Page 1 of 65

Aspecte generale ale semnalizării celulare

Introducere CURS 1
 O caracteristică comună tuturor organismelor este capacitatea constantă de a își coordona
activitățile cu schimbările de mediu.
 Comunicarea cu mediul se realizează printr-o serie de căi care primesc și procesează semnale din
mediul exterior, de la alte celule din organism sau de la regiuni diferite în cadrul aceleiași celule.
 Pe lângă această adaptare a unui organism la modificările de mediu, organismele multicelulare
necesită controlul coordonat al funcțiilor celulare.
 Formarea și menținerea țesuturilor specializate ale organismelor multicelulare depinde de reglarea
coordonată a:
1. Numărului de celule,
2. Morfologiei și localizării celulare
3. Expresiei funcțiilor diferențiate
Această coordonare rezultă dintr-o rețea de comunicare între celule în cadrul căreia semnalele
produse afectează celulele țintă unde acestea sunt traduse în reacții biochimice intracelulare care
determină funcția fiziologică a celulei țintă.
Baza pentru coordonarea funcțiilor fiziologice într-un organism multicelular este semnalizarea
(comunicarea) intercelulară, care permite ca o celulă unică să influențeze comportamentul altor celule în
mod specific.
Deoarece organismele multicelulare conțin celule specializate care formează țesuturi și organe
specifice trebuie să coordoneze un număr de activități fiziologice, de tipul:
o Metabolismului intermediar
o Răspunsul la semnale externe
o Creșterea celulară
o Diviziunea celulară
o Diferențierea celulară
o Motilitatea celulară
o Morfologia celulară
Semnalele generate în timpul comunicării intercelulare trebuie recepționate și procesate în celulele
țintă pentru a determina reacțiile biochimice care susțin diferite funcții fiziologice în organism.
 Page 2 of 65

Semnalizarea intercelulară
 Acest tip de semnalizare asigură faptul că toate celulele de un tip particular primesc și transformă
un semnal, acționând sincronizat
 Coordonează fluxurile metabolice dintre celulele diferitelor țesuturi
 Asigură diviziunea sincronizată a celulelor și dacă este necesar, determină stoparea diviziunii
celulare și intrarea în stare de repaos
 Are rol în diferențiere și dezvoltarea unui organism. În baza programului genetic, moleculele
semnal produse de o celulă influențează și modifică funcția și morfologia altor celule în organism
 Este critică în procesarea informației senzoriale (optice, acustice, stres). Semnalele sunt sesizate în
celulele senzoriale și transmise altor celule prin semnalizare intercelulară.
Instrumente ale semnalizării intercelulare
 Mesageri extracelulari: molecule care determină în celulele țintă desfășurarea unor reacții
biochimice. Celulele care emit semnale influențează multe celule prin moleculele semnal
determinând o reacție temporară coordonată într-un organism.
 Joncțiuni gap: comunicarea dintre celule alăturate este posibilă prin contact direct care conectează
2 celule învecinate pentru un schimb direct de metaboliți și molecule semnal între celule.
 Interacția celulă-celulă via proteine de suprafață: o proteină de suprafață a unei celule leagă o
proteină specifică complementară de pe altă celulă. Astfel se activează o cascadă de semnalizare
intracelulară care inițiază reacții biochimice specifice
 Semnalizare prin impulsuri electrice: conducerea unor impulsuri electrice de către celule neuronale
se bazează pe schimbări ale potențialului de membrană. Neuronii folosesc aceste modificări pentru
a comunica cu alte celule la nivelul sinapselor. Semnalele electrice pot fi transformate în semnale
chimice.

Etapele semnalizării intercelulare

 Mesagerii extracelulari sunt produși ca răspuns la stimuli externi și sunt eliberați prin exocitoză
 Stimulii fizici de tipul semnale electrice, modificări de concentrații ale unor ioni, etc. determină
creșterea cantității de mesageri destinați comunicării extracelulare.
 Stimulii externi determină:
1. Stimularea biosintezei mesagerului extracelular
 Page 3 of 65

2. Producerea mesagerului extracelular matur

3. Eliberarea mesagerului din depozitele celulare
Ultimul mecanism este folosit în eliberarea neurotransmițătorilor ca răspuns la semnalele
electrice, de ex. la nivelul sinapselor
Transportul semnalului și receptarea acestuia de către celula țintă
Semnalul extracelular produs ajunge la celula țintă via circulația sangvină sau prin difuzie. Dacă
semnalizarea se face la distanță mesagerul extracelular se leagă în general de proteine transportor specifice
sau este încorporat în complexe proteice mai mari. Acest fapt se petrece pentru a evita degradarea în
spațiul intracelular pentru a-l furniza numai celulelor țintă și pentru a evita procesarea și metabolizarea
mesagerului dintr-o formă inactivă într-o formă activă prea timpuriu.
O dată ce semnalul extracelular este receptat de celulă, este transmis căilor de semnalizare
intracelulare care activează reacții biochimice distincte, tipice pentru un anumit tip de celulă, determinând
răspunsul în celula țintă (care prezintă receptorul specific).
Procesarea semnalelor extracelulare se poate realiza prin două moduri:
• prin receptori atașați de membrana plasmatică
• prin receptori localizați în citosol sau nucleu

Toate etapele de transmitere a semnalelor extracelulare sunt subiect al reglării. Mecanismele

pentru controlul hormonilor și al concentrațiilor receptorilor se bazează în principal pe reglarea feed-back.
Feed back-ul negativ și/sau pozitiv ajustează comunicarea intercelulară la dezvoltarea și
funcționarea întregului organism.
Mecanismul de feed back controlează în general enzimele implicate în biosinteza, stocarea sau
degradarea hormonilor și cantitatea de receptori pentru conversia semnalului extracelular în răspuns
intracelular. Cu ajutorul acestui mecanism se realizează o ajustare fină a comunicării intercelulare.
 Page 4 of 65

Hormonii în semnalizarea intercelulară (slide 14, 15, 16 – scheme)

Mesagerii intercelulari se numesc hormoni. Din punct de vedere chimic pot fi:
• proteine
• peptide
• aminoacizi și derivați ai acestora
• derivați ai acizilor grași
• nucleotide
• steroizi
• retinoizi
• molecule anorganice mici, de tipul NO

Analogii hormonilor: agoniști și antagoniști

Antagoniștii: derivați hormonali care se leagă la un receptor dar supresează traducerea semnalului.
Aceștia au numeroase aplicații farmaceutice și medicale deoarece interferă cu traducerea semnalelor în
cazul dezechilibrelor hormonale. De ex. propranololul se leagă cu o afinitate de 3 ori mai mare decât
adrenalina la receptorul β-adrenergic, blocându-l.
Agoniștii: analogi hormonali care se leagă specific la un receptor și inițiază căi de traducere a
semnalului în aceeași manieră ca și hormonii adevărați. Aplicațiile în cercetare și medicină sunt importante
pentru acei agoniști care posedă o afinitate mai mare pentru receptor comparativ cu hormonii naturali. Unii
compuși pot funcționa ca agoniști sau antagoniști în funcție de tipul de celulă. Astfel estrogenul sintetic
tamoxifen funcționează în unele țesuturi ca agonist al receptorului pentru estrogeni (ER), în timp ce în alte
celule se comportă ca antagonist al ER. (slide 19 – scheme)

Semnalizarea endocrină, paracrină și autocrină

In semnalizarea endocrină, mesagerul hormonal este sintetizat în celule specializate, endocrine și
exportate via exocitoză în sânge sau fluid limfatic și este distribuit prin sistemul circulator până la celulele
țintă, care prezintă receptori pentru hormonul respectiv.
În semnalizarea paracrină, hormonul ajunge la celulele țintă prin difuzie pasivă. Celulele
producătoare trebuie să fie situate în vecinătatea celulelor țintă. In acest caz, hormonul este tisular sau se
mai numește mediator local. Un caz special îl reprezintă neurotransmisia sinaptică în care neuronii
comunică fie cu alți neuroni fie cu o celulă musculară
În semnalizarea autocrină celulele de același tip comunică între ele. Hormonul produs de o celulă
afectează celulele de același tip prin legarea la receptori, inițiind o cascadă de semnalizare intracelulară.
Dacă un hormon autocrin este secretat simultan de multe celule, se înregistrează un răspuns puternic.
Mecanismul autocrin are o importanță mare în răspunsul imun.
 Page 5 of 65

Un caz special de semnalizare intercelulară este reprezentat de o clasă de molecule mici, reactive,
cum ar fi NO. Acesta este sintetizat intr-o celulă ca răspuns la un semnal extern și eliberat în fluidul
extracelular. Fie prin difuzie, fie sub formă legată de proteine ajunge la celulele învecinate, modificând
structura și activitatea unor enzime. NO nu are un receptor în sensul clasic, deși este un mediator.

Semnalizarea intracelulară
Semnalele externe sunt recunoscute de receptori celulari care traduc semnalele externe într-un
lanț de semnalizare intracelulară.
Căile de semnalizare intracelulară controlează în celule:
 Metabolismul intermediar
 Diviziunea celulară
 Morfologia celulară
 Programul de transcriere
Receptarea semnalelor externe
Celulele folosesc 2 modalități de a traduce semnalele extracelulare în căi de semnalizare intracelulară:
 Receptarea și traducerea semnalului au loc la nivelul unui receptor transmembranar
 Mesagerul trece prin membrana plasmatică și se leagă la un receptor localizat în citosol sau în nucleu.
Receptorul activat comunică semnalul unor componente celulare, de regulă proteine, apoi unor căi
de semnalizare în aval care devin activate și transmit ulterior semnalul.
În funcție de natura semnalului sunt activate diferite căi de semnalizare care controlează procese
biochimice specifice.
Activarea și deactivarea proteinelor de semnalizare
Traducerea semnalului intracelular se realizează prin intermediul unor componente care acționează
secvențial, fiecare component transmițând semnalul următorului. Principalii traductori de semnal sunt:
 Receptorii
 Enzimele de semnalizare
 GTP-azele de semnalizare
În absența semnalului, traductorii există în formă inactivă. După receptarea semnalului, trec într-o
formă activă și transmit semnalului următorului component al căii de semnalizare.

Starea activă se sfârșește după un anumit

timp prin procesul de deactivare, care face ca
traductorul să treacă în starea inactivă, de la care
pornește o nouă rundă de activare-deactivare.
Mecanismele majore:
• Legarea de molecule semnal
• Tranziții conformaționale
• Modificări covalente
• Asociere cu membranele (adresare)
• Compartimentalizare
• Îndepărtarea inhibitorilor
 Page 6 of 65

Prin restricționarea timpului de viață al stării activate, transmiterea semnalului poate fi controlată
și coordonată cu alte căi de semnalizare.
Mecanismele de deactivare a proteinelor implicate în semnalizare pot fi:
• Legarea unor inhibitori
• Modificări inhibitoare direcționate de semnal
• Îndepărtarea modificărilor ce duc la activarea prin sisteme enzimatice specifice.
O proteină implicată în semnalizare poate să primească simultan semnale multiple pentru a deveni
complet activată. Capacitatea de a procesa multiple semnale în același timp datorită structurii modulare a
proteinelor implicate în semnalizare, ceea ce favorizează reglarea și ajustarea fină a semnalizării.
Căile de semnalizare la vertebratele superioare prezintă variabilitate și multiplicitate. Astfel, diferite
celule găzduiesc variante ale căilor de semnalizare care controlează diferite reacții biochimice.
Variabilitate datorită în mare măsură existenței izoformelor (subtipurilor) proteinelor de
semnalizare. Acestea au activitatea principală comună dar diferă prin recunoașterea substratelor și
mecanismele de reglare.
Aceste izoforme pot fi codificate de gene specifice sau pot rezulta în urma splicingului alternativ.
Astfel, variabilitatea căilor de semnalizare crește.
Instrumentele moleculare ale semnalizării intracelulare
• Receptorii
• Enzime de semnalizare
• Mesageri secundari
• Proteine adaptor
Receptorii
Numai celulele care posedă receptori pentru
un hormon pot deveni celule țintă pentru acel hormon.
Legarea hormonului la receptorul din celulele țintă
induce o cascadă intracelulară care conduce la un
răspuns biochimic definit.
De asemenea, stimulii fizici ca lumina și
presiunea pot fi receptați de celulele ce posedă
receptori adecvați (rodopsina în procesul vederii).
Excitarea unui receptor prin stimul fizic determină o
modificare conformațională în acesta fiind folosit în
traducerea de semnal.
Receptorii legați de membrană se mai numesc
proteine TM și prezintă un domeniu extracelular legat
de un domeniu intracelular printr-un domeniu
transmembranar.
O serie de receptori TM sunt oligomeri alcătuiți
din subunități identice sau diferite. Legarea unui
hormon la domeniul extracelular al receptorului induce
o reacție specifică în domeniul citosolic, care determină
reacții ulterioare în celulele țintă.
Semnalizarea prin receptori TM nu necesită
intrarea moleculei semnal în celulă.
Receptorii intracelulari interacționează cu
hormonul care trece prin membrană prin difuzie pasivă.
 Page 7 of 65

Hormonul acționează ca ligand activator iar receptorul activat stimulează activitatea transcripțională a
genelor care prezintă elementele ADN specifice pentru receptor.
Interacția hormon-receptor
Legarea hormon-receptor se face prin interacții necovalente. Totuși această interacție este mai
puternică decât interacția enzimă-substrat.
*H+ +*R+→*HR+ cu KD= *H+∙*R+/*HR+, unde KD= de ordinul 10-6 – 10-12 M
Decisivă pentru intensitatea transmiterii semnalului este concentrația complexelor hormon-
receptor, care depinde de:
• Concentrația hormonului
• Afinitatea hormonului pentru receptor
• Concentrația receptorului
O creștere a concentrației hormonului circulant determinată de un semnal extern generează
creșterea complexului hormon-receptor și activarea căii de semnalizare.
Activitatea receptorilor este reglată pentru adaptarea semnalizării la intensitatea și durata
semnalului extracelular.
Reglarea activității receptorului se face la nivelul:
• concentrației receptorului prin:
1. expresia receptorului,
2. degradarea sa țintită,
3. Internalizare (pentru cei TM)
• Modificarea receptorului prin afectarea afinității acestuia: fosforilare și alte tipuri de modificări
covalente
Enzimele implicate în semnalizare
Enzimele pot fi reglate prin:
Tranziții alosterice
Modificări alosterice
Adresare membranară
Prin aceste mecanisme enzimele trec dintr-o stare inactivă sau slab activă într-o stare activă. Cele
mai multe enzime implicate în semnalizare sunt protein kinaze și protein fosfataze, enzimele implicate în
sinteza și degradarea mesagerilor secundari și GTP-azele reglatoare.
Modalități de participare a enzimelor la semnalizare
 Modifică alte enzime sau proteine care propagă sau sting semnalul: prin fosforilare, reacție
controlată de protein kinaze și protein fosfataze
 Pot cataliza formarea, degradarea sau eliberarea mesagerilor secundari
 GTP-azele (proteine G) permit trecerea între conformațiile active și inactive în funcție de legarea
GDP și GTP. In stare activă, transmiterea semnalului proteinele G transmit semnalul în aval în lanțul
de semnalizare. In stare inactivă, transmiterea semnalului este represată și un semnal activator în
amonte, determină o schimbare GDP cu GTP.
Proteinele adaptor
Proteinele adaptor nu prezintă activitate enzimatică, ci stabilesc legături între proteine din lanțul de
semnalizare, în vederea co-localizării acestora.
De asemenea, proteinele adaptor favorizează adresarea proteinelor de semnalizare către situsuri
subcelulare specifice și recrutează molecule de semnalizare în complexe de semnalizare. În acest caz
proteinele adaptor pot funcționa ca o structură sau un situs de acostare al moleculelor de semnalizare la
situsuri distincte. Acestea (scaffolding proteins) conțin mai multe domenii de legare cu specificități
distincte. Proteinele adaptor pot suferi modificări reglatoare (fosforilări).
 Page 8 of 65

Mesagerii secundari
Activarea intracelulară a enzimelor dintr-o cale de semnalizare determină formarea unor molecule
de semnalizare mici, difuzibile în celulă. Acești mesageri secundari activează enzime care participă la
traducerea de semnal.
 Mesagerii secundari pot fi rapid formați din precursori prin reacții enzimatice
 Pot fi eliberați rapid din depozitele intracelulare
 Pot fi rapid inactivați sau păstrați în compartimente specifice
 Pot activa diferite proteine efector
 Permit amplificarea semnalelor
Totuși, acești compuși nu difuzează în mod normal în toată citoplasma, ci creează semnale limitate
spațial și temporal (vezi semnalizarea cu Ca2+).
Există două tipuri de mesageri secundari: citosolici și legați de membrană.
Cei citosolici se leagă la proteine țintă, activând sau modulând calea de semnalizare. Cele mai
frecvente ținte ale mesagerilor secundari sunt protein kinazele.
Mesagerii asociați membranei interacționează cu proteinele țintă de pe fața internă a membranelor
celulare. In acest caz, proteinele țintă pot fi asociate membranei sau recrutate la nivelul membranei după
legarea mesagerului secundar.

Mecanisme ale semnalizării intracelulare

Cele mai multe proteine eucariote sunt modificate post-translațional. S-au identificat peste 200 de
tipuri de modificări care pot fi:
 Stabile: formare de punți disulfurice, glicozilare, ancorare de lipide, biotinilare, care sunt esențiale
pentru funcțiile proteinelor legate de compartimentalizare, transport și secreție.
 Page 9 of 65

 Tranziente: care sunt introduse în proteine în scop reglator.

Modificările reversibile pot fi considerate ca semnale care sunt traduse de enzimele modificatoare
pe proteinele de semnalizare. Asemenea semnale de modificare controlează activitatea, asamblarea
moleculară și localizarea proteinelor de semnalizare
Pe baza funcției lor, modificările reglatoare pot fi împărțite în două categorii:
• Unele pot servi la modularea și reglarea activității proteinelor de semnalizare prin mecanisme
alosterice și conformaționale. De exemplu, fosforilarea protein kinazelor crește activitatea lor prin
stabilizarea unei conformații active.
• Unele sunt utilizate pentru a crea puncte de atașament pentru legarea efectorilor în aval și amonte
în căile de semnalizare și pentru asamblarea complexelor proteice mai mari. Aceste modificări sunt
recunoscute de module de interacție ale proteinelor.
Pentru a servi în reglare, modificările trebuie introduse în urma unui semnal și să fie îndepărtate atunci
când semnalul încetează. Enzimele implicate în introducerea și îndepărtarea modificărilor sunt elemente
esențiale ale căilor de semnalizare.
Exemple de modificări proteice cu rol reglator
 Ser/Thr fosforilare
 Fosforilare la Tyr
 Acetilarea Lys
 Metilarea Lys și Arg
 Ubichitinarea Lys
 Oxidarea Cys
 Nitrozilarea Cys
Aceste modificări pot fi:
 Cu grupări de mici dimensiuni (acetil, fosfat) sau cu proteine (ubichitină)
 În general sunt realizate prin intermediul unor enzime
 Nitrozilarea sau oxidarea cisteinei nu necesită intervenție enzimatică. Reactivitatea chimică
intrinsecă a grupării modificate este determinantul major pentru formarea aductului covalent.

Recunoașterea modificărilor proteice prin module proteice specifice

O funcție majoră a modificărilor proteice este de a furniza zone de legare a proteinelor efector
situate în amonte sau în aval în calea de semnalizare sau de a ghida asamblarea complexelor proteice mari.
Partenerii proteici recunosc modificările post-translaționale prin intermediul unor module de interacție,
care detectează modificări particulare și natura chimică a acestora. Pe lângă modificarea propriu zisă,
aminoacizii C- și N- terminali sunt utilizați de domeniile de interacție pentru a selecta modificarea la care se
face legarea. Fiecare domeniu de interacție recunoaște aceleași modificări chimice, dar diferă prin
necesitățile referitoare la aminoacizii învecinați.
Astfel, există în jur de 115 domenii SH2 care recunosc resturile de fosfotirozină, codificate de gene
umane, dar fiecare diferă din punctul de vedere al secvenței aminoacizilor învecinați.
În general, proteinele implicate în semnalizare prezintă mai multe module de interacție și de aceea
pot suferi diferite tipuri de modificări post translaționale în vederea interacțiilor ulterioare. Această
multiplicitate a situsurilor de modificare este numită multisite modification și este corelată cu importanța
biologică a proteinei și cu complexitatea organismului.
Proteinele multifuncționale au diferiți parteneri de interacție și exemple de asemenea proteine
sunt: fosfatazele CDC25, receptori tirozin kinazici, PKC, histonele.
Factorii de transcripție la vertebrate suferă adeseori modificări multiple. Astfel, proteine p53, poate
fi fosforilată, acetilată, sumoilată și ubichitinată la multiple situsuri.
 Page 10 of 65

Sunt importante următoarele caracteristici ale modificărilor multiple:

 Aceeași modificare poate avea loc la situsuri diferite ale proteinelor de semnalizare (de ex
fosforilarea la Ser/Thr se face cu ajutorul unor membri distincți ai aceleași clase de enzime).
 Același aminoacid poate suferi tipuri diferite de modificări (de ex. Resturile de lizină pot fi
modificate prin acetilare, metilare, ubichitinare și sumoilare.
 Prezența modificărilor multiple de același tip sau de tipuri diferite poate fi considerată ca un cod de
bare, care specifică funcția distinctă a proteinei de semnalizare. Aceste modificări sunt reversibile și
dinamice și se schimbă în timp și în funcție de localizarea subcelulară.
 Modificările multiple de pe o proteină pot prezenta caracteristici combinatoriale.

Efectul unei modificări date este dependent de context. Astfel, prezența unei modificări poate
preveni o alta. Sau modificările multiple pot avea efect cooperativ. De asemenea, modificările multiple de
același tip pot avea efect aditiv.
În scenariile complexe, modificările la situsuri diferite pot avea efect sinergic și genera un răspuns
exponențial.
Domeniile de interacție se găsesc adeseori în duplicat în cadrul unor proteine de semnalizare.
Astfel, protein fosfataza SHP2 prezintă 2 domenii SH3.
Domeniile de interacție pot fi asamblate din copii repetitive (pana la 50) ale unui motiv peptidic de
dimensiuni mici de tipul anchirinei, cele bogate în leucină, etc.
Liganzi și tipuri de domenii de interacție
Domeniile de interacție din proteinele implicate în semnalizare pot recunoaște:
• Modificările post translaționale ale proteinelor
• Motive peptidice- domeniul SH3 leagă motivele bogate în Pro din liganzii proteici. Se pot regla
astfel multe funcții celulare
• Domenii proteice: o serie de domenii interacționează cu altele în mod homo sau heterotipic.
Asemenea domenii identifică proteinele implicate în semnalizare și participă la coasamblarea
complexelor oligomerice funcționale. Distincția dintre domeniile care recunosc motive peptidice și
domenii proteice nu este foarte clară.
• Fosfolipide: multe procese de semnalizare sunt legate intim de membrana celulară și recrutarea
proteinelor implicate în semnalizare la aceasta reprezintă un pas esențial în semnalizare.
Specificitatea domeniilor nu este bine caracterizată și pare a fi largă. Pe de altă parte unele domenii
ce leagă fosfolipide pot lega și motive peptidice.

