Anestezia

În cercetarea biomedicală, experimentele vor fi

efectuate pe animalul conştient numai dacă nu este
posibil ca studiul să fie efectuat sub anestezie.
Studiul sub anestezie va fi totdeauna de ales pentru a
exclude stress-ul, disconfortul şi durerea la animal,
factori ce pot avea influenţă negativă asupra
rezultatelor farmacologice şi reproductibilităţii
datelor. În general există două posibilităţi pentru
imobilizarea animalelor agresive: restricţia fizică (de
ex. imobilizarea în cuşti sau tuburi de imobilizare) şi
restricţia "chimică", cu ajutorul compuşilor
anestezici. Restricţia fizică poate fi utilizată pentru
intervenţiile scurte şi dureroase cum ar fi,
administrarea substanţelor sau recoltarea sîngelui din
vene. Anestezia locală reprezintă o înlăturare
regională şi reversibilă a durerii cu ajutorul
compuşilor chimici. Funcţiile circulatorii, pulmonare
şi renale nu sunt afectate iar animalul este conştient.
Anestezia de suprafaţă trebuie diferenţiată de
anestezia produsă după o injectare locală. Cele mai
utilizate substanţe pentru anestezia de suprafaţă sunt
tetracaina şi proparacaina. Procaina, butanilicaina,
lidocaina, mepivacaina şi etidocaina sunt cele mai
utilizate anestezice locale injectabile utilizate.
Anestezia locală este recomandată numai pentru
animalele blînde şi calme (vite, oi). Pentru cele mai
multe animale de laborator, metoda de ales este
anestezia generală. Anestezia generală
PREGĂTIREA Este foarte important de a controla
starea generală a animalului înainte de anestezie.
Acest control va include o examinare clinică a
animalului. Uneori poate fi utilă efectuarea cîtorva
teste de laborator. Animalele care prezintă reflex de
vomă vor fi supuse la post înainte de anestezie. Cele
mai multe specii de animale sunt supuse la post cel
puţin 12 ore înainte de anestezie iar porcii şi vitele o
perioadă de cel puţin 24 ore. Apa poate fi oferită, pe
perioada postului, la discreţie. PREMEDICAŢIA
este recomandată înainte de anestezie pentru a uşura
administrarea aneztezicului şi pentru a elimina
efectele secundare ale anestezicului utilizat cum ar fi
tulburarea reflexelor autonome.
Hidratarea şi excesul de baze
Bazîndu-ne pe valorile hematorcritului, hemoglobinei
şi eritrocitelor, hidratarea animalului trebuie realizată
înainte de anestezie. În acest scop poate fi utilă
perfuzarea (infuzarea) de soluţii glucozate sau
Ringer. Pentru a verifica succesul tratamentului sunt
necesare determinări repetate a parametrilor
meţionaţi mai sus.
Atropina Pentru a evita problemele cardiopulmonare
şi pentru a scade secreţia de salivă, atropina trebuie
administrată intramuscular înainte de anestezia
generală.
Sedarea şi înlăturarea durerii
Indicaţiile sedării sunt eliminarea durerii şi calmarea
animalelor precum şi stabilizarea sistemului nervos
vegetativ. Sunt utilizaţi pentru sedare următorii
compuşi:a)tranchilizante minore fără efecte
vegetative: meprobamat, diazepam; b)tranchilizante
majore cu efecte secundare vegetative:
acetilpromazina, azaperona, xilazina, detamidona.
Pentru eliminarea durerii, sunt utilizaţi mai ales
opioizii: metadona, meperidina, fentanyl.
La cele mai multe specii, se observă un efect sedativ
după administrarea acestor compuşi. La alte specii
poate apare un efect excitator. Tranchilizantele
minore, tranchilizantele majore şi compuşii
analgezici sunt utilizaţi adesea împreună cu
anestezicele.
Evoluţia anesteziei Animalul trebuie supravegheat
foarte atent pe durata anesteziei. Pot fi controlate
diverse sisteme cu ajutorul echipamentelor de ex.,
sistemul circulator (ritmul cardiac. pulsul, ECG) sau
sistemul pulmonar (frecvenţa respiratorie).
O procedură foarte importantă pe durata anesteziei
este determinarea profunzimii anesteziei. Se
delimitează patru stadii ale anesteziei:
I. Stadiul de analgezie: creşte frecvenţa cardiacă şi
respiratorie, pupile normal dilatate. II. Stadiul de
excitaţie: respiraţie neregulată, pupile dilatate,
creşterea reflexelor motorii, nistagmus, opistotonus.
III. Stadiul de toleranţă: Acest stadiu este divizat în
patru trepte: A) respiraţie regulată, pupile mici,
majoritatea reflexelor prezente B) muşchi scheletici
relaxaţi, pupile mici, reflex palpebral absent, reflex
cornean prezent, respiraţie superficială, analgezie
bună. Acesta este stadiul optim pentru anestezia
chirurgicală.C) prezent numai reflexul cornean,
respiraţie foarte superficială, pupile dilatate. D) fără
reflexe, respiraţie foarte superficială, pupile foarte
dilatate.IV. Stadiul de asfixie: fără reflexe, fără
respiraţie: pericolul morţii (se utilizează, dacă este
necesar, imediat antidoturi pentru a preveni decesul).
Aceste stadii variate apar evident în cazul utilizării
eterului etilic. Prin utilizarea unor combinaţii diferite
de anestezice – mai ales prin combinarea cu agenţi
relaxanţi musculari – reacţiile animalelor diferă de
schema expusă mai sus.
CĂILE ANESTEZIEI GENERALE
În general, există două căi utilizate pentru anestezia
generală: a) anestezia injectabilă şi b) anestezia prin
inhalare. Uneori este utilizată o combinare a ambelor
căi. Decizia pentru o cale sau alta depinde de specia
animală, scopurile studiului şi necesitatea controlului
pe durata anesteziei anesteziei.

