Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr.

3, Septembrie 2007

45

Metode de separare folosite pentru studiul proteomului

Separation methods used for the study of proteome Ileana Funduc*
Rezumat Termenul proteom definete setul total de proteine exprimate de ctre genom ntr-o celul, esut sau lichid biologic, la un moment dat. Scopul studierii proteomului este identificarea i cuantificarea proteinelor dintr-un material biologic, analiza modificrilor expresiei proteice a celulelor normale fa de cele patologice, caracterizarea modificrilor post-translaionale, studiul interaciilor protein-protein, ct i alte aplicaii. Analiza proteomic se poate clasifica n trei categorii principale: expresia proteomului, analiza bioinformatic i funcionalitatea proteomului. Studiul proteomului utilizeaz pentru analiza de imagine, electroforeza, cromatografia i, pentru identificarea secvenelor proteice, n special spectrometria de mas. Se descriu diferite metode electroforetice i de vizualizare a spoturilor de proteine n geluri. Cnd nivelul sensibilitii i specificitii modelelor proteomice vor avea valori maxime, metodele diagnostice care se sprijin pe acestea vor revoluiona medicina. Cuvinte-cheie: electroforez, cromatografie, spectrometrie de mas.

Abstract
The term proteome defines the total set of proteins expressed by its genome in a given cell, tissue or biological fluid, at a given time. The purpose of proteomics is the identification and quantification of proteins from the given biological material, analysis of the changes in protein expression in normal versus diseased cells, characterization of post-translational modifications, the study of protein protein interactions as well as other applications. Proteomic analyses can be classified as three main categories: expression proteomics, bioinformatics analysis and functional proteomics. The study of proteome uses for the image analyses electrophoresis, chromatography and for the identification of protein sequences, especially mass spectroscopy. The different methods of electrophoresis and visualization of protein spots in gels are hereby described. If the level of the sensitivity and specificity of the proteomic patterns will have maximum values, the disease diagnosis using them will revolutionize medicine.

Keywords: electrophoresis, chromatography, mass spectrometry

Adresa de coresponden: Ileana Funduc, Barajul Uzului 2, bl.Y16, sc.A, apt.18, Sector 3, 032796 Bucureti Tel. 0724210670, Tel/fax: 0213407668

46

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

Introducere Denumirea de PROTEOM a fost introdus prima dat n 1994 de ctre Marc Wilkins14, provenind de la PROTEine exprimate de genOM - adic setul total de proteine al unei celule date, exprimat de genomul su. Analiza proteomic constitue un domeniu de studiu separat, dar complementar cu genomul. Unii cercettori afirm c denumirea de proteom ar proveni i de la PROTEUS o divinitate primordial n mitologia grecilor antici, care cunotea trecutul, prezentul i viitorul, dar i displcea s mprteasc informaiile. El trebuia s fie legat n timpul somnului de dup amiaz, cci altfel scpa i se transforma n diverse forme materiale. Strns legat, ddea rspunsul dorit i apoi se arunca n mare. Datorit puterii sale de a lua diverse forme, Proteus a fost socotit un simbol al materiei de origine din care toi suntem creai. Definiii ale proteomului 1998 Anderson N.L. i Anderson N.G1: folosirea msurrii cantitative a nivelului proteic din expresia genei, pentru a caracteriza procesele biologice i a descifra mecanismele controlului expresiei genetice. 2000 Gygi i Raebersold10: ... abilitatea identificrii sistematice a fiecrei proteine exprimate ntr-o celul sau esut, ct i determinarea proprietilor caracteristice ale fiecrei proteine ca stare de modificare, concentraie, implicare n complexele multiproteice. 2001 Yates15: ... disciplina caracterizrii i analizrii proteinelor, a interaciilor proteice i a modificrilor proteice ale unui organism. 2003 Huber9: ... o colecie dinamic de proteine ce difer de la individ la individ i chiar de la celul la celul. 2003 Beranova-Giorgianni3: ... proteine exprimate ntr-un compartiment biologic (celule, esut, organ) ntr-un anumit moment, sub un set particular de condiii.