Structura modulară a proteinelor de semnalizare

Proteinele implicate în semnalizare
sunt alcătuite din domenii distincte
=module. Proteinele de semnalizare
asamblate în complexe mari pot fi
schimbate în mod regulat. Subtipuri ale
proteinelor de semnalizare se pot asocia într-o manieră dependentă de tipul celular și semnalele receptate.
Domeniile pot acționa independent sau în cooperare și îndeplinesc funcții distincte în semnalizare.

Construcția modulară conferă proteinelor de semnalizare următoarelor caracteristici:

• Multivalența: aceste proteine pot interacționa cu diferiți parteneri, pot recepționa diferite mesaje și
pot avea diferite localizări subcelulare.
 Page 11 of 65

• Folosirea diferențiată a modulelor: modulele pot fi folosite simultan, în ordine secvențială sau doar
în locații subcelulare distincte, ceea ce asigură o mare versatilitate și flexibilitate în semnalizare. De
asemenea, modulele pot fi angajate într-o manieră dependentă de tipul de celulă și țesut.
• Inputuri multiple, influențe și outputuri reglatoare. Proteinele modulare recepționează semnale
multiple și răspund la influențe multiple. Semnalele externe pot fi integrate și convertite în
răspunsuri fenotipice în funcție de mediul celular.

Complexe de semnalizare modulare

Asocierea proteinelor de semnalizare ce pot participa prin domenii de interacție conduce la
formarea unor complexe proteice de mari dimensiuni în citoplasmă și nucleu. Organizarea complexelor este
dinamică și acestea pot fi constituite din pana la 50 proteine. Reglează proteoliza țintită, endocitoza,
traficul proteinelor și veziculelor, polaritatea celulelor, diviziunea celulelor și expresia genică. Complexele
mari permit o transmitere rapidă și eficientă a semnalelor.

Organizarea proteinelor de semnalizare în complexe prezintă avantaje:

• Specificitate –traducerea semnalelor în cadrul complexelor este rapidă deoarece nu necesită difuzia
de reactanți. Complexele asigură o cuplare puternică și specifică a reacțiilor diferite și previne
reacțiile secundare și disiparea semnalului.
• Variabilitatea - în complexele de semnalizare, componentele pot fi înlocuite cu izoforme care diferă
prin detaliile referitoare la reglare și activitate. Această schimbare de componente este utilizată
intens în complexele de reglare a genelor care se pot asocia cu coactivatori diferiți, corepresori sau
cu enzime ce remodelează cromatina în funcție de semnalele receptate de sistem.
• Reglarea. Componentele acestor complexe sunt adeseori modulare, care permite receptarea unor
semnale multiple într-o ordine secvențială sau în același timp.

Căi de semnalizare liniare, ramificate și încrucișate (slide 58 – schema)

Căile liniare de semnalizare: semnalul curge liniar prin componentele organizate ierarhic.
Căile ramificate: proteinele de semnalizare au parteneri multipli în aval.
Căi încrucișate: transmiterea semnalelor prin căi variate ce trebuie coordonate și balansate,
necesită conexiuni între căi diferite.

Interacția dintre căile de semnalizare

Mecanismele majore prin care diferitele căi de semnalizare interacționează sunt: detecția
coincidentă, gating (barieră), feed-back.
 Page 12 of 65

Detecția coincidentă
Două căi de semnalizare distincte A și B care converg către o singură unitate funcțională alcătuită
din una sau mai multe proteine, care reprezintă detectorul de coincidență. Acesta recunoaște când două căi
convergente sunt activate într-o fereastră de timp. Deoarece cele 2 semnale sunt la fel de importante,
detectorul produce un singur răspuns, diferit de cel produs de orice cale activată individual. Răspunsul
poate fi funcțional distinct sau sinergic.
Gating
În acest caz, transmiterea semnalului prin prima cale de semnalizare este reglată prin activarea
celei de-a doua căi. Deci, două semnale diferite interacționează într-o manieră ierarhică. Răspunsul este
astfel doar modificat, dar nu este distinct față de cel generat de prima cale de semnalizare. Ca și detecția
coincidentă, gating permite ca 2 semnale separate să activeze căi de semnalizare diferite.
Feed back
Acesta este un mecanism gating modificat care depinde de un singur semnal, care modulează căi
multiple sau activează o singură cale ce reglează 2 sau mai mulți efectori în aval. Într-un astfel de sistem, un
efector produce efectul biologic și celălalt reglează transmiterea semnalului la efectorul care produce acest
efect. Această configurație permite sistemului de semnalizare să se adapteze din punctul de vedere al
sensibilității la mediu.

Rețele de semnalizare
În mod real semnalizarea are loc prin rețele de semnalizare, care rezultă din interconectarea căilor
de semnalizare. În aceste rețele, aceeași proteină de semnalizare poate recepționa mai multe semnale.
Networking se poate realiza între căi de semnalizare similare (De ex. Rho și Ras) sau diferite
(Gs,α/cAMP și MAPK).
Rețele de semnalizare se bazează pe :
1. Structura modulară a proteinelor implicate în semnalizare
2. Structura modulară a complexelor de semnalizare
Identitatea moleculară a componentelor modulelor de semnalizare și partenerii acestora de
interacție sunt celulă-specifici. Sistemul central de semnalizare este conectat la mecanismele celulare:
transcrierea, traducere, motilitatea și mecanismele secretorii care sunt responsabile pentru răspunsurile
fenotipice.
Interconectările dintre rețelele de semnalizare pot fi împărțite din punct de vedere operațional în 2 clase:
Joncțiuni - semnale integratoare
 Page 13 of 65

Noduri - scindează semnalul.

Semnalizarea este redundantă și specifică

Redundanța:
Aceeași reacție este controlată de mai multe proteine de semnalizare sau căi de semnalizare.
Atunci când o componentă devine nefuncțională poate fi înlocuită de o altă proteină cu activitate similară.
Specificitate:
Se referă la selecția partenerilor de interacție. Interacțiile puternice sunt înalt specifice dar nu sunt
flexibile pentru a răspunde dinamic la modificările condițiilor externe sau ale programelor interne.
Deoarece interacțiile prot-prot depind de modificările post-translaționale, afinitățile sunt relativ modeste.
De aceea adesea se folosesc interacții multiple de mică afinitate pentru a asigura fidelitatea.

Reglarea căilor de semnalizare

Punctele majore de control:
• Receptori - Traducerea mesajului extracelular în răspuns intracelular depinde de cantitatea,
activitatea și specificitatea receptorilor. Reglarea la acest nivel se realizează prin: ubichitinare,
internalizare, fosforilare, legare de antagoniști, expresie genică.
• Enzime implicate în semnalizare-sunt reglate prin modificări covalente (fosforilare-defosforilare),
inhibitori ai kinazelor.
• Mesageri secundari - producerea și degradarea lor este sub control strâns.

Organizarea spațială a căilor de semnalizare

Strategiile celulare folosesc pentru semnalizare:
• Proteine scaffold (schelet) cu specificitate bifuncțională situate pe fața internă a membranei
• Legarea la proteine TM, de ex. resturile de fosfotirozină de pe receptorii activați sunt folosite
pentru acostarea altor proteine care sunt astfel recrutate.
• Prin introducerea unor cozi lipidice post-translațional unele proteine se pot insera în jumătatea
citosolică a membranei plasmatice în vecinătatea receptorului sau altor componente de
semnalizare.
• Legarea la mesageri secundari localizați la membrană (diacilglicerol, IP3). Unii mesageri secundari
servesc ca puncte de atașament pentru proteinele de semnalizare. Mesagerii hidrofobi sunt
recunoscuți prin domenii de interacție din proteinele de semnalizare (de ex. Domeniile PH (de
omologie cu plekstrina) pentru legarea IP3).
 Page 14 of 65

Compartimentalizarea semnalizării
Multe proteine acționează ca o suveică între compartimente distincte ale celulelor pentru a
îndeplini funcții specifice. Acestea fie poartă secvențe semnal, fie modificări post-translaționale care le
direcționează spre situsuri subcelulare distincte, generând astfel semnale locale specifice.
Proteine implicate în semnalizare cu localizări subcelulare variabile sunt: PKC, tirozin kinaza Abl si
unii receptori nucleari.
De asemenea, mișcarea între citoplasmă și nucleu a protein kinazelor și factorilor de transcriere
este un fenomen frecvent observat.
Fosforilarea dependentă de semnal a factorilor de transcriere este un instrument pentru controlul
localizării lor nucleare și in consecință funcția de activare a transcrierii.

Reglarea activității enzimatice CURS 2

Viteza reacțiilor enzimatice în organisme este ajustată în funcție de nivelul nutrienților și de

necesitățile de creștere și diviziune a fiecărei celule, ceea ce asigură supraviețuirea întregului organism. În
funcție de semnalele interne și externe, celulele își adaptează activitatea enzimatică, astfel încât enzimele
sunt ele însele părți ale căilor și rețelelor de semnalizare, primind și producând semnale reglatoare.
Cantitatea unei enzime poate fi reglată prin:
• Expresie genică
• Proteoliză țintită
• Translocare țintită
Un alt nivel al reglării operează prin alterarea activității enzimelor preexistente, prin:
• Legarea moleculelor efector, cu efect pozitiv sau negativ asupra activității enzimatice
• Modificare covalentă (fosforilare, oxidare, etc.).
În cazul creșterii și diferențierii celulare, reglarea concentrației enzimelor se realizează prin
mecanisme de adaptare pe termen lung, pentru că nu sunt necesare răspunsuri biochimice rapide la un
semnal. În schimb, reglarea prin modularea activității enzimelor pre-existente este folosită pentru
răspunsuri rapide la stimuli interni și externi, permițând adaptarea pe termen scurt.
Baza catalizei enzimatice
Enzimele sunt catalizatori și respectă toate legile catalizei:
• Nu se consumă în timpul reacției și teoretic poate provoca transformarea unui număr nelimitat de
molecule de substrat. Eventuala denaturare a enzimei este independentă de actul catalitic.
• Nu modifică natura reacției, echilibrul sau bilanțul ei termodinamic, reacția fiind posibilă și în
absența acesteia
• Accelerează viteza de reacție, determinând o scădere a energiei de activare a reactanților și
conducând la instalarea mai rapidă a stării de echilibru
 Page 15 of 65

Baza reglării alosterice

Alosteria înseamnă că enzima poate exista în conformații variate, care diferă din punctul de vedere
al activității și legării substratelor și/sau liganzilor.
Caracteristicile generale ale enzimelor reglate alosteric:
• Sunt compuse din două sau mai multe subunități, adeseori simetrice
• Subunitățile se găsesc în 2 forme T (tensed) și R(relaxed), între care există un echilibru
• Liganzii se leagă la formele R și T cu afinitate diferită
• Activatorii se leagă preferențial la forma R pe care o stabilizează. Inhibitorii se leagă preferențial la
forma T, când cele mai multe molecule se găsesc în forma T, cu afinitate mai mică pentru substrat,
enzima fiind mai puțin activă.
Bazele moleculare pentru reglarea alosterică sunt:
• Interfața dintre subunități joacă un rol central în reglarea alosterică, ce permite cuplarea
modificărilor conformaționale dintr-o subunitate cu cele din altă subunitate.
• Situsurile de legare pentru substrate se găsesc de regulă la sau lângă interfața dintre subunități. De
aceea, orientarea mutuală a subunităților poate influența accesibilitatea situsurilor de legare a
subunităților.
• Formele active și inactive diferă prin accesibilitatea substratelor la situsurile de legare și/sau prin
poziționarea resturilor de aminoacizi implicați în cataliză.
• Amploarea modificărilor conformaționale poate fi variabilă.
• Legarea unui efector induce modificări conformaționale care influențează conformația situsului
catalitic activ și/sau orientarea resturilor catalitice.
Cooperativitatea (slide 10 – scheme)
Reprezintă un proces determinat de interacții simultane a unui număr mare de participanți sau
evenimente. Poate fi pozitivă și negativă.
Cooperativitatea pozitivă mărește capacitatea sistemului de a răspunde la modificările
concentrației ligandului, astfel încât modificări relativ mici ale concentrației ligandului determină un
răspuns complet.
În cooperativitatea negativă, răspunsul sistemului este întârziat după schimbări în concentrația
ligandului iar sistemul este desensibilizat la conc mari de ligand.
Reglarea enzimelor prin efectori
Este un principiu universal pentru controlul activității metabolice și a altor funcții metabolice.
Tipuri: compuși organici cu MM mică: proteine, ioni metalici.
Legarea efectorilor se face specific, ceea ce determină inhibiția sau stimularea activității enzimatice.
În general într-o cale metabolică, un metabolit sau o moleculă similară este efector pentru enzimele din
acea cale.
Mecanismele majore de acțiune ale inhibitorilor enzimatici:
• Competiționează cu legarea substratului
• Deformează situsul activ și legarea substratelor
În cazul proteinelor cu rol inhibitor, acestea pot fi reglate prin fosforilare, degradare și sinteză de novo.
Exemple de asociere reversibilă de proteine activatoare și enzime îl reprezintă enzimele dependente de
Ca2+ /calmodulină sau ciclinele.

Ionii metalici:
• Pot participa direct la actul catalitic
• Pot avea rol structural
• De o deosebită importanță este Ca2+ care activează PKC și multe alte enzime.
 Page 16 of 65

Reglarea activității enzimatice prin fosforilare

Fosforilarea sub acțiunea catalitică a protein kinazelor este cel mai răspândit mecanism de reglare a
activităților enzimatice la EK. Proteinele sunt fosforilate în principal la Ser/Thr și Tyr. Ocazional sunt
fosforilate și resturile de Asp sau His (His în special la PK). Pentru reglarea activităților enzimatice cele mai
importante sunt Ser/Thr iar fosforilarea resturilor de Tyr, dincolo de reglarea tirozin kinazelor, are rol foarte
important în generarea situsurilor de atașament specifice pentru proteine.
Fosforilarea proteinelor este o reacție enzimatică specifică în care o proteină servește ca substrat
pentru protein kinaze=fosfotransferaze. Consecutiv acestei modificări covalente, structura și activitatea
proteinei substrat este modificată.
Grupările fosfat din proteine:
• Prezintă două sarcini negative
• Pot forma legături de hidrogen
• Principalul partener de interacție este restul de Arg
• Sunt rezistente la hidroliză
• Sunt îndepărtate sub acțiunea fosfatazelor
Consecințele structurale ale fosforilării proteinelor
• Inducerea unor tranziții conformaționale de amplitudine mare sau mică
• Funcționează direct prin efecte electrostatice
Astfel prin fosforilarea restului de Ser 14 din subunitățile glicogen fosforilazei din mușchi de iepure se
produc modificări conformaționale de circa 50 Angstromi.
În izocitrat dehidrogenaza din E. coli situsul de legare a substratului este fosforilat cu minime modificări
conformaționale.
Calea Ubichitin - proteasomului
Timpul de viață al unei proteine depinde de vitezele cu care se produc expresia genică și
degradarea proteolitică. Degradarea proteinelor poate fi: specifică și nespecifică.
În cadrul căii lizosomale sunt degradate proteinele endocitate, în mare parte în mod nespecific.
Degradarea nelizosomală este selectivă în condiții celulare normale și este responsabilă pentru degradarea
intracelulară a proteinelor în condiții de stres. Proteinele sunt degradate în proteasomul de 26S după ce au
fost conjugate cu molecule de ubichitină (Ub).
Proteoliza Ub-mediată:
 Degradarea proteinelor în situații de stres
 Degradarea proteinelor denaturate și alterate
 Degradarea țintită a proteinelor reglatoare: oncoproteine, proteine supresor tumoral, receptori
transmemebranari, cicline, proteinele de activare a transcrierii.
Componentele sistemului Ub
 Ub este o proteină cu 76 aminoacizi, înalt conservată, care se leagă la restul de Lys prin glicina
Carboxi-terminală.
 Ubichitinarea proteinelor este un proces complex care implică 3 reacții secvențiale catalizate de 3
enzime E1, E2, E3.
Ub și proteinele Ub-like
Ub este primul reprezentant al unei familii de proteine, care prezintă un model de pliere comun
numit pliere Ub. Aceste proteine își exercită funcția prin legarea la alte proteine din celulă, modificând prin
aceasta stabilitatea, localizarea sau activitatea proteinelor țintă. Membrii familiei Ub prezintă un mecanism
biochimic comun: o legătură izopeptidică este formată între glicina terminală a Ub și un aminoacid din
proteina țintă. De regulă gruparea amino este donată de un rest de Lys, dar se poate să se realizeze
ubichitinare N terminală. Ub și proteinele-like Ub sunt activate și transferate la proteina țintă prin același
mecanism, cu diferențe referitoare la proprietățile și numărul enzimelor implicate.
 Page 17 of 65

În reacția inițială, Ub este activată prin

legarea grupării carboxil a glicinei C-terminale
la gruparea SH a enzimei E1 în prezența ATP.
A doua etapă este o reacție de
transacilare, în care Ub de la E1-Ub este
transferată la o cisteină din enzima E2.
Enzimele Ub E2 dictează funcțiile biologice
specifice ale Ub datorită faptului că
specificitatea interacției E2/E3 limitează
substratele finale la care Ub este atașată.
Al treilea pas al ubichitinilării constă în
transferul UB la proteina țintă, catalizate de
Ub-protein ligaza sau enzima E3. Ub se leagă
prin glicina sa C-terminală printr-o legătură
izopeptidică cu gruparea ε-amino a unui rest
de Lys din substratul proteic. Ulterior, un rest
de Lys din Ub atașată la proteina țintă, poate fi
el însuși implicat în reacția de ubichitinare
mediată de E3, rezultând proteine
poliubichitinilate. În aceste lanțuri, moleculele
Ub sunt legate printr-o legătură izopeptidică
între K48(sau K29, K63) și G76.

Prezența lanțurilor poli Ub pe proteina țintă reprezintă o necesitate pentru degradarea în

proteasom. E3 și E2 recunosc un motiv de secvență primară în proteine care este semnal de ubichitinilare.
Ulterior proteinele țintă sunt poli Ub, semnal recunoscut de proteasom. Selecția proteinelor pentru ligarea
Ub se face în principal de către E3.
 Page 18 of 65

Recunoașterea substratului
Recunoașterea substratelor de către enzima E3 se bazează pe prezența modificărilor post-
translaționale, ceea ce determină legătura între traducerea de semnal și proteoliza țintită. Aceste modificări
sunt:
• Fosforilarea Ser/Thr (ciclu celular)
• Fosforilarea Tyr (receptori)
• Hidroxilarea Pro (HIF-1α)
• Asocierea de proteine specifice (p53/E6)
• Deacetilarea Lys (p53)
• Aminoacilarea (N-end rule)
• Oxidarea (N-end rule)
Există 2 tipuri majore de E3 la EK:
• Care prezintă domeniul HECT
• Care prezintă domeniul RING
Domeniile HECT și RING prezintă proprietatea de a lega E2. Domeniul de interacție cu E2 este legat
de un altul care este specializat în interacția cu substratele lui E3. Cele două domenii pot fi parte aceluiași
lanț polipeptidic sau pot fi subunități distincte ale unui complex multiproteic.
Enzimele cu domeniu HECT (Homologous to E6-AP-C-terminus) reprezintă o familie mare de enzime
E3 care participă direct la transferul Ub la substrat. În reacția de transfer Ub trece de la purtătorul E2 la un
rest de Cys activ din domeniul HECT al enzimei E3, situat aproape de capătul C-terminal, unde se leagă
covalent. Apoi, Ub este ligată la gruparea ε-amino a unui rest de Lys din proteina substrat. HECT este
implicat în degradarea p53 consecutiv infecției cu papiloma virus.
Domeniul RING pentru a ceda nu formează un intermediar covalent cu Ub, dar în schimb, poate
activa E2 pentru a ceda Ub la un rest de lizină din proteina substrat. Superfamilia RING a enzimelor E3
prezintă proteine care prezintă o serie de resturi de His și Cys, care permit coordinarea a 2 ioni de Zn într-o
structură numită Really Interesting New Gene (RING) finger. Există totuși și o subfamilie RING care nu poate
lega Zn.
Funcțiile celulare reglate de RING E3 sunt: Ciclul celular, Proliferarea celulară, Apoptoza, Secreția,
Traficul componentelor.
Acest motiv RING finger este prezent într-un număr mare de proteine reglatoare care sunt asociate
cu proteoliza mediată de proteasom (de ex: produsul genei BRCA1 și proteina MDM2).
Regula N-terminală- această regulă face o corelație între timpul de înjumătățire al unei proteine in
vivo și identitatea restului N-terminal.
Există aminoacizi care destabilizează proteinele: Arg, Glu, Asp, Cys. De asemenea s-a observat că
arginilarea Cys N-terminale necesită oxidarea Cys în prezență de NO, care este un mesager secundar. Se
poate realiza astfel o legătură între regula N-terminală ca senzor de NO care funcționează prin degradarea
proteinelor ca răspuns la semnale NO.
Ligazele E3 implicate în degradarea N-end sunt UBR1 și UBR2 din drojdii și mamifere. Căile
degradative guvernate de N-end rule sunt implicate în translocarea nucleară, reglarea apoptozei, fidelitatea
degradării cromozomilor.
Proteina Cbl
Proteinele Cbl sunt E3-Ub- ligaze implicate în inhibarea tirozin kinazelor, inclusiv a receptorilor
tirozin kinazici (RTK) și non-RTK. Acestea interacționează cu resturile de fosfoTyr de pe TK activate
printr-un domeniu specific SH2 și conțin un domeniu RING finger care mediază legarea E2. În cadrul
complexului format, are loc transferul Ub la kinază, care astfel poate fi endocitată sau degradată.
 Page 19 of 65

