Sunteți pe pagina 1din 27

ILEANA STOICA

TATIANA VASSU

ELENA SSRMAN

BIOLOGIA I TAXONOMIA MOLECULAR


A MICROORGANISMELOR
COLECIA DE CULTURI MICROBIENE

Ilustraie: Oana Iftime

Ileana Stoica
Coperta: Oana Iftime
Redactor: Oana Iftime
Ileana Stoica

Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei


STOICA, ILEANA
Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor:
Colecia de culturi microbiene / Ileana Stoica, Tatiana Vassu-Dimov,
Elena Ssrman Bucureti: Arvin Press, 2002
p. ; cm.
ISBN 973-96090-3-8
I. Vassu-Dimov, Tatiana
II. Ssrman, Elena
579.8

P A RT E A A T R E I A . B I O LO G I A I TA XO N O M I A
D R O J D I I LO R

CAPITOLUL X

BIOLOGIA I TAXONOMIA DROJDIILOR


Drojdiile sunt un grup de fungi cu o diversitate filogenetic deosebit, ale cror forme
teleomorfe sau stri sexuate sunt prezente la nivelul a dou clase taxonomice majore,
Ascomycotina i Basidiomycotina.
Speciile anamorfe, care prezint numai nmulire asexuat, au fost iniial grupate n
fungii imperfeci.
De asemenea, termenul de drojdie este considerat, n prezent, unul de convenien,
aceste organisme, a cror diviziune mitotic (pe cale vegetativ) se realizeaz prin nmugurire
sau prin fisiune binar, fiind formele unicelulare ale fungilor filamentoi.
Taxonomia sau sistematica unui organism cuprinde trei pri importante i anume:
clasificarea aranjarea organismelor n grupe taxonomice pe baz de similaritate;
identificarea compararea caracterelor organismelor neidentificate cu indivizi deja
caracterizai i clasificai i
nomenclatura atribuirea unor nume taxonilor identificai, parametrii valabili i n
cazul drojdiilor n definirea unui taxon.
Microbiologii au studiat taxonomia drojdiilor de mai bine de un secol, dar nc mai
sunt destule de realizat pentru a stabili un sistem de clasificare complet.
O identificare corect este absolut necesar pentru tratamentul eficient al infeciilor,
pentru nelegerea interaciunii dintre specii n natur i pentru selectarea celor mai potrivite
tulpini pentru industria fermentativ i alimentar.
Un sistem de clasificare acurat presupune stabilirea interrelaiilor filogenetice, ce se
bazeaz pe similariti biochimice i genetice, incluznd diferite ci metabolice i
mecanismele de control ale acestor ci.
Un astfel de sistem filogenetic de clasificare prezint un interes particular pentru
biotehnologi, care trebuie s combine diferite proprieti metabolice i, dac aceste proprieti
aparin unor specii strns nrudite, ansa de a se exprima ntr-un singur organism este mai
mare.
De exemplu, n cazul fuziunii de protoplati, produii de fuziune au o mai mare
stabilitate dac parentalii aparin unor specii strns nrudite. n cazul aplicrii tehnologiei
ADN recombinant pentru introducerea anumitor caracteristici metabolice, ADN-ul heterolog
inserat se exprim mult mai bine ntr-o gazd strns nrudit cu specia donor.
Scopul acestui capitol este de a prezenta principalele metode de clasificare,
identificare i nomenclatur a drojdiilor, inclusiv a tehnicilor de taxonomie molecular, care
permit o ncadrare taxonomic mai corect a diferitelor genuri i specii.
Tabelele 10.1, 10.2 i 10.3 prezint caracteristicile claselor n care se ncadreaz
drojdiile.

Tabelul 10.1. Genurile clasei Ascomycotina i caracteristicile lor

Aspectul

Alte trsturi

Genul

asc

ascospori

celule

Ambrosiozyma

Sferic sau oval

1-4/asc cu form de plrie

Arthroascus

Provine din celule


hifale dilatate

Sferici sau aproape


sferici ; 1-4/asc

nmugurire multipl, pseudohife,


hife adevrate cu septe adevrate
nmugurire multipolar, pseudohife; hife adevrate cu septe,
avnd un singur micropor

Fermenteaz slab zaharurile;


izolate de pe insecte
Nu fermenteaz zaharurile; izolate
din sol; materiale vegetale

Arxiozymma

Sferici sau ovali; 1-2/asc

nmugurire multipolar; pseudohife; nu formeaz hife


adevrate
nmugurie multipolar; nu
formeaz hife sau pseudohife

Fermenteaz zaharurile; izolate


iniial de la psri de curte

Citeromyces

Sferic sau oval;


provine din celule
vegetative
Sferic

Clavispora

Sferic sau alungit Clavai; 1-2/asc

nmugurire multipolar;
pseudohife; nu au hife adevrate

Coccidiascus

Alungit cu form
de banan

Au form de fus; peste 8 per asc

nmugurire multipolar; nu
formeaz hife sau pseudohife

Cyniclomyces

Alungit

Alungii, 1-4/asc

Debaryomyces
Dekkera

Sferici; 1-2/asc

vegetative

nmugurire multipolar;
pseudohife, dar nu hife
adevrate
Sferic sau
n general sferic cu suprafaa
nmugurire multipolar,
elipsoida
ondulat, 1-4/asc
ocazional pseudohife, fr hife
adevrate
Sferic sau alungit Cu form de plrie sau sferic, 1- nmugurire multipolar,
4/ asc
pseudohife, fr hife adevrate

Fermenteaz intens unele


zaharuri; izolate din concentrate
de fructe
Fermenteaz zaharurile; izolat
iniial din surse umane i animale
Izolate de la Drosophila
Fermentaia slab a zaharurilor;
izolate din stomacul i fecalele de
iepure

Fermenteaz zaharurile, proces


care este stimulat de oxigenare;
izolate din bere i vin ca specii

contaminante.
Guilliermondella

Alungit

Sferici, ovali sau reniformi 1-4/


asc

nmugurire predominant lng


polii celulei; formeaz
pseudohife i hife adevrate

Fermenteaz glucoza; izolate din


reziduri taninice.

Hanseniaspora

Oval sau alungit

Cu form de plrie, 1-4 per asc

Issatcheria

Oval sau alungit

Sferici i uor ondulai pe


margine, 1-4 per asc

Celule nmgurite au form de


lmie; formeaz pseudohife dar
nu hife adevrate
nmugurire multipolar,
pseudohife, fr hife adevrate

Kluyveromyces

Sferic sau alungit Sferici sau reniformi, 1-c.1oo/asc nmugurire multipolar, pot
forma pseudohife, dar nu i hife
adevrate

Lipomyces

Elipsoidal sau
alungit

Fermenteaz zaharurile; izolate


din sol, fructe i alte materiale
vegetale i din surse clinice
Fermenteaz zaharurile; izolate
din sol, fructe, vin, Drosophila,
ap marin i surse clinice
Fermenteaz zaharurile; izolate
din sol, ap, fructe i alte
materiale vegetale, Drosophila,
surse clinice
Nu fermenteaz zaharurile; izolate
din sol, formeaz colonii mucoide

Lodderomyces

Sferic sau alungit Oblongi cu capete netede, 1-2per


asc

Metschnicowia

Sferic sau
elipsoidal

Alungii, 1-2 per asc

Nadsonia

Alungit

Sferici; 1-2 per asc

nmugurire bipolar; nu
formeaz nici pseudohife nici
hife adevrate

Nematospora

Alungit

Alungii cu form de fus, cu un


apendice terminal asemntor
unui bici

Inmugurire multipolar;
fsormeaz pseudohife i hife
adevrate

Sferici sau alungii, de culoare


brun, 1-c.3o/asc

nmugurire multipolar, pot


forma pseudohife, dar nu i hife
adevrate
nmugurire multipolar,
formeaz pseudohife dar nu i
hife adevrate
nmugurire multipolar;
pseudohife; nu formeaz hife

