Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

3.3. T E H N O L O G I A

PCR

Definire. Generaliti. Reacia PCR (Polymerase Chain Reaction = Reacie de Polimerizare n Lan) este o metod de amplificare enzimatic in vitro a unei anumite secvene de ADN. n prezent a fost dezvoltat o adevarat tehnologie PCR care este folosit ntr-o varietate foarte mare de domenii: biologie molecular, tiinele mediului, criminalistic, tiine medicale, biotehnologie, microbiologie, industria alimentar, epidemiologie etc. Din punct de vedere chimic, reacia PCR este constituit din cicluri succesive de replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizeaz cu cele 2 catene ale secvenei originale (folosit ca matri n replicare). Diferena esenial ntre o asemenea reacie de replicare i un proces de replicare ADN in vivo, l reprezint faptul c n reacia PCR etapa de desfacere a dublului helix matri i, respectiv, cea de ataare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea unor trepte de temperatur, iar singura enzim folosit n reacie este o ADN polimeraz ADN-dependent (cu funcie de replicaz). Principalele 3 etape ale unei reacii PCR pot fi sintetizate astfel : ADN d.c. matri ADN m.c. ataarea primerilor polimerizare ADN polimeraz ADN dependent termostabil 2 molecule ADN d.c. identice cu molecula matri Principalele componente ale reaciei sunt : ADN matri, o ADN polimeraz termostabil, primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfati (dNTP), tamponul de reacie, ioni de Mg++. O reacie PCR este format din n cicluri (ntre 25 i 40), n fiecare ciclu fiind parcurse 3 etape principale: denaturarea termic a matriei (deci, desfacerea dublului helix ADN), ataarea primerilor i polimerizarea propriu-zis. La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN rezultat este dubl fa de matri. Mai mult, produsele rezultate ntr-un ciclu sunt folosite ca matri n ciclul urmator, astfel nct numrul final de copii ADN este de 2n x y, unde y = numrul iniial de copii, iar n = numrul de cicluri de replicare. Este de subliniat faptul c moleculele acumulate exponenial reprezint copii ale matriei care la capete au incorporai primerii. In concluzie, reacia PCR este o metod prin care se obin cantiti mari dintr-o anumit secven ADN. Aceste molecule pot fi ulterior manipulate/analizate fr a fi necesar o prealabila clonare molecular a acestora. Prima raportare n literatura de specialitate a unui experiment de amplificare in vitro a unei secvene ADN prin PCR a fost realizat de Kary Mullis n 1985. Ulterior, metoda a fost aplicat de ctre un grup de cercettori de la Departamentul de Genetic Uman de la Cetus Corporation (SUA) pentru amplificarea secvenei de ADN ce codific -globina uman i pentru diagnosticul prenatal al anemiei falciforme. Initial, reacia PCR folosea ca replicaz fragmentul mare (Klenow) al ADN polimerazei I de la Escherichia coli. Aceast enzim era nsa inactivat de temperaturile ridicate necesare etapei de denaturare a matritei. Ca urmare, la fiecare ciclu de replicare trebuia adaugat enzim proaspt. Ulterior, a fost descoperit i introdus n reacia PCR o ADN polimeraz termostabil izolata iniial dintr-o tulpin de Thermus aquaticus (bacterie termofil izolat din izvoarele termale Yellow Spring din SUA). Un alt pas important n dezvoltarea tehnologiei PCR a fost procesul de automatizare care a condus la producerea n prezent a unor aparate ce desfaoar singure ntreg procesul de PCR, parcurgnd toate treptele de temperatur n n cicluri. Componentele reaciei a) Matria ADN. De cele mai multe ori, ntr-o reacie PCR se introduc molecule de ADN d.c. linear/circular ce include secvena de amplificat. Puritatea ADN introdus ca matri reprezint un parametru important pentru succesul unei reacii PCR. De exemplu, cantiti mari de ARN dintr-un extract ADN pot chelata ionii de Mg++, determinnd astfel o activitate sczut a ADN polimerazei. Pe de alt parte, o serie de contaminani din extractul ADN pot inhiba aciunea ADN polimerazei.

Cap. 3-2 Tehnologia PCR

Cantitatea de matri ADN introdus ntr-o reacie PCR influeneaz puternic performana reaciei. Cantitile recomandate pentru o reacie PCR standard sunt: maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10 ng ADN bacterian, 0.1-1 ng ADN plasmidial. Cantitatea ADN trebuie ns corelat cu numrul de copii de secven matri, aceasta depinznd de complexitatea moleculelor de ADN. Astfel, pentru un plasmid de 4 kbp din care trebuie amplificat o secven de 1 kbp, secvena matri reprezinta 25% din ADN introdus n reacie. In timp ce, o secven tot de 1 kbp, dar dintr-un ADN genomic uman (specia uman avnd un genom de aproximativ 3.3 x 109 bp), reprezint doar 0.00003% din ADN introdus n reacie. Ca urmare, pentru a avea acelai numr de secvene matri, trebuie introdus o cantitate de aproximativ 1 milion de ori mai mare n cazul ADN genomic uman. Ca recomandare general, se pornete cu un minimum de 104 copii de secven matri pentru a obtine un semnal ntr-o reacie PCR de 25-30 cicluri, avnd ns grij ca, concentraia final de ADN n amestecul de reacie s fie mai mic sau egal cu 10 ng/l. Conversia acizilor nucleici din microgram n numar de molecule
Cantitate 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g 1 g Acid nucleic 1 kbp ARN 1 kbp ADN d.c. Vectorul pGEM 3/4 Z ADN de fag ADN genomic E.coli ADN genomic uman Numr de molecule 12 1.80 x 10 11 9.18 x 10 11 2.85 x 10 10 1.90 x 10 8 2.00 x 10 5 3.04 x 10

