ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A

MICROORGANISMELOR PATOGENE DIN

PRODUSELE ALIMENTARE
2.6. Clostridium perfringens

- Principiu de determinare

- Metoda se bazează pe capacitatea lui Clostridium

perfringens de a reduce sulfatii la sulfuri prin
cultivarea pe medii selective, urmata de confirmarea
prin teste biochimice care diferentiaza speciile
genului.

- Clostridium perfringens se prezintă sub formă de bacili drepti, de dimensiuni 3 – 9 / 0,9 – 1,3 μ,
izolati, Gram-pozitivi, imobili.

- Formează colonii cu diametrul de 2-5 mm translucide cu suprafata lucioasa, galben cenusii.

- Clostridium perfringens este o bacterie strict anaeroba , termofila, cu temperatura optima de

dezvoltare la 370C
- Sursă alimentară: Mâncăruri gătite care după răcire sunt servite fără a fi reîncălzite, în special
fripturi de carne de vită sau de pasăre.

- Simptome specifice: Diaree, crampe abdominale.

- Debutul și durata simptomelor: Debut brusc la 6-24 ore, durează mai puțin de 24 de ore.

Medii de cultura care pot fi folosite in diagnostic:

- mediu sulfit polimixin sulfdianizina agar (SPSA);
- bulion cu tioglicelat;
- agar sange;
- agar galbenus de ou (EYA) sau mediu care conține 20% ser uman;
- mediu lapte turnesolat (Litmus milk test)

Tehnica de lucru:
- din proba omogenizata sau din dilutiile zecimale efectuate din proba se recolteaza cate 1ml si
se inoculeaza in cate 2 placi Petri sterile. Peste inocul se repartizeaza mediul SPSA, se face o
buna uniformizare si se lasa in repaus pentru solidificare.
- se inverseaza placile si se introduc in termostatul anaerob (in atmosfera de azot) si se
incubeaza la 370C timp de 24 de ore.

- se numara coloniile colorate in negru si se apreciazanumarul prezumtiv de celule per gram de

proba de analizat.

- pentru confirmare din aproximativ 10 colonii caracteristice se face transfer in eprubete cu mediu
bulion glicolat. Pentru indepartarea oxigenului se recomanda, ca inainte de utilizare, sa se faca o
scurta fierbere urmata de o racire brusca. Termostatarea se face la 350C timp de 24 de ore.

- in functie de numarul de colonii de culoare neagra dezvoltate in placi si numarul de colonii

confirmate prin teste biochimice, se poate calcula numarul de bacterii pe gram de proba. De
exemplu daca media coloniilor din placile inoculate din dilutia III a fost egal cu 25, iar din cele 10
colonii testate, 8 au fost confirmate, rezulta ca in proba numarul de celule de Cl. perfringens / g
este N = mc x nc/nt x K = 25 x 8/10 x 103 = 2 x 104

- Alte metode de diagnostic:

A. o alta metoda de diagnostic pentru C. perfringens este cultivarea lui pe mediul agar - sange
si observarea hemolizei.
- după incubarea peste noapte pe agar - sânge, coloniile au de obicei 1 până la 3 mm în
diametru, dar pot atinge un diametru de 4 până la 15 mm după incubare prelungită. Coloniile sunt
de obicei plate, oarecum rizoide și crescute central. Unele colonii tind să se răspândească, dar
nu roiesc pe mediu.

- Hemoliza țintă (hemoliză cu zonă dublă)

Pe agaru - sânge anaerob, C. perfringens produce colonii neregulate cu o zonă îngustă internă
de hemoliză completă (datorită toxinei theta), înconjurată de o zonă mult mai largă de hemoliză
incompletă (datorită toxinei alfa).

B. Reacția lui Nagler

C. perfringens produce o opalescență care înconjoară linia de inoculare pe agar - gălbenuș de ou

(EYA) sau mediu care conține 20% ser uman, datorită activității lecitinazei toxinei alfa.

- Opalescența poate fi inhibată prin încorporarea toxinei anti-alfa în mediu. Testul este pozitiv și
pentru alte toxine alfa produse de Clostridium: C. bifermentans, C. baratti și C. sordellii.
C. Test CAMP invers

- Izolatul suspectat de C. perfringens este striat peste centrul plăcii de agar - sânge anaerob și
Streptococcus agalactiae este inoculat perpendicular pe acesta. Prezența vârfului de săgeată al
hemolizei sinergice cu vârful săgeții îndreptate de la streptococ spre C. perfringens este un test
CAMP invers pozitiv.