Se pare că Cbl este inactivă până nu întâlnește kinaza activată pe care o va degrada. În urma acestei
interacții, se produce activarea Cbl, conducând la ubichitinare și degradare. Însăși Cbl este reglată negativ
prin ubichitinare. Se cunosc de asemenea forme oncogenice ale Cbl.
E3 bazate pe culin, SCF și APC
Superfamilia culin-RING ligazelor este populată de enzime cu mai multe subunități, care au un miez
enzimatic înalt conservat, o regiune C-terminală numită culină și o proteină înrudită cu proteinele RING.
Legarea proteinei RING la domeniul C-terminal al culinei determină recrutarea E2, în timp ce domeniul
N-terminal recrutează receptorii care interacționează cu substrate specifice. 6 tipuri diferite de culin-RING
ligaze au fost identificate, fiecare folosind o familie distinctă de receptori substrate. Genomul uman codifică
pentru 300-350 culin RING ligaze și aproximativ 400 Ub ligaze cu alte domenii RING.
Complexul SCF conține Skp 1, culin, proteina F-Box și proteina Rbx1/Roc1/Hrt1 RING. Subunitatea
RING folosește motivul de legare a Zn pentru a recruta și direcționa E2 spre substrate specifice care sunt
recunoscute de receptori numiți proteine F-box, care recrutează substrate pentru ubichitinare prin E2.
Motive F-box se găsesc și în proteine care nu sunt implicate în sistemul de ubichitinare. Proteinele F-box
sunt implicate în recunoașterea substratului și pot necesita fosforilarea substratelor. Complexele SCF
implicate în reglarea ciclului celular determină o ubichitinilare dependentă de fosforilare.
 Page 20 of 65

APC este un complex cu MM mare alcătuit din cel puțin 12 subunități care degradează proteinele
care conțin o secvență specifică de recunoaștere numită destruction box. Activitatea enzimatică E3 este
localizată în proteina RING a APC si anume Apc11 și în subunitatea culin-like Apc2. Reglarea activității se
face prin fosforilare. Substratele sunt importante în reglarea ciclului celular: cicline, inhibitori de kinaze,
proteine asociate cu fusul de diviziune.
Procesarea factorului nuclear (NF)-kB și degradarea IkB
NF-kB determină expresia genelor ce codifică pentru lanțurile ușoare ale imunoglobulinelor, pentru
IL-2 și IL-6 și pentru interferonul β.
Forma activă a NF-kB este un heterodimer ce constă din subunitățile p50 și p65. În citosol, NF-kB se
găsește în stare inactivă pentru că este complexat de inhibitorul IkB, care maschează semnalul de
translocare nucleară a heterodimerului, prevenind astfel transportul său în nucleu.
În urma acțiunii unor citokine (IL-1, TNF-α) care se leagă la receptorul lor TM, sunt activate o serie
de protein kinaze specifice, dintre care una fosforilează IkB. Această fosforilare este un semnal pentru
ubichitinare și degradare a IkB. Astfel NF-kB este eliberat în stare activă și poate suferi translocarea în
nucleu și să activeze gene țintă.
Calea Ub-proteosomală participă la reglarea NF-kB în două puncte:
1. Subunitatea p50 rezultă din degradarea proteolitică a precursorului de 105 kD în citosol, care se
realizează prin poliubichitinare mediată de proteasomul de 26S.
2. Degradarea IkB
În concluzie, ubichitinarea are nu numai rol degradativ total ci poate media și o proteoliză parțială a
unor proteine cu rol reglator.
Degradarea în proteasom
Degradarea conjugatelor proteină-Ub este endergonică (dependentă de ATP) și are loc în
proteasomul de 26S. La acest nivel este degradată proteina la peptide iar ubichitina este eliberată pentru
conjugări ulterioare. Pentru ca degradarea să aibă loc trebuie să fie prezentă poliUb legate de K48 prin
legătură izopeptidică pe proteina substrat. Legarea poliUb la nivelul altor resturi de Lys (K63) direcționează
proteinele spre reparare ADN, răspuns la stres și endocitoză.
Proteasomul de 26S are 2 componente de 20S (particula miez) în care are loc degradarea și
particula de 19S (reglatoare). O altă particulă reglatoare 11SReg γ se poate asocia cu cea de 20S cu
formarea unei particule cu funcții distincte față de proteasomul de 26S.
Particula de 20S
Alcătuită din 14α și 14β aranjate într-o particulă cilindrică alcătuită din 4 inele heptamerice cu un
canal central de 17 Ǻngstromi. Cele 2 inele β interioare prezintă activitate proteolitică în timp ce 2
subunități α exterioare permit intrarea controlată a substratelor.
Prezența centrului proteazic asigură faptul că proteoliza este compartimentalizată. Proteasomul de
20S este latent deoarece cozile N-terminale ale subunităților α obturează canalul proteolitic central.
Accesul proteinelor substrat la centrul proteolitic necesită deschiderea inelului de subunități α cu ajutorul
particulei de 19S. Proteinele sunt accesibile la centrul catalitic activ numai în stare nepliată. În centrul
catalitic activ proteazic se găsește un rest de Thr N-terminal. De aceea 20S face parte din categoria
hidrolazelor nucleofilice N-terminale. La proteasomul de 20S de la vertebrate, au fost identificate 3 centre
catalitice distincte, localizate pe subunități β specifice cu activitate like-chimotripsinică, like-tripsinică și
peptidil-glutamil-peptid-hidrolazică.
Particula reglatoare de 19S
Recunoașterea proteinelor ubichitinilate și orientarea lor în cavitatea proteolitică se realizează prin
intermediul particulei de 19S.
La drojdii această subunitate este alcătuită din 17 subunități diferite. O serie de proteine adaptor se
asociază cu particula de 19S.
 Page 21 of 65

Pentru ca proteina țintă să intre în camera proteolitică:

• Trebuie recunoscut substratul ubichitinilat
• Trebuie îndepărtat lanțul Ub enzimatic
• Trebuie depliată proteina cu consum de ATP
• Trebuie translocată în particula de 20S.
Alte funcții reglatoare ale conjugării cu ubichitină:
Când ubichitinilarea are loc la alte situsuri decât K48 sunt reglate: endocitoza, reciclarea proteinelor
de suprafață, traficul proteinelor, importul proteinelor, replicare și repararea ADN, procesarea și
prezentarea antigenelor, asamblarea ribozomilor.
Ubichitinilarea este o modificare post-translațională care este recunoscută de diferite module de
interacție din proteinele reglatoare ca: fosforilarea sau metilarea.
Ubichitinilarea la situsuri de Lys alternative este considerată ca un cod de modificare a proteinelor
care este folosit pentru a orienta diferiți produși ubichitinilați spre destinații diferite. Codul de ubichitinilare
este citit de diferitele familii de domenii de legare a Ub (UBD) din proteine care funcționează ca receptori
pentru Ub. Cele mai multe UBD ale receptorilor pentru Ub recunosc un buzunar hidrofob în jurul unui rest
de Ile 44.
Numeroase proteine conțin UBD:
• Particula reglatoare 19S a proteasomului
• Enzimele de deubichitinilare
• E3 ligaze
• ADN polimeraze
• Factori de transcriere
Ubichitinilarea proteinelor accesorii ale mașinăriei de replicare a ADN este o importantă modalitate
de reglare specifică a replicării ADN.
Proteinele implicate sunt PCNA (antigenul nuclear al celulelor proliferative) și ADN polimerazelor
trans-lezionale ι și η capabile să sintetizeze ADN pe matrițe ADN modificate. Ca răspuns la apariția leziunilor
în ADN, PCNA devine ubichitinilat și interacționează cu ADN polimerazele trans-lesionale. Ambele ADN
polimeraze prezintă domenii de legare Ub necesare pentru recrutarea polimerazelor la situsurile ADN
vătămate de UV și se crede că interacția PCNA ubichitinilată cu UBDs ale ADN polimerazelor translezionale
determină recrutarea acestora la situsul afectat din ADN.
Conjugarea și îndepărtarea Ub din ADN polimerazele translezionale poate constitui un mecanism
pentru pătrunderea și ieșirea enzimelor din furcile de replicare în timpul și după degradarea ADN.
Reglarea proteinelor prin sumoilare
Proteinele SUMO (small-Ub-related-modifier) sunt atașate reversibil la multe proteine reglatoare
inclusiv factori de transcriere specifici pentru unii promotori, cofactori transcripționali și reglatori ai
structurii cromatinei.
SUMO-1 este o proteină de 98 aminoacizi care este legată covalent printr-o legătură izopeptidică la
un rest de Lys din proteină sub acțiunea catalitică a enzimelor E1 și E2 like.
Spre deosebire de ubichitinilare, sumoilarea este mult mai specifică pentru secvența și necesită un
anumit aminoacid în vecinătatea Lys ce urmează a fi modificat.
Sumoilarea are funcții diverse:
• Multe proteine implicate în reglarea transcrierii sunt modificate reversibil prin sumoilare. În
general, această modificare inhibă transcrierea, probabil prin promovarea recrutării corepresorilor
transcripționali ca deacetilarea histonelor.
• Sumoilarea reglează traficul proteinelor. Astfel, modificarea SUMO a Ran-GAP1 determină
orientarea spre porul nuclear.
 Page 22 of 65

Legarea lipidelor la proteinele de semnalizare

O serie de proteine de semnalizare funcționează atunci când sunt asociate cu membrana celulară.
Pentru aceasta, multe suferă o legare post translațională a unor cozi hidrofobe (de acizi grași sau
izoprenoide) sau glicolipidice la resturi de aminoacizi specifici din proteine, care se inseră în bistratul lipidic
al membranei.
Ancorele lipidice determină localizarea proteinelor implicate în semnalizarea la membrană (ex:
protein tirozin kinaze citoplasmatice) pentru a participa la căile de semnalizare asociate cu membrana
plasmatică. Aceste ancore acționează dinamic.
Funcții ale lipidării proteinelor: (slide 48, 49 – scheme)
• Contribuie la asocierea proteinelor la subdomeniile membranare (de ex. lipid rafts) favorizând
formarea unor complexe de semnalizare mari
• Implicarea în transportul vezicular (de ex. în neuroni)
• Reglarea activității unor enzime
Miristoilare
Unele proteine conțin resturi de acid miristic (14 C, saturat) legate de Gly N-terminală, legate:
• Co-translațional, imediat după scindarea restului de Met N-terminal prin acțiunea aminopeptidazei.
• Post translațional, atunci când un rest interior de Gly este expus la scindare proteolitică.
Secvența consens pentru N-miristoilare este Gly-X-X-X-Ser/Thr (unde X este orice aminoacid, dar
frecvent, primul după Gly este Cys. De asemenea, prezența unei secvențe mici cu aminoacizi bazici la
capătul N-terminal poate servi ca semnal adițional pentru miristoilare. Această modificare permanentă
promovează legarea proteinelor reversibil și slab la membrana plasmatică și interacțiile proteină-proteină.
Această modificare apare la proteinele din familia Src a protein tirozin kinazelor citoplasmatice și la
subunitatea α a proteinelor G heterotrimerice. Miristoilarea Bid și a protein kinazelor activate de caspaze
este implicată în apoptoză.
Palmitoilarea
Se realizează la nivelul unui rest de Cys printr-o legătură S-acil mai labilă decât cea amidică (a
ancorelor miristil) care asigură reglarea asocierii la membrană. S-au detectat și acizi oleic și stearic, de
asemenea. Enzimele implicate în acilare/deacilare sunt protein acil transferaze respectiv acil protein
tioesteraze. Deși nu se realizează la nivelul unor secvențe consens, palmitoilarea s-a identificat în anumite
domenii proteice bine caracterizate ca cele PH(omoloage cu pleckstrina), ale fosfolipazelor D1 și D2. Totuși
s-au identificat în proteine și ancorări de acid palmitic sau stearic la gruparea hidroxil ale Ser/Thr. La unele
proteine EK, palmitatul sau miristitatul sunt legate la gruparea ε-amino a lizinei, de asemenea.
Scindarea legăturii tioesterice poate fi constitutivă sau ca răspuns la semnale.
Funcții:
• Mediază atașamentul la membrană
• Facilitează traficul unor proteine lipidate care în cadrul unor căi secretorii sunt orientate spre
membrana plasmatică, unde suferă o distribuție laterală orientându-se spre rafturile lipidice.
Proteine palmitoilate:
• GTPazele Ras și Rho
• Non-RTKs ca p56LCK
• Proteinele adaptor PSD-95
• Subunitățile α ale proteinelor G heterotrimerice
• Fosfolipazele D1 și D2
Farnezilarea și geranilarea
Proteinele cu modificări izoprenoidice posedă fie un rest farnezil (C15) fie unul geranil-geranil (C20)
legat printr-o legătură tioesterică la un rest de Cys formată într-o reacție catalizată de farnezil sau geranil
transferaze.
 Page 23 of 65

Izoprenilarea are loc la resturile de Cys din secvența consens CAAX-COOH. Natura aminoacidului
C-terminal determină dacă are loc farnezilarea sau geranilarea. După prenilare, aminoacizii C terminali sunt
îndepărtați de endoproteaza dependentă de prenilare Rce-1 iar gruparea C terminală a Cys este metilată,
mărind hidrofobia capului C-terminal.
Prenilarea a fost detectată la: Proteinele Ras și Rab; Subunitatea α a proteinei G.
Funcții:
• Promovarea asocierii cu membranele
• Mediază interacția proteină-proteină
• Mediază traficul proteinelor
Lipidarea duală
Poate fi:
• Miristoilare + palmitoilare
• Prenilare + palmitoilare
• Palmitoilare dublă
Astfel, localizarea membranară a proteinelor asociate cu lipidele este puternică și nu tranzitorie. Exemple:
H-Ras (farnezilare și palmitoilare)
Ancore membranare de colesterol
Proteinele Hedgehog (Hg) care se găsesc la suprafața
celulelor și pot fi secretate pentru semnalizare la distanță leagă
colesterol în timpul maturării. Are loc o scindare autocatalitică care
generează o polipeptidă N-terminală care apoi leagă colesterolul la
Gly C-terminală. Apoi la capătul N-terminal are loc palmitoilarea
produsului de scindare. Astfel, Hg capătă o asociere foarte stabilă cu
membrana plasmatică.

Funcția de comutator a membranelor lipidice

Ancorele lipidice pot participa în mod dinamic la ancorarea la
membrana plasmatică și de aceea pot participa activ la semnalizarea
celulară în 2 moduri:

1. Comutarea miristoil-ligand. Orientarea

restului miristoil la nivelul proteinelor de care
este legat, poate fi controlată prin legarea
ligandului. În funcție de prezența ligandului,
proteina se poate găsi într-o conformație în
care ancora lipidică este îngropată în interiorul
hidrofob al proteinei sau în alta în care ancora
este expusă la suprafața proteinei și este
accesibilă pentru inserția la membrană. În
prezența unor liganzi (Ca2+, GDP/GTP) au loc
modificări conformaționale care permit
proteinei de semnalizare atașare la membrană.
 Page 24 of 65

2. Comutarea miristoil-interacții electrostatice. Proteinele MARCKS (substrate pentru protein kinaza C

bogate în Ala și miristoilate) se leagă la membrană prin intermediul miristatului și un motiv bazic. Prin
fosforilarea catalizată de PKC în motivul bazic se introduc sarcini negative într-o regiune încărcată pozitiv,
ceea ce reduce nivelul interacției cu fosfolipidele acide și determină desprinderea proteinelor MARCKS de
membrană și trecerea lor în citosol.
Ancorarea glicozilfosfatidil inozitolului
Ancora GPI permite legarea
proteinelor la partea externă a membranei
celulare. Ancora constă din etanolfosfatul,
trimanozidul, glucozamina și inozitol
fosfolipidele și este atașată la capătul
C-terminal al proteinei.
Proteinele ancorate prin GPI
sunt implicate în:
• preluarea nutrienților
• adeziunea celulară
• interacția celulă-celulă în sistemul
imun
• activarea limfocitelor T
Aceste proteine pot fi:
• Receptori
• Esteraze sau proteaze
• Antigeni de suprafață
Proteinele ancorate prin GPI pot fi eliberate
prin scindarea enzimatică în ser, sau sub formă
de exozomi (vezicule lipidice).

Semnalizarea prin receptori nucleari CURS 3

Receptorii nucleari reglează expresia genică drept răspuns la legarea moleculelor mici lipofile și de
aceea sunt implicați în controlul a diferite procese celulare. Aceste proteine sunt factori de transcriere
activați de ligand care sunt localizați în citoplasmă și/sau nucleu. Liganzii trec prin membrana plasmatică
prin difuzie simplă și se leagă la receptorul din citoplasmă și/sau nucleu. Prin legarea la elementele ADN din
regiunea control a genelor țintă a complexului ligand-receptor influențează transcrierea acestor gene și
transmit semnale hormonale pentru a modifica expresia genei. Această semnalizare este folosită pentru a
adapta activitatea enzimelor cheie în căile metabolice la condițiile externe modificate sau la modificări în
cursul dezvoltării unui organism.
Liganzii receptorilor nucleari: (slide 4 – scheme)
• Hormoni sexuali
• Hormoni tiroidieni
• Derivați de la vitamina D și vitamina A
• Metaboliți lipofili formați intracelular :
• Prostaglandine, Leucotriene, Acizi grași, Acizi grași oxidați, Derivați de la colesterol, Acizi
biliari, Fosfolipide, Benzoați
 Page 25 of 65

Relativ recent, s-a constatat că hormonii steroizi pot genera răspunsuri rapide în celula țintă care
sunt independente de activarea directă a transcrierii și anume:
• Hormonii estrogeni sau progesteronul se pot lega și activa receptori diferiți de cei nucleari, care
aparțin receptorilor cuplați cu proteinele G
• Hormonii se pot lega la receptorii nucleari și membranari și pot transmite mesaje la alte căi de
semnalizare, generând o varietate de răspunsuri
• Receptorii nucleari pot fi activați prin mecanisme independente de legare a hormonilor

Principiile semnalizării prin receptori nucleari (slide 8 – secvente de legare)

În calea genomică clasică, receptorii nucleari

transmit semnale direct la nivel transcripțional. Legarea
hormonului activează funcția de reglare a transcrierii de
către receptorul nuclear.
În cazul localizării citosolice, legarea hormonilor
la receptor induce translocarea în nucleu unde se leagă
la HRE (hormone responsive element)= o zonă DNA și
afectează transcrierea genei țintă. HRE se găsește în
regiunile control ale genelor și prezența lor determină
faptul că o genă este subiect al controlului prin receptori
nucleari.
Receptorii care sunt localizați în nucleu sunt
asociați permanent cu HRE din zona de control a genelor.
În acest caz, hormonul intră în nucleu se leagă de
receptorul asociat ADN și activează transcrierea.
În absența hormonilor, receptorul represează
transcrierea, iar legarea hormonului la receptor
anihilează represia.
Arareori se poate ca legarea hormonilor să inducă represia transcrierii. Reglatorii transcripționali
cooperează cu alte proteine care pot fi coactivatori, corepresori și mediatori care modifică cromatina și
permit contactul cu aparatul de transcriere. Coactivatorii și corepresorii receptorilor nucleari sunt esențiali
pentru semnalizare. Modificarea covalentă a histonelor și a proteinelor asociate cromatinei ca și
reorganizarea cromatinei sunt de aceea etape esențiale în semnalizarea receptorilor nucleari.
În nou descoperita modalitate de semnalizare nongenomică, receptorii nucleari acționează în afara
nucleului. Astfel, ER (receptorul pentru estrogeni) acționează în unele celule în strânsă colaborare cu
receptorii din membrana plasmatică și mitocondrie. Aceștia conduc semnalele spre componentele proteice
ale altor căi de semnalizare realizând conexiuni între diferite căi de semnalizare. Astfel, semnalizarea prin
hormoni steroizi este conectată cu calea MAPK/ERK, PI3K și Src kinazei.
Structura receptorilor nucleari
 Page 26 of 65

Prezintă o structură modulară, cu 5 domenii, fiecare cu funcție specifică:

A/B regiunea N-terminală variabilă
C-regiunea de legare la ADN
D-regiunea linker care conține semnale de localizare nucleară
E-domeniul de legare a ligandului și de dimerizare
F-domeniul C-terminal variabil, care nu este prezent în toți receptorii
Subdomeniile responsabile pentru transactivare se găsesc în domeniile A/B, E și F (AF= activation
function). Per total, receptorii nucleari pot fi considerați o entitate dinamică cu diferite conformații la
nivelul domeniilor, fiecare din acestea cu proprietăți reglatoare diferite.
Elementele ADN de legare a receptorilor nucleari: HREs
Receptorii pentru hormonii steroizi sunt proteine care leagă secvențe
specifice de ADN=HRE. Acestea sunt alcătuite din 2 copii ale unei secvențe hexamere.
Identitatea unui HRE este determinată de :
• Secvență
• Polaritate
• Distanța hexamerilor
Se consideră că mutația și duplicația unei secvențe de recunoaștere ancestrale a
permis crearea multor elemente ADN în cursul evoluției, a căror secvență, polaritate
și distanță reprezintă caracteristici pentru un receptor dat.
Jumătate din secvența unui HRE poate fi aranjat ca un palindrom, palindrom
inversat sau repetiții directe. Pentru un anumit receptor, există o spațializare optimă
și un număr de perechi de baze între cele 2 secvențe hexamere.
Receptorii se leagă la HRE în principal ca dimeri permițând formarea unor
homodimeri sau heterodimeri între diferiți monomeri ai receptorilor.
Pe baza structurii subunitare a receptorilor ce leagă ADN și a structurii HRE,
au fost descrise 4 clase de receptori nucleari.
Tipuri de receptori:
 Page 27 of 65

1. Receptorul pentru glucocorticoizi se leagă ca un homodimer la o secvență simetrică de pe ADN. În

complex cu ADN, fiecare subunitate a dimerului contactează câte o jumătate a HRE, cu o mare
afinitate.
2. Elementele de legare a ADN pentru receptorii nucleari pentru acizii all-trans retinoic și 9-cis
retinoic, hormonii T3, vitaminei D3 formând heterodimeri cu o structură palindromică a secvenței
de recunoaștere. De obicei, unul din parteneri este RXR (pentru 9 cis retinoic, terpenoide) care
interacționează cu capătul 5’ terminal al HRE.
3. Pentru receptorii care se leagă de HRE cu repetiții directe este necesară o aranjare polară a
dimerilor receptorului. RXR se poate lega și ca homodimer pe HRE.
4. Receptorii orfani se leagă de monomeri la secvențe de recunoaștere asimetrice. Funcția acestor
receptori este slab cunoscută.