Fermenteaz zaharurile; izolate


din sol i suc de portocale; utililizeaz n-alkani
Fermenteaz zaharurile; izolate
din ap marin, ape curgtoare, de
pe flori, nevertrebate i
Drosophila
Fermenteaz zaharurile; izolate
din sol i materiale vegetale
Fermenteaz zaharurile;
determin boli la alunele de
pmnt, capsulele de bumbac,

fasole
Pachysolen

Hemisferc

Hemisferici; 1-4 per asc

nmugurire multipolar; pseudohife; nu formeaz hife adevrate

Pachytichospoa

Elipsoidal

Sferici sau elipsoidali

Pichia

Sferic sau
elipsoidal

Sferici sau cu form de plrie, 14 per asc

Saccharomyces

Sferic sau
elipsoidal

Sferici sau elipsoidali, 1-4 per


asc

nmugurire multipolar; pseudohife rudimentare; nu formeaz


hife
nmugurire multipolar; unele
specii formeaz pseudohife sau
hife adevrate, cu un singur
micropor septal
nmugurire multipo-lar,
pseudohife, nu formeaz hife
adevrate

Saccharomycodes

Elipsoidal sau
alungit

Sferici, 1-4 per asc

Saccharomycopsis

Schizosaccharomyces
Schwanniomyces
Sporopachydermia

nmugurire bipolar, formeaz


pseudohife, dar nu hife
adevrate
Sferic sau
Sferici, elipsoidali sau n form de nmugurire multipolar,
elipsoidal
plrie, 1-4 /asc
formeaz pseudohife i hife
adevrate cu septe avnd
plasmodese
Alungit
Sferici sau elipsoidali; 4-8 per
Diviziune celular prin fisiune
asc
binar; se pot forma hife
adevrate
Sferic sau
Sferici cu un inel ecuatorial
nmugurire multipolar ;
elipsoidal
distinct; 1-2/asc
formeaz ocazinal pseudohife,
nu hife adevrate
Sferic sau alungit Sferici sau elipsoidali, 1-4/asc
nmugurire multipolar,
formeaz ocazional pseudohife
dar nu hife adevrate

Fermenteaz zaharurile, inclusiv


xiloza; izolate din reziduri
taninice
Fermenteaz zaharurile; izolate
din sol i din cecumul animal
Unele specii fermenteaz
zaharurile; izolate din sol, fructe,
alte materiale vegetale insecte,
surse clinice
Fermenteaz viguros zaharurile;
izolate din sol, fructe, alimente,
bere, vin foarte rar din surse
clinice
Fermenteaz zaharurile; izolate
din produse vegetale
Fermenteaz slab zaharurile;
izolate de pe fructe, polen,
material lemnos, insecte, alimente
bogate n amidon
Fermenteaz viguros glucidele
izolate din sucuri, fructe, vin,
substraturi bogate n zaharuri
Fermenteaz zaharurile; izolate
din sol
Nu fermenteaz zaharurile,
produc mirosuri puternice; izolate
din ape marine, curgtoare,

reziduale, surse clinice


Stephanoascus

Sferic

Iniial cu form de plrie,iar la


maturitate devin hemisferici,
1-4/asc
Sferici, 1-4/asc

nmugurire multipolar,
formeaz pseudohife i hife
adevrate
nmugurire multipolar;
pseudohife, nu formeaz hife
adevrate

Torulaspora

Sferic sau
elipsoidal

Waltomyces

Elipsoidal sau
alungit

Sferici sau alungii; pigmentai n


brun;1-20/asc

nmugurire multipolar; nu
formeaz pseudohife sau hife
adevrate

Wickerhamiella

Sferic

Oblongi, n general 1/asc

Nu fermenteaz zaharurile; izolat


din vin i melas

Williopsis

Sferic sau
elipsoidal

Sferici sau elipsoidali, cu un inel


ecuatorial; 1-4/asc

Wingea

Sferic

Au form lenticular; de culoare


brun deschis, 1-4/asc

nmugurire multipolar, nu
formeaz pseudohife i hife
adevrate
nmugurire multipolar,
pseudohife, nu formeaz hife
adevrate
nmugurire multipolar; nu
formeaz hife i pseudohife

Yarrowia

Sferic sau
elipsoidal

Sferici sau n form de plrie;


1-4/asc

Zygoascus

Sferic sau
elipsoidal

Hemisferici sau cu form de


plrie; 1-4/asc

nmugurire multipolar;
formeaz pseudohife i hife
adevrate cu un singur por
central
nmugurire multipolar;
formeaz pseudohife sau hife
adevrate, cu un singur micropor
septal

Nu fermenteaz zaharurile; izolate


din sol, ape reziduale, materiale
bogate n lipide i proteine, surse
clinice i animale
Fermenteaz zaharurile; izolate
din must, reziduri industriale
organice

Nu fermenteaz zaharurile; izolate


din sol, surse animale i umane
Nu fermenteaz zaharurile; izolate
din sol, fructe, sucuri de fructe,
buturi alcoolice, alimente bogate
n zaharuri sau sare, surse clinice
sau animale
Nu fermenteaz zaharurile;
formeaz colonii mucoide; izolate
din sol

Fermenteaz zaharurile; izolate


din sol, ape, material vegetal
Nu fermenteaz zaharurile; izolate
din sol i materiale vegetale

Zygosaccharomices

Format prin
conjugarea a dou
celule, fiecare
cuprinznd 1 sau
mai muli
ascospori

Sferici sau elipsoidali, 1-4/asc

nmugurire multipolar,
pseudohife, nu formeaz hife
adevrate

Fermenteaz zaharurile; izolate


din vin, alimente, fructe, material
vegetal, Drosophila

Tabelul 10.2. Genurile clasei Basidiomycotina i caracteristicile lor

Genul
Chionosphaera

Filobasidiella

Aspectul
starea sexual
celulele vegetative
Conjugarea celulelor nmugurite de Celule nmugurite i ocazional
tip opus de mperechere uninucleate pseudohife; hife adevrate se formeaz
determin formarea unor hife
numai ca parte a ciclului sexuat
dicariotice care formeaz un mic
corp de fructificaie; basidia de pe
corpul de fructificaie poart
basidiospori care se reproduc prin
nmugurire
Celulele nmugurite de tip opus de
Celule nmugurite; nu se formeaz
mperechere se unesc pentru a
pseudohife
forma hife dicariotice; din hife se
formeaz basidii neseptate, care
produc basidiospori aranjai n
lanuri de cte patru; au fost
identificate i tulpini homotalice cu
autofertilizare

Alte trsturi
Cu excepia prezenei corpului de fructificaie
acest gen pare s aib un ciclu de via similar
cu Filobasidiella; nu formeaz teleospori i
pigmeni; izolate de pe suprafaa frunzelor
moarte

Starea teleomorf a lui Cryptococcus


neoformans; nu formeaz teleospori i
pigmeni; izolate din sol i excremente de
porumbel

Filobasidium

Celulele nmugurite de tip opus de


mperechere fuzioneaz pentru a
forma hife dicariotice din care se
formeaz basidii cu basidiospori
terminali; sunt prezente i tulpini
homotalice
Celulele nmugurite de tip opus de
mperechere conjug pentru a
forma hife dicariotice care dau
natere la teleospori; teleosporii
germineaz pentru a forma basdii
septate i neseptate care formeaz
basidiospori; prezint i tulpini
homotalice
Similar cu Leucosporidium

Celule nmugurite, pseudohife i hife


adevrate

Sporidiobolus

Ciclul de sexuat este n mare


msur similar cu cel de la
Leucosporidium

Sterigmatosporidium

Se formeaz hife dicariotice care


poart teleospori,care germineaz
pentru a forma basidii neseptate, ce
dau natere la basidiospori; prezint
i tulpini homotalice

Celule nmugurite, pseudohife i hife


adevrate formate de unele specii nainte
de conjugare; formeaz ca i anamorful
su Sporobolomyces, ballistospori
Mugurii se formeaz la nivelul unor
extensii celulare denumite sterigme; se
formeaz i pseudohife i hife adevrate

Leucosporidium

Rodosporidium

Unele specii fermenteaz zaharurile; nu


formeaz pigmeni i teleospori; izolate din
buturi alcoolice, alimente fermentate i surse
clinice