D. Toleranță la căldură

- C. perfringens poate crește atunci când bulionul de carne (RCM) al lui Robertson este incubat la
45 ° C timp de 4-6 ore. Acest lucru îl diferențiază de alte organisme din gen.

E. Test de lapte turnasolat (Litmus milk test)

- În laptele turnesolat, C. perfringens produce „reacție de cheag furtunos” datorită proteolizei și

fermentării lactozei producând acid și gaze puternice.
2.7. Clostridium botulinum

- Clostridium botulinum este bacil gram-pozitiv, care formează

endospori, care seamănă cu aspectul unei rachete de tenis
datorită prezenței sporilor la capătul sub-terminal.

- Produce o neurotoxină extrem de letală numită toxină botulinică

și provoacă botulism, o boală neuroparalitică rară care pune viața
în pericol. Botulismul are mai multe manifestari clinice, de la
intoxicații alimentare, infecții ale unor plăgii la botulism la sugari.

- Termenul botulism a fost derivat din cuvântul latin „botulus”, adică cârnați; întrucât cârnații slab
fierți erau asociați anterior cu otrăvirea alimentară. Botulinul este, de asemenea, produs de alte
clostridii, cum ar fi C. butyricum, C. baratti și C. argentinense.

- Doza letală de toxină botulinică pentru un om este de 2 μg sau mai mică, deci C. botulinum are
potențialul de a fi folosit ca armă biologică. CDC (Centers for Disease Control and Prevention)
a listat-o ca „agenți de categoria A”, împreună cu Bacillus anthracis, Yersinia pestis etc.
Patogenitate

Transmitere: - are o natură omniprezentă, răspândită pe scară largă ca saprofit în sol,

îngrășământ animal, legume și sedimente marine. Conserve de casă, condimente și produse din
pește sunt cele mai frecvente surse de infecție cu C. botulinum. Ingerarea mierii contaminate este
cauza principală a botulismului infantil.

- Temperatura insuficientă in gătirea mancarii urmată de ambalarea în condiții anaerobe

facilitează germinarea sporilor și sinteza neurotoxinelor.

Mecanismul de acțiune al toxinei botulinice (BoNT)

- Clostridium botulinum este neinvaziv. Patogeneza sa se datorează producerii de neurotoxină

cu actiune foarte puternică „toxină botulinică” (BoNT), probabil cea mai toxică substanță
cunoscută ca fiind letală pentru omenire. Produce paralizie flască.

- Există 7 tipuri serologice de neurotoxină botulinică etichetate ca tipuri A, B, C [C1 C2], D, E, F și

G. Botulismul uman este cauzat în principal de tipurile A, B, E și F (rar).
- toxina botulinică este clasificată ca un potențial agent de bioterorism, dar botoxul este utilizat
pentru a netezi ridurile faciale in industria cosmetica.

- după intrare (fie ingerată, inhalată sau ajunsa într-o rană), toxina botulinică este transportată
prin sânge către terminalele nervoase colinergice periferice. Cele mai frecvente situsuri terminale
nervoase sunt placile neuromusculare, terminațiile nervoase parasimpatice postganglionare și
ganglionii periferici. Nu afectează SNC (sistemul nervos central).

- În stare normală: la stimularea nervilor periferici și cranieni, acetilcolina este eliberată în mod
normal din vezicule în partea neurală a plăcii motorii. Acetilcolina se leagă apoi de receptori
specifici de pe mușchi, inducând contracția.

- Toxina botulinică acționează prin legarea la veziculele sinaptice ale nervilor colinergici,
împiedicând astfel eliberarea acetilcolinei (Ach) la terminatiile nervoase periferice, inclusiv la
placile neuromusculare. Acest lucru are ca rezultat lipsa stimulului asupra fibrelor musculare,
relaxarea ireversibilă a mușchilor și paralizia flască.

