CAPITOLUL I

OBIECTUL DE STUDIU AL GENETICII UMANE

Biologia este stiinta care se ocupa cu studiul legilor ce stau la baza originii,
organizarii si evolutiei organismelor vii.
Desi cunoscuta din antichitate, Biologia s-a dezvoltat si se dezvolta
permanent, reprezentand fundamentul teoretic pentru discipline ca : genetica,
anatomia, fiziologia, embriologia, antropologia, patologia genetica,
imunobiologia, biologia celulara, etc.
Dezvoltarea biologiei a fost si este conditionata de dezvoltarea tehnicii si
perfectionarii metodelor de studiu si cercetare, cautandu-se o permanenta
preocupare de a elucida relatia omului cu universul, cu mediul inconjurator care
este in permanenta schimbare. Este stiinta cu caracter nerestrictiv.
Dar lumea vie se compune dintr-un mare numar de individualitati, care,
prin similitudini de forma, structura, functii, se grupeaza in populatii, in specii.
Similitudinile se mentin in succesiunea generatiilor in populatie datorita
capacitatii de a transmite, in forma codificata, ansamblul de caractere specifice
populatiei sau speciei, dar si cu particularizari fenotipice ale fiecarui individ in
populatie.
Diversitatea fenotipica a indivizilor in populatie este consecinta
recombinarii aparatului genetic in meioza si fecundatie, a proceselor
cronogenetice si cronobiologice in activitatea genomului. Este influenta unor
secvente tranzitionale din genom, sau efectul distructiv indus de factori fizico-
chimici si biologiei agresivi, capabili sa modifice aparatul genetic al celulelor din
organism.
Complexitatea acestor procese particulare organismelor vii a impus
aparitia unei stiinte biologice bine delimitata : GENETICA.
GENETICA este stiinta ereditatii, variabilitatii si reproducerii
organismelor vii. Este stiinta fundamentala.
Relativ tanara, genetica a avut o evolutie rapida, diversificandu-se in mai
multe directii de cercetare si anume:
- genetica umana fundamentala
- genetica moleculara
- genetica medicala
- genetica populatiei sau antropologica
- cronogenetica
9
 - si cronobiologia dezvoltarii organismelor.
Genetica, sinteza dinamica a datelor si descoperirilor din biofizica,
biochimie, biomatematica, cibernetica, semantica, citologie, etc., ne ofera „cheia"
dezlegarii necunoscutelor fiintelor vii.
Genetica permite sa cunoastem structura materialului ereditar,
mecanismelor de conservare sau de diferentiere a caracterelor pe fond genetic, sa
cunoastem factorii cu potential de modificare a structurii si functiei aparatului
genetic (mutatiile). Tot genetica descifreaza macanismele si procesele de
diferentiere, de dezvoltare ontogenetica (normala si/sau patologica). Ea permite
elaborarea de metode pentru clonarea terapeutica, de fertilizare in vitro, etc.
Prin extrapolarea principiilor Biologiei si Geneticii in patologia umana, s-a
conturat o disciplina medicala fundamental : „Genetica Medicala".
Genetica umana, Genetica medicala studiaza principiile, procesele,
mecanismele si legile care guvemeaza diferentierea, cresterea, reproducerea si
dezvoltarea indivizilor din populatiile umane. Analizeaza relatiile dintre individ si
populatiile conspecifice, ca produs al evolutiei normale sau patologice a omului, in
raport cu mediul sau de viata.
Genetica medicala contribuie la elaborarea mijloacelor terapeutice
eficiente in combaterea, corectarea si preintampinarea aparitiei bolilor genetice in
familie, in populatie. Deasemenea asigura starea de sanatate fizica si psihica a
omului.
Recentele achizitii stiintifice in genetica confirma valoarea extrapolarii
principiilor acestei stiinte in medicina, cu posibilitatea cunoasterii complexe a
omului normal sau bolnav.
Datorita progreselor in biologie si biogenetica, J. Bernard afirma ca
Genetica este strans legata de interesele omului, de societate. De aceea spunea
Bernard: „....genetica cere cu necesitate clarificarea stiintifica a proceselor
biologice, abordarea stiintifica a evolutiei genomului uman, cunoasterea, la toate
nivelele de organizare, a organismului si viitorul genetic al omului..."
Linus Carl Pauling (1949) afirma urmatoarele: „...dintre toate sistemele
naturale, materia vie este aceea care, prin imensele sale transformari, pastreaza cea
mai mare parte a propriei sale treceri istorice inscrise in organizarea sa. Ca nu
exista alt sistem ca eel biologic, care sa fie constant suprimat si simultan mentinut,
si ca este suficient a ne interoga pe noi insine pentru a sti in care dintre sistemele
vii actuale s-a realizat cea mai mare parte a trecerii istorice...".

10
 Genetica cauta sa descifreze interrelatiile dintre componenta genetica a
organismului si factorii de mediu, de a descifra interferentele de influenta si/sau
efectele distinctive, intre genotip si mediul ambiant. Genetica, stiinta cu caracter
nerestrictiv, studiaza complexitatea structural-functional-comportamentala a
omului, in care rolul primordial il are genomul, constituit in momentul formarii
zigotului prin procesul de fecundatie.
Pentru o corecta apreciere a aparatului genetic care controleaza caracterele
exprimate fenotipic, este necesara cunoasterea unor marimi pe care Dubinin
(1969) le mentiona pentru om :
- celula gametica la om contine aproximativ un sfert de microni cubi
(miu ) de acizi nucleici, in greutate de 4x10 12 g (grame) ;
3

- populatia terei este estimata la sase miliarde de locuitori : 6x109;

- nasterea acestui numar de oameni necesita 12xl09 gameti haploizi
(6x109 ovule si 6x109 spermatozoizi);
- volumul total al acizilor nucleici existent in cele 12 miliarde de
gameti haploizi se estimeaza la 4,8 mm3 si o greutate de 48 mg ADN;
- intr-un vol urn egal cu o picatura de ploaie este inmagazinata
componenta moleculara, ADN-ul, pentru cele 6 miliarde de indivizi umani;
- dar corpul uman are aproximativ 6xl013 celule, din care se distrug
in 24 de ore cca 5x10" celule. Dar tot atatea se produc, asigurand
regenerarea fiziologica si mentinerea integritatii morfo-functionale a
organismului.
Datele prezentate de Dubinin evidentiaza complexitatea constitutionala a
speciei Homo sapiens.

11
CAPITOLUL II
EREDITATEA LA OM

Ereditatea este functia biologica a organismelor vii de a conserva si

transmite caracterele morfo-structurale, moleculare, fiziologice si comportamentale
de la o generatie la cele care-i succed.
Este latura sincronica, de conservare si transmitere a informatiei genetice,
prin care este mentinut axul structural-functional al speciei in spatiu si timp.
Ereditatea conserva caracterele, le stabilizeaza.
Pentru studiul ereditatii, in fata geneticienilor au fost formulate o serie de
intrebari ca:
- Ce se transmite? Care este natura fizico-chimica a materialului
genetic mostenit de la parinti?
- Cum este transmis materialul genetic? Care sunt mecanismele ce
asigura continuitatea intre generatii?
- Cum actioneaza materialul genetic?
- Daca raspunde destructiv la interferentele cu factorii agresivi din
mediu si care sunt efectele fenotipice asupra indivizilor?
Sunt intrebari fundamentale la care genetica raspunde, explica,
demonstreaza, convinge.
Viata precede intricatiei fenomenelor dinamice, legate de structurile
specifice ale celulei, ale organismului.
„Dinamismul", propriu vietii, este exprimat sub diversele activitati
metabolice care asigura cresterea si functiile organismului.
Suportul acestui dinamism este asigurat de moleculele proteice, cu rol
structural sau enzimatic, ce se caracterizeaza prin specificitate de structura si
functie.
Identitatea si specificitatea proteinelor de la o generatie la alta in cadrul
speciei sunt garantate si realizate prin mecanisme informational codificate, de
biomoleculele genomului uman.
Biomoleculele care detin, in forma codificata, informatiile genetice se
caracterizeaza prin aranjari particulare ale componentelor structurale, realizand
ceea ce numim „masinaria genetica", "banca genetica" de informatii din genomul
organismului. Dar spre deosebire de variabilitate, ereditatea, ca functie sincronica,
stabilizeaza caracterele datorita macromoleculelor codante.

12
 Macromoleculele codante implicate in functiile de ereditate si
variabilitate trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii :
- sa detina informatia necesara structurii, functiei si „stabilitatii" de
reproducere in celulele organismului. Aceasta informatie o gasim codificata
in ordonarea aperiodica a monomerilor, ca unitati de structura ce alcatuiesc
aparatul genetic molecular al celulei, in ADN;
- sa fie capabile de autoreplicare (autocatalitica), mecanism care
asigura trecerea „nemodificata" a informatiei genetice din celula mama spre
celulele fiice ce rezulta prin diviziune;
- sa exercite functia heterocatalitica, cand, prin decodificarea
informatiilor genetice inscrise in structura lor, sa asigure sinteza de ARN
mesager care, in citoplasma, realizeaza sinteza proteinelor cu structura
specifica, in conformitate cu mesajul genetic copiat.
- sa prezinte o oarecare „labilitate" ca raspuns la interferanta cu
factorii de mediu potentiali agresivi si cu efecteie distructive asupra
moleculelor codante.
Aceste conditii sunt indeplinite de acidul dezoxiribonucleic
(ADN-ul), care, virtual, isi exercita functiile la toate organismele: procariote
si eucariote.
Datorita procesului convergent intre informatia codanta si proteine,
apar similitudini de forma structura si functii intre indivizii conspecifici, dar
si o divergenta fenotipica interindivizi, definind individualitatile in
populatie.
De exemplu, fenotipul unui individ este o „sinteza" complexa de
elemente mostenite de la generatiile ascendente, realizata prin procesul
informativ, codificata , transmisa si mostenita.
Trasaturile fenotipice le grupam in categorii de caractere dupa cum
urmeaza:
- caractere specifice care particularizeaza specia;
- caractere intraspecifice sau individuale particulare si de
diferentiere a indivizilor conspecifici;
- caractere dobandite „de novo"posibile a fi inscrise in zestrea
genetica a individului. Ele au efecte severe distructive - morbide sau letale
- si care pot deveni transmisibile.

13
1. Suportul molecular al ereditatii

Dupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul

molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick
(1953) au elucidat structura in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de
cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici.
In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituenti
principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa
de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite
histone.
Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu
functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in forme virulente,
cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul „infectiei"
bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda),
unde, prin autosinteza, se asigura multiphcarea bacteriofagilor.
Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al
ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul
detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul
mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiphcarea prin sinteza de
ARN.
In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a
ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si
timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG =
Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra
ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea
nucleotidelor din moleculele ADN ce apartineau diverselor specii de plante si
animale.
In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie
slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi
nucleotidice din structura ADN-ului.
Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de
complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van
der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei
genetice.
S-a demonstrat ca molecula „tipar" genereaza noi molecule
complementare cu molecula initiala.
S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5 nucleotidele in molecula,
determinant o structura liniara si ordonata care este ADN-ul.
14
1. Suportul molecular al ereditatii

Dupa ce Avery si col. (1944) au demonstrat ca ADN-ul este suportul

molecular care, in forma codificata, detine informatia genetica, iar Watson si Crick
(1953) au elucidat structure in dublu helix a ADN-ului, a urmat o perioada de
cercetari intensive si extensive asupra acizilor nucleici.
In datele publicate de geneticieni se faceau referiri la doi constituent!
principali din genomul eucariotelor : acidul dezoxiribonucleic (ADN-ul) si o clasa
de proteine bazice cu masa moleculara mica si sarcina pozitiva (+), denumite
histone.
Daca Avery si col. au evidentiat rolul ADN-ului la procariote, capacitat cu
functia de transformare a bacteriilor din forme nevirulente in fonne virulente,
cercetatorii Herschey si Chase (1952), demonstreaza ca in procesul „infectiei"
bacteriilor de catre bacteriofagi (numai ADN-ul fagic patrunde in celula gazda),
unde, prin autosinteza, se asigura multiplicarea bacteriofagilor.
Daca predecesorii au evidentiat rolul ADN ca suport malecular al
ereditatii, cercetatorii Conrat si Willams (1955-1956) au demonstrat ca si ARN-ul
detine informatie genetica. Ei au observat ca unele ribovirusuri (exemplu virusul
mozaicului de tutun - VMT), detin ARN, asigura multiplicarea prin sinteza de
ARN.
In 1955, Chargaff si col., folosind metode fizico-chimice de analiza a
ADN-ului, au stabilit cvasi proportionalitate valorica intre cantitatea de adenina si
timina, si a guaninei in raport cu citozina. Raportul de egalitate intre A = TsiG =
Ca primit numele regula sail raportul Chargaff. Continuindu-si cercetarile asupra
ADN-ului, Chargaff a constatat diferente valorice privind numarul si ordinea
nucleotideior din moleculeie ADN ce apartineau diverselor specii de plante si
animale.
In aceeasi perioada au fost descoperite fortele Van der Waals de atractie
slaba, precum si puntile de hidrogen prin care se cupleaza cele doua lanturi
nucleotidice din structure ADN-ului.
Prin aceste descoperiri s-a lansat ipoteza ca fenomenul de
complementaritate intre A-T si G-C, cuplate prin punti de hidrogen si fortele Van
der Waals, au rol in procesul de polimerizare controlata si transmiterea informatiei
genetice.
S-a demonstrat ca molecula „tipar" genereaza noi molecule complementare
cu molecula initiala.
S-a mai stabilit ca legaturile fosfodiesterice 5'-3' cupleaza nucleotidele in
molecula, determinand o structure liniara si ordonata care este ADN-ul.
14
 Totusi momentul „revolutionar" in studiul structurii si dispozitiei
spatiale a ADN-ului este anul 1953, cand Watson si Crick (laureati ai
premiului Nobel) folosind ca metoda de studiu spectreie de difractie a
razelor X, au demonstrat ca molecula ADN are o structura spatiala (o
arhitectura) ordonata sub forma de dublu helix.
Argumentele de ordin general rezultate din cercetarile biochimistilor
si geneticienilor, prin care este atestat rolul ADN-ului ca suport molecular al
ereditatii si variabilitatii sunt urmatoarele:
- ADN-ul este o molecula cu structura speciala determinata de
ordonarea aperiodica a nucleotidelor in catenele cuplate complementar;
- ADN-ul este molecula capacitata cu functia de autoreproducere,
functia autocatalitica, care se realizeaza prin replicare semiconservativa.
Este functia care asigura conservarea informatiei genetice in generatiile ce
succed;
- ADN-ul serveste ca tipar pentru a i se decodifica mesajul genetic
inscris in structura sa. Prin decodificare si respectarea principiului
complementaritatii bazelor, rezulta molecula de ARN mesager, care, in
citoplasma celulei, asigura sinteza de proteine cu structuri si functii
specifice;
- avand structura neramificata, informatia genetica din ADN este
stocata si dispusa liniar. Este principiul care asigura decodificarea
„corecta";
- cantitatea de ADN este aceeasi in toate celulele somatice (cu
aproximatie), fiind celule diploide;
- in celulele gametice, care sunt haploide (cu numarul injumatatit de
cromozomi fata de celulele somatice - la organismele cu reproducere
sexuata) cantitatea de ADN este redusa la jumatate in raport cu celula
somatica diploida;
- cantitatea de ADN variaza in raport cu fazele ciclului celular si
numarul cromozomilor :
- in ciclul mitotic (fig. 1) :
-in stadiul interfazic Gi gasim:
- 2n cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 1 cromatida pentru fiecare cromozom;
- in stadiul interfazic S are loc sinteza ADN-ului prin
replicare semiconservativa. La sfarsitul acestui stadiu cantitatea de ADN va
fi de 4n;
- in stadiul G2 interfazic gasim:
- 2n cromozomi;
- 4n cantitate ADN;
15
 - 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom;
- la sfarsitul ciclului mitotic gasim:
- 2n cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

cantitate
ADN

4o ADN

2n ADN

Fazeieji
INfTERFAZA 10 12 14 16 18 imi20 Z. durata
(h)

|P:'M! ATI

MTTOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor

somatice
- in meioza, cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2)
- In diviziunea primara a meiozei:
- in stadiul d gasim :
- 2n cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 1 cromatida pentru fiecare cromozom;
- in stadiul G2 gasim :
- 2n cromozomi;
- 4n cantitate ADN;
- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;
- la sfarsitul diviziunii primare celulele au :
- in numar cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;
- In diviziunea secundara a meiozei :
- in interfaza, profaza si metafaza gasim :
- in numar cromozomi;
16
 - 2 cromatide (surori) pentru fiecare cromozom;
- la sfarsitul ciclului mitotic gasim:
- 2n cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 1 cromatida pentru fiecare cromozom.

