UTILIATEA PRACTICĂ A METODELOR CROMATOGRAFICE

Determinarea vitaminelor solubile din miere

O metodă izocratică RP-HPLC a fost dezvoltată pentru identificarea și cuantificarea vitamine solubile în
apă din miere. Faza mobilă testată a fost o soluție apoasă de acid sulfuric și detectarea a fost efectuată
simultan prin UV și fluorescenţă. Separarea vitaminelor C (L-ascorbic acid), B1 (tiamină), B3N
(nicotinamidă), B3H (nicotinic acid), B5 (acid D-pantotenic) și B6 (piridoxină) este realizat în aceste
condiţii în 15 min. Adăugarea la faza mobilă a metanolului 2 %v/v a redus semnificativ timpul de analiză
în separarea acestora vitamine până la 10 min. Mai mult, în prezența unui surfactant cationic bromură de
hexadeciltrimetilamoniu (CTAB) în faza mobilă, separarea vitamina C, B1, B3N, B3H, B2 (riboflavina)
și B6 este posibil in 6 min. Combinația dintre cele două faze mobile, H2SO4/metanol și
H2SO4/metanol/CTAB, a fost aplicat analizei, în mod izocratic, la mai multe tipuri de miere monoflore
(rozmarin, cimbru, lavandă, castan, echium) și o miere de albine în analiză de scurtă durată.
Echipamente
Sistemul cromatografic utilizat este echipat cu o pompă model 250 (Perkin-Elmer), un cuptor termostatic
Jet-Stream Plus (Knauer), supapă de injecție de 20 μL (Rheodyne) și două detectoare:
 un detector programabil UV/VIS model 785A (Applied Biosystems)
 un detector de fluorescență 200 (Perkin-Elmer).
S-au utilizat 2 coloane cromatografice μBondapack C18 10 μm, 150×3,9 mm de la Waters, una dintre ei a
fost anterior saturat cu CTAB.
Selectarea fazei mobile
1. a fost pregătită o fază mobilă simplă cu H 2SO4 0,01 % (v/v) la pH 2,5. Au fost obținute următoarele
faze mobile față de acesta, dar modificând diferiți parametri: pH (interval între 2,5 și 3,7), temperatura (a
variat între 25 °C și 40 °C) și în final prin adăugarea unui procent scăzut de scurt alcool de lanț ca
metanol (MeOH), etanol (EtOH), n-propanol (n-PrOH) și n-butanol (n-BuOH). Procentele de alcool au
fost variate de la 1 % la 10 % (v/v).
2. un surfactant a fost adăugat la mobil fază de îmbunătățire a separării. Surfactanții testați au fost

 neionic (polioxietilen-23-laurileter, Brij 35) la un concentrație de 5 mM și în prezență de metanol