Celule nmugurite; unele tulpini formeaz Majoritatea speciilor fermenteaz zaharurile;


hife i pseudohife nainte de conjugare
izolate din ape marine i solul Antarcticii

Celule nmugurite, pseudohife i hife


adevrate formate de unele specii nainte
de conjugare

Nu fermenteaz zaharurile; culturile sunt de


culoare galben stins, portocaliu sau roie
datorit prezenei pigmenilor carotenoizi;
izolate din ape marine i curgtoare, sol,
plante i surse clinice
Nu fermenteaz zaharurile; culturile sunt de
culoare roz sau roie; izolate din sol, ape, aer,
surse clinice i de pe frunze
Nu fermenteaz zaharurile; izolate de pe pasta
de celuloz

Tabelul 10.3. Drojdiile imperfecte (anamorfe ) i caracteristicile lor

Aspectul
teleomorfii asociai

Genul

celulele vegetative

Aciculoconidium

Celule ovale sau elipsoidale


nmugurite i conidii aciculare; se
formeaz hife adevrate
nmugurire multipolar, celule
frecvent ogivale la un capt, se
formeaz pseudohife dar nu hife
adevrate
Celule nmugurite, pseudohife i
hife adevrate; formeaz
balistospori
nmugurire multipolar, pseudohife
i hife adevrate
Celule nmugurite i ocazional
pseudohife

Ascomicete pe baza testului DBB


(diazonim blue B) negativ

Fermenteaz slab zaharurile; izolate de la


Drosophila

Genul Dekkera

Vezi genul Dekkera din tabelul 10.1

Bazidimicete pe baza testului DBB


pozitiv i prezena balistosporilor

Nu fermenteaz zaharurile; nu au pigmeni


carotenoizi; izolate din aer, debriuri vegetale

Multe genuri de ascomicete i cteva


genuri de bazidiomicete
Testul DBB pozitiv indic specii de
bazidiomicete

mugurire bipolar i ocazional


pseudohife rudimentare

Testul DBB negativ indic un teleomorf


ascomicet

Caracteristicile sunt cele ale partenerilor


teleomorfi
Nu fermenteaz zaharurile; inozitolul
reprezint sursa de carbon; izolate din aer,
ap, alimente, materiale vegetale, insecte,
animale, om
Fermenteaz zaharurile; izolate din bere;
acest gen este neobinuit, deoarece prezint
nmugurire bipolar, dar n acelai timp o
serie de caracteristici ale genului
Brettanomyces, incluznd producerea de acid
acetic i un timp scurt de via n cultur

Brettanomyces

Bullera
Candida
Cryptococcus

Feniella

10

Alte trsturi

Fellomyces

nmuguririre din vrful sterigmelor


cu un punct de septare adiacent
mugurelui; celulele mam au n
general cteva sterigme; formeaz
pseudohife i hife adevrate
Celule n form de lmie, cu
nmugurire bipolar; pot s formeze
psudohife, dar nu hife adevrate
Celule cu nmugurire unipolar;
forneaz hife adevrate

Creterea vegetativ este similar cu cea


de la Strigmatosporidim, gen ce
reprezint starea teleomorf

Nu fermenteaz zaharurile; izolate din aer,


ap marin, brnzeturi, insecte, animale, om

Partenerul teleomorf este Hanseniaspora

Vezi genul Hanseniaspora n tabelul 10.1

Pe baza testului DBB bazidiomicete

Izolate de pe piele, de la om i animale

Oosporidium

nmugurire multipolar; se pot


forma pseudohife

Pe baza testului DBB ascomicete

Phaffa

Celule nmugurite; clamidospori;


pseudohife rudimentare

Testul DBB pozitiv indic specii de


bazidiomicete

Rhodotorula

nmugurire multipolar; formeaz


pseudohife i hife adevrate

Starea sexual este reprezentat de


Rhodosporidium

Nu fermenteaz zaharurile; sunt prezeni


pigmeni non-carotenoizi roz sau orange;
izolate din materiale vegetale
Fermentaia slab a zaharurilor; culturile sunt
de culoare roie darorit acumulrii
pigmenilor carotenoizi
Nu fermenteaz zaharurile; culturi de culoare
roie, oranj sau galben; izolate din aer, ap,
sol, materiale vegelale, insecte, animale, om

Sarcinosporon

Celulele nmugurite care se separ


sau rmn legate n agregate de
tipul celor formate de Sarcina
nmugurire bipolar; pseudohifele
sunt rudimentare sau absente, nu
formeaz hife adevrate
Celule nmugurite; unele tulpini
formeaz pseudohife sau hife
adevrate; formeaz balistospori

Testul DBB pozitiv indic specii de


bazidiomicete

Nu fermenteaz zaharurile; izolate din leziuni


ale pielii

Testul DBB negativ indic specii de


ascomicete

Nu fermenteaz zaharurile; izolate din sol i


coninut stomacal

Partenerul teleomorf este Sporodiobolus

Nu fermenteaz zaharurile; culturile sunt roz


sau roii, datorit pigmenilor carotenoizi;
izolate din sol, ap, aer, frunze, surse clinice

Kloeckera
Malassezia

Schizoblastosporium
Sporobolomyces

11

Sterigmatomyces

nmugurire din vrful sterigmelor;


nu formeaz pseudohife sau hife
adevrate

Testul DBB pozitiv indic specii de


basidiomicete

Nu fernenteaz zaharurile; izolate din aer, ap


de mare, surse clinice

Sympodiomyces

Celule nmugurite; unele celule


formeaz conidiofori care produc
conidii terminale; eliberarea
succesiv a conidiilor determin
formarea unui patern de cicatrici de
tip simpodial; se formeaz i hife
adevrate
Celule nmugurite i artrospori care
se formeaz printr-un proces de
fuziune; sunt prezente pseudohife i
hife adevrate; se pot forma i
endospori asexuai
nmugurire multipolar cu celule
elipsoidale sau triunghiulare; nu se
formeaz pseudohife sau hife
adevrate

Testul DBB negativ indic asocirea cu


ascomicetele

Nu fermenteaz zaharurile; izolate din ap


marin

Asocierea unor specii de basidiomicete


i a altora cu ascomicete

Pot s realizeze sau nu fermentarea


zaharurilor; izolate din ap, aer, sol, alimente,
material vegetal, de la om i animale

