Analiza Aminoacizi Proteine

DETERMINAREA PROTEINELOR - determinarea azotului
Rolul proteinelor:
- sursă de energie
- sursă de aminoacizi esenţiali - menţinerea sănătăţii
- component major al alimentelor
- utliziat ca şi ingredient - conferă alimentelor proprietăţi speciale.
1. Determinarea cantitativă a proteinelor

- informaţii nutriţionale
- aspect legal
2. Identificarea proteinelor
- analize de expertiză
- depistarea falsurilor
DETERMINAREA CANTITATIVĂ A PROTEINELOR
Metode
- chimice
- fizice
- fizico-chimice
METODE CHIMICE
- se bazează de determinarea conţinutului de azot.
- mai multe tipuri de azot în alimente
Nt = Na + No = Na + Nnep + Np
- anorganică : NO3-, NH4+

- organică : proteică şi neproteică.
(De regulă speciile anorganice sunt solubile în apă putând fi uşor de îndepărtat
din aliment prin simpla dizolvare în apă)
1. METODA KJELDAHL - elaborată în 1883 de către Johann Kjeldahl (berar)
Principiu
Alimentul este mineralizat în mediu acid puternic, azotul proteic fiind
transformat în ion amoniu determinat ulterior prin titrare cu un acid tare.
Metoda nu măsoară direct conţinutul de proteină - factor de conversie.
Factorul de conversie F=6,25 (Proporţia de azot, in majoritatea proteinelor, este
de aproximativ 16%).
F variază în funcţie de secvenţa de aminoacizi specifică fiecărei proteine :
- cereale (proteine cu conţinut ridicat în glutamină) F=5,7.
- carne F=6,25
- lapte F= 6,38
- ouă F=6,68.
- Aceasta presupune că proporţia de azot neproteic este nesemnificativă astfel
încât determinarea azotului să reprezinte doar conţinutul total de proteine.
- De regulă se determină azotul total
Analiza decurge în 3 etape:

- mineralizarea/digestia
- neutralizarea/distilarea
- titrarea
Mineralizarea/digestia
- are loc la cald cu acid sulfuric când are loc reacţia :

aliment + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 (1)
- reacţia este însoţită de o degajare de SO2 şi SO3, conform reacţiilor:
H2SO4  H2O + SO3
2SO3  2SO2 + O2
Amoniacul format în mediu acid nu este eliberat ca şi NH3 gazos,

deoarece este captat în soluţie sub formă de (NH4)2SO4 .
Mineralizarea probei se face în majoritatea cazurilor cu H2SO4 şi diferite

adaosuri menite să faciliteze acţiunea oxidantă a acestuia (apă oxigenată).
Alegerea H2SO4 nu este făcută întâmplător, deoarece el beneficiază de
avantajul unui punct de fierbere superior, care permite încălzirea prelungită
la temperaturi relativ înalte, fără pierderi importante de soluţie.
Pentru accelerarea procesului de mineralizare se adaugă de obicei săruri ale

metalelor grele cu acţiune catalizantă, cum ar fi Ag+ , Cu2+ , Se3+ , Hg2+ .
Adaosul sărurilor mercurice, creează însă inconvenientul formării
combinaţiilor amidomercurice, ceea ce determină pierderi de NH3, ce trebuie
ulterior surmontate prin adăugarea Na2S2O3 (acesta determină distrugerea
combinaţiilor amidomercurice, în timpul distilării amoniacului).
Se mai adaugă săruri ale metalelor alcaline, cum ar fi K2SO4 sau Na2SO4, în
vederea creşterii temperaturii de fierbere, respectiv creşterea eficienţei
procesului de mineralizare.
Mineraizarea se realizează în baloane speciale, Kjeldahl, cu gât lung,

încălzite în pozitie înclinată faţă de direcţia flăcării şi prevăzute cu o mică
pâlnie, care funcţionează ca un refrigerent de aer, permiţând refluxarea
permanentă a acidului sulfuric, eventual evaporat.
1 - 5 g aliment, probă care conţine cca. 0,03 - 0,04 g N se cântăresc într-un

balon Kjeldahl, se adaugă 20 mL acid sulfuric concentrat.
Încălzirea se realizează lent, până la carbonizarea completă şi innegrirea

puternică a soluţiei. Oxigenul rezultat oxidează treptat substanţele
organice, fapt observat prin modificările de culoare care apar în soluţie.
Culoarea neagră iniţială se atenuează şi se modifică treptat, ajungând până
la decolorarea completă, sau la o slabă nuanţă galbenă (dacă există în
probă cantităţi mari de fier), ceea ce indică terminarea procesului.
Dacă proba conţine mult zahăr, spumează puternic la început, provocând

astfel debordarea amestecului şi eventuale pierderi. Pentru evitarea acestui
fenomen se utilizează fie adaosul a câtorva picături de alcool octilic, fie
introducerea câtorva bile de sticlă, cu ajutorul cărora spuma se sparge
mecanic. Uneori spumarea este evitată dacă se lasă proba cu acid peste
noapte, înainte de încălzire.
Când există cantităţi mari de elemente ale grupei metalelor alcalino-

pământoase, sulfaţii acestora precipită provocând pierderi prin
coprecipitare.
Operaţia durează de obicei mult, în funcţie de cantitatea şi de natura

substanţei oxidate (mai ales în cazul probelor bogate în grăsimi).
În cazul în care se urmăreşte determinarea azotului total trebuie remarcat

faptul că în procesul de mineralizare nu se relizează trecerea în săruri de
amoniu a combinaţiilor azotate oxigenate cum ar fi, nitraţii, nitriţii sau a
unor combinaţii organice nitro, notrozo, nitril. Astfel se adaugă la proba
de analizat acid sulfuric conc răcit la gheaţă, acid salicilic şi se agită bine
balonul timp de 10 min. Se adaugă apoi Na2SO4 anh, Na2S2O3 sau granule
de Zn, compuşi cu caracter reducător. Se mineralizează apoi proba în
mod obişnuit.
Neutralizarea/distilarea
După ce digestia s-a terminat (culoare alb-galbuie a soluţiei), balonul de

mineralizare este conectat la un balon colector, prin intermediul unui tub.
Soluţia din balonul de mineralizare este alcalinizată prin adiţie de NaOH şi
supus încălzirii :
(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4
Amoniacul gazos format este captat în balonul de captare, ce conţine o

soluţie de acid boric, de concentraţie şi volum riguros cunoscut. Amoniacul
este reţinut în soluţie sub formă de sare:
NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3-