2 % (v/v)
 cationic (bromură de hexadeciltrimetilamoniu, CTAB) la concentrații cuprinse între 10−4 și 0,02
M, mai mică și mai mare decât concentrația sa micelară critică.
Determinarea vitaminelor în probe de miere
Probele de miere analizate în acest studiu au fost o miere și șase tipuri de miere monofloră. Probele de
nectar de tip miere au fost următoarele: două miere de cimbru (Thymus vulgaris L.), una de rozmarin
(Rosmarinus officinalis L.), una de castan (Castanea sativa Mill.), una de lavandă (Lavandula latifolia L.)
și una de echium ( Echium vulgare L.), fară a fi preluctrate industrial și menținute la o temperatură de -20
° C până la analiză.
Probele au fost preparate prin dizolvarea unei cantități între 5 g și 15 g de miere în 25 ml de apă ultrapură
și filtrate printr-un filtru de seringă de nailon de 0,45 μm înainte de injectarea lor în sistemul
cromatografic. Vitaminele B1, B3H, B3N, B5 și B6 au fost analizate folosind faza mobilă H2SO4 0,01
%/MeOH 2 % (v/v) la pH 3,5 și 25 °C, iar vitaminele C și B2 au fost analizate cu faza mobilă H2SO4
0,01 %/ CTAB 0,01 M/MeOH 2 % (v/v) la pH 2,75 şi 25 °C.
Influența pH-ului, a temperaturii și a adăugării unui alcool cu lanț scurt la o fază mobilă H2SO4
0,01 % (v/v)
Pentru a realiza separarea vitaminelor reducând timpul de retenție al vitaminelor B2 și B9, s-a studiat
influența pH-ului și a temperaturii asupra separării cromatografice. pH-ul a fost variat între 2,5 și 3,7
valori. Vitaminele au structuri chimice foarte diferite, și pentru aceast motiv pentru care influența pH-ului
este foarte diferită asupra fiecăruia. În unele cazuri, cum ar fi perechile B1–B3H și B3N–B6, ordinea de
eluție este inversată în jurul valorii de 3,2 și, respectiv, 3,0. Din diferențele observate în factorii de
retenție pentru fiecare vitamină în funcție de pH, cele mai bune condiții de separare se obțin la pH=3,5.
Odată ce valoarea pH-ului a fost stabilită, temperatura a fost variată între 25 și 45 °C.
După cum este de așteptat, o creștere a temperaturii produce o scădere a timpilor de retenție a vitaminelor.
Când temperatura atinge valori ridicate, vârfurile cromatografice corespunzătoare acidului nicotinic
(B3H) și tiaminei (B1) își pierd rezoluția și se suprapun complet la 40 °C. Din acest motiv, și ținând cont
de faptul că o creștere a temperaturii ar produce degradarea vitaminelor, în restul lucrării au fost selectate
25 °C.
Prin urmare, faza mobilă H2SO4 0,01 M/pH 3,5 la 25 °C asigură separarea a șase vitamine solubile în apă
în 16 min. Cromatograma acestei separări este prezentată în Fig. 1a.
Timpul de analiză este mai mic decât cel raportat anterior în modul izocratic cu faze mobile hidro-
organice sau prin cromatografie lichidă micelară în prezența SDS/n-pentanol. Cu toate acestea, folosind
această fază mobilă, nu este posibilă eluarea vitaminelor B2 și B9 într-un timp scurt mai mic de 30 de
minute, deoarece aceste vitamine sunt cele mai hidrofobe dintre vitaminele solubile în apă și au o reținere
lungă la orice pH și temperatură. dacă se foloseşte un conţinut scăzut de modificator organic în absenţa
unui surfactant. Din acest motiv, în Fig. 1 aceste vitamine nu sunt separate.
În următorul pas al studiului, atunci când un alcool cu lanț scurt (MeOH, EtOH, n-PrOH și n-BuOH) este
adăugat în faza mobilă, n-butanolul este singurul care permite eluarea vitaminei B2 într-un scurt timp cu
8,3 %v/v, dar vârfurile celorlalte șase vitamine sunt suprapuse la un timp mort al coloanei. Cea mai bună
îmbunătățire a separării cu ceilalți alcooli între 2 % și 10 %v/v se obține în prezența a 2 %v/v MeOH.
Cromatograma se obține cu alcoolul într-un timp de analiză mai scurt (10 min față de 15 min) cu o
rezoluție bună, așa cum este prezentat în Fig. 1b.
Figura 1. Separarea cromatografică a vitaminelor a)cu faza mobilă H2SO4 0,01 %,pH03,5 la 25 °C; b) cu
faza mobila H2SO4 0,01 %/MeOH 2 %, pH 03,5 la 25 °C cu UV și fluorescență detectarea în fiecare caz
Studiul separării vitaminelor folosind un surfactant în faza mobilă
Surfactantul neionic a fost adăugat la faza mobilă într-o concentrație de 5 mM și nu oferă posibilități bune
de separare deoarece toate vârfurile de vitamine apar la timpi de retenție apropiati de timpul mort al
coloanei. Utilizarea acestui surfactant a fost testată și în prezența MeOH 2 %, iar separarea vitaminelor nu
a fost posibilă.
Surfactantul cationic CTAB a fost adăugat la faza mobilă în concentrații care variau între 10−4 și 0,02 M,
dar pentru concentrații mai mici de 5 10−3 M linia de bază a cromatogramei nu este stabilizată până la cel
puțin 2 ore.
Din separările obținute cu diferitele concentrații de surfactant, se constată că 0,01 M este concentrația
minimă de surfactant care realizează stabilizarea coloanei într-un timp rezonabil și, de asemenea, ar putea
separa un număr acceptabil de vitamine solubile în apă. Cu toate acestea, vârfurile obținute sunt largi și au
eficiențe scăzute. Pentru a o rezolva, la fazele mobile micelare se adaugă și un solvent organic pentru a
îmbunătăți eficiența maximă și pentru a reduce timpii de retenție. Ca urmare, s-a ales același alcool în
cantitate mică (metanol 2 %v/v) și același ca în absența surfactantului pentru a îmbunătăți eficiența de
vârf și separarea. Astfel, prima fază mobilă testată a fost H2S04 0,01 %/CTAB 0,01 M/MeOH 2 %, pH
03,5. Cu toate acestea, vitamina B3H eluează într-un timp îndelungat, iar vârfurile vitaminelor B1 și B6
se suprapun în timp mort. Prin urmare, a fost realizat din nou un studiu al retenției de vitamine în funcție
de pH, de data aceasta în prezența CTAB. pH-ul nu afectează reținerea vitaminelor B2, B3N, B1 și B6,
dar pentru valori ale pH-ului mai mari de 3 reținerea vitaminelor C și B3H este modificată dramatic.
Conform acestor rezultate, este esențial să se modifice pH-ul fazei mobile în prezența CTAB astfel încât
faza mobilă aleasă în prezența surfactantului să fie H 2SO4 0,01 %/CTAB 0,01 M/MeOH 2 % la 25 °C și
pH 2,75. Folosind această fază mobilă, separarea a șase vitamine (C, B1, B2, B3N, B3H și B6) a fost
realizată în mod izocratic, prin UV la 254 nm și detecție fluorescentă la lungimi de undă de
excitație/emisie 290/396 nm pentru B6 și 450. /520 nm pentru B2, așa cum se arată în Fig. 2 cu UV (a) și
detecție fluorescență (b). Acidul folic (vitamina B9), foarte instabil în mediu acid, nu a fost detectat.

