CAPITOLUL 1 - CONCEPTE DE BAZĂ ÎN INTERPRETAREA

TULBURĂRILOR METABOLISMULUI AMINOACIZILOR

Obiective:

1. Descrierea structurilor chimice de bază ale aminoacizilor.

2. Descrierea tehnicilor de analiză ale aminoacizilor.
3. Prezentarea caracteristicilor generale ale aminoacidopatiilor, cu specificarea
defectului metabolic și tehnica utilizată pentru detectare.
4. Definirea următorilor termeni: cromatografie, faza mobilă, faza staționară, factor de
retenție.
5. Explicarea principiilor cromatografiei și utilitatea acesteia în laboratorul clinic.

Definiții:

1. Aminoacid: un compus organic ce conține ambele grupări funcționale:

amino (-NH2) și carboxil (- COOH).
2. Aminoacizi esențiali: aminoacizi care nu pot fi sintetizați de către
majoritatea mamiferelor şi de aceea sunt considerați constituenți esențiali ai
dietei în vederea menținerii sănătății sau creșterii normale a organismului.
3. Legătura peptidică: este legătura amidică formată între gruparea carboxil a
unui aminoacid și gruparea amino a celuilalt aminoacid.
4. Oligopeptide: un lanț scurt alcătuit din aminoacizi (3-4 reziduuri).
5. Cromatografia: metoda fizică de separare în care componentele ce trebuie
separate sunt distribuite între două faze: faza staționară şi faza mobilă.
6. Cromatograma: reprezentarea grafică a răspunsului detectat, respectiv a
concentrației analitului.

Introducere

Aminoacizii reprezintă unitatea structurală de bază a proteinelor. Peptidele și

proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor, caracteristicile fiecărei proteine fiind
determinate de secvența liniară de aminoacizi, numită structură primară.

9
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Structura generală a aminoacizilor

Un carbon central (carbon α) de care sunt atașate 4 grupări diferite:

• Gruparea amino (bazică): -NH2;
• Gruparea carboxil (acidă): -COOH;
• Un ion de hidrogen (-H);
• Radicalul (-R): ce diferă de la un aminoacid la altul.

Proprietățile optice ale aminoacizilor

Atomul de carbon cu patru substituenți diferiți este denumit carbon asimetric și

reprezintă centrul de chiralitate. Moleculele ce conțin un astfel de centru în structura lor
sunt optic active, adică pot roti planul luminii polarizate spre dreapta (dextrogir – D) sau
spre stânga (levogir – L). Se formează astfel enatiomerii care sunt izomeri optic activi ai
aceluiași compus, ce se prezintă ca obiectul și imaginea sa în oglindă.

Ionizarea aminoacizilor

Aminoacizii sunt molecule amfotere, prezentând atât o grupare acidă (-COOH), cât
și o grupare bazică (-NH2), se comportă ca acizi în mediu bazic și baze în mediu
acid. Grupările -COOH şi -NH2 sunt capabile de ionizare. Punctul izoelectric (pI)
reprezintă pH-ul la care încărcă
tura moleculară a aminoacizilor sau proteinelor este 0.
Clasificarea aminoacizilor

Se poate realiza după mai multe criterii:

I. În funcție de natura radicalului R:
1. Radical alifatic (monoaminomonocarboxilici): glicină, alanină, valină,
leucină, izoleucină;
2. Radical grupare acidă (monoaminodicarboxilici): acid aspartic, asparagina,
acid glutamic, glutamina;
3. Radical grupare bazică (diaminomonocarboxilici): arginină, lizină,
histidină;
4. Radical cu grupare hidroxil (hidroxiaminoacizi): serină, treonină;
5. Radical cu grupare tiolică (tioaminoacizi): cisteină, metionină;
6. Radical aromatic: fenilalanină, tirozină, triptofan;
7. Iminoacizi: prolina, hidroxiprolină.
II. În funcție de caracterul catenei laterale:
• Aminoacizi cu catenă laterală nepolară: glicină, alanină, valină, leucină,
izoleucină, fenilalanină, triptofan, metionină, prolină;
10
 Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

• Aminoacizi cu catenă laterală polară neutră: serină, treonină, cisteină,

asparagină, glutamină;
• Aminoacizi cu catenă laterală încărcată:
• pozitiv (caracter bazic): lizină, arginină, histidină, etc;
• negativ (caracter acid): acidul glutamic, acidul aspartic, etc.
III. În funcție de cerințele nutriționale:
• Aminoacizi esențiali: valină, leucină, izoleucină, metionină, treonină, lizină,
fenilalanină, triptofan;
• Aminoacizi semi-esențiali: arginină, histidină;
• Aminoacizi ne-esențiali: glicină, alanină, serină, cisteină, acid aspartic,
asparagină, acid glutamic, glutamină, hidroxilizină, tirozină, prolină,
hidroxiprolină.
IV. În funcție de evoluția metabolică:
• Aminoacizi pur cetogenici: leucină, lizină;
• Aminoacizi pur glucogenici: glicină, alanină, valină, serină, treonină,
cisteină, metionină, acid aspartic, asparagină, acid glutamic, glutamina,
histidină și arginină;
• Aminoacizi glucogenici și cetogenici: izoleucină, tirozină, fenilalanină,
triptofan.
Principalul rol al aminoacizilor în organism este de a intra în componența proteinelor
plasmatice, structurale și intracelulare. Zece din cei douăzeci de aminoacizi necesari
organismului pentru a produce proteine nu pot fi sintetizați și trebuie suplimentați prin
dietă, numindu-se aminoacizi esențiali (Tab. 1.1).

Tab. 1.1: Aminoacizi esențiali.

Aminoacizii esențiali sunt: leucina, izoleucina, lizina, metionina, fenilalanina,

treonina, triptofan și valina.

11
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Leucina (Leu)
Este un aminoacid esențial, mono-amino mono-carboxilic ramificat, cu caracter
nepolar, implicată în procesele de vindecare ale muschiului, pielii și oaselor și
recuperarea postchirurgicală. Este al doilea cel mai comun aminoacid ce intră în structura
proteinelor. Este necesară pentru creșterea optimă la copii și menține balanța azotată la
adulți.
Izoleucina (Ile)
Este un aminoacid esențial, mono-amino mono-carboxilic ramificat, cu caracter
nepolar, îndeplinind roluri similare cu cele ale leucinei. Alterarea metabolismului celor
două duce la apariția bolii urinii cu miros de sirop de arțar.
Lizina (Lys)

Este un aminoacid esențial, polar cu caracter bazic, cu rol în sinteza anticorpilor și

homeostazia calciului. Este necesară pentru dezvoltarea normală a oganismului, fiind
implicată în sinteza osoasă la copii și în menținerea balanței azotate a adultului. Este un
precursor al carnitinei și contribuie la formarea colagenului. Punctul izoelectric este 9.7.
Metionina (Met)
Este un aminoacid esențial, ce conține sulf, cu caracter nepolar, fiind un precursor
pentru creatină, epinefrină, ornitină, colină și putresceină. Este o sursă de sulf necesară
pentru dezvoltarea normală a organismului și contribuie la detoxifierea organismului.
Este donor de grupări metil sub formă de S-Adenozin-Metionină.
Fenilalanina (Phe)
Este un aminoacid esențial, cu radical aromatic, având caracter nonpolar. Scade
percepția durerii și este implicată în procesele de învățare și memorie. La nivelul
sistemului nervos central este utilizată în calea de sinteză a norepinefrinei, dacă se
găsește în cantități mari, poate interfera cu producerea de serotonină, care îndeplinește
rolul de neurotransmiţător. Intră în compoziția aspartamului, un îndulcitor artificial și
are rol esențial în biosinteza altor aminoacizi. Alterarea metabolismului fenilalaninei
duce la apariția fenilcetonuriei, aminoacidopatie caracterizată de eliminarea
fenilcetonelor în urină și inversarea raportului fenilalanină/tirozină. Punctul izoelectric
este 5.9.
Treonina
Este un aminoacid esențial, ce conține o grupare hidroxil, cu caracter polar neutru, cu
rol important în sinteza unor neurotransmițători și în sinteza colagenului și a elastinei.
Triptofanul
12
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Este un aminoacid esențial, heterociclic, ce prezintă o grupare indol, având caracter

