TEHNICA

IMUNOENZIMATICA

CE ESTE TEHNICA
IMUNOENZIMATICA?

ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent
Assay
Metoda de detectare a unor molecule
(proteine, carbohidrati, etc.) cu ajutorul
complexelor antigen-anticorp conjugate cu o
enzima
Foarte sensibila (pg/ml)
Cantitativa sau calitativa
Utilizeaza anticorpi monoclonali si enzime

PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI
Antigen
Fuzionarea
celulelor
HIBRIDOM

Mielom

Plasmocite
producatoare de Ac

Testarea clonelor

Cultivarea
hibridoamelor

Hibridoamele se separa
si se cultiva
Mentinerea
hibridoamelor in
soareci

Clonele
dorite se
cultiva sau
se
congeleaza
Anticorpii monoclonali
sunt purificati

ENZIMELE

Enzime=catalizatori biochimici, compusi care

maresc viteza reactiilor chimice ce se
desfasoara in sistemele biologice, fara sa se
consume in cursul lor
Intensitatea reactiei ~ cantitatea de enzima
Enzime utilizate:

Peroxidaza
Fosfataza alcalina
Glucozoxidaza
G6PH

ENZIMELE

Substraturi: substante cromogene, care

formeaza produsi de reactie colorati
(cromofore)
Enzima + substrat cromofor citire la
spectrofotometru

PROBE BIOLOGICE

Ser
Plasma
Urina
Scaun
Lichid sinovial
LCR
Lichid de lavaj bronsic

PLACA PENTRU ELISA

96 godeuri
Plastic pe care adera usor proteinele

TIPURI DE ELISA

ELISA necompetitiva sandwich

ELISA competititiva

ELISA indirecta (dozarea Ac)

ELISA SANDWICH

Ag trebuie sa prezinte 2 epitopi (identici sau

diferiti)
Ac primar (Ac1):

Imobilizat in faza solida in godeurile placii

Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):

Marcat enzimatic

ELISA SANDWICH
1.

2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.

Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu

Ac1 fixat
Se incubeaza complexe Ag-Ac1
Se spala excesul de Ag (Ag liber)
Se pipeteaza Ac2 (marcat enzimatic)
Se incubeaza complexe Ac1-Ag-Ac2
Se spala excesul de Ac2 (Ac2 liber)
Se adauga substratul colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ag din proba
Se citeste la spectrofotometru

ELISA SANDWICH

ELISA COMPETITIVA

Ac primar (Ac1):

Specific pentru Ag de determinat

Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):

Specific pentru Fc al Ac1

Marcat enzimatic

ELISA COMPETITIVA
1.

2.

3.

Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate

cunoscuta de Ac1, in solutie
Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag
fixat
2 situatii:

Exces de Ag
Exces de Ac1

ELISA COMPETITIVA

Exces de Ag:

Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ag libere

Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
nu se formeaza complexe Ag-Ac1 fixe
Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere
Se pipeteaza Ac2 in godeuri nu se formeaza
complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe
Se spala Ac2 liber (tot Ac2, de fapt)
Se adauga substratul nu apare nicio reactie
incolor

ELISA COMPETITIVA

Exces de Ac1 :

Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ac1 liberi

Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
complexe Ag-Ac1 fixe
Se spala Ag-Ac1 libere
Se pipeteaza Ac2 in godeuri complexe Ag-Ac1Ac2 fixe
Se spala Ac2 liber
Se adauga substratul colorarea mediului de
reactie i.p. cantitatea de Ag din proba
Se citeste la spectrofotometru

ELISA COMPETITIVA

ELISA INDIRECTA

Dozarea Ac
Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat
Ac primar (Ac1):

=Ac de determinat
Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):

Specific pentru Fc al Ac1

Marcat enzimatic

ELISA INDIRECTA

Se pipeteaza proba (cu Ac1) in godeurile cu

Ag fixat
Se incubeaza complexe Ag-Ac1 fixe
Se spala Ac1 liber
Se pipeteaza Ac2
Se incubeaza complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe
Se spala Ac2 liber
Se adauga substratul colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ac1 din proba
Se citeste la spectrofotometru

ELISA INDIRECTA

ELISA

AVANTAJE

Sensibila
Reproductibila
Cantitati mici de reactivi (ieftina)
Determina si Ag, si Ac
Automata (rapida)
Noniradianta

APLICATII

Hormoni
Markeri tumorali
Droguri, medicamente
Citokine
Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare
Ac (HIV!)

TEST HIV

TEST DE SARCINA