Titrarea
Conţinutul de azot este estimat prin titrarea boratului de amoniu format cu

o soluţie titrimetrica de acid silfuric sau clorhidric, în prezenţa unui
indicatpr potrivit pentru evidenţierea punctului final al titrării.
NH4+ + H2BO3- + H+ + Cl- H3BO3 + NH4+ + Cl-
Volumul soluţiei de acid necesar la titrare este echivalent cu cantitatea de

amoniac eliberată în etapa anterioară. În general alături de proba de
analizat se efectuează şi o probă blank pentru a putea fi luată în
considerare orice cantitate de azot rezidual din reactivii utilizaţi pentru
analiza.
Avantaje şi dezavantaje
Avantaje: Metoda Kjeldahl este utilizată pe plan internaţional şi este încă

metoda standard de comparaţie pentru alte metode de determinare a
proteinelor. Faptul că poate fi aplicată pentru orice tip de proteină,
datrorită preciziei şi reproductibilităţii înalte ii conferă poziţia de lider
între metodele de determinare a proteinelor.
Dezavantaje: Nu dă informaţii despre conţinutul de proteină reală,

deoarece azotul din alimente nu provine numai de la proteine. Diferite
proteine au factori de conversie diferiţi deoarece au secvenţe diferite de
aminoacizi. Utilizarea atât acidului sulfuric la temperaturi înalte cât şi a
sărurilor cu rol catalitic ridică factorul de risc al analizei. Este o tehnică
care necesită mult timp, mineralizarea necesitând cel puţin 2-3 ore.
METODA DUMAS
Este o tehnică automată instrumentală, capabilă să măsoare rapid
conţinutul proteic. Se bazează pe metoda descrisă pentru prima dată de
Dumas, acum un secol. Metoda concurează cu metoda Kjeldahl ca metodă
standard pentru analiza proteinelor datorită rapidităţii ei.
Principii generale
O cantitate cunoscută de probă este arsă la temperaturi mari (900 oC) în
prezenţă de oxigen. În urma arderii are loc eliberarea de CO 2, H2O şi N2.
CO2 şi H2O sunt înlăturate prin trecerea gazelor prin coloane speciale care
le absorb. Conţinutul de azot este apoi determinat prin cromatografie de
gaze. Coloana are ca scop separarea azotului de CO2 şi H2O rezidual, ca
detector se utilizează detectorul de conductivitate termică. Instrumentul
este calibrat prin analizarea unui material aflat în stare pură şi cu un
conţinut binecunoscut de azot, cum ar fi EDTA ( 9.59%N). Astfel semnalul
de la detector poate fi transformat în conţinut de azot. Ca şi în metoda
Kjeldahl concentraţia de azot determinată este transformată în conţinut
propteic utilizând factorul de conversie specific.
Avantaje: Este mult mai rapidă decât metoda Kjeldahl (sub 4

min/determinare). Nu necesită reactivi toxici, măsurarea se poate face
automat, este simplu de utilizat.
Dezavantaje: Cost per analiză mare, nu dă o valoare adevărată a

conţinutului proteic deoarece este analizat azotul total din aliment.
Deasemenea proteine diferite necesită factori de conversie diferiti.
Metoda necesitând cantităţi mici de probe ceea ce face dificilă etapa de
obţinere a unei probe reprezentative.
MĂSURAREA ABSORBŢIEI RADIAŢIEI
· UV-ViZ: concentraţia proteinelor poate fi determinată prin

măsurarea absorbţiei radiaţiei din domeniul UV-VIZ.
· IR: măsurarea absorbanţei în domeniu IR al spectrului poate fi

utilizată pentru determinarea conţinutului proteic din alimente. În mod
natural proteinele absorb radiaţia IR datorită vibraţiilor caracteristice a
grupărilor chimice specifice scheletului polipeptidic. Analizele prin
absorbţia în IR sunt utile în special pentru analizele on-line rapide. Sunt
de asemenea avantajoase deoarece necesită o cantitate mică de probă şi
sunt nedistructive. Dejavantajul major îl reprezintă costul ridicat al
aparaturii şi calibrarea destul de laborioasă.
· Rezonanţa magnetică nucleară: RMN poate fi utilizată la

determinarea conţinutului total proteic. Acesta este determinat prin
măsurarea ariei de sub picul corespunzător fracţiei proteice din spectrul
RMN.
METODE SPECTROFOTOMETRICE UV-VIZ
Aceste metode utilizează abilitatea proteinelor atât în stare naturală cât

şi în stare chimic sau fizic modificată de a absorbi/împrăştia lumina din
domeniul UV-VIZ a spectului electromagnetic.
Principiul de bază a fiecărui astfel de test este similar. În primul rând

este elaborată o curbă de calibrare absorbanţă (turbiditate) în funcţie
de concentraţia de proteină, pe baza unor soluţii proteice de
concentraţie cunoscută. Se măsoară apoi absorbanţa (turbiditatea)
soluţiei de analizat la aceeaşi lungime de undă şi se determină
concentraţia pe baza curbei de calibrare.
Diferenţele principale dintre metode constau în grupele chimice care

sunt responsabile de absorbţie/împrăştierea radiaţiei, cum ar fi
legătura peptidică, grupările aromatIce din lantul lateral, grupările
bazice sau agregatele proteicie.
Măsurarea directă la 280 nm
Triptofanul şi tirozina absorb puternic lumina UV la 280 nm. Conţinutul de

triptofan şi tirozină din multe proteine este aproape constant, deci
absorbanţa soluţiilor proteice la 280 nm poate fi folosită pentru
determinarea concentraţiei proteice.
Avantajele acestei metode sunt: procedură simplă, nedistructivă, nu

necesită reactivi speciali.
Dezavantajul major este acela că acizii nucleici absorb deasemenea

puternic la 280 nm şi pot astfel interfera în determinarea proteinelor dacă
aceştia sunt în concentraţie suficient de mare. Chiar şi în această situaţie
au fost dezvoltate metode pentru a preveni aceste probleme, de exemplu
măsurarea absorbanţei la două lungimi de undă diferite.
Metoda biuretului
În condiţii alcaline ionul cupric reacţionează cu grupările din legăturile

peptidice rezultând un compus colorat violet-purpur.
După amestecarea reactivului cu soluţia proteică se lasă să se dezvolte
culoarea timp de 15-30 min după care se citeşte absorbanţa la 540 nm.
Avantajul major al acestei tehnici este acela că nu există interferenţi
proveniţi din chimicale care să absoară la această lungime de undă iar
tehnica este mai puţin sensibilă la tipul de proteină deoarece utilizează
absorbţia implicând legătura peptidică – comună tuturor proteinelor decât
pe grupările laterale specifice.
Reactivul – biuret care conţine toate chimicalele necesare analizei poate fi
procurat din comerţ.
Dezavantaje: sensibilitatea este mai mică decât metodele de absorbţie

directă în UV-VIZ.
Metoda Lowry
Metoda Lowry combină reactivul biuret cu un alt reactiv - Folin-