ADN

4n ADN

2n ADN

0,5 C2 C,

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 iiili 20 22 Riwfeji

, fc.11111 durata
irsTTERFAZA ^T^-s W
|P!M ATI
* fc
MITOZA

Fig.l Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celulelor

somatice
- in meioza. cu formarea gametilor haploizi, gasim : (fig.2)
- In diviziunea primara a meiozei:
- in stadiul d gasim :
- 2n cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 1 cromatida pentru fiecare cromozom;
- in stadiul G2 gasim :
- 2n cromozomi;
- 4n cantitate ADN;
- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;
- la sfarsitul diviziunii primare celulele au :
- in numar cromozomi;
- 2n cantitate ADN;
- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;
- In diviziunea secundara a meiozei :
- in interfaza, profaza si metafaza gasim :
- in numar cromozomi;
16
 - 2n cantitate ADN;
- 2 cromatide pentru fiecare cromozom;
-la sfarsitul diviziunii secundare celulele vor avea :
- in numar cromozomi;
- in cantitate ADN;
- 1 cromatida pentru fiecare cromozom.
Observam ca in celula gametica numarul cromozomilor si cantitatea de
ADN sunt reduse la jumatate in raport cu celula somatica;
- cand structura ADN este modificata, efect al actiunii
agresive a factorilor potentiali mutageni, sau printr-un mecanism de
crossing-over inegal, apar caractere noi (normale - adaptative sau
patologice).

Fig. 2 Variatia cantitatii de ADN in raport cu fazele ciclului celular in

gametogeneza.

2. Structura moleculei de acid dezoxiribonucleic (ADN)

Molecula de ADN din genomul procariotelor si eucariotelor are o

structura polidezoxiribonucleotidica dublu catenara, catenele fimd cuplate intre
ele pe principiul complementaritatii bazelor azotate componente. Cele doua
catene cuplate realizeaza o dispozitie spatiala, o arhitectura in dublu helix.

17
legaturi fosfodiester 5 -3 formand scheletul glucido-fosforic.
ADN-ul este molecula inalt polimerizata.

2.1. Unitatea de structura a molecuiei de ADN

Unitatea de structura a ADN-ului este nucleotidul. Este un monomer

in componenta caruia exista trei tipuri de molecule, inseparabile intre ele : o
baza azotata, o pentoza si un radical fosfat.
Bazele azotate pot fi purinice si pirimidinice.
Bazele purinice prezinta doua heterocicluri : un hexaheterociclu
(pirimidinic) si un pentaheterociclu (imidazolic). Bazele purinice in structura
ADN-ului sunt : adenina (A) si guanina (G) (fig. 3).

NM, 0

I ! CM

W I

NM, O

N CH HN C
it i *
C XH C .CM
X X
O MM O NM

■"

Fig.3 Structura bazelor purinice (A; G) si pirimidinice (T; C).

18
 Bazele pirimidinice se prezinta sub forma unui hexaheterociclu
pirimidinic. In structura ADN-ului bazele pirimidinice sunt reprezentate de
timina (T) si citozina (C) (fig.3).
A doua componenta din structura nucleotidului este pentoza, un
glucid care se prezinta ca heterociclu de tip beta ((3)- furanozic.
Cele doua componente, baza azotata si pentoza, esterifica cu
formarea nucleozidului. Esterificarea se face printr-o legatura N-glucidica,
legatura covalenta. Esterificarea se face intre hidroxidul din pozitia Ci al
pentozei si azotul din pozitia N3 la pirimidine si pozitia N9 pentru purine.
A treia componenta a nucleotidului este radicalul fosfat, care se
cupleaza, prin esterificare, de nucleozid, cuplarea stabilindu-se cu
hidroxidul de la C3 sau C5 al pentozei.
Cuplarea celor trei componente fmalizeaza structura nucleotidului
(fig.4sifig.5).

Fig. 4 Structura nucleotidului cu baza pirimidinica ( Timina ) ; esterificare

C5-

Structura nucleotidului cu baza purinica (Adenina) ; esterificare C5.

19
 H-'
H

HO' P">-CM>/
li 0
H\H H/M

1OK OK
(Acidul fosforic poate esterifica si la OH de la carbonul 3, ramane liber
de la carbonul 5).

Fig. 5 Structura nucleotitului cu citozina

N
H

0 - 0<^
1 0- J H
O-P- CH,

o o.
OH

20
 Structura nucleotidului cu guanina
OH OH

ADN-ul este molecula rezultata din esterificarea si ordonarea liniara

acelorpatru tipuri de nucleotide.
o—:
2.2. Structura primara a ADN

Structura primara analizeaza modul de formare a monocatenei din

structura moleculei de ADN.
Se urmareste ordonarea nucleotidelor si gradul de polimerizare a
monocatenei ADN-ului.
Polimerizarea nucleotidelor se face prin legaturi fosfodiesterice, intre
radicalul fosfat al nucleotidului,cu hidroxidul din pozitia 3' sau 5', a pentozei
nucleotidului urmator. Prin polimerizare se formeaza scheletul glucido-fosforic
al monocatenei liniare din molecula ADN-ului.
Desi prezente, bazele azotate nu participa la realizarea structurii
scheletului glucido-fosforic. Bazele sunt cuplate cu hidroxidul Ci al pentozei
fiecarui nucleotid.
Prezenta si ordinea bazelor din monocatena polinucleotidica determina
specificitate structural-functionala moleculei de ADN. Ordonarea

21
specifica realizeaza informatia genetica inscrisa in ADN-ul genomic (fig. 6).

ADN-ul

Fig. 6 Structura primara a ADN (scheletui glucido-fosforic) - esterificare

3'-5\

22
 Nucleotidele sunt molecule orientate, cuplate intre ele prin legaturi
fosfo-diester in ordinea:
. . .-y-s'-y-S'-y-S'-y-S'-y-S'-ys'-y'S'-ys'-y-s'-y-s'-....
Ordonarea nucleotidelor confera polaritate moleculei de ADN.
Polaritatea confera proprietati fizico-chimice deosebite si functii biologice
particulare moleculei de ADN.
Monocatena are la un capat pentoza terminala cu hidroxidul liber in
pozitia OH-3', iar la capatul opus pentoza cu hidroxidul liber OH-5\ Acesti
hidroxili terminali asigura cuplarea si dispunerea in tandem a moleculelor
de ADN, cu realizarea structurii tridimensionale in cromozomul celular.
Este distributia in spatiu sau arhitectura cromozomilor.
Dupa descoperirea rolului ADN-ului in ereditatea organismelor,
analizele fizico-chimice care s-au efectuat ulterior, au identificat prezenta a
patru tipuri de nucleotide in structura sa.
Initial s-a crezut ca in molecula ADN-ului, cele patru tipuri de
nucleotide ar respecta ordonarea periodica, care ar structura cele doua
catene polinucleotidice. Periodicitatea considera ordonarea regulata a celor
patru nucleotide, conform schemei :

.....A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C ....
.....L_____J L_____J L____J L_____J L_____J 1_____J I______I L_____J_.
...... 1 2 3 4 V 2' 3' 4' ....

Conform principiului ordonarii periodice a nucleotidelor, structura

moleculelor de ADN ar fi trebuit sa fie identica atat la procariote cat si la
eucariote, atat la protozoare (organisme unicelulare) cat si la om, atat la
regnul vegetal cat si la eel animal. Ca urmare, datorita identitatii structurii
moleculelor de ADN, si cum ADN-ul are functia de determinism genetic, ar
fi trebuit ca toate speciile de pe Tera: plante-animale, bacterie-om, sa
prezinte aceleasi caractere, cu aceleasi structuri si functii.
Dar studiile fizico-chimice cantitative au consemnat ca nucleotidele
nu au ordonare periodica. Rationamentele pentru care nu s-a acceptat
periodicitatea nucleotidelor sunt urmatoarele:
- s-ar fi realizat o informatie genetica limitata;
- prin periodicitatea nucleotidelor s-ar fi obtinut numai patru tipuri
de triplete (codoni) care sa specifice aminoacizii din structurile proteice;
- cum exista o stricta corespondenta intre codon si aminoacid (un
codon specifica strict un tip de aminoacid) ar fi trebuit ca toate moleculele
proteice sa contina numai patru aminoacizi a caror ordonare respecta
ordonarea periodica a codonilor (tripletelor), iar proteinele sa prezinte

23
 Nucleotidele sunt molecule orientate, cuplate intre ele prin legaturi
fosfo-diester in ordinea:
...-y-s'-ys'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s'-y-s''.....
Ordonarea nucleotidelor confera polaritate moleculei de ADN.
Polaritatea confera proprietati fizico-chimice deosebite si functii biologice
particulare moleculei de ADN.
Monocatena are la un capat pentoza terminala cu hidroxidul liber in
pozitia OH-3', iar la capatul opus pentoza cu hidroxidul liber OH-5'. Acesti
hidroxili terminali asigura cuplarea si dispunerea in tandem a moleculelor
de ADN, cu realizarea structurii tridimensionale in cromozomul celular.
Este distributia in spatiu sau arhitectura cromozomilor.
Dupa descoperirea rolului ADN-ului in ereditatea organismelor,
analizele fizico-chimice care s-au efectuat ulterior, au identificat prezenta a
patru tipuri de nucleotide in structura sa.
Initial s-a crezut ca in molecula ADN-ului, cele patru tipuri de
nucleotide ar respecta ordonarea periodica, care ar structura cele doua
catene polinucleotidice. Periodicitatea considera ordonarea regulata a celor
patru nucleotide, conform schemei :

......A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C ....
L____J L____J L___J L_____J L____J L____J I____J L____J..
....... 1 2 3 4 1' V 3' 4' ....

Conform principiului ordonarii periodice a nucleotidelor, structura

moleculelor de ADN ar fi trebuit sa fie identica atat la procariote cat si la
eucariote, atat la protozoare (organisme unicelulare) cat si la om, atat la
regnul vegetal cat si la eel animal. Ca urmare, datorita identitatii structurii
moleculelor de ADN, si cum ADN-ul are functia de determinism genetic, ar
fi trebuit ca toate speciile de pe Tera: plante-animale, bacterie-om, sa
prezinte aceleasi caractere, cu aceleasi structuri si functii.
Dar studiile fizico-chimice cantitative au consemnat ca nucleotidele
nu au ordonare periodica. Rationamentele pentru care nu s-a acceptat
periodicitatea nucleotidelor sunt urmatoarele:
- s-ar fi realizat o informatie genetica limitata;
- prin periodicitatea nucleotidelor s-ar fi obtinut numai patru tipuri
de triplete (codoni) care sa specifice aminoacizii din structurile proteice;
- cum exista o stricta corespondenta intre codon si aminoacid (un
codon specifica strict un tip de aminoacid) ar fi trebuit ca toate moleculele
proteice sa contina numai patru aminoacizi a caror ordonare respecta
ordonarea periodica a codonilor (tripletelor), iar proteinele sa prezinte
aceeasi structura, acelasi numar de aminoacizi, aceiasi aminoacizi ca structura
la toate organismele vegetale si animale.
Ca urmare din structurile proteice ar fi trebuit sa lipseasca 16
aminoacizi (cunoscuti in structurile proteice sunt 20 aminoacizi) si prezenti
numai patru tipuri .
Cel care a demonstrat ca cele patru tipuri de nucleotide au o ordonare
aperiodica, aleatorie, a fost Chargaff (1950). Folosind metode fizico-
chimice cantitative, prin degradare enzimatica a moleculelor de ADN, a
demonstrat ordonarea aperiodica si ca cele patru tipuri de nucleotide, ce
structureaza monocatena polinucleotidica a moleculei de ADN, au o ordonare
aleatorie, non-periodica.
Dupa Chargaff, ordonarea aperiodica, aleatorie in monocatena ADN-
ului s-a realizat in cursul evolutiei bio-genetice a moleculelor de ADN.
Sa consideram ipotetic o secventa aperiodica din catena moleculei
deADN:

.......A T T C C G A G C T T A C G A G T T G C T T A C C C C A A T A . . . .
L_J I____I I___J I—J L___I I___I L_J L_J l__J L_J L_.............
...... 123 45 6 7 8 9 10
Analizand aceasta secventa observam ca numarul tripletelor
(codonilor), ca tipuri diferite, asigura o crestere numerica a tipurilor de
triplete (43 = 64 - vezi codul genetic), dar si pozitia tripletelor este aleatorie.
Datorita ordonarii aperiodice a nucleotidelor si tripletelor se
realizeaza o cantitate inepuizabila de informatie genetica depozitata in
structura moleculelor de ADN.
Informatia genetica realizata prin aperiodicitatea nucleotidelor,
confera fiecarei molecule de ADN specificitate structural-functionala,
obtinindu-se marea diversitate a tipurilor de mesaje genetice depozitate in
structurile ADN-ului. Mesajele genetice inscrise in structurile ADN pot fi
decodificate si matedalizate in molecule de ARN mesager. Cum ARNm este
implicat direct in sinteza de proteine, imprima acestor proteine o structura
specifica (conform mesajului genetic decodificat din ADN), proteine care vor
exercita si functii specifice in celula, in organism.
Pentru o mai corecta intelegere a semnificatiei biologice a
aperiodicitatii nucleotidelor ce structureaza, biochimic, monocatena
polinucleotidica din molecula ADN, vom analiza o secventa „arbitrara" in
componenta careia sunt 1000 nucleotide. Cum fiecare nucleotid este
reprezentat de una din cele patru tipuri de baze azotate, conform principiului
aperiodicitatii (ordonarea aleatorie), se pot realiza combinatii polinucleotidice
de ordinul 41000, respectiv 10600. Dar genomul uman
24
 contine aproximativ 3.500.000.000 perechi de nucleotide. In consecinta
[ ordonarea aperiodica ar determina combinatii de ordinul 43.500.000.000 perechi
de nucleotide. Si daca folosim preceptul lui Einstein ca numarul atomilor
din Univers ar fi 0.88 x 1079 se poate considera ca informatia genetica ar fi
I inepuizabila in spatiu si timp, datorita aperiodicitatii structurii primare.
Importanta structurii primare:
- asigura specificitate structural-functionala moleculelor ADN;
- realizeaza informatia genetica , care este depozitata sub forma de
mesaje ereditare pentru caracterele moleculare, celulare, tisulare, de organ
si pentru activitatea metabolica a organismului uman;
- sub forma de mesaje genetice, informatia genetica este
decodificata prin sinteza de ARNm, care, in citoplasma, determina sinteza
deproteine cu structuri si functii specifice in celula.