b) primerii oligonucleotidici. In general, dimensiunea primerilor folosii n reaciile PCR este cuprins ntre 15 i 30 bp i, de obicei, sunt complementari cu capetele 5 i, respectiv, 3 ale regiunii ce urmeaz a fi amplificat. Se recomand ca primerii s aib un procent molar de guanin + citozin (% mol GC) cuprins ntre 40 60% i s aib o distribuie echilibrat a domeniilor bogate n A/T i G/C. Este recomandabil ca cei 2 primeri s aib valori Tm care s permit temperaturi de ataare ntre 55 i 65oC (pentru specificitate maxim se folosesc temperaturi de 62-65oC). Pe de alt parte, este ideal ca cei 2 primeri s aib valori Tm identice sau foarte apropiate i s nu prezinte secvene cu complementaritate intracatenar (i care, deci, s determine structuri secundare interne). Totodat, pentru a se evita dimerizarea primerilor, este necesar ca primerii s nu fie complementari unul cu celalalt. In general, concentraiile optime ale primerilor ntr-o reacie PCR sunt cuprinse ntre 0.1 i 0.6 M. Intr-o reacie PCR, un parametru important l repezint temperatura de ataare a primerilor la matria ADN (primer annealing temperature). Astfel, n cazul primerilor cu valori ridicate de Tm poate fi crescut temperatura de ataare a primerilor. Acest lucru conduce la minimizarea atarilor nespecifice, la reducerea cantitii de dimeri de primeri, precum i la creterea cantitii de produs PCR corect. Pentru a determina valorile Tm ale acizilor nucleici exist numeroase formule. Pentru determinarea acurat a valorilor Tm ale primerilor, se recomand efectuarea reaciei PCR la diverse temperaturi de ataare, pornind de la o temperatur cu 5oC mai mic dect valoarea Tm calculat. Formula de mai jos poate fi folosit pentru a estima temperatura de topire pentru orice oligonucleotid: Tm = 81.5 + 16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%G+C) 675/n Unde [Na+] reprezint concentraia salin molar ([K+] = [Na+]) i n = numrul de baze din oligonucleotid De exemplu, pentru calcularea Tm a unui oligonucleotid 22mer (format din 22 de nucleotide) cu 60% G + C n 50 mM KCl: Tm = 81.5 + 16.6 x (log10[0.05]) + 0.41 x (60) 675/22 = 53.84oC c) ADN polimeraza termostabil In prezent n toate reaciile de tip PCR se introduc ADN polimeraze termostabile. Variantele naturale ale unor asemnea enzime au fost izolate din microorganisme termofile, care posed echipamente enzimatice cu temperaturi optime ridicate (mai mari de 70oC) i care sunt capabile s desfoare activitile specifice i dup treceri peste temperaturi extreme (n jur de 100oC). In marea majoritate a cazurilor, pornind de la asemenea variante naturale, ADN polimeraze termostabile au fost manipulate genetic (cu obinerea unor variante ameliorate) i clonate n tulpini de E.coli (microorganism ce este mult mai uor de crescut i manipulat dect bacteriile termofile). In majoritatea experimentelor, cantitatea optim de ADN polimeraz termostabil (sau de amestec de ADN polimeraze) este cuprin ntre 0.5 i 0.25 U / 50 l volum de reacie. Tipuri de ADN polimeraze ADN dependente termostabile a) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa Taq 1) ADN polimeraza Taq 2