Ciocalteau (reactiv specific pentru grupele fenolice) care reacţionează
cu tirozina şi triptofanul.
În urma reacţiei rezultă un compus albastru a cărui absorbanţă poate fi
citită în intervalul 500 - 750 nm în funcţie de sensibilitatea necesară.
Există un mic pic în jur de 500 nm care poate fi utilizat în cazul
concentraţiilor mari de proteină şi un pic mai mare în jur de 750 nm
care poate fi utilizat pentru determinarea concentraţiilor mai mici de
proteină.
Această metodă este mai sensibilă la concentraţii mai mici de proteină
decât metoda biuretului.
Metoda cu coloranţi
O cantitate cunoscută şi în exces de colorant anionic (încărcat negativ)

se adaugă la soluţia proteică a cărui pH este ajustat astfel încăt proteina
să fie încărcată pozitiv (mai mic decât punctul izoelectric).
Proteina şi colorantul formează un complex insolubil în apă datorită
interacţiunilor electrostatice. Colorantul anionic se leagă de grupările
cationice a reziduurilor bazice ale aminoacizilor (histidină, arginină şi
lisină) şi la grupările amino terminale libere.
Colorantul nelegat rămâne în soluţie şi este determinat prin măsurarea
absorbanţei, după separarea complexului insolubil prin centrifugare.
Cantitatea de proteină din soluţia analizată este proporţională cu
cantitatea de colorant legată care se calculează prin diferenţă.
Colorantlegat = colorantiniţial - colorantliber

Avantaje: Tehnicile UV-VIZ sunt rapide şi simple şi sunt sensibile pentru

concentraţii proteice mici.
Dezavantaje: Pentru majoritatea tenicilor UV-VIZ sunt necesare utilizarea

soluţiilor diluate şi transparente, care nu conţin substanţe contaminante
care să absoarbă sau să imprăştie radiaţia la aceeaşi lungime de undă
ca şi proteina analizată. Necesitatea soluţiilor transparente presupune
faptul că majoritatea alimentelor trebuie să parcurgă o serie de etape de
pregătire a probei înainte de analiză, cum ar fi: omogenizare, extracţie
cu solvenţi, centrifugare, filtrare, operaţii care pot fi laborioase şi
consumatoare de timp. În plus este extrem de dificilă extracţia
cantitativă a proteinelor din câteva tipuri de alimente, mai ales după ce
acestea au fost procesate astfel proteinele devenind agregate sau legate
covalent de alte substanţe. În plus absorbanţa depinde de tipul proteinei
analizate – proteine diferite având secvenţe diferite de aminoacizi.
DETERMINAREA CALITATIVĂ - separarea şi caracterizarea proteinelor
Analiza alimentelor este interesată şi de tipul proteinelor prezente,

deoarece fiecare proteină are caracteristicile nutriţionale şi fizico-chimice
unice.
Tipul proteinei este de obicei determinat prin separarea şi izolarea

proteinei individuale din amestecul complex de proteine, astfel încât să
poată fi identificată şi caracterizată.
Proteinele sunt separate pe baza diferenţelor dintre proprietăţile fizico-

chimice, cum ar fi mărime, sarcină, solubilitate, stabilitaze termică şi
parametrii de adsorbţie.
Unul dintre factorii care trebuie luaţi în considerare în procesul de

separare este posibilitatea alterării structurii tridimensionale a proteinei
native.
Există metode de separare la scală macro pentru izolarea proteinelor

care se găsesc în cantitate mare, în timp ce pentru proteinele aflate în
cantităţi mici sau sunt scumpe există metode la scală micro.
Alegerea celei mai potrivite tehnici de separare depinde de o serie de

factori, cum ar fi: cantitatea de probă disponibilă, echipamentul
disponibil, tipul de proteină existent, costul de analiză, inclusiv motivul
pentru care se efectuează analiza.
Cunoaşterea apriori a efectelor condiţiilor de mediu asupra structurii

proteinei şi a interacţiunilor acesteia cu mediul este foarte util pentru
alegerea celei mai potrivite tehnici de separare. În primul rând pentru că
ne ajută să determinăm condiţiile cele mai potrivite pentru izolarea unei
anumite proteine dintr-un amestec (pH, forţă ionică, tip solvent,
temperatură) şi în al doilea rând sunt importante condiţiile care nu au
efect negativ asupra structurii proteice (protejare).
Metode bazate de diferenţa de solubilitate
Proteinele pot fi separate prin exploatarea diferenţelor de solubilitate în

soluţii apoase. Solubilitatea unei molecule de proteină este determinată
de :
- mărime,
- formă,
- hidrofobicitate
- sarcina electrică.
Proteinele pot fi selectiv precipitate sau solubilizate prin modificarea pH-
ului, forţei ionice, constantei dielectrice sau temperatura soluţiei. Aceste
variabile, reflectări ale faptului că proteinele sunt electroliţi de masă
moleculară mare, pot fi utilizate la separarea amestecurilor de proteine,
deoarece fiecare proteină are compoziţia sa proprie de aminoacizi, care
determină comportarea ca electrolit. Tehnicile de separare sunt simplu de
utilizat când sunt implicate cantităţi mari de probă, deoarece ele sunt
relativ rapide, ieftine şi nu sunt influenţate în mod particular de către
ceilalţi componenţi alimentari. Sunt des utilizate ca un prim pas în
procedurile de seaprare deoarece majoritatea componenţilor
contaminanţi pot fi uşor înlăturaţi.
Salefierea proteinelor
Sărurile neutre au efecte puternice asupra solubilităţii proteinelor
globulare. În concentraţii mici, sărurile cresc solubilitatea proteinelor,
fenomen cunoscut ca salting-in. Sărurile ionilor divalenţi MgCl2 şi
(NH4)2SO4 sunt mult mai eficiente în acest sens decât cele monovalente
KCl, NaCl, NH4Cl. Capacitatea sărurilor neutre de a influenţa solubilitatea
proteinelor este în funcţie de forţa ionică, mărime care măsoară atât
concentraţia cât şi numărul de sarcini electrice. Pe măsură ce tăria ionică
continuă să crească solubilitata proteinelor începe să scadă. La o tărie
ionică suficient de mare, o proteină poate fi precipitată aproape complet
din soluţie, fenomen cunoscut sub numele de salting-out. Principiile
fizico-chimice care stau la baza acestui proces sunt complexe. Unul din
factorii care intervin este îndepărtarea apei de hidratare din molecula
proteinei de către concentraţia mare de sare, ceea ce duce la scăderea
solubilităţii. Fiecare proteină răspunde diferite la concentraţia sărurilor
neutre.
Precipitarea izoelectrică
Solubilitatea celor mai multe proteine globulare este puternic influenţată

de pH-ul sistemului, indiferent de concentraţia NaCl. De ambele părţi ale
pH-ului critic solubilitatea creşte forte brusc. Aproape toate proteinele
globulare au un minim de solubilitate, pH-ul corespunzător diferind de la
o proteină la alta. pH-ul la care o proteină este cel mai puţin solubilă este
pH-ul său izoelectric, definit ca pH-ul la care molecula nu are încărcare
electrică şi nu se deplasează în câmp electric. În aceste condiţii nu sxistă
respingere electrostatică între molecule proteice învecinate, care tind să
se aglomereze şi să precipite. La valori de pH deasupra sau sub pI toate
moleculele de proteină au încărcare electrică netă de acelaş semn, deci
ele se vor respinge prevenind aglomerarea, în agregate insolubile.
Deoarece proteinele au valori deferite ale pH-ului izoelectric, datorită

conţinutului lor diferit de aminoacizi cu grupări R ionizabile pot fi separate
prin precipitare izoelectrică.
Proteină pH-izoelectric Proteină pH-izoelectric