Domeniul de legare a ADN al receptorilor nucleari este cel mai conservat și localizat în domeniul C
și conține elemente structurale care mediază recunoașterea specifică a HRE și contribuie la dimerizarea
receptorului pe HRE. Miezul acestui domeniu conține 70-80 resturi de aminoacizi care interacționează cu
hexamerii HRE și care conține 2 motive Zn2Cys4 care permit poziționarea helixului de recunoaștere la nivelul
fosei majore a ADN, unde interacționează cu cei 2 hexameri ai HRE.
Domeniul de legare a ligandului (E) are 3 funcții importante:
• Homo și heterodimerizarea
• Legarea liganzilor-atât agoniști cât și antagoniști
• Transactivarea și transrepresia.
La nivelul domeniului de legare a ligandului, alcătuit din 12 structuri α helix (H1...H12), există un
element de dimerizare. În jumătatea inferioară a structurii se găsește un buzunar de legare a ligandului,
care are caracter hidrofob și o mărime variabilă în funcție de structura hormonului.
Domeniul de transactivare AF-2 interacționează cu co-reglatorii care conțin motivul peptidic LXXLL.
Legarea ligandului determină o reorientare a helixului H12, care iese din structura compactă a
domeniului E.
H12 reprezintă miezul AF-2 și în consecință joacă un rol cheie în transactivare și transrepresie.

Mecanismele reglării transcripționale prin receptori nucleari

Cea mai mare parte a funcțiilor receptorilor nucleari pot fi descrise în termeni de activare și
represie a transcripției. Acțiunile receptorilor nucleari depind de o serie de variabile:
• Secvența exactă a HRE
• Vecinătățile secvenței HRE
• Cooperarea cu alți activatori ai transcripției
• Disponibilitatea altor receptori nucleari de a forma heterodimeri
• Modificările post translaționale ale receptorilor
• Distribuția dinamică a receptorilor între nucleu și citoplasmă

Pentru a-și îndeplini sarcinile în timpul activării transcrierii, receptorii nucleari:

• Selectează genele țintă prin legare specifică la HRE
• Remodelează cromatina pentru a îndepărta structurile represive și pentru a o face competentă
pentru începerea transcrierii
• Participă la începerea transcrierii prin modificarea continuă a cromatinei și stabilizarea complexului
de transcriere
 Page 28 of 65

Pentru a se parcurge acești pași, este necesar să stabilească contacte cu complexe proteice care
remodelează și modifică cromatina dar și complexele de transcripție:
 Factorii asociați cu proteinele de legare a TATA box (TAFs)
 Proteinele de legare la TATA box (TBP)
 Holoenzima RNA polimeraza II
Receptorii nucleari interacționează cu o serie de proteine care sunt implicate în modificarea
cromatinei în mod dinamic și combinatorial. Astfel pentru receptorul pentru estrogeni (ER) s-a raportat
participarea a 46 de proteine diferite.
În funcție de tipul de receptor, structura HRE și multitudinea de co-reglatori au fost identificate 5
stări funcționale ale receptorilor nucleari legați la ADN.

Coactivatorii receptorului pentru steroizi (SRC)-1/p160 și al receptorului pentru hormoni tiroidieni (TRAP)
Au fost identificate o serie de proteine sau complexe proteice cu funcție de co-activatori care
interacționează specific cu receptorul legat la ligand, activat, sau cu AF-1 sau AF-2. Cei ce interacționează cu
AF-1 sunt mai puțin caracterizați, dar 2 din cei ce interacționează cu domeniul AF-2 au fost bine
caracterizați. Aceștia sunt:
• din familia p160 de co-activatori cu SRC-1 ca membru bine caracterizat
• complexul TRAP
Membrii familiei de co-activatori p160 îndeplinesc 2 funcții:
• interacția cu receptorul într-o manieră dependentă de ligand
• recrutarea enzimelor ce modifică cromatina ca histon acetilazele (CPB/p300) lizin
metiltransferazele și arginin metil transferazele (CARM1/PRMF1).

Membrii familiei coactivatorilor p160 prezintă un motiv de interacție cu receptorul, LXXLL, care
mediază interacția cu domeniul AF2 al receptorilor nucleari. Zona de catenă polipeptidică din AF-2 care
interacționează cu motivul LXXLL este expusă la suprafață numai după activarea receptorului prin legarea
ligandului sau agonistului. Același motiv LXXLL este prezent și la alți co-activatori, de exemplu TRAP 220,
care este un component al complexului TRAP/mediator. Coactivatorii p160 conțin de asemenea domenii
care interacționează cu histon acetilazele, lizin metilazele și arginin metilazele.
Complexul TRAP/mediator formează o punte între receptorul legat la ADN și aparatul de transcriere
prin intermediul AF-2 într-o manieră dependentă de ligand via motivul LXXLL din TRAP 220.
În cazul coreglatorilor asociați cu ER, în funcție de tipul de celulă și ligand, aceștia pot fi diferiți.
Astfel, agoniștii sintetici pot induce conformații distincte ale domeniului de legare a ligandului (LBD) care
permite legarea unor seturi distincte de co-activatori. Astfel, se poate realiza o modulare specifică a
receptorilor nucleari. Pentru ER, aceștia au fost numiți modulatori selectivi ai ER (SERMS). SERMS ca
tamoxifen și roloxifen se comportă ca antagoniști ai ER la nivelul sânului și ca agoniști în oase.

Elementele de transactivare ale receptorilor nucleari

AF-1: localizat în regiunea A/B. Mediază transactivarea independentă de ligand. Conține situsuri de
fosforilare și situsuri de interacție pentru co-activatori. Interacționează cu AF-2. Rolul său în activarea
transcrierii nu este bine înțeles.
AF-2: localizat în regiunea E. Bine conservate în membrii superfamiliei. Funcționează într-o manieră
dependentă de receptor. După legarea ligandului, suprafață hidrofilă a helixului H12 este orientată în
exterior, furnizând o interfață de legare a regiunilor complementare ale coactivatorilor sau corepresorilor.
Corepresorii receptorilor nucleari
Au un rol important în diminuarea expresiei genice dependente de receptor.
 Page 29 of 65

Receptorii liberi pentru T3 și acidul all-trans retinoic represează transcrierea bazală în absența
ligandului cu ajutorul a 2 mari proteine nucleare: co-represorul (NcoR) și mediatorul de silențiere pentru
receptorii pentru hormon tiroidian și acid all trans retinoic. După legarea ligandului, acești corepresori
disociază de receptor și permit T3R și RAR să se asocieze cu co-activatori și să stimuleze expresia genică.
Corepresorii interacționează cu HDAC=histon deacetilaze de tipul complexului mSin3 sau NuRD, care permit
menținerea cromatinei în stare represată.
Receptarea semnalizării prin receptori nucleari
În calea genomică clasică, receptorii nucleari primesc semnalele și le transmit la nivel
transcripțional.

Reglarea la nivelul concentrației ligandului

Se poate realiza prin:
 Secreție, transport și stocare
 Modificare din punct de vedere chimic
 Reglare prin feed-back a concentrației hormonului circulant la nivelul sistemului hipotalamo-
hipofizar, utilă pentru a preveni supraproducția hormonilor steroizi sau a hormonului T3.
Reglarea prin fosforilare
Receptorii nucleari conțin mai multe situsuri de fosforilare care sunt folosite pentru a modula
funcțiile genomice și nongenomice și pentru a lega semnalizarea prin receptori nucleari cu alte căi de
semnalizare.
Fosforilarea afectează semnalizarea prin receptori nucleari modulând:
• Legarea la ADN și transactivarea
• Specificitatea pentru ligand
• Distribuția celulară nucleu/citoplasmă
• Localizare membranară
La nivelul AF1 există situsuri de fosforilare la Ser/Thr/Tyr.
ERα și ERβ sunt fosforilate la multe situsuri la nivelul AF-1, ceea ce permite activarea genelor țintă
ale ER în absența estrogenilor. Fosforilarea are loc sub acțiunea cascadei MAPK care transmite semnale de
la căile stimulate de factori de creștere și proteinele Ras (legătura între receptorii nucleari și factorii de
creștere). Alte protein kinaze: ciclin A-CDK, Akt kinaza, PI3K, cJun N terminal kinaza fosforilează alte situsuri
de Ser/Thr ale ER. De asemenea Src kinaza este implicată în fosforilarea situsurilor de Tyr din ER.
 Page 30 of 65

Reglarea prin coactivatori și corepresori

Se realizează prin activitatea și disponibilitatea coactivatorilor și corepresorilor. Aceștia sunt ținta
modificărilor reglatorii de tip fosforilare, acetilare și metilare.
Interacția cu alți activatori transcripționali
Poate avea loc în 2 moduri:
• ER, T3R, RAR și receptorul pentru glucocorticoizi (GR) acționează ca transrepresori ai factorului de
transcriere AP-1, care este un heterodimer compus din proteinele c-Jun și c-Fos. Pe de altă parte
AP-1 poate inhiba transactivarea prin acești receptori. De asemenea un efect antagonist mutual al
receptorilor pentru glucocorticoizi asupra funcției NF-kB.
• ERs și receptorii pentru progesteron (PRs) pot stimula expresia genelor fără legarea la ADN prin
asociere cu alți factori de transcriere legați de promotorii genelor responsive. Interacțiile proteină-
proteină între ERs și factorii de transcriere Sp1, AP-1 ca și activatorii de transcriere (proteinele
STAT) au determinat transcrierea unor gene care nu conțin elemente DNA responsive la ER.
Înțelegerea acestor interfețe este limitată.
Reglarea prin ubichitinilare
Mai multe modalități:
a. Proteoliza dependentă de ubichitinilare a receptorilor nucleari pentru a diminua receptorii în
condiții de tratament hormonal pe termen lung. Ubichitinilarea dependentă de ligand și degradarea
proteosomală ulterioară a fost descrisă pentru ERα, PR, receptorul pentru vit D 3(VDR), T3R, RARα și
reprezintă un mecanism de control al magnitudinii și duratei reglării transcrierii mediate de ligand
Ubichitinarea receptorilor nucleari este necesară pentru activarea transcrierii. Are loc îndepărtarea
și reasamblarea complexelor receptorilor la nivelul promotorilor în cursul ciclurilor de transcriere.
b. Corepresorii și coactivatorii receptorilor nucleari sunt subiect al ubichitinilării
c. Alte modificări reglatoare sunt sumoilarea și prin NO (oxid nitric, monoxid de azot).

Căile de semnalizare ale receptorilor hormonilor steroizi

Există 2 tipuri de receptori pentru hormonii steroizi:
1. localizați în nucleu și citoplasmă și translocarea receptorilor din citoplasmă în nucleu în prezența
ligandului (majoritatea hormonilor steroizi).
2. Localizați în nucleu iar legarea ligandului la receptoorul legat la ADN activează transcrierea
(receptorul pentru acid retinoic, T3, vit D3).
Activarea receptorilor citoplasmatici
Hormonii steroizi circulă în organism legați de proteine serice specifice cum ar fi transcortina care
transportă corticosteroizii. O dată intrați în celulă prin difuzie, activează receptorii citosolici.
În absența hormonilor, receptorii rămân inactivi sub forma complexelor aporeceptor care devin
active după legarea hormonului. Aceste complexe conțin aporeceptorul și o serie de proteine chaperone:
hsp 90, hsp 40, hsp 70, cochaperonul Hop, imunofiline din familia proteinelor de legare FK 506 și factorul
proteic p23.
Chaperonii asistă proteinele să se plieze corect co-translațional și post-translațional, în timpul
transportului transmembranar și să se asambleze corect în complexe.
Imunofilinele prezintă o activitate peptidil-prolil cis-trans izomerazică și se asociază cu hsp 90
prin domenii distincte ce conțin repetiții tetratricopeptidice.
Se pare că hsp 90 menține receptorul într-o conformație parțial nepliată care este competentă
pentru legarea ligandului iar cochaperonii facilitează asocierea corectă a hsp90 cu receptorul. Legarea
hormonului la acest complex activează receptorul și facilitează translocarea receptorului în nucleu cu
participarea dineinei. Receptorul activat prezintă o secvență de localizare nucleară și este capabil să se lege
 Page 31 of 65

la ADN și să determine o transactivare. Datorită faptului că domeniul de transactivare este poziționat corect
se pot realiza interacții stimulatoare cu aparatul de transcriere.
La ora actuală se cunoaște că receptorii nucleari sunt molecule flexibile, care se găsesc în mai
multe stări conformaționale, fiecare cu funcție distinctă.
Este posibil ca chaperonul să stabilizeze conformația optimă pentru legarea hormonului.
În cazul ER, acesta este sechestrat în nucleu într-un complex cu proteinele chaperon inhibitoare.
Legarea hormonilor la receptor permite disocierea proteinelor chaperon și faclitează legarea la ADN,
formarea dimerilor și interacțiile cu coactivatorii și aparatul de transcriere.

Semnalizarea prin retinoizi, vit D3 și hormonul T3

Receptorii pentru retinoizi, T3 și vit D3 sunt localizați în nucleu, legați de HRE specifici. În cele mai
multe cazuri, receptorul fără ligand are o influență represivă asupra genei țintă. Legarea hormonului induce
o modificare conformațională în domeniul de legare a ligandului și expunerea situsului de legare a
coactivatorilor. Si astfel este activată transcrierea. În unele cazuri, receptorul fără ligand mediază
transcrierea iar legarea ligandului induce represia genei.
Receptorii pentru retinoizi se leagă ca heterodimeri asimetrici orientați spre HRE specifice
compuse din 2 structuri repetitive directe a unui miez hexameric care se găsesc în configurațiile DR5, DR2
sau DR1. În cazul configurațiilor DR5 și DR2, RXR ocupă motivul hexameric 5’, iar RAR motivul 3’. În cazul
conformației DR1, polaritatea este inversată 5’ RAR/RXR 3’ și are rol represor. RXR formează heterodimeri
cu receptorii pentru T3 și D3, când ocupă întotdeauna poziția 5’.
Receptorii pentru retinoizi fără ligand represează transcrierea prin recrutarea corepresorilor
NcoR și SMPT, care conduc la imobilizarea nucleosomilor. Pentru a activa transcrierea, receptorii pentru
retinoizi trebuie să se elibereze de structurile represive ale cromatinei pentru a permite recrutarea
mașinăriei de transcriere.
 Page 32 of 65

Legarea ligandului induce o modificare conformațională în suprafața de legare a coreglatorului și

în helixul 11. Drept urmare, corepresorii disociază și complexul poate lega activatori care conduc la
remodelarea și decompactarea structurilor represive și la recrutarea stabilă a mașinăriei de transcriere.
Coactivatorii sunt p160 și complexul TRAP.
În acești heterodimeri cu receptorii pentru acid retinoic, legarea ligandului poate induce o
modificare conformațională care se transmite la celălalt partener al heterodimerului prin cuplaj alosteric.
Retinolul este oxidat în citosol la acid retinoic și apoi acesta interacționează cu proteine specifice
care determină intrarea acidului retinoic în nucleu, unde interacționează cu RAR.

RARs și RXRs sunt substrate pentru multe Ser/Thr protein kinaze și protein fosfataze. Cele mai
multe situsuri se găsesc în domeniul AF-1. Protein kinazele CDK7 și MAPK p38 modulează funcțiile
receptorilor prin reglarea:
 Legării ADN
 Legării ligandului
 Recrutării la co-activatori și co-represori
 Recrutării Ub ligazelor în vederea degradării proteosomale

Funcțiile non-genomice ale receptorilor nucleari și liganzilor lor

Receptorii nucleari fac parte dintr-o rețea care realizează conexiuni între diferite căi de
semnalizare. Astfel receptorii nucleari pot primi și transmite semnale de la și la alte căi ceea ce determină o
activare independentă de ligand a receptorilor dar și acțiuni ale receptorilor în afara nucleului.
Astfel, acești receptori și liganzii lor generează răspunsuri rapide care nu sunt dependente de
transcriere, mediate de funcții non-nucleare ale receptorilor și/sau de legarea hormonilor la receptori
cuplați cu proteinele G. Ambele moduri de acțiune leagă hormonii steroizi de căile de semnalizare
citoplasmatice, care generează răspunsuri biochimice rapide.
Exemplu: ER
Acesta este foarte studiat datorită implicării sale în dezvoltarea cancerelor de sân și uter.
 Page 33 of 65

Cele două izoforme ERα și ERβ au aproape același domeniu de legare a ADN, domenii similare de
legare a ligandului și o mare divergență în AF-1.
Ambii receptori acționează prin același mecanism general în celulele țintă cu acțiuni distincte
asupra promotorilor genelor specifice și ca răspuns la liganzi sintetici. ERα este puternic exprimat și joacă
un rol major în cancerele de uter și sân.
ERs sunt fosfoproteine cu resturi de serină specifice fosforilate ca răspuns la:
• Liganzi
• Mesageri secundari
• Factori de creștere
Această fosforilare se realizează sub acțiunea MAPK, PKA, PKC și a căilor dependente de ciclină.
La nivelul ERs are loc și fosforilarea unor resturi de tirozină.

Fosforilările mediază:
• Stimularea independentă de ligand
• Modularea ERs
• Legarea acestor receptori la majoritatea căilor de semnalizare din celulă
• ERs activați transmit semnale la căi ce activează creșterea și proliferarea celulară
Legarea semnalizării prin estrogeni la căile de semnalizare centrale implică 2 mecanisme principale:
• Interacția directă a ERs cu protein kinaze, receptori TM și proteine adaptor
• Legarea estradiolului la receptori diferiți de ERs
Aceste funcții non-genomice ale ER sunt intim asociate cu membrana celulară. ERs se găsesc în nucleu, dar
într-o manieră dependentă de celulă se găsesc și în citoplasmă, reticul endoplasmatic, membrana
plasmatică, mitocondrie.
ERs prezintă o ancoră de acid palmitic cu care se asociază la membrană și se găsesc în complexe
de semnalizare TM la nivelul caveolelor sau altor situsuri distincte. La aceste nivele există tirozin kinaze,
proteine G și proteine adaptor. Asocierea cu caveolele sau alte situsuri membranare este mediată prin
proteina striatina și prin legarea la proteina adaptor Shc.
ERs interacționează cu 2 enzime: c-Src și PI3K. Interacția cu c-Src se realizează prin legarea ER la
domeniul SH2 al c-Src. Fosforilarea Tyr537 din domeniul de legare a ligandului din ER este implicată în
 Page 34 of 65

aceasta. Legarea c-Src poate fi mediată de asemenea de o moleculă numită moderator al activității
nongenomice a ER (MNAR). Interacția Src kinazei cu ER sau MNAR scoate pe Src din starea de autoinhibiție,
care poate activa calea MAPK și astfel stimula proliferarea și creșterea celulară.
Activarea PI3K de către ER determină formarea fosfoinozitelor și activarea Akt kinazei care
stimulează NO sintaza endotelială. 17β estradiolul se leagă la un receptor activat de proteina G, GRR30 și
determină formarea de mesageri secundari. Astfel s-a constatat creșterea concentrației intracelulare de
calciu consecutiv administrării de estradiol.

Căile de semnalizare cuplate cu proteinele G CURS 4

Semnalele extracelulare:
 Compuși cu masă moleculară mică
 Proteine
 Semnale senzoriale (lumina, presiune, gust, miros)
Acestea pot fi receptate de receptori nucleari, dar în
majoritate prin receptori transmembranari.
Traducerea de semnal la nivelul membranelor se
poate realiza prin 3 moduri.
Structura receptorilor TM
Un domeniu extracelular
Un domeniu TM
Un domeniu citosolic
Funcționează în general ca oligomeri (în special dimeri). În
plus, subunitățile non-TM se pot asocia la domeniul
extracelular sau intracelular

Domeniul extracelular
Conține situsul de legare a ligandului
Conține situsuri de glicozilare
Poate fi foarte divers din punct de vedere structural
 Page 35 of 65

Dacă receptorul conține mai multe segmente transmembranare, domeniul extracelular prezintă
mai multe bucle, adeseori legate prin punți disulfurice.
Pot exista receptori care au un singur domeniu TM, dar în domeniul extracelular prezintă mai multe
subunități legate prin interacții proteină-proteină sau prin punți disulfurice.
Domeniul TM
Există tipuri diferite cu funcții diferite.
Pentru receptorii controlați de ligand, domeniul TM transmite semnalul la domeniul citosolic al
receptorului. Pentru canalele ionice controlate de ligand și voltaj, porțiunea TM formează un por care
permite trecerea selectivă și reglată a ionilor. Receptorii TM străbat membrana plasmatică de aproximativ 5
nm prin intermediul elementelor TM. Majoritatea receptorilor TM prezintă un element α-helix sau 7
prezente în buchet. În ultimul caz, elementele α helix sunt legate prin bucle extracelulare și intracelulare.
De regulă elementele α helix TM conțin 20-30 resturi de aminoacizi hidrofobi iar la interfața cu mediul apos
se întâlnesc aminoacizi hidrofili care interacționează cu capetele polare ale fosfolipidelor.
În cazul rodopsinei recepția luminii determină o modificare a orientării mutuale a helixurilor care
este transmisă în modificarea conformațională a buclelor citoplasmatice. Aceasta este sesizată de restul
componentelor căii de semnalizare sau determină activarea unei enzime pe partea citosolică a membranei
care generează un semnal în interiorul celulei.
Domeniul TM poate conține și elemente de β structură. Porina Omp F din E. coli conține elemente
de β structură care formează o structură de butoi, care nu conține exclusiv aminoacizi hidrofobi.
Domeniul intracelular al receptorilor membranari
Folosește 2 mecanisme pentru a conduce semnalul:
1. Prin interacții proteină-proteină. Modificările conformaționale ale complexului ligand-receptor
determină o modificare conformațională care creează o suprafață nouă de interacție pentru
proteinele adaptor, ce se găsesc în aval în calea de semnalizare
2. Receptarea semnalului determină exprimarea unei activități enzimatice în domeniul citosolic. De
regulă aceasta este tirozin kinazică și mai rar Ser/Thr kinazică. Poate fi datorată receptorului sau
unei proteine asociate receptorului pe fața internă a membranei.
Principalele ținte ale receptorilor TM activați :
• Proteine G
• Protein kinaze
• Canale ionice
• Proteine adaptor