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Dezvoltarea foarte mare a tehnologiei PCR, precum i a aplicaiilor sale se datoreaz n bun masur, nlocuirii n asemenea tehnici, a fragmentului Klenow-ADN pol I izolat din E.coli cu o ADN polimeraz termostabil izolat din Thermus aquaticus i denumit Taq pol. Prima specie molecular de Taq pol izolat (n anii 1976-1980) avea o greutate molecular de aproximativ 70 KDa i o activitate specific de 2000 uniti/mg. Ulterior (n 1989), a fost izolat o alt specie molecular de Taq pol, cu o greutate molecular de 94 KDa i cu o activitate specific de 20.000 uniti/mg. Aceast enzim are temperatura optim de 75-78oC, iar la temperaturi de peste 90oC activitatea sa scade semnificativ. La temperatura optim, o molecul din aceast enzim polimerizeaz aproximativ 150 nucleotide/sec. In afar de activitatea de polimerizare (n direcia 5-3), aceast specie molecular de ADN polimeraz, mai are i activitate exonucleazic n aceeai direcie cu cea de polimerizare (5-3). Nu are ns activitate exonucleazic n direcie invers polimerizarii (3-5 - activitate enzimatic ce asigur funcia de citire i incorporare corect a nucleotidtrifosfailor - proofreading), astfel nct fidelitatea incorporrii depinde strict de concentraia dNTP n amestecul de reacie. Analizele moleculare au demonstrat ca Taq pol prezint similaritate de secven a aminoacizilor cu ADN polimeraza I din E.coli, mai ales n treimea dinspre captul amino-terminal, domeniu care la E.coli ADN pol I este responsabil de activitatea exonucleazic 5-3. Taq pol permite realizarea de reacii PCR n 3 trepte de temperatur (Fig3.31), n care denaturarea moleculelor de ADN d.c. se realizeaz la 90-95oC, ataarea primerilor la 55-60oC, iar polimerizarea la 72-75oC. 2) ADN polimeraza Ampli-Taq. Aceast enzim este o ADN polimeraz recombinant obinut prin exprimarea unei forme modificate a genei pentru Taq pol n E.coli. Activitatea optim a acestei enzime se desfoar n range-ul de temperatura la care are loc i ataarea stringent a primerilor (55-75oC, cu maximumul la 60oC). Ca urmare, folosirea acestei enzime simplific reacia PCR de la 3 trepte de temperatur la 2 trepte (Fig 3.32): 95oC temperatura la care se realizeaz denaturarea ADN d.c., 60oC ataarea primerilor i polimerizarea. Pe de alta parte, Ampli-Taq pol are o stabilitate mult mai mare la temperaturi de peste 90oC, fa de Taq pol, a crui activitate enzimatic scade semnificativ cu fiecare trecere peste 90oC. In plus, Ampli-Taq pol are i activitate exonucleazic n direcie 3-5, ceea ce determin ca aceast enzim s prezinte o mult mai mare specificitate de citire i de incorporare. 3) ADN polimeraza Ampli-Taq fragmentul Stoffel este reprezentat de Ampli-Taq din care a fost scos un fragment de 290 aminoacizi de la capul N-terminal. Fragmentul excizat este responsabil de activitatea exonucleazica n directie 5 3, i deci, Stoffel-Ampli-Taq nu prezint acest tip de activitate, ceea ce, pe de o parte, crete mult viteza de polimerizare, iar pe de alt parte permite o amplificare mai eficient a matrielor circulare (de ex. ADN plasmidial). Este de 2 ori mai termostabil decat Ampli-Taq i i pstreaz activitatea optim ntr-un range mult mai larg de concentraii de Mg++. b) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa VENT 1) ADN polimeraza VENT pol este o ADN polimeraz ADN dependent termostabil izolat din Thermococcus litoralis. Aceast bacterie triete n izvoare marine calde, cunoscute n literatura de specialitate sub denumirea de vent-uri. VENT pol desfoar ambele tipuri de activiti exonucleazice(n direie 3-5 i, respectiv, n direcie 5-3). 2) ADN polimeraza VENT pol (exo-) este similar cu VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic 5 3. c) ADN polimeraze ADN dependente termostabile din clasa DEEP VENT 1) ADN polimeraza DEEP VENT pol este o enzim izolat dintr-o tulpin de Pyrococcus (microorganism ce triete n izvoare marine calde de mare adncime). Aceast enzim desfoar ambele tipuri de activiti exonucleazice, dar este mai rezistent dect VENT pol, i dect Ampli-Taq pol la temperaturi de 100oC - temperaturi necesare denaturrii matrielor (n mod special la matriele circulare, lungi sau cu % mol GC ridicat). 2) DEEP VENT (exo-) pol este similar cu DEEP VENT pol, dar nu are activitate exonucleazic 5 3. d) ADN polimeraze ambivalente termostabile 1) ADN polimeraza rTth pol este o ADN polimeraz recombinat obinut prin exprimarea unei forme modificate a genei din Thermus thermophilus, n E.coli. Caracterul ambivalent al acestei enzime const n faptul c poate fi folosit ca ADN polimeraz ARN dependent (revers-transcriptaz), n prezena MnCl2, dup care, prin chelatarea ionilor de Mn i adugare de MgCl2, poate aciona ca ADN polimeraz ADN dependent, desfurnd o reacie PCR. In afar de asemenea enzime tipic ambivalente, este de menionat faptul c i alte ADN polimeraze (Taq, Ampli-Taq, Stoffel) prezint i activitate revers-transcriptazic, dar foarte slab. In ceea ce privete concentraia de enzima polimerizatoare, aceasta depinde de tipul de enzim folosita. Pentru ADN polimeraza Taq pol sunt suficiente 1.25 U ntr-un volum de reacie de 50 l (pentru multe aplicaii va fi chiar ntr-un oarecare exces). Cantiti crescute de enzim sau timpi 3

Cap. 3-2 Tehnologia PCR

prelungii de polimerizare nu vor crete semnificativ produsul de reacie, ci vor genera artefacte datorate activitii exonucleazice 5 3 a ADN polimerazei Taq pol (n gelul de verificare vor aprea ca nite benzi mnjite). Un alt parametru important al reaciei PCR este temperatura la care are loc reacia de polimerizare (extension temperature). Aceast temperatur este determinat de tipul de ADN polimeraz folosit, n general recomandndu-se meninerea timpului de 1 minut pentru fiecare kbp de amplificat. Ca numr de cicluri, pentru marea majoritate a reaciilor PCR sunt suficiente 25-40 de cicluri. Un alt aspect important n manipulrile genetice ulterioare ale unui produs de reacie PCR l reprezint tipul de capete pe care l genereaz ADN polimeraza respectiv. Astfel, ADN polimeraza Taq pol genereaz capete coezive cu prelungiri 3-A. In timp ce majoritatea enzimelor ce prezint activitate exonucleazic 3 5 genereaz capete netede.