Testul DBB negativ indic asocierea cu


ascomicetele

Nu fermenteaz zaharurile; din bere i must

Trichosporon

Trigonopsis

12

X.1. Metode convenionale de identificare a drojdiilor


Separarea drojdiilor n genuri i specii se realizeaz, ntr-o prim etap, pe baza
analizei aspectului microscopic al strilor vegetative i sexuate.
Testele fiziologice reprezint etapa urmtoare de identificare a drojdiilor la nivel de
specie. Majoritatea taxonomitilor utilizeaz aceste teste asociate cu cele morfologice, dar
exist numai cteva scheme care permit o identificare complet a unui taxon numai pe baza
reaciilor de fermentaie i asimilaie. Principalul dezavantaj n utilizarea exclusiv a acestor
teste const n faptul c exist o variabilitate mare n reaciile test, fie datorit procedeelor
utilizate, fie datorit rspunsului tupinii, ceea ce duce la o identificare eronat.
1. Teste morfologice
Morfologia strilor vegetative
Marea majoritate a drojdiilor prezint nmugurire multipolar, un tip de diviziune
celular n care mugurii se formeaz pe o arie extins a suprafeei celulare.
Au fost identificate i specii cu nmugurire bipolar sau unipolar.
Speciile genului Schizosaccharomyces difer de celelalte drojdii, prin faptul c
nmulirea vegetativ se realizeaz exclusiv prin fisiune binar, proces care presupune
formarea unui perete celular n partea central a celulei i separarea celor dou celule fiice.
O alt variaie se ntlnete n cazul speciilor genului Trichosporon, care se divid i prin
nmugurire i prin fisiune binar.
Unele specii, pe lng diviziunea prin nmugurire sau fisiune, pot s formeze hife sau
pseudohife. Hifele adevrate se caracterizeaz prin lipsa constriciilor la nivelul pereilor
despritori, n timp ce pseudohifele, dei sunt alungite, se formeaz prin nmugurire i
prezint constricii n punctele de ataare celular. Formarea hifelor i a pseudohifelor este
stimulat de reducerea oxigenului, fapt ce se poate realiza n laborator ntr-o plac Petri, prin
plasarea unei lame de sticl pe suprafaa agarului, n zona inoculului.
Morfologia strilor sexuate
n cazul drojdiilor ascomicete, o semnificaie taxonomic deosebit o prezint o serie
de caracteristici ale strilor sexuate, cum ar fi:
dac au un sistem de mperechere homo- sau heterotalic;
tipul de conjugare, dac exist, nainte de formarea ascosporilor;
forma, topografia i numrul ascosporilor.
Speciile heterotalice sunt uneori izolate din natur sub form de haploizi asporogeni,
care ulterior sunt intermixai cu tipul de mperechere complementar, pentru sporulare i
analiz genetic.
Tulpinile homotalice prezint un proces de autofertilizare, formnd diploizi pornind de
la o cultur monosporal, spre deosebire de tulpinile heterotalice, care prezint fertilizare
ncruciat i formeaz diploizi prin conjugarea celulelor de tip opus de mperechere.
Ascosporii prezint o varietate de forme i ornamentri de suprafa. Forma cea mai
comun este cea de plrie. Alte forme sunt sferice, elipsoidale, alungite, cu apendice n
form de bici, etc. Unii spori prezint pe suprafa cutri i creste.
13

Bazidiosporii produi de bazidiomicete sunt, n general, celule neornamentate,


elipsoidale sau alungite, dar evenimentele ce duc la formarea lor pe suprafaa bazidiilor sunt
extrem de complexe. Depinznd de gen, bazidiile pot s apar din teleospori cu peretele
ngroat sau apar direct din hife. Speciile pot s fie homo- sau heterotalice, iar mperecherea
poate fi controlat de o pereche sau dou perechi de alele, spre deosebire de ascomicete, unde
o singur pereche de alele controleaz conjugarea.
2. Teste fiziologice
Dup cum am mai discutat, separarea drojdiilor n genuri s-a realizat iniial pe baza
observaiilor microscopice. Recunoaterea pn la nivel de specie pune, ns, problema
realizrii unor teste de asimilaie i fermentaie.
Testele de fermentaie
Drojdiile prezint o mare variabilitate n ceea ce privete fermentarea zaharurilor (de
la o fermentaie foarte viguroas pn la lipsa complet a capacitii fermentative), proces
evideniat de majoritatea taxonomitilor prin tehnica Durham, metod extrem de simpl i
eficient.
Metoda const n cultivarea drojdiilor pe medii cu extract de drojdie (Yeast Extract
0,5g/l), incluznd ca surs de carbon diferite zaharuri n concentraie de 50 mM. Capacitatea
de fermentaie a diferitelor zaharuri se estimeaz pe baza procentului de gaz (CO 2) acumulat
n tuburile Durham. Zaharurile utilizate sunt D-glucoz, D-galactoz, zaharoz, maltoz,
lactoz, rafinoz i trehaloz. Ocazional, sunt incluse n test, pentru comparaie, i melibioza,
D-xiloza, amidonul i inulina.
Testele de asimilaie
Testele de asimilaie presupun creterea drojdiilor n condiii de aerobioz pe diferite
zaharuri. Se realizeaz n eprubete care conin mediu lichid standard (YNB-yeast nitrogen
base-5ml ), sursa de carbon fiind adugat n concentraie de 50 mM. Citirile se realizeaz
dup 1, 2, 3 i 4 sptmni. Pattern-urile de asimilaie pentru diferte specii pot fi gsite n
determinatoare de genul: The Yeasts. A Taxonomic Study (Kreger-van Rij, 1984) i Yeast:
Characteristics and Identification ( Barnett et al., 1983).
Au fost puse la punct i metode rapide de identificare, de tipul kiturilor de testare, care
sunt, ns, valabile n special pentru drojdiile cu importan medical. Deoarece spectrul
compuilor cu carbon este limitat, aceste kituri au o aplicabilitate mai mic n cazul celorlalte
tipuri de drojdii (Baker et al., 1981).
Alte tipuri de teste
Alte teste de cretere includ rspunsul la compui cu azot, absena vitaminelor din
mediu variaia presiunii osmotice, prezena n mediu a cicloheximidei i variaia temperaturii.

14

O problem major care se pune este, n cazul drojdiilor anamorfe, identificarea


partenerilor teleomorfi, care pot s aparin ascomicetelor sau bazidiomicetelor. Van der Walt
i Hopsu-Havu (1976) au pus la punct un test simplu de culoare, care distinge cele dou clase.
Colorarea se realizeaz cu albastru de diazonium B (DBB-Diazonium Blue B) care
reacioneaz cu celulele ce aparin culturilor de bazidiomicete, peretele celular colorndu-se
n rou aprins. Ascomicetele nu rspund la reacia cu DBB.
Tabelul 10.4. Compuii organici utilizai n mod obinuit n testele de asimilaie i
fermentaie la drojdii

CLASA

COMPUII

Hexoze

D-glucoz, D-galactoz, D-ramnoz, D-sorboz

Pentoze

D-xiloz, D-riboz, D-arabinoz

Dizaharide

zaharoz, maltoz, celobioz, trehaloz, lactoz, melibioz

Trizaharide

rafinoz, melezitoz

Polizaharide

amidon solubil, inulin

Alcooli

eritritol, ribitol, D-manitol, inozitol, metanol, etanol, glicerol,


galactitol, sorbitol

Acizi organici

acid succinic, acid citric, acid lactic, acid malic, acid gluconic, acid
gucuronic, 2-cetoglucuonat, 5-cetoglucuonat

Glicozide

-metil-D-glucozid, arbutin, salicin


glucono- lacton, D-glucozamin, hidroclorid, decani, hexadecani

Ali compui

3. Sisteme generale de identificare utilizate de taxonomiti


Identificarea definitiv
Pentru a obine o identificare definitiv este necesar compararea rezultatelor obinute
pentru o tulpin necunoscut cu caracteristicile unor tulpini standard.
Barnett i colab (1983) au realizat un sistem relativ simplu, computerizat, de ncadrare
cu ajutorul unor chei de identificare, care se bazeaz n special pe teste fiziologice.
Dezavantajul sistemului const n faptul c, utiliznd un numr mare de chei de identificare,
comportarea atipic a tulpinii necunoscute ntr-un singur test poate da rezultate eronate.
Kirshop i colab. (1986) au pus la punct un sistem mai rapid de identificare, ce se
bazeaz pe o matrice probabilistic ce cuprinde rspunsul la 46 de teste morfologice i
fiziologice pentru 400 de specii de drojdii, reproductibile i aplicabile la o gam larg de
specii. Identificarea se bazeaz pe rspunsul unei tulpini necunoscute la toate testele, iar un
rspuns atipic la un test este inclus n calculul probabilistic. Sistemul, denumit COMPASS
(computer assay) este accesibil Coleciilor Naionale de Culturi de Drojdii conectate la
Internet.

