- opalescen cu nuan verde
- turbulen puternic de culoare galben-verde
- precipitat galben-portocaliu
- precipitat rou
104
2[Ag(NH3)2] OH + R CHO
2AgOH + 2NH4NO 3
+
2[Ag(NH3)2] OH + 4H2O
2Ag + 4NH3 + H2O + R-COOH
Reactivi :
1. Soluie de AgNO3 2% n ap bidistilat;
2. Soluie de amoniac diluat 5%;
3. Soluie glucoz 2%.
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet foarte curat se pipeteaz, n ordine: 5ml AgNO 3 2% i apoi
soluia de amoniac, pictur cu pictur, pn la apariia i apoi dizolvarea
precipitatului care se formeaz, evitndu-se excesul. Se adaug 3 ml soluie
glucoz, se agit i se las pe baie de ap la 60 0C timp de 15 minute i se observ
formarea oglinzii de argint .
c) Reacii de reducere ale ionului Bi+3
Reacia NYLANDER
Reacia se bazeaz pe reducerea azotatului de bismut (III) (subnitrat de
bismut) n mediu alcalin la Bi, n prezena glucidelor reductoare care se oxideaz
la acizii corespunztori.
Bi(OH)2NO3 + NaOH
2Bi(OH)3 + 3R-CHO
Bi(OH)3 + NaNO3
2Bi + 3H2O + 3R-COOH
Reactivi:
1. Reactiv Nylander: se dizolv 2 g nitrat bazic de bismut (III) i 4g tartrat
dublu de sodiu i potasiu n 100 ml NaOH 10%. Se nclzete pe baie de
ap la fierbere, se rcete i se aduce cu ap la 1000 ml;
2. Glucoz 2%;
105
Tehnica de lucru
ntr-o eprubet se iau 2 ml soluie de glucoz 2% i 0,5 ml reactiv Nylander
i se nclzete direct n flacr, timp de cteva minute. Reacia este pozitiv cnd
se obine un precipitat de culoare neagr (Bi metalic) i este sensibil chiar la
cantiti foarte mici de oze.
d) Reducerea unor compui organici
1. Reducerea acidului picric
Glucidele reductoare, n mediu alcalin i la cald, reduc acidul picric de culoare
galben la acid picramic de culoare roie-portocalie, simultan cu oxidarea gruprii
aldehidice a ozei la gruparea acid.
OH
OH
NO2
O2N
NH2
O2N
3RCHO
3H2O
NO2
+ 2H2O + 3R-COOH
NO2
Reactivi :
1. Soluie de acid picric;
2. Soluie de glucoz;
3. NaOH 10%.
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 2 ml soluie de acid picric, 1 ml soluie de glucoz i 1
ml NaOH 10% i se fierbe.
Reacia este pozitiv cnd apare o culoare portocalie la nclzire. Persistena
reaciei negative este indicat printr-o culoare galben. Reacia poate servi i la
dozarea glucozei din lichidele biologice, ex. reacia Seifert-Crecelius.
2.Reducerea albastrului de metilen
Glucidele reductoare reduc albastrul de metilen la un leucoderivat (derivat
fr culoare). n prezena oxigenului din aer are loc o reoxidare i recolorare,
proces similar cu aciunea unor dehidrogenaze, cnd albastrul de metilen servete
ca transportor de H de la un donor de H (glucoz) pe un acceptor de H (n
experiena de fa, oxigenul), cu diferena c albastrul de metilen este autooxidabil,
adic reacioneaz direct cu O2 din aer, ceea ce nu se ntmpl de obicei cu
dehidrogenazele.
106
R - COOH
R - CH=O
H
N
N
(H3C)2N
N(CH3)2 (H3C)2N
H2O
N(CH3)2
1/2O 2
Reactivi :
1. Soluie de albastru de metilen 0,1 % n ap
2. Soluie glucoz 1%;
3. NaOH 2N.
Tehnica de lucru
Se iau ntr-o eprubet 5 ml ap, 10 picturi soluie de albastru de metilen i
2 picturi de NaOH 2N i se nclzete. Se adaug cteva picturi de glucoz 1%,
treptat, pn se obine decolorarea probei, n timpul nclzirii de cteva secunde la
fierbere.
Dup cteva minute de repaus se agit i se observ recolorarea albastrului
de metilen, datorit efectului oxigenului din aer. Dac eprubeta nu se agit,
recolorarea apare mai ncet, de la suprafaa eprubetei spre interior.
VII.7. DOZAREA GLUCIDELOR REDUCTOARE
Metoda IONESCU-MATIU
Glucidele reduc la cald i n mediu alcalin, fericianura de K (hexacianoferat
III de potasiu). Cnd ntreaga cantitate de fericianur a fost complet redus, primele
picturi de glucoz n exces intr n reacie cu acidul picric (folosit ca indicator) i
culoarea soluiei vireaz de la galben spre rou-portocaliu.
Recativi :
1. Soluia de fericianur: 46g hexacianoferat (III) de potasiu i 46g NaOH se
dizolv n ap distilat i se completeaz cu ap distilat la 1000 ml. Se
pstreaz la frigider.
2. Soluie saturat de acid picric (aprox.1,2 %). Se obine prin dizolvarea a
1,3g de acid picric n 100 ml ap distilat la fierbere.
3. Soluie de glucoz 0,5 % i o soluie de glucoz de concentraie
necunoscut.