- denaturarea termica a matritei

ADN matrita: o molecula de ADN d.c. 92-95oC

M a t r i\ ` d en a tu r a t`

- atasarea primerilor

55-60oC

- reactia de polimerizare pornind de la primeri

72-75oC

ADN polimeraza

ADN polimeraza

Produsul unui ciclu de amplificare: doua molecule de ADN d.c. - al 2-lea ciclu de amplificare

4 molecule ADN d.c.

- n cicluri de amplificare

Fig.3.31. Reacia PCR n 3 trepte de temperatura

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

- denaturarea termica a matritei

ADN matrita: o molecula de ADN d.c. 92-95 C

o

Matrita denaturata

- atasarea primerilor - reactia de polimerizare pornind de la primeri 57-60oC

ADN polimeraza

ADN polimeraza

Produsul unui ciclu de amplificare: doua molecule de ADN d.c. - al 2-lea ciclu de amplificare

4 molecule ADN d.c.

- n cicluri de amplificare

2 molecule ADN d.c.

Fig.3.32. Reacia PCR n 2 trepte de temperatur

Tipul de ADN polimeraz Klenow-ADN pol I Taq pol Ampli-Taq ADN pol Stoffel-Ampli-Taq pol Vent pol Vent pol (exo ) Deep Vent pol Deep Vent pol (exo-) Pfu pol RTth pol
-

Microorganism de origine E.coli Thermus aquaticus Thermococcus litoralis Pyrrococcus furiosus

TC optim 37 75-80 55-75 55-60 55-60 55-60 55-60 55-60 55-60

Stabilitate la 95o 100 C + + + + + + +

Activitate exonucleazic 35 + + + + + + + +

Activitate exonucleazic 53 + + + +

Nr.trepte de temperatur 3 2 2 2 2 2 2 2 2

d) dNTP (deoxinucleotidtrifosfai = dATP, dGTP, dCTP, dTTP). Deoxinucleotidtrifosfaii introdui n reacie sunt folosii de ctre ADN polimeraz n reacia de polimerizare. In amestecul de reacie se introduc cantiti echimolare din cele 4 tipuri de molecule; n caz contrar scade fidelitatea ADN polimerazei. Concentraia optim a dNTP variaz ntre 50 i 500 M (pentru fiecare dNTP), valoarea cea mai uzual fiind 200 M. Aceast concentraie trebuie corelat cu concentraia Mg++. In cazul n care se dorete obinerea unor produi de reacie PCR marcai (radiactiv sau neradioactiv), se introduc dNTP marcate. 5