polar. Triptofanul este atât precursor al serotoninei, cât şi al melatoninei. Melatonina (5-
hidroxi triptofanul) este obținută prin hidroxilarea în poziția cinci a triptofanului, sub
acțiunea triptofan hidroxilazei și este utilizată pentru tratamentul depresiei. Serotonina
(5-hidroxi triptamina) este rezultatul decarboxilării 5-hidroxi triptofanului sub acțiunea
triptofan decarboxilazei. Este un important neurotransmițător cu rol în reglarea tonusului
vascular și este responsabilă de procesele de dependență hedonică. De asemenea,
triptofanul poate fi considerat un relaxant natural, scăzând anxietatea şi depresia. Punctul
izoelectric este 5.9.
Valina
Este un aminoacid esențial, mono-amino mono-carboxilic ramificat, cu caracter non-
polar implicat în sinteza proteinelor fibroase. Are un rol esențial în coordonarea
musculară, repararea tisulară și menținerea balanței azotate. Este folosită ca sursă de
energie la nivel muscular. Valina este utilizată în tratamentul insomniei, anxietății,
patologiei musculare și hepato-biliare. Punctul izoelectric este 6.
Cei 10 aminoacizi ce intră în componenţa proteinelor și pot fi sintetizați de către
organism (aminoacizi neesențiali) sunt: alanina, arginina*, asparagina, acid aspartic,
cisteina**, acidul glutamic, glutamina, glicina, histidina*, prolina, serina şi tirozina**
(Tab. 1.2).

Tab. 1.2: Aminoacizi neesențiali și semi-esențiali (*).

*
Aminoacizi semi-esențiali: rata lor de sinteză în organism în condiții normale
este suficientă, devine însă insuficientă în condiții particulare
(traumatisme, intervenții chirurgicale, sepsis, etc.)
**
Aminoacizi condiționat-esențiali: deoarece sunt sintetizați din aminoacizi esențiali
fenilalanina, respectiv metionina, pot deveni indispensabili pentru organism atunci când
sinteza celor două este insuficientă.

13
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Principalii aminoacizi non-proteinogeni și rolurile acestora sunt prezentați în tabelul

1.3.

Tabelul 1.3: Aminoacizi non-proteinogeni.

Arginina (Arg)
Este un aminoacid semi-esențial, di-amino mono-carboxilic, cu rol important în
diviziunea celulară, stimularea sintezei proteice, biosinteza ureei și creatininei. Este
precursor pentru sinteza oxidului nitric și este frecvent localizată la nivelul situsului
catalitic activ pentru numeroase enzime. Punctul izoelectric al argininei este la 10.8.
Histidina (His)
Este un aminoacid semi-esențial, heterociclic, cu caracter bazic, cu o grupare
imidazol, fiind un precursor direct al histaminei. Histamina este o proteină implicată în
generarea răspunsului imun al organismului și stimulează secreția gastrinei. Alt rol
important al histidinei este acela de a furniza atomii de carbon necesari pentru biosinteza
bazelor purinice. Este necesară pentru creșterea organismului și are rol în conducerea
impulsului nervos, fiind implicată în sinteza mielinei. Punctul izoelectric este la 7.6.
Cisteina (Cys)
Este un aminoacid ce conține sulf, cu rol important structural și funcțional pentru
proteine şi enzime, astfel încât poate să devină esențial pentru sugari, vârstnici sau în
cazul sindroamelor de malabsorbție. Este absorbită ca cistină în tractul gastrointestinal,
un compus mai stabil, fiind ulterior redusă la două molecule de cisteină.

14
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Tirozina (Tyr)
Este un aminoacid hidrofil sintetizat din fenilalanină, fiind un precursor pentru
sinteza hormonilor adrenali: epinefrina, norepinefrina și dopamina și al hormonilor
tiroidieni. Acționează ca stimulent al metabolismului și sistemului nervos, reduce
depresia și anxietatea și scade apetitul.
Un alt rol important al aminoacizilor este acela de neurotransmiţători: acidul glutamic
(glutamatul), acidul aspartic, serina, glicina și acidul gama amino butiric.
Glutamatul (Glu)
Este un aminoacid cu caracter acid la pH neutru, fiind principalul neurotransmițător
cu caracter excitator. Are un rol important în plasticitatea sinaptică şi stimulează
procesele de învățare și memoria. Excesul de glutamat extracelular duce la deteriorare și
moarte neuronală și este întânlit în traumatismele cerebrale, accidentele vasculare
cerebrale, scleroza laterală amiotrofică, boala Alzheimer. Acidul glutamic a fost asociat
și cu apariția crizelor epileptice.
Participă la reacțiile de transaminare și are rol important în metabolismul
carbohidraților și lipidelor. De asemenea, se găsește în numeroase alimente, fiind folosit
și ca aditiv alimentar, potențator de aromă, sub formă de glutamat monosodic.
Sub acțiunea glutamat decarboxilazei ajută la sinteza acidului gama amino butiric și
poate intra în ciclul Krebs sub formă de alfacetoglutarat, în urma reacțiilor de
transaminare.
Acidul gama amino butiric (GABA)
Are rol inhibitor la nivelul neuronilor GABA-ergici, acționând prin intermediul a doi
receptori: GABA-A și GABA-B, permițând controlul farmacologic al compușilor.
Sindromul Stiffman este o tulburare neurologică ce se caracterizează prin scăderea
sintezei GABA, manifestată prin hipertonie musculară.
Glicina (Gly)
Este un aminoacid non-esențial, alifatic nepolar și este singurul aminoacid ce nu este
optic activ, deoarece nu are în structura sa atomi de carbon asimetrici. Glicina este
esențială în sinteza acizilor nucleici, acizilor biliari, purinelor, porfirinelor și altor
proteine și aminoacizi. Este folosită ca îndulcitor, potențiator de aromă, datorită
gustului său dulce. De asemenea, glicina este un neurotransmițător cu rol inhibitor
la nivelul sistemului nervos central, în măduva spinării, trunchiul cerebral și retină.

Analiza de laborator a aminoacizilor

Cel mai frecvent urmărim nivelul aminoacizilor în sânge și urină.

15
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Concentrația plasmatică a aminoacizilor variază pe parcursul zilei cu aproximativ

30%, fiind mai ridicată după-amiaza și mai scăzută dimineața.
Concentrația plasmatică a aminoacizilor este ridicată în prima zi de viață. De
asemenea, nou-născuții, mai ales cei prematuri, au o excreție crescută de aminoacizi
cauzată de imaturitatea sistemului de reabsorbție tubulară renală.
Aminoacizii sunt filtrați liber la nivelul membranei glomerulare renale, însă
majoritatea sunt reabsorbiți la nivelul tubilor renali. Aminoaciduria (eliminarea
aminoacizilor în urină) este tranzitorie la persoanele sănătoase și devine patologică
atunci când:
• concentrația plasmatică crescută a unui aminoacid depășește capacitatea de

• reabsorbție
există un adefect
rinichiului;
congenital sau dobândit la nivelul transportorului
transmembranar renal pentru unul sau mai mulți aminoacizi;
• apare saturarea sistemului de reabsorbție tubular renal.
Este necesar ca pacienții să urmeze o dietă normală cu aproximativ 2-3 zile înaintea
recoltării probelor, cu o perioadă de post de minim 8 ore. Probele de sânge și urină
trebuie recoltate simultan, fiind preferată utilizarea vacutainerelor heparinizate pentru
obținerea plasmei. Majoritatea aminoacizilor rămân stabili în probele colectate, cu
excepția glutaminei, care ciclizează la 5-oxiprolina, cu eliberare de amoniac.
Procesarea probelor este efectuată rapid, fiind necesară o etapă de deproteinizare în
primele 30 de minute de la colectare. Analiza cantitativă a aminoacizilor urinari necesită
colectarea pe 24 de ore a urinei și conservarea acesteia cu timol.
Testele de laborator utilizate pentru identificarea aminoacidopatiilor se împart în:
1. Teste de screening:
a. Testul Guthrie
b. Cromatografia planară în strat subțire
c. Teste urinare de culoare
2. Teste cantitative:
a. Cromatografia
b. Electroforeza capilara
c. Spectrometria în masă
3. Teste specifice de identificare a aminoacizilor:
a. Spectrometria în masa
b. Teste imunoenzimatice
Cromatografia
Cromatografia este o metodă fizică de separare și identificare a compușilor chimici
prezenți în amestecuri complexe, pe baza vitezei cu care sunt transportați de către o fază
mobilă printr-o fază staționară.