2.3. Structura secundara a ADN

Cu exceptia unor bacteriofagi, la care ADN-ul este monocatenar, toate

procariotele si eucariotele au molecula ADN structurata din doua I
monocatene cuplate.
<> ADN-ul este dublu catenar. catenele fiind copolimerice.
Catenele copolimerice sunt cuplate intre ele prin punti de hidrogen,
punti ce se stabilesc intre bazele azotate prezente in structura
monocatenelor.
Chargaff (1950), este cercetatorul care a demonstrat ca ADN-ul are o
structura secundara dublu catenara.
Folosind metode fizico-chimice de analiza cantitativa, Chargaff
stabileste raportul de complementaritate intre bazele purinice si cele
pirimidinice, complementaritate care asigura cuplarea catenelor
copolimerice.
Rezultatele lui Chargaff pot fi sintetizate astfel : -intre bazele azotate
intercatenare se stabilesc punti de hidrogen. I Complementaritatea, in conditii
fiziologice normale a structurii ADN-ului, se realizeaza intre: Adenina cu
Timina (A - T) si Guanina cu Citozina (G-C);
- raportul de complementaritate se bazeaza pe urmatorul
rationament valoric: indiferent de specie si regn, s-a constatat ca adenina
este valoric egala cu timina, iar cantitatea de guanina este egala cu a
I citozinei. Aceste raporturi valorice: A = T si G = C explica complemen-

25
taritatea. Acest raport complementar in baze A = T si G = C este numit
„regula Chargaff” sau „ratio baza" ;
- complementaritatea este demonstrata prin cinetica reactiilor fizico-
chimice, conform urmatoarelor principii de analiza : hidrogenul din
componenta bazelor azotate are un „nucleu" cu volum mic si intens pozitiv.
In jurul acestui nucleu graviteaza un electron negativ (e~). Acest electron
negativ este „incapabil" sa satisfaca sarcina pozitiva a nucleului atomic. In
consecinta, hidrogenul poate primi un electron negativ de la alt atom, cu
care isi completeaza orbita. In aceste conditii se poate stabili o legatura
electrovalenta. Hidrogenul reahzeaza aceste legaturi si cu atomul de azot
sau cu oxigenul din structura altei baze azotate, care poate fi purina sau
pirimidina ;
- in molecula ADN-ului cu structura normala, adenina (ca baza
purinica) poate stabili doua punti de hidrogen cu timina (baza pirimidinica),
iar guanina (ca baza purinica) reahzeaza trei punti de hidrogen cu citozina
(baza pirimidinica), (fig.7). Sunt cupluri complementare in ADN: A = T;
T = AsiG = C;C = G. Cuplarea complementara prin punti de hidrogen
este principiul structurii secundare a moleculei de ADN;

» Ir r , ' r r|
&*\ UM.............o OH, K**\ o-...—im

5
/ ?\ /♦ >\ / / *\ /' \ /

H
A T G C
{«*•**) l*irtft«) foMBMI jcftorirt}

Fig. 7 Cuplarea bazelor azotate prin legaturi de hidrogen. T se leaga cu A

prin doua legaturi de hidrogen ; C se leaga cu G prin trei legaturi de
hidrogen.

- analiza cantitativa a moleculelor de ADN extrase de la diverse specii

animale sau vegetale au evidentiat urmatorul aspect : cantitatea de A + T nu
este egala cu cantitatea G + C :
26
 A+T
---------^ 1
G+C

Datorita raportului valoric neunitar este confirmata aperiodicitatea

ordonarii nucleotidelor in catenele copolimerice (deci intre purinele si
pirimidinele din componenta celor doua catene este respectata
complementaritatea de cuplare). Valoarea neunitara a raportului Chargaff
confirma aperiodicitatea celor doua catene (aperiodice) copolimerice , desi
intre bazele purinice si cele pirimidinice este respectata
complementaritatea.
A+T
- raportul ---------, valoric , variaza in limite foarte largi.
G + C De
exemplu:
- la Saccharomyces cerevisie cuplul A + T este in proportie de 64%
fatadeG + C-36%; "
- la Bos taurus A + T este in proportie de 58% iar G + C in proportie
de 42%;
- la Homo sapiens (om) proportia este de 62% A + T iar G + C de
38% etc.
Observam ca intre specii apar diferente valorice intre A + T si G + C;
- desi valoarea raportului Chargaff variaza valoric intre specii, la
indivizii conspecifici se mentine aproape constant si apropiat valoric. In
1978 Lints confirma aperiodicitatea cuplurilor complementare.
Ca importanta, complementaritatea structurii secundare confera
moleculei de ADN functii bio-genetice esentiale:
- respectand principiul complementaritatii se asigura replicarea
semiconservativa a ADN-ului (autocatalitica) si continuitatea informatiei
genetice (functia sincronica si conservarea ei);
- pe principiul complementaritatii bazelor azotate, se realizeaza
decodificarea mesajelor genetice inscrise in structura ADN-ului de catre
moleculele de ARNm. Moleculele de ARNm sunt complementare fata de
secventele decodificate din ADN;
- metode de analiza a structurii ADN-ului prin denaturare si
renaturarea moleculei se bazeaza tot pe principiul complementaritatii
bazelor purine si pirimidine;

27
 - pe principiul complementaritatii bazelor azotate se „construiesc" si
se folosesc sondele si amprentele genetice pentru identificarea si localizarea
genelor, pentru secventierea moleculelor de ADN.

2.4. Structura tertiara a ADN

Prin tehnica difractiei razelor X s-a stabilit ca ADN-ul are o arhitectura

spatiala ordonata.
Wilkins (1950) este primul cercetator care a folosit tehnica difractiei
razelor X in studiul moleculei ADN , urmat de Franklin in 1951. Rezultatele
obtinute de Wilkins si Franklin au confirmat ca:
- cele doua catene copolimerice, cuplate complementar, au
dispozitia spatiala in dublu helix. Aceasta observatie confirma ca molecula
ADN are structura tridimensionala sau dispozitie spatiala;
- structura tridimensionala a ADN-ului este asemanatoare pentru
procariote si eucariote, indiferent de gradul de evolutie a speciilor.
In 1953, Crick si Watson care, fara sa cunoasca lucrarile si observatiile lui
Wilkins si Franklin, folosind tehnica difractiei razelor X, elaboreaza ipoteza asupra
structurii tridimensionale a moleculei ADN din genomul celular. Modelul elaborat
de Watson si Crick a fost publicat in 1953 in revista „Nature", rezultate pentru care
li s-a acordat Premiul Nobel pentru Medicina.
La elaborarea modelului tridimensional, Watson si Crick au folosit
raportul de complementaritate intre cele doua catene copolimerice din molecula
ADN. Pe baza datelor obtinute prin difractia razelor X cei doi cercetatori au
elaborat postulatul: „ADN-ul este molecula dublu catenara. Cele doua catene sunt
cuplate prin punti de hidrogen, conform principiului complementaritatii intre
purine si pirimidine (A = T si G = C). Catenele cuplate se spiraleaza formand un a
helix iar catenele copolimerice fiind antiparalele. Planele pentozelor cuplate cu
acidul fosforic sunt dispuse la exteriorul duplexului, formand scheletul glucido-
fosforic paralel pe axa virtuala a dublului helix. Bazele azotate, cuplate
complementar si dispuse in interiorul moleculei au planele perpendiculare pe axa
virtuala a moleculei de ADN".
Planele cuplurilor complementare sunt la distanta de 3,4 A
(0,34nm) intre ele. Fiecare cuplu complementar de baze are un unghi de rotatie de
36° in raport cu cuplul urmator. Cuplurile complementare sunt

Valori folosite in studiul moleculei ADN:

lm = 102cm = 103mm = 106um = 109nm = 1010A
metru centimetri milimetri micrometri nanometri
Angstromi
28
„etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus
de stabilitate moleculei de ADN.
Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui „ax central virtual",
se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360° are un pas de
34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri
complementare de baze azotate.
Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin
interrelatii termodinamice:
forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia
puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de
suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen.
La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de
histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine
bazice care neutralizeaza sarcinile negative.
Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai
important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen.
In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are o
structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce
asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G
= C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista
toate permutarile posibile de inserare secventiala.
Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii
polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu
sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea,
denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile
fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca
proprietati fizico-chimice mentionam:
- prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei molecule
ADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiului
corespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesaje
genetice in ADN-ul genomului uman;
- ADN-ul este molecula neramificata, putin rigida. Este o molecula
polimerica „flexibila si fragila" ;
- masa moleculara a moleculei de ADN poate fi estimata la 12-16
x 6
10 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46
cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7><10
mg ADN. Daca cele doua catene inalt copolimerice ar avea bazele

"AH = 5-6 Kcal / mol; este modalitatea de calcul si evaluare a castigului de energie
(Crothers si Zimm, 1964).
29
„etajate". Intre ele se stabilesc interrelatii hidrofobe, ceea ce confera un plus
de stabilitate moleculei de ADN.
Rotatia, spiralizarea dublului helix in jurul unui „ax central virtual",
se realizeaza spatial, nu plan. Inaltimea unei rotatii de 360° are un pas de
34A (3,4 nm). Pe o spira completa se gasesc etajate zece perechi de cupluri
complementare de baze azotate.
Energia de suprapunere (stocking energy) se evalueaza prin
interrelatii termodinamice:
forma haotica-forma helicoidala. Dupa Polland si col. (1966), contributia
puntilor de hidrogen este mica, iar valoarea AH2 reprezinta energiile de
suprapunere a nucleotidelor cuplate prin punti de hidrogen.
La eucariote, stabilitatea moleculei de ADN este asigurata si de
histone, proteine cu care se cupleaza ADN-ul. Histonele sunt proteine
bazice care neutralizeaza sarcinile negative.
Unii fizico-chimisti considera ca fortele Van der Waals au rolul mai
important in stabilitatea dublului helix, fata de puntile de hidrogen.
In ordonarea bazelor, desi aperiodica , molecula de ADN are 0
structura tertiara ordonata. Cuplurile A = T si G = C au simetrie, ceea ce
asigura inserarea lor in lant, indiferent care este ordinea : A = T , T = A, G
= C sau C = G. De retinut ca intre cele patru cupluri complementare exista
toate permutarile posibile de inserare secventiala.
Metodele folosite in studiul ADN-ului, ca : difractia luminii
polarizate, spectrele de difractie a razelor X, ultracentrifugarea cu
sedimentarea moleculelor, difuziunea, autoradiografierea,
denaturarea-renaturarea, clonarea moleculei, etc, au stabilit proprietatile
fizico-chimice, precum si functiile exercitate de ADN in genom. Ca
proprietati fizico-chimice mentionam:
- prin dispozitia in dublu helix, spatiul si volumul unei molecule
ADN sunt considerabil reduse. Prin micsorarea volumului si spatiului
corespunzator se asigura un depozit impresionant de informatii si mesaje
genetice in ADN-ul genomului uman;
- ADN-ul este molecula neramiflcata, putin rigida. Este o molecula
polimerica „flexibila si fragila" ;
- masa moleculara a moleculei de ADN poate fl estimata la 12-16
x
10 daltoni. Genomul uman are in celula somatica diploida (46
cromozomi) aproximativ 3,5 x109 perechi de nucleotide, respectiv 7><10-9
mg ADN. Daca cele doua catene inalt copolimerice ar avea bazele

"AH = 5-6 Kcal / mol; este modalitatea de calcul si evaluare a castigului de energie
(Crothers si Zimm, 1964).
29
complementare cuplate in dispozitie rectiliniara s-ar obtine un filament ADN
a carui lungime poate ajunge la 200 cm;
- in lumina ultravioleta (UV), absorbtia ADN se face la lungimea de
unda de 260nm;
- structura tridimensionala asigura functiile: autocatalitica,
heterocatalitica si variabilitatea (prin mutatie, repararea eronata sau prin
recombinarea genetica a moleculelor ADN).

Stabilitatea termodinamica a ADN-ului se asigura prin:

- legaturile slabe de hidrogen, numite si legaturi metastabile. Cuplul
G-C cu trei punti de hidrogen este mai „puternic", mai stabil, decat cuplul
A-T, care are numai doua punti de hidrogen.
- fortele Van der Waals, desi slabe, sunt „suficiente" pentru a
organiza si mentine molecula in helixuri de homopolimeri nucleotidici;
- interactiunile hidrofobe intre planurile cuplurilor de baze
complementare si hidratarea gruparilor P04";
- de proteinele histonice, care, combinandu-se cu dublul helix al
ADN-ului, neutralizeaza sarcinile negative.