Cap. 3-2 Tehnologia PCR

e) tamponul de reacie (contine Tris-hidroxi-aminometan - ca substan amfoter - , i MgCl2, necesar funcionrii optime a ADN polimerazei termostabile). Exist i variante n care tamponul de reacie nu conine Mg++, iar acesta este livrat separat, permind optimizarea concentraiei ionilor de Mg++. Ionii Mg++ formeaz complexe solubile cu moleculele dNTP pentru a produce substratul propiu-zis recunoscut de ADN polimeraz. Concentraia ionilor de Mg++ este un factor crucial ce afecteaz performana oricrei ADN polimeraze. Astfel, o serie de componente ale reaciei de PCR (matria ADN, ageni chelatori prezeni n proba de ADN cum sunt de exemplu EDTA sau citraii - sau diverse tipuri de proteine) pot scdea cantitatea ionilor liberi de Mg++, ceea ce conduce la o activitate slab sau chiar inactivitate a Taq polimerazei. Pe de alt parte, excesul ionilor de Mg++ reduce fidelitatea enzimei i poate conduce la creterea amplificrilor nespecifice. Concentraia optim de MgCl2 variaz ntre 1 i 5 mM, valoarea cea mai frecvent folosit fiind 1.5 mM (cu dNTP la concentraia de 200 M fiecare). Mg++ influeneaz activitatea enzimei i crete valoarea Tm a ADN d.c. Excesul ionilor de Mg++ ntr-o reacie PCR poate crete atarile nespecifice ale primerilor. Din aceste motive este necesar a determina concentraia optim de MgCl2 pentru fiecare reacie PCR. Acest lucru poate fi realizat prin prepararea unei serii de reacii ce conin diverse concentraii de Mg++, ntre 1.5 i 3.0 mM Mg++ (cu incremente de 0.5 mM), prin adugarea a 3, 4, 5 i, respectiv, 6 l dintr-o soluie stoc de 25 mM MgCl2 la amestecuri de reacie de 50 l. Este important de reinut c n acest caz trebuie folosit un tampon de reacie ce nu conine MgCl2. Nota: Inainte de folosire, soluiile ce conin Mg++ trebuie dezgheate complet i vortexate cteva secunde pentru c atunci cnd sunt ngheate soluiile de MgCl2 tind s formeze gradieni de concentraie. Dupa amestecarea tuturor componentelor unei reacii PCR se adaug un strat de ulei mineral pentru a preveni evaporarea n timpul reaciei. Dac termocycler-ul este prevzut cu un capac cu nclzitor, nu este necesar stratul de ulei mineral. Treptele de temperatur ale unei racii PCR standard Denaturarea iniial Pentru ca oreacie PCR s se desfoare eficient, este foarte important ca moleculele ADN matri s fie denaturate iniial complet. Acest lucru poate fi realizat prin nclzirea iniial amestecului de reacie 2 min la 94-95oC. Treapta de denaturare din cadrul fiecrui ciclu De obicei, este suficient o denaturare de 20-30 sec la 94-95oC, dar aceasta trebuie adaptat funcie de termocycler i de tuburile folosite (de ex., dac se lucreaz n tuburi de 500 l sunt necesari timpi mai lungi dect dac se lucreaz n tuburi de 200 l). Totodat, pentru matrie bogate n GC se recomand folosirea unor timpi de denaturare mai lungi. Ataarea primerilor In marea majoritate a experimentelor, temperatura de ataare a primerilor trebuie determinat i optimizat empiric. Alegerea acestei temperaturi reprezint unul din factorii cei mai critici pentru asigurarea unei nalte specificti a reaciei PCR. Dac temperatura de ataare este mult prea nalt, nu are loc ataarea primerilor, iar dac temperatura este prea sczut, atunci crete probabilitatea atarilor nespecifice. Polimerizarea propriu-zis Taq ADN pol polimerizeaz aproximativ 60 baze per secund la 72oC. In fiecare ciclu, o perioad de polimerizare de 45s este suficient pentru amplificarea unor fragmente de pn la 1 kbp. Pentru amplificarea unor fragmente mai mari de 1 kbp, timpul se calculeaz n multiplii de 45s, urmat de ajustri pentru diverse matrie. Pentru a obine o cantitate ct mai mare de amplicon, se poate varia timpul de polimerizare, astfel: pentru primele 10 cicluri se folosete un timp constant de polimerizare (de ex. 45s pentru 1 kbp), iar pentru urmtoarele 20 de cicluri se crete timpul de polimerizare cu 2-5s per ciclu (de ex. 50s pentru ciclul 11, 55s pentru ciclul 12 etc). O asemenea mrire progresiv a timpului de polimerizare ofer enzimei mai mult timp pentru polimerizare, pentru c pe msur ce reacia PCR avanseaz, n amestecul de reacie se gsete din ce n ce mai mult matri i din ce n ce mai puin enzim activ (randamentul enzimei scade datorit expunerii prelungite la temperaturi nalte). Numrul de cicluri Intr-o reacie PCR obinuit, mai puin de 10 molecule de matri pot fi amplificate n mai puin de 40 de cicluri, obinndu-se un produs (amplicon) detectabil n electroforez n gel de agaroz. La o cretere mult prea mare a numrului de cicluri, se pot acumula produi de reacie nespecifici. 6

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Polimerizarea (extensia) final In multe reacii, dup ultimul ciclu de amplificare, tuburile de reacie se tin 5-15 min la 72oC pentru a realiza polimerizarea complet a produilor pariali, precum i renaturarea moleculelor monocatenare. Platoul amplificrii O reacie PCR de amplificare ADN in vitro nu este infinit: dup un anumit numr de cicluri, secvena amplificat nu se mai acumuleaz exponenial, iar reacia intr ntr-o faz linear (staionar) denumit platoul amplificrii. In laboratorul nostru efectum reaciile PCR cu ajutorul unui kit Promega PCR Core System II (cu Taq polymerase) pentru care productorii recomand urmtoarele volume de reacie i concentraii finale pentru reacia de control :
Component Soluie MgCl2 25 mM Tampon 10X fr MgCl2 Amestec dNTP 10mM Upstream control primer 15M * Downstrean control primer 15M * ADN polimeraza Taq 5U/l Plasmid - control pozitiv 1ng/l * Apa nuclease-free Volum 3 l 5 l 1 l 3.3 l 3.3 l 0.25 l 1 l Pn la volum total de 50 l Concentraie final 1.5 mM 1X 0.2 mM 1 M 1 M 1.25 U / 50 l <1ng / 50 l

* Kitul Promega PCR Core System II conine (ca, de altfel, toate kiturile de PCR comercializate) i un sistem de control pozitiv constitutit dintr-un ADN matri plasmidial i 2 primeri specifici pentru acesta. Acest sistem permite verificarea calitii celorlalte componente ale reaciei: ADN polimeraz, tamponul, soluia de MgCl2, amestecul de dNTP. Volumele i concentraiile listate n acest tabel sunt valabile pentru sistemul de control pozitiv. Pentru diverse probe este necesar ncercarea a mai multor variante de reacie. Este evident c cei 2 primeri sunt utili numai pentru matria plasmidial de control. In laboratorul nostru s-a folosit o schem similar celei prezentate mai sus:
Component Tampon 10X cu 15mM MgCl2 Amestec dNTP 10mM Upstream control primer 15M * Downstrean control primer 15M * ADN polimeraza Taq 5U/l Plasmid - control pozitiv 1ng/l * Apa nuclease-free Volum 5 l 1 l 2 l 2 l 0.3 l 1 l 38.7 l Concentraie final 1X cu 1.5 mM MgCl2 0.2 mM 0.6 M 0.6 M 1.5 U / 50 l <1ng / 50 l