16
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Termenul cromatografie este derivat din grecescul „chroma”, care înseamnă culoare
și „graphia” – scris. Pentru prima dată folosită de către Tsvet în 1903 pentru separarea
pigmenților vegetali, tehnica a crescut în popularitate după anul 1930 și a stat la baza
secvențierii proteinelor, odată cu descoperirea structurii de aminoacizi a insulinei în
1955 de către Federick Sanger. În prezent, tehnicile moderne de cromatografie ne permit
separarea diferitelor biomolecule, inclusiv proteine, carbohidrați, lipide și acizi
nucleici.
Etapele cromatografiei
Protocolul de separate cromatografică presupune:
a) aplicarea amestecului de separat pe un mediu solid staționar sau în faza mobilă;
b) separarea analiților pe măsură ce faza mobilă se deplasează prin faza staționară;
c) eluarea are loc în timpi diferiți, analitul cel mai puțin atras de faza staționară
separându-se primul;
d) identificarea analiților cu ajutorul indicelui de refracție, absorbanței în UV, etc.;
e) generarea cromatogramei.
În funcție de tipul de suport folosit, metodele cromatografice se împart în:
• Cromatografie pe coloană
• Cromatografie planară
Cromatografia pe coloană
Folosește coloane în care sunt împachetate substanțe insolubile, capabile să lege
reversibil și diferențiat componenții amestecului de separat, cele mai comun utilizate
fiind oxidul de aluminiu, silicații și silicagelul. Amestecul de separat este pipetat în strat
fin în partea superioară a coloanei, după ce aceasta a fost echilibrată cu o soluție tampon.
Pe măsură ce eluentul trece prin coloană, amestecul de separat va parcurge coloana,
rezultând benzi ce vor elua în timpi diferiți. Astfel, componentul mai strâns legat de
matriță va parcurge coloana mai lent (Fig. 1).

Fig. 1.1: Cromatografia pe coloane – reprezentare schematică.

17
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Lichid cromatografia de înaltă performanță (HPLC)

Este o tehnică modernă de separare cromatografică ce folosește o fază mobilă lichidă
și coloane de oțel care permit aplicarea unei presiuni înalte, obținându-se astfel o creștere
importantă a performanței metodei.
Lichid cromatografia de înaltă performanță se subclasifică în:
a) Cromatografie de adsorbție de înaltă performanță
b) Cromatografie de repartiție de înaltă performanță
c) Cromatografie de schimb ionic de înaltă performanță
d) Cromatografie de înaltă performanță prin excluderea mărimii particulelor
e) Cromatografie de afinitate
Cromatografie de adsorbție de înaltă performanță
Tehnica se bazează pe separarea analiților prin diferența de adsorbție la suprafața unei
faze solide, ca urmare a interacțiunii grupurilor funcționale polare cu faza staționară.
Faza staționară polară poate fi bazică - alumina (oxidul de aluminiu), acidă - silcagelul
sau neutră – cărbune activ, acestea fiind și cele mai folosite substanțe adsorbante
împachetate în coloane. Amestecul de separat este aplicat în partea superioară a coloanei
împreună cu solventul. În urma procesului de eluție, componenții separați în eluat se vor
vizualiza sub forma unor fracțiuni.
Cromatografia de repartiție de înaltă performanță
Metoda utilizează solubilitatea relativă a analiților într-un amestec de solvent organic
(nepolar) și apos (polar) pentru a separa părțile componente. Tehnic, unul dintre lichidele
nonmiscibile funcționează ca fază staționară prin legarea chimică sau adsorbția în film
fin pe suprafața de suport sau pe peretele interior al coloanei. Moleculele nepolare sunt
extrase în solventul organic, în timp ce moleculele polare rămân în solventul apos (Fig.
1.2).
Când solventul mobil este mai puțin polar decât solventul staționar, sistemele de
repartiție sunt considerate de fază normală (NPLC – normal phase liquid
chromathography), iar când solventul mobil este mai polar, sistemele de partiție sunt
considerate de fază inversă (RPLC – reversed phase liquid chromatography).
Ca rezultat, moleculele de solut sunt împărțite între două faze distincte.
Coeficientul de repartiție este raportul dintre concentrațiile de dizolvat din cele două
lichide.

18
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Fig. 1.2: Cromatografia de repartiție – reprezentare schematică.

Cromatografia de schimb ionic de înaltă performanță

Cromatografia de schimb ionic de înaltă performanță are la bază schimbul de ioni
între o suprafață staționară încărcată și analiții de sarcină opusă din faza mobilă. Analiții
sunt fie cationi (încărcați pozitiv), fie anioni (încărcați negativ), în funcție de condițiile
de migrare. Cel mai frecvent, suprafața staționară este reprezentată de o rășină polimer
sau silicagel insolubile, la care sunt fixate grupări funcționale cu sarcini pozitive sau
negative, numită „rășină schimbătoare de ioni” (Fig. 1.3).
Rășinile schimbătoare de cationi sunt folosite pentru a separa sau „schimba” soluții
cationice (încărcate pozitiv) și includ grupări funcționale încărcate negativ, cum ar fi
grupări puternic acide (ioni sulfonat) sau grupări slab acide: ionii carboxilat, grupările
carboximetil (CM), fosfat (P), sulfometil (SM), sulfoetil (SE) sau sulfopropil (SP).
Separarea soluțiilor anionice (încărcate negativ) se face prin rășini schimbătoare de
anioni, ce conțin amine cuaternare încărcate pozitiv (puternic bazice) sau grupări slab
bazice: aminoetil (AE), dietilaminoetil (DEAE), guanidoetil (GE) și epiclorhidrin-
trietanolamină (ECTEOLA).
Prin modificarea pH-ului fazei mobile, a forței ionice sau ambele, ionii soluției sunt
eluați selectiv. Ionii fixați la faza staționară se vor disloca din coloană prin eluții repetate
cu soluții ce conțin analiți cu o mai mare afinitate pentru grupările fixate pe coloană.

19
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Cromatografia de schimb ionic de înaltă performanță prezintă numeroase utilizări,

cum ar fi separarea aminoacizilor, peptidelor, proteinelor, nucleotidelor,
oligonucleotidelor și acizilor nucleici. Separarea și îndepărtarea ionilor anorganici din
amestecurile apoase este încă o utilizare majoră a cromatografiei de schimb ionic. De
exemplu, coloane cu „pat mixt” de rășini cationice și anionice sunt folosite pentru a
produce apă deionizată. Apa se formează atunci când protonii și ionii hidroxil sunt
deplasați prin coloană.

Fig. 1.3: Cromatografia de schimb ionic de înaltă performanță - reprezentare

schematică.

Cromatografia de înaltă performanță prin excluderea mărimii particulelor

Cromatografia prin excluderea mărimii particulelor, cunoscută și sub denumirea de
cromatografie prin filtrare în gel sau cromatografie prin penetrație în gel, este un tip de
cromatografie care separă analiții pe baza dimensiunilor lor moleculare. Procedura ține
cont de forma moleculei și de starea de hidratare. Odată cu trecerea prin coloană, analiții
de mici dimensiuni pătrund în porii fazei staționare, mobilitatea lor fiind diminuată, fapt
ce duce la o eluare tardivă (Fig. 1.4).