De ce a aprut necesitatea studierii proteomului? Analiza genomic este limitat, ea neputnd s ofere informaii complete referitoare la funciile celulare, subcelulare i supracelulare n care proteinele i nu genele guverneaz. Un exemplu l prezint diversele stadii ale ciclului de via al unei insecte: aceeai gen determin diverse morfologii datorit variaiei proteomului i nu genomului (Figura 1). Genomul este constant ani de zile; proteomul variaz cu tipul celulei (dei toate celulele au acelai genom), rspunde la stimulii mediului nconjurtor, la tratamente chimice i depinde chiar i de istoricul celulei. Numrul de gene din genomul uman atinge 10000. Celula uman are aproximativ 20000 proteine cu o greutate medie de 50 kD8 care, cnd sunt supuse digestiei, produc un numr mare de peptide. Dup Regnier10, digestia triptic a celulelor elibereaz cel puin 1 milion de peptide, deoarece celulele conin mii de proteine, fiecare genernd o mulime de fragmente triptice. Proteinele sufer transformri dup ce sunt exprimate (activitate enzimatic, abilitate de legare etc.), transformri ce pot determina creterea numrului de peptide dintr-un singur esut la 10-20 milioane.

Figura 1. Stadii diferite ale ciclului de via a unei insecte cu acelai genom i morfologii diferite determinate de variaii ale proteomului11.

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

47

Scopul studierii proteomului3: identificarea i cuantificarea proteinelor din celule, esuturi i lichide biologice; analiza modificrilor expresiei proteinelor n celulele normale n raport cu cele patologice; studierea interaciunilor protein-protein; caracterizarea modificrilor post-translaionale. Prin atingerea acestor obiective sunt posibile: clarificarea mecanismelor moleculare ce guverneaz procesele moleculare; caracterizarea reelelelor complexe de pro- Figura 2. Schema general a etapelor analizei proteomice (dup [2]). teine i a perturbaiilor lor; 1. Ob inerea unei expresii proteomice descoperirea proteinelor-biomarkeri pentru detectarea i diagnosticul bolilor; 1.1. Prepararea probei pentru analiz identificarea intelor pentru proiectarea implic solubilizare, extracie, izolare din ceterapiei medicamentoase. lul sau esut. Datorit proprietilor fizice i chimice 11 diverse ale proteinelor, se aplic diferite protoEtapele analizei proteomice (Figura 2) coale de extracie care s favorizeze anumite compartimente ale ntregului proteom. Dintre 1. Obinerea unei expresii proteomice: substanele folosite pentru solubilizarea probei 1.1. Prepararea probei pentru analiz (solubilifac parte uree de mare concentraie, tiouree, zare, extracie, izolare din celul sau esut). DTT (dithiothreitol), DTE (dithioeritritol), fos1.2. Separarea componentelor probei. fine, detergeni (triton) etc7. Cele mai multe 1.3. Detectare (evaluare i identificare). protocoale de extracie pentru electroforez biAceast faz permite compararea exdimensional pezint o limitare pentru solubilipresiei proteice ntre dou sau mai multe condizarea proteinelor de membran. ii experimentale sau stadii de boal, ceea ce 1.2. Separarea componentelor probei. contribuie la nelegerea mecanismelor fizioloDefinirea metodologiei de separare a gice i patogenice i la determinarea comparatiproteinelor dintr-un mediu biologic se face n v a abundenei proteice n diversele condiii. funcie de ceea ce vrem s studiem10: o anumit 2. Analiza bioinformatic - extinde inprotein, un grup de proteine, toate proteinele. formaiile anterioare la posibilitatea obinerii de a. O anumit protein structuri primare, secundare i teriare, secveniSepararea selectiv se face folosind eri, domenii, interaciuni proteice i reele, locaelectroforeza capilar (CE) i HPLC (High Perlizri subcelulare etc. formance Liquid Chromatography) de afinitate 3. Funcionalitatea proteomului, prin (Figura 3). care sunt analizate interaciunile protein - proPrincipiul de afinitate se bazeaz pe tein, complexele proteice i modificrile posabilitatea substanei biologic active s lege spettranslaionale, n scopul nelegerii rolului procific i reversibil substana de interes. Locurile teinelor int asupra funciilor celulare. de legare a substanei imobilizate trebuie s fie accesibile steric, chiar i dup cuplare i nu tre-