107
Tehnica de lucru
a) Determinarea factorului reactivului
ntr-un balon termorezistent se pipeteaz exact 10 ml soluie
fericianur i se adaug 10 picturi soluie de acid picric i 20 ml ap
distilat. Se nclzete la fierbere i se titreaz din biuret cu soluia de
glucoz 0,5%, meninnd tot timpul soluia n fierbere, pn la virajul culorii
de la galben spre rou-portocaliu, notnd cu N ml glucoz utilizai.
f
5N
1000
1000f
N'
108
109
110
c / min
E / min
sd
, unde:
E
1
. , unde:
2,3R T
catalaza
2H2O + O2
112
3. Influena temperaturii
Tehnica de lucru:
Se iau 5 flacoane Erlenmeyer (numerotate de la 1 la 5) i n fiecare se
introduce volumul de extract convenabil (2 ml) i diferena pn la 10 ml se
completeaz cu ap distilat:
- flaconul nr.1 se menine la temperatura camerei,
- flaconul nr.2 se ine la 400C (termostat sau n baie de ap) timp de 10
minute;
- flaconul nr.3 se ine la 600C;
- flaconul nr.4 se fierbe cteva minute,
- flaconul nr.5 se ine ntr-un cristalizor cu ghea (la 0 0C) timp de 10
minute.
- n al 6-lea flacon se pipeteaz numai 10 ml ap distilat (martor).
Dup rcirea flacoanelor 2, 3 i 4 la temperatura camerei, se introduc n
toate 6 flacoanele cte 10 ml H2O2 0,5N i se las n repaus la temperatura camerei
exact 10 minute.
Dup acest interval de timp se pipeteaz n fiecare flacon cte 10 ml H 2SO4
i apoi, n ordine 10 ml KI i 2-3 picturi molibdat. Se agit i dup 2-3 minute se
titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,1N pn la apariia unei culori galben deschis, cnd
se adaug cteva picturi de amidon i se continu titrarea pn la apariia culorii
albastre.
Se noteaz cu N nr. de ml folosii la titrarea martorului i cu n 1 pn la n5
ml folosii la titrarea celor 5 probe.
Activitatea enzimatic pentru fiecare caz n parte se exprim prin cantitatea
de H2O2 consumat, rezultat din diferena N-n1, N-n2, etc.
Se reprezint grafic, lund pe abscis t0C i pe ordonat activitatea
enzimatic (n ml tiosulfat de sodiu rezultai prin diferena N-n1,N-n5).
Curba obinut relev dependena activitii catalazei din cartof de variaia
temperaturii.
4. Influena pH-ului asupra activitii enzimatice
Reactivi:
1. Tampon citrat 50 mM cu pH = 4-6;
Soluia A: 2,1g acid citric monohidratat se dizolv n 100 ml ap;
Soluia B: 2,49g citrat trisodic cu 2 moli ap se dizolv n ap
distilat lipsit de CO, la un volum final de 100 ml;
Pentru a obine cele 3 soluii se procedeaz astfel:
- pentru pH = 4 - 33 ml sol. A + 17 ml sol. B + ap dist. pn la 50 ml;
- pentru pH = 5 - 20,5 ml sol. A + 29,5 ml sol .B + ap dist. pn la 50 ml;
- pentru pH = 6 - 9,5 ml sol. A + 41,5 ml sol. B + ap dist. pn la 50 ml.
2. Tampon Tris 50mM pH = 7,2-9
Soluia A: 4,84g Tris (hidroximetil-amino-metan) se dizolv n 200
ml ap
Soluia B: HCl 0,2 M;
113
R - OH + H3PO4
O2N
OPO3H2 + H2O
O2N
OH + H3PO4
11
11,0
1,0
0,2
12
1,0
0,2
2,0
2,0
115
OPO3H2 + H2O
O2N
OH + H3PO4
Reactivi :
1. Soluie tampon-substrat cu pH=10,5: tampon glicocol 0,05M, MgCl 2
0,0005M, p-nitrofenilfosfat 0,0055M. Se dizolv 375 mg glicocol, 10 mg
MgCl2.6H2O i 165 mg p-nitrofenilfosfat sare de sodiu n 42 ml NaOH 0,1N;
2. NaOH 0,02N;
3. Soluie p-nitrofenol 5.10-5M. Se dizolv 695 mg p-nitrofenol n 1000 ml
NaOH 0,02N.10 ml, din aceast soluie se dilueaz cu NaOH 0,02N la 1000 ml.
Tehnica determinrii
n 2 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:
116
Reactivi
Prob
Martor
Soluie tampon-substrat 0,2 ml
0,2 ml
Ser proaspt
0,1 ml
Se agit i se incubeaz 30 de minute la 370C, dup care se adaug
urmtorii reactivi:
NaOH 0,02N
2,5 ml
2,5 ml
Ser
0,1 ml
Se citete Ep fa de martor la 405 nm, n cuve de 1 cm.