20
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Mai multe tipuri de materiale pot fi utilizate ca fază staționară, cum ar fi: dextran
reticulat, poliacrilamidă, agaroză, polistiren-divinilbenzen, sticlă poroasă și amestecuri
ale celor menționate mai sus.
Aceste materiale sunt poroase, având diametrele porilor suficient de mari pentru a
capta pentru scurt timp molecule mici. Moleculele care sunt prea mari pentru a pătrunde
în pori sunt eluate primele. Moleculele de dimensiuni intermediare sunt captate în
diferite fracțiuni ale porilor și eluează între molecule mari și mici.
Faza mobilă poate fi un solvent polar (apa) sau un solvent nepolar (tetrahidrofuranul),
în funcție de solubilitatea și stabilitatea analiților ce urmează a fi separați.
Cromatografie prin filtrare în gel folosește un gel hidrofil format dintr-un amestec
de apă cu dextran reticulat, poliacrilamidă sau agaroză și este utilizată împreună cu o
faza mobilă apoasă pentru separarea amestecurilor polare.
Cromatografie prin penetrție în gel utilizează particule de gel de polistiren hidrofob
și o fază mobilă organică nepolară pentru a separa mixturi nepolare.

Fig. 1.4: Cromatografia de înaltă performanță prin excluderea mărimii particulelor -

reprezentare schematică.

Cromatografia de afinitate
În cromatografia de afinitate, analitul și ligandul au o relație biologică unică, aceasta
fiind exploatată pentru a le separa. În această formă de cromatografie, sunt folosite
21
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

interacțiuni enzimă-substrat, hormon-receptor sau antigen-anticorp, ce generează

interacțiuni biospecifice între componenții amestecului de separat și un ligand inclus în
sistemul cromatografic. Puterea cromatografiei de afinitate rezidă din selectivitatea sa
(Fig. 1.5).
Coenzimele pot fi utilizate pentru a purifica enzimele în acest mod, de exemplu NAD+
este utilizată pentru purificarea dehidrogenazelor. Antigenele ar putea fi izolate cu
ușurință folosind anticorpi. Anticorpii, pe de altă parte, pot fi purificați prin trecerea lor
printr-o coloană care conține antigen.
Prima etapă a cromatografiei de afinitate constă în echilibrarea mediului în tamponul
de legare. Apoi, amestecul de separat este trecut prin coloană, rezultând eluția
componentelor nelegate. Separarea componentului țintă de ligandul specific se poate
face:
a) specific, cu ajutorul unui ligand competitiv;
b) nespecific, prin modificarea pH-ului, a polarității sau a puterii ionice.
Cromatografia de afinitate a fost utilizată în laboratorul clinic pentru a separa analiți
cum ar fi hemoglobina glicozilată în coloane de fenil boronat și lipoproteinele cu
densitate scăzută (LDL) și foarte scăzută (VLDL) în coloane cu heparină. De asemenea,
a fost folosită pentru a purifica proteine și anticorpi în scopuri de cercetare.

Fig. 1.5: Cromatografia de afinitate – reprezentare schematică.

22
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Aparatura
Componentele principale ale unui sistem de cromatografie lichidă de înaltă
performanță sunt:
a) rezervorul de solvent;
b) pompa;
c) filtru de gaz;
d) sistem de introducere a probei;
e) coloana;
f) sistem de detecție;
g) sistem de control.
a) Rezervorul de solvent este cel mai adesea de sticlă și este special construit pentru a
permite utilizarea unor volume mici de solvent. Sistemele moderne cuprind filtre
pentru îndepărtarea particulelor din solvenți, precum și robinet pentru degazarea în
vid.
b) Sistemul cromatografic folosește atât pompe pneumatice, cu presiune constantă, cât
și pompe mecanice, cu debit constant, acestea din urmă fiind mai frecvente. Pompa
mecanică aspiră faza mobilă din rezervorul de solvent și furnizează un flux constant
prin sistemul cromatografic în timpul funcționării.
c) Dispozitivul pentru degazare sau filtrul de gaz este necesar pentru îndepărtarea
bulelor de gaz din solvenți și poate fi realizat prin barbotare de heliu în rezervorul
de solvent sau prin folosirea unei unități de degazare cu vid.
d) Introducerea probei poate fi realizată prin injectare cu seringi, mult mai puțin
utilizată în HPLC, sau prin folosirea unei valve de injectare cu mai multe canale.
Acestea sunt precise, funcționează la presiune înaltă, pot fi programate pentru
utilizarea cu sisteme automatizate.
e) Cromatografia de lichide utilizează atât coloane compacte, cât și coloane capilare.
Selectivitatea, stabilitatea și reproductibilitatea coloanelor analitice au fost mult
îmbunătățite datorită progreselor tehnologice, precum și a materialul utilizat pentru
a acoperi suprafața interioară a unor astfel de coloane. Majoritatea coloanelor HPLC
sunt fabricate din tuburi din oțel inoxidabil cu diametrul cuprins între 0,1 mm și 5
mm și lungimi cuprinse între 50 mm și 250 mm. În plus, sunt dezvoltate nanocoloane
cu diametrul care variază de la 25 la 100 pm. În general, coloanele cu diametrul mai
mic sunt mai eficiente, au limite de detecție mai mică și au nevoie de volume mai
mici ale fazei mobile.
f) Sistemul de detecție cel mai utilizat este de tip absorbție în UV (fotometru și
spectrofotometru), dar pot fi utilizate și detectoare de refracție, cu fluorescență,
electrochimice. Detectoarele HPLC moderne urmăresc eluatul pe măsură ce iese din
coloană și generează un semnal electric proporțional cu concentrația fiecărei
componente separate.
23
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

g) Sistemul de control computerizat realizează atât operațiunile de procesare a datelor,

cât și controlul sistemului cromatografic prin reglarea diferiților parametrii.
Gaz Cromatografia (GC)
Fază mobilă gazoasă este utilizată pentru a transporta un amestec de substanțe volatile
sau parțial volatile printr-o coloană care conține faza staționară. Un gaz inert, cum ar fi
azotul, heliul sau argonul este utilizat ca fază mobilă, cunoscut și sub numele de gaz
purtător. Principiul separării folosește variațiile relative ale presiunii vaporilor
substanțelor dizolvate și interacțiunile cu faza staționară. Ca rezultat, coloana eluează un
dizolvat mai volatil înainte de unul mai puțin volatil. Mai mult, o substanță dizolvată
care interacționează selectiv cu faza staționară eluează din coloană după o substanță
dizolvată care are un grad mai scăzut de interacțiune. Dizolvatele separate sunt
transportate la detector în ordinea eluării lor de către efluentul coloanei.
Cromatografia gazoasă poate fi cromatografia gaz-solid (CGS) sau cromatografia
gaz-lichid (CGL), care utilizează un lichid nevolatil ca fază staționară. În laboratoarele
clinice, CGL este cel mai adesea utilizată.
Cromatografia gaz-solid (CGS)
Faza staționară este solidă, separarea componenților apare în principal prin diferența
de adsorbție la suprafața fazei solide.
Cromatografia gaz-lichid (CGL)
Este un tip de cromatografie de partiție în care faza staționară este un lichid, în timp
ce faza mobilă este un gaz. O coloană de material inert susține faza lichidă nevolatilă
legată chimic pe particulele de împachetare ale coloanei sau direct pe peretele interior al
coloanei capilare. La un capăt al coloanei amestecul de compuși care urmează să fie
separați devine volatil, iar vaporii sunt trecuți prin coloană de un gaz purtător inert, cum
ar fi argonul sau azotul. Un dispozitiv de detectare identifică și cuantifică fracțiile care
ies din coloană.
Aparatura
Sistemul de bază pentru cromatografia gazoasă este format din:
a) coloană cromatografică;
b) rezervor cu gaz purtător și aparate de reglare al debitului fluxului de gaz prin
sistem;
c) un injector pentru introducerea unei probe sau analitul derivatizat în coloană;
d) sistem de încălzire la temperatură pre-specificată;
e) sistem de detecție.
a) Coloanele cele mai frecvent utilizate pentru gaz-cromatografie sunt coloanele
compacte și cele capilare. Au un diametru interior de 1 până la 4 mm, o lungime de