15

Tabelul 10.5. Teste utilizate n sistemul COMPASS de identificare a drojdiilor


TESTUL

Creterea pe mediu lichid


Creterea pe mediu agarizat

INFORMAIILE OBINUTE

Diviziunea celular; formarea de pelicule


Caracteristicile creterii vegetative
Formarea de pseudomicelii
Formarea de hife adevrate
Prezena artrosporilor
Prezena balistosporilor

Creterea pe mediu solid cu acetat de


potasiu sau carbonat de calciu

Formarea de ascospori

Fermentarea zaharurilor

Capacitatea de a fermenta 5 zaharuri

Creterea n aerobioz pe medii cu surse de


carbon

Capacitatea de cretere aerobiotic pe 31 de


carbohidrai

Creterea n aerobioz pe surse de azot

Capacitatea de cretere aerobiotic pe 2 surse de


azot

Creterea pe mediu fr vitamine

Capacitatea de cretere fr adaos de vitamine

Activitate ureazic

Prezena activitii ureazice

X.2. Nomenclatura drojdiilor


Caracteristicile cele mai importante utilizate frecvent n definirea unui taxon de
drojdii sunt, dup cum s-a menionat i anterior:
aspectul microscopic al celulelor;
tipul de reproducere sexuat;
caracterele fiziologice i
caracterele biochimice.
Speciile care prezint o nmulire sexuat cunoscut sunt denumite teleomorfe, n
timp ce starea anamorf este caracteristic drojdiilor imperfecte, care nu prezint
sexualitate.
Unul dintre punctele cardinale ale taxonomiei este faptul c, n clasificare, se pornete
de la starea teleomorf n construirea de arbori filogenetici.
Dac se determin capacitatea de reproducere sexuat i respectiv apartenena la forma
teleomorf, un gen poate fi clasificat alturi de un alt gen, anamorf, care prezint aceleai
caracteristici morfologice i fiziologice. De exemplu, Candida utilis este anamorful speciei
Pichia jadinii, n timp ce Candida pulcherrima are ca partener teleomorf specia
Metschnikowia pulcherrima.
Taxonii cunoscui ca avnd doar reproducere asexuat sunt listai ca genuri anamorfe.
Odat cu identificarea unor forme sexuate, genul respectiv se asimileaz cu partenerul
teleomof i se renun la denumirea dat formei anamorfe.
O alt problem care apare n clasificarea diferiilor taxoni este prezena sinonimelor.
Sinonimele apar din modificri fcute n nomenclatura unei specii sau din redescrierea
neadecvat a unei specii deja cunoscute.
Un exemplu pentru primul caz ar fi cel al drojdiei utilizate n sinteze proteice Torula
utilis, reclasificat drept Torulopis utilis. Mai trziu a fost transferat genului Candida i a
16

devenit Candida utilis. Ca urmare, numele de Torula utilis i Torulopsis utilis au devenit
sinonime cu Candida utilis. n prezent, Candida utilis este cunoscut i ca anamorful speciei
Pichia jadinii.
Un alt sinonim al drojdiei C. utilis este C. guillermondii. Acest termen a rezultat din
denumirea incorect a unei tulpini de C. utilis identificat ca o specie nou.
Alte exemple includ speciile Saccharomyces diastaticus i S. italicus care n urma
analizelor ADN s-au dovedit identice cu S. cerevisiae i deci au devenit sinonime.
Cunoaterea sinonimelor prezint o importan deosebit i pentru biotehnologi, care
pot s evite confuziile care apar n urma unei clasificri eronate.
De exemplu, descoperirea c o anumit reacie poate fi mediat de S. cerevisiae, S.
beticus, S. chevalieri, S. gaditensis, S. hispalensis i Zygosaccharomyces paradoxus a sugerat
iniial o funcie metabolic comun; ulterior s-a stabilit c sunt conspecifice cu S. cerevisiae i
sunt sinonime.

X.3. Taxonomia molecular a drojdiilor


Aplicarea tehnicilor moleculare n sistematica drojdiilor a dus la identificarea mai
precis a diferitelor specii i a permis reevaluarea arborilor filogenetici existeni. Prin
aplicarea unor metode genotipice, fenotipice i a unor criterii filogenetice s-au pus bazele aa
numitei taxonomii polifazice.
Informaiile genotipice sunt aduse de studiile realizate pe acizii nucleici (ADN i
ARN); cele fenotipice deriv din studiul proteinelor i al funciilor lor, al unor markeri
chemotaxonomici i al altor trsturi exprimabile - morfologie, fiziologie, enzimologie,
serologie.
1. Analize taxonomice pe ADN cromozomal
Metodele genotipice sunt cele care aduc datele cele mai rapide i acurate privind
ncadrarea taxonomic a unei anumite specii. Aceste tehnici moleculare vizeaz la drojdii
analiza ntregului ADN cromozomal:
determinarea compoziiei n baze azotate, respectiv a procentului molar de guanin/
citozin - % mol GC;
determinarea gradului de omologie prin reasocieri ADN/ADN;
analiza profilului de lungime a fragmentelor de restricie - RFLP (Restriction
Fragments Length Polimorfism);
studii de omologie a ARNr i a genelor corespunztoare;
compararea profilurilor cromozomale obinute prin tehnici electroforetice speciale
(electrocariotipare).
Determinarea coninutului n guanin/citozin (% mol GC)
n ultimii ani au fost puse la punct o serie de tehnici de analiz a ADN cromozomal, ce
ofer informaii cu valoare taxonomic despre microorganisme. Una dintre cele mai folosite
analize este reprezentat de determinarea compoziiei ADN genomic n baze azotate.
Complementaritatea bazelor azotate i structura dublucatenar a ADN asigur existena n
molecul a unor cantiti echivalente de guanin - citozin i adenin timin.
17

Este important de subliniat faptul c similaritatea n compoziia n baze azotate nu


nseamn n mod necesar c dou microorganisme sunt nrudite, pentru c pot avea acelai %
mol GC, dar secven diferit de nucleotide. Reciproca nu este ns valabil, pentru c dou
tulpini cu valori foarte diferite ale mol % GC, au i secven diferit de nucleotide. Ca urmare,
compoziia n baze azotate exprimat n % mol GC reprezint un criteriu taxonomic de
excludere i nu de includere (criteriu negativ de ncadrare a taxonilor).
Estimarea procentului G+C al moleculelor ADN se poate realiza prin trei principale
metode:
determinarea cromatografic a bazelor azotate obinute n urma hidrolizei ADN
cromozomal, utilizndu-se tehnica HPLC (High Performance Liquid Chromatographycromatografie n faz lichid, Nakaseetal, 1989);
Aceast metod este extrem de acurat, dar este laborioas i costisitoare, iar la
eucariote prezint i dezavantajul existenei i a ADNmt n fracie.
ultracentrifugarea probei de ADN cromozomal n gradient de densitate de CsCl
urmat de calcularea densitii de plutire a macromoleculelor de ADN din prob cu
ajutorul densitii de plutire a unei probe standard de ADN;
Procentul molar G+C se calculeaz pe baza relaiei:
Densitatea de plutire = 1,66 x mol % GC
i aceast metod este laborioas i costisitoare, dei nu la fel de acurat ca HPLC.
denaturarea termic, metoda utilizat n prezent cel mai frecvent n stabilirea
procentului molar de guanin + citozin dintr-o prob de ADN.
n aceast tehnic, moleculele de ADN sunt nclzite ntre 20 i 100o C, timp n care
este msurat spectrofotometric variaia absorbanei la lungimea de und = 260 nm (A260).
Datorit creterii temperaturii, are loc denaturarea termic a moleculelor ADN.
Procesul const n ruperea legturilor de hidrogen dintre cele dou catene i trecerea
moleculelor de ADN din form dublucatenar n form monocatenar.
n timpul denaturrii termice, valoarea A260 crete cu pn la 40%, proces denumit
shift hipercromic. Temperatura la care jumtate din cantitatea de ADN se afl sub form
monocatenar este denumit temperatur de topire, Tm, i este corelat linear cu % mol GC
din prob.
n decursul timpului, au fost elaborate mai multe ecuaii de corelaie ntre cei doi
parametrii (%mol GC), n funcie de tipul de microorganism i de ncrctura ionic a
tamponului n care a fost dizolvat ADN-ul (n special concentraia ionilor de sodiu).
Astfel, pentru bacterii au fost elaborate dou ecuaii de corelaie:
a)

% mol GC = 2,44 x Tm 169

(Franck, 1971)

util cnd ADN este dizolvat n 0,1X SSC (NaCl 15 mM, citrat trisodic 1,5 mM), rezultnd o
concentraie mai mare a ionilor de sodiu.
b)

% mol GC = 2,08 x Tm 106,4

util cnd ADN este dizolvat n tampon TE pH= 8,0 (Tris 10 mM EDTA 1mM), deci la o
concentraie mai mic a ionilor de sodiu.
Pentru drojdii este valabil o alt formul, i anume:
%mol GC = 2,08 x Tm 106,4

(Owen, 1985)

Valorile % mol GC ofer posibilitatea diferenierii claselor i genurilor i la drojdii.