Calcul:
Activitatea fosfatazei alcaline se obine din tabelul alturat sau din
urmtoarea formul de calcul:
mU / ml 200E 405nm
E405nm
0,050
0,060
0.070
0,080
0,090
0,100
0,120
0,140
0,160
0,180
0,200
0,220
0,240
0,260
mU
10
12
14
16
18
20
24
28
32
36
40
44
48
52
E405nm
0,280
0,300
0,320
0,340
0,360
0,380
0,400
0,420
0,440
0,460
0,480
0,500
0,520
mU
56
60
64
68
72
76
80
84
88
92
96
100
104
E405nm
0,540
0,560
0,580
0,600
0,620
0,640
0,660
0,680
0,700
0,720
0,740
0,760
0,780
mU
108
112
116
120
124
128
132
136
140
144
148
152
156
117
[S]
[S] K M
[S]
[S] K M'
[ I]
K M' K M 1
K i
[S]
[S] K M
118
unde:
'
Vmax
Vmax
[ I]
1
Ki
M x
V Vmax Vmax [S]
Dac se reprezint grafic 1/V n funcie de 1/[S] se obine o dreapt (I) (Fig.
12) a crei pant este KM/Vmax, intersecia dreptei cu abscisa este 1/KM, iar cu
ordonata 1/Vmax. Se poate calcula deci KM i Vmax.
Determinarea experimental a Ki pentru ambele tipuri de inhibiie, se
realizeaz astfel: se lucreaz n condiii identice cu cele de mai sus urmrind
variaia vitezei de reacie la concentraie constant de inhibitor i concentraii
variabile de substrat. Se reprezint grafic apoi 1/V n funcie de 1/[S] i se
calculeaz de pe grafic KM, respectiv Vmax. Datele obinute se introduc n ecuaia
(3), respectiv (4) i se calculeaz Ki.
Tehnica de lucru
Reactivi :
1. Tampon fosfat pH=7,8;
2. Acetiltiocolin 1mM;
3. Benzoilcolin 1mM;
4. NaF 10mM;
5. Ser dil.1/10;
6. DTNB = reactiv de culoare.
Se determin concomitent KM, colinesteraza (ChE) seric pentru
acetiltiocolin ca substrat, (principiul determinrii fiind dat la determinarea
activitii ChE serice) i Ki pentru benzoilcolin (inhibitor competitiv prin analogie
structural) i pentru NaF inhibitor necompetitiv, astfel:
119
inhibitia competitiva
1
v0
pantafara inhibitor =
inhibitia incompetitiva
inhibitia necompetitiva
fara inhibitor
pantainhibitor =
KM
KM
Vmax
(1 +
Vmax
[I]
KI
1
[S]
4
1,0
0,8
0,2
5
0,8
1,0
0,2
M
1,8
0,2
2,0
2,0
2,0
4
0,8
0,8
0,2
0.2
5
0,6
1,0
0,2
0.2
M
1,8
-
0,2
0,2
0,2
0,2
0,2
2,0
2,0
2,0
E
E / min
4
.dil.ser 405nm .
1,5E 405nm
mM
10.13,6 0.02
1/S
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
10
5
3,3
2,5
1,65
Se reprezint grafic 1/V n funcie de 1/S pentru cele trei serii de rezultate
(Vezi Fig.12), obinnd trei drepte:
Din: - I se calculeaz Km i Vmax;
- II - Km
- III - Vmax.
Pentru calcularea KI rezultatele se introduc n relaia:
I
K 'M
[ I]
K 'M K M 1
1
sau:
KI
KM
KI
V
V
[ I]
'
Vmax
max sau max 1
'
[ I}
KI
Vmax
1
KI
Determinarea activitii enzimatice a colinesterazei serice nespecifice
Colinesterazele sunt enzime din clasa hidrolazelor, subclasa esteraze. Dup
mecanismul de aciune sunt serin-hidrolaze.
Se cunosc dou enzime:
- Acetilcolinesteraza, cu o specificitate strict pentru acetilcolin,
este prezent n diferite esuturi, mai cu seam n eritrocite i creier i are
121
AcChE
+
Dozarea acestei enzime n ser (valoare normal: 3-8 U/ml ser) are valoare
diagnostic n laboratorul clinic:
- este un indicator preios n depistarea intoxicaiilor cu organofosforice
cnd activitatea enzimei scade pn la 10% din valoarea normal;
- n insuficiena hepatic (ciroz), este de asemenea sczut datorit
capacitii reduse de biosintez proteic a ficatului.
Principiul determinrii
Pentru vizualizarea produilor de reacie se utilizeaz un analog de substrat:
butiriltiocolina (un atom de O este nlocuit cu S) care prin hidroliz enzimatic n
prezena de ChE pune n libertate tiocolina; aceasta formeaz cu DTNB ( reactiv de
culoare pentru gruprile SH) un compus colorat, cu maxim de absorbie la 412 nm
(mM = 13,6 ).
ChE
NO2
NO2
COOH
COOH
HOOC
O2N
122
NO2
Reactivi :
1. Soluie substrat: butiriltiocolin 10mM n tampon fosfat 20mM pH =7,8;
2. Ser dil.1/100;
3. Reactiv de culoare: DTNB 0,2mM n tampon fosfat 20mM pH = 7 i
etanol 1/1.
Tehnica de lucru :
n 2 eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:
Reactivi
Soluie substrat
Ser diluat 1/100
Se incubeaz 10 minute
Reactiv de culoare
Ap distilat
P
0,2
0,2
M
0,2
-
2,0
-
2,0
0,2
E / min
dil.serului
E 412 nm
E 412nm 2400
x
8,8E 412 nm
136
2
P
1,0
4,0
M
1,0
4,0
C
E
UI / ml ser
mg prot . / ml ser
GPT
NH2
NH2
Pentru a doza GPT, se las s reacioneze serul de analizat asupra cetoglutaratului i alaninei n soluie tampon. Cantitatea de piruvat se msoar
fotometric, sub form de 2,4 dinitrofenilhidrazon.