30
3. Formele izomorfe de ADN

(Forme „geometrice" de ADN)

Din analiza moleculelor de ADN prin metoda spectrelor de difractie

a razelor X, metoda de rotatie a luminii polarizate si imaginile
electronomicroscopice s-a evidentiat existenta formelor izomorfe de ADN.
S-a observat ca prin cresterea numarului de rotatii complete pe
unitatea de lungime, se produce o „tensiune" helicoidala crescuta. Aceasta
tensiune poate fi dispusa prin formarea unei bucle cu rotatie levogira sau
superinfasurarea pozitiva („positive super coil"). Daca ADN-ul are rotatia
opusa fata de normal, apar bucle dextrogire sau superinfasurare negativa
(„negative super coil").
Moleculele de ADN lipsite de bucle dextrogire sau levogire laterale
sunt considerate molecule „relaxate".
Cand numarul de spiralizari pozitive creste, in duplexul moleculei se
produce si o condensare a spirelor.
Tensiunea superficiala induce „suprasolicitarea" structurii tertiare a
ADN-ului cu alternative potentiale, cum ar fi: catenele neperechi, ADN-ul
de tip Z si/sau forma „in agrafa, ac de par". Ca alternative potentiale sunt si
regiunile zonale ale duplexului ADN-ului de tip B , formate dintr-o
monocatena autocomplementara, numita palindrom.
Tensiunea superhelicoidala poate exista in interiorul celulelor sau
nucleului celular daca exista un mecanism biologic care ar determina
comprimarea capetelor moleculelor de ADN.
0 structura simpla, in care capetele moleculei de ADN sunt
comprimate (constranse), este ADN-ul in cere inchis covalent, prezent in
genomul multor virusuri, in ADN-ul mitocondrial si cloroplaste, sau in
genomul unor procariote mici.
La eucariote ADN-ul se asociaza cu proteinele histonice prin legaturi
saline formand nucleoproteine. Proteinele histonice au dispozitie
discontinua, cu formarea nucleozomilor si solenoizilor. Prin aceasta
dispozitie histonica se mareste diametrul moleculei de ADN. Histonele,
impreuna cu ionii de Ca2+, au rol in mentinerea arhitecturii spatiale a
ADN-ului.
In general, spiralizarea dublului helix al moleculei de ADN este
dextrogira. Dar imaginile electrono-microscopice si analizarea in lumina
polarizata au consemnat ca rotatia helixurilor poate fi atat dextrogira cat si
levogira.

31
 De exemplu, Alexander Crick (1979), folosind metoda observatiei
cristalografice cu variatia gradului de hidratare a mediului, a descoperit ca pe
secventa de 4-12 perechi de nucleotide obtinute artificial, apare o spiralizare
diferita de cea dextrogira.
In prezent putem vorbi de existenta a trei forme izomorfe de ADN
(fig.8): ADN-ul de tip A , ADN-ul de tip B si ADN-ul de tip Z.

Forma A Forma Z Forma B

Fig.8 Forme izomorfe de ADN

Saenger (1984), folosind spectrele de difractie a razelor X, constata

ca distanta dintre cele doua catene cuplate complementar dispuse in spirala,
nu este uniforma , chiar daca ele sunt dextrogire in lumina polarizata.
Dupa aspectul depresiunilor intercatenare, Saenger considera ca, la
eucariote, molecula de ADN se poate gasi sub doua forme izomorfe: forma
tip A si tip B.

32
 ADN-ul de tip A este forma deshidratata si cristalizata a moleculei.
Este forma care roteste lumina polarizata de la dreapta spre stanga. Este
forma dextrogira. Bazele azotate sunt exact perpendiculare pe axa virtuala
dextrogira a helixului. Tipul A este putin alungit, distanta dintre cuplurile
complementare redusa, iar diametrul moleculei este mai mare. Acest tip nu
are existenta histologica de lunga durata in ciclul celular.
ADN-ul de tip B este forma hidratata a moleculei. Este forma
dextrogira. Are existenta biologica.
Saenger, analizand comparativ molecula deshidratata si cristalizata
de tip A si molecula hidratata de tip B, constata diferente de dimensiune si
aspect in traseul de spiralizare a celor doua catene cuplate, si anume:
prezenta depresiunilor primare si secundare (major si minor) (fig. 9).
De exemplu ADN-ul de tip A prezinta un helix larg, iar pasul
helixului dupa o revolutie completa, este mai mic. Ca urmare, depresiunea
primara (major) are o deschidere mica, dar foarte adanca (profunda), si o
depresiune secundara putin vizibila. La ADN-ul de tip B sunt vizibile
ambele depresiuni: depresiunea primara cu deschidere foarte larga dar putin
adanca si depresiunea secundara, vizibila.
Saenger a mai stabilit ca cele doua forme A si B sunt forme
reversibile. Si anume, conversia helixuluide tip B intr-un helix de tip A si
invers, este conditionata de hidratarea mediului in care sunt introduse
cristalele. Este consecinta directa a interferentei stereochimice intre
depresiunea larga si cea ingusta, precum si prezenta moleculelor de apa, al
caror numar variaza in raport cu gradul de depresiune.
Rich (1979), Saenger (1984) si altii au descoperit ADN-ul de tip Z
ADN-ul de tip Z este forma levogira ca spiralizare a moleculei. Este un
ADN format aproape in exclusivitate din G-C. Helixurile se rotesc de la
stanga spre dreapta, iar scheletul glucido-fosforic al celor doua catene
cuplate are aspect de zig-zag (linie franta), de unde si numele de ADN de
tipZ.
ADN-ul de tip Z are helixurile mai alungite si cu diametru mai mic
fata de ADN-ul de tip B. Depresiunea majora este cu deschidere larga dar
aplatizata.
Guanina din ADN tip Z se gaseste la periferia moleculei. Aceasta din
cauza excesului de guanina in componenta lanturilor polinucleotidice. ADN
de tip Z poate fi obtinut artificial. Retine atentia deoarece, prezentand
guanina eversata spre exteriorul moleculei, are tendinta de a se cupla
spontan cu substantele necunoscute cu potential cancerigen.
In conditii fiziologice nu s-a constatat „tranzitia" ADN -ului de tip A
sau B intr-un ADN de tip Z. Experimental s-a obtinut aceasta tranzitie din
tipul A sau B, dar procesul nu este reversibil.
33
Imbach si Gosselin (1982), analizand procesul tranzitional, spuneau:
„ADN-ul de tip Z levogir este bogat in repetitia cuplurilor G-C, secvente I
care in ADN-ul de tip A sau B la eucariote sunt rare". In stare nativa tipul i de
ADN Z, cu inalta repetitivitate a cuplului G-C, este prezent in secventele
genomice ale unor virusuri potential oncogene.
Se pare totusi ca acest tip de ADN Z este uneori prezent si la
eucariote. El ar avea rol in reglarea functiei aparatului genomic.
Argumentele care presupun existenta „in vivo" a ADN-uluide tip Z la
eucariote, sunt urmatoarele:
- enzimele nucleare, topoizomerazele, pot forma sau pot distruge
reversibil, structura tipului Z „in vivo";
- anticorpii produsi prin imunizare cu ADN sintetic, se fixeaza pe I
ADN-ul nuclear in puncte precise (situsuri) ale cromozomilor.
Sunt ipoteze de lucru care sustin existenta ADN-ului cu structura levogira Z
„in vivo", molecule cu distributie specifica si care ocupa situsuri precise in
cromozomii nucleari.
De asemenea, s-a observat ca trecera formei dextrogire A sau B in
forma levogira Z, „in vivo", antreneaza dereglari in mecanismele reglatoare '
in expresia mesajului genetic.
In prezent nu sunt cunoscute exact situsurile cromozomale unde sunt
localizate moleculele ADN-ului Z si nici rolul exercitat in genomul celular.

4. ADN-ul nuclear

Dupa ce Avery (1944) a stabilit rolul fundamental al ADN-ului in

ereditatea caracterelor, cercetarea ADN-ului, la eucariote, s-a intensificat si
diversificat.
Primii care si-au concentrat cercetarile asupra ADN-ului au fost
Boivin si Vendrely (1948) care analizand ADN-ul, la Bos taurus, extras din
diverse tesuturi (timus, ficat, pancreas, rinichi) au constatat ca:
- indiferent de tesutul analizat, in nucleul celulelor cantitatea de
ADN este aceeasi. Au mai stabilit ca nucleul diploid al celulelor somatice
are o cantitate de ADN de aproximativ 6,5x10-l2gv
- fata de celulele somatice diploide, in gametii cu nucleul haploid,
cantitatea de ADN este redusa cu aproximativ 50% (3,4x 10-12 grame);
In 1949, Mirsky si Ris constata ca in componenta moleculelor de ADN exista
aceleasi baze azotate, indiferent de regn sau specie.

34
 In 1950 Mirsky, analizand cantitatea de ADN la diverse specii de
eucariote, observa existenta unor diferente valorice. Datorita acestor
observatii, Mirsky a demonstrat urmatorul aspect: cantitatea de ADN nu
este direct proportionala cu numarul cromozomilor existenti in nucleul
celulelor si nici cu gradul evolutiei biologice a speciilor.
Determinarile efectuate au evidentiat urmatoarele: specii „putin"
(evoluate au o cantitate mai mare de ADN nuclear, iar specii „mult"
evoluate au o cantitate mai mica.
De exemplu:
- Procariotele au o cantitate ADN de 10 ori mai mare in raport cu
numarul proteinelor codificate.
- Euglena viridis contine o cantitate de ADN aproximativ egala cu
cea existenta in nucleul celulelor somatice la Homo sapiens (om).
- Salamandra (Amphiuma), precum si unele specii de pesti inferiori,
au o cantitate de ADN de 50 de ori mai mare in raport cu cantitatea de ADN
la om.
- Unele plante si specii de batracieni au in genomul lor de 100 de ori
mai mult ADN fata de ADN-ul genomului uman.
- Ariciul de mare (nevertebrat superior) contine de 50 de ori mai
mult ADN decat cantitatea ADN la Rattus norvegicus (soarece).
Daca am lua in consideratie ^cantitatea de ADN" criteriu de
apreciere a gradului de evolutie biologica si complexitate structural
(fiinctionala , si daca tot ADN-ul existent ar fi codant, ar trebui sa admitem
pa ariciul de mare ar fi de 50 de ori mai evoluat ca soarecele, ca unele specii
de batracieni si pesti inferiori si chiar unele plante, sa prezinte un grad de
polutie de 50 de ori si chiar de 100 de ori mai mare decat al omului; sau
Euglena sa o pozitionam pe aceeasi treapta de evolutie cu omul actual.
S-a consemnat o neconcordanta intre cantitatea de ADN si gradul de
polutie a speciilor, o neconcordanta intre cantitatea de ADN si numarul de
gene codante.
De exemplu, Mirsky (1950) a lansat ipoteza ca in genomul
prganismelor vii exista o cantitate mare de ADN necodant, non-functional
indeterminismul genetic al sintezei de proteine.
Rezultatele obtinute i-au determinat pe geneticieni sa-si concentreze
bercetarile asupra studiului ADN-ului eucariotelor.
Primele incercari apartin lui Marmur si col. (1963), care elaborand si
folosind tehnica „denaturarii si renaturarii ADN-ului, purificat dupa
bxtragerea de la diverse specii de eucariote, au constatat diferente in
lapiditatea de reasociere si refacere a moleculelor. In procesul de reasociere a
catenelor complementare apar diferente de timp. Unele catene reasociaza
intr-un timp foarte scurt, altele reasociaza lent sau foarte lent.
35
 Britten si Kohne (1968), folosind aceeasi metoda au facut un studiu
comparativ al procesului de denaturare-renaturare a ADN-ului de la
procariote si eucariote. Ei au extras ADN-ul de la Escherichia coli (procariot)
si de la Bos taurus (eucariot) si cu fragmentele de ADN, a caror lungime era
variabila, au urmarit cinetica procesului de denaturare-renaturare.
Fragmentele folosite de ei aveau o lungime in jur de 500 perechi de
nucleotide.
Rezultatele au fost urmatoarele: viteza si tipul de renaturare a
ADN-ului la Escherichia coli difera semnificativ fata de renaturarea ADN la
Bos taurus. O alta observatie a fost ca in interiorul unei molecule ADN de la
Bos taurus sunt secvente polinucleotidice ce difera intre ele prin viteza de
renaturare, concentratie molara si timp de refacere a moleculei (fig9).

hibridizarea % (Fractia
neasociata)
i i i i i i i i
i i i i i i i i
i i i i i i i i
i i i i i i i i
i i i i i i i i
i i i i i i i i

0 10-3 10-2 10-1 1 10 102 103 104

Cot (moli x
secunde)

Fig.9 Cinetica renaturarii ADN la Escherichia coli si Bos taurus (dupa Britten
si Kohne - 1968).

Din studiul comparativ al moleculelor de ADN procariotic si

eucariotic, au obtinut o curba cu mai multe sigmoide la Bos taurus in
comparatie cu cele de la E. coli
36
 Aceste observatii au fost premiza elaborarii ipotezei referitoare la
heterogenitatea tipurilor de ADN in genomul nuclear al eucariotelor,
ipoteza confirmata ulterior. Dupa ei, la eucariote este o cantitate de ADN
care are runctie de a codifica sinteza de proteine (are informatie genetica),
darsi o mare cantitate de ADN non-codant, denumit ADN „egoist".
Rezultatele obtinute au permis acceptatrea a trei tipuri de ADN. In raport cu
cinetica renaturarii si a heterogenitatii secventelor polinucleotidice
constitutionale, in genomul eucariotelor gasim : ADN inalt repetitiv, ADN
moderat repetitiv si ADN nerepetitiv (fig. 10).