24
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

1 m sau mai mult și sunt realizate din tuburi de sticlă sau oțel inoxidabil. Deși
coloanele înguste sunt mai eficiente, coloanele mai largi pot fi folosite pentru mai
multe probe. Coloanele mai lungi sunt mai eficiente, dar necesită presiuni mai mari
ale gazului purtător.
b) Rezervorul cu gaz purtător și aparatura de reglare sunt esențiale pentru eficiența
coloanei și generarea de rezultate reproductibile. De la dispozitive mecanice simple,
la sistemele electronice complexe utilizate pentru a oferi debite constante, toate
asigură o alimentare constantă cu gaz purtător în sistem. Un sistem simplu constă
dintr-un rezervor de gaz sub presiune, o supapă cu ac pentru controlul debitului, un
debitmetru și un manometru. Sistemele înalt performante, utilizează un regulator de
debit diferențial mai avansat, cum ar fi un sistem electronic de control al presiunii
programat pentru a regla debitul și presiunea gazului purtător, la o temperatură
specifică.
c) Injectorul are ca sarcină introducerea în coloană a probei de examinat necesară
pentru a începe procesul cromatografic la cel mai mic flux de gaz în coloană. O
microseringă de sticlă este utilizată pentru a injecta o alicotă de 1 până la 10 μl din
proba de separat printr-un sept care acționează ca interfață între injector și sistemul
cromatografic.
d) Atât coloanele compacte, cât și cele capilare necesită un control precis al
temperaturii coloanei, injectorului și detectorului în timpul funcționării.
Temperatura coloanei poate fi controlată prin introducerea acesteia într-un cuptor
sau prin încălzire directă. Încălzirea rezistivă este utilizată în mod obișnuit pentru a
regla temperatura injectorului și a detectorului. În timpul cromatografiei,
temperatura coloanei este fie menținută la un nivel prestabilit constant (funcționare
izotermă), fie modificată în funcție de timp (funcționare programată în gradient de
temperatură).
e) Sistemul de detecție utilizează o varietate de detectori sensibili care generează
semnal electronic la trecerea eluenților prin coloană. Acestea includ atât unități
universale care detectează o gamă largă de analiți, cât și dispozitive extrem de
selective care detectează doar analiți specifici (Tab. 1.3).

25
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Tab. 1.4: Tipuri de detectori utilizați în gaz-cromatografie.

Derivatizarea unui eșantion

Deoarece multe substanțe chimice sunt nevolatile, ele sunt dificil de separat folosind
gaz-cromatografia. Modificarea chimică sau derivatizarea crește volatilitatea unor astfel
de substanțe pentru analiză și se poate realiza prin: achilare, sililare (introducerea unui
atom de Si într-o structură chimică), esterificare și oximare. În plus față de creșterea
volatilității soluției, derivatizarea este utilizată pentru a îmbunătăți specificitatea și
sensibilitatea testelor. De exemplu, derivatizarea amfetaminei cu un reactiv chiral
mărește selectivitatea și facilitează separarea izomerilor D și L pe o coloană CG
convențională.
Cromatografia planară
Cromatografia pe hârtie
Cromatografia pe hârtie folosește ca fază staționară un strat de apă sau un solvent
polar depus peste fibrele de hârtie (celuloză), fiind un tip de cromatografie de repartiție.
Faza mobilă este alcătuită din solvenți nemiscibili: un solvent polar, un solvent
nepolar și un acid sau o bază pentru ajustarea pH-ului, cum ar fi butanol-acid acetic-apă
și fenol-apă-amoniac. Dacă faza mobilă este aplicată jos (crescător), vorbim despre
cromatografie ascendentă, iar dacă este aplicată sus (descrescător), de cromatografie
descendentă.
Câțiva microlitri din amestecul de compuși care urmează să fie separați se aplică la
linia de start, la aproximativ 2-3cm de margine.
Hârtia este plasată într-o cameră de sticlă care conține solventul, închisă compact
pentru a asigura saturarea mediului și pentru a împiedica evaporarea. Solventul
transportă componentele amestecului de separat cu viteze diferite, în funcție de afinitatea
lor pentru faza staționară sau mobilă. Distanța pe care o parcurge fiecare compus este
26
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

determinată de factorul de retenție: Rf – raportul dintre distanța parcursă de compus și

distanța parcursă de solvent.
Cromatografia pe hârtie monodimensională folosește un singur amestec de
solvenți pentru deplasarea compușilor într-o singură direcție (Fig. 1.6).

Fig. 1.6: Cromatografia pe hârtie monodimensională – reprezentare schematică.

Cromatografia pe hârtie bidimensională folosește două migrări, cu amestecuri

diferite de solvenți, pentru a separa compușii ai căror Rf în cromatografia
monodimensională este dificil de diferențiat (Fig. 1.7).

Fig. 1.7: Cromatografia pe hârtie bidimensională - reprezentare schematică.

27
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Cromatografia pe strat subțire

Este un alt tip de cromatografie de repartiție ce folosește ca fază staționară un strat
subțire de silicagel sau alumină fixat pe o placă de sticlă, plastic sau metal, iar faza
mobilă este un amestec de solvenți ce permit separarea compușilor de analizat. În cazul
cromatografiei pe hârtie, separarea compușilor poate dura până la 14-16 ore, în timp ce
cromatografia pe strat subțire permite separarea în doar 2-4 ore. Poate fi mono sau
bidimensională, iar procesul de separare este similar cu cel al cromatografiei pe hârtie.
După uscarea plăcii, componentele separate sunt detectate și identificate folosind o
varietate de metode, inclusiv detectori cu ultraviolete (UV), fluorescență, pulverizare cu
reactivi speciali pentru generarea de culori.
Evaluarea rezultatelor
Analiza calitativă
Pentru identificarea compușilor separați prin cromatografie este utilizată compararea
timpului de retenție sau distanța parcursă pe o placă (Rf) cu cel al unor compuși standard.
În cromatografia planară compușii de referință sunt cromatografiați simultan cu proba
de identificat. Identificarea se realizează prin măsurarea factorului de retenție (Rf):
raportul dintre distanța parcursă de compus și linia de front (distanța parcursă de
solvent). Se presupune că sunt compuși identici dacă Rf este identic. Cu toate acestea,
deoarece mai mult de un compus poate avea același Rf într-un sistem cromatografic dat,
identificarea prezumtivă trebuie confirmată folosind alte metode, cum ar fi: reactivi
specifici de pulverizare, complexe antigen-anticorp sau izolarea compusului urmată de
analiză chimică și/sau instrumentală.
În cazul cromatografiei pe coloane, este posibilă introducerea componentelor unei
singure probe în două coloane cu faze staționare distincte, cu detectoare de același tip
sau de tipuri diferite. Când proprietățile de reținere ale unui singur analit sunt comparate
cu cele ale unei substanțe de referință pe două coloane distincte, șansele ca analitul să
fie identificat corect se îmbunătățesc. Cu toate acestea, un detector cu informații
structurale, cum ar fi un spectrometru de masă, oferă cea mai fiabilă identificare a
analiților.
Analiză cantitativă
Datele cantitative sunt generate folosind semnalele electronice generate de detector.
Concentrația compușilor este proporțională cu volumul de eluat și timpul de eluție în
raport cu absorbanța. Pentru calibrare se folosesc soluții cu concentrații cunoscute ale
standardelor. Tehnicile de calibrare utilizate sunt atât externe, cât și interne.
Calibrarea externă implică procesarea soluțiilor de referință care conțin cantități
cunoscute de analiți în același mod în care sunt procesate probele care conțin analitul.