Componentele reaciei (cu excepia matriei) au fost amestecate ntr-un tub Eppendorf de 0.5 ml cu perei subiri (pentru a se realiza mai rapid transferul de temperatur). Intr-un alt tub a fost pus 1.25 l ADN matri (plasmid de control pozitiv 1ng/l). Tubul a fost introdus n termocycler unde a fost denaturat 6 min la 95oC. Apoi, din matria denaturat a fost adugat 1 l n amestecul de reacie. Tubul a fost apoi vortexat i centrifugat 30 sec. In final, tubul a fost introdus n termocycler, iar acesta a fost programat pentru : 25 cicluri formate din: 95oC 1 min : denaturare 50oC 1 min : ataare primeri 72oC 2 min : polimerizare elongare final 7 min la 72oC Dupa terminarea reaciei PCR, ca de altfel, n foarte multe alte situaii, nainte de a analiza sau manipula ampliconul, este necesar efectuarea unei electroforeze n gel de agaroz pentru verificarea reaciei. In funcie de dimensiunea moleculei amplificate se prepar un gel de agaroz de diverse concentraii. Totodat, pentru verificarea dimensiunii moleculare a ampliconului este necesar folosirea unui marker de greutate molecular. Pentru ampliconul de control din kitul Promega PCR Core System II (323 bp) se recomand folosirea unui gel de agaroz de concentraie 2%, preparat n tampon TBE 1X, iar tamponul de electroforez s fie TBE 0.5X (n general, pentru fragmente de ADN d.c. linear de dimensiuni relativ mici se recomand TBE 0.5X ca tampon de electroforez).

Cap. 3-2 Tehnologia PCR

Fig.3.33. Electroforeza n gel de agaroz 2%, TBE 0.5X a ampliconului de control din kitul Promega PCR Core System II (ampliconul a fost obinut n condiiile de reacie menionate mai sus). Godeuri: 1- -ADN / BstEII; 2- Ampliconul de control (25 l); 3- Sigma PCR marker; 4- ADN / EcoRI, HindIII. In laboratorul nostru se realizeaz un studiu privind frecvena alelelor STR in diverse segmente din populaia Romaniei. Locii STR (Short Tandem Repeat) constau n secvene repetitive scurte, de 3-7 bp. Aceste repetiii sunt abundente n genomul uman i sunt localizate n diverse gene (de ex. genele pentru lipoproteinlipaz, tirozinhidroxilaz, tiroidperoxidaz, factorul XIII de coagulare etc). Pentru fiecare din aceste gene se manifest un polimorfism al locilor STR (distingndu-se astfel diverse alele), polimorfism dat de prezena / absena secvenelor repetitive i, respectiv, de numrul acestor secvene. Folosirea STR ca markeri polimorfici este util in diferenierea populaiilor umane. Cea mai facil metod de detectare a acestor secvene folosete reacia PCR. Cu ajutorul kiturilor Promega, se realizeaz urmtourl amestec de reacie :
Componentele reaciei Apa nuclease-free Tampon 10X pentru STR * Pereche de primeri specifici pentru locusul analizat 10X Taq ADN pol 0.5U/l ADN genomic uman ** Volum (l) 18.5 2.5 2.5 0.5 1

Nr. fragmente 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

-ADN / BstEII 8.454 bp 7.242 6.369 5.686 4.822 4.324 3.675 2.323 1.929 1.371 1.264 702 224 117

-ADN / EcoRI, HindIII 12.226 bp 5.148 4.973 4.268 3.530 2.027 1.904 1.584 1.375 947 831 564 125

Sigma PCR marker 2.000 bp 1.500 1.000 750 500 300 150 50

* Tampon 10X pentru STR: 500 mM KCl, 100 mM Tris.HCl, 15 mM MgCl2, 1% Triton X100, 2mM din fiecare dNTP ** Acest protocol poate fi folosit utiliznd cantiti foarte mici de ADN (1-5 ng) Dupa amestecarea tuturor componentelor reaciei se adaug o pictur de ulei mineral. Condiiile de amplificare: Denaturare iniial - 2 min la 96oC Amplificare 30 cicluri : 1min la 94oC 1 min la 60oC 1.5 min la 70oC Variante tehnice i aplicatii ale tehnologiei PCR Marele avantaj al tehnicilor PCR l reprezint faptul c permite obinerea unei cantiti mari dintr-o anumit secven ADN, fr a necesita clonarea acesteia n prealabil ntr-o molecul de tip vector. Pe de alt parte, tehnologia PCR a revoluionat i implicarea geneticii moleculare n domenii n care se apeleaz la cantiti foarte mici de ADN. Asemenea situaii se ntlnesc n : - diagnosticul unor boli monogenice, precum i detectarea de noi tipuri de mutaii n gene importante n anumite boli; - diagnosticul unor infecii umane: permite detectarea particulelor infecioase bacteriene i virale chiar aflate ntr-o proporie mic, chiar pentru specii ce se cultiv dificil in vitro, chiar pentru patogeni cu variabilitate antigenic mare, i chiar pentru patogeni ce au perioad mare de laten; astfel, pot fi identificai indivizii umani pozitivi nainte de seroconversie; - studii privind mecanismele genetice ce acompaniaz procesele maligne (detectarea secvenei i esutului n care se exprim anumite oncogene n diverse procese maligne); - studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular: obinerea rapid a unei cantiti mari din secvene ADN cu valoare taxonomic i/sau filogenetic; - biologia populaiilor, inclusiv la organisme mici: tehnologia PCR permite secvenierea rapid a unor molecule de ADN de la foarte muli indivizi, fr a necesita n prealabil clonarea acestora; 8

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

studii de antropologie: tehnica PCR permite n prezent recuperarea i analiza unor secvene ADN din fosile; medicin legal: cu ajutorul reaciilor PCR pot fi n prezent analizate la nivel molecular o serie ntreag de probe biologice.