Anestezia injectabilă
Compusul narcotic este dizolvat într-un lichid cînd se
utilizează această cale de anestezie. Calea de
administrare poate fi intravenoasă, intramusculară,
subcutanată sau intraperitoneală. Sunt menţionaţi mai
jos cel mai frecvent utilizaţi compuşi: Barbituraţi.
Există trei grupe de barbituraţi: - cu acţiune lungă, cu
acţiune scurtă şi cu acţiune foarte scurtă. Pentru
animalele de laborator sunt utilizaţi, predominant,
barbituraţii cu acţiune scurtă şi foarte scurtă.
Barbituraţii sunt metabolizaţi în ficat şi excretaţi în
special prin bilă. Sunt foarte liposolubili. Durata lor
scurtă de acţiune se datorează redistribuirii în ţesutul
adipos. Grăsimea reprezintă un compartiment mare
pentru aceşti compuşi, cu o excreţie relativ lentă.
Aceasta poate conduce la prelungirea efectelor
narcotice după dose repetate. Dozarea barbituraţilor
va fi ajustată în concordanţă cu reacţiile observate la
animal deoarece există diferenţe individuale în
funcţie de vîrstă, greutate corporală, mărime,
cantitatea de grăsime şi starea generală a animalului.
Cloralhidrat. Cloralhidrat este un compus relativ
vechi. Se observă efecte secundare cardiovasculare
după utilizarea lui ca anestezic. Limitele de dozare
sunt foarte strîmte; din aceste motive utilizarea lui la
animalele de laborator este limitată.
Combinaţii de analgetice cu compuşi neuroleptici.
Această metodă este utilizată adesea la cîini şi
rozătoare. Sunt combinate analgetice puternice
(morfina, metadona, meperidina, fentanil) cu
neuroleptice cum ar fi fenotiazina, acetilpromazina or
butirofenona. Ketamina. Ketamina este un compus
narcotic cu un debut al acţiunii narcotice foarte rapid,
chiar şi după administrarea intramusculară. Poate fi
utilizată aproape la toate speciile. Unul dintre
efectele secundare ale acestui compus este creşterea
tonusului muşchilor scheletici. Agenţii hipnotici.
Hipnoticele sunt compuşi care produc un somn foarte
profund fără a produce analgezie (metomidat). Ca
singur compus, metomidatul poate determina
anestezie numai la păsări.
Xilazina. Xilazina este utilizată frecvent pentru
anestezie în combinaţie cu alte substanţe. Singur este
utilizat pentru a produce anestezie numai la vite.
Uretan. Uretanul a fost utilizat iniţial ca agent
hipnotic. Poate, în doză corespunzătoare, să producă
anestezie de lungă durată la şobolan (aproape 10 ore).
Uretanul este toxic hepatic şi de aceea utilizarea sa
este limitată la cîteva modele farmacologice în care
metabolismul hepatic este fără importanţă.
Inhalarea Acest tip de anestezie joacă un rol minor
pentru animalele de laborator mici cum ar fi
rozătoarele. Anestezia inhalatorie este utilizată mai
ales la animalele de laborator mari cum ar fi cîinii,
pisicile, oile, maimuţele. Avantajele acestui tip de
anestezie sunt: controlul exact al profunzimii
anesteziei şi tratarea rapidă a complicaţiilor.
Componentele unui sistem de anestezie inhalatorie
includ: tub de oxigen, valve pentru reglarea presiunii,
gazometru, evaporator, "bypass" pentru oxygen,
tuburi pentru sistem. Sunt utilizate diferite tehnici
pentru animalele de laborator:
Tecnica insuflării
Administrarea compusului anestezic este realizată
prin intermediul unei măşti. Expirarea se realizează
în aerul încăperii. Advantajele sunt: procedură
simplă, fără valve şi absorbant de CO2, un volum
"mort" al sistemului foarte mic. Dezavantajele sunt
pierderea anestezicului, uscarea traheei animalelor,
imposibilitatea controlului volumului respirator şi
expirarea anestezicului în încăpere.
Sistem deschis. Gazele inspirate şi expirate sunt
separate printr-o valvă. Aerul inspirat constă dintr-un
amestec proaspăt de gaze. Este recomandat pentru
animalele mici.
Sistemele pe jumătate închise şi sistemele închise. În
sistemele închise, tot aerul expirat trece printr-un
absorbant de CO2. CO2 este înlăturat chimic iar aerul
este inspirat din nou cu o nouă cantitate de compus
anestezic evaporat şi amestecat cu oxigen. În
sistemul pe jumătate închis, parte din aerul expirat
ajunge în atmosferă. Avantajele sistemelor închise
includ beneficiul economic, scăderea pierderii de
fluide şi de temperatură a corpului animalului şi lipsa
riscurilor pentru experimentator. Dezavantaje:
necesitatea de a schimba absorbantul-CO2 la fiecare
8–10 h pe durata anesteziei, producţia de căldură şi
creşterea rezistenţei la respiraţie.
Dacă este posibil, inhalarea se va face prin intubarea
animalului; poate fi astfel minimalizat riscul
aspiraţiei conţinutului stomacal cu pericolul unei
pneumonii de aspiraţie. Este foarte important de a
utiliza un tub de lungime şi diametru corespunzător
animalului intubat. Pentru intubaţie, animalul trebuie
să fie inconştient. Pentru a evita reflexele de tuse sau
de înghiţire se recomandă administrarea de
succinilcolină. De asemenea poate fi administrată
atropina pentru a scădea producţia de salivă.
Compuşi inhalatori Amestecul inhalat trebuie să
includă 21% oxigen. Uneori este mai bine să se
administreze oxigen 33%. În ciuda pericolului de
explozie, eterul este unul dintre cal mai frecvent
utilizaţi compuşi anestezici. La fel halotanul,
metoxifluranul şi enfluranul sunt compuşi larg
folosiţi pentru anestezia inhalatorie. Prin utilizarea
unui amestec de N2O şi O2 cantitatea de compuşi
evaporaţi poate fi redusă drastic.
Terminarea anesteziei
Anestezia inhalatorie poate fi oprită prin înlăturarea
administrării compusului evaporat. Pentru a grăbi
eliminarea compuşilor anestezici se poate creşte
concentraţia oxigenului în sistem pentru o perioadă
de cîteva minute. Eliminarea compuşilor injectaţi este
dificil de influenţat. Este posibilă accelerarea
metabolismului anestezicului prin utilizarea agenţilor
care stimulează metabolismul hepatic şi excreţia prin
rinichi. Este foarte importantă verificarea
temperaturii corporale a animalului pe durata
anesteziei. Este necesară utilizarea lămpilor de
încălzire sau învelitorilor în cazul în care temperatura
corpului scade. După terminarea anesteziei animalele
trec prin aceleaşi faze ca cele enumerate mai sus, dar
în ordine inversă (toleranţă, excitaţie, analgezie).
Pe durata anesteziei poate fi necesară stimularea
respiraţiei sau circulaţiei. Agenţii stimulanţi pentru
respiraţie sunt doxapram, pentametilentetrazol,
niketamid, metetarimid, lobelina sau micorenul.
Agenţii stimulatoripentru circulaţie sunt adrenalina,
efortil, dopamina and efedrina. Administrarea pe
mască a oxigenului pur este recomandată de
asemenea pe durata anesteziei injectabile.
Antidoturile morfinei şi derivaţilor ei sunt
antagoniştii morfinici cum ar fi naloxonul.
Eutanasia Cercetarea biomedicală necesită animale.
Aceasta este cel mai evident în experimentele pe
animal in vivo. Oricum, pentru alte scopuri ştiinţifice,
de ex. studii in vitro, este necesar material biologic
pentru a studia enzime, membrane, receptori, celule,
ţesuturi sau organe care sunt obţinute de la animalele
decedate. De aceea, animalele trebuiesc sacrificate în
laboratoare biomedicale la sfîrşitul unui experiment
in vivo, pe durata experimentului unde sacrificarea
animalelor nu este parte a studiului dar trebuie
efectuată atunci cînd durerea, agonia şi suferinţa
excede nivelele acceptabile sau atunci cînd este
evident că animalul va rămîne cu durere sau
disconfort după terminarea experimentului, pentru a
obţine material biologic pentru studiile in vitro.
Eutanasia înseamnă o moarte uşoară şi trebuie
privită ca un act al unei metode umane de a sacrifica
un animal cu minimum de suferinţă fizică şi mentală.
Metoda eutanasiei va fi proprie speciei şi vîrstei
animalelor. Metoda va fi nedureroasă, va evita
excitaţia şi va atinge rapid inconştienţa şi moartea. În
plus, metoda va fi realizabilă, reproductibilă şi
ireversibilă. Înaintea eutanasiei, este important de a
recunoaşte unele simptome: teama, disconfortul şi
anxietatea; aceste simptome sunt specifice speciei. În
funcţie de specie, aceste simptome pot include
vocalizare de disconfort, tentative de evadare,
agresiune, tremurături, salivaţie, micţiuni, defecaţii.
Vocalizarea de distress şi eliberarea unor mirosuri
sau feromoni de către animalul speriat poate cauza
distress şi la animalele cazate în vecinătate. În acest
context trebuie de subliniat că multe vocalizări ale
animalelor sunt în limite de frecvenţă ce nu sunt în
limitele auzului uman. De aceea, animalele nu vor fi
expuse, pe durata eutanasiei, altor animale, în special
celor din propria specie. Dacă este posibil, un animal
nu va fi omorît în camera unde sunt cazate alte
animale şi în particular în cazul eutanasiei printr-o
metodă sîngerîndă, de ex. decapitarea. În mod
obişnuit, eutanasia necesită cîteva controale fizice ale
animalelor. Controlul adecvat minimizează durerea,
distress-ul, frica şi anxietatea la animal şi depinde de
specie, mărime, stadiul de domesticitate şi metoda
eutanasiei. Manipularea blîndă, scărpinatul şi vorbitul
către animal pe durata eutanasiei au adesea un efect
calmant asupra multor animale. Utilizarea drogurilor
sedative şi imobilizante poate fi necesară în acele
cazuri în care capturarea sau restricţia fizică poate
cauza durere, leziuni sau anxietate animalului.
Persoana care efectuează eutanasia este factorul cel
mai important pe durata sacrificării unui animal în
ceea ce priveşte minimizarea durerii, fricii sau
distressului. O metodă de eutanasie recomandată
poate fi extrem de nocivă pentru animal dacă este
prost executată. Toate persoanele ce efectuază
eutanasia trebuiesc a fi foarte bine instruite, trebuie
să demonstreze profesionalism şi trebuie să fie foarte
sensibile la valoarea vieţii animalului. După
eutanasie este esenţial să fie confirmată moartea.
Semnele morţii sunt încetarea bătăilor cardiace şi
respiraţiei şi absenţa reflexelor. Se poate garanta
moartea prin exsanguinare sau îndepărtarea inimii,
distrugerea creierului, decapitare, eviscerare sau
prezenţa rigidităţii cadaverice. Metodele pentru
eutanasia animalelor de laborator pot fi împărţite în
metode fizice şi chimice.
Metode fizice recomandate pentru eutanasia
Metodele fizice sunt: şocurile (lovituri, şocuri
electrice), dislocarea cervicală, decapitarea şi
iradierea cu microunde.
Diferitele metode de aplicare a şocurilor precum şi
decapitarea determină o pierdere rapidă a conştienţei
ce trebuie urmată imediat de o metodă care să forţeze
şi să garanteze moartea animalului. La animalele
mici poate fi suficientă numai lovirea (de ex. la
rozătoare), pentru a realiza inconştienţa; se realizează
prin lovirea capului. Şocul electric este metoda
comună utilizată pentru animalele domestice,
predominant pentru porci. Pentru această metodă
trebuiesc folosite numai echipamente specifice. Şocul
provocat cu o bară metalică este de asemenea o
metodă comună şi eficientă de realizare a
inconştienţei la animalele mari. Pentru iepuri mari se
poate folosi această metodă. Aplicarea corectă a
loviturii cu bara metalică în scopul distrugerii
imediate a creierului este foarte importantă.
Dislocarea cervicală distruge bulbul dar vasele mari
ale creierului sunt adesea intacte. Toate aceste
metode trebuie urmate imediat de un act prin care să
se forţeze şi să garanteze moartea. Prin procesul de
decapitare, capul este separat de gît ceea ce
determină o întrerupere imediată a circulaţiei sîngelui
la creier şi o cădere a presiunii sanguine la nivelul
creierului şi consecutiv, pierderea conştienţei. Acest
lucru este valabil numai pentru animalele cu sînge
cald. La vertebratele cu sînge rece se recomandă
lovirea animalului înainte de decapitare (datorită
rezistenţei lor mari la anoxie). Pentru decapitarea
animalelor mici de laborator au fost imaginate
ghilotine speciale. Eutanasia prin iradiere cu
microunde este utilizată de neurobiologi pentru
fixarea metaboliţilor creierului fără distrugerea
anatomiei creierului. În acest scop se utilizează
numai echipamente specifice (nici într-un caz
generatoare de microunde "domestice"). Este esenţial
de a localiza şi dirija corect "trenul" de microunde în
creierul animalului.
Agenţi chimici recomandaţi pentru eutanasia
Multe substanţe chimice pot determina moartea
datorită toxicităţii lor dar numai cîteva sunt
recomandate pentru eutanasie. Cele mai indicate
substanţe chimice pentru eutanasie sunt unele
anestezice în supradoză. În acest caz agentul
anestezic determină inconştienţă urmată de moarte.
Anestezicele volatile, cum ar fi halotanul, enfluranul,
isofluranul si metoxifluranul trebuie administrate
numai cu aparate speciale (mască). Dioxidul de
carbon în concentraţii mari (80-100%), determină
inconştienţă în cîteva secunde. Anestezicele
injectabile, predominant barbituraţii (cum ar fi
pentobarbiton sodic), sunt cei mai larg utilizaţi agenţi
pentru eutanasie pentru majoritatea animalelor.
Administrarea unei doze de trei ori mai mare decît
doza anestezică determină, în general, inconştienţă şi
moarte rapidă. Injectarea intravenoasă este calea cea
mai rapidă. Injectarea intraperitoneală poate fi de
asemenea utilizată la rozătoarele mici (dar la acestea
moartea se instalează într-un timp mai îndelungat).
Administrarea intracardiacă şi intrapulmonară este
recomandată numai la animalele inconştiente
deoarece este dureroasă şi, în cazul injectării
intracardiace, este dificil de a fi realizată cu succes la
prima tentativă. Agentul T61 este un amestec de
anestezic local, un hipnotic şi un compus curarizant.
Se administrează numai intravenos. Datorită
componentei curarizante, nu este permis în unele ţări
dar s-a demonstrat că inconştienţa şi blocada
neuromusculară apare simultan la cîini şi iepuri.
Oricum, se va realiza înainte de toate, sedarea dacă
aceasta este posibilă.
Metode şi substanţe ce nu vor fi folosite pentru
eutanasia animalelor de laborator.
Metodele fizice care nu vor fi folosite pentru
eutanasie sunt exsanguinarea, răcirea rapidă,
decompresia, hipertermia, hipotermia, asfixia şi
strangularea. Substanţele chimice care nu vor fi
folosite sunt monoxidul de carbon, nitrogenul, oxidul
nitric, ciclopropanul, cloroformul, tricloretilena,
cianura, sulfatul de magneziu, clorura de poatsiu,
nicotina, stricnina, cloralhidratul şi etanolul. Unele
dintre chimicalele menţionate nu sunt recomandate
pentru eutanasie pentru că sunt extrem de nocive şi
periculoase pentru experimentator. Agenţii blocanţi
neuromusculari, cum ar fi curara, succinilcolina sau
suxametoniu, care nu cauzează inconştienţă rapidă
înainte de moarte, de asemenea nu vor fi utilizaţi.
Ketamina este un foarte bun anestezic cu o latitudine
terapeutică foarte mare pentru marea majoritate a
animalelor de aceea nu este recomandată pentru
eutanasie. Oricum, metodele inacceptabile pentru
eutanasie, pot fi utilizate dacă animalul este
anesteziat sau determinat inconştient sau insensibil
printr-o metodă acceptată. Aceasta este valabil de ex.
pentru exanguinare, răcire rapidă. Exsanguinarea nu
trebuie făcută în văzul sau mirosul altor animale.
Răcirea rapidă este importantă pentru a minimiza
procesele enzimatice în scopul efectuării de
determinări în ţesuturi şi organe.