28
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Concentrația analitului din probe este calculată utilizând o curbă de calibrare a înălțimii
vârfului, aria vârfului sau densității spotului față de concentrația standardului.
Calibrarea internă, cunoscută și ca standardizare internă, implică prepararea soluțiilor
de referință cu concentrații cunoscute de analit, precum și adăugarea unei cantități
constante dintr-un compus diferit, standardul intern, la fiecare soluție de referință și
probă. O curbă de calibrare care corectează pierderile sistemului este construită prin
reprezentarea grafică a raportului dintre înălțimea (sau aria) vârfului analitului sau
densitatea spotului la înălțimea (sau aria) vârfului standardului intern sau densitatea
spotului față de concentrația analitului.

Patobiochimie

Defecte metabolice în metabolismul aminoacizilor

Aminoacidopatiile reprezintă o clasă de boli determinate de modificări genetice ale
unor enzime implicate în catabolismul anumitor aminoacizi. Defectele ereditare se pot
exprima prin afectarea fie a activității unei enzime specifice, fie a transportului
membranar al aminoacizilor. Defectele ereditare pot fi determinate de pierderea totală a
activității enzimei sau, mai frecvent, o pierdere parțială a activității catalitice. Ca urmare
a acestor defecte enzimatice, căile metabolice sunt blocate la nivelul enzimei afectate,
determinând acumularea produșilor intermediari anteriori, care în concentrații mari au
efect toxic sau pot forma produși toxici care pot fi cauza bolilor.
Aminoacidopatiile se manifestă imediat după naștere, iar fără tratament, prin
acumularea metaboliților cu efect nociv, determină apariția retardului mental și alte
anomali de dezvoltare.
Aceste defecte ereditare ale metabolismului aminoacizilor pot fi puse în evidență prin
screening neonatal. Au fost descrise peste 100 de astfel de tulburări, dar cele mai multe
dintre ele sunt rare, determinând complicații severe prin prezența în sânge a
aminoacizilor toxici sau a produșilor de metabolism.

Fenilcetonuria

Fenilcetonuria este o boală ereditară cu transmitere autozomal recesivă, datorată

deficitului de fenilalanin-hidroxilază, având o prevalență de 1 la 15000 de nașteri. Există
două forme de fenilcetonurie, forma clasică și forma atipică.
Forma clasică este determinată de un defect în sinteza părții proteice a fenil-alanin-
hidroxilazei. Forma atipică a fenilcetonuriei este determinată de un defect la nivelul
sintezei coenzimei (tetrahidrobiopterina BH4) sau un defect al enzimei dihidropteridin-
reductaza (BH2) care generează BH4 din BH2. Aceste deficite determină o creștere
indirectă a concentrației de fenilalanină, deoarece fenilalanin-hidroxilaza necesită drept

29
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

coenzimă – BH4. BH4 este un cofactor necesar sintezei aminoacizilor aromatici,

fenilalanină, tirozină și triptofan. Deficitul BH4 determină creșterea fenilalaninei și
deficit în procesul de biosinteză a neurotransmițătorilor derivați din tirozină și triptofan.
Fenilalanina are efect inhibitor asupra enzimelor tirozinhidroxilaza și
triptofanhidroxilaza. Terapia cu L-DOPA și 5-hidroxitriptofan ameliorează evoluția
acestor forme de hiperfenilalaninemie.
Forma clasică se caracterizează prin absența activității enzimatice a enzimei
fenilalanin-hidroxilazei (enzimă care catalizează conversia fenilalaninei în tirozină),
determinând acumularea fenilalaninei peste valoarea de 1200 µmol/L. La nou născuți
limita superioară a fenilalaninei este de 120 µmol/L. În formele netratate de
fenilcetonurie nivelul seric al fenilalaninei este peste valoarea de 2.4 mM/L.
Deficitele parțiale ale fenilalaninhidroxilazei sunt caracterizate prin niveluri ale
fenilalaninei între 600-1200 µmol/L în formele medii de fenilcetonurie, sau între 180-
600 µmol/L situație în care nu se acumulează fenilcetone.
Din fenilalanina care se acumuleză prin transaminare rezultă acid fenilpiruvic, din
care rezultă acid fenilacetic (fenilcetone) și ulterior acid fenil-lactic și
fenilacetilglutamină. Acești compuși au efecte toxice, în special la nivel cerebral unde
determină demielinizări cu caracter reversibil, dar și alte tipuri de leziuni responsabile
de „idioțenia fenilpiruvică”. Acești compuși sunt prezenți la nivel sangvin și în urină
dând un miros caracteristic urinei.
Nou născuții și copiii cu aceste defect ereditar, datorită efectelor toxice la nivel
cerebral ale fenilalaninei și a metaboliților acesteia, pot prezenta microcefalie și retard
mental. Acestea pot fi prevenite dacă boala este diagnosticată la naștere și copii urmează
o dietă cu conținut scăzut de fenilalanină. Femeile cu fenilcetonurie netratate pe durata
sarcini dau naștere unor copii cu microcefalie și retard mental. Acestea pot fi prevenite
dacă mama urmează o dietă cu restricție pentru fenilalanină înainte de concepție.
Diagnosticul fenilcetonuriei
Metoda de referință pentru determinarea nivelului seric al fenilalaninei este
cromatografia lichidă de înaltă performanță. Pot fi utilizate și alte metode cum ar fi
metoda fluorometrică și cele enzimatice.
Deoarece în fenilcetonurie se întâlnește creșterea fenilalaninei și scăderea tirozinei
trebuie calculat raportul fenilalanină/tirozină.
Un test rapid de diagnostic al fenilcetonuriei neonatale este microwave-assisted
silylation urmată de gaz-cromatografie. Aminoacizi sunt extrași și derivați rapid, din
probele de sânge cu N,O bis trimetilsilil-trifluoroacetamidă. Produșii rezultați sunt
ulterior analizați prin microwave-assisted silylation urmată de gaz-cromatografia.

30
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Diagnosticul prenatal se poate realiza utilizând tehnici de analiză ADN.

Fenilcetonuria rezultă din mutații independente, peste 400, la nivelul locusului
fenilalanin-hidroxilazei.
Tratamentul fenilcetonuriei
Deoarece proteinele naturale conțin fenilalanină, pentru evitarea depășirii nivelului
normal de fenilalanină, se recomandă o dietă care să conțină aminoacizi sintetici care va
fi completată cu alimente naturale cum ar fi fructele, legumele și anumite cereale.
Deoarece anumite niveluri de fenilalanină sunt necesare pentru creșterea și dezvolatarea
organismului o dietă cu conținut de fenilalanină în cantități mici este permisă. Alimentele
cu conținut proteic mare cum ar fi carnea, peștele, ouă, brânză și lapte trebuie evitate.
Medicamentul utilizat în tratamentul fenilcetonuriei este Kuvan (dihidroclorid
sapropterin). Acesta reduce nivelul fenilalaninei prin creșterea activității enzimei
fenilalanin-hidroxilazei, fiind eficient la pacienții cu deficite parțiale ale enzimei asociat
dietei cu resticție pentru fenilalanină.

Tab. 1.5: Fenilcetonuria.