In afar de toate aceste aplicaii directe ale tehnologiei PCR, pornind de la reacia iniial de amplificare, au fost imaginate o serie ntreag de variante tehnice ce permit abordarea unor manipulri ct mai acurate a moleculelor de acizi nucleici. 1. Obinerea unor cantiti suficiente dintr-o anumit secven Cu ajutorul tehnologiei PCR se pot obine cantiti suficiente dintr-o anumit secven ADN, astfel nct s poat fi folosit n diverse manipulri, inclusiv pentru secveniere sau experimente de clonare. 2. Obinerea de sonde ADN/ARN marcate Foarte multe tehnici de obinere de sonde ADN/ARN folosesc variante de reacii PCR. Astfel, ntr-o prim variant, se folosesc primeri marcai (n sistem radioactiv sau neradioactiv de marcare) i dNTP nemarcate. Ampliconii obinui ntr-o asemenea reacie sunt molecule dublu-catenare marcate la capete (primerii unei reacii PCR intr n structura produilor de reacie).
Matrita

denaturarea termica a matritei

atasarea primerilor marcati

reactia de polimerizare folosind dNTP nemarcate

n molecule dc marcate la capete denaturare

sonde marcate la capete

Fig.3.34. Obinerea prin PCR de sonde marcate la capete

Intr-o alt variant tehnic, n reacia PCR se introduc att primeri marcai, ct i dNTP marcate. Ampliconii obinui vor fi reprezentai de molecule marcate pe toat lungimea. In ambele cazuri, ampliconii rezultai sunt denaturai termic, obinndu-se n final sondele monocatenare utilizabile n reaciile de hibridizare molecular. 3. PCR n mutageneza situs-specific Pornind de la faptul ca primerii folosii ntr-o reacie PCR sunt inclui n produsele PCR (ampliconi), au fost dezvoltate o serie ntreag de variante tehnice ale acestei reacii. Astfel, n experimentele de mutagenez situs-specific, modificrile dorite pot fi introduse n ampliconi pe calea primerilor, fie c este vorba de inserii sau de deleii. In toate aceste cazuri se utilizeaz o tehnologie PCR n care reacia de amplificare este mprit n 2 reacii PCR separate n care sunt amplificate cele 2 secvene ADN aflate de o parte i de alta a situsului de modificat (Fig.3.36). In aceste 2 etape se folosesc perechi de primeri constituite dintr-un primer extern (pentru captul moleculei ADN iniiale) i un primer intern (primerii interni sunt complementari situsului de modificat i conin n secven modificarea dorit). Prin folosirea unor asemenea primeri, ampliconii rezultai conin deja modificarea dorit, precum i o zon de complementaritate inter-ampliconi. Dup aceast etap se realizeaz ndepartarea primerilor interni, amestecarea celor 2 produse PCR, denaturarea termic a moleculelor urmat de renaturarea acestora n condiii de stringen. Se adaug primeri exteriori i se realizeaz o noua reacie PCR, al crei rezultat va fi reprezentat de molecule ADN identice cu matria initial, coninnd ns i modificarea dorit. 9

Cap. 3-2 Tehnologia PCR

Spre deosebire de tehnicile clasice de mutagenez, i chiar de experimentele de mutagenez cu ajutorul transposonilor, asemenea variante tehnice de PCR permit o rezoluie i o acuratee mult mai mare n obinerea de molecule ADN modificate. In mare majoritate, aplicaiile practice vizeaz analiza corelaiilor dintre secvena de nucleotide a unor molecule ADN i realizarea anumitor funcii.
Matrita

denaturarea termica a matritei

atasarea primerilor marcati

reactia de polimerizare folosind dNTP marcate

n molecule dc marcate pe toata lungimea denaturare sonde marcate pe toata lungimea

Fig.3.35. Obinerea prin PCR de sonde marcate pe toata lungimea

Situs unde vom introduce o pereche de baze ADN d.c tinta

Primer extern 1

Re ac tii PCR sep ar ate , folosind primeri interni care contin o alterare

Primer intern 2

Primer intern 1

PCR

PCR

Primer extern 2

- indepartarea primerilor interni; - amestecarea celor 2 produse PCR; - denaturare-renaturare, urmate de atasare de primeri externi

Primeri externi

- polimerizare

Molecule ADN care contin o alterare

Fig.3.36. Mutagenez situs specific prin PCR

10

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

ADN d.c. tinta

Secventa de inserat

Primeri externi

Doua reactii PCR separate

Primeri externi

Primeri interni care contin secventa ce va fi inserata

PCR

PCR

Amestecarea celor doua produse de reactie, denaturare, renaturare in conditii de stringenta

Hibrid molecular

-atasare primeri externi -polimerizare

Fig.3.37. PCR pentru introducere de inserii

Secventa ce va fi deletata ADN d.c. tinta

Doua reactii PCR separate Primeri externi Primeri externi

Primeri interni

Primeri interni

PCR

PCR

Amestecarea celor 2 produse de reactie, denaturare, renaturare in conditii de stringenta

