Bioseparari analitice

Curs 1
Bioprocesarea se refera la studiul sistematic al principiilor științifice și
inginerești utilizate pentru obtinerea si purificarea pe scară largă a

produselor biologice.

Bioprocesarea poate fi clasificata în două categorii:

1. bioprocesare reactivă
2. bioprocesare extractiva
Bioprocesarea reactivă are drept componenta o anumită reacție

biologică
Ex. Producere de antibiotice, hormoni, vaccinuri

Bioprocesare extractiva implică aproape în întregime biosepararea

Biosepararile analitice se refera la purificarea

componentelor active cu un singur scop: evaluarea

cantitatii de produs existent in matricea prelucrata si
poate opera cu probe de diverse dimensiuni pana la o

singura celula.
Categorii de produse obtinute prin procese de bioseparare
Categorii
Solvenţi
Acizi Organici
Vitamine
Aminoacizi
Antibiotice

Exemple
Etanol, acetonă, butanol
Acid citric, acidul lactic, acidul butiric
Acid ascorbic, vitamina B12
Lizina, fenilalanină, glicină
Peniciline, rifampicină, streptomicină, soframycin, kanamicina

Zaharuri și carbohidrați
Lipide
Acizi nucleici

Glucoza, fructoza, amidon, dextran, xantan, gelan

Glicerol, acizi grași, corticosteroizi, prostaglandine
Plasmide, ADN terapeutic, vectori retrovirali, oligonucleotide,
ribozomi
Factorii de creștere, proteine, citokine, interleukine, hormoni

Proteine purificate
Proteine semipurificate
Cellule
Extracte celulare brute
Hidrolizate

enzime industriale, proteine din ou, proteine din lapte, proteine

din zer, proteine din soia
Drojdie de panificație, drojdie de bere, lactobacili uscati prin
congelare
extract de drojdie, extracte de soia, extract de țesut de origine
animală
Hidrolizate din soia, hidrolizațe din zer, hidrolizațe din țesut de
origine animală
Principalele activitati economice care beneficiaza de procesele de bioseparare
Categorii
Produse chimice industriale
Agrochemicals
Biofarmaceutice

Exemple
Solventi, acizi organici, enzime industriale
Biofertilizanți, biopesticide
Antibiotice, hormoni, anticorpi monoclonali, plasma
proteine, vaccinuri, hormoni, citokine, acizi nucleici
terapeutici

Produse alimentare si aditivii

alimentari

Proteinele din zer, proteine din lapte, proteine din ou,

soia proteine, hidrolizate proteice

Nutraceutice

Vitamine, enzime, coenzime, cofactori, aminoacizi,

proteinele din zer purificate

Produse medicale pentru

diagnostice
produse chimice de mărfuri
Reactivi de laborator
Produse cosmetice

Glucoză oxidază, peroxidaza, HCG

Detergenti de tip enzime, insecticide

Albumină serică bovină, ovalbumina, lizozima
Extracte din plante, extracte de țesuturi de origine
animala
Importanța economică a biosepararii
Purificarea produselor biologice pornind de la materialul brut este o sarcina
dificila si costisitoare din punct de vedere tehnic. Acest aspect este un factor
critic si limitant pentru comercializarea unui produs biologic. În multe cazuri,
costul bioseparii poate fi o componentă substanțială a costului total al
bioprocesarii (de ex. pentru proteine și acizi nucleici folosite ca
biofarmaceutice)
Produse

Costul Bioseparii (%)

Solvenţi

15-20
20-25
20-25
30-40

Celule
Extracte celulare brute
Acizi organici
Vitamine si aminoacizi

Gume și polimeri
Antibiotic
Enzime industriale
Proteine terapeutice non-recombinante
Produsele ADN recombinant
Anticorpii monoclonali
Produse pe bază de acizi nucleici
Proteine plasmatice

30-40
40-50
20-60
40-65
50-70

60-80
50-70
60-80
70-80
Natura biosepararilor

Biosepararile se bazează în mare parte pe procese de separare

chimice.
O multitudine de tehnici de separare bine fundamentate
utilizate in industria chimica.

sunt

Unele dintre aceste tehnici s-au dovedit a fi potrivite pentru

efectuarea de bioseparari.
Cu toate ca unele tehnici se pot adapta necesitatilor din industria
biosepararilor diferențe fundamentale intre substantele chimice
sintetice si biomolecule exista si trebuie luate in calcul.
Unele biomolecule (antibiotice sau vitamine si aminoacizi) se pot purifica
utilizand tehnici convenționale de separare, cum ar fi: extracția lichidlichid,
adsorbție cu strat fix, evaporarea și uscarea fara nici o modificare
fata de tehnicile curente din industria chimica.
Modul de abordare se schimba radical cand este vorba de molecule
complexe cum ar fi: proteine, lipide, carbohidrați și acizi nucleici.
De cele mai multe ori sunt necesare tehnici complet noi sau adaptarea
celor existente.
Diferentele intre procesele de bioseparare si separarile chimice
bazeaza pe urmatoarele aspecte:

se
1. Produsele biologice sunt prezente în concentrații foarte scăzute în materialul
de pornire. De
exemplu, anticorpii monoclonali sunt de obicei prezenti în concentrații în jur de
0,1 mg / ml in
supernatantul din culturile celulare animale. Prin urmare volume mari de produs
diluat
trebuie vehiculat
2. O serie de alte substanțe care sunt, de obicei, impurități și, în unele cazuri,
produse
secundare sunt prezente în materia primă împreună cu produsele biologice țintă.
Frecvent
aceste impurități sau produse secundare au proprietăți fizice și chimice similare
cu cele ale
produsului dorit. Acest lucru face ca separarea sa fie foarte dificila. De aceea,
biosepararea
trebuie să fie foarte selectiva.
3. Există cerințe stricte de calitate pentru produsele utilizate în scopuri
profilactice, diagnostice
și terapeutice, atât în termeni ai conținutului de produs activ, cât și în ceea ce
privește absența
impurităților specific (produse terapeutice injectabile trebuie să fie liber de
endotoxine și
pirogeni). Procedurile pentru respectarea acestor cerinte trebuie sa fie elaborate
in carul
procesului de bioseparare.
4. Produsele biologice sunt susceptibile la denaturare și alte forme de
degradare. Prin urmare, tehnicile de bioseparare trebuie să să fie "blânde" în
ceea ce privește evitarea condițiilor fizico-chimice extreme, cum ar fi pH-ul și
tăria ionica, condiții hidrodinamice, viteze de forfecare ridicate, și expunerea
la interfețe gaz-lichid. Solvenții organici care sunt utilizate pe scară largă la
separări în industria chimică au o utilizare relativ limitata în bioseparari tinand
cont de tendința lor de a promova degradarea multor produse biologice.
5. Multe produse biologice sunt termolabile și, prin urmare, majoritatea
biosepararilor sunt de obicei efectuate la temperatură sub-ambiantă.
6. Biosepararea se bazează adesea pe o filiera de tehnici (un flux deseori
complex care are la baza o serie de tehnici individuale).
Bazele separarii în procesele de bioseparare

Produsele biologice sunt separate pe baza uneia sau mai multora din
următoarii factori:
1. Dimensiune molecule: de ex filtrare, separare prin membrană, centrifugare
2. Densitate: de ex centrifugare, sedimentare, flotație
3. Difuzivitate: ex separare prin membrană
4. Forma: de ex centrifugarea, filtrarea, sedimentarea
5. Polaritate: de ex extracția, cromatografia, adsorbția
6. Solubilitate: de ex extracție, precipitare, cristalizare
7. Incărcare electrostatica: de ex adsorbție, separare prin membrană,
electroforeză

8. Volatilitatea: de exemplu, distilare, distilare cu membrană, pervaporatie

Forma fizica in care se afla materia care trebuie separata
Biosepararea implică de obicei separarea fizică a portiunilor de materie care se
afla in
diferite forme .
1. Separare de tip particule-lichid
Exemple de separare a particulelor de lichide pot fi:

• separarea celulelor din mediul de cultură celulară,

• separarea celulelor sanguine din plasma, producere proteinelor plasmatice,
• eliminarea bacteriilor și viruși din soluții proteice.
 Separarea particulelor de lichid poate fi realizată prin forțarea suspensiei
printr-un
mediu poros care reține particule în același timp permițând lichidului să treacă
prin
acesta. Acest principiu este utilizat în separarea și filtrarea pe membrane.

 Separarea particulelor-lichid poate fi realizată prin supunerea suspensiei unor

câmpurile gravitaționale naturale sau induse artificial. În cazul în care
particulele
sunt mai dense decât mediul lichid în care acestea sunt suspendate se formeaza la
baza vasului un sediment și lichidul limpede lăsat în urmă este denumit
supernatant.
Acest principiu este utilizat în procesele de separare, cum ar fi sedimentarea și
centrifugarea.
 Dacă particulele sunt mai ușoare decât lichidul în care acestea sunt suspendate,
acestea tind să plutească și, prin urmare, să se concentreze în partea de sus a
containerului în care are loc suspendarea. Acest principiu este utilizat în
flotatie.
2. Separare de tip particula-particula din mediul lichid
Exemple de separare a particulelor de alte particule în mediul lichid sunt:
• fracționarea organelelor subcelulare,
• separarea ADN-ului plasmidic din ADN-ul cromozomial
• separarea celulelor mature de celule tinere.
Acest tip de separare poate fi realizată prin centrifugare zonală. Ca
rezultat particulele mai grele vor migra mai repede decât particulele mai
ușoare, având ca rezultat segregarea lor în benzi distincte din care aceste
particule pot fi recuperate ulterior utilizând mijloace adecvate.
Separarea particulelor de particule poate fi realizată în teorie prin
utilizarea unui mediu poros care reține particulele mai mari, dar permite
particulelor mai mici să treacă prin acesta.
Aceasta operatie este destul de dificil de pus in practica și se poate
efectua numai în cazul în care particulele mai mari pot fi împiedicate să
blocheze mediul poros.
3. Separarea substanței dizolvate în mediu lichid

Un exemplu în acest sens este separarea antibioticelor dizolvate care sunt produse
in
celule.