Metode recomandate pentru eutanasia unor specii

de animale: Şoarece: Decapitarea, Dislocarea
cervicală cu exsanguinare consecutive, Eutanasia în
atmosferă de dioxid de carbon 80%, Eutanasia în
atmosferă de anestezic volatil recomandat. Şobolan:
Lovitura, dislocarea cervicală (amîndouă cu
exsanguinare consecutivă), decapitarea, (realizată
numai de persoane bine instruite), Eutanasia în
atmosferă de dioxid de carbon 80%, Eutanasia în
atmosferă de anestezic volatil recomandat, Iradierea
cu microunde. Hamster: Decapitarea (realizată
numai de persoane bine instruite), Eutanasia în
atmosferă de dioxid de carbon 80% Eutanasia în
atmosferă de anestezic volatil recomandat.
Pentobarbital sodic în doză de 300 mg/kg i.p. Cobai:
Lovirea (cu exsanguinare consecutivă), decapitarea
(realizată numai de persoane bine instruite),
Eutanasia în atmosferă de dioxid de carbon 80%,
Eutanasia în atmosferă de anestezic volatil
recomandat, Pentobarbital sodic în doză de 150
mg/kg i.p. Iepure: Lovirea cu exanguinare
consecutivă (realizată numai de persoane bine
instruite), Pentobarbital sodic în doză de 120 mg/kg
i.v., T61 în doză de 0.3 ml/kg strict i.v. via un cateter.
Pisică: Pentobarbital sodic în doză de100 mg/kg i.v.
sau 200 mg/kg i.p., T61 în doză de 0.3 ml/kg strict
i.v. via un cateter; este recomandată anestezierea
animalului înainte cu 20–30 mg/kg ketamine i.m. sau
1–2 mg/kg xilazin plus 10 mg/kg ketamine i.m.
Cîine: Pentobarbital sodic în doză de 100 mg/kg i.v.,
T61 în doză de 0.3 ml/kg strict i.v. via un cateter;
este recomandată anestezierea animalului înainte cu
1–2 mg/kg xilazin plus 10 mg/kg ketamine i.m. Vite,
oi, capre, cai, porci: Pentobarbital sodic în doză de
100 mg/kg i.v.; pentru animalele mai mari se
recomandă mai întîi sedarea cu xilazin. Toate
celelalte metode acceptabile care sunt folosite în
sacrificări.
Primate: Pentobarbital sodic în doză de 100 mg/kg
i.v.; este recomadată anestezierea animalului înainte
cu 1–2 mg/kg xilazina plus 10 mg/kg ketamina i.m.
T61 în doză de 0.3 ml/kg strict i.v., este recomadată
anestezierea animalului înainte cu xilazina/ ketamine
i.m
sddxvsdvad
sdfsdfsdxcbsfdbd
s
Tehnici de recoltare a singelui la animale de
laborator La animalele de laborator, singele este
colectat in scopuri stiintifice diverse, de exemplu,
pentru a studia efectele unui drog asupra unor
costituienti variati cum ar fi hormoni, substrate sau
celule sanguine. In domeniul farmacocineticii si
metabolismului drogurilor, esantioanele de singe sunt
necesare pentru determinari analitice ale
medicamentului si metabolitilor. Singele este de
asemenea necesar pentru unele studii in vitro
utilizind celule sanguine sau fractii proteice
plasmatice definite. Tehnicile pentru recoltarea
singelui depind de factori specifici care difera de la
un experiment la altul. Este o diferenta intre tehnicile
de recoltare terminal si non-terminala. Conditiile
colectarii singelui la sfirsitul unui experiment care
include decesul animalelor (experiment terminal),
sunt total diferite (anestezia, volumul de singe) de
colectarea unica sau repetata a singelui de la animalul
constient. Colectarea "terminala" a singelui sub
anestezi permite utilizarea tehnicilor ce nu sunt
acceptabile pentru colectarile sanguine non-
terminale. Aspecte ale protecţiei animalului
Minimizarea oricărei dureri sau disconfort la
animalele de laborator pe durata procedurilor
experimentale trebuie să fie la fel de importantă ca
obţinerea rezultatelor dorite. Acest aspect este
important nu numai din raţiuni umanitare ci şi ca
parte a unei bune practici ştiinţifice. Colectarea
sîngelui poate fi stresantă pentru animal datorită
manipulărilor şi disconfortului asociat unei tehnici
anume. Multe modificări biochimice şi fiziologice
sunt asociate cu stress-ul ceea ce afectează
rezultatele, de exemplu, creşterea nivelului
catecolaminelor din sînge, prolactinei şi
glucocorticoizilor ce pot influenţa anumiţi parametri
metabolici cum ar fi glucoza ca şi numărătoarea
eritrocitelor, celulelor albe şi volumul celular total.
De aceea stress-ul trebuie redus la un minimum
posibil dacă nu se poate evita cu desăvîrşire; aceasta
este nu numai în interesul binelui animalului ci şi în
interesul binelui ştiinţific (acela de a obţine date
reprezentative). Pentru a minimiza stress-ul pe durata
colectării sîngelui (de ex. de la cîini sau pisici), poate
fi utilă pentru animal, ca şi pentru operator,
efectuarea unor "giumbuşlucuri" şi atribuirea unor
"recompense" animalului. Pe durata colectărilor non-
terminale este important de a nu recolta o cantitate
prea mare ce ar putea duce la reducerea volumului
total de sînge şi în final la rezultate false. Un volum
total de sînge redus se acompaniază de un conţinut în
hemoglobină şi o capacitatea de transport a
oxigenului reduse ca şi de o cădere a presiunii
sanguine şi o creştere a concentraţiei "hormonilor de
stress". Mai mult acestea se pot acompania în
continuare de alte probleme cum ar fi necroza
mucoasei gastrice. Binele animalului nu trebuie
primejduit prin recoltarea unui volum prea mare de
sînge sau recoltări prea frecvente. Cel mai adesea
aceasta se întîmplă cînd sunt folosite ca animale de
experienţă animale mici (şoarece, şobolan, hamster).
În aceste cazuri, protocoalele de studiu vor fi
adaptate să utilizeze mai multe animale pentru a
minimiza disconfortul pentru animalul individual.