Pepsină 1 γ1- globulină 6,6
Ovalbumină 4.6 Hemoglobină 6,8
Albumină serică 4,9 Mioglobină 7
β-lactoglobulină 5,2 Ribonuclează 9,6
Fracţionarea cu solvenţi
Solubilitatea proteinelor depinde de constanta dielectrică a soluţiei
deoarece alterează amplitudinea interacţiunilor electrostatice dintre
grupele cu sarcină. Pe măsură ce constanta dielectrică scade
intensitatea interacţiunilor electrostatice creşte. Aceasta duce la
scăderea solubilităţii proteinelor în soluţie deoarece ele sunt mai puţin
ionizate, şi astfel repulsiile electrostatice dintre ele nu sunt suficient de
mari pentru a preveni agregarea. Constanta dielectrică a soluţiilor
apoase poate fi scăzută prin adăugare de solvenţi organici solubili, cum
ar fi etanol şi acetonă. Cantitatea de solvent organic necesară
precipitării depinde de tipul proteinei, şi prin urmare aceasta poate fi
separată prin precipitare de restul proteinelor. Cantiatea optimă de
solvent organic necesară precipitării proteinei variază între 5-60%.
Operaţia se realizează de obicei sub 0oC pentru a preveni denaturarea
proteinelor prin creşterea temperaturii la amestecarea solvetului organic
cu apa.
Separarea proteinelor prin cromatografie de adsorbtie

Cromatografia de adsorbţie implică separarea compuşilor prin
adsorbţia/desorbţia selelctivă a compuşilor pe suprafaţa unui
adsorbant reţinut în interiorul unei coloane prin care proba şi faza
mobilă trec. Separarea se bazează pe diferenţele de afinitate a
proteinelor faţă de faza staţionară. În funcţie de tipul fazei staţionare
există două tipuri de mecanisme de separare care se pot aplica în
cazul separării proteinelor:
- cromatografia prin schimb ionic
- cromatografia de afinitate.
Separarea si caracterizarea se poate realiza atat pe pe coloane
deschise cat si inchise, de inalta performanta.
Cromatografia prin schimb ionic
Cromatografia prin schimb ionic se bazează pe fenomenele reversibile

de adsorbţie/desorbţie respectiv schimb ionic a ionilor din soluţie şi
grupările ionice ale unei matrici solide sau reţea polimerică. Această
tehnică este cea mai utilizată tehnică cromatografică pentru separarea
proteinelor. Un sorbent capabil sa schimbe anionii proprii cu cei ai
probei se numeste anionit. Faza mobilă este formată dintr-un electrolit
având o anumită forţă ionică şi un anunmit pH, astfel încât să favorizeze
un număr maxim de legături între faza staţionară şi proteina de interes.
Proteinele contaminante trebuie să se lege mai puţin puternic, astfel
încât să treacă mai repede prin coloană. Proteina de interes este apoi
eluată cu o altă soluţie tampon care să favorizeze desorbţia.
Cromatografia de afinitate
În cromatografia de afinitate, ca fază staţionară se utilizează suporţi

solizi de care se leagă chimic-covalent un ligand. Ligandul este o
moleculă care prezintă afinitate specifică pentru o proteină dată. Proba
de analizat este trecută prin coloană, iar proteina de interes este
reţinută pe suprafaţa sorbentului, în timp ce proteinele contaminante
trec nereţinute. Proteina de interes este apoi eluată cu cu o soluţie
tampon care favorizează desorbţia. Această tehnică este cea mai
eficientă metodă de separare a proteinelor individuale dintr-un amestec
de proteine, dar este şi cea mai scumpă metodă, deoarece necesită
coloane cu faze staţionare specifice.
Separări bazate pe diferenţele de masă

Proteinele pot fi separate pe baza masei moleculare. Aceasta variază
între 10.000 şi 1.000.000 daltoni. In practică, separarea depinde de raza
Stokes a proteinei, mai degrabă decât masa moleculară. Raza Stokes
reprezintă raza medie pe care molecula proteică o are în soluţie şi
depinde de structura ei tridimensională.
Dializa
Dializa este folosită pentru separarea moleculelor din soluţie. Se
bazează pe utilizarea unor membrane semipermeabile care permit
trecerea moleculelor mai mici decât o anumită mărime dată. Soluţia
proteică este plasată în tubul de dializă care este închis şi plasat într-un
volum mare de apă sau tampon şi care este agitată uşor continuu.
Moleculele mici trec prin pereţii tubului iar cele de proteină vor fi
reţinute în interiorul lui. Dializa este o metodă lentă, necesitând până la
12 ore. Este utilizată frecvent în laborator pentru înlăturarea sărurilor
după separarea prin salefiere.
Ultrafiltrarea
Soluţia proteică este plasată într-o celulă ce conţine o memdrană

semipermeabilă şi apoi este aplicată o presiune sau este supusă
centrifugării. Moleculele mici şi apa trec prin membrană, moleculele de
proteină fiind reţinute. Principiul de separare este similar dializei, dar
datorită aplicării presiunii separarea este mult mai rapidă. Sunt
disponibile membrane semipermeabile cu dimensiunile critice
cuprinse între 500 şi 300.000.
Cromatografia prin excludere moleculară

Această tehnică cunoscută şi sub numele de filtrare prin gel separă
proteinele pe baza mărimii lor. Soluţia proteică este introdusă într-o
coloană a cărei umplutură este formată dintr-un polimer reticulat
(dextrină, agaroză). Moleculele mai mari decât porii polimerului sunt
excluse şi ies rapid din coloană. Moleculele mai mici pot intra în pori,
deci viteza lor de deplasare prin coloană este retardată. Astfel
moleculele sunt eluate din coloană în ordinea scăderii dimensiunilor.
Există faze staţionare care prezintă mărimi diferite ale porilor astfel
încât permit seaprarea proteinelor cu diferite mase moleculare.
Fabricantul acestor faze staţionare dau informaţii asupra domeniului
de greutăţi moleculare pentru care acestea sunt cele mai potrivite.
Masa moleculară a proteinelor necunoscute poate fi determinată prin
compararea volumului de eluţie cu cel al unor molecule proteice cu
masa cunoscută: reprezentare grafică a volumunlui de eluţie funcţie de
logaritmul masei moleculare trebuie să fie o linie dreaptă. O problemă
asociată acestei metode este că masa moleculară nu este direct
corelată cu raza Stokes pentru diferite forme ale proteinelor.
ANALIZA AMINOACIZILOR
Analiza aminoacizilor depinde de mulţi factori:

- matricea probei,
- concentraţia de aminoacizi,
- sensibilitatea ceruta,
- tipul analizei.
In urma analizei se determina:

- profil de aminoacizi liberi
- profil total de aminoacizi (după hidroliză).
ETAPE
1. Pregătirea probei
Tratamentul probelor diferă, depinzând de scopul analizei.
- Pentru determinarea aminoacizilor liberi este necesara obţinerea unui extract,
purificare si derivatizare înainte de determinare.
- Pentru determinarea conţinutului total de aminoacizi - etapa de hidroliză.
Extracţia - se poate realiza in cazul matricilor insolubile (peste, carne, cereale, etc.) si de obicei
se realizează prin omogenizarea probei mărunţite sau măcinate într-un solvent potrivit. Există
aparate specializate (Polytron Stomacher) sau dispozitive mai simple care presupun agitarea
cu sau fără încălzire. Aminoacizii sunt solubili în apă, cisteina şi tirozina având solubilitatea
mai mică. De regula se utilizează apă sau o soluţii de acid sulfosalicilic 4%, acid tricloracetic
5%, HCl 0,1 N. Se pot utiliza de asemenea şi soluţii alcoolice (etanol, metanol) care prezintă
avantajul de a nu extrage proteinele (nu mai este necesară purificarea ulterioara a extractului).
Solidele solubile necesită doar dizolvare preliminară.
In cazul probelor lichide nu se mai pune în discuţie extracţia.
2. Purificarea probei
- izolarea aminoacizilor de alţi compuşi extraşi (proteine, carbohidraţi, grăsimi)
- este necesar pentru a evita probleme potenţiale cum ar fi colmatarea coloanei
analitice şi/sau interacţiunea cu alţi compui extraşi cum ar fi proteinele.
Prezenţa grăsimilor nu ridică probleme pentru extracţie dar trebuie îndepărtate pentru a
preveni interferenţele sau deprecierea coloanei. Grăsimile sunt extrase din probe solide cu un
amestec cloroform : acetona (1:3), sau extractul poate fi spălat succesiv cu acetat de etil şi
dietileter.
Extractul obţinut este centrifugat la rece (4 C) iar supernatantul filtrat prin vată de sticlă când
se reţin materiile grase de pe suprafaţa supernatantului.
Separarea de proteine şi polipeptide - deproteinizare.

- chimică se realizează cu soluţii concentrate de acizi tari, acid sulfosalicilic,
percloric, trifluoracetic, picric, fosfomolibdenic, soluţii concentrate saline, solvenţi organici
(metanol, etanol, acetonitril). În aceste condiţii proteinele precipita prin denaturare în timp ce
aminoacizii rămân în soluţie.
- fizică presupune centrifugarea prin filtre membrane limitative (CUT-OFF) care
permit trecerea aminoacizilor în timp ce compuşii cu masa moleculara mare sunt reţinuţi.
Diferenţa dintre aceste metode consta in:

- diferenţa între masa moleculara a moleculelor excluse,
- grad de recuperare a aminoacizilor,
- compatibilitatea cu condiţiile de derivatizare şi cele necesare separării analitice.
Exemple:
- Acidul fosfomolibdenic este foarte eficient dar produce pierderi de aminoacizi cu
caracter acid si/sau bazic în special lizină. Acizii tari scad foarte mult valoarea pH-ului în contextul în
care derivatizarea se realizează în medii bazice pentru analizele prin derivatizare precoloană.
Îndepărtarea acidului se realizează prin evaporare şi/sau ajustarea pH-ului. În cazul în care analiza
se realizează prin cromatografie de schimb ionic şi derivatizare postcoloană nu mai apar probleme.
Chiar dacă acidul sulfosalicilic este cel mai utilizat agent de deproteinizare s-au constatat unele
interferenţe şi grade scăzute de recuperare.
- Utilizarea solvenţilor organici prin amestecarea a 2-3 volume solvent organic cu un
volum extract are rezultate foarte bune, gradul de recuperare fiind aproape de 100%. Prezintă
avantajul că este uşor de îndepărtat prin evaporare.
- Soluţiile saline concentrate nu sunt utilizate la deproteinizare deoarece interferă în
procesul de derivatizare şi hidroliză.
Purificarea probelor utilizând răşini schimbătoare de cationi (cationiţi) reţin aminoacizii din
medii acide în timp ce alţi interferenţi cum ar fi carbohidraţii trec prin coloana nefiind reţinuţi.
Ulterior aminoacizii sunt desorbiţi cu o bază volatilă care apoi este înlăturată prin evaporare.
În cazul extracţiei pe fază solidă cu C18 compuşii cum ar fi grăsimile, proteinele şi peptidele
sunt reţinute, în timp ce compuşii polari şi aminoacizii trec nereţinuţi. Metoda nu este foarte
bună deoarece aminoacizii hidrofobi se pot reţine (grade mici de recuperare) iar compuşii
hidrofili nu se reţin, impurificând extractul.
Hidroliza
1. Hidroliza acidă - proba este tratată cu HCl 6N la 110C timp de 20-96 h sau 145C timp de 4 h.
În aceste condiţii dure poate avea loc degradarea unor aminoacizi. Digestia se realizează în
recipiente închise în atmosferă inertă de azot, pentru a minimiza degradările. Hidroliza poate fi
realizată atât cu metode în fază lichidă cât şi gazoasă. În metodele în fază lichidă HCl este în
contact direct cu proba, fiind potrivită pentru probe complexe (cereale etc.). Hidrolizatul
contine multi interferenti, de aceea analiza necesita metode cromatografice prin schimb ionic
şi derivatizare postcoloană. Digestia în fază gazoasă reduce zgomotul de fond. În cazul
cantităţilor limitate de probe se utilizează hidroliza în fază de vapori. În această metodă în
tubul de hidroliză este plasată proba şi apoi totul într-un vas mare ce conţine HCl. Atmosfera
oxidantă (oxigen) este înlocuită cu azot inert. În urma încălzirii numai vaporii de HCl vin în
contact cu proba, fiind astfel exclusă contaminarea cu compuşi nevolatili. Această metodă
este mai potrivită pentru determinările cu derivatizare precoloană.
Hidroliza poate fi îmbunătăţită prin optimizarea temperaturii şi a timpului de hidroliza, sau prin
adăugarea de compuşi protectori ai aminoacizi labili (tirosină, serină, treonină, metionină,
triptofan-foarte sensibil în probele cu conţinut ridicat de carbohidraţi) cum ar fi: fenol,
Na2SO3, triptamină, mercaptoetanol, acid mercaptoetenoic, acid tio- şi ditiodipropionic. De
asemenea HCl poate fi înlocuit cu acid metansulfonic 4 N. Se utilizează agenţii de alchilare
pentru a stabiliza aminoacidul (cisteina) rezultat în urma hidrolizei: acid brompropionic, acid
iodoacetic bromopropilamina, vinilpiridina. Glutamina şi asparagina sunt dezaminate în timpul
hidrolizei şi sunt codeterminate cu acidul glutamic şi aspartic. O altă problema de care trebuie
ţinut cont este rămânerea intactă a unor peptide chiar după 24 de ore de hidroliză. Aceste
polipeptide sunt formate în principal de către aminoacizii hidrofobi cum ar fi valina, leucina,
isoleucina, şi fenilalanina. Aceste peptide sunt mult mai rezistente faţă de hidroliză şi necesită
o perioadă mai lungă. Dar aceste condiţii ar duce la degradarea altor aminoacizi.
Aşa cum se observă nu există nici un set de condiţii experimentale care să îndeplinească toate
condiţiile metodele utilizate reprezintă un compromis pentru obţinerea unui număr cât mai mare
de aminoacizi. Se realizează o hidroliza la 110 C 22-24 h, de preferat în stare de vapori, în
prezenţă de agenţi protectivi (fenol). Pentru analiza triptofanului şi cisteinei sunt necesare
proceduri speciale.
2. Hidroliza alcalină – se realizeaza cu soluţii 4,2 M de NaOH, KOH, LiOH sau Ba(OH)2 cu sau
fără adiţie de 1% (m/v) tioglicol timp de 18 h la 110 0C.
3. Hidroliza enzimatică - se realizează cu enzime proteolitice cum ar fi tripsina, chimotripsina,