Reactivi:
1. Soluie tampon-substrat (tampon fosfat 100mM pH=7,4; D-L alanina
200mM; acid -cetoglutaric 2 mM);
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazin 1mM;
3. Soluie NaOH 0,4N.
Tehnica determinarii:
n dou eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:
Reactivi (ml)
Soluie tampon-substrat
124
P
0,5
M
0,5
GOT
NH2
Piruvatul rezultat n urma reaciilor de mai sus, reacioneaz cu 2,4dinitrofenilhidrazin n mediu alcalin i formeaz 2,4-dinitrofenilhidrazon de
culoare roie, care se msoar fotometric la 546 nm.
Reactivi:
1. Soluie tampon-substrat pH 7,4;
2. Reactiv de culoare: 2,4-dinitrofenilhidrazin 1mM;
3. Soluie NaOH 0,4N.
Tehnica determinrii:
n dou eprubete se pipeteaz urmtorii reactivi:
Reactivi (ml)
M
P
Soluie tampon-substrat 0,5
0,5
Ser proaspt
0,1
nehemolizat
Ap distilat
0,1
o
Se agit i se incubeaz 30 de minute la 37 C, apoi se adaug:
Reactiv de culoare
0,5
0,5
Se agit i se las la temp. camerei 20 de minute, dup care se adaug:
NaOH 0,4N
5
5
Se agit eprubetele iar dup 5 minute se citete extincia probei fa de
martor la 546 nm n cuva de 1 cm.
Dac extincia depete valoarea de 0,260 se dilueaz serul 1:10 i se repet
determinarea n condiiile de mai sus.
Corespondena ntre valoarea E546nm i activitatea enzimatic (mU) este
redat n tabelul urmtor:
E546nm
mU/ml
E546nm
mU/ml
0,020
4
0,160
34
0,040
8
0,180
40
0,060
11
0,200
48
0,080
16
0,220
57
0,100
19
0,240
67
0,120
24
0,260
80
0,140
28
Dac citirile nu se pot executa la 546 nm se face o curb de etalonare a
piruvatului.
Valorile normale n ser sunt de pn la 12mU/ml.
126
Interpretarea rezultatelor
GOT:
- Creteri marcate (de 10-100 ori fa de valorile normale) se observ n:
- infarctul miocardic,
- hepatit viral acut,
- necroz toxic a ficatului.
- Creteri moderate se observ n:
- evoluia hepatitelor cronice,
- ictere mecanice,
- mononucleoz infecioas,
- anemii hemolitice severe.
GPT:
- Creteri marcate (de aproape 100 ori fa de valorile normale) apar n:
- hepatita viral acut
- necroza toxic a ficatului.
- Creteri moderate apar n:
- hepatita cronic i ciroze,
- ficatul de staz cardiac i
- mononucleoza infecioas.
Raportul GOT/GPT se numete coeficient DE RITTIS = 1,33 la subiecii
normali. Acest raport:
- scade n leziunile inflamatorii ale ficatului, datorit creterii
marcante a GPT.
- leziunile necrotice duc la creterea GOT, iar raportul GOT/GPT
crete.
- hemoliza duce la creteri ale GOT-ului.
Determinarea activitii -glutamiltranspeptidazei serice
Principiu:
-Glutamiltranspeptidaza (-GT) catalizeaz transferul acidului glutamic de
pe un donor (-glutamil-p-nitroanilid), pe un acceptor (glicilglicin). In urma
reaciei se formeaz p-nitroanilin, colorat n galben (mM = 9,9).
Reactivi:
1. Substrat n Tris HCl;
2. Ser de analizat;
3. Acid acetic 1N.
127
O 2N
NH - C = O + CH2 - COOH
(CH2)2
NH - C = O
CH - NH2
CH2 - NH
COOH
O 2N
Tehnica de lucru:
Pentru fiecare determinare se pregtesc 2 eprubete n care se pipeteaz:
Reactivi (ml)
M
P
Substrat Tris n HCl
0,30
0,30
Ser
0,02
o
Se incubeaz la 25 C timp de 20 de minute, apoi se adaug:
Acid acetic 1N
1,50
1,50
Ser
0,02
Se citete extincia probei fa de martor la 405 nm dup 30 de minute de la
adugarea ultimului reactiv.
Calcul:
1 UI este cantitatea de enzim care catalizeaz transferul a 1 mol de acid
glutamic de pe un donor pe acceptor la temperatura de 250 C n timp de 1
minut.Activitatea enzimei serice se exprim n U/L.
Activitatea -GT ( U/L ) = 460 x E405/20 minute
Interpretarea rezultatelor
Valori normale: 6 - 28 U/L la brbai;
4 - 18 U/L la femei.
Testul -GT este folosit n diagnosticul suferinelor hepatice, fiind mult mai
sensibil dect fosfataza alcalin pentru depistarea formelor de colestaz i este
singurul test enzimatic pentru decelarea hepatopatiilor alcoolice.
Valori crescute se ntlnesc i n:
- hepatite cronice,
- neoplasm primitiv sau metastazic al ficatului,
- insuficien cardiac cu staz hepatic sau
- leziuni pancreatice
- administrare de barbiturice
128
- la alcoolici.