Volumul total de sînge

Acesta este foarte dificil de determinat şi depinde de
specie, sex, vîrstă şi sănătate ca şi de starea de
nutriţie.Volumul total de sînge este mai mic la
animalele mai mari decît la animalele mici din
aceeaşi specie, în relaţie cu greutatea corporală. Este
de asemenea mai la animalele în vîrstă şi obeze
comparativ cu animalele tinere şi cu greutate
normală. Volumul total de sînge circulant este în
limitele de 55-70 ml/kg greutate corporală.
Colectarea terminală a sîngelui poate fi: (i)
exsanguinarea, ca singur proces de îndepărtare a
sîngelui prin care se colectează cît mai mult sînge
posibil şi (ii) eşantioane de sînge, multiple, recoltate
pe durata unui experiment terminal, sub anestezie
generală. Exsanguinarea va fi efectuată numai după
ce, printr-o altă metodă, animalul a devenit
inconştient, de exemplu şoc fizic sau anestezie
generală. Trebuieşte îndeplinită această condiţie
deoarece stress-ul apare odată cu hipovolemia severă
iar accesarea vaselor profunde provoacă durere.
Datorită condiţiilor particulare la animalul anesteziat
şi naturii "terminale" a experimentului, metodele ce
pot fi utilizate pentru exsanguinare nu vor fi nicodată
recomandate pentru colectarea sîngelui non-terminal
(condiţii în care se urmăreşte şi recuperarea
animalului). Aceste metode includ: a) recoltarea
sîngelui din vena cavă caudală sau aortă după
laparotomie cînd se colectează cît mai mult sînge
posibil în condiţii sterile; b) exsanguinarea după
decapitare, incizia venei jugulare sau arterei carotide,
condiţii în care se colectează sîngele non-steril;
c)sîngerarea retro-orbitală a animalelor mici de
laborator (şoareci, hamsteri şi şobolani), poate fi de
asemenea o metodă de exsanguinare.
Colectarea sîngelui non-terminală pot fi
diferenţiate recoltare unică sau multiplă. Recoltare
sanguină unică O singură recoltare de pînă la 15%
din volumul sanguin total nu influenţează binele
animalului. Oricum, recoltarea de 15-20% se poate
acompania de efecte secundare cum ar fi o scădere a
debitului cardiac sau presiunii sanguine. {ocul
hemoragic poate fi indus de recoltarea a 30-40% din
volumul sanguin total iar pierderea a 40% cauzează
mortalitate la mai mult de 50% dintre animalele unor
specii (şobolan, porc). Cîte o singură recoltare de
sînge sub 15% din volumul total de sînge poate fi
repetată după 3-4 săptămîni (de la un animal normal
şi sănătos), fără efecte adverse detectabile. Aceasta
nu înseamnă că animalul nu are experienţa unor
efecte adverse ci numai că nu le manifestă în mod
evident. Simptomele şocului hipovolemic sunt: puls
accelerat, membrane mucoase palide, hiperventilaţie,
temperatura corporală subnormală inclusiv piele şi
extremităţi reci. La aceste animale, intervenţia
terapeutică constă în substituirea volumului sanguin
cu perfuzie intravenoasă izotonă şi caldă. Recoltări
de sînge multiple Recoltările de sînge multiple nu
vor depăşi 1% din volumul sanguin total în 24 ore
(0.6 ml/kg corp/zi). Recoltări mai frecvente şi/sau a
unor cantităţi mai mari de sînge pot cauza anemie.
Simptomele anemiei sunt: mucoasa conjunctivală şi
bucală palidă, intoleranţă la exerciţii fizice şi o
creştere a frecvenţei respiratorii în anemiile severe.
Anemia poate fi uşor detectată prin determinarea
numărului de eritrocite, a hematocritului, a nivelelor
hemoglobinei precum şi prin numărătoarea
reticulocitelor în eşantioanele de sînge. În caz de
anemie animalul va trebui să fie tratat cu fier şi
vitamina B12 şi va fi monitorizat în legătură cu
parametrii sanguini menţionaţi mai sus, pe durata
terapiei, pînă cînd valorile revin la normal.
Aspecte tehnice ale recoltării sîngelui
O metodă comună de colectare a sîngelui capilar în
volum de 0.1 ml (la şoarece şi şobolan), este de a
îndepărta vîrful cozii animalului. Pentru eşantioane
de sînge (repetate), chiagul de sînge de pe coadă
trebuie îndepărtat, pentru a obţine sînge capilar
proaspăt. Această metodă este bună şi suficientă
pentru determinarea glucozei sanguine, sau
radioactivităţii totale (după administrarea
medicamentelor radiomarcate). La animalele fără
coadă (cobai sau hamster), este preferată puncţia
cardiacă, sub anestezie generală. Pentru colectarea
sîngelui de la animalele mari se preferă abordarea
unei vene superficiale. Persoana care ţine animalul şi
evidenţiază vena, are un rol cheie în colectarea
sîmgelui (nu trebuie să inducă stress animalului ci
trebuie să-i vorbească şi să maseze animalul). Unele
animale (cîini şi unele primate), pot fi antrenate să
prezinte un picior pentru recoltarea de sînge fără a
utiliza vreo constrîngere fizică. Este important de a
localiza cu acurateţe vasul înainte de inserţia acului
sau cateterului. În cele mai multe cazuri, este
necesară obstrucţia returului venos pentru distensia
vasului şi inserţia cu succes a acului. Lumenul acului
trebuie să fie cît mai larg posibil pentru a asigura o
recoltare a sîngelui rapidă cu risc minim de obstrucţie
a acului. Cînd sîngele este aspirat prea rapid cu o
seringă, vena se colabează. După ce acul a fost retras,
se va aplica imediat o presiune continuă, de cel puţin
30 secunde durată, la locul de puncţie. Animalul va fi
monitorizat apoi timp de 15 minute în ceea ce
priveşte sîngerarea.
Canularea venoasă permanentă
Pentru recoltări de sînge multiple se recomandă
adesea accesul venos prin canulare cronică. În cele
mai multe cazuri (şi în particular la şobolani), este
necesar de a restrînge activitatea animalului (cu o
"jachetă"), pentru a preveni deteriorarea sau
smulgerea canulei. În aceste cazuri semnele de stress
sunt evidenţiate frecvent de o creştere a niveleleor
serice ale hormonilor de stress. Oricum, după cîteva
zile după implantarea cateterelor, nivelele acestor
hormoni devin normale la şobolanii contenţionaţi.
Astfel de animale sunt, în mod obişnuit, cazate
singure iar "încăperea" restrînge unele mişcări
normale cum ar fi culcatul pe spate sau rostogolirea.
Astfel de restricţii pot fi considerate totuşi ca surse
potenţiale de stress. Acest lucru poate fi prevenit prin
poziţionarea ieşirii cateterului pe spatele animalului;
cateterul trebuie să aibă o lungimea exterioară de cel
mult 2 cm şi capătul reprezentat de un ac de seringă
(metalic). În timpul experimentului, pentru recoltarea
sîngelui se ataşează un cateter mai lung. Trebuie
echilibrat foarte atent stress-ul şi disconfortul
animalului cu canulare permanentă (în condiţii de
"restricţie") într-o perioadă mai lungă cu recoltările
de sînge multiple fără canulare permanentă. În primul
caz, pot fi obţinute valori multiple de la acelaşi
animal evidenţiind, poate, diferenţe individuale într-
un grup de animale. În ultimul caz poate fi necesară
utilizarea unui număr mai mare de animale (iar
disconfortul animalului luat individual este mai
redus). Canularea pe termen scurt (mai puţin de o zi),
a unui vas sanguin periferic la animalele mari este
uşor de realizat. Un ac "fluturaş" poate fi plasat în
condiţii aseptice iar probele de sînge multiple pot fi
recoltate rapid. Canularea pe termen lung (mai mult
de două zile) la animalele mici sau mari prezintă
adesea complicaţii, în special blocarea canulei cu
trombi. Infuzarea şi administrarea substanţelor via
canulă permanentă este mult mai facilă decît
recoltarea sîngelui (trombii ataşaţi la capătul canulei
funcţionează ca u valvă cu un singur sens).
Coagularea poate fi prevenită prin umplerea
cateterului cu soluţie salină conţinînd heparină.

Sîngerarea retro-orbitală
Recoltarea sîngelui prin puncţie orbitală este o
tehnică destul de controversat. Această tehnică este
adesea aplicată la animalele fără coadă (de ex.
hamster). Această tehnică este de asemenea utilizată,
la şobolani şi şoareci, cînd sunt necesare volume mari
ce nu pot fi obţinute din vena cozii. Sîngerarea retro-
orbitală se efectuează totdeauna sub anestezie
generală. Sunt utilizate pipete Pasteur, micropipete
sau tuburi microcapilar ce sunt împinse prin mişcări
de rotaţie prin conjunctiva laterală, dorsală sau
medială a ochiului spre peretele posterior al orbitei.
În general, reacţiile inflamatorii histologice pot fi
văzute pe traiectul de puncţie patru zile după puncţie.
După patru săptămîni, leziunile sunt vindecate fără
cicatrici detectabile (van Herck et al 1992). Oricum,
nu pot fi excluse complet efecte secundare severe
cum ar fi hematomul retro-orbital cu presarea
consecutivă a ochiului. Această presiune poate leza
nervul optic. Animalul poate fi incapabil de a închide
ochiul. Sîngerarea din plexul venos orbital cu
recuperarea animalului se va efectua numai în
condiţii excepţionale, cînd alte metode nu sunt
posibile. Tehnica va fi aplicată doar de către
personalul foarte bine antrenat în astfel de manevre
(tehnici); se va utiliza numai un singur ochi.
Puncţia cardiacă
Colectarea sîngelui prin puncţie cardiacă a fost
efectuată la cobai şi hamsteri. La aceste specii este
dificilă colectarea sîngelui prin metode alternative
(cu excepţia sîngerării retro-orbitale). În general,
puncţia cardiacă se va efectua sub anestezie generală,
cu premedicaţie cu atropină (pentru prevenirea
aritmiei cardiace). Dacă puncţia cardiacă este
utilizată pentru recoltarea sîngelui non-terminală (cu
recuperarea animalului). animalultrebuie separat de
celelalte pînă cînd acesta este conştient deplin. Va fi
atent supravegheat în ceea ce priveşte efectele
adverse şi sacrificat dacă se remarcă tulburări
datorate complicaţiilor (cum ar fi sîngerarea
intrapericardică sau intra-toracică).