18

Astfel, procentul G+C al drojdiilor ascomicete este cuprins ntre 30 i 50 %, n timp ce


la basidiomicete variaz ntre 50 i 70% (Nakase i Komagata, 1968; Kurtzman, Phaff i
Meyer, 1983). i genurile clasei de drojdii imperfecte, cu excepia celor cu valori apropiate,
cuprinse ntre 48 i 52 %, pot fi determinate pe baza coninutului n baze azotate.
n general, variaia % mol GC pentru diferitele specii ale unui gen nu este mai mare de
10%, fapt confirmat pentru majoritatea genurilor de drojdii. Exist, ns i excepii, cum ar fi
n cazul speciilor genului Pichia la care diferena ajunge pn la 22%, sau la Rhodotorula,
pn la 14%. Ca urmare, s-a sugerat necesitatea diferenierii unor asemenea taxoni n mai
multe genuri de drojdii.
Studii de hibridizare ADN-ADN
Hibridizarea sau reasocierea ADN nuclear reprezint o metod indirect de estimare a
gradului de nrudire dintre dou specii (Kurtzman i Phaff, 1987), ce ofer o rezoluie mai
mare comparativ cu determinarea procentului molar de baze azotate.
Pn n prezent au fost descrise diferite metode de evaluare a gradului de hibridizare
ADN, dintre care amintim :
Metodele spectrofotometrice (DeLey i colaboratorii, 1970)

Metodele spectrofotometrice permit:


decelarea ntre formele mono- sau bicatenare, absorbana la 260 nm fiind mult mai
mare pentru ADN monocatenar dect pentru ADN dublucatenar;
studierea renaturrii ADN n funcie de timp (diminuarea absorbanei), la o temperatur
optim:
TOR = (0,51 x % molGC) + 47 (OR = renaturare optim)
Hibridizarea pe suport solid

Aceast metod utilizeaz filtre de nitroceluloz i sonde marcate de ADN i se poate


realiza prin:
metode directe: ADN-ul monocatenar A, neradioactiv, fixat ireversibil pe filtre de
nitroceluloz ; incubarea filtrelor la Tm - 25 0C n prezena sondei monocatenare
marcate radioactiv;
metode prin competiie: filtrul pe care s-a fixat ADN de referin, neradioactiv A este
incubat n prezena ADN radioactiv, denaturat, A* homolog i o cantitate mai mare de
ADN denaturat - B, aparinnd tulpinii luate n studiu (competitorul).
Martori:- negativ : fr ADN competitor B = 100% reasociere cu A* = 0% competiie ;
- pozitiv: ADN competitor este ADN-ul A) = 0% reasociere cu A* = 100%
competiie.
Hibridizarea n soluie

Se realizeaz innd cont de anumii parametrii:


19

ADN radioactiv s fie n cantitate foarte mic (reasocierea este improbabil);


ADN neradioactiv s fie n cantitate de 1500 de ori mai mare.
Hibridizarea n NaCl 0,42 M, sau n tampon fosfat 0,28 M, la temperatur optimal (de
la Tm 25 la Tm 30o C ): prin aplicarea acestei metode se impune n final separarea ADN
hibrid (bicatenar) de ADN rmas monocatenar, fie prin cromatografie pe hidroxiapatit, fie
prin tratament cu nucleaz S1, care hidrolizeaz specific ADN monocatenar (Vandamme et
al., 1996).
Rezultatele obinute prin aplicarea metodelor de reasociere ADN se exprim n
procente de omologie, dar exist anumite semne de ntrebare n deciderea punctului n care
dou tulpini sunt considerate specii diferite. Unii cercettori au sugerat faptul c un procent de
reasociere mai mare de70 80 % demonstreaz conspecificitate (Price et al., 1978).
Kurtzman i colab. (1980) au analizat aceast problem la tulpinile de drojdii
heterotalice i au constatat c o complementaritate crescut a moleculelor de ADN este
corelat cu fertilitatea. Astfel, au constatat c speciile Pichia amylophila i P. missippiensis
care prezint capacitate de mperechere, dar sporii nu sunt viabili, au un procent sczut de
omologie ADN, n jur de 25%. Ca urmare, se poate face o corelaie ntre fertilitatea sczut i
un grad mic de complementaritate ADN.
n acelai timp, ns, relaia dintre alte tulpini, cum ar fi Issatchenikia scutulata var.
scutulata i I. scutulata var. exigua este oarecum diferit. Aceti doi taxoni prezint o
omologie ADN de numai 25%, dar ncrucirile genetice dau o viabilitate a ascosporilor de 36 %. Mai mult, ncruciarea descendeilor din F1 a dat o viabilitate de 17% n generaia F 2.
Aceste rezultate sugereaz faptul c toi descendenii au n general cromozomi omologi i nu
apar nici amfiploizi, nici aneuploizi.
Este clar c limita minim a valorii procentului de reasociere ADN-ADN, care
sugereaz delimitarea speciilor, nu este bine definit, iar diferena n secvena de nucleotide,
estimat din compararea ntregului genom, poate fi chiar de 75% fr ca s apar modificri
genetice.
Tabelul 10.6 cuprinde principalele date referitoare la corelaiile dintre procesul de
mperechere i complementaritatea ADN.
n aceste studii se demostreaz c descreterea procentului de reasociere este asociat
cu scderea competenei de mperechere i a fertilitii.
Existena unor excepii n ceea ce privete omologia ADN genomic i fertilitatea
descendenilor pune problema c procentul de reasociere reprezint un indicator puternic, dar
nu infailibil al nrudirii speciilor. Aceste excepii se datoresc unor mutaii genetice de tipul
inversiilor, translocaiilor, autoploidiei i aloploidiei, care afecteaz fertilitatea. Majoritatea
acestor modificri nu pot fi detectate n urma comparrii ADN genomic total. Doar
amfiploidia poate fi decelat, n cazul n care apar variaii n mrimea genomului la specii
foarte nrudite.
De exemplu, S. carlsbergensis este nalt nrudit i cu S. cerevisiae i cu S. bayanus,
dei aceste dou ultime specii sunt foarte puin nrudite ntre ele. Compararea mrimii
genomurilor sugereaz c S. carlsbergensis este un amfiploid parial care apare ca un hibrid
natural ntre S .cerevisie i S. bayanus. (Vaughn Martin i Kurtzman, 1985). n acest caz, s-a
presupus c S. carlsbergensis este infertil cu parentalii, n ciuda omologiei mari a ADN.
Studiile de reasociere ADN au avut un impact extraordinar n definirea speciilor i
genurilor de drojdii (Tabelul 10.7).
Astfel, speciile genurilor Candida i Torulopsis au fost iniial ncadrate n taxoni
diferii pe baza faptului c primele produc pseudohife. n prezent, aceti taxoni sunt
considerai sinonimi, pe baza studiilor de reasociere ADN, i denumirea de Candida a avut
prioritate, fiind prima descris.
Este i cazul speciilor Pichia lindneri i Hansenula minuta (Kurtzman, 1984), care au
fost iniial ncadrate ca taxoni diferii pe baza capacitii diferite de asimilare a azotului, iar n
prezent sunt considerate ca aceeai specie, prezentnd un procent de omologie ADN de 75%.