- Deoarece toxina botulinică produce paralizie flască, aceasta poate fi utilizată terapeutic pentru
tratamentul afecțiunilor spasmodice, cum ar fi strabismul (ochii nealiniați), blefarospasmul (clipire
incontrolabilă) și mioclonul (spasm mucular bruc. Mișcarea ete involuntară și nu poate fi oprită.)
- Manifestari clinice

Manifestările botulismului se datorează scăderii acetilcolinei în sistemul nervos cranian și

terminatiile sistemului nervos parasimpatic. Simptomele frecvente includ:

- Diplopie (vedere dublă) sau estomparea vederii;

- Disfagie (dificultăți la înghițire);
- Disartrie (dificultate în vorbire) sau slăbirea vorbirii;
- Paralizia flacidă simetrică descendentă a mușchilor voluntari;
- Scăderea reflexelor profunde ale tendonului;
- Oboseală;
- Ameţeală;
- Greaţă;
- Constipație;
- Paralizia musculară respiratorie poate duce la moarte.

Nu există deficite senzoriale sau cognitive.

- Tipuri de botulism

- Există trei tipuri majore de botulism uman bazat pe modul în care sunt dobândite:

1. Botulism alimentar: Rezultă din consumul de alimente contaminate cu toxină botulinică

preformată, cum ar fi conservele de casă.

2. Botulismul plăgii: este o intoxicație sistemică rezultată din creșterea numarului de celule de
C. botulinum și toxine în răni. Se prezintă ca un botulism alimentar, cu excepția absenței
caracteristicilor gastro-intestinale.

3. Botulismul infantil: botulismul infantil este mult mai ușor decât versiunea pentru adulți.
Rezultă din ingestia de alimente (de obicei miere) contaminate cu spori de C. botulinum de către
copii cu vârsta sub 1 an.

- Sporii germinează în intestin, iar celulele vegetative secretă toxină botulinică. Manifestările
clinice includ incapacitatea de a suge și de a înghiți, vocea slăbită, ptoza (pleoapa cazuta), gâtul
floppy și slăbiciunea extremă numită sindromul copilului floppy. Este o boală autolimitativă;
prognosticul este excelent dacă este gestionat prin îngrijire de susținere și hrănire asistată.
- Sporii nu germinează în mod normal în intestinul adult, cu toate acestea pot germina în
intestinul sugarilor.

Diagnosticul de laborator

- Diagnosticul botulismului include izolarea și identificarea bacililor prin proceduri biochimice

culturale convenționale și demonstrarea prezenței neurotoxinei botulinice într-un eșantion de
pacienți sau în alimente (pentru investigarea focarului) cu testul de neutralizare a toxinei.

- Demonstrarea prezentei toxinei botulinice (test de neutralizare a șoarecilor) în ser sau fecale
confirmă diagnosticul clinic de botulism.

- Probă: - Ser, fecale, conținut gastric, vărsături, tampon, exudat sau țesuturi în funcție de tipul de
botulism.

- Diagnosticul botulismului: - Microscopie directă

- Colorarea Gram a frotiurilor obținute din alimente sau fecale suspectate - dezvăluie bacili gram
pozitivi, necapsulați, cu spori subterminali, ovali, bombați.
- Cultură

- Izolare - cultura se face pe agar - sânge sau bulion de carne gătită (RCM) al lui Robertson.
În bulionul RCM: Turbiditatea apare la rotirea particulelor de carne: culoare neagra și
producerea mirosului urât pentru C. botulinum A, b, f (proteolitic) sau culoare roz - C. botulinum
C, D, E (zahararolitic).

- În agar - sânge: coloniile sunt mari, neregulate, semitransparente, hemolitice și marginea

fimbriată.

- Creșterea pe medii de cultură poate fi confirmată prin colorare Gram, teste biochimice sau
analize moleculare. Serotipizarea se face cu antiseruri de tip specific.

- Identificarea caracteristicilor lui Clostridium botulinum

- bacili mobili prin flageli peritricali;

- prezenta activitatea lipazei pe agar - gălbenuș de ou.

- Test de neutralizare a toxinei (biotest pe șoareci)

- Testul in vivo pe șoareci este testul „standard” pentru detectarea toxinei botulinice active. Acest
test implică injectarea intraperitoneală de alimente suspectate contaminate într-un șoarece și
observarea timp de 4-6 zile pentru boală / deces.

Dacă acea activitate letală poate fi neutralizată (într-un alt set de șoareci) prin injectarea
anticorpilor împotriva unuia dintre serotipurile toxinei botulinice, aceasta confirmă prezența
neurotoxinei botulinice.

Diagnosticul molecular

Tehnicile moleculare, cum ar fi reacția în lanț a polimerazei (PCR), direcționate către genele
neurotoxinei, sunt ideale pentru detectarea și identificarea C. botulinum.