48

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

Coloan plin ICI IBI IAI Produii separai sunt eluai din coloan

Faza mobil

Detectori

Sistem de alimentare cu solvent

Colectare sau evacuare Injector Concentraie Sistem de nregistrare Injecia amestecului de prob coninnd produii A, B, C Timp nregistrare grafic A B C

Figura 3. Schema unei instalaii de cromatografie lichid de nalt performan17.

buie s se deformeze prin imobilizare. n cazul HPLC, substana de interes se ataeaz de suprafaa activ a materialului care umple coloana, iar n cazul CE, de suprafaa coloanei. Amestecul se injecteaz pe coloan i proteina este captat de substana biologic activ prin afinitate, iar restul compuilor trec prin coloan. Proteina captat se elueaz modificnd proprietile tamponului (pH, pI, to etc) (Figura 4).

Figura 4. Schema unei instalaii de electroforez capilar (dup [16]).

b. Un grup de proteine Separarea implic folosirea acelorai metode ca n cazul precedent sau modificarea n trepte a condiiilor experimentale, n funcie de proprietile grupului de proteine ce se separ (hidrofobicitate, ncrctur electric, polaritate). Aceasta se obine modificnd proprietile fazei mobile (pH-ul tamponului, concentraia srurilor etc.) sau tipul coloanei (afinitate, schimb ionic, filtrare n gel). c. Toate proteinele Separarea n acest caz se realizeaz cu o metod multidimensional (bi- sau tridimensional) care s foloseasc dou sau mai multe metode (SDS PAGE -electroforez n gel de poliacrilamid i sodiu dodecil sulfat, HPLC, CE) sau una singur, dar cu mecanisme diferite (partiie, adsorbie, schimb ionic, afinitate, filtrare n gel etc.). Electroforeza bidimensional n gel a rmas, totui, tehnica esenial de separare utilizat n studierea proteomului. Prima dimensiune implic focalizarea izoelectric, prin care proteinele se separ pe baza sarcinii electrice, folosind geluri cu gradient de pH imobilizat, iar a doua dimensiune - separare SDS-PAGE, prin care proteinele se separ pe baza greutii lor

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

49

Figura 5. Electroforez bidimensional: focalizare izoelectric n prima dimensiune, electroforez n gel de poliacrilamid cu sodiu dodecil sulfat n a doua dimensiune (dup [4]).

moleculare (Figura 5). Mii de proteine separate n gel se pot pstra luni i chiar ani la temperatura camerei, ntr-un spaiu egal cu o pagin de bloc-notes. Colorarea se face cu Coomasie Blue sau cu Ag (limit de detecie 1ng), Figura 6. Spoturile de proteine colorate se elibereaz din gel, se cliveaz cu tripsin la carbonul terminal al lizinei i argininei i apoi se caracterizeaz fragmentele peptidice. Electroforeza bidimensional are anu-

mite limite: Este manual, laborioas. Nu exist o matri de gel standardizat pentru a reproduce modelele proteice9. Capacitatea de rezoluie este limitat, fapt pentru care vizualizarea se reduce la 300010000 proteine, n funcie de detecie. Celula mamar, de exemplu, prezint 50000 spoturi/ celul, dintre care doar 7-24% din proteine se pot separa prin electroforez bidimensional,

a.

b. Figura 6. Colorarea traseelor de electroforez cu argint (a) i cu Coomassie Blue (b) 12.