Fig.10 ADN-ul NUCLEAR DIN GENOMUL UMAN TIPURI DE ADN

ADN
N ER E P ET IT IV NUCLEAR
*
»

S EC V E N T E COPII
(C O P II)U N IC E
»
MULTIPLE
CODAN TE HETEROCROMATIMA
CONSTITUTIVA :
CENTROMER.
TELOMER,
CONSTRICTII
FA M IL IID E G EN E SECUNDARE
CO DAN TE

D IS P E R SA T E TANDEM

1
DET EI VlINlbM ARNr
GEN IETIC ARNt

37
4.1. Denaturarea si valoarea Cot de renaturare a ADN-ului
celular

Principiul metodei: moleculele de ADN, extrase si purificate, se I supun la

temperatura de 100°C timp de 10 minute. La aceasta temperatura si intr-un mediu
alcalin, legaturile de hidrogen stabilite intre bazele I complementare se rup
separandu-se catenele copolimerice. Acest proces este numit denaturare.
Dupa 10 minute are loc o racire lenta a mediului de reactie cand se
restabilesc legaturile de hidrogen, recuplandu-se complementar cele doua catene,
cu refacerea integrala a dublului helix al moleculei de ADN, proces numit
renaturare.
Britten si Kohne (1968) au observat ca la temperatura ridicata si un pH
alcalin, legaturile de hidrogen dintre catenele complementare se rup cu
suprimarea interactiunilor Van der Waals.
O alta observatie pe care au facut-o este ca in timpul denaturarii creste
absorbtia in UV
(k = 260nm) a bazelor azotate dupa decuplarea complementara, in timp ce I
cantitatea de lumina UV absorbita de molecula de ADN in dublu helix este I mai
mica. Autorii explica diferenta de absorbtie a UV astfel: prin rupereal puntilor de
hidrogen si separarea catenelor complementare, bazele azotate; sunt mai expuse la
actiunea UV, efect denumit hipercromic. Cand molecula de ADN este in dublu
helix, datorita spiralizarii, o parte din bazele azotate dispuse etajat, sunt partial
„mascate" de scheletul glucido-fosforic al ADN- | ului. In consecinta, absorbtia in
UV a moleculei este mai scazuta. Acest efect 1-au numit efect hipocromic.
Autorii considera ca prin denaturare se manifesta efectul de
hipercromaticitate, iar prin renaturare efectul de hipocromaticitate.
Denaturarea si renaturarea sunt procese reversibile. Cand
temperatura si pH-ul sunt aduse la valorile fiziologice, fortele necovalente se refac,
catenele se recupleaza complementar, iar molecula de ADN isi I reface dublul
helix.
In prezent, principiul de lucru in procesele de denaturare-renaturare este
urmatorul:
ADN-ul extras din celula procariota sau eucariota se fragmenteaza in I secvente de
aproximativ 1000 perechi de nucleotide. Fragmentele se supun procesului de
disociere, cand catenele complementare se separa. Daca

38
repunem catenele singulare in conditii fiziologice (temperatura si
concentratie ionica favorabila) ele se vor recupla.
Cand fragmentele de ADN nu contin secvente repetitive, refacerea
moleculei se face cu aceeasi viteza (ex. ADN-ul la procariote). Daca
fragmentele contin secvente repetitive si nerepetitive, recuplarea
monocatenelor se realizeaza la valori diferite de timp (ex. ADN-ul la
eucariote).
Parametrii care influenteaza gradul si viteza de recuplare a
monocatenelor dupa denaturarea ADN-ului sunt:
-concentratia initiala a ADN-ului - Co;
-timpul necesar pentru renaturare - t;
Valoarea Cot este produsul dintre concentratia molara a ADN-ului si
timpul necesar pentru reasocierea monocatenelor complementare exprimat
in secunde.
Cot - Cot' = valoarea de comparatie a vitezei de recuplare a diferitelor
secvente de ADN. ,
Cu cat diferenta valorii Cot este mai mica, cu atat viteza de recuplare
a catenelor este mai rapida iar timpul necesar refaceii moleculei ADN este
mai mic.
Pentru valoarea Cot se foloseste ca referinta valoarea Cot a unui
ADN "standard" (un homopolimer) sau a unui ADN procariotic cu lungime
cunoscuta.
Complexitatea genomului compus din secvente repetitive se
stabileste prin curba Cot:

Cot = Co x t

- de unde - Co - este concentratia initiala a ADN-ului in moli de

nucleotide /litru;
-1 - este timpul de renaturare in secunde.
Valorile Cot se exprima pe un grafic, curba exprimand repetarea
secventelor din genomul studiat (fig. 11).

39
 Perechi de nucleotide

t 10 102 1£p 10« 105 1Q6 10* 1G50 10^

1{)7 i_____I
J....,J 100 1000 10000
T ......1
icr3 ......-i
____-L
T
£
10° 1CT* W 0.1 1 10
Col (molxs/1)

v-4
Fig.ll Curba Cot. Valoarea Cot 10" - 10" exprima un ADN inalt repetitiv.
Valoarea Cot 10 - 10" exprima un ADN moderat repetitiv. Valoarea Cot
peste 102 este un ADN nerepetitiv (dupa J. M. robert, 1983).

In 1975, L. Stryer, studiind cinetica reasocierii catenelor

complementare si curbele Cot, a stabilit :
- ADN-ul cu un timp de renaturare foarte mic - 10"4 < Cot < 0.01
(renaturare foarte rapida) si refacerea integrala a moleculei, este un ADN
inalt repetitiv. Este tipul de ADN usor de identificat si analizat, cu
oligoelemente repetitive scurte (de 5-300 perechi de nucleotide) dispuse in
tandemuri lungi.
- ADN-ul cu o valoare Cot cuprinsa intre 0,01 < Cot < 10
corespunde ADN-ului moderat repetitiv, la care secventele au lungimi
variabile cuprinse intre 100-1000 perechi de nucleotide.

40
 - ADN-ul la care valoarea Cot de reasociere variaza intre 10 < Cot < |
l000. deci are o valoare mare, este un ADN nerepetitiv sau cu secvente
junice. Datorita secventelor nerepetitive, timpul necesar pentru recunoastere
si recuplare a catenclor complementarc este mai mare.
Cinetica renaturarii ADN este in raport de logaritmul Cot, adica
produsul concentratiei initiale si al timpului, exprimat in moli
litruxsecunde.
Cand Cot are valoare de 50% mai mica fata de valoarea Cot a ADN
inalt repetitiv, se noteaza Cot '/2 si este ADN moderat repetitiv.

5. Heterogenitatea ADN-ului din genomul uman si

pnctiile lui

Plecand de la demons'tratiile lui Chargaff (1974) si in raport cu

frecventa secventelor de ADN care apar in genomul nuclear, in genomul
uman exista dona grupe mari de ADN:
- ADN-ul repetitiv, care poate fi inalt repetitiv si moderat repetitiv;
- ADN-ul nerepetitiv sau cu secvente unice ;
|ln analiza lungimii secventelor polinucleotidice din genomul uman si a
tuturor speciilor din regnul animal si vegetal, sunt folosite urmatoarele
notatii valorice:
|-pb =perechi debaze;
|-Kb = kilobaza = 1000 pb = 10? pb;
bib = megabaza = 1000 kb = 1.000.000 pb = 106 pb;
lGb = gigabaza - 1000 Mb = 1.000.000 kb =1.000.000.000 pb = 10° pb.

5.1 Familii de ADN repetitiv

In genomul eucariotelor si/sau unor organisme eucariote superioare

rvoluate din regnul animal gasim ADN repetitiv. In raport cu dimensiunea
■ numarul secventelor repetitive, cu functia codanta sau nu, in genomul
^rnian gasim ADN moderat repetitiv si inalt repetitiv.
a) ADN-ul moderat repetitiv. La organismele eucariote 25-30% in
totalul ADN-ului nuclear se reasociaza cu o viteza a carei valoare Cot
variaza in limite largi: intre 0.1 si 10.

41
 Toate moleculele din ADN-ul genomic nuclear care au valoare Cot
intre aceste limite de reasociere sunt denumite ADN nulear moderat
repetitive.
Coeficientul de repetabilitate a secventelor identice variaza intre 10 -
104. Secventele repetitive sunt scurte. Contin intre 300-1000 pb. Numarul
perechilor de baze este mai mare in ADN-ul moderat repetitiv, respectivele
secvente fiind foarte scurte, cu un numar foarte mic de cupluri
complementare.
In raport cu sensibilitatea la enzimele care degradeaza ADN-ul si
temperatura de „topire" (TM), de disociere-reasociere, s-au stabilit
urmatoarele:
- secventele ADN-ului moderat repetitiv nu se caracterizeaza prin
repetabilitate secventiala ordonata si reasociere exacta. Ordonarea este
discontinua; '
- renaturarea, reasocierea, se poate face in secvente „inrudite" dar nu
identice, rezultand un hibrid .
Distributia ADN-ului moderat repetitiv in cromozomi este
discontinua. Secvente moderat repetitive se pot intercala si printre moleculele
de ADN nerepetitiv.
Aceasta discontinuitate in distributia intracromozomiala a ADN-ului
moderat repetitiv a fost demonstrata experimental.
De exemplu, prin fragmentarea moleculelor de ADN cromozomial in
secvente a caror dimensiune este de aproximativ 5 Kb, urmata de procesul de
denaturare la o valoare Cot corespunzatoare ADN-ului moderat repetitiv, se
constata ca mai mult de 50% din totalul secventelor disociate vor forma
hibrizi ADN-ADN, iar restul secventelor, reasociind foarte lent, este
nerepetitiv.
Un alt indicator care confirma distributia discontinua a secventelor
moderat repetitive este frecventa cu care clonele de ADN recombinat contin
secvente de ADN moderat repetitive.
De exemplu, prin folosirea de ADN din genomul celular uman pentru
prepararea unui „situs de clonare" genomica, a carui lungime medie este de
20 Kb, s-a observat ca aproximativ 90% din moleculele donate contin
secvente moderat repetitive.
Young (1979) a demonstrat ca secventele repetitive intermediare
variaza ca numar si pozitie in ADN-ul diverselor specii. De asemenea, el a
mai demonstrat ca apar diferentieri de repartitie chiar intre indivizii
conspecifici, diferentieri de repartitie intracromozomiala. Diferentierile de
numar si pozitie a secventelor repetitive intre indivizii conspecifici sunt si
rezultatul recombinarilor intracromozomiale prin „crossing-over inegal".

42
 Secventele cu pozitie si ordine neomogena intre indivizii
conspecifici, pot fi folosite ca marked genetici pentru studiul populatiilor,
camarkeri pentru identificarea indivizilor (criminalistica, medicina legala),
sau folosite ca markeri corelat cu diverse boli determinate genetic.
0 serie de cercetatori, precum Pardue (1973), Sanger (1981), Li
(2001), Venter (2001), IHGSC (2001), Whitfield (1995), s.a. au stabilit ca
printre secventele de ADN moderat repetitiv se gasesc numeroase secvente
codante. Conform datelor obtinute, secventele codante sunt gene care,
genetic, determina sinteza histonelor (histogenele) sau gene care codifica
jtipurideARNrsiARNt.
De exemplu, se presupune existenta in genomul uman haploid a
circa 200 gene pentru ARNr 5S, iar pentru ARNf aproximativ 1300 gene
(Pardue si col.,1973).
Pe baza indicatorilor mentionati se estimeaza existenta in genomul
uman a circa 3x10' fragmente repetitive din ADN.
Printre secventele ADN repetitive se mai gasesc si alte tipuri de
secvente genetic active. Acestea ar codifica, informational genetic, diverse
sinteze proteice necesare activitatii celulare.
Din acest grup de secvente informational active din ADN moderat
repetitiv, mentionam :
- genele ribozomale care codifica molecule de ARNr (acid
ribonucleic ribozomal). Transcrierea este catalizata de enzimele ARN
polimeraze III, cu locusuri pe bratul scurt „p"al cromozomilor acrocentrici
|(vezi cromozomii). In segmentele cromatidice denumite „organizatori
nucleolari" se gasesc intre 150-200 copii genice (familia de gene ale
ARN,). Pe bratul lung „q", in apropierea centromerului cromozomului
numarul 1. ar fi locusul genei pentru ARNr 5S.
- genele pentru sinteza ARNt (acid ribonucleic de transport) cu
locusurile pe cromozomii nr. 1 si 6 sunt catalizate tot de ARN polimeraza
III;
- secventele SINEs (short interspred repeated sequences) a caror
lungime este estimata intre 100 si 400 pb si reprezinta 3-5 % din totalul
ADX-ului genomului uman. In genomul uman se estimeaza un numar de
aproximativ 500.000 de secvente SINES (nature, 2001, 411). Unii
cercetetori includ secventele SINEs si Alu in grupa elementelor
transpozabile, cu rol in activitatea replicarilor (vezi initierea sintezei ADN).
- secventele LINEs (long interspred repeated sequences) sunt
secvente de 6-7 kb . In genomul uman se estimeaza existenta a 100.000 de
secvente LINEs. Amplificarea lor s-ar face prin reverstranscriere
(retrotranspozitie). Se presupune a avea rol in cuplarea cromozomilor

43
omologi in zigomerul profazei primare a meiozei si implicare in
crossing-over.
Se crede ca secventele SINEs si LINEs ar proveni din gene codante
printr-un mecanism de retroinsertie. Aceste secvente nu sunt transcrise in
molecule de ARMm .

Tabel I. Tipul si numarul copiilor din genomul uman al familiei ADN

repetitiv (dupa IHGSC, 2001; Li si col., 2001)

Familia secventelor Numar relativ de copii in

repetitive genomul uman
SINEs: 155800
Alu 109000
MIR 39300
MIR3 75000
LINEs: 868000
LINEs-1 516000
LINEs-2 315000
LINEs-3 37000
Elemente LTR 443000
Transpozoni ADN 294000

5.2. Tipuri de ADN inalt repetitiv

Din totalul genomului uman, aproximativ 10% este ADN inalt|
repetitiv. Este reprezentat de secvente cu dimensiuni de 1 pana la 200 pb (si
mai multe), dispuse in tandem. Moleculele de ADN inalt repetitiv au lungimi
variabile in raport cu dimensiunea secventelor si gradul de repetabilitate a
secventelor. Se considera ca acest tip de ADN poate aveaun coeficient de
repetabilitate a microsecventelor ce pot depasi si un milionde ori.
De exemplu, Walker si col. (1969) apreciau ca secventele scurte de
CCCTAA
GGGA TT se P°t repeta, prin dispunerea in tandem de peste 1.000.000 de ori.
ADN-ul inalt repetitiv este necodant, fiind in exclusivitate un ADN
„egoist" deoarece isi exercita numai functia de autoreplicare.
Intr-un studiu efectuat de Tartoff in 1975, s-a constatat ca raportul bazelor
A+C complementare G+C IN ADN-ul inalt repetitiv,
valoric, este diferit fata de
ADN-ul repetitiv.
44
 Tartof a mai observat ca, in majoritate, ADN-ul inalt repetitiv este
localizat in zonele cu heterocromatina constitutiva (respectiv in benzile C) ale
cromozomilor si anume: regiunea pericentromerica (majoritar), la nivelul
telomerelor si constrictiilor secundare (Tabel II) .

Tabel II. Secvente de ADN inalt repetitiv satelitic in regiunea

pericentromerica (dupa Tartof, 1975)

Specia Componenta secventelor

repetitive
Drosophila melanogaster AGAAG
ATAAT
ATATAAT
AATAACATAG
AGAGAAGAAG
Drosophila viridis ACAAACT
ATAAACT
ACAAATT
Cancer boscalis AT
Pagurus pollicaris CGT
ATCC
Cavia porcellus CCCTAA
Dipodomys ordii ACACAGCGGG

Un studiu facut pe cromozomul Y uman a evidentiat ca secventele

repetitive din celulele gametice sunt hipometilate, iar in cromozomii celulelor
somatice secventele sunt hipermetilate (Dib si col. 1996; Bird, 1999).
Se presupune ca ADN-ul inalt repetitiv ar avea rol in imperecherea liniara
a cromozomilor in stadiul de zigonem din profaza primara a meiozei. Dupa
dimensiune, numar si limgimea dispunerii in tandem, secventele inalt repetitive
din ADN pot fi de tipul:
- ADN satelit;
- ADN mini satelit;
- ADN microsatelit;
- ADN interspres (transpozonic), (fig. 12 si fig. 13);
Clasificarea familiilor secventelor inalt repetitive din ADN genomic
uman a fost facuta de Casanova si col. (1985), Nogo si col. (1986),

45
Malaspina si col. (1990), Lavett (1997), Venter si col. (2001), IHGSC3
(2001), s.a.
ADN-ul satelit. Este ADN-ul cu numar foarte mare de secvente
repetitive a caror lungime variaza in limite cuprinse intre 5 si 25 pb. Prin
dispunerea lor in tandem, lungimea satelitului ajunge la cca 100 kb. Se
apreciaza ca unitatile repetitive ale ADN-ului satelit sunt simple sau moderat
complexe. Densitatea ADN-ului satelit este determinata de componenta in
baze azotate a unitatilor de repetitie , care-i total diferita de restul ADN-ului
nuclear.
Folosindu-se metoda ultracentrifugarii in gradient de densitate
Ag-CsSCU, s-a stabilit ca in raport de numarul unitatilor repetitive dispuse in
tandem, se pot identifica trei familii majore de ADN satelit:
- familia de ADN satelit compusa din unitati repetitive foarte scurte,
prin numarul bazelor/secventa;
- familiile II si III (familia II = 1,693 g/cm3; familia III = 1,697
g/cnr) ce contin, dispuse in tandem, secvente de tipul ATTCC.........
Prin centrifugare in gradient de densitate nu s-a putut stabili
heterogenitatea complexa a secventelor ADN-ului repetitiv satelitic. Totusi
heterogenitatea a fost demonstrata prin folosirea digestiei ADN-ului cu
enzime de restrictie, care recunosc un singur situs din unitatea repetitiva.

