Tehnici de concentrare prin sedimentare

Principiul de baza: chisturile si oochistii

-au greutate specifica mai mare decat a mediului in care materiile fecale sunt suspensionate. In mediu
reprezentat de apa sau solutie fiziologica au tendinta de a se depune.

Separarea si depunderea elementelor parazitoare poate fi grabita printr-un tratament chimic sau printr-o
centrifugare usoara astfel inlaturandu-se resturile nedigerate din materia fecala.

Prima forma de sedimentare: formol 10%, eter, apa distilata, ser fiziologic, solutie Lugol, sita din material
textil, tub, centrifuga, pipete pasteour, lame si lamele.

Prepararea sol de formol 10%: se introduc intr-un flacon de 1L, 100ml formol apoi se adauga 900ml apa
distilata. Solutia poate fi folosita 2 ani.

1.Tehnica de sedimentare

Se recolteaza din mai multe puncte ale mat fecal , se omogenizeaza cu 10 ml ser se filtreaza suspensia
printr-o sita intr-un tub pe centrifuga. Apoi se pune la centrifuga cu 2000 rot/min, supernatantul se
indeparteaza iar sedimentul se reia in 10 ml ser fiziologic.

Aceasta operatie se repeta de n ori pana cand supernatantul este limpede. Dupa ultima spalare
sedimentul obtinut se reia cu formol 10%. Se agita si se lasa cateva min sa se depuna. Se adauga 1-2 ml
de acetat de etil apoi se inchide tubul si se agita puternic. Se centrifugheaza la 1500 rot/min timp de 1
min. La sfarsitul centrifugarii in tub pot fi observate 4 straturi. La suprafata un strat format de acetatul de
etil, un strat inchis la culoare continand elemente nedigerate, un strat continand formolina si ultimul
sedimentul. Cu ajutorul unui varf de pipeta se desprinde cu atentie de peretii tubului elementul
reprezentat de al 2-lea strat dupa care se decanteaza celelalte 3 straturi. Cu o pipeta pasteour
sedimentul se repartizeaza pe lame pe cate o picatura de Lugol. Se acopera cu o lama si se examineaza.
Sedimentarea poate fi aplicata si in cazul probelor fixate cu PVA. Lamele cu mat de examinat trebuiesc
pregatite cel mai tarziu in interval de 1 ora. Pentru a preintampina acest lucru se pune o pic de formol.
Pot aparea erori in diagnostic atunci cand cantitatea de material fecal este prea mica sau prea mare.
Sedimentarea cu sol acetoacetica si sedimentarea cu HCL.

2.Flotare sau flotatie

Principiul de baza: chisturile protozoarelor si ouale helmitilor avand o greutate specifica mai mica decat a
mediului pot fi recoltate prin flotare.

Materiale necesare: sol saturata de clorura de sodiu 40%, recipienti cu deschidere suficient de mare pt a
primi o lamela cu diametrul de 18x18mm, lame si lamele.

Mod de lucru: intr-un recipient se introduc cateva mici fragmente din material fecal , se adauga o
cantitate mica din sol saturata de NaCl pana la limita superioara a recipientului cu ajutorul unei pense se
depune o lamela de microscopie, depunerea facandu-se cu grija astfel incat lamela sa nu se scufunde.
Dupa aproximativ 30min tot cu ajutorul pensei lamela se ridica, insa pastrandu-se paralelismul si se
depune pe lama de examinare. Se examineaza.

Aceasta metoda nu este eficienta in depistarea oualelor operculate. Depasirea timpului de flotare in
conditiile in care are loc un proces de evaporare la suprafata lichidului poate favoriza depunerea
cristalelor de NaCl si ingreunarea oualelor care se pot scufunda nemaiputand fi evidentiate.

Coloratia ZIEHL NIELSEN

-este recomandata pt evidentierea oochistilor de Cryptosporidium parvum

Reactivi: fuxina fenica, formol 10% sol HCL etanol, sol verde Malachit sau albastru de metilen,
sol HCL-metanol, alcool metilic si H2O.

Mod de lucru: se adauga metanolul absolut se agita usor pana la dizolvarea colorantului se dizolva
separat fenolul in putina apa distilata. Se adauga fenolul dizolvant peste colorant si se agita. Se adauga
restul de apa distilata si iar se agita. Solutia poate fi utilizata la infinit.

Solutia de HCL-etanol folosim HCL concentrat 1ml, etanol 95% 100ml, se amesteca etanolul 95% si se
introduce intr-un flacon de 250ml care poate fi inchis ermetic si se adauga HCL dupa care se amesteca.

Sol de glicerol verde Malachin sau albastru de metilen - glicerol 100ml si verde Malachin sau albastru
de metilen in solutie apoasa 3% 1ml si apa distilata 100ml. Intr-un flacon se introduc 3g de verde
Malachin peste care se adauga 100ml apa distilata. Intr-un alt flacon se introduc 1ml din sol 3%
preparata anterior peste care se adauga 100ml glicerol si 100 ml apa distilata. Se amesteca cele 2 solutii
inainte de utilizare.

Sol HCL-metanol pt care avem nevoie de HCL concentrat 3ml si metanol absolut 100ml. Se introduce
metanolul absolut intr-un flacon se adauga HCL se amesteca si se inchide ermetic flaconul.

Tehnica de lucru: se executa frotiuri subtiri din material fecal ce urmeaza a fi examinat. Se usuca la aer si
se fixeaza cu metanol sau HCL-metanol timp de 2-3min. Se acopera frotiurile cu fuxina fenica rece timp
de 5-10min. Se adauga solutie de HCL-metanol pana cand colorantul nu mai difuzeaza. Se spala cu apa
de robinet. Se contracareaza cu sol de 3% verde malachin sau albastru de metilen timp de 30sec apoi se
spala cu apa de robinet se usuca si se examineaza la microscop. Oochistii apar colorati in rosu. Se
recomanda examinarea cu obiectivul de imersie in scopul unor particularitati de structura.