Fig 2. Separarea cromatografică a vitaminelor într-o fază mobilă H 2S04 0,01 %/CTAB 0,01 M/MeOH 2
%, pH 02,75, 25 °C. un UV detectie si detectie b fluorescenta
Analiza vitaminelor solubile în apă din diferite probe de miere
Ambele faze mobile alese în absența și în prezența CTAB au fost folosite pentru a analiza probe reale de
miere cu origine botanică diferită. Figura 3 prezintă cromatogramele corespunzătoare unora dintre probele
analizate cu ambele faze mobile ca exemple și utilizând detectarea UV și fluorescență.

Fig 3. Cromatograme probe de miere cu a) fază mobilă H2SO4 0,01 %/MeOH 2 %, pH 03,5, 25 °C
(1Echium UV, 2 Echium FL) și b) fază mobilă H2SO4 0,01 %/CTAB 0,01 M/MeOH 2 %, pH 02,75, 25
°C (1 Echium UV, 2 Honeydew UV, 3 Honeydew FL)
După ce s-a determinat conținutul diferitelor vitamine din probele de miere, la probe s-au adăugat 2,0, 4,0
și 6,2 mg/L din fiecare vitamină. Rezultatele ca media a trei determinări cu abaterea lor standard sunt B1
102,6±18,4 %, B2 101,1±3,35 %, B3H 109,4±5,7 %, B3N 86,3±4,0 %, B5 90,1±3,1 % și B6 95,0±2,8 %.
Concluzii
O metodă simplă RP-HPLC în mod izocratic a fost dezvoltată pentru a detecta șapte vitamine solubile în
apă (B1, B2, B3H, B3N, B5, B6 și C) în miere. Combinația a două faze mobile, H2SO4 0,01 %/MeOH 2
%/25 °C/pH 3,50 și H2SO4 0,01 %/CTAB 0,01 M/MeOH 2 %/25 °C/pH 2,75, oferă o metodă adecvată
pentru separarea cromatografică, identificarea si cuantificarea acestor vitamine.
Caracteristicile analitice care utilizează ambele faze mobile sunt bune, cu sensibilitate ridicată și limite
scăzute de detecție. Prezența CTAB este utilă în special pentru determinarea vitaminelor C și B2.
Bibliografie
1. León-Ruiz, Virginia, et al. "Analysis of water-soluble vitamins in honey by isocratic RP-HPLC." Food Analytical
Methods 6.2 (2013): 488-496.