"' IHGSC = International Human Genome Sequencing Consortium .

46
 < "^
1—I £— 1
■■/J
G*
H Pio §
o b

z
ft.
z A.

TELOMERIC
<

ADN
i— * "

5
J

w
5 —»■

o
z

w
0
z

J3

z
Q
<
w
J

—
h
U
z
5
u,
w
w
—
a:
>■* h

47
 ry'v/vvyv/'-'
Insertia transpozonului
s Transpozon in gena

Clranspozooy

Gena cu functie mutanta

modificata

JWWW C
Transpozon^
VSAAAA

Secventa transpozomului folosit, rezultat prin insertie.

Indepartarea transpozomului si refacerea
initiala a genei

Gena

Fig. 13 Dinamica transpozonului insertionat in gena dupa Clark si Wall (1992).

ADN-ul satelit nu este transcris in ARNm. Este non-informational. D
gasim localizat, in special, in regiunile heterocromatice la cromozomii Iq, 9q, 16q
si Yq.
Un tip particular de ADN satelit este ADN-ul alfoid (alfa = a), prezent in
toti cromozomii din genomul celulei, localizat in regiunea centromerica. Se
caracterizeaza prin repetitivitatea in tandem a unei unitati ce contine 117 pb.
Satelitul alfoid centromeric are un situs cu ajutorul caruia se leaga cu o
proteina centromerica specifica.
Familia ADN alfoida ar contine 8 x 103 copii de unitati dispuse in tandem
si reprezinta 4% din totalul genomului nuclear. Csink si Henicoff (1988)
presupun, pe baza cercetarilor efectuate, ca ADN satelit s-ar gasi localizat si in
regiunile constrictiilor secundare.
Sunt si cromozomi genomici unde ADN-ul satelit este „combinat", prin
altemanta repetitiva si in raporturi valorice variabile, cu alte tipuri de ADN
repetitiv. In aceasta combinatie sunt identificate, ca dispersie, intracromozomic
(in diverse segmente cromatidice). Aceasta dispersare

48
 cromozomica combinativa ii este caracteristica ADN-ului satelit, in
comparatie cu ADN-ul alfoid care e omniprezent in regiunea centromerica a
cromozomilor.
ADN-ul minisatelit. Este ADN-ul alcatuit din grupe repetitive,
care, dispuse in tandem pot avea lungimi ce ajung la 20 kb. Unitatea
repetitiva are dimensiunea ce variaza intre 14 si 65 pb. In zona telomerica
a cromozomilor sunt minisateliti la care unitatea repetitiva este
reprezentata de un hexanucleoid de tipul ... 5'- TTAGGG -
3'....Aceasta imitate, repetata de sute de ori, se cupleaza cu telomeraza.
Sccventa comuna a ADN-ului minisatelit este - GGGCAGGAXG - de
iinde „X" poate fi orice tip de nucleotid. Aceasta secventializare o gasim la
ADN-ul minisatelit localizat in regiunile distal-telomerice ale
cromozomilor. Deoarece „X" poate fi orice tip de nucleotid, confera
minisatelitilor trasaturi hipervariabile.
Pe cromozomii sexuali x si y nu s-a identiflcat ADN minisatelit. Ca
rol, ADN-ul minisatelit telomeric ar proteja cromozomii sa nu se
„degradeze" in timpul replicarii ADN.
AD\-ul minisatelit este denumit si VNTR (,,variable number of tandem
repeats"). Datorita hipervariabilitatii secventelor, s-au consemnat diferente
de mvel molecular intre indivizii conspecifici. Diferentele interindividuale
variaza in limite intre 0,1 si 20 kb.
Datorita variatiilor individuale (prin repartitie sau prin prezenta
tipului de minisatelit) minisatelitii pot fi folositi ca markeri genetici, ca
amprcnte genetice, cu ajutorul carora se poate stabili tipul constitutional al
fiecarui individ din populatie, din familie.
Asemenea markeri se pot folosi in studiile antropologice, in studiul
etniilor, in stabilirea gradului de rudenie intre indivizi. Se folosesc la studiul
cuplurilor gemelare pentru a stabili starea de gemeni univitelini
(monozigoti) sau bivitelini (dizigoti) . Deasemenea au aplicabilitate,ca test
genetic, in criminalistica, in medicina legala, in diagnosticul bolilor
moleculare pe fond genetic.
ADN-ul microsatelit. Este ADN-ul genomic care, la eucariote,
prezinta secvente simple repetate, constituite din 1 pana la 13 pb. Este
distribuit in tot genomul nuclear uman. Aceste secvente „simple" se pot
repetade 10-20 de ori, realizand microsateliti de lungimi variabile.
Un exemplu de microsatelit cu secvente simple, care prezinta ca
unitate repetabila o singura pereche de nucleotide, este microsatelitul care
are repetabilitate de „n" ori a cuplului complementar A-T:

49
.......5' - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA................3'
.......3' - TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT..............................................5'
In genomul uman exista 15% din ADN-ul microsatelit format din
repetitivitatea unui singur cuplu complementar A-T, iar 28% este ADN
microsatelit compus din repetarea a doua perechi de nucleotide:
.. ..5' - C AC AC AC AC AC AC AC ACAC AC AC A 3'
.... 3' - GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT. .5'
si care reprezinta 28% din ADN-ul genomic.
Microsatelitii au o mare variabilitate determinata de numarul
mononucleotidelor si binucleotidelor care intra in componenta lor, dar si in
raport cu lungimea secventelor repetete.
Diversitatea microsatelitilor se amplifica prin: repetari extensive a
secventei initiale, prin recombinarea ADN-ului cu formarea de repetitii
interdispersabile, prin pierderea unei unitati repetitive (un nucleotid) in
timpul replicarii sau repararii moleculei de ADN.
De asemenea diversitatea microsatelitilor se realizeaza si prini
activitati de transpozitie realizate de mecanismele de conversie ale ARN-ului
in ADN, prin implicarea retrovirusilor, in special cei endogeni (RVE).
Repetitiile trinucleotidice in ADN-ul microsatelit sunt foarte rare in
genomul uman.
Datorita unei ample diversitati pot fi folositi ca marked genetici (vezi rolul
minisatelitilor).
ADN-ul inalt repetitiv interspres. In genomul uman sunt
identificate doua familii de ADN inalt repetitiv interspres : familia Kpn si
familia Alu.
- Familia Kpn . Din aceasta familie fac parte secventele lungi,
repetate, in genomul uman (Strachan si Read, 1991). Repetitiile secventelor
lungi sunt identificate la fiecare 50 Kb din genomul uman.
Datorita diferentelor de lungime a secventelor, aceasta familie este
considerata heterogena, determinand un accentuat poiimorfism molecular in
genomul uman.
Fiecare secventa „Kpn" are un capat 3' si se termina cu o „caseta"
poli-A de lungime variabila.
Secventele interspres „Kpn" le gasim localizate in benzile
eucromatice G-pozitive (in metafaza, benzile G-pozitive sunt intunecate si
intens cromatice).
Ca distributie, aceasta familie se gaseste si in zone cu eucromatina
cromozomiala dar nu in zonele codante.
Unele secvente „Kpn" prezinta similitudine structurala cu gena care
codifica enzima transpozaza.

50
 Sunt presupuneri ca secvente din familia „interspres Kpn" sunt
implicate in procesele transpozitionale din genom, dar fara a fi cunoscut
pana in prezent rolul lor in aceste procese.
Repetitiile „Kpn" lipsesc din exoni dar sunt prezente in introni.
- Familia interspres Alu. Descoperita in genomul uman de catre
Calabretta si col. (1982). Secventele Alu in numar de aproximativ 300
-500.000, sunt dispuse grupat sau dispersat pe grupuri de secvente, in zonele
eucromatice ale cromozomilor. Denumirea de secvente Alu este data de
enzima de restrictie prin care sunt izolate din genomul celular. Secventele
Alu apar la fiecare 4 kb.
Desi lipsesc din exonii genelor, sunt identificati in introni si chiar in
unele pseudogene sau in interiorul ADN satelit.
Ca lungime o secventa Alu poate ajunge pana la 300 pb. Dupa
Whitfield si col. (1995), familia Alu este reprezentata si de
transpozoni, iar elementele Alu pot fi transcrise de ARN polimeraza III.
Datorita diferentelor de lungime a secventelor , familia Alu amplifica
heterogenitatea genomului uman la nivel molecular.
Calabretta a stabilit diferente de numar in populatiile celulare la
acelasi individ si diferente intre indivizii conspecifici. Tot Calabretta a
consemnat diferente valorice ale secventelor „Ahi" intre indivizii normali si
intre cei care manifesta o anume boala pe fond genetic.
Exemplul urmator convinge diferentele numerice intre omul normal
si eel bolnav.
Astfel, in genomul leucocitelor omului normal se pot identifica 50
secvente Alu, cuplate cu „secventele unice" Hi5A , in timp ce in genomul
leucocitelor la bolnavii cu leucemie acuta , s-au identificat numai 5 cupluri
Alu-Hi5A. O alta diferenta intre individul normal si eel bolnav de leucemie
acuta este ca in citoplasma leucocitelor la leucemici se gasesc un numar
crescut de secvente Alu in forma de inel, ceea ce la individul normal
lipsesc.
Datorita studiilor si rezultatelor obtinute, s-a lansat ipoteza ca
familia Alu este reprezentata si de transpozoni, dintre care unii ar fi
retrovirasi, sau secvente interspres labile (Whitfield si col. 1995).
Autorii acestei ipoteze considera ca retrovirusii din genomul uman
nuclear, respectiv transpozonii, ar trece in citoplasma leucocitelor, unde ar
determina o accentuata instabilitate genomica la om (leucemie acuta).
Calabretta si col. considera ca secventele „Alu" sunt si de origine
crossing-over intragenic inegal, responsabil de patru deletii si o duplicate.
Familia Alu poate prezenta un situs de restrictie pentru enzima Alu I.

51
 Merita aprecierea pe care cercetatorii o dau secventelor repetitive din
genomul uman. Ei considera ca secventele repetitive sunt resturi ancestrale
(din ADN-ul primar sau arhaic). Datorita polimorfismului accentuat,
identificarea lor poate fi folosita ca marked antropologici si paleontologici.
Au aplicabilitate bio-genetica si valoare diagnostica.
Daca se accepta ca sunt produsul si al crossing-overului inegal in
meioza si autoduplicatie, prin studiul comparativ al primatelor actuale si al
formelor fosile, aceste secvente repetitive reprezinta repere de interpretare si
evolutie antropologica a lui Homo sapiens.

5.3. Elemente genetic transpozabile

Transpozonii

Majoritatea secventelor inserate (SI) din familia Alu sunt

transpozonii, amplificati prin procesele de transpozitie. Primele identificari
legate de prezenta transpozonilor si miscarilor transpozitionale ale
acestor secvente apartin lui Barbara McClintock in | 1950.
Descoperirea B. McClintock a deschis un teren de cercetare genetica
in genomul organismelor eucariote si in mod deosebit in genomul uman.
Situindu-se printre cei care s-au ocupat in mod deosebit de procesele
transpozitionale, B. McClintock (Premiul Nobel in 1983), sugera ca
dispunerea spatiala a moleculei de ADN cromozomial nu este constanta. Ca
moleculele ADN-ului genomic nuclear ar contine secvente nucleotidice
repetitive. Ipotetic, autorul considera ca materialul genetic cromozomial
suporta frecvente modificari datorita transpozitiei unor secvente nucleotidice.
Aceste secvente, care-si schimba locusul de la un cromozom la altul, au fost
denumite transpozoni (fig. 12, 13, 14). Prezenta si transpozitia
transpozonilor are loc la toate organismele procariote si eucariote.
Transpozonii, secvente polinucleotidice de insertie, tree dintr-un
locus in altul pe cromozomi, in interiorul genomului celular. Secventele
inserate de ADN altereaza genomul, cauzand modificari fenotipice ale unor
caractere,si ale caror efecte sunt asemanatoare mutatiilor.

52
 Fig. 14 ELEMENTE GENETIC TRANSPOZABII 1
ELEMENTE GENETIC
TRANSPOZABILE

L/, EXCIZIE
EUCARIOTE IMPRECISA

transpozitie "}
i au
SECVENTE TRANSPOZONI
INSERTIONATE V. CROMOZOMALA
OPERONUL LA REARANJARI
LOCULDEINSERTIE CROMOZOMIALE RETROTRANSPOZONI
ATRANSPOZONULUI

determina

MUTATII
POLARE

RUPTURI
(DELETII)
CCROMOZOMIALE
INFECTII
RETROVIRALE SIDA
 Natura secventelor de insertie transpozabile a fost studiata prin
fenomenele de recombinare. Modelele biologice folosite pentru studiu au fost
bacteriile Sacharomyces cerevisiae si Ddosophila melanogaster.
De exemplu sunt observatii care confirma ca molecula de ADN a
bacteriofagului lambda (X), dupa ce traverseaza membrana celulei bacteriene, se
insera aproape constant, in anumite puncte (situsuri) specifice ale cromozomului
inelar. S-a constatat ca inserarea este facilitata de o integraza.
Dupa cum observam, inserarea beneficiaza de existenta unor zone sau
puncte din ADN-ul cromozomial care au proprietati de fixare. Aceste situsuri
sunt simbolizate prin notatiile ISi. IS2, IS3 etc., plasate in zone diferite din
genomul bacterian.
S-a mai observat ca segmentul de ADN insertionat, enzimatic se poate
detasa, inserandu-se in alt punct de fixare al cromozomului. De aici si denumirea
de gene „saritoare". Enzima implicata in detasarea si insertionarea secventei de
ADN ar fi transpozaza. (D.E. Snyder, 1992).
Fenomenul de „migrare" a unor secvente polinucleotidice din
componenta unei molecule ADN in alta molecula sau in alt cromozom, a fost
numit de cercetatori transpozitie genica, iar segmentul transpozat cu numele de
transpozon sau gena saritoare (Shapira,1979).
Fenomenul nu este identic formei de recombinare intre moleculele de
ADN omoloage. Transpozitiile se produc in celulele „rec"", respectiv celule al
caror ADN nu se recombina prin mecanismul clasic.
La primele cercetari si observatii s-a presupus ca transpozitia genica este
proprie numai unor fagi temperati, sau unor virusuri oncogene. Dar prin
continuarea si extinderea cercetari lor s-a constatat ca transpozitia genica se
manifesta si la alte vietuitoare, inclusiv la om.
Din studiile efectuate, G. Childs considera ca in genomul celular ar exista
0 noua clasa de gene, pe care a denumit-o clasa de gene „orfonf. Dupa Childs,
orfonii sunt secvente nucleotidice izolate, insertionate printre grupele de gene din
componenta normala non-repetitiva a cromozomului. Dupa el, procesul si locul
de insertionare este aleatoriu.
Tot Childs emite ipoteza ca orfonii ar fi gene implicate in dezvoltarea
organismului.
Ulterior, cercetatorii G.J. Brewer si Ch.F. Sing, lanseaza urmatonil
concept : cand transpozonul este insertionat in interiorul sau in apropierea unei
gene din cromozom, acesta blocheaza activitatea respectivei gene. In cazul cand
transpozonul se detaseaza din acel punct insertionat, gena isi recapata functia
initiala, iar transpozonul putandu-se insertiona ulterior pe alt cromozom.