20

Tabelul 10.6. Corelaia dintre reacia de mperechere i complementaritatea ADN ntre


ascomicete heterotalice strns nrudite i bazidiomicete

SPECIILE

Filobasidiela neoformans x
F. bacillispora

REACIA DE MPERECHERE

% OMOLOGIE ADN

Conjugare slab; viabilitatea


bazidiosporilor 0-30% (descendena
F 1, 2 nedeterminat)

55-63
(Aulakh, 1981)

Issatchenkia scutulata var.


exigua x I.scutulata var.
scutulata

Conjugare bun; ascospori viabili:


F1= 5%; F2 =17%

21-26
(Kurtzman et al., 1980)

Pichia amylophila x P.
mississippiensis

Conjugare bun; ascospori neviabili

20-27
(Kurtzman et al., 1980)

P. bimunadalis x P.americana

Conjugare slab; nu se produc


ascospori

21
(Kurtzman et al., 1980 )

P.alni x P. canadensis

Conjugare slab; nu se produc


ascospori

6
(Fuson et al., 1979)

Issatchenkia orientalis x I.
occidentalis

Conjugare slab; nu se produc


ascospori

3-8
(Kurtzman et al., 1980 )

Tabelul 10.7. Utilizarea criteriilor de reasociere a ADN n taxonomia drojdiilor

SPECIA

CARACTERISTICILE /+ SAU /-

%REASOCIERE ADN

Candida slooffi
Torulopsis pintolopesii

pseudohife/+
/-

80
(Mendonsa-Hagler & Phaff, 1975)

Hansenula wingei
Hansenula canadensis

hife adevrate/+
/-

78
(Fuson,1979)

fermentarea glucozei/+
/-

96
(Price et al., 1978)

asim. lactozei /+
/-

97
(Price et al., 1978)

asim. azotatului /+
/-

75
(Kurtzman, 1984)

asim. azotului/+
/-

100
(Kurtzman,1984)

Debaryomyces formicarius
Debaryomyces vanriji
Schwanniomyces castellii
Schwanniomyces occidentali
Hansenula minuta
Pichia lindneri
Sterigmatomyces halophilus
Sterigmatomyces indicas

21

2. Studii de omologie pe ADN mitocondrial


Studiile de omologie pe ADN mitocondrial (ADNmt) se realizeaz prin compararea
pattern-urilor de restricie i prezint avantajul c, ADN mitocondrial avnd dimensiuni mai
mici dect ADN nuclear, analiza fragmentelor de restricie este mai facil.
Dei structura genetic a ADNmt este aceeai pentru toate speciile de drojdii,
profilurile de restricie sunt diferite, datorit modificrilor de dimensiune ce apar frecvent, fie
n urma unor mutaii ireversibile ce afecteaz ntregul genom, fie datorit variabilitii genelor
mozaicate.
Astfel, locusul cob-box, care codific pentru apoproteina citocromului b, este format la
unele tulpini din 4 exoni i 3 introni, n timp ce la alte tulpini conine 6 exoni i 5 introni,
datorit inseriei a 3 introni n exonul 1. De asemenea, gena pentru ARNr 21S prezint, la
unele tulpini, un intron de 1,1 Kpb, n timp ce la alte tulpini acest intron este deletat.
Recent, a fost pus la punct o tehnic simpl i rapid de analiz a pattern-ului de
restricie a ADNmt (Querol,1996), care nu necesit n prealabil izolarea i purificarea ADN
mt, prin ultracentifugare izopicnic, permind caracterizarea facil a unui numr mare de
tulpini naturale de drojdii.
Metoda const n tratarea ADN total (izolat printr-o micrometod) cu endonucleaze de
restricie care recunosc secvene tetranucleotidice (AluI, HaeIII, Hpa, RsaI, Sau3A, MboI) sau
pentanucleotidice (DdeI, HinfI, MaeIII). Pentru aceste enzime de restricie sunt prezente
foarte multe situsuri de recunotere n ADN-ul nuclear, n timp ce n ADNmt sunt foarte
puine secvene specifice. Datorit dimensiunii lor mari, aceste fragmente pot fi observate cu
uurin n gelul de agaroz, profilurile RFLP obinute permind decelarea diferitelor tulpini
de drojdii, avnd astfel o valoare taxonomic deosebit.
3. Studii de omologie pe ADNr pe baza reasocierii ARNr-ADNr
n ultimul timp, studiile de taxonomie la drojdii apeleaz, ca de altfel i n cazul altor
organisme, i la analiza genelor pentru diferitele tipuri de ARNr (25 S, 18 S, 5,8 i 5 S).
S-a ajuns la concluzia c secvenele ADNr i implicit moleculele de ARN ribozomal
corespunztoare prezint, n scar evolutiv, un grad ridicat de constan funcional i de
secven, constituind cele mai bune cronometre moleculare. Astfel, interesul pentru studiile
realizate pe ARNr/ ADNr se datoreaz unor caracteristici importante, cum ar fi:
ribozomii sunt prezeni la toate organismele i au aceeai origine evolutiv, ceea ce
presupune o origine molecular comun pentru toate organismele vii;
unele secvene ARNr/ADNr sunt nalt conservate i, ca atare, omoloage la toate
organismele, reprezentnd puncte de referin pentru identificarea secvenelor variabile,
markeri de identificare a relaiilor filogenetice dintre specii;
genele ADNr sunt organizate n uniti repetitive dispuse n tandem, fiind prezente la
eucariotele inferioare, inclusiv la drojdii, n 100-200 copii. Din acest motiv reprezint
un material perfect pentru reaciile de restricie (Kurtzman, 1994 ).
Studiile de taxonomie molecular s-au axat iniial pe analiza moleculelor de ARNr,
innd cont de faptul c metodele de izolare i purificare a acestor molecule se realizeaz
relativ facil, datorit cantitii mari de ARNr existent n celule.
Tehnicile de caracterizare a diferitelor tipuri de ARNr, de dimensiuni mici i mari,
constau n secvenierea moleculelor ARNr prin aplicarea metodei Sanger sau, mai recent, a
moleculelor ADNc rezultate prin utilizarea unor primeri oligonucleotidici specifici i a
reverstranscrierii (Lane i colab, 1985). De altfel, s-a constatat c se obin rezultate mai
22

acurate prin secvenierea ADNr, utiliznd primeri oligonucleotidici i reacia PCR


(Kaltenboecker i colab., 1992).
n sistematica drojdiilor, primele studii de reasociere ARNr-ADNr au fost realizate n
1970, de Bicknell i Douglas.
Prin estimarea gradul de reasociere dintre probe de ARNr 25S marcate radioactiv i
ADN nuclear au stabilit nrudirea strns dintre genurile Saccharomyces, Kluyveromyces,
Zygosaccharomyces, Torulopsis i Arxiozyma i o divergen crescut ntre aceti taxoni i alte
drojdii, cum ar fi Pichia jadinii (specia anamorf, Candida utilis). O metodologie similar a
fost utilizat i de Segal i Zylan (1974) n compararea speciilor de Candida, inclusiv
Candida albicans.
i la bazidiomicete studiile de reasociere ARNr-ADN au reevaluat relaiile dintre
diferite specii, stabilind, de exemplu, c speciile cu pigmentaie roie, Rhodosporidium
toruloides i Sporidiobolus salmoniocolor sunt mult mai puin nrudite ntre ele dect R.
toruloides i specia Leucosporidium scotti, care nu produce pigmeni carotenoizi.
Dei hibridizrile ARNr/ADNr dau informaii generale privind relaiile dintre taxoni,
prezint unele impedimente n aplicarea lor extensiv n studiile de taxonomie, deoarece sunt
laborioase, iar n cazul n care cresc distanele filogenetice se ajunge la un punct n care
secvenele de nucleotide sunt att de diferite, nct nu permit hibridizri moleculare. De altfel,
s-a sugerat c similaritatea de secven trebuie s fie n jur de 80%, pentru a se realiza
reasocierile moleculare.
Studiul paternurilor de restricie pe ADNr
Studiile realizate pe diferii taxoni de drojdii au demonstrat c pattern-urile de
restricie pe ADNr dau rezultate concludente, att n identificarea speciilor, ct i a tulpinilor
unei anumite specii.
Primele cercetri care au vizat ncadrarea taxonomic a drojdiilor prin RFLP pe ADNr
au avut ca obict de studiu drojdiile patogene, cu importan medical. n cazul tulpinilor
patogene aceast tehnic prezint valoare de diagnostic.
Astfel, au fost stabilite relaiile filogenetice ntre diferite specii aparinnd genurilor
Candida i Cryptococcus (Magee i colab., 1987; Vigalys i Hester, 1990). Aceste estimri
sunt ns mai puin acurate dect cele derivate din compararea secvenelor de nucleotide,
deoarece cu ct distanele filogenetice sunt mai mari, cu att estimarea similaritilor
paternurilor de restricie este mai puin sigur.
Secvenierea ARNr 5S
Majoritatea studiilor de secveniere a ARNr 5S s-au realizat la bazidiomicete i
prezint o importan deosebit n stabilirea relaiilor filogenetice, datorit analizei facile a
acestor molecule de dimensiuni mici (circa 120 nucleotide) i cu o secven de nucleotide
nalt conservat (Kurtzman, 1993).
La ascomicete, aceste studii au fost mai puin abordate, dar au avut o mare relevan n
stabilirea evoluiei divergente a speciilor Schizosaccharomyces pombe i Saccharomyces
cerevisiae (Mao i colab., 1985 ).
Rezultate similare au fost obinute i de Walker (1985), care a demonstrat pe baza
studiilor de secveniere a ARN 5S c ascomicetele prezint o divergen mult mai mare dect
s-a crezut iniial i se divid n trei grupe mari: 1. Schizosaccharomyces i Protomyces; 2.
drojdiile care se nmulesc prin nmugurire; 3. fungii filamentoi.
23