Metodele utilizate pentru separarea solutului sunt fundamental similare cu cele

utilizate pentru separare solid-lichid, datorită faptului că resturile de solut
raman

dizolvate în mediul lichid.

4. Separare solut-solvent
Separare solutului de solvent este destul de comună în bioseparare, scopul acesteia
fiind fie
eliminarea totală sau parțială a unui solvent dintr-un solut produs. Aplicatiile
curente sunt:
 cresterea concentrației de proteina ,
 îndepărtarea impurităților dizolvate dintr-un produs lichid,
 înlocuirea unui solvent dintr-o soluție cu altul (schimb de solvent).
O serie de opțiuni sunt disponibile pentru separarea solutului de solvent si cele
mai simple

dintre acestea sunt evaporarea și distilarea.

O problema esentiala a acestor tehnici este necesitatea aplicarii unui tratament
termic și,
prin urmare, nu pot fi utilizate pentru separarea materialelor biologice care tind
să fie

termolabile.
Membranele care pot reține materialul dizolvat permițând în același timp
eliminarea solvenților reprezinta o alternativa viabila mai ales ca sunt prezente
diverse variante:
 o membrana de osmoza inversa va reține molecule mici si ioni,
 o membrană de nanofiltrare va retine mai molecule mai mari, cum ar fi
vitamine, hormoni și antibiotice,

 O membrană de ultrafiltrare va retine macromolecule cum ar fi proteinele și

acizi nucleici
Principiul separarii prin membrana

Domenii de aplicare a membranelor

Un alt mod de a scoate un solvent dintr-o substanță dizolvată este prin legare
reversibila a solutului pe o suprafață solidă, acesta fiind procesul de adsorbtie.
Odată ce legarea solutului a avut loc, această separare este transformata într-o

separare de tip particula-lichid, adică solventul este separat de solutul legat de

solid.
Solutul legat este recuperat ulterior din materialul solid, procesul fiind denumit
desorbție.
O metoda indirectă de separare a substanței dizolvate din solvent este precipitarea
Care se transforma astfel încă o dată in separare de tip particula-lichide.
Schimbul de solvent poate fi realizat prin extracție lichid-lichid unde substanța
dizolvată este transferată de la un lichid la altul, cu care solventul original
este
nemiscibil.
5. Separarea de tip solut-solut în mediu lichid

Separarea solut-solut este de departe forma cea mai dificila de separare.

Un exemplu în acest sens este separarea de albumină serică dintr-un amestec de alte
proteine serice.
Separarea solut-solut poate fi realizată prin adsorbție selectivă, adică prin
legarea selectivă si reversibila a solutului dorit pe un
material solid.
Separarea solut-solut pot fi transportata prin extracție lichid-lichid, de exemplu
prin punerea în contact a soluției ce contine

amestecul de biomolecule cu un lichid nemiscibil în care solutul țintă are o

solubilitate ridicată.
In urma apariției membranelor, separarea solut-solut a devenit mult mai facila.
Membrane de tip nanofiltrare, ultrafiltrare si dializa pot fi folosite pentru
astfel de separari.
Un mod indirect de a efectua separarea solut-solut este prin precipitare, care
implică precipitarea selectivă a solutului ținta
6. Separarea lichid-lichid
Separarea lichid-lichid este necesară pentru fabricarea de solvenți ca acetonă și
etanol, care

de obicei se formeaza in mediu apos. Dacă solventul este nemiscibil cu apa,

separarea
urmată de decantare poate fi suficientă. Cu toate acestea, în cazul în care
solventul este

miscibil cu apa (ca în cazul etanolului) sau formeaza amestecuri azeotrope, alte
metode de
separare trebuie utilizate. In cazul etanolului distilarea a fost utilizată în mod
tradițional. Cu
toate acestea, odată cu apariția tehnologiei membranelor, procesele de separare cum
ar fi
distilarea prin membrana și pervaporatie au inceput sa fie utilizate pe scara
larga.
Curba lichid vapori pentru doua substante X si Y care nu formeaza si care formeaza
amestec azeoptrop de maxim
Principiul de functionare a procesului de pervaporatie care este de fapt o
distilare cuplata cu separare prin membrana