54
 Brewer si Sing sustin ca unii transpozoni reprezinta o gena sau
agment de gena in genom.
ranspozonii pot fi identificati in genomul organismelor procariote si
carote.
De exemplu la Escherichia coli miscarile de insertie a
inspozonilor se realizeaza cu o frecventa de aproximativ 1/10 replican. I
genomul uman, unde este o cantitate mare de ADN repetitiv, un numar
litre secventele genice insertionate sunt de origine transpozonica.
La om, transpozonii sunt transpozati prin actiunea enzimei
iverstranscriptaza.
I Cercetatorii Strachan si Read (1999) au demonstrat ca prin folosirea
ft „matrite" ARN, enzima reverstranscriptaza va determina sinteza
implementara a unei secvente polinucleotidice de ADN capabila sa se
sertioneze in genomul celular.
Se considera ca majoritatea transpozonilor au origine ancestrala.
I Transpozonii pot fi folositi ca markeri pentru stabilirea tipului
nstitutional genetic al indivizilor umani, la identificarea gemenilor
litelini si bivitelini, pentru studii paleoontologice si antropologice, in
ibilirea etapelor si evolutia speciei Homo sapiens. De asemenea se
losesc ca elemente implicate in transmiterea si diferentierea particulara a
caractere, ca markeri in diversele boli pe fond genetic.
L Pe langa rolul lor ca markeri genetici, elementele transpozabile pot
implicate in activitatea genomului uman, avand rolul:
- capacitatea de „directionare" a actiunii genelor in timpul
diferentierii si dezvoltarii organismului;
- stabilirea interactiunii cu alte gene, in special in studiul genelor
reglatoare si structurale din componenta operonilor;
- prin procesul de transpozitie insertionala, induc conditii noi de
reorganizare a cromozomilor, cu implicatii in etapele ontogenice, si
aparitia diverselor structuri la individul unde s-au produs procesele
transpozitionale ale segmentelor polinucleotidice;
- transpozonii determina un grad ridicat de variabilitate genetica la
nivel molecular (polimorfism molecular);
- prin numar si frecventa insertiei secventelor in genomul uman,
in stabili „labilitatea" genomului uman, receptivitatea genomului la
actiunea factorilor de mediu, capacitatea de adaptare, sau nu, la
conditii
deosebite de stres sau noxe fizico-chimice.
Desi cu un potential ridicat de roluri, sau influente in care sunt
implicati transpozonii, ei pot fi contrabalansati de prezenta mutatiilor sau
producerea mutatiilor „de novo" in genomul uman.

55
 Un aspect important a fost relevat de Brewer si Sing. Ei considera ca
elementele transpozabile ar fi implicate in producerea anomaliilor
cromozomale de tipul: ruperi (deletii) cromozomale la nivelul situsurilor
fragile. Aceste fisuri cromozomale pot determina afectiuni, boli pe fond
genetic.
Datorita transpozonilor care indue labilitate genomica, se poate
transforma functia unei celule sau unui tesut normal, pot induce dereglari in
activitatea celulelor sau tesuturilor.
Un exemplu care confirma posibilele modificari in activitatea
organismului sunt transpozonii, care determina rezistenta la diverse
antibiotice (penicilina, kanamicina, cloramfenicol etc.). Modificarile
genomice induse de transpozoni ca rezistenta la antibiotice, sunt
urmatoarele: segmentul ADN care determina rezistenta la cloramfenicol are
in partea terminala secventa de insertie ISi, iar gena care confera rezistenta la
tetraciclina are in zona terminala secventa de insertie IS3.
Orfonii ar fi gene rezultate din translocatia cromozomilor cu
implicatie in dezvoltarea organismului.

5.4. Palindromul

O categorie de ADN repetitiv necodant este ADN-ul in palindroame.

Palindromul se formeaza datorita posibilitatii de realizare a
autocomplementaritatii, consecinta ordonarii particulare a bazelor azotate pe
o secventa monocatenara din structura ADN-ului cromozomal.
Sa presupunem o secventa pe o monocatena din structura moleculei
deADN:
. CCGATTAGGCAAT ATTGCCTAATCGG....
Daca se analizeaza cu atentie putem observa aparitia posibilitatii de
cuplare complementara a bazelor, formand o bucla numita palindrom:

.....CCGATTAGGCAAT

.....GGCT AATCCGTTA

Ca lungime, palindroamele variaza in limite foarte largi, continand

intre 6 pb pana la cateva sute si chiar mii de pb.
La unele eucariote numarul pb din componenta palindroamelor ar
reprezenta pana la 50% din totalul nucleotidelor din genom.
Homo sapiens (omul actual) ar avea aproximativ un numar de 120.000
palindroame.
In 1975, Schmid si col. au identificat secvente unice de ADN
flancate la cele doua extremitati de secvente terminale de tipul:
ATTCGG---------------------------------------CCGAAT
ADN cu secventa unica

6. Genomul mitocondrial sau ereditatea citoplasmatica

In evolutia biologica a organismelor vii a avut loc o specializare

intracelulara.
La unele bacterii si alge, materialul genetic, respectiv moleculele de
ADN, este prezent in citoplasma celulelor.
La eucariote consemnam concentrarea materialului ereditar in nucleu, mai
exact in cromozomii nucleari.
Concentrarea materialului ereditar in nucleul celulelor la eucariote,
asigura:
- o mai buna „protectie" a materialului ereditar;
- o distributie „precisa" a materialului ereditar in timpul diviziunii
mitotice sau meiotice.
Dar la eucariote materialul ereditar nu este in totalitate localizat in
nucleu. Sunt identificate molecule de ADN in cloroplaste (la plante) si
mitocondrii (la animale). De retinut ca la procariote in afara de moleculele
ADN care formeaza unicul cromozom, exista si epizomii, forme libere de
ADN in citoplasma.
In citoplasma celulelor somatice, la eucariote, gasim molecule de
ARNm. ARN-ulm sintetizat in nucleu poate persista in citoplasma, avand o
oarecare autonomie in raport cu ADN-ul nuclear (vezi mecanismele
diferentierii). Autonomia relativa a ARNm fata de nucleu s-a demonstrat
experimental prin supravietuirea limitata a celulelor enucleate, care pot
sintetiza proteine cu viata lunga pe baza ARNm existent in citoplasma.
Cantitatea ADN-ului citoplasmatic este foarte mica in raport cu cea
din nucleu (0,5 din totalul ADN-ului celular). Acest ADN da nastere
fenomenelor de ereditate citoplasmatica sau extracromozomiala.
Terminologia folosita in studiul ereditatii citoplasmatice este
urmatoarea:
- plasmonul sau plasmotipul este echivalentul genotipului nuclear,
reprezentand totalitatea masei ereditare localizata in citoplasma;
- plasmida, echivalentul genei, este unitatea ereditara a
plasmonului, denumita si plasmogena;

57
 - plasmonul sau plasmotipul reprezinta totalitatea determinantilor
genetici din componenta plasmidelor;
- citoplasmonul, totalitatea plasmidelor ce se gasesc dispersate in
citoplasma.

Structura genomului mitocondrial

Molecula ADN-ului mitocondrial este in dublu helix cu aspect

circular (fig. 15). Sanger a stabilit ca ADN-ul mitocondrial din celuleie
somatice umane are in componenta sa 16590 perechi de baze (de nucleotide)
pentru fiecare mitocondrie. In 1981, Anderson si col. au finalizat
secventierea (cartografierea) structurii moleculei de ADN mitocondrial (fig.
15).

58
Fig. 15 ADN-ul mitocondrial
CYS
\ HIS LYS

1 LEU
..wfiP - \i .AUG

"/ ASf/-ARG
' /ALA -
IL.E

. AS*
6.1.Caracteristicile si functiile ereditatii citoplasmatice

Din cercetarile facute pana in prezent se pot stabili urmatoarele

teristici si functii ale ereditatii citoplasmatice (Fig. 16): - nu prezinta
V
^, - CITOCROM
OXIDAZA III

segregare de tip mendelian. Nu respecta legile

jdelienc;

L-IMET
PRO

59
 - ereditatea este uniparentala, de regula materna. In Fi unele
caractere sunt apropiate de cele ale genitorului matern;
- absenta fenomenului de linkage;
- posibilitatea ca unele plasmagene sa suporte mutatii, iar caracterele
care apar (normale sau patologice) nu respecta regulile mendeliene de
segregare si transmitere;
- in componenta moleculei ADNm nu sunt proteine de tip histone si
nonhistone;
- cercetarile lui Stracham si Read (2000) au stabilit ca cele do
catene ale moleculei ADNm au componente nucleotidice diferite : d
complementare, pe o catena predomina guanina, fiind denumita si cate
grea (notata H), cealalta catena este bogata in citozina, denumita catena
usoara (notata L);
- molecula de ADNm, lipsita de introni, are foarte putine secvente
repetitive. Asa se explica de ce aproape intreaga molecula ADNm isi
exercita functia de determinism genetic, pe secvente genice;
- molecula de ADNm detine aproximativ 37 gene cu func1"
determinante. Preponderent detine genele pentru moleculele de ARNt si ale
ARNr (Diane K. Lavett, 1997);
- prin lipsa mecanismelor de reparare a moleculei ADNm in
genomul mitocondrial, creste riscul ratei mutatiilor;
- factorii ereditari citoplasmatici sunt detectati prin absenta
segregarii in meioza (ovogeneza) sau printr-o segregare care, valoric, nu
respecta legile mendeliene;
- replicarea moleculei ADNm este unidirectionata;
- analizata la microscopul electronic, molecula de ADNm are
arhitectura similara cu genomul procariotic (circulara);
- se sintetizeaza semiconservativ, dar independent de replicarea
ADN-ului cromozomial.

6.2. Ereditatea citoplasmatica sau matroclina

La produsul de conceptie, ADN-ul mitocondrial, respectiv ereditate'

citoplasmatica, este de origine materna.
Explicatia este urmatoarea: la organismele eucariote sexuate
fecundatia se realizeaza intre ovul si spermie. Ovula retine aproape in
totalitate masa citoplasmatica, citoplasma in care se gasesc mitocondrii cu
ADN. Spermia (capul spermatozoidului cu nucleul haploid) este lipsita de
masa citoplasmatica, sau are o cantitate extrem de mica. In consecinta nu
contine mitocondrii. Deci rezulta lipsa ADN-ului mitocondrial.

60
 Prin fecundatie si constituirea zigotului, zigotul care contine
preponderant ADN-ul cromozomial nuclear de dubla origine (23 |
cromozomi din ovul si 23 cromozomi din spermie- zigotul devenind celula
diploida), contine si o cantitate suplimentara de ADN. Deoarece ADN-ul
suplimentar mitocondrial este de origine materna, la copil apar unele
■nsaturi de caracter apropiatc de ale mamei. Sunt caractere transmise
uniparental, sunt nemendeliene.
Acest tip de transmitere a caracterelor uniparental, materne este
Hnnoscut si sub denumirea de ereditate matroclina sau materna.
Genitorul patern nu transmite acest tip de ADN citoplasmatic.
Citoplasmonul nu se formeaza de novo. El se formeaza prin
replicarea iinui organit „preexistent" ancestral ca rezultat al unor simbioze
realizate in cursul evolutiei biologice, care au avut loc intre eucariotele si [
procariotcle ancestrale (arhaice).

6.3. Mutatii in genomul mitocondrial si efecte induse

Datorita incapacitatii de reparare, sau o reparare limitata si

incompleta (in raport cu genomul nuclear), ADN-ul mitocondrial poate fi
[supus niecanismelor mutationale, mutatii induse de actiunea factorilor
potential mutageni, de origine exogena sau endogena.
Dupa Farland (2001), Pascale de Lonloy (2001), Saado (2001),
Ehonbridge (2001). s.a., mutatiile mitocondriale reprezinta o cauza
■portanta a bolilor umane pe fond genetic.
In conditii normale, ADN-ul mitocondrial codifica polipeptide
implicate in sistemele de fosforilare oxidativa (lantul respirator) ale celulei.
Sunt procese care asigura energia necesara activitatii tuturor tesuturilor si
^■nelor din organism (exemple: sistemul nervos, muscular, etc.) ADN-ul
pitocondrial codifica si sinteza moleculelor de ARNt si ARNr (fig. 16).
I ADN-ul mitocondrial este implicat, prin functia de determinism genetic la:
[sinteza hem-ului, in procesele de detoxifiere a amoniacului din ciclul
Bireogenetic, in procesele de oxidare a grasimilor, dar si in fazele initiale ale
j apoptozei celulare.
In conditii de mutageneza, mutatia genelor mitocondriale induce
Iboli din grupul bolilor degenerative, ca: miopatiile, encefalopatiile, [
epilepsia mioclonica, neuropatii, etc.
De exemplu, Mc Farland si col. (2001) au studiat sindromul Leigh,
Berminat genetic de mutatii in secventele moleculei ADN-ului I
mitocondrial. Autorii au identificat cinci modificari in structura ADN-ului

61
mitocondri
al,
considerate
modificari
polimorfice
de
secventa.
Aceste
modificari
polimorfice
indue
encefalopat
ie necrotica
subacuta,
miocardiop
atie
hipertrofica
cu efuziune
pleurala
bilaterala,
precum si
scaderea
activitatii
citocrom C
oxidazei
(Cox) in
muschii
scheletici si
cardiac.
In
trecut,
unele
anomalii
erau
considerate
boli cu
specificitate
de organ.
Cercetarile
recente
accepta
ipoteza
mutatiilor
in ADN-ul
mitocondria
l, pe care
Mc Farland
le considera
mutatii
homeoplas
mice.
Sun
t cerectari
care au
identificat
proteine
modificate
in lantul
respirator
mitocondria
l,
consecinta
mutatiilor
in ADN-ul
mitocondria
l.
Asemenea
proteine
modificate
indue
disfunction
alitati, cum
ar fi:
deficienta
complexulu
i III (Cm
ubiquinol-
citocrom C-
reductaza)
din lantul
mitocondria
l, care in
mod
normal,
catalizeaza
transferul
de electroni
de pe
succinat si
nicotinamid
-
adenindinuc
leotid, legat
de
dehidrogen
aza.
Bolnavii cu
disfunction
alitati ale
complexulu
i Cm,
manifesta
mioencefal
opatie si
miocardiop
atie
(Pascale de
Lonay si
col, 2001).
Un
studiu
interesant
apartine lui
Rovio si
col. (2001)
care au
stabilit o
corelatie
intre
mutatiile
ADN-
polimerazei
mitocondri
ale umane
si
infertilitate
a
masculina.