Reglarea activității receptorilor

Se face în 2 scopuri:
1. Desensibilizare, atenuare și diminuare
2. Comunicare cu alte căi de semnalizare
Se realizează prin:
a. Fosforilarea și reciclarea receptorului. Fosforilarea se realizează la nivelul domeniului citosolic la
Ser/Thr/Tyr și poate conduce la inactivarea sau activarea receptorului. Consecutiv fosforilării
Ser/Thr are loc internalizarea receptorilor. Protein kinazele sunt adesea componente ale altor căi
de semnalizare și pot lega activitatea receptorilor TM la alte rețele de semnalizare.
b. Ubichitinarea și degradarea. Degradarea țintită a receptorilor TM se face prin fosforilare a
domeniului citosolic și apoi ubichitinare pentru a-i orienta spre degradare proteosomală.
 Page 36 of 65

Receptorii dependenți de proteinele G

Aproximativ 60% din toți receptorii celular sunt GPCR. Genomul uman codifică în jur de 720 GPCR
diferiți. Jumătate din aceștia sunt receptori senzoriali iar din cealaltă jumătate, 2 treimi au liganzi cunoscuți,
restul fiind orfani.
Se apreciază că aproximativ 80% din toți hormonii și neurotransmițătorii cunoscuți semnalizează
prin GPCRs. Aceștia pot fi activați de proteaze (ex. Trombina) care scindează o peptidă de la capătul
N-terminal și capătul N-terminal nou creat servește ca loc de legare a ligandului pentru receptorii activați
de proteaze. Activarea GPCR se realizează consecutiv receptării semnalului sau legării ligandului.
Majoritatea GPCR au 7 helixuri TM, care interacționează cu proteinele G heterotrimerice și cu alte proteine
citoplasmatice sau mai rar cu alte proteine ce nu sunt proteine G.
Clasificarea GPCRs (slide 18, 19 – scheme)
Se bazează pe:
• Similitudinea de secvență
• Mărimea buclei extracelulare
• Prezența unor resturi de aminoacizi cheie
• Formarea legăturilor disulfurice
Familii A, B, C, Frizzled, olfactivi/gustativi
Familia A: Legături disulfurice conservate. Motiv DRY pe parte citoplasmatică. Situsul de legare a liganzilor
între cele 7 helixuri transmembranare.
Familia B: Un domeniu transmembranar extins. Multe legături disulfurice. Unii membri formează
heterodimeri cu o proteină cu un singur domeniu TM numită RAMP, care modifică legarea ligandului sau
proprietățile de semnalizare a receptorului.
Familia C: Un domeniu extracelular extins. Poate prezenta homo sau heterodimerizare.
Frizzled: Activitatea receptorilor este modulată prin interacții cu receptori membranari adiționali.
Olfactivi/gustativi: Aproximativ 400 membri la oameni și 1200 la șoarece iar la nevertebrate mult mai
puțini.
În cazul rodopsinei bovine s-au identificat 7 helixuri TM care conțin între 20 și 33 resturi de
aminoacizi, stabilizate prin legături de hidrogen. Cromoforul 11 cis-retinal care mediază activarea prin
lumină este legat în interiorul buchetului de structuri α helix în starea bazală. Absorbția luminii excită
cromoforul și activează rodopsina prin modificarea modelului de legături de H, concomitent cu modificarea
conformației buclelor intracelulare de la capătul C terminal, care interacționează cu proteinele G. Detaliile
procesului de activare nu se cunosc.
Buclele extra si intracelulare
Buclele extracelulare: Foarte variabile în lungime. Adăpostesc situsuri pentru modificari post
translaționale (AsnXSer/Thr). Conțin frecvent resturi de Cys conservate și punți disulfurice.
Buclele intracelulare: Facilitează interacția cu proteinele efector. Pot fi palmitoilate (Ex receptorii
alfa și beta adrenergici) la resturi de Cys C terminale pentru ancorare la membrana plasmatică. Au situsuri
de fosforilare.
Legarea ligandului și mecanismul de transmitere a semnalului
Legarea liganzilor mici se face într-o adâncitură formată între cele 7 helixuri TM fără participarea
secvențelor intracelulare și extracelulare. Excepție face rodopsina în care retinalul este legat printr-o
legătură de tip bază Schiff la un rest de Lys din helixul TM 7 iar situsul de legare este îngropat în interiorul
domeniului TM.
Pentru receptorii ce au liganzi peptide sau proteine, domeniul extracelular este implicat în legarea
acestora. Legarea ligandului determină o modificare conformațională și implicit crearea unei suprafețe cu
mare afinitate pentru proteinele G heterotrimetrice.
 Page 37 of 65

În urma interacției proteinei G ce există în formă GDP inactivă se leagă prin intermediul
subunităților α și γ la receptorul activat și devine ea însăși activată. Are loc schimbul GDP→GTP la nivelul
subunității α iar subunitățile βγ disociază. Ulterior proteina G se desprinde de receptor care fie trece în
stare inactivă sau activează alte proteine G.
Reglarea GPCRs
Reglarea se realizează la nivelul segmentului C terminal. Proteinele care interacționează cu acest
segment sunt:
• Proteinele care modifică activitatea receptorilor (RAMPs) care interacționează cu GPCR din familia
B.
• Proteinele scaffold: membri ai familiei proteinelor adaptor ale proteinelor de ancorare a A kinazei
(AKAP)
• Proteinele care conțin modulul PDZ care formează complexe proteice mari.

Decuplarea și desensibilizarea receptorilor 7 TM

Desensibilizarea stabilirea transmisiei semnalului în condițiile stimulării de lungă durată cu
hormoni, neurotransmițători sau semnale senzoriale. Chiar dacă semnalul extracelular este persistent,
după un timp, nu mai este transmis sau diminuat prin desensibilizare, proces ce poate avea loc în mod
omolog sau heterolog.
• Desensibilizarea omoloagă: dependentă de agonist
• Desensibilizarea heteroloagă: independentă de agonist
Desensibilizarea poate avea loc pe termen scurt sau lung. În ambele cazuri acest proces are loc prin
fosforilarea GPCR la nivelul regiunii citoplasmatice. Desensibilizarea pe termen scurt este blocată prin
legarea proteinei arestina la situsurile de fosforilare. Pe termen lung se realizează prin internalizarea
mediată de arestină și reciclarea receptorului.
Desensibilizarea heteroloagă
Fosforilarea domeniului citosolic al receptorilor 7TM are loc prin acțiunea PKA și PKC, într-un mod
independent de agonist. Acesta este un mecanism de feed back negativ. Activarea hormonală a
receptorului. (slide 27 – schema)
Desensibilizarea homoloagă
Acest proces implică fosforilarea GPCR sub acțiunea GPCR kinazelor (GRKs).
Mecanismul major constă din 2 etape:
• Receptorul legat de agonist este fosforilat de GRK, apoi
• Leagă arestina care întrerupe semnalizarea prin proteinele G
Numai receptorul ocupat de agonist (activat) este fosforilat și represat.
La oameni există 7 tipuri de GRK. Unele GRKs sunt ca o suveică între citoplasmă și membrană într-o
manieră dependentă de activare. Atunci când un agonist se leagă la GPCR determină asocierea receptorului
cu proteina G heterotrimerică conducând la disocierea subunității α de subunităților βγ.
Subunitățile βγ care prezintă o ancoră prenil se leagă la GRK determinând asocierea acesteia cu
membrana plasmatică. Legarea mesagerilor din cascada fosfatidilinozitolică la domeniul PH (de omologie cu
plekstrina) al GRKs consolidează legarea GRK la membrană. Unele GRKs sunt legate la membrana
plasmatică prin ancore farnezil sau palmitoil.
Fosforilarea receptorului de către GRKs determină crearea unui situs de legare de mare afinitate a
arestinei. Până în prezent sunt descrise 3 arestine:
• Specifică pentru rodopsină
• β arestinele 1 și 2 cele mai importante pentru desensibilizarea celor mai mulți receptori activați.
 Page 38 of 65

Legarea β arestinelor are următoarele

consecințe:
 Receptorul fosforilat este împiedicat să
interacționeze cu proteinele G
heterotrimerice astfel încât transmiterea
semnalului în timpul procesului vizual în
cazul aplicării unui stimul luminos de lungă
durată.
 Consecutiv legării β arestinei, receptorul
fosforilat poate fi translocat în interiorul
celulei. Acest proces este o reglare pe
termen lung și astfel β arestina se leagă la
receptor pentru internalizare prin
endocitoză, dar se leagă și la clatrină și la
alte proteine asociate cu aceasta.
Receptorul este internalizat la endozomi,
defosforilat și transportat înapoi la
membrana plasmatică.
Această translocare determină diminuarea
transmiterii semnalului în cazul stimulării
hormonale de lungă durată.
Dimerizarea GPCRs
Se apreciază că in vivo GPCRs pot forma dimeri funcționali. Dimerizarea modifică legarea ligandului
și proprietățile de semnalizare și trafic al GPCRs. Pentru subfamilia B s-a descris formare de heterodimeri cu
receptori înrudiți din aceeași subfamilie
Proteinele G heterotrimerice
Sunt de fapt GTPaze reglatoare care leagă GTP și-l hidrolizează funcționând ca un comutator în
procesele celulare centrale.
Superfamilia GTPazelor se găsesc în plante, bacterii și animale.
Sunt implicate în:
• Biosinteza proteinelor
• Traducere de semnal la nivel celular
• Controlul diferențierii și diviziunii celulare
• Translocarea proteinelor prin membrane
• Transportul veziculelor în celulă
GTPazele:
Sunt de fapt comutatori :
• În stare inactivă cu GDP
• În stare activă cu GTP
Semnalele externe sunt receptate de GTPaze și transmise în aval în calea de semnalizare.
Atât în formă activă cât și în cea inactivă, GTPazele prezintă o afinitate specifică pentru alte
proteine care se găsesc în amonte sau aval în calea de semnalizare.
Modularea și reglarea funcției de comutator
Ciclul GTPazic este caracterizat de 2 procese: schimbul GDP-GTP și hidroliza GTP. Aceste reacții sunt
foarte lente iar accelerarea prin proteine specifice este folosită de celule pentru a comuta on și off.
 Page 39 of 65

Aceste proteine reglatoare sunt:

 Factorii de schimb ai nucleotidelor guaninice (GEFs). Receptarea unui semnal de către GTPazele
reglatoare determină creșterea vitezei de disociere a GDP (care în mod natural este foarte mică). În
prezența GEFs care acționează în aval față de GTPaze, viteza de disociere a GDP crește. Pentru prot.
G heterotrimerice, receptorul legat de agoniști reprezintă GEF.
 Proteinele activatoare ale GTPazelor (GAPs) atenuează și termină semnalul. Cele mai multe GTPaze
prezintă o viteză de hidroliză a GTP care este echivalentă cu un timp de viață lung al stării activate.
GAPs cresc viteza de hidroliză a GTP, ceea ce reduce timpul de viață al stării active. GAPs
funcționează ca reglator negativ pentru semnalizarea cu ajutorul GTPazelor. Proteina Ras are
activitate ATPazică intrinsecă scăzută, dar în prezența unei GAP aceasta poate crește de 10 ori.
Diferitele GTPaze diferă foarte mult în privința vitezei de hidroliză a GTP și a influenței GAPs.
Adesea activitatea GAPs este reglată de alte căi de semnalizare.
 Inhibitorii disocierii guanin nucleotidelor. Disocierea GDP sau GTP poate fi inhibată de proteine
specifice=GDIs. Proteinele cu această funcție acționează asupra membrilor superfamiliei
proteinelor Ras. Rolul GDIs este să furnizeze un fond citosolic de proteine de legare a GDP inactive.

Inhibiția GTPazelor cu analogi GTP (slide 39 – scheme)

În prezența analogilor GTP nehidrolizabili, prot G rămân în formă activă. Astfel, s-au putut cristaliza
și studia complexele GTPazice în formă activă.

Domeniul G ca element structural comun al GTPazelor

Legarea și hidroliza GTP are loc în domeniul G al tuturor GTPazelor. Secvența GX4GK (S/T) se găsește
la situsul de legare a nucleotidelor și interacționează cu grupările β și γ fosfat ale GTP și GDP, fiind
cunoscută ca P-loop. Mai există și alte secvențe conservate care leagă γ fosfatul sau guanozina.

Familia GTPazelor
Circa 100 membri. Au fost grupate în funcție de omologie, masă moleculară și structura
subunităților.
 Page 40 of 65

Proteinele G heterotrimerice
La om/șoarece există :
• Subunitatea α: 39-46 kDa, cel puțin 16 gene
• β: 36 kDa, 5 gene
• γ: 8 kDa, 12 gene
Subunitatea α prezintă
activitatea GTPazică. Subunitățile β și
γ formează un complex și sunt active
în această formă. Specificitatea
funcției de comutator este
determinată în principal de
subunitatea α care interacționează și
cu precedent și cu moleculele efector
următoare în calea de semnalizare.
Complexul βγ este de asemenea
implicat în transmiterea semnalului la
proteinele efector.

Clasificarea proteinelor G heterotrimerice (slide 44 –tabel)

Pe baza secvenței de aminoacizi, proteinele Gα au fost împărțite în 4 familii : Gs, Gi, Gq, G12.
Subfamilia Gs Membrii sunt inhibați de toxina holerei. (slide 45 – schema)
Subfamilia Gi Primul membru descoperit a reprezentat un efect inhibitor al adenilat ciclazei. În această
subfamilie există membri ce interacționează cu PLCβ. Gt și Gg implicate în transmiterea semnalelor
senzoriale aparțin tot subfamiliei Gi. Proteinele G implicate în transmiterea semnalului în procesul vederii
se numesc transducine(Gt). Transducinele sunt activate de rodopsină (fotoreceptor) și localizate în celulele
cu conuri și bastonașe din retină. Percepția gustului amar este mediată de gustducină care este înalt
omoloagă cu transducina. Majoritatea membrilor subfamiliei Gi sunt inhibate de toxina pertusis. (schema –
slide 46)
Subfamilia G12 Implicate în reoraganizarea citoscheletului, activarea protein kinazei N terminale cJun și
stimularea schimbului Na+/ H+. Determină activarea Rho GTPazei.
 Page 41 of 65

Ciclul funcțional al proteinelor G heterotrimerice

Starea inițială inactivă este Gα GDP(βγ) heterotrimerică fie liberă, fie legată de receptor. Situsurile
de legare de pe Gα sunt blocate de subunitățile β și γ. Complexul heterotrimeric este ancorat de fața
internă a membranei plasmatice prin cozi lipidice.
Legarea moleculei semnal la GPCR inițiază activarea prot G. Receptorul activat interacționează cu
complexul heterotrimeric prin buclele citosolice ceea ce determină disocierea GDP: Receptorul
interacționează cu capătul C-terminal al Gα și al Gγ determinând o modificare conformațională
semnificativă care determină disocierea GDP de la situsul de legare a nucleotidelor. În stare “liberă”
heterotrimerul are afinitate mare pentru receptorul activat și este imediat ocupat de GTP (deoarece GTP
este în exces în celulă comparativ cu GDP).
Gα leagă mai puternic GTP comparativ cu GDP. Receptorul activat este GEF pentru proteinele G
trimerice. Legarea GTP are 2 consecințe:
1. Dimerul βγ disociază
2. Legarea la receptorul activat este anulată
Receptorul activat poate activa alte proteine G și astfel are loc amplificarea semnalului. Gα∙GTP
interacționează cu o moleculă efector și inițiază următorul pas în calea de semnalizare. Hidroliza GTP
datorată activității GTPazice intrinseci a subunității α finalizează transmiterea semnalului la nivelul prot G.
Viteza de hidroliză a GTP este un ceas intern al transmiterii semnalului. Activarea funcției GTPazice se
realizează cu RGS și alte proteine efector.
RGS cresc activitatea GTPazică până la 3 ori, ceea ce atenuează semnalul transmis de prot G. Există
însă și alte proteine efector care acționează în aval în calea de semnalizare ca GAPs. Acestea sunt:
• PLCβ care stimulează activitatea GTPazică a subunității Gq-11 de aproximativ 2 ori
• Izoforma V a adenilat ciclazei
• cGMP fosfodiesteraza, necesară pentru stimularea activității GTPazice a unor proteine specifice
RGS în procesul vederii
Interacțiile prot G cu efectorii lor în amonte și aval se realizează la nivelul unor microdomenii
membranare de tipul lipid rafts, bogate în sfingolipide și colesterol. Un subset al acestora sunt caveolele,
caracterizate de prezența caveolinei pe partea citoplasmatică a membranei celulare. Aceste microdomenii
sunt bogate în GPCRs, prot G heterotrimerică, adenilat ciclaza și proteine scaffold AKAP. Asemenea
ansambluri supramoleculare asigură o mare eficiență și specificitate a semnalului.

Aspecte structurale ale funcției de comutator a proteinei G

Studiile s-au efectuat pe rodopsină și transducină. Modificările induse de ligand în orientarea
relativă a helixurilor transmembranare 3, 6 și 7 în rodopsină se propagă la buclele citoplasmatice, ceea ce
crează o conformație deschisă a acestora și expunerea situsurilor de legare a prot. G.
Prot G interacționează cu receptorul activat prin Gα și Gγ. Orientarea complexului Gα∙GDP (βγ) față
de membrană este dictată de ancorele lipidice ce se găsesc la capătul N-terminal al Gα și C-terminal al Gγ.
Deoarece suprafața citoplasmatică a rodopsinei în stare de bază este mai mică decât suprafața de interacție
a proteinei G probabil că au loc modificări conformaționale majore la nivelul ambelor proteine pentru a se
forma complexul activ.
Gα este alcătuit din 2 domenii GTPazice cu structură α helix. Situsul de legare a nucleotidelor se
găsește într-un buzunar între cele 2 domenii. Modificările conformaționale ce apar în urma tranziției GDP-
GTP sunt restricționate la 3 domenii structurale: switch I, II și III. Acestea conțin doar 14% din transducină.
Legarea GTP la Gαt determină modificări conformaționale în switch II ceea ce duce la disocierea
complexului βγ. Acesta din urmă se leagă la regiunile switch I și II, iar adenilat ciclaza se leagă la switch II,
apare o concurența pentru switch II.
 Page 42 of 65

Structura și funcția complexului βγ

Toate Gβ conțin 7 structuri repetitive WD la fiecare 40 resturi de aminoacizi, care formează structuri
β antiparalele. Aceste structuri repetitive WD care formează o structură de elice cu 7 palete se găsesc în
multe proteine și pot forma complexe reversibile cu alte proteine.
Există și opinii conform cărora Gβγ nu disociază de Gα după activarea receptorului ci suferă o
rearanjare la nivelul heterotrimerului, determinând expunerea suprafețelor de interacție ale Gα cu
proteinele efector. Pe de altă parte Gβγ interacționează cu molecule efector specifice.
Proteinele RACK sunt proteine scafold care nu interacționează doar cu PKC ci și cu alte proteine
adaptor din alte căi de semnalizare. (slide 57 – tabel)

Asocierea prot G cu membrana plasmatică

Subunitățile α de subtip Gi și G0 posedă o ancoră lipidică de tip miristoil la Gly N-terminală.
Miristoilarea sau palmitoilarea Gα determină adresarea la regiuni membranare specifice și reglează
interacția cu alte proteine ca: adenilat ciclaza, GPCRs și complexul Βγ. Gγ are o ancoră membranară prenil,
în mod similar cu prot Ras. Gruparea carboxil terminală este esterificată cu metil. (slide 58 – schema)

Reglatorii prot G: fosducina și proteinele RGS

Reglarea căii de semnalizare este în general negativă și se realizează în 2 scopuri:
• Celula să slabească răspunsul citoplasmatic în condițiile activării persistente a receptorilor
• Celulele trebuie să stingă semnalul
Cele mai importante puncte reglatoare la nivelul prot G și receptorilor lor sunt:
• Desensibilizarea
• Diminuarea numărului de recptori
• Inactivarea complexului βγ (legarea fosducinei la acesta)
• Reducerea timpului de viață a Gα∙GTP (cu ajutorul RGS)

Reglarea prin fosducină.

Fosducina este abundentă în celulele
fotoreceptoare din retină și reglează
sensibilitatea la lumină prin interacția
transducinei cu βγ.

Reglarea prin proteinele RGS

Există cel puțin 37 gene care codifică RGS
diferite în genomul uman. Proteinele RGS accelerează
activitatea GPT-azică intrinsecă a Gα de până la 2000 de
ori. Toate proteinele RGS prezintă un domeniu RGS, înalt
conservat care mediază contactul cu Gα. Proteinele RGS
stabilizează starea de tranziție a reacției de hidroliză a
GTP. Aceste proteine au o structură modulară.
 Page 43 of 65

Funcții independente de receptor ale prot G heterotrimerice

Acestea au fost descoperite în C. elegans și Drosophila și sunt importante pentru poziționarea
fusului mitotic și atașamentul microtubulilor la cortexul celular. În acest caz este necesar ciclul GDP-GTP și
aceste tranziții necesită acțiuni ale factorilor de schimb GEFs și GAPs. La C. elegans un tip de GEF este
proteina citosolică RIC-8.

Efectorii proteinelor G
Au activități enzimatice sau sunt canale ionice.
Efectorii majori: Adenilat ciclaza, Fosfolipazele, Canalele ionice, Fosfodiesterazele cGMP specifice.
Mesagerii secundari difuzibili: cAMP, cGMP, DAG, IP3, Ca2+.
Deschiderea canalelor ionice mediată de proteine G conduce la schimbarea potențialului de
membrană și a nivelului ionilor.
Adenilat ciclaza
La mamifere există cel puțin 9 tipuri diferite de AC(I-IX) cu o
omologie de secvență de 50%. În plus există o adenilat ciclază citosolică
reglată de Ca2+ și bicarbonat ce joacă un rol important în motilitatea
spermatozoizilor. Acs(I-IX)sunt proteine TM cu 2 domenii M1 și M2 cu o
porțiune N-terminală citoplasmatică scurtă: M1 și M2 au 6 secțiuni TM.
Între M1 și M2 există un domeniu citoplasmatic larg C1 iar M2 se termină
cu un domeniu citoplasmatic C2. Interacția cu Gα și sinteza cAMP au loc la
nivelul C1 și C2, care sunt omoloage între diferite subtipuri. În schimb M1
și M2 sunt puțin conservate. Centrul catalitic activ al enzimei se găsește la
interfața C1 C2. Similar cu DNA polimeraza, AC folosește un mecanism cu 2
ioni metalici pentru cataliză. Interacția cu Gα ∙GTP este relativ departe de
cca (centru catalitic) dar determină modificări conformaționale care duc la
reorganizarea cca la interfața C1C2.