IX. ANALIZA BIOCHIMIC A LIPIDELOR
Lipidele sunt compui organici care intr n constituia tuturor organismelor
vii i care au o caracteristic comun, aceea de a fi insolubile n ap, dar uor
solubile n solveni organici. Din punct de vedere chimic, lipidele sunt esteri ai
unor polialcooli cu acizii grai superiori. Ele constituie o clas heterogen de
substane organice, iar gruparea lor n aceeai clas de substane se face numai pe
baza proprietilor lor fizice de solubilitate.
IX.1.CLASIFICAREA LIPIDELOR
A. Din punct de vedere structural lipidele se mpart n:
I. Lipide simple : - esteri ai acizilor grai cu glicerina (triacilgliceroli)
- esteri ai acizilor grai cu alcooli superiori
monocarboxilici (ceruri)
II. Lipide complexe: - glicerofosfolipide: esteri ai glicerinei cu acizi grai,
compui azotai i un rest de acid fosforic
- sfingolipide: conin un alcool (sfingozina), acizi
grai, compui azotai i un rest de acid fosforic
Exemple: - fosfolipide
- glicolipide
- sulfatide
- aminolipide
- lipoproteine
III. Derivai ai lipidelor sunt compui rezultai prin hidroliza lipidelor
simple i complexe.
Exemple: - acizii grai: - saturai
- nesaturai
- glicerina
- steroizi
- aldehide grase
- corpi cetonici
B. Din punct de vedere funcional lipidele se mpart n :
I. Lipide de rezerv. Acestea sunt localizate n esutul adipos i sunt
constituite n special din trigliceride de provenien exogen (alimentar)
II. Lipidele citoplasmatice sunt lipide complexe care alctuiesc elementul
constant care variaz numai n funcie de natura esutului.
129
OCO
CH2
OCO
CH2 OCO
H2O
CH
OH
OH
CH2
+3
COOH
OH
COONa
H3C
COOH
COOH
H3C
COONa
130
COONa
BaCl2
(R
COO)2Ba
NaCl
I2
I
Reactivi: 1. untdelemn
2. tinctur de iod
3. soluie de amidon
Mod de lucru
La cca 5 ml ulei se adaug cteva picturi de soluie de iod. Se agit bine
pn cnd mediul capt o culoare roie. Prin nclzirea uoar a amestecului se
observ dispariia culorii roii. Dac soluia se rcete i se ncearc prezena
iodului cu cteva picturi de soluie de amidon, se constat c nu se obine culoarea
albastr pe care o d iodul cu amidonul ceea ce denot lipsa iodului liber. Iodul
adugat se fixeaz la dubla legtur formnd un derivat diiodurat al grsimii
cercetate.
IX.3.LIPOPROTEINELE
Exist ase clase de lipoproteine divizate n funcie de dimensiune i
coninutul de lipide. Densitatea acestor lipoproteine i viteza de sedimentare la
ultracentrifug este invers proporional cu coninutul lor de lipide.
Clase de lipoproteine
Lipoproteinele
Chilomicroni
Chilomicroni
Rest
Lipoproteine cu
densitate foarte
sczut
VLDL
Lipoproteine cu
densitate
intermediar
IDL
Lipoproteine cu
densitate sczut
LDL
Lipoproteine cu
densitate mare
HDL
Dimensiuni
[nm]
Proteine
75-1000
30-80
2
...
Colesterol
liber
2
...
Ester de
colesterol
3
...
30-80
25-40
10
20
7.5-10
Compoziia
Trigliceride
Fosfolipide
Locul de
Formare
Intestin
Capilare
90
...
3
...
16
55
17
Ficat i
intestin
25
40
20
VLDL
20
46
21
IDL
50
16
25
Ficat i
intestin
131
Locul de sintez
Intestine, ficat
Intestine, ficat
Ficat
Intestine
Ficat
Ficat
Ficat
ficat, intestin,
macrofage
Funcia
activeaz LCAT
transport trigliceride i colesterol se leag de LDL
transport trigliceride
activeaz LCAT
activeaz lipoproteinlipaza
inhib lipoproteinlipaza
se leag de receptorul LDL i probabil i de alt receptor al
ficatului
Chilomicronii
sunt
ndeprtai
din
circulaie
sub
aciunea
lipoproteinlipazei, care este localizat la nivelul endoteliilor vasculare, n special
al capilarelor. Enzima catalizeaz scindarea trigliceridelor din chilomicroni la acizi
grai liberi i glicerol. Acizii grai liberi intr dup aceea n celulele adipoase i se
reesterific, restul rmai n circulaie se fixeaz de albumin. Lipoproteinlipaza,
care necesit prezena heparinei ca i cofactor, ndeprteaz de asemenea
trigliceridele din lipoproteinele cu densitate foarte joas (VLDL).
Chilomicronii i VLDL conin Apo C, complex de proteine care i desparte
n capilare. O component a complexului, apolipoproteina C-II, activeaz
lipoprotein lipaza.
Chilomicronii din care s-au ndeprtat trigliceridele rmn n circulaie ca i
lipoproteine bogate n colesterol, denumii rest de chilomicroni, care au un
diametru de 30-80 nm. Ei sunt transportai la ficat, unde se leag de receptorii
restului de chilomicroni i LDL. Ei sunt ndat internalizai prin intermediul unor
receptori specializai printr-un proces de endocitoz i degradai n lizozomi.
Chilomicronii i resturile lor constituie un sistem de transport pentru lipidele
exogene ingerate.