Secvenierea ARNr 18S i 25S


Compararea secvenelor ARNr 18S i 25S (Guttel i Fox, 1988 ) a demonstrat faptul
c la capetele 5 aceste molecule prezint un grad ridicat de variabilitate, ceea ce permite
decelarea speciilor nalt nrudite. Astfel, Peterson i Kurtzman (1991) au artat c regiunea
desemnat 25S-635 (domeniul D2, Guadet i colab., 1989) prezint o variabilitate destul de
mare, care permite separarea speciilor stns interrelate (Tabelul 10.8).
Exist i excepii, cum ar fi perechea Saccharomyces bayanus/ S. pastorianus, cu o
variabilitate de 0% n regiunea D2. Se presupune c S. pastorianus este un amfidiploid parial
rezultat din hibridizrile S. cerevisiae x S. bayanus, care a reinut ADNr de la S. bayanus
(Peterson i Kurtzman, 1991).
Tabelul 10.8. Variabilitatea regiunii 25S-635- criteriu de difereniere a speciilor strns
nrudite

SPECIILE PERECHE

OMOLOGIE ADN
(%)

VARIABILITATE N
REGIUNEA 25S-635 (%
NUCLEOTIDE DIFERITE)

58
10
70
25
21
25

5,4
5,4
0
2,0
1,0
5,1

30
30
43

0,7
2,0
0

Specii heterotalice
Saccharomyces cerevisiae x S.pastorianus
S.cerevisiae x S. bayanus
S.pastorianus x S. bayanus
Pichia mississippiensis x P. amylophila
P. bimundalis x P. americana
Issatchenkia scutulata x var. esigna
Specii homotalice
Debaryomyces melissophilus x D.sp.n.
Saturnospora saitoi x S. ahearnii
Williopsis saturnus x sargentensis

Astfel, regiunea D2 este suficient de variabil pentru a permite, cu cteva excepii,


identificarea speciilor de drojdii aparinnd ascomicetelor i bazidiomicetelor, chiar i a celor
cu un grad mare de nrudire.
Speciile conspecifice prezint n mod obinuit o divergen de 0-1%, n timp ce la
speciile ndeprtate filogenetic, cum ar fi Pichia bimundalis i Schizosaccharomyces
japonicus var. versatilis, se observ o varabilitate de circa 47% (Peterson i Kurtzman, 1991).
Analiza comparativ a regiunii D2 i a regiunilor 25S-1841 i 18S-1627 la diferite
specii de drojdii a permis construirea arborilor filogenetici la genurile Debaryomyces,
Saccharomyces i Schizosaccharomyces.
S-a constatat c n cele trei regiuni pot s apar substituii de perechi de baze, cu rate
variabile n funcie de gen, reprezentnd, astfel, un criteriu important n clasificarea drojdiilor.
Identificarea drojdiilor prin tehnici electroforetice speciale
Tehnicile de electrocariotipare permit separarea prin electroforez n gel de agaroz a
moleculelor de ADN cu dimensiuni de peste 25 kpb a cror migrare este blocat n condiiile
electroforezei clasice datorit imposibilitii de naintare prin ochiurile reelei gelului de
24

agaroz. O soluie ar fi utilizarea unei agaroze de concentraie mai mic de 0,5% ceea ce
ridic ns dificulti de manipulare a gelului.
Aceste tehnici fac posibil evidenierea celor 16 cromosomi de la S. cerevisiae a cror
dimensiune medie (determinat prin tehnicile clasice de cartare genetic) variaz ntre 500 1000 kpb.
n prezent se utilizeaz diferite tehnici de electrocariotipare care difer att prin
numrul i dispunerea electrozilor ct i prin tipul de cmp electric generat, fapt care
determin grade diferite de rezoluie a benzilor electroforetice:
Tehnica OFAGE (ortogonal field alternation gel electrophoresis)
Aceast tehnic a fost introdus de Carle i Olson n 1984, utilizeaz 2 perechi de
electrozi astfel plasai nct produc cmpuri electrice n diagonal la unghiuri mai mari de 90o.
Datorit neomogenitii cmpului aplicat moleculele de ADN migreaz pe o traiectorie curb
departndu-se de centru, asigurnd totui apariia unor benzi clare (Figura 10.1). Actualmente
tehnica a fost nlocuit cu altele mai performante.

Figura 10.1. Tehnici electroforetice speciale


25

Tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis)


n tehnica FIGE (field inversion gel electrophoresis) Olson i Carle (1984) - este
schimbat cu 180o polaritatea cmpului electric la fiecare ciclu cu un timp mai mare (aproape
dublu) pentru direcia spre anod. Relaia ntre viteza de migrare i dimensiunea moleculelor de
ADN este complex i, de regul, impune creterea timpului de schimbare a direciei de migrare,
proces numit ramping. La unele drojdii care prezint cromosomi de dimensiuni mari, cum este
cazul celor din genul Saccharomyces, s-a reuit separarea cromozomilor fr ramping.
Pentru cei 16 cromosomi de la Saccharomyces cerevisiae, s-au evideniat 13 benzi
electroforetice datorit co-migrrii unor cromozomi cu dimensiuni apropiate (XIII i XVI, VII i
XV, V i VIII) (Fig. 4. 18). Mrimea cromosomului XII variaz de la o tulpin la alta (2 Mb
3Mb) n funcie de numrul de copii (100 200) ale genelor ADNr prezente la nivelul acestui
cromosom. Acest aspect s-a dovedit a fi de mare importan n taxonomia drojdiilor.
CROMOZOM

DIMENSIUNE

IV
XII
VII + XV
XIII + XVI
II
XIV
X
XI
V + VIII
IX
III
VI
I

1625
1095+ADNr
1120+1170
965+1015
840
825
760
680
585+595
440
350
270
245

(KPB)

Figura 10.2. Cromosomii de S. cerevisiae evideniai prin


FIGE

Tehnica CHEF (contour clamped homogeneous electric fields)

Descris de Chu (1989), Meese i Meltzer (1990), aceast tehnic folosete o arie
hexagonal n care sunt plasai muli electrozi mici conectai n serie astfel nct cmpurile
electrice se ntretaie n unghiuri de 120 o. Benzile rezultate sunt mai clare i pe acelasi gel poate
fi ncarcat un numr mare de probe (Fig. 4. 17). O variant a acestei tehnici este RGE (rotating
gel) n care se utilizeaz cmpuri electrice ntretiate omogene rezultate prin rotirea gelului cu
90o la fiecare ciclu.

26

Tehnicile electroforetice speciale permit: (I) separarea i caracterizarea cromosomilor


(molecule de ADN intacte) n scopul determinrii polimorfismului cromosomal a diferitelor
tulpini de drojdii; (II) identificarea poziiei genelor pe cromosomi; (III) prepararea i
screening-ul bibliotecilor YAC (Yeast Artificial Chromosomes).

27