Reglarea adenilat ciclazei

Are loc diferențiat pentru fiecare izoformă a AC.
Stimularea adenilat ciclazei poate avea loc prin:
Subunitatea Gα,s∙GTP, Ca2+ /calmodulină, PKC, Gβγ
Inhibiția sa este posibilă prin: Gαi GTP, Ca2+, Gα
Izotipurile AC I, III, VIII sunt reglate prin Ca2+ /calmodulină
 Page 44 of 65

Fosfolipaza C
Există cel puțin 13 izoforme ale PLC la mamifere, cel mai bine caracterizate fiind PLCβ, γ, δ, ε.
Activarea acestor enzime se face sub acțiunea unor stimuli extracelulari: Neurotransmițători,
Hormoni, Mediatori în inflamații
PLCs conțin domenii PH, care mediază interacția membrană-proteine și proteine-proteine.
Domeniul PH din PLCβ leagă specific fosfatidil inozitol fosfatul. Domeniul EF leagă cu mică afinitate Ca 2+.
Domeniul catalitic este format din EF,X,Y și C2.
PLCβ participă la semnalizarea prin proteina G iar PLCγ este efector pentru receptorii tirozin
kinazici.
Fiecare din izoenzimele PLCβ prezintă sensibilitate diferită pentru Gα,q și Gβγ. Acestea prezintă
regiuni care mediază interacția cu proteine ce conțin domenii PDZ, ce sunt adaptor sau scaffold.
PLC γ este activată de RTKs și este implicată în traducerea semnalelor induse de factori de creștere.
RTKs fosforilează enzima la resturi de Tyr specifice și inițiază activarea PLC γ care mobilizează
rezervele de calciu intracelular și interacționează cu căile de semnalizare protein kinazice.
PLC γ prezintă domenii SH2 și SH3. SH2 mediază legarea Tyr fosforilate ale RTKs activate prin
autofosforilare.
PLCδ este reglată de concentrația ionilor de Ca2+.
Toate izoformele conțin semnale de localizare nucleară și prezintă o translocare intracelulară
coordonată în timpul ciclului celular.
PLCε este activată de proteinele Ras și Rho și de Gs, Gi/o, G12/13.

Mesageri secundari CURS 5

Introducere
Mesagerii intracelulari sunt formați sub acțiunea unor enzime specifice și servesc ca efectori care
reglează activitatea altor proteine.
Caracteristici generale ale mesagerilor intracelulari
 Molecule difuzibile
 Pot fi împărțiți în 2 tipuri:
1. Cu caracter hidrofob: DAG și derivații de la fosfatidil inozitol. Sunt localizați în membrană și
promovează localizarea membranară a proteinelor țintă
2. Mesagerii hidrofili, localizați în citosol, care difuzează până la proteinele țintă și în general le
activează prin mecanisme alosterice
 Mesagerii secundari activează protein kinaze sau factori de schimb al guanin nucleotidelor.
 Pot fi formați și degradați în reacții enzimatice specifice
 Mesageri de tipul Ca2+ sunt stocați în organite specifice
 Pot fi produși în locații specifice și pot fi îndepărtați sau inactivați în funcție de locație. De aceea
celula poate crea semnale limitate din punct de vedere spațial și temporal

cAMP
Concentrația de cAMP este reglată prin viteza sa de sinteză și viteza de degradare.
Adenilat ciclaza, fosfodiesteraza (PDE) și PKA colocalizează la nivelul acelorași situsuri subcelulare,
ceea ce generează un control precis al acestei concentrații. PDE sunt subiect al unor influențe reglatoare
prin Ca2+ /calmodulină și fosforilare. Datorită importanței sale în reglarea concentrației cAMP este o țintă
pentru inhibitori specifici de uz farmaceutic.
 Page 45 of 65

Țintele cAMP
cAMP este reglator alosteric pentru
proteine de semnalizare situate în aval față
de adenilat ciclaza.
Acestea sunt:
• PKA
• Canale ionice
• Factorul de transcripție Epac

cAMP se leagă la elementele structurale

citoplasmatice ale canalelor ionice și reglează
starea deschisă. Un exemplu este trecerea
Ca2+ reglată de cAMP prin canalele de calciu,
sau percepția mirosului la mamifere.
Majoritatea efectelor biologice ale
cAMP sunt mediate prin PKA. Natura proteinelor substrat ale PKA este foarte diversă.

cGMP și guanilat ciclazele

cGMP este prezent de la bacterii și drojdii până la om. Multe proteine țintă ale cGMP conțin un
modul de recunoaștere a nucleotidelor denumit domeniul GAF (cyclic GMP, adenilil cyclase, FhlA). Inițial
s-a crezut că domeniul GAF leagă doar cGMP, ulterior s-a constatat că leagă de asemenea cAMP. Proteine
cu domenii GAF sunt adenilat ciclazele nonmembranare, guanilil ciclaze și PDEs.
Deși guanilat ciclazele catalizează reacții similare cu adenilat ciclazele, aceste enzime diferă
considerabil din punct de vedere al structurii și mecanismului de activare.
Există 2 tipuri de guanilat ciclaze, unele citoplasmatice care conțin o grupare hem și celelalalte care
conțin un segment transmembranar și sunt reglate de semnale extracelulare.
Guanilat ciclazele receptori
Reprezintă o clasă unică de receptori TM care transmit semnale extracelulare prin formare directă a
unui mesager secundar intracelular. Intervin în relaxarea vaselor de sânge.
Acești receptori conțin:
• Un domeniu extracelular ce leagă ligandul
• Un domeniu TM helical
• Mai multe domenii extracelulare.
Drept liganzi funcționează peptide cu proprietăți vasodilatatoare ca de ex: peptida natriuretică
atrială. De aceea acești receptori se numesc receptori peptidei natriuretice NRPs. Formează homodimeri.
 Page 46 of 65

Domeniile intracelulare sunt activate de legarea peptidei la domeniile extracelulare. După legarea
ligandului are loc fosforilarea domeniului kinazic intracelular, legarea ATP și activarea sintezei cGMP. Se
presupune că ATP funcționează ca un reglator allosteric.
Guanilat ciclazele solubile
Formele solubile acționează ca heterodimeri și sunt activate de NO. Gruparea hem, care conferă
sensibilitate la NO este ancorată la capătul N-terminal al acestor enzime. În urma legării NO la gruparea
hem are loc stimularea activității guanilat ciclazei.
Țintele cGMP
acționează asupra următoarelor ținte:
1. Protein kinazele dependente de cGMP (GK sau
PKG) sunt activate de cGMP, care au elemente
similare cu PKA. Spre deosebire de PKA au
situsurile catalitic și reglator pe aceeași catenă
polipeptidică. Prin legarea cGMP la domeniul
reglator este anulată autoinhibiția datorată
capătului N-terminal și are loc fosforilarea
proteinelor substrat.
GKs modulează mai multe procese fiziologice:
• Relaxarea musculaturii netede (vase de sânge,
tract gastrointestinal, vezică, organe genitale)
• Agregare plachetară
• Eliberarea reninei
• Secreția intestinală
• Învățarea și memoria
La nivelul țesutului muscular neted ca substrate ale
GKs sunt și canalele de calciu și protein fosfataza specifică
miozinei. Prin fosforilarea acestora se modulează nivelele
de Ca2+ și se controlează tonusul musculaturii netede.
2. Canalele cationice, care posedă situsuri de legare a
cGMP pe partea lor intracelulară. Prin legarea
cGMP la canalele cationice induce deschiderea
canalelor și influxul cationilor (în procesul vederii).
3. Unele PDEs specifice pentru cAMP sunt reglate de
cGMP.

Metabolismul inozitol fosfolipidelor și inozitol fosfaților

Fosfolipidele care conțin inozitol din membrana plasmatică sunt compuși parentali pentru o serie
de mesageri cu MM mică drept răspuns la semnale intra și extracelulare. Acești mesageri secundari sunt:
• DAG
• IP3
• Fosfoinozite (fosfatidil inozitol 3,4,5 trifosfat) membranare. Fosfatidil inozitol 3,4,5 trifosfatul se
leaga de domeniile PH (cu omologie pentru pleckstrină) și este format în reacția catalizată de PI3K
(fosfatidil inozitol 3 kinaza). (slide 15 – scheme)
 Page 47 of 65

Hidroliza fosfatidilinozitol 4,5 bifosfatului în

prezența PLC→ DAG și IP3. IP3 activează eliberarea
Ca2+ iar DAG acționează prin stimularea PKC.
Fosfatidil inozitol 3,4,5 trifosfat poate funcționa ca
mesager localizat la nivelul membranei.
Inozitol fosfații și fosfoinozitele suferă
transformări ulterioare care conduc la aproximativ
30 de compuși cu potențial de mesager, care
rezultă prin fosforilări ulterioare (IPK= inozitol
polifosfat kinaza) sau defosforilări specifice sau
catalizate de inozitol fosfataze (inozitol polifosfat 5’
fosfataze).
Activarea PLC și formarea inozitol fosfatului
Două căi centrale de semnalizare reglează
pozitiv activitatea PLC în celule. Izoforma β este
activată prin proteinele G de GPCRs. Izoforma γ
este activată de receptori TM cu activitate tirozin
kinazică asociată. Stimulii extracelulari ce activează
PLC prin cele 2 căi de semnalizare sunt foarte
diferiți.
Stocarea și eliberarea Ca2+
IP3 mobilizează Ca2+ din organitele de stocare. Nivelul intracelular al Ca2+ este reglat prin intrarea
ionului prin canalele de Ca2+ și prin eliberarea din rezervele intracelulare.
Concentrația Ca2+ liber în citosol este de 10-7 M în condiții de repaus pentru că fosfații anorganici de
calciu sunt greu solubili. Cantitatea mică de Ca2+ citosolic este contrabalansată de cantitatea mare din
organite și din spațiul extracelular unde este de ordinul 1mM. În reticulul endoplasmatic, Ca2+ este
complexat cu calreticulina. Aceasta este o proteină ce leagă Ca2+ cu afinitate scăzută și în consecință are
capacitate mare de legare. Din starea legată de proteine, Ca2+ poate fi eliberat prin procese de traducere de
semnal. În reticulul sarcoplasmic, Ca2+ este legat de proteina calsechestrină, de unde este eliberat de un
stimul nervos și inițiază contracția musculară. Concentrația Ca2+ liber este un mecanism universal de control
 Page 48 of 65

al unor reacții metabolice și fiziologice. La nivel celular există multiple modalități pentru a modela
semnalele de calciu în termeni de spațiu, timp și amplitudine.
Eliberarea Ca2+ din depozitele de Ca2+
3 tipuri de mesageri sunt implicați:
• IP3
• NAAD (acid nicotinic adenin dinucleotid
fosfat)
• cADP-riboza
În plus, Ca2+ determină eliberarea calciului din
depozite. Pentru mobilizarea Ca2+ legarea mesagerului
secundar la canalele activate de ligand în care
receptorul și canalul ionic formează o unitate
structurală.

Receptorul pentru IP3

Este un canal de Ca2+ dependent de ligand: IP3, ATP și Ca2+. Receptorul pentru IP3 este o proteină
canal homotetramerică cu 6 helixuri TM la capătul C-terminal al fiecărei subunități. Situsurile de legare a
IP3 și Ca2+ se găsesc la capătul N-terminal. Legarea IP3 la receptor crește afinitatea pentru Ca2+ iar după
legarea Ca2+, are loc transportul Ca2+ din RE în citosol. Pentru activarea receptorului pentru IP3 este
necesară o concentrație de Ca2+ de 500 nM. La concentrații citosolice de calciu mai mari canalele activate
de IP3 se închid datorită legării Ca2+ la capătul N-terminal al receptorului. Deci concentrația Ca2+ are efect
stimulator la concentrații mici și inhibitor la concentrații mari. Acest receptor suferă reglări în funcție de
interacțiile proteină-proteină datorate legării proteinelor RACK și fosforilării prin PKA.
Receptorul rianodinic
A fost numit așa datorită stimulării prin alcaloidul vegetal rianodină. Are o compoziție similară cu
receptorul pentru IP3 și este implicat în conducerea semnalelor de Ca2+ în multe celule excitabile (din
musculatura netedă și striată, neuroni). Starea deschisă a receptorului rianodinic este controlată în parte de
Ca2+ care se leagă la receptor și induce deschiderea sa. Datorită influxului de Ca2+ din spațiul extracelular
datorată deschiderii canalelor de Ca2+ acționate de voltaj se deschid receptorii rianodinici ceea ce conduce
la o creștere abruptă a concentrației de Ca2+ citosolic, ceea ce inhibă fluxul Ca2+ prin receptorul activat de
IP3.
 Page 49 of 65

În celulele musculare există o cuplare între influxul de Ca2+ extracelular și receptorul rianodinic. În
acest caz în membrana plasmatică există un canal dependent de Ca2+ acționat de voltaj, receptorul
dihidropiridinic, este cuplat direct cu domeniul citosolic al receptorului rianodinic localizat în membrana RE.
Se realizează o cuplare electromecanică ce permite deschiderea receptorului rianodinic.
cADP-riboza și NAADP
În celulele musculare cardiace și pancreatice există un alt mesager secundar cADP-riboza, care este
implicat în deschiderea receptorului rianodinic. cADP-riboza și NAADP este formată din NADP+ sub acțiunea
ADP-ribozil-ciclaza. NAADP eliberează Ca2+ independent de IP3 și cADP-riboza din rezervele intracelulare.

Influxul Ca2+ din regiunea extracelulară

• Canalele activate de voltaj sunt deschise prin depolarizarea sau schimbarea potențialului membranar
• Canalele activate de ligand (de ex. cele activate de acetilcolină)
• Canalele activate mecanic în celulele care răspund la stresul mecanic
• Canalele activate ca răspuns la golirea rezervoarelor de calciu intracelulare
• Canale controlate de Gα
• Canale controlate de sfingolipide
Îndepărtarea și stocarea Ca2+
Concentrația calciului citoplasmatică este doar temporar și local crescută în timpul stimulării
celulelor. Celulele posedă sisteme de transport eficient al Ca2+ care transportă rapid acest ion în spațiul
extracelular sau în organitele de stocare. Ca2+ este preluat și în mitocondrii. Ca2+-ATPazele sunt implicate în
drenarea Ca2+ în spațiul extracelular prin transport activ, împotriva gradientului de concentrație. De
asemenea, există un antiport Na+ - Ca2+ în celule musculare și neuroni. Există Ca2+ -ATPaze în membrana RE.
Deschiderea canalelor de calciu conduce la o creștere locală în concentrația citosolică a Ca2+ de la
10-7 la 10-6 M. La această concentrație transportul acestui ion este foarte eficient. O creștere a concentrației
Ca2+ peste 10-5 M datorită perturbării celulelor determină pomparea Ca2+ în mitocondrie prin sisteme de
transport localizate în membrana mitocondrială internă.
Modificări temporale și spațiale ale concentrației Ca2+
Atunci când canalele de la nivelul membranei plasmatice și intracelulare sunt activate, se produc
numai pulsuri scurte de Ca2+ pentru că aceste canale sunt deschise numai perioade scurte de timp. La nivel
local, aceste semnale de calciu controlează alte canale ionice și semnale specifice de Ca 2+ la nivel nuclear.
Coordonarea eliberării de calciu de către mai multe tipuri de canale generează efecte mai persistente în
timp și cu o mai mare distribuție spațială. Din totalitatea canalelor, fiecare celulă folosește un set specific
de canale și pompe pentru a crea semnale variabile în spațiu și timp. Semnalele de calciu globale au
caracter pulsator și apar ca unde sau piscuri. Mecanismele prin care undele și piscurile sunt generate sunt
diverse și sunt folosite într-o manieră specifică în funcție de tipul de celulă. Sensibilitatea diferențială a
 Page 50 of 65

receptorilor pentru IP3 și rianodinic pentru concentrații mari de Ca2+ este un mecanism care contribuie la
formarea undelor și piscurilor de Ca2+.
O mică creștere a concentrației de Ca2+ datorită unui tip de semnal de calciu va activa alte canale și
va permite un influx de calciu într-o manieră cooperativă. Datorită acestui fapt, conc Ca2+ crește până la o
valoare prag, care este suficientă pentru a inhiba influxul de calciu prin canale și nivelul ionilor de calciu
scade din nou. Nivelul Ca2+ eliberat activează PLC, ceea ce crește nivelul IP3, care difuzează în celulă și
determină eliberarea de ioni de calciu din RE.
Funcțiile fosfoinozitelor
PI3Ks fosforilează fosfatidil inozitoli în poziția 3’. Fosfatidilinozitol 3,4,5 trifosfat își exercită funcția
celulară prin legarea la domeniile PH în proteinele de semnalizare. Multe protein kinaze conțin domenii PH.
Fosfatidilinozitol 3,4,5 trifosfatul se leagă și la alte tipuri de domenii SH2, PTB, C2 al PKC, precum și
domeniul inel FYVE al mai multor proteine membranare. Activarea proteinelor efector se face prin :
• Procese alosterice
• Adresarea la membrană
Alte tipuri de fosfoinozite sunt implicate în: Polimerizarea actinei, Secreție, Traficul vezicular,
Recunoasterea domeniilor PH, PX, ANTH, FYVE.

Ca2+ ca moleculă semnal

Consecutiv unei stimulări electrice sau hormonale are loc o creștere a nivelului ionului de calciu
ceea ce determină inițierea altor reacții în celule. Creșterea nivelului de Ca2+ se realizează prin trei căi de
semnalizare importante:
• Activate de proteinele G (GPCRs)
• Receptorii tirozin kinazici
• Canalele activate de voltaj sau liganzi
Informația furnizată de nivele tranziente de Ca2+ este transmisă prin intermediul unor proteine ce
leagă Ca2+ care convertesc semnalul în modificări biochimice. (slide 43 – tabel)
Ca2+ este implicat în:
• Contracția musculară
• Procesul vederii
• Proliferarea celulară
• Secreție
• Motilitate celulară
• Formarea citoscheletului
• Expresia genică
• Reacții ale metabolismului intermediar
Semnalizarea prin ioni de calciu se realizează prin: Activarea directă a enzimelor, Legarea la
proteine senzor: calmodulină, troponină C, recoverina. (slide 36 – tabel)
Activarea directă a proteinelor
Există multe proteine care prezintă un situs specific de legare a Ca2+ în centrul catalitic activ, acest
ion având un rol esențial în cataliză. Exemplu: PLA2 are 2 ioni Ca2+ legați puternic la centrul catalitic activ.
Un ion de Ca2+ este implicat direct în cataliză. Acesta leagă substratul și neutralizează sarcina negativă în
starea de tranziție a hidrolizei esterului. Al doilea ion de Ca2+ are o funcție structurală dar și de stabilizare a
stării de tranziție. PKC și PLCγ de asemenea sunt activate de Ca2+. Alte proteine fără funcție enzimatică
reglate de legarea ionului de calciu sunt: anexina, fimbrina, gelsolina și vilina care sunt implicate în
organizarea citoscheletului.
 Page 51 of 65

Legarea Ca2+ la proteinele senzor

Proteinele senzor traduc nivelele de Ca2+ în răspunsuri celulare specifice prin adaptarea unor
modificări conformaționale care expun situsul de legare pentru un efector în aval. Modificări ale
concentrației ionilor de calciu în domeniul 0,1-10 µM conduc la la legarea Ca2+ la molecule senzor.
Afinitatea pentru calciu a diferiților senzori de calciu este fin reglată în acest domeniu de concentrații.
Motivul EF-hand este un element de structură secundară helix loop helix care există în proteinele
ce leagă calciu. Acest motiv se găsește în perechi, pentru că astfel se asigură cooperativitatea legării Ca2+
care este necesară pentru a genera un răspuns clar la variații relativ modeste de Ca2+.
Afinitatea pentru calciu variază foarte mult în cadrul motivelor EF hand din diferite proteine
(constanta de disociere a Ca2+ pot fi între 10-5 și 10-9 M). Cele mai importante proteine senzor sunt
calmodulinele, care au circa 150 resturi de aminoacizi. Prezintă 2 domenii globulare EF separate printr-o
structură helicală flexibilă. Leagă Ca2+ cu o afinitate (KD de ordinul 10-7 - 10-6 M) care se încadrează în nivelul
concentrației intracelulare a acestui ion în majoritatea celulelor.
Afinitatea pentru Ca2+ ale domeniile N și C-terminal pot fi foarte diferite, astfel încât ocuparea unui
domeniu se face la concentrații scăzute de calciu, pe când a celuilalt domeniu numai la concentrații înalte
de Ca2+.
După legarea Ca2+ are loc expunerea unei suprafețe hidrofobe a celor 2 domenii care mediază
legarea proteinelor țintă. Catena de legătură dintre cele 2 domenii determină o variabilitate în orientarea
relativă a celor 2 domenii care reprezintă un factor critic în capacitatea calmodulinei de a interacționa cu un
număr mare de proteine țintă. Calmodulina se poate lega la proteinele țintă în moduri diferite:
a) Fie ambele domenii se încolăcesc în jurul unei regiuni a proteinei țintă
b) Domeniile interacționează cu regiuni diferite ale proteinei țintă
c) Induce dimerizarea proteinei țintă

Mecanismele prin care calmodulina reglează proteinele țintă sunt diverse, cele mai importante fiind:
1. Legarea ireversibilă a calmodulinei la proteina țintă indiferent de nivelul de Ca2+ (ex: fosforilaza
kinaza care conține CaM puternic legată și este activată de Ca2+)
2. Formarea unor complexe cu afinitate mică, inactive cu CaM la concentrații mici de Ca2+ și tranziția
la complexe active în prezența unor concentrații ridicate de Ca2+ (ex: calcineurina)
 Page 52 of 65

3. Activarea prin Ca2+ /CaM (ex: protein kinaze dependente de Ca2+ /CaM)
4. Inhibiția prin Ca2+ /CaM (ex: membri ai GPCR kinazelor și subtipuri ale receptorului pentru IP3)
În proteomul uman există peste 100 de proteine care leagă CaM. Printre acestea se numără și:
adenilat ciclaza CaM dependentă, PDE, calcineurina, CaMK, MCLK (kinaza lanțului miozinic ușor implicat în
contracția musculaturii netede).
Alți senzori de calciu
1. Proteina S100, dimerică, cu două domenii EF hand. Se asociază cu proteine care promovează
creșterea celulară, reglarea ciclului celular, transcrierea.
2. Troponina C-component al aparatului de contracție a mușchiului, prezintă 2 domenii EF. Unul din
acestea leagă Ca2+ cu mare afinitate astfel încât rămâne încărcat și în stare de repaus. Celălalt are
mică afinitate pentru Ca2+ și reglează interacția troponină C-proteine implicate în contracția
musculară.
3. Recoverina, proteină importantă în procesul vizual cu 4 structuri EF, poate exista în formă citosolică
sau asociată cu membrana și are o ancoră lipidică miristoil N-terminală. Trecerea din formă liberă în
formă asociată cu membrana este reglată de Ca2+. În absența Ca2+ recoverina se găsește într-o
conformație în care restul miristoil este ascuns în interiorul proteinei. După legarea Ca2+ au loc
modificarea conformației și coada lipidică este expusă și se poate asocia cu membrana

DAG ca molecule semnalizare

După scindarea fosfatidil inozitol 4,5 difosfat sub acțiunea PLC se formează DAG, imobilizat de
membrană și IP3 difuzibil.
• DAG rămâne legat de membrana plasmatică și este o sursă importantă pentru eliberarea acidului
arahidonic sub acțiunea PLA2
• DAG stimulează PKC. De fapt PKC este modulată de Ca2+, DAG și fosfatidil serină.