Exist de asemenea un sistem endogen format din VLDL, lipoproteine cu
densitate intermediar (IDL), lipoproteine cu densitate joas (LDL) i lipoproteine
cu densitate mare (HDL), care transport trigliceridele i colesterolul n tot corpul.
VLDL se formeaz n ficat i transport trigliceridele formate din acizii
grai i hidraii de carbon din ficat la esuturile extrahepatice. Dup ce trigliceridele
sunt n mare msur ndeprtate cu ajutorul lipoproteinlipazei, VLDL devin IDL.
IDL ndeprteaz fosfolipidele i prin aciunea enzimei plasmatice lecitincolesterol aciltransferaz (LCAT), capteaz esterii de colesterol formai din
colesterol n HDL. O parte de IDL este preluat de ficat. IDL rmas dup aceea mai
pierde trigliceride i proteine, probabil n sinusoidele ficatului i devine LDL. n
timpul acestor transformri pierd Apo E, dar Apo B100 rmn.
LDL furnizeaz colesterol la esuturi. Colesterolul este un constituent al
membranelor celulare i este utilizat de celulele glandulare pentru a sintetiza
hormoni steroizi.
n ficat i n cele mai multe esuturi extrahepatice, LDL este captat de un
receptor prin intermediul endocitozei. Receptorii recunosc componenta Apo B 100 a
LDL. Ei de asemenea leag i Apo E, dar nu leag Apo B48 (Fig. 14.).
133
Receptorul LDL
Receptorul uman pentru LDL este unul din clasa de receptori care s-au
specializat pentru de transportul macromoleculelor n celule prin endocitoz. Este
un complex molecular mare format dintr-un rest de aminoacid cu cistein n poziia
292 care leag LDL.
Particulele lipoproteice captate de receptori ptrund mpreun cu acetia n
interiorul celulei formnd microvezicule numite endozomi. Prin acidifierea
endozomilor receptorul se desface din complexul cu particula lipoproteic i este
readus la suprafaa celulei.
n cazul receptorului LDL, dar nu i a receptorului restului de chilomicroni,
are loc eliberarea receptorilor LDL, care se recicleaz la membrana celular (Fig.
15.). Endozomii dup aceea se contopesc cu lizozomii, unde colesterolul (format
din esterii de colesterol sub aciunea lipazei acide din lizozomi) devine disponibil
pentru nevoile celulei.
Colesterolul n celule inhib sinteza intracelular de colesterol prin
inhibarea HMG-CoA reductazei, stimuleaz esterificarea colesterolului eliberat n
exces i inhib sintez de noi receptori LDL. Cu ajutorul acestor mecanisme se
realizeaz controlul cantitii de colesterol din celul.
LDL sunt preluai de macrofage cu afinitate redus i nc multe alte celule.
n plus, macrofagele preiau LDL modificat prin oxidare. Oxidarea poate avea loc n
macrofag.
134
dintre cele 150 mutaii ale genei receptorului LDL. Hipercolesterolemia familial
care prezint durere recurent abdominal i pancreatit poate fi rezultatul unei
mutaii genetice a lipoproteinlipazei sau a apo C-II.
O clasificare simplificat se face n primare (familiale) i secundare
(ctigate).
Tulburri cu caracter primar
Clasificarea propus de Fredrickson sau OMS este cea mai acceptat pentru
hiperlipemiile primare (Fig. 16.) i se bazeaz pe evaluarea creterii unei anumite
fraciuni electroforetice a lipoproteinelor serice.
Tipul
Plasm
(12 h la +4C)
Normal
Tipul I
Tipul II-a
Tipul II-b
Tipul III
Tipul IV
Tipul V
Lipoproteine
Chilomicroni
LDL
VLDL
N sau
LDL
VLDL
IDL
Colesterol
total
Trigliceride
LDL colesterol
N sau
Chilomicroni
VLDL
N sau
N
N
N sau
N sau
HDL
colesterol
N sau
N sau
N sau
N sau
N sau
N sau
arterial.
Fenomenele implicate n aterogenez sunt:
1. Acumularea intra i extracelular de material lipidic, mai ales colesterol,
n prezen de apoB100 care se fixeaz cu mare afinitate n peretele arterial. Exist
dovezi c macrofagele capteaz mai ales particulele de LDL modificate
(peroxidate, glicozilate, malonilate) relativ bogate n apoB100.
2. Migrarea unor monocite din sngele circulant sau macrofage din peretele
arterial n care ptrund fie prin diapedez, fie la nivelul leziunilor i formeaz
celulele spumoase. Macrofagele sau monocitele ncrcate cu LDL i reduc
mobilitatea i rmn blocate n peretele arterial ca macrofag rezistent care continu
s nglobeze LDL oxidate i apoi s se transforme n celule spumoase.
3. LDL oxidate i macrofagele ncrcate cu aceste particule exercit un
efect nociv avnd ca urmare proliferarea celulelor musculare din peretele arterial.
4. Consecina acestui proces este ngroarea plcii ateromatoase i implicit
ngustarea lumenului vascular. Celulele musculare proliferate dobndesc proprieti
secretorii cu formare de fibre de colagen, elastin i proteoglicani. Se formeaz o
capsul fibroas ce include un material cremos glbui format din celule spumoase,
detritusuri celulare i material lipidic extracelular.
5. n condiiile n care se perforeaz capsula fibroas se ulcereaz placa
ateromatoas, coninutul acesteia, care conine i un bogat factor tisular, activnd
coagularea.