Studiile vaselor sanguine izolate

Unul dintre cele mai flexibile şi accesibile tipuri de
ţesuturi izolate utilizate în farmacologie este vasul
sanguin izolat. Arterele şi venele conţin un spectru
larg de receptori ce mediază contracţia (5-HT, a-
adrenergici), relaxarea (b-adrenergici), şi funcţia
endotelială (acetilcolina). Vasele sanguine sunt
formate dintr-un strat adventicial, celule musculare
netede şi endoteliu, cu contracţii şi relaxări controlate
de muşchi, în timp ce mediatorii sunt eliberaţi din
celulele endoteliale. Metode pentru măsurarea
răspunsului la agonist (ca modificare în tensiunea
vasului sanguin). Cele trei metode comune implică
măsurarea tonusului mecanic al preparatelor: “inel
vascular”, “panglica” spirală (protocol alternativ),
vas perfuzat.
PREPARATELE “INEL” DE VASE SANGUINE
Deoarece celulele musculare netede sunt orientate în
cercuri concentrice dea lungul circumferinţei vaselor
sanguine, un mijloc convenabil şi simplu de a măsura
tensiunea contractilă este de a utiliza un preparat inel.
Se inseră două cârlige opuse în lumenul vasului
sanguin, cu un cârlig fixat la baia de organ iar celălalt
la un traductor izometric.
Materiale
Vas sanguin izolat, Soluţie salină fiziologică sau
echivalent, 4○ şi 37○C, oxigenată prin barbotare cu
gaz carbogen (95% O2/5% CO2). Soluţie stock de
KCl, 0.1 M. Canulă de polietilenă sau tub rulat, cu
dimensiunea corespunzătoare diametrului intern al
vasului (Fisher), Cârlige în unghi drept, cu vârful
bont,
Baie de organ încălzită la 37○C şi barbotată cu gaz
carbogen. Traductor izometric (de exemplu, Grass
FT.03 sau echivalent)
1. Se plasează o canulă de polietilenă în lumenul
vasului sanguin. Diametrul canulei trebuie să
permită amplasarea confortabilă, fără a întinde
vasul. Vasele sanguine mari, cum ar fi aorta, nu
necesită canulare pentru manevrare. 2. Se taie 3- 5
mm lungime din canulă plus vas sanguin şi se
împinge secţiunea pe capetele celor două cârlige. Se
înlătură delicat vasul sanguin de pe canulă cu un
forceps (pensă), pe cele două braţe orizontale ale
cârligelor. Se separă cu blândeţe cârligele utilizate
pentru montarea vasului.
Unele vase sunt suficient de mari pentru a fi
manipulate fără ajutorului unei canule inserate.
Aorta de şobolan, de exemplu, poate fi tăiată în inele
de 2-3 mm şi manipulate cu pensa pe cârlige.
3. Se fixează unul din cârlige la holder şi se plasează
preparatul într-o baie de organ ce conţine PSS cald şi
oxigenat. Se ataşează celălalt cârlig la un traductor de
forţă izometric. Se creşte încet tensiunea asupra
inelului, la nivelul dorit (nivelul diferă pentru diferite
vase). 4. Se lasă vasele sanguine să atingă un nivel
constant al tensiunii de repaus (se permite o perioadă
de echilibrare de 60-120 minute), cu schimbarea
frecventă a mediului din baie. Se ajustează tensiunea
de repaus pe durata perioadei de echilibrare, pentru a
o corecta pentru întindere. Se echilibrează ţesutul
pentru a atinge lungimea şi tensiunea precum şi
cerinţele specifice bazale ale experimentului.
5. Când ţesutul este echilibrat (tensiune de repaus
stabilă), se testează răspunsul contractil la o
concentraţie de 1 mM KCl (în mediul din baia de
organ).Odată echilibrat, ţesutul trebuie să fie stabil
şi nu va necesita ajustări frecvente. KCl acţionează
rapid şi este uşor înlăturată prin spălare. Acesta este
un test standard (control pozitiv), şi trebuie inclus
(doar dacă nu interferă cu necesităţile specifice ale
studiului), ca etapă a experimentului.
PREPARATUL PANGLICĂ (BANDELETĂ)
SPIRALĂ DE VASE SANGUINE
Dacă lumenul vasului sanguin este prea îngust pentru
un preparat tip inel, sau vasul este prea fragil pentru a
genera tensiune măsurabilă când este pregătit în acest
fel (inel), poate fi de preferat o bandeletă spirală
deoarece aceasta oferă un număr mai mare de celule
musculare pentru măsurarea tensiunii. Dacă vasul are
un lumen larg, sunt utilizate pense pentru a-l
manipula în timp ce este tăiată panglica spirală. O
metodă pentru manevrarea unui vas cu lumen îngust
este de a monta vasul pe un ac de oţel inoxidabil (sau
canulă pentru vasele mai largi): se apucă un capăt cu
pensa şi se trage blând în timp ce se taie o bandă
spirală cu un foarfec fin. Este descrisă aici, ca
exemplu, metoda de preparare a unei panglici spirale
din aorta de şobolan.
De notat că unghiul sub care este tăiată spirala poate
influenţa gradul de contracţie observat pe bandeletă.
Datorită orientării celulelor musculare netede, o
panglică spirală măsoară un vector forţă egal cu
lungimea panglicii multiplicată cu sinusul unghiului
de tăiere. De aceea, un unghi de tăiere abrupt este
optim pentru generarea forţei maximale. Prepararea
unei benzi spirale poate determina lezarea extinsă a
endoteliului şi în consecinţă, panglicile spirală
evidenţiază un răspuns endotelial sărac.
Materiale adiţionale Şobolan
Instrumente de disecţie sterile: Bisturiu, Forcepsuri
(pense), Foarfece fine, Ac de siringă din oţel
inoxidabil sau canulă de polietilenă (calibru
corespunzător diametrului intern al vasului), Holder
pentru ţesut, din plexiglas (de exemplu, Harvard
Apparatus), Fir de mătase G 5-0
1. Este sacrificat şobolanul prin asfixiere cu CO2 şi
se deschide toracele şi abdomenul printr-o incizie pe
linia mediană. Se taie aorta de la nivelul arcului
(aproape de inimă) şi se îndepărtează cu blândeţe,
prin tăierea ţesutului conectiv în direcţia organelor
abdominale caudale. 2. Se curăţă excesul de ţesut
conectiv şi grăsimea de pe faţa exterioară a vasului şi
se montează pe o porţiune rigidă a canulei de
polietilenă care este fixată la banc. Se trage capătul
aortei cu forcepsul şi se începe tăierea vasului la un
unghi ales. Se împinge uşor banda spirală la o parte
tăind continuu până când întreaga lungime a aortei
este o bandă de muşchi. 3. Se leagă unul din capetele
benzii la un holder de ţesut din plexiglas cu un fir de
mătase G 5-O şi se ataşează un alt fir la celălalt
capăt. Se plasează muşchiul în baia de organ ce
conţine PSS încălzit şi oxigenat. 4. Se leagă celălalt
fir la un traductor de forţă izometric şi se creşte uşor
tensiunea de repaus la 2 g. Se spală repetat preparatul
cu soluţie proaspătă (la fiecare 20 minute), timp de 2
ore, reajustând tensiunea de repaus la 2 g, pe măsură
ce ţesutul se întinde. 5. Când ţesutul este echilibrat
(tensiunea de repaus este stabilă), se testează
răspunsul contractil la o concentraţie de 1 mM KCl
adăugat în mediul băii de organ.
PREPARATE DE VASE SNGUINE PERFUZATE
Pentru vasele cu lumen extrem de îngust poate fi
perfuzată prin vas o soluţie salină. în scopul
măsurării tonusului muşchiului neted. Răspunsul
unui vas perfuzat este, în mod obişnuit, măsurat ca
modificare a presiunii de perfuzie. Un vas de o
lungime oarecare este canulat şi plasat cu un holder
într-o baie de organ. Lichidul de perfuzie poate fie să
difuzeze în fluidul din baia de organ fie poate fi
dirijat separat în afara sistemului prin intermediul
unei canule separate. Ultima variantă permite
drogurilor să fie administrate în interiorul lumenului
sau pe suprafaţa exterioară a ţesutului. Dacă este
necesar, preparatul va fi verificat pentru eventualele
pierderi din arteriolele mici, prin perfuzarea unui
colorant prin lumen (de exemplu, albastru Evans), şi
testarea colorimetrică a mediului din baie. Sistemul
constă dintr-un fluid de perfuzie încălzit, pompat prin
vas (tipic, cu o pompă peristaltică), şi un traductor de
presiune plasat între pompă şi ţesut.
Materiale Iepure mascul (2.5 - 4.0 kg)
Soluţie salină fiziologică sau echivalent, 4○ şi 37○C,
oxigenată prin barbotarea cu gaz carbogen (95%
O2/5% CO2). Soluţie uretan 25%, Soluţie stock de
KCl, 0.1 M, Aparat de perfuzie. Bisturiu, pense,
foarfece fine sterile, Holder pentru ţesut, Canulă de
polietilenă de calibru corespunzător, Baie de organ
încălzită la 37○C 1. Se perfuzează soluţia salină
fiziologică (la 37○C) prim aparatul de perfuzie
pentru a îndepărta toate bulele de aer. 2. Se
eutanasiază iepurele cu 7 ml/kg soluţie uretan 25%,
prin injectare intraperitoneală. Se tunde părul de la
baza urechii dea lungul arterei centrale a urechii. 3.
Se incizează pielea adiacentă arterei centrale a
urechii şi se expune un segment de arteră de 2 cm. Se
străpunge suprafaţa de sus a arterei proximal şi se
inseră un cateter de polietilenă fin în lumen pe o
distanţă cu ~0.5 cm mai lungă decât cea cerută de
experiment. O arteră utilă are între 1,5 şi 2,5cm
lungime. 4. Se taie artera la locul unde a fost canulată
şi la un punct situat la 2-3 cm sub punctul de inserţie
al canulei, se înlătură canula cu artera şi se plasează
într-un Petri ce conţine PSS la 4○C barbotat cu gaz
carbogen. 5. Se curăţă artera de ţesutul gras exterior
şi se examinează dacă există gări în lumen
(preparatul nu trebuie să aibă orificii). Se leagă un
capăt al vasului pe canula aparatului de perfuzie în
timp ce se perfuzează PSS proaspăt. 6. Se ajustează
holder-ul astfel încât celălalt capăt al vasului să nu fie
întins în timp ce este legat la canula holder-ului. Se
separă uşor cele două canule până când vasul nu este
pliat dar fără să se întins. Se inseră în baia de organ.
7. Se ajustează rata (debitul) de perfuzie până când
presiunea începe să crească; se ajustează debitul până
când presiunea este de 60 mmHg. 8. Când ţesutul
este echilibrat (presiune de repaus stabilă), se
testează răspunsul contractil la o concentraţie de 1
mM KCl adăugat în soluţia de perfuzie. Odată
echilibrat, ţesutul ar trebui să fie stabil şi să nu
necesite ajustări frecvente. KCl acţionează rapid şi
este uşor înlăturată prin spălare. Acesta este un test
standard (control pozitiv), şi trebuie inclus (doar
dacă nu interferă cu necesităţile specifice ale
studiului).
COMENTARII
Pot fi canulate vasele mari din toate organele precum
şi organele perfuzate, in vitro, ca preparate de vase
sanguine. Unul dintre primele preparate vasculare
perfuzate a fost inima Langendorf (Langendorf,
1895), preparat imaginat să măsoare tonusul arterial
coronarian. În acest caz, fluidul este perfuzat
retrograd în aortă; aceasta închide valvulele aortice
determinând fluidul să pătrundă prin ostium-ul
coronar în arterele coronare. Alte preparate vasculare
perfuzare sunt mezenterul, stomacul şi rinichiul.
Pentru a obţine un preparat vascular care să opereze
optim este utilă cunoaşterea şi înţelegerea relaţiiler
dintre debit, presiune, rezistenţă şi raza lumenului.
Preparatele inel
În timp ce preparatele inel sunt flexibile şi simple,
distribuţia receptorilor vegetativi dea lungul vaselor
sanguine poate fi heterogenă cu o densitate a acestora
(pentru un anume agonist), ce diferă de la un preparat
la altul. Aşa cum se vede în figura 6, funcţia
contractilă mediată de histamină rămâne aproape
constantă dea lungul vasului în timp ce
contractilitatea la acetilcolină diminuă cu cât inelul
este recoltat mai departe de arcul aortic (Altura and
Altura, 1970).
Un alt factor important ce trebuie luat în considerare
la preparatele inel, este efectul cârligelor de metal
asupra stratului endotelial al vasului sanguin. Se pare
că endoteliul situat lângă cârlige va fi afectat (efect
abraziv al cârligelor). Dacă pentru experiment este
necesar răspunsul endotelial trebuie avut grijă ca în
timpul montării vasului pe holder să fie prevenită
frecarea capetelor vaselor snguine.
Banda spirală este utilă pentru studiul vaselor foarte
mici unde un inel nu va genera suficientă tensiune
pentru a fi măsurată. Elementul cheie este că
sensibilitatea preparatului este dependentă de unghiul
de tăiere. De asemenea, ţesutul este mult mai mult
manevrat decât preparatele inel ceeea ce poate
determina afectarea ţesutului. Este important de a ne
asigura că intervenţia chirurgicală şi pregătirile
consecitive sunt efectuate în mediu umed cu ţesutul
menţinut rece.
Preparate perfuzate delimitează relaţia dintre
presiune şi raza unui vas sanguin perfuzat. Deoarece
pereţii interiori ai vaselor nu sunt manipulaţi,
preparatele perfuzate sunt optime pentru studiul
răspunsurilor endoteliale. Se utilizează preparatele
perfuzate la presiune fiziologică (ce poate fi ajustată
cu mare sensibilitate prin controlul debitului).
Debitul extrem de mare poate însă “spăla” celulele
endoteliale şi de aceea un astfel de debit de perfuzie
trebuie evitat.
Un factor ce trebuie luat în considerare când se
utilizează un preparat perfuzat este administrarea
drogurilor. Acestea trebuiesc perfuzate la o
concentraţie constantă astfel încât cantitatea în
compartimentul receptor să fie cunoscută.
GENOTOXICITATEA. CE ESTE O
GENOTOXINĂ
Deşi corpul uman este extrem de complex, relaţia lui
cu o genotoxină poate fi descrisă în termeni foarte
simpli. În orice organism viu, cele mai mici unităţi
capabile de existenţă independentă sunt celulele şi
fiecare celulă are funcţii specifice care trebuiesc
menţinute pentru a susţine viaţa. Instrucţiunile pentru
aceste activităţi sunt codate în gene sau secţiuni ale
ADN, alocate fiecărei funcţii specifice. Un filament
constând din mai multe gene, este numit cromozom;
fiecare dintre cromozomi sunt divizaţi în două
cromatide care sunt împreunate printr-o joncţiune
cunoscută sub numele de centromer. O alterare a
oricărei părţi a aceste structuri a ADN care determină
modificări transmisibile ale funcţiei celulare este
numită mutaţie iar agenţii care determină astfel de
mutaţii sunt cunoscuţi ca agenţi genotoxici sau
genotoxine. Există trei mari tipuri de efecte
genotroxice: mutaţii genice, aberaţii cromozomiale şi
efecte asupra AND. Deoarece nici un studiu in vitro
singur nu este capabil să detecteze toate cele trei
tipuri de efecte, este recomandată o baterie de teste.
Testele pentru mutaţii genice şi aberaţii
cromozomiale detectează leziunile din molecula de
AND în timp ce testele pentru efectele asupra AND
detectează evenimente care pot conduce la afectarea
celulei. Testele in vitro pentru fiecare categorie, pot
fi efectuate pe microorganisme sau celule de
mamifere.
METODE DE TESTARE
Testele pentru mutaţii genice. Mutaţiile care
afectează o porţiune mică din molecula de ADN
(incluzând “frameshifts” şi substituire ale perechilor
de baze), sunt cunoscute ca mutaţii punctiforme sau
punctuale. Testul cel mai utilizat pentru a detecta
astfel de mutaţii genice este studiul “Ames bacterial
reverse mutation”, care utilizează Salmonella
typhimurium histidin-dependentă ca organism pentru
testare. Microsomii activi S9 din ficatul de şobolan
sunt încorporaţi într-o porţiune a organismelor test
pentru a simula expunerea întregului animal. După
expunerea la extractul fluid din articolul de testat,
organismele sunt cultivate (în triplicat), pe mediu
nutritiv de agar fără histidină apoi incubate pentru
perioade de timp specificate. Sunt apoi numărate
coloniile iar datele sunt comparate cu cele obţinute în
condiţii de control pozitiv şi control negativ.
Deoarece bacteriile nemodificate nu vor creşte fără
histidină, orice creştere indică faptul că expunerea la
agentul genotoxic a determinat o mutaţie punctuală
care a produs o linie bacteriană ce nu mai are nevoie
de histidină. Pot fi utilizate şi alte bacterii în acest
design de testare, de exemplu Escherichia coli cu
necesităţi speciale de aminoacizi.
O altă metodă in vitro utilă pentru detectarea
mutaţiilor genice într-un sistem mamifer este studiul
pe limfomul de şoarece. În acest test, celulele de
limfom de şoarece sunt expuse la extractele de testat,
în prezenţa sau absenţa activării metabolice exogene.
După incubare, culturile sunt clonate pe medii
restrictive pentru fenotipul mutant. Mutaţiile sunt
măsurate la locusul timidin-kinazei pentru a detecta
mutaţiile perechilor de baze, mutaţiilor de tip
frameshift precum şi pentru deleţii mici. Deoarece
coloniile mutante evidenţiază o mărime caracteristică
a frecvenţei distribuţiei, măsurarea coloniilor poate fi
utilizată pentru a distinge între tipurile de afectare
genetică.
Testele de aberaţii cromozomiale. Pentru testarea
aberaţiilor cromozomiale se pot utiliza fie teste in
vitro fie in vivo. Aceste teste detectează leziunile
cromozomiale induse după o diviziune celulară; sunt
evaluate modificările structurale cromozomiale în
timpul stadiului de metafază a diviziunii celulare.
Modelul in vitro utilizează celule ovariene de
hamster chinez. Ca şi în alte metode in vitro, sistemul
test este evaluat în prezenţa sau absenţa activării
metabolice exogene. Cele mai multe aberaţii pot fi
identificate fie ca fiind de tip cromozomal fie de tip
cromatidic.
Teste de efecte asupra AND. Genotoxinele pot
induce lezarea AND prin câteva mecanisme. Printre
metodele pentru evaluarea unor astfel de efecte este
testul micronucleelor din măduva osoasă de şoarece.
Acest studiu in vivo detectează leziunile
cromozomale ori ale aparatului mitotic ale celulelor
roşii imature ce se găsesc în măduva osoasă. În
timpul diviziunii celulare, cromozomii neafectaţi dau
naştere la un nucleu-fiică normal dar dacă aceştia
sunt lezaţi sau dacă aparatul mitotic este afectat, pot
fi incorporate fragmente de cromozomi în nucleul
secundar în loc de nucleul principal. Nucleii
secundari sunt mult mai mici decât nucleul principal
fiind cunoscuţi sub termenul de micronuclei. Când
eritroblaştii se diferenţiază în eritrocite policromatice
(PCE), nucleul principal este extrudat dar oricare
micronucleu ce este prezent rămâne vizibil în spate.
Astfel, o creştere a numărului de PCE micronucleate
la animalul tratat cu extract din articolul de testat este
o indicaţie a prezenţei genotoxinei. Testul “sister
chromatid exchange” este de asemenea utilizat pentru
a evalua efectele pe AND. În acest studiu, celulele
mamifere active şi inactive metabolic sunt expuse la
extractul test iar apoi cromatidele colorate diferenţiat
sunt examinate pentru a vedea dacă fragmente ale
AND au fost puse în comun sau schimbate între
cromatidele “surori”. Dovezi ale unor astfel de
schibări apar ca striaţii sau efect de bandă. O creştere
a numărului de schimburi observată în culturile test
este o indicaţie de toxicitate genetică.
CONCLUZII
Testele clasice in vivo şi in vitro pot fi utilizate
pentru evaluarea genotoxicităţii materialelor din
dispozitivele medicale. În toate cazurile, efectele
adverse sau echivoce, justifică utilizarea altor
investigaţii. Standardul cerut este confirmarea
testând relaţia doză-răspuns. În plus, o descoperire
prezumtiv pozitivă într-un studiu in vitro poate fi
confirmată prin realizarea unui studiu alternativ pe un
model in vivo. Rezultatele acceptabile din bateria de
teste pentru genotoxicitate nu oferă date numai
despre securitatea biomaterialului; în unele cazuri
astfel de date pot justifica abandonarea studiilor de
carcinogenitate in vivo.