Alți mesageri lipidici

Ceramidele sunt mesageri lipofili care reglează diferite căi de semnalizare: apoptoza, răspunsul la
stres, senescență și diferențiere celulară. În cele mai multe cazuri, efectele ceramidelor sunt antagonice cu
creșterea și supraviețuirea celulară. Ceramidele se formează:
1. Prin sinteză de novo
2. Din sfingomielină sub acțiunea sfingomielinazei care scindează legătura alcool-fosfat. Activarea
sfingomielinazei se realizează ca răspuns la iradiere, expunere la agenți ce afectează ADN sau tratament cu
TNFα.
Ceramidele sunt agenți apoptogenici potenți. Acestea și ceramid -1- fosfații produși sub acțiunea
sfingomielinazei sunt mesageri localizați în membrană care activează ținte în aval: protein kinaza
 Page 53 of 65

N-terminală c-Jun și protein fosfatazele 1 și 2. Activarea fosfatazelor inactivează subtipuri ale PKC și
proteina supresor tumoral de retinoblastom pRB. Ceramidele au efecte opuse față de DAG. DAG stimulează
creșterea celulară via PKC, pe când ceramidul este inhibitor potențial al creșterii celulare
Acidul lisofosfatidic (LPA) este mesager extracelular. Poate funcționa ca hormon și servește pentru
comunicarea dintre celule. LPA este eliberat de plachetele sangvine și alte tipuri celulare. Este produs al
procesului de coagulare a sângelui și este un constituent important al serului la nivelul căruia se găsește
legat de albumină. LPA se leagă la GPCRs specifici din multe celule. Receptorul pentru LPA poate transmite
semnalul la proteine Gq, Gi sau G12. Dacă este implicată Gq, se formează IP3 și Ca2+. Conducerea semnalului
via Gi sau G12 se face prin calea Ras sau activează proteina Rho.
NO ca moleculă semnal (oxidul nitric)
NO este un mesager universal care se găsește în aprope toate celulele vii. Participă la comunicarea
inter și intracelulară la toate EK vegetale și animale și bacterii. NO este un radical liber cu viață scurtă care
rezultă ca urmare a acțiunii unor enzime specifice activate de semnale extra și intracelulare. Este sintetizat
intracelular și ajunge la molecule efector, care pot fi localizate in aceeași celulă sau în celulele învecinate
prin difuzie. NO este și implicat în patogeneza bolii Alzheimer și atac vascular.
Spre deosebire de mesagerii extracelulari, traducerea de semnal via NO implică reacțiile redox care
au loc prin modificări covalente ale proteinelor țintă, de regulă reversibile și tranzitorii, care duc la
modificarea activității biologice.
Reactivitatea NO
NO este hidrosolubil și poate traversa membranele aproximativ liber prin difuzie. Are un timp de
viață în soluție apoasă de 1-5 s. NO acționează prin forma sa radicalică, prin forma oxidată (NO+ ) și redusă
(NO- ) conducând la nitrozilare (adiționare de NO), nitrozare (adiționare de NO+ ) și nitrare (adiționare de
NO2 ) a biomoleculelor.
Principalele ținte sunt grupările SH ale proteinelor, glutation și cisteină liberă, aminoacizii cu catenă
laterală ce conțin N și centrele cu ioni metalici ale proteinelor. Produșii de reacție:
• S-nitrozil (S-NO)
• N-nitrozil (N-NO)
• Metal-nitrozil (Mex+ -NO)
Reprezintă formele bioactive ale NO în care NO poate fi schimbat și transportat acolo unde în
formă liberă este greu detectabil.

NO format în reacția catalizată de NO sintază (NOS) nu reacționează cu catenele laterale ale

proteinelor ci se crede că reacționează cu centrele cu ioni metalici din proteine sau cu O2 sau O2-.
În prezența O2 se formează NO2 și N2 O3 care generează ionul nitrozil NO+, responsabil pentru S- sau
N-nitrozilare. În prezența O2- generează peroxinitritul ONOO- care conduce la nitrarea Tyr.
Natura compușilor cu azot oxidați în proteinele țintă depinde de starea redox a țesutului.
NO se formează din Arg în prezența NOS. Citrulina și arginina sunt intermediari ai ciclului ureei și
arginina poate fi regenerată din citrulină în cadrul acestei căi metabolice.
 Page 54 of 65

NOSs au masă moleculară de circa 300 kDa și sunt active ca dimeri, dar există și sub formă de
monomeri inactivi.
Există 3 tipuri majore de NOSs:
• Neuronală (nNOS sau NOS I)
• Constitutiv endotelială (eNOS sau NOS III)
• Inductibilă (iNOS sau NOS II)
Enzimele constitutive nNOS și eNOS necesită Ca2+ și Ca2+/calmodulină pentru activitate și pot forma
cantități scăzute (de ordinul pM) de NO. Datorită dependenței de Ca2+, aceste enzime răspund la o serie de
stimuli extracelulari și intracelulari care eliberează Ca2+.
NOS constitutive pot fi fosforilate și
nitrozilate în prezența NO exogen și se găsesc în
situsuri intracelulare specifice. De aceea produc
NO într-o manieră înalt compartimentalizată și
localizată.
NOS inductibilă este Ca2+ independentă
și este reglată în principal la nivelul expresiei
genice. iNOS poate fi indusă de :
• Citokine proinflamatorii (TNFα, IFNγ, IL-
1β)
• Lipopolizaharide bacteriene
iNOS produce NO în concentrație de
ordinul nM câteva ore după expunere. O mare
parte a reglării transcripționale a iNOS este
mediată de NF-kB.

Funcția fiziologică a nitrozilării

Are o funcție de apărare atunci când se produce la nivel moderat. Producerea excesivă a NO are
efecte toxice și este folosită de celulele de mamifere pentru acțiune antimicrobiană. Nitrozilarea vizează
centrele cu ioni metalici din proteine sau grupările tiol ale resturilor de cisteină din proteinele țintă.
 Page 55 of 65

Nitrozilarea guanilat ciclazei

Guanilat ciclaza, enzimă citoplasmatică activată de NO de circa 200 ori conține hem și est un
receptor heterodimeric al NO. Modul în care NO activează guanilat ciclaza nu est încă elucidat. Creșterea
nivelului de cGMP determină stimularea protein kinazelor dependente de cGMP care au drept substrate
PI3K și fosfatazele. De asemenea, cGMP deschide canalele de Na+ și Ca2+ modulate de cGMP care joacă rol
important în fototraducere și neurotransmisie. Ca urmare a acestei acțiuni crește nivelul Ca2+ cu consecințe
biochimice extinse.

Nitrozilarea hemoglobinei
NO se leagă la centrul cu ion metalic și
determină S-nitrozilare. α2 β2, fiecare catenă de globină
conține câte o moleculă de hem și β globinele conțin
câte un rest de Cys (Cys 93) reactiv. Inițial NO se leagă la
Fe2+ din hem și apoi la Cys 93. La presiune parțială de
oxigen ridicată, Hb este oxigenată (în stare R) și toate
grupările hem sunt ocupate de O2 și este favorizată
legarea NO la Cys 93. La pO2 scăzută Hb este în stare T,
formarea HbSNO este defavorizată și NO este cedat în
microcirculație. Astfel, în țesuturile neoxigenate se
elibereaza NO, ceea ce determină relaxarea vaselor și
accelerarea vitezei de curgere a sângelui. Eliberarea NO
din Hb-SNO pare a fi mediată de proteina schimbătoare
de anioni AE1 din membrana hematiilor care acceptă
direct NO.

Funcțiile reglatoare ale S-nitrozilării

S-nitrozilarea reglează o serie de procese fiziologice: Homeostazia vasculară, Transportul
membranar vectorial, Neurotransmiterea, Raspunsul imun celular, Apoptoza,Transcrierea genelor.
S-nitrozilarea aberantă este implicată în patogeneza: artritei, diabetului, șocului septic, accidentelor
vasculare și astmului. S-NO este un semnal bazat pe reacții redox specifice bazate pe modificări unui singur
rest de Cys din proteinele țintă.
Selectivitatea S-nitrozilării este realizată datorită:
• Distribuției subcelulare a NOS
• Contextului de secvență a Cys în proteina țintă. Astfel s-au identificat 2 motive de nitrozilare:
1. Cys este localizată între un aminoacid bazic și unul acid la nivelul structurii primare sau terțiare
2. Cys este localizată într-o zonă hidrofobă.
Menținerea nitrozilării depinde de formarea și îndepărtarea acestei modificări post-translaționale.
Se pare că nitrozilarea se transferă de la proteine la GSH cu formarea de glutation S-nitrozilat care
apoi degradat sub acțiunea glutation S-nitrozilat reductaza.
Proteina 1-SNO + GSH↔GSNO + Proteina 1
GSNO+2NADH+2H+ +GSH↔GSSG+ NH3 + 2NAD+ + H2 O (slide 65 – table)
Dintre toate proteinele țintă pentru S-nitrozilare, NF-kB stimulează transcrierea tuturor NOSs, iar
S-nitrozilarea NF-kB inhibă activarea transcrierii. Un punct de atac crucial pentru NO în semnalizarea prin
NF-kB este IkB/IkB kinaza care controlează activitatea NF-kB. Inhibitorul IkB se leagă la NF-kB și îl
sechestrează în citoplasmă. O serie de stimuli induc fosforilarea IkB sub acțiunea IkB kinazei ceea ce
conduce la ubichitinarea IkB și degradarea sa proteosomală, permițând translocarea nucleară finală a NFkB.
 Page 56 of 65

Subunitatea catalitică a complexului IkB kinazei este subiect al S-nitrozilării unui rest specific de Cys și
această modificare inhibă fosforilarea IkB și deci activarea NFkB.
Acțiunea toxică a NO și stresul de nitrozilare
Atunci când NO este format în exces și într-un mod mai puțin reglat, de ex. prin inducerea iNOS în
timpul inflamațiilor sau infecțiilor bacteriene, au loc reacții nespecifice la nivelul proteinelor, lipidelor și
ADN. Astfel ia naștere stresul nitrozilant analog stresului oxidativ. NO reacționează cu O2- formând
peroxinitrit care nitrează țintele celulare, formând în special 3-nitro-tirozina. Împotriva acestui stres
nitrozilant acționează GSH. Stresul nitrozilant este însă benefic împotriva infecțiilor microbiene, pentru că
NO interacționează cu centrele cu ioni metalici și resturile de Cys din proteinele microbiene.

Protein kinazele și protein fosfatazele Ser/Thr specifice CURS 6

Fosforilarea reversibilă a catenelor laterale ale aminoacizilor este procesul cel mai folosit pentru
reglarea activității enzimelor și proteinelor de semnalizare. Prin aceasta protein kinazele și protein
fosfatazele joacă un rol esențial:
 Reglarea metabolismului
 Reglarea expresiei genice
 Reglarea creșterii, diviziunii și diferențierii celulare
Aproape toate căile de semnalizare folosesc fosforilarea proteinelor pentru a crea și a conduce
semnale.
Clasificarea și funcția protein kinazelor
Ser/Thr kinazele și Tyr kinazele sunt cele mai
importante. Mai sunt și alte proteine kinaze care
fosforilează și alți aminoacizi, dar sunt de importanță
minoră. În funcție de aminoacizii acceptor există 4 clase
de protein kinaze.
Esterii fosfat formați pe proteine prin acțiunea
protein kinazelor sunt modificări stabile care necesită
pentru îndepărtarea lor acțiunea protein fosfatazelor.
Fosforilarea prin acțiunea protein kinazelor influențează
funcția, activitatea și localizarea subcelulară a
substratelor proteice în modurile următoare:
• Inducerea modificărilor conformaționale prin
mecanisme alosterice
• Interferența directă cu legarea substratului sau
cu alți parametri de legare, de ex. izocitrat
dehidrogenaza.
• Crearea unor situsuri de legare pentru molecule efector. De ex. Legarea p-Tyr la domeniul SH2 și
PTB (domeniu de legare a fosfotirozinei).
Pe baza secvenței și structurii, protein kinazele Ser/Thr și Tyr specifice formează o superfamilie
strâns înrudită, distinctă de histidin kinaze și alte proteine cu acțiune fosfotransferazică. Din punct de
vedere al secvențelor domeniilor catalitice există diferențe între Ser/Thr kinaze și Tyr kinaze
Clasificarea Ser/Thr Kinazelor (slide 6 – tabel)
În afara acestor subfamilii există protein kinaze cu o specificitate dublă, care pot fosforila resturi de
Ser/Thr și Tyr. Un exemplu de astfel de protein kinazeă este MAPK kinaza (kinaza protein kinazei activate de
mitogene).
 Page 57 of 65

Există de asemenea protein kinaze Ser/Thr specifice care sunt parte integrală a receptorilor
transmembranari (TM) sau a canalelor ionice. Astfel receptorul pentru factorul de creștere transformant β
(TGF-β) prezintă o activitate Ser/Thr protein kinazică în partea citoplasmatică a polipeptidei TM. De
asemenea, unii membri ai canalelor TRP (transient receptor potential chanel) prezintă o activitate protein
kinazică la nivelul părții citoplasmatice a proteinei canal, esențială pentru funcția canalului. Canalele TRP
modulează intrarea Ca2+ în celulele EK ca răspuns la semnalele externe. Activitatea sa protein kinazică
localizată la nivelul domeniului citoplasmatic și se autofosforilează și apoi fosforilează alte proteine la
resturi de Ser/Thr.
Structura și reglarea protein kinazelor
Mecanismul catalitic, proprietățile structurale și mecanismele controlului kinazic sunt foarte
similare pentru cele 2 tipuri de protein kinaze (Ser/Thr și Tyr).
Funcția catalitică comună este fosforilarea covalentă a proteinelor substrat prin transferul grupării
γ fosfat din ATP la gruparea OH a Ser/Thr/Tyr. Această funcție catalitică este localizată în domeniul catalitic
ce conține circa 270 resturi de aminoacizi iar resturile catalitice sunt înalt conservate în cele 2 familii de
protein kinaze. Structura domeniului kinazic prezintă 2 lobi legați printr-o balama flexibilă. Centrul catalitic
este format din resturi de aminoacizi din ambii lobi. (slide 9 – schema)
Jucătorii cheie în reacție sunt:
• Aminoacizii cu caracter acid necesari pentru stabilizarea stării de tranziție și activarea grupării OH ai
aminoacizilor acceptor pentru atac nucleofilic asupra γ-fosfatului
• Unul din cei 2 ioni metalici care coordinează γ fosfatul din ATP ajută la fixarea ATP și stabilizează
sarcinile negative în stare de tranziție.
• Aminoacizii bazici care servesc pentru a stabiliza sarcinile negative în starea de tranziție și
îndepărtarea ADP.
Elementele structurale principale ale protein kinazelor
Protein kinazele Ser/Thr și Tyr specifice adoptă o conformație comună cu domeniul tirozin kinazic.
Elementele structurale ale protein kinazelor sunt:
1. P-loop: buclă bogată în glicină din lobul N-terminal. Această buclă se găsește în formă similară în
proteinele Gα și este necesară pentru ancorarea resturilor fosfat ale ATP
2. Lobul N-terminal conține 5 β structuri și un α helix numit helix C. În conformațiile celor mai active
protein kinaze restul E91 (Glu 91) din helixul C formează o punte salină cu Lys (K72), permițând o
poziționare optimă a fosfatului ATP. Mecanismele reglatoare adesea modulează activitatea kinazică
prin alterarea conformației helixului C, afectând integritatea acestor interacții.
3. Bucla catalitică este localizată la baza situsului catalitic și conține un rest conservat de Asp (D166)
care se presupune că este rest catalitic. În această buclă se găsește și un rest de Asn (N171)
4. Segmentul de activare cu bucla de activare. Structura primară a segmentului de activare prezintă 2
motive tripeptidice conservate (DFG....APE) în cadrul lobului mare. Restul D184 din motivul
conservat DFG este implicat în legarea ionului metalic la ATP. Bucla de activare prezintă diversitate
structurală considerabilă și plasticitate conformațională și este unul din cele mai importante
elemente de control pentru activitatea protein kinazelor. În multe kinaze, bucla de activare este
situsul de fosforilare reglatoare sau de interacție cu modulatorii. Resturile de Ser/Thr sau Tyr din
bucla de activare pot fi fosforilate ca răspuns la semnalele de activare și această fosforilare
promovează o activitate mărită a kinazelor.
Adeseori, în starea inactivă a protein kinazelor, bucla de activare colapsează în situsul
catalitic activ și blochează legarea substratelor. După fosforilare, se îndepărtează de centrul catalitic
activ și adoptă o conformație deschisă ce permite legarea substratului și actul catalitic.
Critică pentru această modificare de conformație este interacția electrostatică dintre un
rest fosfat din buclă și un buzunar bazic care conține motivul Arg-Arg conservat în kinazele reglate
 Page 58 of 65

prin fosforilare. Pentru unele protein kinaze (MAPKs) fosforilarea buclei de activare facilitează
homodimerizarea kinazei necesară pentru localizarea nucleară a enzimei.
5. Elementul autoinhibitor. Multe protein kinaze conțin elemente autoinhibitoare care fixează o
conformație inactivă prin legare intramoleculară la situsul de legare a substratului. Datorită faptului
că nu prezintă resturi de aminoacizi ce pot fi fosforilate, aceste elemente se mai numesc
pseudo-substrate.
Elementele autoinhibitoare pot fi localizate pe aceeași polipeptidă cu domeniul kinazic sau
pot fi prezente pe o subunitate separată a unei kinaze oligomerice. De asemenea, o ancoră
N-terminală de acid miristic poate participa la autoinhibiție. (slide 16, 17 – scheme)

Legarea și recunoașterea substratului

Specificitatea de acțiune a protein kinazelor este dată de vecinătatea resturilor de Ser/Thr/Tyr.
Fiecare subfamilie este caracterizată de necesități diferite referitoare la vecinătățile resturilor ce urmează a
fi fosforilate. În multe secvențe de fosforilare există mai multe resturi de Ser/Thr astfel încât este posibilă
fosforilarea cooperativă și multiplă la nivelul unui segment. Astfel, ARN Pol II conține la capătul C-terminal
52 de copii ale secvenței heptamer YSPTSPS ca situsuri potențiale de fosforilare.
În plus față de contextul secvenței situsurilor de fosforilare, există și alte părți structurale ale
proteinelor substrat care contribuie la legarea substratului. Astfel, cuplarea unei protein kinaze cu
substratul proteic poate fi realizat via părțile structurale localizate departe de situsurile de fosforilare și de
situsul de legare a substratului la kinază.
Un alt determinant major al creșterii specificității reacției kinazice este colocalizarea protein
kinazelor și a substratelor lor. Doar substratele ce au fost translocate la situsuri subcelulare specifice vor fi
fosforilate de protein kinaze.
Situsul de legare a substratului peptidic este localizat la capătul C-terminal al protein kinazelor.
Substratul peptidic este contactat prin interacții multiple, la capetele N- și C-terminale.
Pentru multe protein kinaze, de tipul receptorului pentru insulină și CDK2, nu există un situs de
legare a proteinei în forma inactivă a kinazei. Numai după fosforilarea buclei de activare, urmată de
modificarea conformațională, se formează un situs de recunoaștere a substratului la nivelul acestor kinaze.
Controlul activității protein kinazelor
Protein kinazele pot exista în forme activă și inactivă și datorită acestui fapt sunt comutator în căile
de semnalizare. În general, protein kinazele se găsesc în starea off în care activitatea este minimă. După
receptarea semnalelor specifice acestea sunt convertite în starea on cu activitate maximă. Structurile
protein kinazelor conțin mai multe elemente flexibile care pot adopta conformații active sau inactive.
Starea activată a protein kinazelor este caracterizată de următoarele caracteristici:
• Cei 2 lobi sunt apropiați
• Molecula de ATP este îngropată între cei 2 lobi și acesta fosforilează bucle P
• Helixul C este poziționat pentru formarea legăturii ionice cu β structura din lobul N-terminal
• Situsurile de legare pentru substratele peptidice și ATP sunt complet accesibile
• Bucla de activare fosforilată se deplasează de la nivelul situsului activ și adoptă o conformație
extinsă, care ajută la organizarea resturilor catalitice pentru transferul optim al grupărilor fosfat
Spre deosebire de conformațiile active, care sunt similare indiferent de protein kinază, conformațiile
inactive sunt diverse. Stările inactive sunt caracterizate de o conformație mai deschisă a celor 2 lobi ceea ce
împiedică orientarea optimă a resturilor de aminoacizi implicate în legarea substratului și actul catalitic.
Stabilizarea stării inactive se realizează prin:
• Legarea inhibitorilor protein kinazelor
• Fosforilarea inhibitorie
• Legarea subunităților reglatoare (PKA)
 Page 59 of 65

• Autoinhibiție: un element autoinhibitor adoptă o conformație care induce alinierea improprie a

resturilor catalitice și blochează legarea substratului

Pentru activarea kinazelor:

1. Legarea subunităților activatoare (de ex. Cicline)
2. Legarea mesagerului chimic concomitent cu
eliberarea subunităților inhibitorii
3. Legarea cofactorilor Ca2+/CaM, DAG, AMP,
fosfolipide
4. Fosforilarea buclei de activare
5. Defosforilarea situsurilor fosforilate inhibitorii
6. Modificări în starea de oligomerizare a kinazei ca
o consecință a legării ligandului la domeniul
extracelular al protein kinazei TM
7. Legarea substratului fosforilat
Controlul activității kinazelor:
a) Existența subunității reglatoare (activatoare
și/sau inhibitoare)
b) Degradarea kinazelor sau a subunităților
reglatoare în calea proteosomală
c) Activarea protein kinazelor în amonte care
fosforilează situsuri reglatoare (de ex. bucla activatoare)
d) Activarea protein fosfatazelor în amonte
e) Legarea liganzilor extracelulari la protein kinaze TM
f) Mesageri secundari (Ca2+, DAG)
g) Legarea unor metaboliți (AMP/ATP)
h) Colocalizarea kinazelor și substratul lor