6. n contact cu peretele vascular i cu elementele sngelui circulant
determin complicaii trombotice.
Este important de subliniat pentru patologia clinic c dei, proliferarea
celulelor musculare netede i formarea esutului fibros ngusteaz lumenul
vascular, totui contribuie la integritatea plcii. Acest proces determin formarea
unei plci ateromatoase stabile care pe plan clinic corespunde unei afeciuni relativ
benigne. Cu toate acestea, unele plci ateromatoase cu o capsul fibroas subire se
pot fisura uor i pot duce la formarea de trombi, i implicit, la sindroame
coronariene acute precum angin instabil, infarct miocardic i moarte subit.
Tromboza constituie prin urmare cel mai important eveniment n evoluia
natural a plcii ateromatoase. Tromboza oclusiv a arterei produce o complicaie
major a aterosclerozei. Acest lucru depinde i de o eventual predispoziie la
tromboz a pacientului, determinat de o hiperreactivitate a plcuelor i de o
hipercoagulabilitate i/sau de o insuficien a sistemului fibrinolitic.
Tratamentul hiperlipemiilor
Dezvoltarea unei hiperlipemii depinde de factorii genetici i de obiceiurile
alimentare i de via, profilaxia putnd fi considerat ca o problem de educaie
sanitar.
140
Tratamentul const n:
1. Regim igieno-dietetic care va fi adaptat dup tipul de hiperlipemie:
- n caz de hipercolesterolemie se vor exclude alimentele bogate n
colesterol.
- n hipertrigliceridemia endogen (tipul III, IV, V) se recomand reducerea
hidrailor de carbon.
Este deosebit de util i cultura fizic medical. Se aplic n centre
specializate sub control medical strict n funcie de anomalia lipidic.
2. Medicaie cu efect hipolipemiant care s aib efecte secundare minime, s
reduc nivelul colesterolului, fosfolipidelor, trigliceridelor i betalipoproteinelor
- exemplu: Clofibrat, Cuemid, Questran, Lovastatin, Simvastatin etc.
141
- metanol,
- ribonucleaz (RNA-az),
- sticlrie de laborator,
- centrifug,
- tuburi de plastic 12 x 75 mm (Falcon 2054) cu capac,
- vortex,
- citometru de flux etc.
Tehnic de lucru.
Se pregtete soluia de colorare (care const din 10 mg de iodur de
propidiu, 0,1 ml Triton X-100, 3,7 mg de EDTA i 90 ml de TFS ), soluia de ARNaz (10 mg de ARN-az n 5 ml TFS) i o baie de ghea pe care se vor lucra
probele.
Suspensia de celule se ajusteaz la 1 x 10 celule/ml n TFS rece, se
porioneaz cte 1 ml n fiecare tub de analiz i se centrifugheaz timp de 10 min
la 200xg, dup care tuburile se in pe ghea. Peste sedimentul de celule se adaug
metanol n picturi, la rece, pn la volumul de 2 ml/tub, n acelai timp agitnd
probele la vortex. Tuburile se incubeaz pe ghea timp de 30 de min, apoi se
centrifugheaz timp de 5 min la 300xg. La sedimentul de celule din fiecare tub se
adaug fie 500l de TFS, care conine iodur de propidiu ( PI ) 100l /ml, fie
acelai volum din soluia de colorare (alegerea depinde de tipul de celule
investigate) i 500l din soluia de ARNaz n TFS (concentraie final 100
uniti/ml).
Probele se agit cu ajutorul unui vortex, se incubeaz pentru 30 min. la
temperatura camerei, apoi se analizeaz la un citometru de flux. Aparatul este
calibrat cu o suspensie de microsfere de polistiren fluorescente cu diametrul de
10m n vederea stabilirii unor standarde dimensionale. Sunt msurate simultan
mrimea i granularitatea celulelor pentru a exclude din analiz debriurile celulare,
iar fluorescena se citete la lungimea de und trecut prin filtrul 578/28 nm.
X.2. IZOLAREA ACIZILOR NUCLEICI
Acizii nucleici (ADN i ARN) sunt macromolecule formate prin
policondensarea nucleotidelor. Un nucleotid este format prin legarea unei baze
purinice sau pirimidinice de o pentoz fosforilat n poziia 5. Astfel fiecare lan
polinucleotidic are un capt 5 i unul 3 .
Bazele purinice din ADN sunt adenina (A) i guanina (G), iar cele
pirimidinice timina (T) i citozina (C).
Bazele purinice din ARN sunt adenina (A) i guanina (G), iar cele
pirimidinice uracilul (U) i citozina (C). Nucleotidele se leag prin legturi
fosfodiesterice.
Acizii nucleici se gsesc peste tot n lumea vie: virusuri, procariote i
eucariote. Spre deosebire de organismele cu organizare celular, virusurile conin
un singur tip de acid nucleic, fiind clasificate n ADN-virusuri i ARN-virusuri.