50

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

restul de 76% fiind sub limita de detecie. Domeniul dinamic este, deci, limitat; sunt observate proteinele cele mai abundente i unele clase sunt excluse sau subreprezentate (proteinele foarte acide sau bazice, foarte mari sau foarte mici i proteinele de membran)13. Sensibilitatea este redus: coloranii convenionali nu detecteaz proteine cu rol cheie n procesele celulare (receptori, proteine reglatoare etc.), proteine alcaline, hidrofobe i proteinele membranare, datorit solubilitii lor reduse. Colorantul cu argint sau combinat cu glutaraldehid, nu obine uor reproductibilitatea intensitii spotului. Soluia coloid Coomasie Blue ar fi mai potrivit n acest sens, dar sensibilitatea sa este mai mic 9. Se mai utilizeaz Sypro Ruby, un colorant fluorescent sau marcarea cu fluorofori Cy3 i Cy57. Pentru nlturarea aceastor limite s-au propus unele mbuntiri: alchilarea i marcarea ulterioar cu tritiu, iodacetamid sau cu 125I; prefracionarea proteinelor nainte de electroforez pentru reducerea complexitii lor i/sau izolarea specific a subseturilor lor; sisteme SDS-PAGE verticale; colorani fluoresceni; roboi pentru extirparea spoturilor de pe gel i module pentru digestia automat a proteinelor3; geluri cu domeniu de pH ngust13; dispozitive microchip integrate pentru dife-

rite trepte ale separrii (electroforez, digestie, marcare, fluorescen)10. Toate aceste ncercri au ameliorat impedimentele, dar nu le-au eliminat. HPLC i CE multidimensionale implic nti digerarea proteinelor i apoi separarea lor, deoarece peptidele sunt mai solubile i mai uor de separat comparativ cu proteinele din care provin, cum ar fi proteinele hidrofobe sau cele de membran. Fa de electroforeza n gel, preconcentrarea soluiilor diluate este realizat n HPLC n vrful coloanei prin manipularea fazei mobile nainte de separare, iar n EC cu ajutorul anticorpilor, a dopului de C-18, prin focalizare izoelectric sau izotacoforez. Numrul de peptide separate prin varianta HPLC-CE multidimensionale este mai mare fa de varianta anterioar, dar proteinele cu abundena sczut scap detectrii. 1.3. Detectare (identificare i cuantificare). Identificarea Identificarea cu ajutorul electroforezei bidimensionale n gel, prin colorare sau alt procedeu, a rmas n urm fa de HPLC, fluorescen, fluorescen indus cu laser (LIF) i CE (care permit detectarea on-line folosind absorbia n ultraviolet) i, nu n ultimul rnd, spectroscopia de mas2. Spectroscopia de mas (Figura 7) a rmas tehnica ideal de detectare a peptidelor i proteinelor, datorit universalitii, selectivitii i sensibilitii sale (msoar cu extrem sensi-

Figura 7. Schema etapelor detectrii prin spectroscopie de mas (dup [18]).

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

51

bilitate raportul mas/sarcin electric a ionilor n faz gazoas cu mase moleculare de 50050000 Da)7. n special cuplat cu HPLC sau CE, este cea mai important tehnic pentru cercetarea proteomului, realizarea hrii peptidice, confirmarea secvenelor proteice i investigarea modificrilor post-translaionale. Spectrometria de mas folosete 3 metode ce permit introducerea n spectrometrul de mas a compuilor polari, nevolatili, precum peptidele i proteinele10: bombardament atomic rapid n flux continuu (FAB); ionizare prin pulverizare electric (ESI), prin care se produc ioni n gaz la presiune atmosferic pentru secvenierea parial de peptide; spectrometrie de mas prin desorbie/ionizare cu laser pe matri asistat (MALDI-MS) cu analizor de mas. A mai fost introdus ulterior ionizarea prin pulverizare electric cu analizor cu timp de descrcare de tip quadrupole (ESI-Q-IT-MS), care implic iniial o etap de cromatografie lichid, iar analiza dureaz o or3. Un analizor cu timp de descrcare quadrupole se poate cupla cu ESI sau cu MALDI cu sensibilitate crescut, aprnd generaii ulterioare din ce n ce mai perfecionate. Astfel, a aprut varianta n care proteinele sunt capturate dup separarea pe o faz staionar i imobilizate pe un chip. Acesta se pune pe o matri, dup care urmeaz ionizarea i, n final, se msoar raportul dintre mas i sarcin5. Alte variante utilizeaz anterior analizei spectrometrice, HPLC capilar, cu rezoluie ultra nalt, sau cromatografie de interaciune hidrofob10. Identificarea proteinelor a folosit spectrometria de mas prin 2 modaliti13: Clasic: electroforez bidimensional, digestie, fingerprinting prin spectrometrie de mas; metoda este rapid (3-5 minute/analiz), sensibil (msoar cantiti peptidice de pn la 50 ppm). n final, identificarea se face comparnd lista cu masele peptidelor observate cu o list