Tirozinemia

Tirozinemia este o boală metabolică ereditară în care este afectat catabolismul

tirozinei, care determină excreția urinară a tirozinei și cataboliților acestora. Există trei
variante ale acestei boli, fiecare având o simptomatologie distinctă și fiind determinată
de un defect enzimatic distinct.
Tipul I este cea mai frecventă formă, având o prevalență de 1 la 100000 de nașteri și
este determinată de nivelul scăzut al enzimei fumaratacetoacetat hidrolaza.
Simptomatologia clinică cuprinde diaree, vărsături, icter, abdomen destins de volum,
edeme gambiere și creșterea riscului de sângerare. În tipul I al tirozinemiei pot apărea
insuficiență hepatică și renală, afectarea sistemului nervos central și creșterea riscului de
apariție al cirozei și neoplasmului hepatic.
Tipul II este determinat de deficitul tirozin aminotransferazei, având o prevalență de
1 la 25000. Tirozinaminotransferaza este prima din cele cinci enzime implicate în
31
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

convertirea tirozinei în molecule mici excretate renal sau folosite în scopul obținerii de
energie. Aproximativ jumătate din pacienții cu acest tip de afecțiune prezintă retard
mental și simptome cum ar fi fotofobie, lăcrimare excesivă, dureri oculare, leziuni
cutanate dureroase la nivelul palmelor și feței plantare a piciorului.
Tipul III este o formă rară de boală determinată de deficitul enzimei 4-
hidroxifenilpiruvat dioxigenaza, localizată preponderent la nivel hepatic și în cantități
mici la nivel renal. Aceasta face parte dintr-o serie de enzime implicate în fragmentarea
tirozinei. Simptomatologia clinică cuprinde retard mental, crize epileptice și afectarea
coordonării.
Diagnosticul acestei afecțiuni este pus prin confirmarea nivelurilor crescute de
tirozină prin spectrometrie de masă, cuplată cu teste care evidențiază niveluri crescute
ale metabolitului succinilacetona.
Tratamentul tirozinemiei cuprinde dietă cu conținut proteic redus și medicamentul
Nitisione care împiedică formarea acidului maleilacetoacetic și acidului
fumarilacetoacetic care sunt convertite în succinil acetonă cu efect hepato și nefrotoxic.
Alcaptonuria
Alcaptonuria este o boală metabolică rară, cu transmitere autozomal recesivă,
caracterizată prin absența enzimei homogentizat oxidaza implicată în catabolizarea
tirozinei și fenilalaninei. Prevalența bolii este de 1 la 250000 de nașteri. Datorită acestui
deficit enzimatic acidul homogentizic se acumulează în sânge și trece în urină, care în
contact cu aerul, datorită formării unor produși de oxidare ai acidului homogentizic, se
închide la culoare. În forme servere se colorează și țesuturile, în special conjunctivele,
datorită pigmenților formați din acidul homogentizic.
Simptomele caracteristice bolii apar târziu în evoluție, în jurul vârstei de 40 de ani.
Acidul homogentizic se poate acumula la nivelul cartilajelor și țesuturilor conjunctive
colagenice - pigmentarea ocronotică, articulațiilor – artrită, sclerei, nasului și
tendoanelor. Simptomele cardinale ale bolii sunt acidurie homogentizică, artrită și
pigmentare ocronotică.
Diagnosticul alcaptonuriei se pune prin analiza urinii. Dacă este adăugat feric clorid
în urină, acesta determină colorarea neagră a urinii pacienților cu alcaptonurie.
Tratamentul alcaptonuriei include doze mari de vitamina C care scad depunerea
pigmentului în cartilaje și poate încetinii evoluția artritei.

32
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Tab. 1.6: Alcaptonuria.

Boala urinei cu miros de sirop de arțar

Boala urinei cu miros de sirop de arțar este o afecțiune genetică cu transmitere

autozomal recesivă cu o prevalență de 1 la 150000 de nașteri, determinată de un defect
total sau parțial în activitatea enzimei α-cetoacid decarboxilaza implicată în
catabolizarea aminoacizilor alifatici cu catenă ramificată (valină, leucină și izoleucină).
Principala caracteristică a boli este mirosul de sirop de arțar al urinei, respirației și pielii.
Datorită deficitului acestei enzime, aminoacizii alifatici cu catenă ramificată și cetoacizii
corespunzători se acumulează în sânge, urină și lichid cefalorahidian.
Există mai multe forme ale acestei boli (forma clasică, forma intermediară și forma
intermitentă), cea mai frecventă formă fiind cea clasică. În forma clasică activitatea
enzimei este sub 2%.
Nou-născuții cu această boală nu prezintă simptomatologie clinică la naștere, dar
după o săptămână prezintă letargie, vărsături, scăderea apetitului, și simptomatologie
determinată de afectarea sistemului nervos central (rigiditate musculară, stupor,
respirație neregulată). Boala progresează, iar toxicitatea celor trei aminoacizi și a α-
cetoacizilor corespunzători determină apariția întârzierii dezvoltării mintale, crize
epileptice, acidoză și hipoglicemie. Dacă nu este diagnosticată și tratată la timp boala
este letală în forma clasică a bolii.
În forma intermediară activitatea enzimatică a decarboxilazei este de aproximativ
25%, determinând o creștere persistentă a aminoacizilor alifatici cu catenă ramificată,
dar aceste niveluri pot fi controlate print-o dietă restrictivă pentru leucină, izoleucină și
valină.
Metodele de diagnostic cuprind diagnosticul antenatal și screening-ul neonatal.
Tratamentul presupune administrarea unor preparate sintetice care conțin cantități
limitate de leucină, izoleucină și valină.

33
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Acidemia izovalerianică

Acidemia izovalerianică este o boală metabolică ereditară determinată de un deficit

al enzimei izovaleril-CoA dehidrogenaza care intervine în metabolismul aminoacidului
cu catenă ramificată leucina. Această boală are o prevalență de 1 la 250000 de nașteri
fiind determinată de o mutație la nivelul genei izovaleril-CoA dehidrogenaza.
Simptomatologia clinică a bolii apare la câteva zile după naștere și cuprinde vărsături,
letargie, crize epileptice, comă și chiar deces. O proporție mică din pacienții cu această
mutație genetică pot fi asimptomatici și nu vor prezenta niciodată simptome și semne ale
acestei boli.
Screening-ul neonatal al nou născuților cu acidemie izovalerianică se face prin
spectrofotometrie de masă și cromatografie. Analize de laborator indică acidoză
metabolică, cetonurie moderată, hiperamoniemie, neutropenie și leucopenie.
Tratamentul acestei boli include o dietă restrictivă pentru proteine care să prevină
acumularea acidului izovalerianic care are toxicitate la nivelul sistemului nervos central.
Administrarea orală a suplimentelor cu glicină și carnitină pot fi prescrise datorită
interacțiunii cu acidul izovalerianic în urma careia rezultă produși netoxici care sunt
rapid excretați.

Cistinuria

Cistinuria este o boală ereditară cu transmitere autozomal recesivă determinată de un

defect al transportului aminoacizilor sau mai rar de un deficit enzimatic. Cistinuria este
determinată de reabsorbția inadecvată a cisteinei la nivel renal, care favorizează creșterea
concentrației acestui aminoacid. Cistina poate precipita, determinând apariția calculilor
renali, în uretere și vezică. Calculii renali sunt cei care determină direct sau indirect
simptomatologia bolii care include colică renală, hematurie și infecții ale tractului urinar.
Diagnosticul cistinuriei este pus prin analiza urinei cu cianid nitroprusid care
reacționează cu grupările sulfhidril determinând colorarea urinii în roșu purpuriu. Un alt
test de laborator este determinarea în urină a trei aminoacizi cu structură similară cistinei
– lizină, arginină și ornitină.
Tratamentul cistinuriei are drept obiectiv principal prevenirea formării calculilor
renali, prin creșterea volumului urinar pentru a reduce concentrația urinară a cistinei și
reducerea precipitării acesteia cu apariția calculilor. Creșterea aportului de lichide la
minim 4 L de apă.

34
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Tab 1.7: Cistinuria.