CITOTOXICITATEA
Acest standard prezintă un număr de metode
imaginate să evalueze efectele biologice adverse
acute ale substanţelor extractabile din materialele
dispozitivelor medicale. Pentru realizarea acestor
teste sunt necesare culturi de celule de mamifere
(obişnuit de şoarece sau de origine umană obţinute de
la furnizori comerciali); culturile se realizează
containere în prezenţa mediilor de cultură specifice.
Tehnicile de laborator pentru cultivarea celulelor sunt
foarte asemănătoare cu cele utilizate pentru creşterea
bacteriilor. Celulele de mamifere cultivate se
reproduc prin diviziune celulară şi pot fi subcultivate
pentru a produce un număr mai mare de tancuri cu
celule necesare evaluării materialelor.
METODE DE TESTARE
În metodele standard de testare a citotoxicităţii, se
cresc celulele în monostrat până aproape de
confluenţa în tancul de cultură (obişnuit 80%
confluenţă) iar apoi sunt expuse articolului testat sau
controlului, direct sau indirect (prin intermadiul
fluidelor de extractare). În testul prin metoda eluţiei
(care este larg utilizat), extractele sunt obţinute prin
plasarea materialelor de testat şi controalelor în medii
de cultură separate, în condiţii standard (de exemplu
3 cm2 sau 0.2 g/ml de mediu de cultură timp de 24
ore la 37°C). Fiecare extract fluid obţinut este apoi
aplicat peste monostratul celular din cultură
(înlocuind mediul care a hrănit celulele până în acest
punct). În acest fel, celulelor-test li se oferă un aport
de nutriente proaspete ce conţine în acelaşi timp
substanţele extrase din materialul de testat sau din cel
de control. Culturile sunt apoi depuse în incubator la
37°C şi periodic sunt examinate la microscop timp de
până la trei zile. Celulele sunt studiate pentru
semnele vizibile de toxicitate (cum ar fi o modificare
a mărimii sau aspectului, aspectul componentelor
celulare sau distrugerea configuraţiei), ca răspuns la
materialele de testat sau cele de control.