calculat a tuturor maselor peptidice. Spoturile de protein separate prin electroforez bidimensional se pot cuantifica n raport cu intensitatea culorii. n acest caz, ns, ne lovim de limitele acestei metode. Un sistem superior folosete LC (Liquid Chromatography) care elimin etapa de electroforez bidimensional. Unele variante folosesc i izotopi i au posibilitatea de a detecta modificri ale profilelor proteice, de exemplu, ntre esutul normal i patologic. Evaluarea cantitativ presupune obinerea unor date cel puin semicantitative. Cantitatea proteinelor din prob se poate calcula cu ajutorul unor standarde marcate cu izotopi care se introduc chimic, metabolic sau prin ncorporare enzimatic n timpul proteolizei13. Marcarea se face folosind un reactiv ce conine un marcator de afinitate biotina, un ligand ce ncorporeaz izotopii i un grup specific pentru tiol. Proba se denatureaz, se reduce, se marcheaz, sufer digestia cu tripsin i se separ prin HPLC on-line cuplat cu spectrometria de mas. 2. Analiza bioinformatic Odat cu imaginile gelurilor de electroforez cu proteinele identificate pe ele i unele date experimentale ca punctul izoelectric i mas molecular, se mai obin i informaii din cursul separrii gelurilor, a microsecvenializ rii, a analizei compoziiei aminoacidice i din spectrometria de mas a fingerprinturilor7. 3. Funcionalitatea proteomului Interaciunile proteice i complexele se analizeaz prin tehnici de co-imunoprecipitare urmate de electroforez bidimensional sau de cromatografie de afinitate, chipuri de proteine, analiza interaciei biomoleculare cu purificare prin spectrometrie de mas etc. Toate aplicaiile se bazeaz pe folosirea unui anticorp specific sau a unui receptor specific i a unor proteine de interacie, analiza ulterioar realizndu-se prin spectrometrie de mas.

52

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

Aplicaii
n ciuda limitelor sale, electroforeza bidimensional este nc folosit pentru analizarea proteomului celular i tisular, pentru compararea hrilor bidimensionale a strilor diferitelor boli10. Astfel, n 2000 s-au folosit gelurile bidimensionale pentru analiza plasmei la bolnavii cu Alzheimer. Tot n acelai an, s-a efectuat analiza proteomic a liniei celulare de carcinom de colon uman i proteomul liniei celulare de carcinom hepatocelular uman. La Conferina anual a Societii Americane de Electroforez din 20046 s-au prezentat rezultatele unui studiu proteomic asupra muchiului scheletic lezat prin arsur, acestea fiind utile n terapia acestor cazuri. Tot cu aceast ocazie a fost prezentat studiul proteomic al lichidului cefalo-rahidian al bolnavilor cu Alzheimer comparativ cu cel provenind de la indivizi sntoi i de la bolnavi cu alte tulburri neuro-degenerative. Cum numrul de proteine variaz ntre 6 1x10 i 5x106, inventarul tuturor proteinelor, unul din scopurile majore ale analizei proteomice, este aproape imposibil de realizat. Mai mult, aceste proteine sunt diferite structural i au caracteristici fizico-chimice diverse, iar caracterizarea acestora constituie o enorm angajare3, 7. Electroforeza bidimensional va mai fi pentru un timp principala tehnologie utilizat n studiul proteomului, dar abordarea cromatografic va nlocui aceast tehnic n viitor9. Unul din scopurile analizei proteomice este gsirea de biomarkeri specifici unei boli care s poat fi utilizai pentru detectarea, monitorizarea evoluiei bolii i a rspunsului terapeutic5. Un biomarker ideal indicat exclusiv pentru o boal nu exist. Conceptul folosirii modelului proteomic ca instrument diagnostic este nc n fa, datorit dificultilor privind folosirea bioinformaticii, descoperirea bazelor biologice din spatele soluiilor matematice etc. La Conferina Internaional asupra proteomului din 2006 s-a artat c elucidarea secvenei

