Spectrofotometrie

1. Scopul lucrarii

Metoda spectrofotometrica face parte din clasa metodelor fizice de determinare a concentratiei unei
solutii in laborator. Similar celorlalte metode fizice, este simpla, rapida si ieftina. Folosind un
spectrofotometru Spekol, se va determina concentratie unei solutii.

2. Teoria lucrarii

Spectrofotometria reprezinta o clasa larga de metode de investigare. Ea face parte dintr-o clasa si mai
mare si anume, clasa metodelor spectrometrice. Orice metoda spectrometrica inregistreaza si masoara
spectre electromagnetice.

Spectru electromagnetic

Un spectru reprezinta totalitatea valorilor unei marimi ce caractereizeaza un sistem. In cazul unui spectru
electromagnetic acesta reprezinta totalitatea lungimilor de unde ( frecventelor ) pe care un sistem le poate
emite sau absorbi. Atunci cand un sistem absoarbe radiatii electrimagnetice, el trece pe un nivel energetic
superior, iar cand emite, pe unul inferior. Conditia ( de rezonanta ) ce trebuie indeplinita esti :

hʋ=𝐸𝑠 -𝐸𝑖

Unde 𝐸𝑠 = energia nivelului superior

𝐸𝑖 = energia nivelului inferior

ʋ= frecventa radiatiei

Din conditia de rezonanta rezulta ca sistemele pot absorbi aceleasi radiatii pe care le pot si emite. Vom
obtine deci, practice, aceleasi informatii, fie ca analizam ce emite sistemul, fie ca inregistram ce absoarbe.

Daca lungimile de unde emise sau absorbite au valori intr-un domeniu cvasicontinuu, obtinem spectre de
benzi, iar daca variaza discontinuu, sunt spectre de linii. Spectrele de linii sunt in general specific
substantelor in stare atomica, in timp ce spectrele de benzi sunt, in general, specific substantelor in stare
moleculara.

Fiind vorba de un numar foarte mare de metode, se impune clasificarea lor. Si in acest caz se pot face mia
multe clasificari, vand in vedere mai multe criteria :

Fiind vorba de un numar foarte mare de metode, se impune clasificarea lor. Si in acest caz se pot face
mai multe clasificari, vand in vedere mai multe criteria :

 Criteriul domeniului spectral investigat. In toate domeniile spectrale electromagnetice exista metode
de investigare, multe dintre ele cu aplicatii clinice. Domeniile spectrale electromagnetice sunt, in
ordinea crescatoare a lungimii de unda, urmatoarele : gama (Y), raza X, ultraviolete (UV),vizibil,
infrarosu (IR), microunde si radiounde. In cazul metodelor spectrometrice din domeniile UV, vizibil
si IR, metodele se numesc, in general, spectrofotometrice.
 Criteriul modului de obtinere a spectrelor. Sistemele analizate pot fi puse sa emita sau sa absoarba
radiatii electromagnetice. Vorbim astfel de spectrometrie de emisie, respective de absorbtie.

Metode cu implicatii clinice :

Domeniul Numele metodei Informatii Informatii Semnificatii
spectral (actiuni) directe (actiuni) indirecte clinice

ɣ Gama-terapie Absorbtia Distrugerea Terapia

(cabaltoterapie) radiatiilor ɣ in celulelor cancerului
tesuturi canceroase
ɣ Scintigrafia Inregistrarea Determinarea Diagnostic
emisiei de radiatii distributiei functional al
radioizotopilor organului
introdusi in
organism
X Radiografie Absorbtia Imagini ale Diagnisticarea
radiatiilor X in organelor interne fracturilor etc.
tesuturi
X Tomografie Absorbtia razelor Imagini ale Imagini cu detalii
computerizate cu X in tesuturi oricarei sectiuni de ordinul
raze X prin corp milimetrului
UV, vizibil, IR Spectrofotometrie Absorbtia acestor Determinarea Diagnosticarea
radiatii de catre conc. Diferitelor diferitelor maladii
molecule molecule
Vizibil, IR Oximetrie Abosrbita Determinarea Monitorizarea
radiatiilor rosii si raportului gradului de
IR de catre sange 𝐶𝑜𝑥𝑖ℎ𝑒𝑚. /𝐶ℎ𝑒𝑚 oxigenare a
sangelui
Microunde RES Absorbtia Urmarirea Se spera ca se vor
microundelor de proceselor in care putea urmari
catre rad. Liberi apar radicalii procesele
aflati in camp liberi metabloice
magnetic
Radiounde RMN Absorbtia Imagini ale Imagini cu detalii
radioundelor de oricarei sectiuni de ordinul
catre necleele de prin corp milimetrului
H plasate in camp
magnetic
Un fascicol de radiaţii de intensitate I0,ce străbate sub o incidenţă normală un strat absorbant, pierde o
parte din energia sa radiantă prin reflexie Ir iar o parte din aceasta este absorbită de către sistemul Ia.
Metoda de analiza chimica a alimentelor prin spectrofotometrie este o metoda care are la baza legea
LAMBERT-BEER.