Alternativ, probele de articole de testat şi controalele

pot fi aplicate direct pe monostratul de celule
acoperite cu mediul nutritiv sau cu un strat semisolid
de agar ce conţine şi nutriente (acest strat acoperitor
protejează celulele de orice efect fizic care poate fi
cauzat de contactul cu probele). Pe durata incubării,
extractabilele din probe vor migra în mediul nutritiv
sau prin stratul de agar către celulele aflate în zona
inferioară a tancului de cultură. După incubare,
monostratele sunt evaluate în termenii prezenţei sau
absenţei de efecte celulare în zona de sub şi zona
adiacentă probelor. Condiţiile de extracţie prin
metodele stratului acoperitor şi contactului direct
sunt mai puţin riguroase decât în testul prin metoda
eluţiei. Oricum, aceste metode sunt în mod particular
utile dacă dispunem de cantităţi foarte mici pe probă
sau dacă ne interesează să evaluăm numai o suprafaţă
a materialului. Două metode adiţionale, deşi utilizate
mult mai puţin decât cele menţionate anterior, sunt
totuşi suficient de folosite pentru a merita
menţionarea. În metoda inhibiţiei creşterii celulare,
se adaugă la suspensiile de celule extracte saline iar
efectele inhibitorii asupra celulelor sunt determinate
prin măsurarea masei celulelor, după o perioadă
standard de incubare. În metoda japoneză de studiu a
formării de colonii, un număr specificat de celule
sunt expuse la un extract din materialul de testat sau
control; apoi, după incubare, sunt numărate coloniile
de celule (atât pentru materialul de testat cât şi pentru
control). Dacă se formează mai puţine colonii la
extractul din articolul-test decât la controlul negativ,
aceasta este considerată ca dovadă de citotoxicitate.
BENEFICIILE TESTĂRII CITOTOXICITĂŢII
Testarea citotoxicităţii este un mijloc rapid, sensibil
şi necostisitor de a determina dacă materialul conţine
cantităţi semnificative de extractabili agresivi din
punct de vedere biologic. Sensibilitatea mare a
metodei se datorează testării pe celule izolate în
cultură şi absenţei mecanismelor protective care
asistă celulele dintr-un organism întreg. Mediul de
cultură pentru celulele de mamifere este extractantul
de preferat deoarece acesta este o soluţie fiziologică
capabilă să extragă o varietate largă de structuri
chimice, nu numai pe cele solubile în apă. Pot fi
adăugate la mediu antibioticele, pentru a elimina
potenţiala interferenţă cu contaminanţii microbieni ce
pot fi prezenţi pe materialul de testat sau pe probele
control. Rezultatele testelor de citotoxicitate se
corelează rezonabil de bine cu studiile implantelor
pe termen scurt (vezi in continuare). Oricum, nu este
necesar să se coreleze bine cu alte teste standard de
biocompatibilitate care sunt destinate să examineze
aspecte specifice (cum ar fi sensibilizarea) sau cu
cele care utilizează extracte preparate în condiţii mult
mai riguroase (de exemplu, la 121°C în soluţie salină
sau ulei de seminţe de bumbac).
Metodele de testare a citotoxicităţii sunt utile pentru
screening-ul materialelor care pot fi utilizate în
dispozitivele medicale deoarece ele servesc la
separarea materialelor reactive de cele non-reactive,
oferind dovezi predictive ale biocompatibilităţii
acestora. Metodele de testare a citotoxicităţii sunt
utile de asemenea pentru compararea lot-cu-lot a
materialelor, pentru a determina dacăun potenţial
material înlocuitor este echivalent cu cel aflat în uz
curent precum şi pentru a depista problemele şi a
explora semnificaţia schimbărilor din procesul de
producţie.
CONCLUZII
Testarea pentru citotoxicitate este un prim pas
valoros pentru asigurarea biocompatibilităţii unui
dispozitiv medical. Un rezultat negativ sugerează că
acel material este lipsit de extractanţi periculoşi sau
că prezintă o cantitate insuficientă a acestora (ce ar
putea cauza efecte acute pe celulele izolate), în
condiţii exagerate. Oricum, trebuie de reţinut că
acesta este un prim pas în evaluarea
biocompatibilităţii. Pe de altă parte, un rezultat
pozitiv a testului de citotoxicitate poate fi considerat
ca un avertisment precoce că acel material conţine
unul sau mai multe substanţe extractabile care pot fi
de importanţă clinică. În acest caz sunt necesare
investigaţii suplimentare pentru a determina utilitatea
materialului.

EFECTELE IMPLANTELOR
Testele de implantare sunt utilizate pentru a evalua
efectele locale ale materialului dispozitivului asupra
ţesutului viu (atât din punct de vedere micro- cât şi
macroscopic). Implantarea articolului de testat în
corpul unui animal de laborator este cel mai direct
mijloc de a evalua efectele potenţiale ale materialului
unui dispozitiv medical asupra ţesutului viu
înconjurător. Probele sunt tăiate la mărimi
corespunzătoare şi eventual sterilizate şi apoi
implantate în condiţii de asepsie. Apoi, după o
perioadă de timp de la câteva săptămâni la câteva
luni, locurile de implant sunt analizate. Atenţia se
concentrază numai pe efectele locale ce apar ca
răspuns la prezenţa materialului testat care a fost în
contact intim cu ţesutul viu.
MODELUL DE TESTARE PE IEPURE
Deşi recomandarile ISO menţionează utilizarea
şoarecilor, şobolanilor şi cobailor, iepurele (datorită
mărimii şi manevrabilităţii uşoare), a fost animalul
cel mai utilizat pentru testarea prin implant. Modelul
care utilizează iepurele descris în ISO este similar cu
cel prezentat de multe farmacopei naţionale. În acest
model, materialele test şi de control sunt tăiate în
piese de aproximativ 1 x 10-mm şi plasate în lumenul
unui ac de mărime 15–19. Probele pot fi sterilizate
fie înainte fie după ce sunt încărcate în ac dar metoda
de sterilizare trebuie să fie aceeaşi cu cea folosită
pentru sterilizarea produsului final pentru a ne
asigura că efectele procesului de sterilizare a
materialului sunt luate în calcul. După ce iepurii sunt
anesteziaţi şi pielea bărbierită şi pregătită (aplicarea
regulilor de asepsie), se implantează patru probe test
în musculatura paralombară (pe o parte a spatelui) şi
patru probe de plastic (control negativ, cunoscute ca
non-reactive), se plasează în musculatura de partea
opusă. Pentru a evalua materialele utilizate pentru
implanturi pe termen scurt, răspunsul local al
ţesutului este analizat după 1, 4 şi 12 săptămâni.
Testele pentru materiale cu utilizare indelungată
specifică intervale de 12, 26, 52 şi 78 săptămâni.
Sunt necesare cel puţin trei animale pentru fiecare
interval de testare. Cobaii sau alte rozătoare mici pot
fi utilizate în locul iepurilor; oricum, pentru a avea
mai multe locuri de evaluare la speciile mici,
trebuiesc utilizate mai mult de trei animale per test.
De asemenea. Pot varia în anumite limite şi
intervalele dacă se folosesc alte specii în loc de
iepuri. La sfârşitul intervalului specificat, fiecare loc
de implant este examinat cu ajutorul lupei şi se
înregistrează mărimea capsulei care înconjoară
implantul. Materialele reactive pot produce o capsulă
cu o grosime de 2-4 mm în timp ce materialele
controlului negativ nu produc, în general, o capsulă
vizibilă. Implantul este apoi îndepărtat (în cele mai
multe cazuri) iar ţesutul este procesat pentru
examinarea histopatologică. La nivel microscopic
poate fi evaluată şi se pot acorda scoruri naturii şi
extensiei reacţiei celulare la implant. Reacţiile severe
se caracterizează prin prezenţa crescută a celulelor
inflamatorii şi moartea celulelor musculare ce
înconjoară implantul.