carboxipeptidază, papaină, thermolizină. Trebuie sa se tina cont de activitatea specifică a
enzimei utilizate.
DETERMINAREA CANTITATII TOTALE DE AMINOACIZI
Cea mai simpla sarcina este determinarea continutului total de aminoacizi, fara a face
discriminare unii de altii. Sunt metode spectrofotometrice, care se bazeaza pe reactia
gruparilor α-aminice cu reactivi:
- o-ftaldialdehida,
- ninhidrina
- acid trinitro-benzen-sulfonic.
Exista o corelatie liniara intre intensitatea absorbtiei/emisiei si concentratia gruparilor aminice.
Se aplica pentru:
- obtinerea indexului protelitic,
- controlul gradului de hidroliza a proteinelor alimentare,
- controlul procesului de eliminare a proteinelor din vin,
- controlul proceselor de fabricatie (branza),
- dezvoltarea aromei pe baza aminoacizilor care in urma transformarilor genereaza
compusi ce comfera aroma, etc.
METODE DE DETERMINARE CARE IMPLICA TEHNICI DE SEPARARE
Analiza aminoacizilor individuali necesită o separare prealabilă mai puţin cazul in care se
utilizează metode selective de determinare.
determinare Separarea aminoacizilor din amestec necesita
tehnici de separare foarte eficiente cum ar fi cromatografia (HPLC, CG) sau electroforeza
capilara. Alegerea tehnicii de analiza depinde in principal de echipamentul disponibil şi de
preferinţele personalului, deoarece fiecare metoda prezintă avantaje si dezavantaje.
A) Cromatografia de lichide
1. Metode prin schimb cationic - se bazează pe faptul ca aminoacizii au sarcină electrică. Ca
fază staţionară se utilizează polistirenul sulfonat cu soluţii apoase tampon de citrat de sodiu
ca faze mobile. Elutia se realizează cu gradient, creşterea atât a pH-ului cât si a concentraţiei.
In aceste condiţii aminoacizii cu caracterul cel mai acid vor ieşi primii iar cei cu doua sau mai
multe grupări amino primare vor fi eluati mai târziu. După separare aminoacizii sunt
derivatizaţi pentru detecţie fie in VIZ fie in fluorescenţă. Se pot utiliza de asemenea si
detectori electrochimici. Avantajul metodei este ca da rezultate foarte precise pentru toate
tipurile de probe cunoscute. Este considerată metoda de referintă. Fiecare metodă noua
trebuie sa se raporteze la această metodă. Dezavantajul major constă in costul ridicat al
aparaturii, a fazelor mobile complexe şi a timpului lung de analiză.
2. Crompatografie de lichide cu fază inversă (RP-HPLC) - este foarte utilizata deoarece poate
fi folosita şi pentru alte aplicaţii.
În acest caz aminoacizii trebuie derivatizaţi înainte de separare pentru ai transforma în

molecule hidrofobe, astfel încât să poată participa la procese de repartiţie între faza
stationară şi cea mobilă. Totodată derivatizarea va permite o detectie mai bună.
- Faza mobilă trebuie să dizolve proba pentru a fi transparentă pentru sistemul de
detectie. Faza mobilă este o combinaţie de tampon apos cu un solvent organic ca
metanol, acetonitril, tetrahidrofuran. Tamponul este format din soluţii cel mult
100mM de acetat sau fosfat. De regulă eluţia se realizează cu gradient.
- Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel chimic modificate cu
grupări alchil, în principal C18. Selectivitatea obţinută cu coloane provenite de la
producători diferiti este diferită datorită metodelor diferite de atasare a lantului
alchil de suprafata suportului de silicagel, de densitatea acoperirii care comfera
un grad mai mare sau mai mic de hidrofobicitate.
Deasemenea grupările silanol nereactionate pot interacţiona cu moleculele aminoacidului

ducând la aparitia picurilor cu cozi. Pentru a preveni acest inconvenient se poaze adăuga
trietilamină.
Analiza aminoacizilor
Derivatizarea - are ca scop îmbunătăţirea :