Hibrid molecular

- atasare de primeri externi - polimerizare

ADN d.c ce prezinta o deletie

Fig.3.38. PCR pentru producere de deleii

11

Cap. 3-2 Tehnologia PCR

4. PCR n obinerea de molecule ADN recombinate Un alt set de studii i propun analiza funciilor de promotor a unor secvene ADN, sau chiar obinerea de molecule ADN recombinate cu rat nalt de transcriere (Fig.). In acest scop, se folosete o schem de manipulare genetic similar celei de mai sus. Astfel, se realizeaz 2 reacii PCR separate n care sunt amplificate secvena potenial promotor i, respectiv, secvena codificatoare. In ambele reacii PCR se utilizeaz perechi de primeri constituite dintr-un primer extern i un primer intern (n acest caz, primerii interni conin i o poriune complementar celeilalte molecule). Etapele urmtoare sunt similare: ampliconii rezultai n aceste 2 reacii PCR se amestec, se denatureaz i se renatureaz n condiii de stringen. In aceast a treia reacie PCR se introduc doar primeri externi i se obin molecule ADN recombinate, formate din secvena promotor i din secvena codificatoare.
Promotor Secventa codificatoare (ORF)

PCR

PCR separat pentru fiecare secventa

PCR

2n

2n

Amestecarea celor 2 produse de reactie, denaturare-renaturare in conditii de stringenta

Hibrid molecular

PCR cu primeri externi

Promotor

Secventa codificatoare 2n molecule

Fig.3.39. PCR combinatorial

5. ARN PCR O serie ntreag de experimente vizeaz obinerea de molecule de ADNc (complementar cu anumite molecule ARN). O variant tehnic utilizeaz reaciile de revers-transcriere, n timp ce o alt variant se bazeaz pe reacii PCR (Fig.3.40). Astfel, dupa denaturarea structurilor secundare ale moleculelor ARN, se ataeaz un primer complementar capului 3 al moleculei ARN i are loc sinteza primei catene de ADNc. In aceast reacie se folosete o ADN polimeraz ARN-dependent (reverstranscriptaz), de tipul AMV-RT (Avian Mieloblastosis Virus Revers-Transcriptase), MLV-RT (Murine Leukaemia Virus Revers-Transcriptase), rTth(recombinant Thermus thermophilus DNA polymerase). Hibridul ARN:ADN obinut n aceast reacie de revers-transcriere este supus unei reacii de distrugere a catenei ARN cu RNaza H, dup care la catena ADN rmas este ataat un primer complementar cu capul 3 al acesteia. Dup sinteza celei de-a doua catene ADN, moleculele sunt introduse ntr-o reacie PCR obinuit la sfritul creia sunt obinute moleculele de ADNc (complementar cu moleculele ARN de la care s-a plecat). Avantajul unei asemenea variante tehnice l reprezint faptul c se obine o cantitate mare a secvenelor ADNc. PCR invers In foarte multe experimente este necesar amplificarea unor molecule de ADN cu secven necunoscut. Un asemenea caz este i cel n care se studiaz situsurile n care se insereaz o serie de transposoni sau genomul unor virusuri (Fig.3.41). In aceast situaie se secioneaz cu endonucleaze de restricie o molecul ADN ce cuprinde secvena cunoscut (transposon, genom viral) ncadrat de secvene necunoscute (aparinnd genomului gazdei). Aceast molecul este apoi circularizat i introdus ntr-o reacie PCR n care se folosesc primeri complementari cu capetele secvenei cunoscute. Ampliconul rezultat este reprezentat de secvena necunoscut. 12

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

ARN m.c.

- denaturarea structurilor secundare cu metilmercur hidroxid

- atasare primer 1 (primer ARN)

- sinteza primei catene de ADNc (revers transcriere) Hibrid ADN :ARN - degradarea catenei ARN cu RN azaH - atasarea primer 2

- polimerizare cu ADN polimeraza termostabila

- denaturarea termica a ADN d.c.

- atasarea primerilor 1 si 2; polimerizare

2n molecule

Fig.3.40. ARN-PCR

Regiune cunoscuta

ADN cu secventa necunoscuta, de studiat Digestie cu enzime de restrictie si circularizare

|||
||||

| | | | | || | | | | | | | | |

||| ||||

||

|||

||

Secvente primer orientate invers

||| ||||

PCR
2n molecule

6. PCR in situ Una din limitrile tehnicii PCR o reprezint necesitatea de a extrage i purifica matria (ADN sau ARN) nainte de amplificare. Varianta tehnic PCR in situ combin o reacie PCR cu o hibridizare molecular in situ. Astfel, reacia PCR se realizeaz n celule intacte i este apoi detectat prin hibridizare in situ (ntreaga reacie, att PCR, ct i hibridizarea, se realizeaz pe esut mparafinat i plasat pe lama de microscop). Printr-o asemenea tehnica se poate identifica foarte exact care celule poseda o anumita secven ADN, sau care exprima o anumita gena. Pe de alta parte, se reduce foarte mult riscul contaminarii produselor PCR cu alte secvene ADN.

||

||

Fig.3.41. PCR invers

13

||

||

|||

||||||

||||||||||

|||

||

||