Homocistinuria

Homocistinuria este o boală ereditară cu transmitere autozomal recesivă determinată

de un defect al enzimei cistationin-β-sintetază care convertește homocisteina în
cistationină și are o prevalență de 1 la 200000 de nașteri. Datorită acestui defect
enzimatic crește în sânge și urină nivelul metioninei și al precurorului acesteia
homocisteina. Boala se manifestă spre sfârșitul copilăriei prin osteoporoză, subluxsația
cristalinului, retard mintal. Dacă boala nu este tratată pot apărea boala mixtă a țesutului
conjunctiv, afectarea sistemului nervos central și tromboze datorită toxicității endoteliale
ale homocisteinei.
Screening-ul neonatal cuprinde diverse tehnici cum ar fi testul microbiologic
Gutherie, spectrofotometria de masă. Metoda de confirmare a diagnosticului este high-
performance liquid chromatography.
Nivelul seric crescut al homocisteinei este un factor de risc pentru bolile
cardiovasculaare. Pacienții cu homocistinurie prezintă niveluri crescute de homocisteină
(200-300 mmol/L) determinând o predispoziție pentru tromboembolie înaintea vârstei
de 30 de ani. Pacienții cu ateroscleroză au niveluri serice moderat crescute ale
homocisteinei. Hiperhomocisteinemia poate fi determinată și de o concentrație serică
scăzută de folat și vitamina B12, alterarea funcției renale sau defecte genetice ale enzimei
metilentetrahidrofolat reductaza care convertește homocisteina în metionină.
Tratamentul cuprinde o dietă cu conținut scăzut de proteine, dar și doze mari de
vitamina B6. La administrarea de vitamina B6 pacienți pot răspunde și în aceste condiții
vor urma un astfel de tratament pe toată durata vieții, sau pot să nu răspundă și vor urma
un tratament cu trimetilglicină, suplimente cu concentrații normale de acid folic, sau
dietă cu supliment de cisteină.

35
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

Tab. 1.8: Homocisteinuria.

Citrulinemia

Citrulinemia face parte dintr-o categorie de boli genetice cu transmitere autozomal

recesivă, aparținând grupului de anomali ale ciclului ureogenetic. Ciclul ureogenetic este
o cale metabolică ce se desfășoară la nivelul ficatului având ca rol principal eliminarea
amoniacului rezultat din metabolismul proteic. Excesul de amoniac este transformat în
uree care se elimină prin urină.
Există două tipuri ale acestei boli: tipul I și tipul II.
Tipul I este cea mai frecventă formă de boală și are o prevalență de 1 la 57000 de
nașteri. Tipul II este cel mai frecvent la populația japoneză unde are o incidență de 1 la
100000 - 1 la 230000 de locuitori.
Tipul I este un defect metabolic determinat de absența enzimei argininsuccinat-
sintetaza, care determină acumularea aminoacizilor cum ar fi citrulina, dar și a
amoniacului în sânge. Simptomatologia clinică cuprinde simptome cum ar fi: inapetență,
vărsături, letargie, crize epileptice, comă, precum și acumularea amoniacului în
organism. Dacă nu este tratată se produc leziuni cerebrale severe și ulterior poate surveni
decesul. În puține cazuri această formă a citrulinemiei poate apărea tardiv în timpul
copilăriei sau în adolescență.
Tipul II este determinat de o mutație a genei implicată în sinteza proteinei citrina.
Citrina este implicată în transportul moleculelor implicate în metabolismul
carbohidraților, biosintezei proteice și ciclului ureei. Moleculele transportate de citrină
sunt implicate în sinteza nucleotidelor, elemente constitutive ale ADN-ului și ARN-ului.
În tipul II de citrulinemie celulele blochează citrulina, care va inhiba ciclul ureogenetic
și biosinteza proteinelor și nucleotidelor. Astfel, amoniacul și alte substanțe toxice se
acumulează determinând apariția simptomatologiei clinice secundare afectării
sistemului nervos central. Simptomatologia clinică poate fi declanșată de medicamente,
infecții, intervenții chirurgicale, consum de alcool.

36
Capitolul 1 – Concepte de bază în interpretarea tulburărilor metabolismului aminoacizilor

Tratamentul citrulinemiei include o dietă hipercalorică, dar restrictivă pentru

proteine, suplimente de arginină și administrarea de benzoat de sodiu și fenilacetat de
sodiu.

Aciduria argininosuccinică

Aciduria argininosuccinică este o boală ereditară cu transmitere autozomal recesivă

aparținând grupului de anomali ale ciclului ureogenetic, având o prevalență de 1 la 70000
de nașteri. Defectul genetic este absența enzimei argininsuccinat-liaza care blochează
conversia acidului argininosuccinic în arginază. Creșterea nivelului acidului
argininosuccinic poate determina creșterea concentrației serice a citrulinei. Datorită
mutației la nivelul genei ASL, ciclul ureogenetic nu funcționează corespunzător
determinând acumularea amoniacului în sânge. Amoniacul are efecte toxice în special la
nivelul sistemului nervos central, dar și la nivelul ficatului. Simptomatologia bolii apare
precoce, cu letargie și refuzul alimentației.
Tratamentul acestei boli este compus din dietă hipercalorică, restrictivă pentru
proteine, suplimente de arginină, benzoat de sodiu și fenilacetat de sodiu.

BIBLIOGRAFIE

1. Atanasiu V, Mohora M, Duta C, Gilca M, Muscurel C, Popa C, Virgolici B.

Biochimie medicala, Partea I, Editura Universitară Carol Davila, București, 2017.
2. Atanasiu V, Stoian I. Biochimie medicală, Partea a II-a, Editura Universitară Carol
Davila, București, 2018.
3. Atkinson AC, Tobias RD. Optimal experimental design in chromatography. J
Chromatogr A. 2008 Jan 4;1177(1):1-11. doi: 10.1016/j.chroma.2007.11.045. Epub
2007 Nov 22. PMID: 18062982.
4. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. Clinical Chemistry: Principles, Techniques, and
Correlations, Seventh Edition, Lippincott, Philadelphia, 2013.
5. Dinu V, Trutia E, Popa Cristea E, Popescu A. Biochimie medicală. Mic tratat.
Editura Medicală, Bucureşti, 2000.
6. Dobreanu M. Biochimie clinică: implicații practice, Ed. Rev. și adăug, Vol.1, Iași:
Editura Pim, 2020. ISBN: 978-606-13-5632-4.
7. Ebere EC, Obinna IB, Wirnkor VA. Applications of Column, Paper, Thin Layer and
Ion Exchange Chromatography in Purifying Samples: Mini Review. SF J Pharm
Anal Chem. 2019; 2(2): 1018. ISSN 2643-8178.
8. Guyton & Hall. Tratat de fiziologie a omului ed. A XI –a, Ed. Medicală Calisto,
București, 2007.
9. Harvey R, Ferrier D, Biochemistry 5th Edition, Lippincott, Baltimore, 2011.

37
 Laborator clinic și interferențe farmacologice – Volumul II

10. Lieberman M, Marks AD. Marks’Basic Medical Biochemistry: A Clinical

Approach. Fourth Edition, MD, Lippincott, Philadelphia, 2012.
11. Löffler G, Petrides PE. Biochemie und Pathobiochemie, Springer, 2014.
12. Michele D. Biochimie clinică, ed. a II a revizuită și adăugită, Ed. Medicală
Bucureşti, București, 2010.
13. Mohora M. Biochimie Medicală, Ediţia a II-a, Ed. Medicală Bucureşti, București,
2005.
14. Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth Edition, W.H.
Freeman, 2012.
15. Newsholme E, Leech T, Functional Biochemistry in Health and Disease, West
Susssex: John Wiley & Sons, 2021. ISBN: 978-0-471-98820-5.
16. Ó’Fágáin C, Cummins PM, O’Connor BF. Gel-Filtration Chromatography. In:
Walls D, Loughran S (eds) Protein Chromatography. Methods in Molecular Biology.
Vol. 1485. Human Press, New York, 2017.
17. Rafai N, Horvath AR, Wittwer CT. Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry and
Molecular Diagnostics, Eight Edition, London: Elsevier, 2019. ISBN: 978-0-323-
53044-6.
18. Rhoades R, Bell D. Medical Physiology. Principles for Clinical Medicine. 3rd
edition. Lippincott, 2009.
19. Rosenthal M, Robert H. Glew Medical Biochemistry: Human Metabolism in Health
and Disease, Wiley, 2009.
20. Vasudevan DM, Sreekumari S, Vaidyanathan K. Textbook of Biochemistry for
Medical Students, Sixth Edition, Jaypee Brothers Medical Publishers, 2011. ISBN:
978-93-5025-016-7.

38