Diferitele vieuitoare conin molecule de ADN de lungimi diferite i cu succesiuni
143
Fig. 17. Structura ADN dublu catenar; dup J.D.Watson i colab. (1992)
Sunt mai multe tipuri de ADN dublu helix descrise de J. Watson i F. Crick
( premiul Nobel n 1963 ) i apoi de alii ( A. Wang, A. Rich ), cel mai frecvent
ntlnit fiind aa numita form B cu 10 nucleotide pe tur, orientate perpendicular
pe axul lung al moleculei. Pasul helixului este de 3,4 nm i diametrul de 2,0 nm.
mperecherea bazelor, pe baza complementaritii, constituie aspectul principal pe
care se bazeaz metodele de identificare a secvenelor de ADN.
n ultimele decenii au fost precizate numeroase aspecte cu importan
teoretic i practic deosebit pentru toate disciplinele biologice. Se poate afirma
144
totui c indiferent de aspectul studiat prima condiie rmne izolarea n stare pur
i cu structura intact, nedenaturat a tipului de acid nucleic care urmeaz a fi
analizat din punct de vedere al proprietilor fizice, chimice sau biologice.
Principii de izolare ale ADN
1. Eliberarea coninutului intracelular. Acest proces se poate face n diferite
moduri depinznd de proba din care vrem s izolm ADN :
- mecanic prin omogenizare urmat de liz cu un detergent
- prin mojarare cu oxid de aluminiu a probelor ngheate n azot lichid
- prin ultrasunete sau liz cu enzime specifice (lizozim pentru bacterii)
2. Precipitarea proteinelor ntr-un mediu care inhib ADN hidrolazele: sunt
folosite diferite amestecuri de solveni organici dup adugarea unui agent care
desprinde proteinele asociate din cromatin. De exemplu se folosesc concentraii
mari de NaCl, iar ca amestec denaturant fenolul simplu sau n amestec cu
cloroform.
3. Purificarea avansat prin adugarea de proteaze i ribonucleaze pentru a
hidroliza ARN
4. Recoltarea prin centrifugare a stratului care conine ADN dizolvat
5. Precipitarea selectiv a ADN cu etanol la rece ( sau alt alcool )
6. Recoltarea ADN prin rsucirea pe o baghet sau prin centrifugare
X.2.1. IZOLAREA ADN DIN MATERIALE BIOLOGICE
Principiu:
Primul pas pentru succesul unei metode de biologie molecular l reprezint
izolarea ADN din celule. Oricare ar fi materialul utilizat, acesta trebuie s fie
proaspt sau congelat nainte de utilizare pentru a mpiedica degradarea ADN-ului
de ctre enzimele prezente n extractul celular.
Celulele trebuie distruse pentru a elibera componentele sale. Eliberarea
coninutului intracelular se poate face n diferite moduri depinznd de proba din
care vrem s izolm ADN.
Urmeaz precipitarea proteinelor, iar apoi purificarea avansat prin adugarea
de proteaze i ribonucleaze, urmat de recoltarea prin centrifugare a stratului care
conine ADN dizolvat.
Metoda de izolare a ADN din timus de viel
Timusul reprezint un organ deosebit de bogat n celule i cu puin substan
fundamental, de aceea este materialul preferat pentru extracia ADN-ului, n cazul
n care nu urmrim scopuri speciale.
Metoda se poate aplica i altor esuturi dar randamentul va fi mai mic.
145
146
147
148
1
0,0
2
0,2
3
0,5
4
1
2,8
2,5
Reactiv
difenilamin
1
0,0
3
2
0,2
2,8
3
0,5
2,5
4
1
2
Reactiv
difenilamin
151
153
, unde:
0,19
154
Bibliografie
1. Mitrea N., Margin D., Arsene A., Grdinaru D., Burta C., Biochimie
Vitaminele n procesele metabolice, Ed. Didactic i Pedagogic Bucureti,
2008
2. Barrett A.J., Cantor C. R., Enzyme nomenclature, Academic Press, 1992
2. Cristea-Popa E., Popescu A., Truia E., Dinu V., Tratat de Biochimie
Medical, Ed. Medical-Bucureti, 1991.
3. Felszeghy E., Abraham A., Biochimie, Ed. Didactic i Pedagogic
Bucureti, 1972
4. Lehninger A.L. Biochimie, Ed.Tehnic Bucureti, 1987
5. Gilu D., Antonescu A., Dobjanschi L., Gilu R.D., Gilu L., Compendiu
de Biochimie medical, Ed. Imprimeriei de Vest Oradea, 2002.
6. Gilu L. Proinov I., Biochimie, Ed. Universitii din Oradea, 1999
7. Mihele D., Biochimie clinic, Ed.Medical Bucureti, 2001.
8. Thierry Grisar, Elements de biochimie humaine normale et pathologique,
partium I, Les Editions de lUniverite de Liege, 2004
9. rmure Cornelia, Biochimie structural i metabolic vol.I, Ed.Dacia
Cluj-Napoca, 1996
10. Vrana K.E., Biochemistry, Lippincott Williams Wilkins, Philadelphia,1999.
11. Mody Eugen, Funduc I., Alexandrescu R., Dobreanu M., Biochimie clinic,
Editura All Educational, Timioara, 2000
12. Dobjanschi Luciana, Antonescu A., Bogdan N., Codreanu I., Gilu D.,
Murean M., Gilu L., Lucrri practice de biochimie, Editura Imprimeriei
de Vest, Oradea, 2001
13. Mihele Denisa, Biochimie clinic metode de laborator, Editura Medical,
Bucureti, 2000
14. Bettelheim F., Landesberg J., Laboratory Experiments for general,
organic&Biochemistry, Saunders Golden Sunburst Series, 1997
15. Pallag Anamaria, Mraz Camelia, Jebeleanu Gheorghe, Patologie
molecular experimental, Editura Universitii din Oradea, 2004
155