- separarii,
- detecţiei.
Eficienţa agentului de derivatizare este evaluată pe baza următoarelor aspecte:
- să reacţioneze atât cu aminoacizii primari cât şi cu cei secundari,
- să dea un singur derivat cu fiecare aninoacid,
- să reacţioneze cantitativ şi reproductibil,
- produsul rezultat să fie stabil,
- să nu existe interferenţe ale produşilor secundari sau a excesului de agent de
derivatizare,
- să necesite condiţii simple şi blânde de reacţie,
- să prezinte posibilitate de automatizare.
DERIVATIZARE ÎN VEDEREA ÎMBUNĂTĂŢIRII DETECŢIEI - sensibilitatea şi selectivitatea
detecţiei sunt influentate de proprietăţile spectrale şi electrochimice a derivaţilor obţinuţi.
Alegerea agentului de derivatizare este fosrte importantă.
Detecţie spectroscopică - se bazeaza pe ataşarea de molecula aminoacidului grupări care

conferă moleculei derivate proprietăţi absorbante (UV/Viz) sau fluorescente. Derivatizarea se
poate realiza înaintea separării - derivatizare precoloană sau după separare - derivatizare
postcoloană. Derivatizarea precoloană atât on-line cât şi off-line iar cea postcoloană se
realizează on-line.
1. Derivatizarea precoloană: pe lângă îmbunătăţirea selectivităţii și sensibilităţii în urma

derivatizării moleculele de aminoacid devin mai hidrofobe, făcându-le potrivite şi pentru
separarea prin cromatografie de lichide pe fază inversă RP18. Ca reactivi de derivatizare se
utilizează:
a. Fenil-iso-tiocianat – reacţionează atât cu aminoacizii primari cât şi cu cei secundari, formând

derivatul feniltiocarbamil, detectabil în UV la 245 nm. Derivatul rezistă la temperatura camerei 1 zi
şi o durată mai lungă de timp în frigider, mai ales în absenta apei. Prepararea probei este
laborioasa, necesită mediu bazic (trietilamina, pH 10,5) şi include câteva etape de uscare, ultima
etapă fiind cea de înlăturare a excesului de reactiv, care poate distruge coloana. Derivatul apare
în cel mult 10 min, deci un timp de reacţie de 20 de min este suficient pentru reacţia totală.
Compoziţia reactivului de derivatizare este esenţială pentru determinarea acidului glutamic şi
aspartic. Prezenţa cationilor mono şi bivalenţi (provenit din sticlărie în timpul hidrolizei) şi a
sărurilor (NaCl) pot cauza insolubilizarea derivaţilor acidului aspartic şi glutamic. Pentru ceilalţi
aminoacizi concentraţia NaCl nu prezintă importanţă
C6H5-N=C=S + H2N-HCR-COOH C6H5-NH-CS-NH-HCR-COOH

b. Clorura de 4-dimetil-aminobenzen-4-sulfonil (Dabsyl-Cl sau DBS) - detecţie în domeniul vizibil
la 448-468 nm. Lungimea de unda mare de absorbţie face ca linia de bază a cromatogramei să
fie stabilă pentru multe sisteme de solvenţi. Limita de detecţie în domeniul picomolilor. Derivaţii
sunt foarte stabili (1 săptămână) şi pot fi formaţi atât de aminioacizii primari cât şi cei
secundari. Timpul de reacţie este de aprox. 15 min la 70 C, are loc în mediu bazic cu exces de
reactiv. Eficienţa reacţiei depinde foarte mult de matrice şi variază funcţie de tipul aminoacidului
şi prezenţa clorurilor în concentraţie mare.
O R
H N N N S Cl + H N CH
2 2
O COOH
-HCl
O R
H2N N N S HN CH
O COOH
c. Clorura de 1-dimetilamino-naftalen-5-sulfonil (Dansyl-Cl) - este mult folosit pentru
determinarea azotului terminal din proteine şi peptide. Reacţionează cu aminoacizii primari şi
secundari dând un derivat puternic fluorescent (detecţie prin excitare la 350 nm şi măsurarea
emisiei la 510 nm sau detecţie la 250 nm). Derivatul este stabil 1 zi sau 7 zile la întuneric şi la -
40 C. Derivatizarea este simplă, necesită mediu bazic pH-9,5 timp de reacţie 1 h la temperatura
camerei la întuneric / 15 min la 60C sau 2 min la 100C. Poate forma derivaţi multiplii cu
histidina, lisina şi tirosina, deci condiţiile de reacţie trebuie optimizate şi atent controlate.
N(CH3)2 N(CH3)
2
R
+ H N CH
2
-HCl R
COOH
SO Cl SO2 NH CH
2
COOH
d. 5-5'-ditio-bis(nitrobenzoic acid) (DTNB) - utilizat pentru aminoacizii cu sulf
HOOC
HOOC HOOC
O2N S
+ HS R +
S
O2N O2N ON S H
S S R 2
HOOC
e. 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-F) - da derivaţi stabili atât cu aminoacizii

primari cât şi cu cei secundari, lungimea de excitare la 470 nm şi cea de emisie 530
nm. Timp de reacţie 1 min la 60 0C
f. 4-cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl) - se utilizează la determinarea

cantitativă a tiolilor şi aminelor reacţionează cu cisteina in mediu acid dând un produs
verde cu maximul de absorbţie la 410 nm.
g. 9-fluorenilmetil-cloroformate (F-MOC) - dă derivaţi fluorescenti atat cu aminele primare cat
si cu cele secundare, lungimea de undă de excitare 265nm, emisie 315 nm. Dezavantajul cel
mai mare este ca reactivul de derivatizare este fluorescent şi poate interfera in determinare.
Este extras înainte de analiză. Reactioneaza cu amine puternic hidrofobe rezultând compuşi
cu timp de retenţie mare. Timp de reacţie 45-90s fara incalzire.
R O
O
H2N CH R
O C + - HCl O C
COOH NH CH
Cl
COOH
h. Aldehida o-ftalica (o-phthaldialdehyde – OPA) – reactioneaza cu aminoacizii primari in

prezenta mercaptanului pentru a da un compus cu fluorescenta ridicata. Fluorescenta este
măsurata la 455nm sau 470 nm după excitare la 230 respectiv 330 nm. Reactivul in sine nu
este fluorescent. Derivaţii pot fi detectaţi si in absorbţie la 338 nm. Tipul mercaptanului utilizat
influenteaza stabilitatea selectivitatea cromatografica si intensitatea fluorescentei. Dintre cei
mai utilizati: 2-mercaptoetanol, etantiol, si acidul 3-mercaptopropionic. Derivatizarea este
rapida (1-3 min) la temperatura camerei si in mediu alcalin (tampon pH=9,5). Dezavantajul
major este ca aceşti derivaţi nu sunt stabili, problema fiind parţial rezolvata prin controlarea
stricta a timpului dintre etapa de derivatizare si cea de injectie. Nu reactioneaza cu aminele
secundare. Acest dezavantaj poate fi surmontat prin transformarea aminelor secundare in
amine primare prin oxidare cu hipoclorit sau cloramina înainte de derivatizare.
2. Derivatizarea postcoloană - implică separarea aminoacizilor liberi prin cromatografie de
lichide, introducerea în efluent a agentului de derivatizare potrivit, amestecarea şi trimiterea
lor cu ajutorul unei pompe în camera de reacţie şi în final pomparea derivatului obţinut în
detector. Principalul dezavantaj al acestui tip de derivatizare este că necesită echipament
adiţional: o pompă pentru introducerea şi amestecarea agentului de derivatizare şi eventual un
dispozitiv de încălzire. Un alt dezavantaj este lărgirea picului la bază produs de către volumul
mort introdus după coloană.
Ca şi reactivi de derivatizare se utilizează: ninhidrina, fluorescamina şi aldehida o-ftalică.
a. fluorescamina – nu este fluorescenta, derivatul se masoara la 475 excitare la 390nm. Un