Deci din intensitatea iniţială numai o parte din radiaţie este transmisă şi ea se notează cu It.
Gradul de diminuare al intensităţii radiaţiei incidente este (conform legii lui Beer-Lambert) proporţional
cu grosimea stratului traversat şi cu concentraţia speciei absorbante:

Legea Beer-Lambert - exprimă legătura între intensitatea luminii care traversează o soluţie şi
concentraţia soluţiei respective.
În spectrofotometrie se folosesc uzual doi parametri pentru a cuantifica absorbţia:
T - este transmisia E - este extincţia .

Se observa ca 𝐸𝜆= 𝐾𝜆 x d. Este evident ca marimea absorbtiei depinde de numarul centrilor absorbanti,
respective de concentratia acestora, fapt explicat de Beer, care a stability relatia :

𝐾𝜆= Ɛ𝜆 x C

Unde : C-concentratia substantei, masurata in mol/l

Ɛ𝜆 –coeficient de extinctie, masurat in l/mol x cm

Coeficientul de extinctie depinde numai de lungimea de unda a radiatiei si caracterizeaza substanta

absorbanta. Asa cum atomii pot fi identificati, in emisie, dupa spectrele proprii de emisie, tot astfel o
anumita specie de atomi poate fi identificata prin studierea curbelor de absorbtie Ɛ𝜆 = 𝑓(𝜆).
 3. Descrierea aparatului

Spectrofotometrul este un aparat optoelectronic care măsoară raportul a două valori ale unei mărimi
radiometrice la aceeaşi lungime de undă şi în acelaşi interval îngust de lungime de undă . Cu ajutorul unor
oglinzi mobile din monocromator se schimbă în salturi foarte mici frecvenţa luminii selectate din
radiaţia totală a sursei. De fiecare dată se măsoară absorbţia, transmisia sau extinţia şi se calculează
valoarea coeficientului de extinţie E. Reprezentând grafic variaţia lui E în funcţie de frecvenţă sau
lungimea de undă se obţine o spectrogramă (un spectru).

(T-100%)
B
S M D A I
P
Schema bloc a unui spectrofotometru

S- sursa de radiatii

M-monocromator, allege din ce emite sursa o singura lungime de unda λ

B-solventul (blanc) foloseste la etalonarea de T=100%

P-proba pentru care masura E (sau T)

D-detectorul transform alumina in current electric ( fotocelula sau fotomultiplicator)

A-amplificator

I-inregistrator, microampermetru gradat in unitati liniare de transmisie si unitati logaritmice de extinctie

 4. Mod de lucru

1. Se trasează un grafic A = f(λ)

2. Se trasează cele patru curbe pentru fiecare soluţie de AO (2‰, 4‰, 8‰, x‰); Obs: toate cele patru
curbe se trasează pe acelaşi grafic

3. Se selectează lungimea de undă corespunzătoare maximului de absorbţie pentru toate cele patru
soluţii de AO

4. Se calculează concentraţia necunoscută a soluţiei de AO - două metode:

a) calcularea concentraţiei folosind metoda grafică:

 se trasează un grafic A = f(c) - cu valorile absorbanţei pentru maximul de absorbţie al soluţiilor

de AO
 se determină concentraţia necunoscută a soluţiei de AO prin intrapolare

b) calcularea concentraţiei prin metoda matematică (metoda celor mai mici pătrate):

 se scrie ecuaţia dreptei de regresie:

Y=a+bX

A =a+b cx

A = absorbanţa; cx = concentraţia necunoscută

 se calculează parametrii a şi b - cu ajutorul unui program pentru calcularea parametrilor dreptei

de regresie.
 se înlocuiesc în ecuaţia dreptei de regresie valorile parametrilor asi b
 se calculează concentraţia necunoscută a soluţiei de AO.

6. Se compară valoarea concentraţiei obţinută prin metoda grafică cu valoarea

obţinută prin metoda matematică .
 5. Rezultat

În funcţie de masa probei, volumul final al soluţiei, softul aparatului prelucrează aceste date şi
afişează direct rezultatul.
Se ia în considerare media celer două determinări, dacă sunt îndeplinite condiţiile de
repetabilitate.
 r-repetabilitatea : valoarea sub care diferenţa absolută dintre rezultatele a două teste
separate obţinută în condiţii de repetabilitate (de exemplu : aceeaşi probă, acelaşi
operator, acelaşi aparat, acelaşi laborator şi interval scurt de timp) se situează în limitele
unei probabilităţi specifice ( în principiu 95%), astfel r= 2.8xs(r).
 s(r) - deviaţia standard, calculată din rezultatele obţinute în condiţii de repetabilitate.