Reglarea fosforilării proteinelor prin localizare subcelulară și subunități specifice de adresare

Multe substrate ale protein kinazelor se găsesc asociate de membrane sau particule. Pentru ca
protein kinazele și fosfatazele să își îndeplinească funcția fiziologică într-o cale de semnalizare, acestea
trebuie să fie translocate la situsul celular unde se găsește substratul. Prin restricționarea acțiunii acestor
două clase de enzime la situsuri celulare distincte sunt îmbunătățite persistența, amplitudinea și raportul
semnal/zgomot.
Adresarea subcelulară a acestor enzime este adeseori mediată de subunitățile lor reglatoare care
interacționează specific cu proteine scaffold, adaptor sau de ancorare la situsuri celulare specifice. Astfel,
proteinele membranare, receptorii TM, canalele ionice sau proteinele de citoschelet pot constitui ținte de
ancorare. Subunitățile reglatoare funcționează ca un mijloc de localizare care determină în care situs celular
acestea au acces la substrate. (slide 27 – schema)

PKA
Această protein kinază cAMP-dependentă a fost clasificată ca aparținând superfamiliei AGC kinazelor, care
conține:
o PKA
o PKB (numită și Akt kinaza)
o PKC
o PKG (kinaza cGMP- dependentă)
 Page 60 of 65

ACG kinazele au o structură similară a domeniului catalitic și sunt reglate în manieră similară prin
fosforilarea buclei de activare.
PKA este implicată în reglarea metabolismului glicogenului, lipidelor, zaharurilor, a canalelor ionice.
De asemenea, intervine în modificările pe termen lung la nivelul sinapselor, în transcrierea genelor care
prezintă elemente responsive la cAMP în regiunea lor control. O creștere a nivelului cAMP activează PKA,
care fosforilează factorul de transcriere CREB (cAMP responsive element (CRE)-binding protein) la Ser 133.
CREB se leagă numai la coactivatorul transcripțional CBP (CREB-binding protein) în stare fosforilată și
activează transcrierea genelor țintă.
Structura și specificitatea de substrat a PKA
Activitatea PKA este în primul rând controlată de cAMP. (imagine inainte de cGMP)
Consecutiv legării cAMP, subunitatea R suferă o modificare conformațională în urma căreia
afinitatea între R și C este redusă cu un factor de 104 - 105. Activitatea completă a C necesită fosforilarea
unui rest de Thr 197 în bucla de activare și această fosforilare este de asemenea necesară pentru interacția
cu R.
La mamifere, s-au descris 4 izoforme pentru R (RIα, RIβ, RIIα, RIIβ) și 3 subtipuri de C (Cα, Cβ, Cγ).
Existența unor subunități R și C multiple cu diferite trăsături biochimice permite formarea holoenzimelor cu
caracteristici biologice diferite care contribuie la specificitatea și variabilitatea semnalizării prin PKA.
Rs au o structură modulară similară. Prezintă la capătul N-terminal un domeniu de dimerizare care
formează un mănunchi de 4 helixuri care constituie o suprafață de acostare pentru proteinele care
ancorează kinazele A (AKAPs). La capătul C terminal al fiecărui protomer se găsesc 2 situsuri tandem care
leagă cAMP cu afinități diferite. În plus, subunitățile RII prezintă o regiune flexibilă care conține o secvență
autoinhibitorie. Această regiune mimează substratul și se leagă la situsul activ din subunitatea catalitică și
împiedică accesul substratului real.
Subunitatea C prezintă un rest de acid miristic cu funcție încă necunoscută la capătul N-terminal și
prezintă la capătul N-terminal și prezintă o pliere kinazică tipică. Subunitatea C are situsuri specifice de
fosforilare la nivelul Ser/Thr, adică Thr 197 și Ser 338. Thr 197 este localizată în bucla de activare și este
fosforilată printr-un mecanism de autofosforilare.
Secvența consens pentru fosforilare prin PKA este RRXSX. Subunitatea RII conține o asemenea
secvență și de aceea poate fi subiectul fosforilării sub acțiunea subunității C în cadrul holoenzimei, dar făară
anularea inhibiției. (slide 32 – schema)
Reglarea activității PKA
Activitatea PKA poate fi controlată prin următoarele mecanisme modulate temporal și spațial:
1. Modificări în concentrația cAMP. În multe țesuturi, o creștere de 2-3 ori a concentrației de cAMP
este suficientă pentru a determina efectul fiziologic maxim. PKA este controlată prin feedback
control de cAMP fosfodiesteraza. PKA activată fosforilează și activează PDE care hidrolizează cAMP
la AMP. Acest mecanism permite PKA să controleze propria activitate. Asigura ca atunci când se
diminuează semnalul extern, semnalul de cAMP scade rapid.
2. Legarea proteinelor inhibitoare. Există trei inhibitori naturali ai PKA. De exemplu, PKI este implicată
în transportul subcelular al subunităților C și este considerată un reglator major al activității C.
3. Adresarea la situsuri subcelulare prin AKAPs. Având în vedere că PKA este activată de o mare
varietate de semnale externe, se pune întrebarea cum se realizează specificitatea PKA în celulă,
dincolo de modelul izoenzimatic, fosforilarea diferențială și legarea inhibitorilor.
Compartimentalizarea specifică a PKA este recunoscută a fi un determinant major pentru
specificitatea PKA. Prin legarea la situsurile subcelulare prin AKAPs izoenzimele PKA sunt asamblate
la situsuri distincte în vecinătatea substratelor.
Cele mai multe interacții dintre AKAPs și holoenzimee PKA sunt mediate de RII.
 Page 61 of 65

AKAPs
Creșterea cAMP și activarea PKA sunt însoțite, în multe cazuri, de o modificare a localizării
subcelulare a holoenzimelor PKA ce conțin RI sau RII. Exista circa 50 de membri ai AKAPs. AKAPs
imobilizeaza izoformele PKA la diferite situsuri specifice celulare prin subunitățile R. Legarea cAMP la Rs
eliberează C care fosforilează substratele în imediata vecinătate. De asemenea, subunitățile catalitice
eliberate pot fi transferate în alte compartimente celulare. Unele AKAPs sunt puncte de asamblare focală la
GPCRs și canale ionice. Izoformele AKAP250 și AKAP79 sunt proteine scaffold versatile care prezintă situsuri
de legare pentru multe proteine de semnalizare. Cele două sunt ele însele reglate prin fosforilare.
Complexul AKAP 250/79 se poate asocia cu:
 Rs ale PKA-PKC
 PP2B-calcineurina
 Receptorul β2 adrenergic
 Src kinaza
 GPCR kinaza 2
AKAPs conțin motive de
adresare care le direcționează către
determinanți specifici subcelulari sau la
receptori TM sau canale ionice. De ex.,
AKAP denumită Yotiao direcționează
PKA II și PP1 spre receptorii pentru
N-metil-D aspartat (NMDA).
Posibilitatea de a aduce PKA și
alte molecule de semnalizare în același
loc în celulă poate determina o reglare
coordonată și stratificată a activităților
într-un complex multiproteic ancorat în
jurul unui GPCR la un situs subcelular.
 Page 62 of 65

Calea fosfatidil inozitol-3-kinazei (PI3K)/Akt (de aici=caiet+slide 39-54)

Realizează fosforilarea fosfatidil inozitol difosfatului la fosfatidil inozitol trifosfat ce este mesager
secundar recunoscut de domeniul PH din o serie de proteine. În funcție de tipul de proteine care
interacționează cu fosfatidil inozitol 3,4,5 trifosfat (PI3P) semnalul biologic rezultat poate fi: creștere
celulară, proliferare, efect antiapoptotic.
În aval PI3K interacționează cu AKT kinaza iar alterări în această cale de semnalizare se întâlnesc în
cancer. Multe funcții fiziologice mediate de insulină utilizează calea PI3K/AKT fiind implicată în
metabolizarea glucozei.
Această cale funcționează în citosol și nucleu, PI3K catalizează fosforilarea în poziția 3’ a
inozitolului, inozitol 4,5 difosfatului.
Familia PI3K conține 15 membri care diferă prin specificitatea asupra substratului, natura
subunităților asociate și modul de reglare, fiind grupați astfel în 3 subfamilii. Cel mai bine caracterizată este
prima subfamilie în care subunitatea C este reprezentată de (P110). Această subfamilie cuprinde izoformele
P110α, P110β, P110γ, P110δ. Aceste izoforme pot fi activate prin acțiunea unor TK sau prin acțiunea unor
hormoni care interacționează cu GPCR (receptori cuplați cu proteina G). Celelalte 2 subfamilii joacă rol
cheie în traficul celular. Toți membrii primei subfamilii sunt asociați cu o proteină care joacă rol adaptor în
procesul de traducere a semnalului.
Izoforma P110α este cea mai studiată fiind un heterodimer cu subunitatea catalitică 110α și
subunitatea reglatoare P85α (ce prezintă două domenii SH2, două domenii SH3, două domenii bogate în
prolină, aceste domenii funcționează ca module de legare de alte proteine).
Izoforma P110γ este stimulată de interacția βγ și are propria sa subunitate reglatoare.
Pentru PI3K din creier la nivelul domeniului C (catalitic) s-a detectat pe lângă o activitate lipid
kinazică (LK) și una protein kinazică, astfel PI3K poate produce un semnal bifurcat, pe de o parte datorită LK
este stimulat AKT kinaza iar datorită PK este stimulată activitatea MAPK.
PI3P pe lângă creștere mai stimulează și sinteza glicogenului și chemotaxia. Acest lipid trifosforilat
este în cantitate nedecelabilă în celule nestimulate dar în celule stimulate nivelul său crește rapid
concomitent cu translocarea PI3K la membrană.
Activitatea PI3K se realizează prin trei mecanisme:
1. Interacția cu receptori TK activați
2. Interacția cu receptorii pentru insulina mai ales cu substratele receptorului pt insulină
3. Interacția cu proteine RAS (PI3K este proteină efector a proteinei RAS în acest caz).

Dimerii βγ sunt obținuți prin activarea GPCR.

Efectorul în aval este PK AKT sau PKB, există 3 izoforme de AKT fiecare conținând 3 domenii
(domeniu PH, domeniu K, domeniul reglator). Activarea AKT se realizează prin interacția PI3P la domeniul
PH, în urma acestei interacții are loc o modificare de conformație care determină expunerea restului de
treonină care este fosforilată sub acțiunea fosfoprotein kinazei dependentă de fosfoinozite (PDK1).
În calea de semnalizare AKT un FC (PDGF) activează receptorul TK TM corespunzător, având loc
fosforilarea la nivel citosolic al RTK (receptorilor tirozin kinazici), interacția cu resturile de fosfotirozină
determină activarea PI3K rezultând PI3P care este recunoscut de domeniul PH al PDK1 care devine activă,
fosforilează AKT care la rândul ei devine activă și este ancorată la membrană prin PI3P, AKT acționează apoi
asupra proteinelor țintă. Calea AKT este folosită pentru prevenirea apoptozei, promovarea proliferării
celulare, deci AKT este o oncogenă și substrate sunt FT, procaspaza 9, MDM2.
Calea PI3K/AKT activată de insulină modulează multe efecte metabolice, sinteza glicogenului,
proteinelor, metabolismul glucozei, transportul celular, metabolismul lipidelor.
 Page 63 of 65

Modulator negativ în acest caz (calea de semnalizare AKT) este fosfolipaza PTEN ce diminuează PI3P
și are efect proapoptotic/antiproliferativ în concordanță cu observația că la nivelul multor tumori enzima
este inactivă din punct de vedere funcțional.
PKC
Descrie 12 subtipuri în 3 subfamilii în funcție de domeniul reglator care determină sensibilitatea la
cofactori: DAG și calciu.
1. Subfamilia PKC clasice, conventionale, activate de calciu, DAG și forbol esteri
2. Subfamilia PKC noi, fiind activate de calciu dar nu si de DAG și forbol esteri
3. Subfamilia PKC atipice, calciu dependente necesită proteine activator
Din punct de vedere structural toți membrii prezintă o singură catenă polipeptidică cu masă moleculară de
68 și 83 kDa. Izoformele PCK cu specificități diferite au și localizare diferită. Izoformele α, δ sunt găsite în
aproape toate țesuturile, altele doar în țesuturi specializate.
Din PKC atipice 1 sg motiv C1 și un singur motiv Cys care nu este capabil să lege DAG și forbol
esterii.
În cadrul domeniului reglator (PKC clasice), subdomeniile C1 și C2 (consevat) – C1 prezintă secvență
pseudosubstrat care se leagă în cadrul structurii tridimensionale la centrul catalitic activ și menține enzima
în stare activă, în absența cofactorilor, se găsesc 2 motive bogate în Cys care leagă zinc și mediază legarea
DAG și forbol esterilor.
Subdomeniul C2 conține 120 resturi de AA și leagă fosfolipidele în manieră dependentă de calciu și
deci activarea domeniului kinazic adiacent. C2 și la PLC2 mediază interacții proteină proteină.
Forbol esterii sunt promotori tumorali, activatori ai PKC clasice, se leagă la subdomeniul C1, induc
atașarea membranară (exemplu tetradecanoil forbol acetat – asemănător DAG). În prezența forbol esterilor
au loc fosforilări nedorite a proteinelor ce duce la dereglarea proliferării celulare. În celulele mamiferelor au
fost descoperite proteine α și β chimerine care nu au activitate kinazică dar care fixează forbol esterii și
DAG cu afinitate mare.
PKC sunt activate prin cofactori pentru că aceștia, de fapt, determină reprimarea autoinhibiției
domeniului catalitic, astfel are loc o modificare conformațională care stabilește subunitatea catalitică în
conformație activă. Cofactorii promovează legarea PKC la membrană, reglarea activității PKC se realizează
la nivelul de efector prin semnalul de fosforilare și prin reglarea la proteine care pot avea funcție
enzimatică, proteinele scaffold sau proteine adaptor.
Diferite subtipuri de PKC sunt sensibile la diferite semnale (reacționează la semnale în mod diferit).
Principalii modulatori ai PKC fiind calciu (nivelul nu crește numai sub acțiunea PLC cât și prin
deschiderea canalelor de calciu activate de liganzi) și DAG ce mediază legarea PKC la membrană.
Toate subtipurile de PKC conțin mai multe situsuri de fosforilare la nivelul resturilor de serină.
Fosforilarea esențială pentru activarea completă PKC, este fosforilarea de PDK1 (activată de PI3P, mai
activează și PKA).
PDK1 prezintă rest de Tyr la nivelul domeniului catalitic plus autofosforilare la 2 situsuri care se află
lângă capătul carboxi-terminal al PKC. Unul dintre situsuri se află în zona hidrofobp, enzima se desprinde de
pe membrană în urma unei astfel de fosforilări.
PKC izoforma δ și ε se fosforilează la Tyr de către TK fără funcție de receptor din familia Src și Lyn.
Există o serie de proteine care interacționează cu PKC în timpul transmiterii semnalului și determină
direcționarea PKC spre compartimente intercelulare, spre substrate pentru PKC. Localizarea intracelulară
este diferită fiind dată de proteinele care interacționează cu PKC, exemplu RACK, interacția dintre RACK și
PKC prin domeniul C2 dar RACK interacționează și cu alte proteine ancorate în membrană (SrcK).
Funcțiile reglate de PKC – proliferarea celulară, transportul, migrare, reorganizare schelet,
imunitate, apoptoză, memorie (dezvoltarea memoriei)
MARCKS – proteine bogate în Ala și miristoilate implicate în formarea citoscheletului.
 Page 64 of 65

CaM-Kinaze dependete de calciuCaM (calciu calmodulină) pot fi specializate sau multifuncționale

(specializate – fosforilează lanțul ușor de miozină MLCK astfel controlează contracția musculaturii netede
prin fosforilarea substratului)
4 subfamilii CaMK – tipul 2 sunt ezime oligomerice, din subfamilia 1 și 4 găsim enzime monomerice
și fosforilate sub acțiunea KCaMK, (din subfam 1,4 – fosforilează adenilat ciclaza și o serie de factori de
transcriere)
CaMK2 prezintă 2 inele, fiecare inel din 6 monomeri, inelele hexamerice se asociază cu formarea
unui cilindru, fiecare inel conține câte 6 copii ale monomerului α, β, γ, δ. Domeniile catalitice sunt orientate
spre exterior iar cele de asociere formează un miez central al fiecărui inel. În absența calmodulinei
domeniul catalitic este în stare de autoinhibiție; prin legarea calmodulinei la nivelul domeniului reglator,
domeniul catalitic se eliberează din structura împachetată și realizează transfosforilarea la nivelul
subunității adiacente, la restul de treonină. Odată ce această fosforilare are loc la 2 subunități din inel,
CaMK ajunge să fie activă într-o stare independentă de calciu și CaM (calmodulină). Spre deosebire de alte
tipuri de CaMK tipul 2 nu necesită fosforilarea buclei de fosforilare (Ser/Thr).
Activarea CaMK inițial prin creșterea nivelului de calciu care interacționează cu calmodulina,
complexul calciuCaM determină autofosforilarea și trecerea în stare activată autonomă. Dacă semnalele de
calciu sunt rare CaMK2 rămâne activată (in stare autonomă). Eliminarea fosforilării CaMK2 interferă cu
memoria și procesul învățării, terminarea autoactivării CaMK2 se realizează prin defosforilare sub acțiunea
PP1 dar și a unei fosfataze caracteristice CaMK. (PP1 – protein fosfataza 1)
Reglarea prin colocalizare enzimă + substrat.

Serin/treonin fosfataze
În condiții fiziologice catalizează scindarea esterilor fosfat care sunt foarte stabili. La mamifere sunt
întâlnite 25 de serin/treonin fosfataze (necesită ioni metalici).
Exemple PP1, PP2A, PP2B (calcineurina).
Fosfatazele au subunități catalitice și mai multe subunități asociate care au rol reglator sau de
adresare. PP pot avea rol dual în calea de semnalizare (diminuarea traducerii de semnal mediată de protein
kinaze și rol pozitiv prin defosforilarea proteinelor semnal are loc activarea proteinelor și amplificarea
semnalului).
Reglarea activității Serin/Treonin Fosfatazelor (STF) se face prin 2 mecanisme, prin fosforilarea la
nivelul subunității catalitice și/sau reglatoare ceea ce poate să ducă la schimbarea compoziției în subunități,
sau la activarea funcției catalitice sau poate influența localizarea subcelulară. Reglarea STF prin localizare
țintită duce la diminuarea posibilității de a cataliza hidroliza grupărilor fosfat de la alte substrate potențiale.
Reglarea cu proteine inhibitoare ce pot fi fosforilate.
PP1 este implicată în progresia prin ciclul celular, contracția musculară, metabolismul glucidelor și
sinteza proteinelor și semnalizarea neuronală. Subunitatea catalitică 35-38 kDa este înalt conservată la EK,
subunitatea catalitică interacționează cu cea reglatoare prin secvență scurtă RVXF (arginină, valină, X,
fenilalanină) resturile de AA din subunitatea catalitică care interacționează cu această secvență sunt
invariabile în subunitățile PP1 dar nu se găsesc în subunitățile catalitice ale PP2A și PP2B.
Subunitatea reglatoare are 3 tipuri de interacțiuni:
1. Modulează activitatea prin efect inhibitor (subunitatea reglatoare fosforilată și blochează
activitatea catalitică față de substrate fiziologice)
2. De adresare – se leagă la subunitatea catalitică + substrate (subunitatea reglatoare G se leagă de
subunitatea catalitică și de substratul care este glicogen sintaza)
3. Reprezintă substrate care se leagă direct la subunitatea catalitică dar funcționează și ca subunitate
de adresare
 Page 65 of 65

PP2A este implicată în progresia prin ciclul celular, apoptoză, replicarea ADN, transcriere și
traducere. Prezintă activitate duală – cea majoră fiind STF, minoră este tirozin fosfatazică – stimulată
specific de o proteină distinctă ce este activator al proteinei tirozin fosfatază.
Subtipurile – enzime oligomerice alcătuite din subunitate catalitică conservată plus subunitate
reglatoare, enzima miez este dimer alcătuit din subunitatea catalitică plus activatoare.
Există o a 3 subunitate (pe lângă subunitatea catalitică și cea reglatoare) cu următoarele
proprietăți:
1. Reglarea activității de fosforilare (duce la inactivare) la Tyr prin TK receptori și nonreceptori.
2. Metilarea carboxi-terminală, se realizează la resturile de leucină în prezența metil transferazei
caracteristice, demetilarea în prezența esterazei specifice, metilarea fiind necesară pentru
asocierea subunității 3 și este determinată pentru formarea holoenzimei active
3. Natura subunității 3 asociată - influențează specificitatea de substrat, activitatea catalitică,
distribuția subcelulară a enzimelor.

PP2B calcineurina, controlată de calciu, implicată în activarea limfocitelor, dezvoltarea neuronală, a

musculaturii, dezvoltarea valvelor inimii la vertebrate.
Pentru ca enzima să fie complet activă, trebuie să interacționeze cu calciuCaM subunitatea
catalitică conține 3 domenii reglatoare, situsuri de atașare pentru complexul calciuCaM plus legarea unor
proteine inhibitoare. Situsul catalitic activ este un centru bimetalic cu fier și zinc pentru hidroliza esterilor
fosforici.
Calciuneurina B prezintă analogie cu calmodulina, conține 4 domenii EF care sunt situsuri de legare
pentru calciu.
În absența calciuCaM dimerul calcineurină A, B este inactiv datorită segmentului autoinhibitor legat
la substrat. PP2B este considerat senzor de calciu.
Calcineurina este legată de funcția a 2 medicamente: ciclosporina și FK506 (folosite în transplantul
de organe). Ciclosporina interacționează cu ciclofilina iar FK506 interacționează cu o proteina de legare a
FK506. (proteinele au activitate peptidil-prolil-trans-izomerazică). Aceste complexe se leagă la calcineurină
și inhibă activitatea fosfatazică.
Interleukina 2 este implicată în proliferare limfocitelor T, iar în cazul imunosupresoarelor are loc
inhibiția calcineurinei adică factorii de transcriere NFAT nu se mai translocă și nu mai stimulează
interleukina 2 în final numărul de limfocite rămâne scăzut.