dezavantaj major este acela că reacţia are loc în mediu bazic, în contextul în care separarea
prin schimb ionic are loc în mediu acid. Aceasta face necesară adaugarea unei pompe
suplimentare pentru a introduce un tampon bazic înainte de a reactia cu fluorescaina. Se
foloseşte numai în cazul derivatizărilor speciale.
R
HOOC C H
R N O
O O
HC NH OH
2 +
COOH O OH
O
O
b. ninhidrina - reacţionează cu toţi cei 20 de aminoacizi dând compuşi coloraţi fără a produce
compuşi secundari sau mai mulţi compuşi de derivatizare. Derivaţii proveniţi de la amine
primare dau un produs albastru cu maximul de absorbţie la 570 nm, iar cei proveniţi de la
amine secundare dau un compus brun cu maximul de absorbţie în jur de 440 nm.
O O
R R
OH
+ H2N CH N CH
OH COOH COOH
O O
O
NH2 + R C CO2
+
H
O
O O O O
OH
NH2 N
+ - 2H O
OH 2
O O O O
DERIVATIZARI IN VEDEREA OBTINERII UNEI SEPRARI MAI BUNE
Scopul acestor derivatizari este de a obtine compusi volatili si termostabili in vederea

analizei GC.
Derivatizarea se realizeaza in doua etape:

- esterificare cu alcooli acidulati cu HCl 3M, de exemplu: metanol, i-propanol, i-
butanol, n-propanol, n-butanol si alcool i-amilic (gruparea COOH).
- N-acilare – cu o anhidrida acida in mediu anhidru : anhidrida trifluoracetica,
anhidrida pentafluoropropionica, N-tert(butildimetilsilil)trifluoracetamida
(gruparea NH2).

Analiza Aminoacizi Proteine

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Analiza Aminoacizi Proteine

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

DETERMINAREA PROTEINELOR - determinarea azotului

1. Determinarea cantitativă a proteinelor

- se bazează de determinarea conţinutului de azot.

- mai multe tipuri de azot în alimente

- anorganică : NO3-, NH4+

1. METODA KJELDAHL - elaborată în 1883 de către Johann Kjeldahl (berar)

Analiza decurge în 3 etape:

- are loc la cald cu acid sulfuric când are loc reacţia :

Amoniacul format în mediu acid nu este eliberat ca şi NH3 gazos,

Mineralizarea probei se face în majoritatea cazurilor cu H2SO4 şi diferite

Pentru accelerarea procesului de mineralizare se adaugă de obicei săruri ale

Mineraizarea se realizează în baloane speciale, Kjeldahl, cu gât lung,

1 - 5 g aliment, probă care conţine cca. 0,03 - 0,04 g N se cântăresc într-un

Încălzirea se realizează lent, până la carbonizarea completă şi innegrirea

Dacă proba conţine mult zahăr, spumează puternic la început, provocând

Când există cantităţi mari de elemente ale grupei metalelor alcalino-

Operaţia durează de obicei mult, în funcţie de cantitatea şi de natura

În cazul în care se urmăreşte determinarea azotului total trebuie remarcat

După ce digestia s-a terminat (culoare alb-galbuie a soluţiei), balonul de

(NH4)2SO4 + 2 NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4

Amoniacul gazos format este captat în balonul de captare, ce conţine o

NH3 + H3BO3 NH4+ + H2BO3-

Conţinutul de azot este estimat prin titrarea boratului de amoniu format cu

NH4+ + H2BO3- + H+ + Cl- H3BO3 + NH4+ + Cl-

Volumul soluţiei de acid necesar la titrare este echivalent cu cantitatea de

Avantaje: Metoda Kjeldahl este utilizată pe plan internaţional şi este încă

Dezavantaje: Nu dă informaţii despre conţinutul de proteină reală,

Avantaje: Este mult mai rapidă decât metoda Kjeldahl (sub 4

Dezavantaje: Cost per analiză mare, nu dă o valoare adevărată a

MĂSURAREA ABSORBŢIEI RADIAŢIEI

· UV-ViZ: concentraţia proteinelor poate fi determinată prin

· IR: măsurarea absorbanţei în domeniu IR al spectrului poate fi

· Rezonanţa magnetică nucleară: RMN poate fi utilizată la

METODE SPECTROFOTOMETRICE UV-VIZ

Aceste metode utilizează abilitatea proteinelor atât în stare naturală cât

Principiul de bază a fiecărui astfel de test este similar. În primul rând

Diferenţele principale dintre metode constau în grupele chimice care

Măsurarea directă la 280 nm

Triptofanul şi tirozina absorb puternic lumina UV la 280 nm. Conţinutul de

Avantajele acestei metode sunt: procedură simplă, nedistructivă, nu

Dezavantajul major este acela că acizii nucleici absorb deasemenea

În condiţii alcaline ionul cupric reacţionează cu grupările din legăturile

Dezavantaje: sensibilitatea este mai mică decât metodele de absorbţie

Metoda Lowry combină reactivul biuret cu un alt reactiv - Folin-

O cantitate cunoscută şi în exces de colorant anionic (încărcat negativ)

Colorantlegat = colorantiniţial - colorantliber

Avantaje: Tehnicile UV-VIZ sunt rapide şi simple şi sunt sensibile pentru

Dezavantaje: Pentru majoritatea tenicilor UV-VIZ sunt necesare utilizarea

Analiza alimentelor este interesată şi de tipul proteinelor prezente,

Tipul proteinei este de obicei determinat prin separarea şi izolarea

Proteinele sunt separate pe baza diferenţelor dintre proprietăţile fizico-

Unul dintre factorii care trebuie luaţi în considerare în procesul de

Există metode de separare la scală macro pentru izolarea proteinelor

Alegerea celei mai potrivite tehnici de separare depinde de o serie de

Cunoaşterea apriori a efectelor condiţiilor de mediu asupra structurii

Metode bazate de diferenţa de solubilitate

Proteinele pot fi separate prin exploatarea diferenţelor de solubilitate în

Solubilitatea celor mai multe proteine globulare este puternic influenţată

Deoarece proteinele au valori deferite ale pH-ului izoelectric, datorită

Proteină pH-izoelectric Proteină pH-izoelectric

Separarea proteinelor prin cromatografie de adsorbtie

Cromatografia prin schimb ionic

Cromatografia prin schimb ionic se bazează pe fenomenele reversibile