aminoacidice a unei proteine nu este suficient pentru a nelege funcia sau interaciunile sale cu alte proteine i macromolecule; este nevoie s fie luate n considerare modificrile posttranslaionale pentru a nelege dinamica proteomului. Dac sensibilitatea i specificitatea metodologiei vor fi perfecionate, diagnosticul bolilor bazat pe modelele proteomice va revoluiona medicina. Aa cum se spune aceste ghete sunt fcute pentru a merge, acum se pare c ghetele proteomului se potrivesc i avem chiar o idee asupradireciei corecte spre care s mergem9. Se anticipeaz s se ajung n viitor la dezlegarea misterelor unor procese biologice i informaiile modelelor proteomice s constituie un instrument cu un rol mai mult dect complementar n mna medicului clinician.

Bibliografie
1. Anderson N.L., Anderson N.G. - Proteome and proteomics : New technologies, new concepts, and new words. Electrophoresis, 1998;19:1853-1861. Baecher R. 2005, Information Systems in Biology, Proteome Analysis http://lsirwww.epfl.ch/courses/isb/2004ws/Prote ome%20analysis.pdf. Beranova-Giorganni S. Proteome analysis by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry: strengths and limitations. Trends in Analytical Chemistry, 2003; 22;5:273-280. Binz A. P. 2001, Swiss Institute of Bioinformatics, Geneva, Switzerland - Proteomics day: step by step EMBO course, Uppsala, Alain Binz http://www.lcb.uu.se/course/embo2001/binz/pre sentation-PAB-tutorial/ppframe.htm Conrads T.P., Zhou M., Petricoin III E.F. et al. Cancer diagnosis using proteomic patterns. Expert Mol.Rev.Diagn. 2003; 3;4:411-419. Garfin D.E., Rodkey I.S. Electrophoresis in 2004: The Annual Meeting of the American Electrophoresis Society - Expert Rev. Proteomics 2005; 2;2;157-164. Govorun V.M., Archakov A.I. - Proteomic Te-

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Revista Romn de Medicin de Laborator Vol. 8, Nr. 3, Septembrie 2007

53

8.

9.

10.

11.

12.

13.

chnologies in Modern Biomedical Science - Biochemistry (Moscow), 2002;67;10:1109-1123. Hardiman G. Introduction to proteomics: tools for the new biology. Expert Rev.Proteomics 2004;1;1:1-10. Huber L.A. Is proteomics heading in the wrong direction? - Nature Reviews, Molecular Cell Biology, 2003;4:74-80. Issaq H.J. The role of separation science in proteomics research. - Electrophoresis, 2001; 22:3629-3638. Klein J.B. - Overview of Proteomics, Thongboonkerd V., Klein J.B., (eds) Proteomics in Nephrology Contrib.Nephrol.Basel, Karger, 2004;144:1-10. Kossida S.,. Pitknen E, Rousu J. 2007, Proteomics & Bioinformatics, MBI, Master's Degree Program, Helsinki, Finland www.cs.helsinki.fi/bioinformatiikka/mbi/courses/06-07/proteomics/slides/lecture1.ppt. Lane C.S. Mass spectrometry based proteo-

14.

15. 16.

17. 18.

mics in the life sciences. CMLS, Cell.Mol.Life Sci., 2005;62:848-869. Wilkins M.R., Sanchez J.C., Gooley A.A. et al. Progress with proteome projects: Why all proteins expressed by a genome should be identified and how to do it. Biotechnol. Genet. Eng.Rev. 1996; 13:19-50. Yates J. Proteomics Workshop at HPCE 2001, Boston, MA, 2001. --- Protein separation and fractionation GMS6181-2007 http://bioinformatics.ufl.edu/courses/GMS6181/ Week10-Proteomics-2.pdf. --- High Performance Liquid Chromatography (HPLC), www.protein.iastate.edu/hplc.html --- CMSC 838T Lecture 12 Proteomics, Study of the proteome: Methods, 2D electrophoresis, Mass spectrometry, Protein arrays & microarrays. http://amber.cs.umd.edu/class/838-s04/lec12.pdf