TEHNICI ALTERNATIVE
Cele mai multe probe de material sunt implantate în
muşchiul scheletic dar ISO recunoaşte, de asemenea,
că datorită mărimii sau formei dispozitivului ce se
intenţionează a fi folosit, unele probe pot fi
implantate în ţesutul subcutanat sau în os. Deşi o
astfel de cerinţă nu este menţionată în standard, ea
poate fi utilă pentru materialele de implant cu intenţie
de utilizare clinică în ţesuturi specializate. Astfel,
materialele pentru şunturi cerebrale pot fi implantate
în sistemul nervos central iar lentilele intraoculare în
ochii animalelor de experienţă. Pentru majoritatea
materialelor este necesară includerea unui cotrol
pozitiv în protocolul testului de implantare. Oricum,
unele materiale induc un răspuns de “corp străin”
intens care este considerat aproape “normal” pentru
acel material. În astfel de cazuri, rezultatele testelor
vor fi evaluate în lumina intenţiei de aplicare clinică
şi în comparaţie cu răspunsul la produse similare
utilizate deja în clinică. Standardul recomandă ca
acel control de referinţă (cum ar fi metalul, ceramica
corespunzătoare), să fie implantat la animalele testat,
în plus faţă de controlul standard negativ din plastic.
O altă opţiune frecvent utilizată este implantarea
chirurgicală în loc de metoda plasării cu acul descrisă
mai sus. Această abordare este necesară când nu este
posibilă realizarea de fragmente de material suficient
de mici pentru a fi plasate cu acul. Procedura
chirurgicală constă în realizarea de mici “buzunare”
în muşchi sau ţesutul subcutanat unde se introduce
proba apoi închiderea în planuri a ţesuturilor. Aşa
cum s-a menţionat mai înainte, materialele implantate
sunt obişnuit înlăturate înainte ca ţesutul să fie
pregătit pentru examinare microscopică histologică.
Aceasta se face deoarece lamele microtomului
utilizat pentru tăierea secţiunilor fine de probe
(incorporate în parafină), sunt incapabile să taie
materialele dense din plastic sau metal ale
implanturlui. Pentru unele implanturi, în special
pentru cele din os, de un interes special este interfaţa
material-ţesut iar această zonă se poate pierde în
timpul înlăturării implantului. Pentru astfel de cazuri,
sunt disponibile metode de “îmbrăcare” a ţesutului şi
implantului în matrici dense de plastic care vor fi
tăiate cu cuţite speciale diamantate.
Testele tip implant sunt realizate cel mai adesea
utilizând probe solide. Dacă materialul dispozitivului
medical este sub formă de pudră, gel sau pastă, este
posibil ca un plastic inert de referinţă sau oţel
inoxidabil să fie acoperit cu acest material şi să se
deruleze testul standard. Astfel de materiale de testat
pot fi de asemenea injectate – în doză de 1 ml/loc, de
exemplu. Ca o alternativă, unele materiale test pot fi
plasate într-un tub inert care este apoi implantat iar
reacţiile ţesutului pot fi evaluate la capetele tubului
unde proba intră în contact cu ţesutul viu.
IRITAŢIA. RĂSPUNSURILE IRITATIVE
Substanţele chimice eliberate din materialele
dispozitivelor care intră în contact cu organismul pot
produce iritaţii la nivelul pielii, mucoaselor sau
ochilor. În termeni generali, o astfel de iritaţie
reprezintă răspunsul local al ţesutului, răspuns
caracterizat prin semnele obişnuite ale inflamaţiei –
roşeaţă şi edem – şi uneori se acompaniază de
creşterea temperaturii locale şi durere. Numeroase
substanţe chimice sunt capabile să determine iritaţie,
fie imediat fie întârziat, şi unele dintre acestea pot fi
prezente în materiale ca aditivi, substanţe
complementare în procesul de fabricaţie sau
contaminanţi. Este esenţial ca substanţa chimică sau
materialul de interes să fie deja suficient caracterizata
astfel încât datele aflate la dispoziţie să fie corelate
cu cele descrise în literatură. Al doilea pas este
utilizarea testelor in vitro disponibile şi validate (cum
ar fi studiul citotoxicităţii prin utilizarea culturilor
celulare de mamifere), pentru a identifica, de câte ori
este posibil, materiale sever iritante, fără utilizarea
testelor pe animale. Când materialele nu pot fi
caracterizate prin aceşti doi paşi, ele trebuiesc
evaluate utilizând testele in vivo descrise în standard.
Pasul final îl reprezintă utilizarea studiilor clinice
non-invazive pe subiecţi umani, dar acest pas nu este
prezentat în standard ca o parte de rutină a
programului de testare pentru iritaţie.
METODE DE TESTARE IN VIVO
Testele de iritaţie intracutanate, iritaţia primară a
pielii şi iritaţia oculară sunt cele trei teste preclinice
in vivo utilizate obişnuit pentru evaluarea
materialelor cu privire la posibilul risc de agresiune
prin contact. Testul intracutanat a fost descris în
United States Pharmacopeia (USP) de mai bine de 30
de ani, ca mijloc de a investiga containerele
farmaceutice de plastic în relaţie cu intenţia de
utilizare a acestora. Testul este realizat aproximativ
la fel cu testarea alergiei la pacienţii umani.
Extractele fluide ale materialului de testat sunt
preparate în condiţii controlate de temperatură, timp
şi raport al suprafeţei materialului/volumul fluidului
de extracţie. Utilizând un ac fin, se injectează un
volum de extract proaspăt intracutanat (adică în
piele), în locuri multiple la nivelul spatelui la doi
iepuri albinoşi (după ce se bărbiereşte zona). Se
injectează un număr egal de locuri la animalele de
control cu acelaşi volum de vehicul de extracţie
netratat. La 24, 48 şi 72 ore după injectare se studiază
locurile de injectare şi se dau scoruri pentru
severitatea roşeţii (eritemului) şi edemului. Extractele
care produc răspunsuri semnificativ mai mari decât
controalele sunt considerate iritante. Pentru
materialele dispozitivelor medicale, se utilizează
sluţia salină şi uleiul vegetal, pentru a asigura
extracţia atât a chimicalelor hidrosolubile cât şi a
celor liposolubile. Testul reactivităţii intracutanate
este agresiv prin aceea că utilizează extracte
preparate în condiţii exagerate şi le plasează direct în
pieleaanimalului de experienţă, maximizând astfel
şansa de a decela chimicale iritante (dacă acestea ar fi
prezente). Testul iritaţiei primare a pielii este mai
puţin agersiv prin aceea că porţiuni din materialul de
testat sunt plasate direct pe spatele iepurilor albinoşi
(bărbieriţi). Probele sunt apoi acoperite cu
îmbrăcăminte ocluzivă şi lăsate pe loc cel puţin 4 ore
(în mod obişnuit, 24 ore). Locul de contact este apoi
observat pe o perioadă de 72 ore în ceea ce priveşte
edemul şi roşeaţa. După ce se totalizează scorul,
acesta se compară cu valori cunoscute pentru iritaţia
primară a pielii (disponibile sub formă de tabel), iar
răspunsurile sunt clasificate drept neglijabile, uşoare,
moderate sau severe. Atunci când este necesar,
metoda poate fi modificată pentru utilizarea pe locul
de contact a extractelor fluide (în loc de utilizarea
materialului propriu-zis).
Testul de iritaţie oculară, rezervat în general
produselor care vin în contact cu ochiul, este realizat
de obicei cu extracte fluide preparate cum a fost
descris mai sus (deşi unele materiale pot fi testate
direct ca solide sau pulberi). Se plasează un volum
mic de extract fluid proaspăt (sau solid), direct în
sacul conjunctival al unui iepure albinos. Celălalt
ochi al iepurelui rămâne netratat (reprezentând
controlul). Se execută observaţii la intervale regulate
timp de până la 72 ore şi se realizează scorul pentru
roşeaţa şi edemul conjunctivei ochiului, răspunsul
irisului la lumină, opacitatea corneeană, lăcrimare.
Aceste scoruri sunt apoi comparate cu cele din tabele
de clasificare (pentru a determina care materiale
testate sunt iritante pentru ochi). În plus de testele
intracutanate, iritaţiei primare a pielii şi iritaţiei
oculare, mai sunt descrise şi alte teste adiţionale:
iritaţia orală, rectală, peniană şi vaginală. Ultimile
teste sunt considerate relevante pentru dispozitivele
medicale cu intenţie de aplicare pe aceste arii
mucoase ale corpului. Dintre aceste patru teste
adiţionale, testul de iritaţie vaginală la iepure este de
o importanţă deosebită dim mai multe motive.
Extractele aplicate pe mucoasa vaginală rămân în
contact cu ţesutul pe o perioadă extinsă de timp
exagerând expunerea; epiteliul vaginalal iepurelui
este constituit numai dintr-un singur strat de celule
subţiri (şi în felul acesta este foarte sensibil la
iritanţi); există sisteme microscopice de atribuire a
scorului ceea ce oferă baza celulară în judecarea
potenţialului iritativ al unui material.
CONCLUZII
Nici o metodă raportată până în prezent nu reuşeşte
să modeleze fiziologia complexă a modelului animal
astfel încât cercetările continuă. Testele descrise mai
sus oferă un mijloc de a minimaliza potenţialul de
expunere al pacientului uman la dispozitivele
medicale iritante precum şi numărul de animale pe
care se realizează testarea.
SENSIBILIZAREA
Testarea pentru sensibilizare la chimicalele
extractabile din dispozitivele medicale este un
element cheie al standardelor de
biocompatibilitate.
După (ISO) toate materialele dispozitivelor trebuie
testate din punct de vedere al citotoxicităţii,
sensibilizării şi iritatiei. Metodele de testare sunt
utilizate pentru a determina dacă reacţiile de
sensibilizare sunt cauzate de o substanţă chimică ce
poate fi eliberată din biomaterialele specifice şi/sau
din dispozitivele medicale.
REACŢIILE DE SENSIBILIZARE sau
hipersensibilizare apar obişnuit ca rezultat al
contactului repetat sau prelungit cu substanţa chimică
care interacţionează cu sistemul imun al
organismului. Deoarece cele mai multe astfel de
reacţii la biomateriale sunt de tip mediat de celulele
dermale (mai mult decât de tip umoral sau antigen-
anticorp), în laborator se utilizează pielea animalelor
pentru testarea sensibilizării. Reacţiile dermice de
sensibilizare urmărite la animalele de laborator sunt
roşeaţa şi edemul.
Biomaterialele şi dispozitivele care pot determina
reacţii de sensibilizare realizează aceste fenomene
datorită substanţelor chimice extractabile. În unele
cazuri, un individ poate dezvolta o reacţie numai
după expuneri (contacte) repetate sau de lungă durată
cum ar fi de exemplu un implant; sau după ce se
utilizează zilnic, timp de câteva săptămâni sau luni
mănuşi de latex, o persoană aparent sănătoasă poate
dezvolta “rash” persistent la nivelul mâinilor (Figura
1). Această sensibilizare poate fi determinată de unul
din cele câteva componente chimice din mănuşi,
substanţe ce pot acţiona ca un alergen.
În alte cazuri, când un individ este deja sensibilizat la
o substanţă chimică (cum sunt cele prezente în
mediu), persoana va prezenta reacţia de sensibilizare
la prima expunere la un dispozitiv care conţie acea
substanţă chimică. Astfel, un individ sensibilizat
anterior la nichel, va dezvolta un “rash” (inflamaţie)
la nivelul tâmplelor la câteva zile după ce începe să
poarte ochelari cu rame nichelate.
METODE DE TESTARE
Biomaterialele şi alte materiale din dispozitive sunt
testate pentru prezenţa chimicalelor sensibilizante
utilizând cobai, o specie cunoscută ca având un
răspuns dermic la sensibilizanţi aproape identic cu
cel al pielii umane. Testele de sensibilizare pe cobai
necesită între 6 şi 8 săptămâni şi astfel consumă cel
mai mult timp pentru realizare comparativ cu
celelalte teste descrise în standardele ISO 10993.
Metoda patch-ului repetat (sau Buehler), presupune
expunerea directă a spatelului cobaiului (spate
bărbierit), la materialul de testat (sub formă de
pansament ocluziv), pentru minim 6 ore. Această
procedură este repetată de trei ori pe săptămână timp
de trei săptămâni. Această parte a testului este
cunoscută sub denumirea de fază de inducţie. După o
perioadă de repaus sau recuperare de 2 săptămâni ce
permite dezvoltarea unui răspuns întârziat, animalele
sunt provocate cu o expunere finală la patch-ul de
biomaterial. Modelul patch-ului repetat este utilizat
în primul rând pentru testarea dispozitivelor cu
aplicare topică (cum ar fi electrozii, câmpurile şi
halatele chirurgicale ş.a.), deoarece în aceste cazuri
metoda de testare prin aplicare directă pe animal
simulează utilizarea clinică.
În metoda de testare maximizată (sau metoda
Magnuson-Kligman), extractele fluide ale
materialului de testat sunt preparate în soluţie salină
sau uleioasă; grupuri separate de cobai sunt expuse
repetat la cele două tipuri de extracte. Cobaii sunt
mai întâi injectaţi cu un extract împreună cu un
adjuvant ce are rolul de a accentua un răspuns imun,
apoi se trece la aplicarea topică. După două
săptămâni de repaus sau recuperare, animalele sunt
acoperite cu un patch topic ce conţine extractul.
Considerat în general mai sensibil decât modelul
patch-ului repetat, testul maximizării este utilizat
pentru materialele dispozitivelor care vor veni în
contact cu arii ale corpului, altele decât pielea.
Utilizarea atât a soluţiei saline cât şi a extractului
uleios simulează extracţia de către fluide şi de către
lichidele cu administrare intravenoasă precum şi alte
produse farmaceutice, care vin mai întâi în contact cu
dispozitivul apoi cu pacientul. În ambele tehnici,
suprafeţe expuse la patch-uri sunt examinate pentru
reacţii (roşeaţa şi edemul), care nu sunt prezente în
grupul de animale control-negativ. În plus, sunt
utilizate periodic chimicale cunoscute ca fiind
sensibilizante, pentru a valida modelul.
LIMITE ŞI POSIBILITĂŢI VIITOARE
Testul de sensibilizare efectuat pe cobai şi descris
mai sus este o metodă utilă în eliminarea posibilităţii
ca pacientul să fie expus la chimicale puternic
sensibilizante extrase din materialele dispozitivelor
medicale. Oricum, aceste metode sunt departe de a fi
perfecte în capacitatea lor de a detecta sensibilizanţi
slabi; de asemenea nu detectează chimicale care
acţionează ca adjuvanţi şi care întăresc un răspuns
imun la alte substanţe chimice cu care pacientul
poate veni în contact. De asemenea aceste teste nu
pot detecta răspunsurile la antigene cum ar fi
proteinele ce se găsesc în cauciucul natural (proteine
care au fost responsabile în trecut de răspunsuri
imune sistemice severe şi chiar cu risc vital).

Metode de testare adiţionale sunt în prezent în stadiu

de evaluare. Unul dintre aceste teste ce promite este
studiul nodulilor limfatici la şoareci. În această
metodă, urechile şoarecilor sunt tratate apoi sunt
studiaţi nodulii limfatici din zonă: este studiat
răspunsul proliferativ limfocitar (ce poate fi
demonstrat de acumularea unui marker radio-marcat.
Există preocupări pentru realizarea de alternative de
testare in vitro (până în prezent fără succes).