62

NU ARE LOC
SEGREGARE
CITOPLASMA
TIC A
 MATERNA
(MATROCLINA)

Fig. 76 ADN-ul MITOCONDRIAL sau CITOPLASMATIC

7.Replica rea ADN-ul ui

Diviziunea celulara si reproducerea organismelor asexuate si

sexuate implica transmiterea integrala a informatiei genetice de la o
generatie la generatiile care succed.

GENELE
PENTRU
ARNr
63
 Cercetatorii au intuit si au demonstrat ca rolul primordial in I
mentinerea si transmiterea informatiei genetice il are ADN-ul din genomul
organismelor procariote sau eucariote.
De exemplu, Pauling (1962) mentiona: „...dintre toate sistemele
naturale, omul, ca toate fiintele vii, este acela care prin intensele sale
transformari, pastreaza cea mai mare parte a propriei sale treceri istorice in
organizarea sa. Se considera ca nu exista alt sistem, cum este eel biologic,
care sa fie mai constant suprimat si simultan mentinut, si ca este suficienta
ne interoga genetic pe noi insine pentru a sti in care din sistemele vii
structurale s-a realizat trecerea istorica."
In 1953, Watson si Crick, pe baza complementaritatii bazelor
azotate din dublul helix al ADN-ului, demonstrata de Chargaff, au facut
urmatoarea remarca: „...se poate remarca urmatorul aspect: existenta
postulata a perechilor specifice (complementare) sugereaza imediat un
mecanism posibil de copiere a materialului genetic."
Cei doi cercetatori, Watson si Crick ( laureati ai premiului Nobel in
1953), rezuma astfel replicarea ADN-ului celular: „modelul nostru de ADM
este de fapt constituit din perechi tipar de nucleotide, fiecare complementare
intre ele. Noi credem ca inainte de replicare legaturile de hidrogen se rup si
ca cele doua lanturi se desperecheaza si se separa. Fiecare lant joaca rol de
tipar pentru formarea unui nou lant complementar, pe care, secventa de
nucleotide a lantului vechi va fi riguros respectata pe catena nou formata."
Conform ipotezei lansata de Watson si Crick, replicarea moleculei
ADN este de tip semiconservativ. Catenele se separa asemanator desfacerii
unui fermoar (de aici si denumirea „ipoteza fermoarului" lansata de cei do:
cercetatori). Fiecare catena ce se separa din molecula in replicare va servi
ca matrita (template) pentru sinteza catenei noi, care complementar se vor
cupla rezultand doua molecule. Fiecare molecula va avea o catena veche si
una nou sintetizata. Moleculele rezultate sunt identice intre ele dar identice
si cu molecula ADN initiala de la care a inceput replicarea.
Ceea ce Watson si Crick au intuit ipotetic, cercetarile ulterioare au
confirmat corectitudinea: replicarea este de tip conservativ.
Replicarea semiconservativa a ADN-ului a deschis cai noi in
cercetarea genetica, in general si in patologia umana, in special.

64
 7.1. Principiul si mecanismul replicarii

Proprietatea autocatalitica, respectiv replicarea moleculelor de ADN.

este caracteristica pentru toate organismele eucariote. Sinteza ADN-ului
respecta trei reguli:
a) Sinteza ADN-ului este copierea semiconservativa a ADN-ului in curs
de replicare, cu respectarea principiului complementaritatii bazelor, stabilit
de Chargaff si demonstrat ca structure secundara a ADN de catre Watson si
Crick.
b) Sinteza ADN-ului pe catenele „matrita"se realizeaza numai in directia
5'-3' deoarece legaturile fosfodiesterice au directie defmita chimic : 5'(fosfat)
terminal si 3'(hidroxil) terminal. Desfacerea lanturilor cu ruperea puntilorde
hidrogen este dezavantajata energetic dar este condusa energetic spre ATP.
c) Enzimele polimeraze catalizeaza elongarea catenelor care se cupleaza
complementar pe catenele matrita completand moleculele ADN in replicare.
Replicarea este semiconservativa. Fiecare molecula rezultata va contine o
catena veche (matrita) si o catena nou sintetizata (complementara pe matrita).
Fiecare diviziune celulara este precedata de replicarea „corecta" a ADN-
ului genomic.
Modelul Watson-Crick prezice existenta „furcii de replicare" in cursul
sintezei ADN-ului (fig. 17).
Furca de replicare s-a studiat la procariote cu ajutorul atomilor marcati
cu timidina tritiata. Autoradiografiile obtinute asupra dinamicii replicarii
ADN au fost examinate la microscopul electronic (J. Coirns,1963).

65
 Catena replica Uf contlnuu
(eaten* conductoare)
ADN
ligaza
Replicare discontinue prin
fragmente Okazaki)

Fig. 17 Replicarea ADN

„Furca"de replicare. Replicarea ADN

se poate produce numai in directia 5'-3'. Un
lant ADN se poate sintetiza continuu pe
directia 5'-3'.Celalalt lant este sintetizat
fragmentat (fragmente Okazoki), care apoi
Direcjia de deplasare a sunt sudate in prezenta ADN-ligaza, pentru a
furcii de replicare alcatui un lant complet.

7.2. Metode de studiu

Pentru a demonstra ca ADN-ul se replica semiconservativ sunt

folosite variate metode dintre care mentionam:
a) autoradiografia cu examinarea imaginilor la microscopul
electronic ;
b) ultracentrifugarea in gradient de densitate.

a) Microscopia electranica. Primele incercari de vizualizare a|

replicarii semiconservative apartin lui Coirns (1962). El a demonstrat
Escherichia coli, ca replicarea are un punct de initiere, de la care procesul
progreseaza pana cand apar doi cromozomi inelari in celula bacteriana.

66
 Prin folosirea BrdU (brom-deoxi-uridina), precursor de sinteza
analog timidinei, sau prin folosirea timidinei tritiate (3H), s-a analizat
incorporarea acestora in moleculele ADN nou sintetizate. Cu ajutorul
microscopului electronic s-a observat ca, incepand cu punctul de initiere
incepe ruperea puntilor de hidrogen. Acest proces progreseaza
unidirectional punctului de initiere sau bidirectional (fig. 18).
Moleculele care vor rezulta prezinta catenele „de novo" diferit
colorate fata de catenele matrita si ami me:
-catena matrita se prezinta de culoare inchisa (intunecata);
- catena nou sintetizata va fi de culoare deschisa datorita
incorporarii nucleotidelor marcate.
Aceasta metoda are aplicabilitate in studiul genomului uman in
testarea mutagenitatii chimice.

Replicare 100
(Orpine de
replicare) kb
I
____f%___
Czr~
Direc|ia
de
replicar
Fig.18

b) Experimentul Meselson si Stahl. Mecanismele si procesele

implicate in replicarea moleculelor ADN la procariote si eucariote au fost
elucidate folosindu-se mutanti, „conditionale", care influenteaza efectele
secundare (fenotipica) in conditii speciale.
Contributie speciala la studiul replicarii semiconservative a ADN-
ului genomic au avut Meselson si Stahl (1958) prin experientele la
procariote.
Cei doi cercetatori au elaborat o metoda de masurare a densitatii
moleculelor de ADN hibride. Ei au folosit pe cale fizica separarea
densitatilor de diferentiere. Metoda elaborata confirma „in vivo" ca
molecula ADN se replica semiconservativ, conform srtucturii dublului

67
 Principiul metodei: cand diverse molecule se supun I ultracentrifugarii
prin folosirea unei solutii concentrate de CsCl, conform I gradientului de densitate,
separarea si repartitia moleculelor se va realiza I conform principiului: in fiecare
punct concentratia si repartitia in CsCl a I moleculelor este in functie de fortele de
gravitatie ale moleculelor supuse I centrifugarii.
Moleculele cu concentratie si masa moleculara mare se dispun la I fundul
eprubetei de ultracentrifugare, iar cele cu concentratie mica spre supra fa la
lichidului.
ADN-ul, molecule cu masa moleculara diferita, prinl ultracentrifugare se
stratifica in benzi in CsCl.
Aparitia benzilor ADN in gradient de densitate in CsCl este j rezultatul a
doua forte antagoniste:
- forta de gravitatie, care are tendinta de a sedimenta moleculele de
ADN;
- fortele de sens contrar, prin care moleculele ADN se dispun in benzi,
in raport cu masa moleculara.
Dispunerea stratificata in benzi este in relatie cu difuziunea termica a
moleculelor ADN.
Concentratiile moleculelor ADN (in raport cu numarul generatiilor ce au
succedat hibridizarii moleculare) se vor dispune bandat in gradientul de densitate.
In functie de valoarea medie si in raport cu generatia cercetata, distributia este
gaussiana.
Cand tubul de ultracentrifugare contine un amestec de molecule ADN cu
masa moleculara diferita, aceste molecule vor stratifica la nivele diferite in
concentratia de CsCl, formand benzi distincte (fig. 19). Fiecare banda poate fi
analizata la spectrofotometru sau autoradiografic, rezultatele putand fi exprimate
si grafic.
Meselson si Stahl, folosind culturi de Escherichia coli si izotopi de atomi
de azot diferit marcati, au demonstrat experimental replicarea semiconservativa a
ADN :
a) Au cultivat celule de Escherichia coli pe un mediu de cultura marcat
cu "N, care este un azot greu. In timpul sintezei ADN-ului, precursorii marcati cu
N sunt incorporati in catenele nou sintetizate, cuplandu-se complementar cu
catena tipar (provenita din molecula initiala in curs de replicare).
In acest mediu marcat cu 15N, bacteriile sunt mentinute mai multe
generatii pentru a avea certitudinea ca ambele catene, ce vor rezulta cuplate
complementar intre ele, vor fi marcate cu l5N.

68
 ;

A unnat extragerea ADN-ului din coloniile de E. coli dezvoltate pe

mediul de cultura si supus ultracentrifugarii in gradient de densitate intr-o
soluticde CsCl. Deoarece aceste molecule au incorporat in timpul sintezei
numai precursori marcati cu azot greu ~N, ADN-ul cu masa moleculara mai
mare (un ADN grcu), fata de ADN-ul nemarcat (natural), prin
uliracenlrifugare, se va strati Ilea in partea inferioara a tubului de
centrifugare. ADN-ul se dispune sub forma unei benzi in regiunea de
concentratie a CsCl din tub, care este egala cu densitatea sa de plutire (fig.
19).
b)Un experiment asemanator au efectuat cu Escherichia coli, numai ca
mediul de cultura a fost marcat cu azot usor l4N. Dupa o suita de generatii
celulare si replicari ale ADN-ului din genomul procariotic, supune ADN-ul,
care prin sinteza a incorporat l 4 N (azotul usor) ultracentrifugarii in gradient de
densitate in CsCl. Deoarece aceste molecule au incorporat azot usor N , masa
moleculara fiind mai mica (este un ADN usor), se vor stratifica in partea
superioara a tubului, form and o banda distincta si jdistantata fata de banda
15
N. Este banda ADN l4N (fig. 19).
c) dupa stabilirea gradientului de densitate 15N si 14N, au elaborat
urmatorul experiment: un mediu de cultura (mediul III) marcat cu azot usor
ftpe acest mediu a insamantat E.coli din mediul 1 care a fost marcat cu
Dt greu 15N. Pe mediul III, E. coli s-a dezvoltat un interval de timp
corespunzator unui singur ciclu celular (o generatie procariota). In consecinta
si ADN-ul genomic procariotic s-a replicat o singura data. Au extras acest
ADN, 1-au supus ultracentrifugarii in gradient de densitate cu CsCl.
Rezultatul a fost urmatorul: aparitia unei benzi de ADN localizat
I'intermediar ca distanta fata de banda 15N si banda 14N. Este un ADN hibrid
care este structural din dona catene : o catena '^N si una ,4N (,5N/14N) j ( f i g .l 9 ) .
 G enerative "0"
M arcare N 15 M a rca reN l4

G e n era tiaT V

A D N extras

1
1
/\
A D N extras

N14
N14
N14
ADN
hibrid N 14 5 0%

N15
Uitfacentfifuaare in CsCl Fig. 19 Etapele experimentului Meselson-
Stahl la Escherichia coli.

d) Au continuat experimentul folosind mediul IV, marcat tot cu azoi

usor 14N, pe care a insamantat E.coli recoltata din mediul III. Pe aces: mediu
bacteriile au fost mentinute tot o singura generatie. ADN-ul extras si supus
gradientului de densitate prin ultracentrifugare in CsCl s-a stratificai astfel : 50%
in zona mediana a tubului (ADN hibrid 15N/14N) si si 50% in zona gradient 14N.
Nicio molecula ADN nu a fost identificata la gradientul ,5N. Acest ADN ar
corespunde genomului din generatia a II-a a bacterid E.coli.

70
Explicatia data de Meselson si Stahl este urmatoarea (fig.20):

Generatia F2

16N
15N
Generatia"0" ADN marcat 15N

Fig.20 Mecanismele etapelor replicarii ADN dupa Meselson-Stahl

La sfarsitul generatiilor F0, dupa o suta de replicari aleADN-ului

genomic, pe parcursul mai multor generatii celulare, intreg ADN-ul
continea catenele marcate: pe mediul I cu l5N (15N/15N) iar pe mediul II cu
l4
N(l4N/l4N).
I 4,
Trecandu-se E. coli de pe mediul I pe mediul III marcat cu N, unde
s-a mentinut o singura generatie celulara, deci o singura replicare, ADN-ul
rezultat este un ADN hibrid cu o catena marcata cu l5N, a doua marcata cu ,
4
N (ADN hibrid 15N/14N). In consecinta masa moleculara este
14 15,
,3
diferita de a ADN-ului N si '*N. Va avea o masa moleculara intermediara
celor doua gradiente 1:,N si l4N. Deci ADN-ul marcat continea o catena

71
veche marcata cu 15N si o catena noua complementara in raport cu cea
veche, dar marcata cu 14N. Masa moleculara este media masei molecularea
ADN-ului 15N si 14N. ADN-ul hibrid, dublu catenar, rezultat prin replicare in
primul ciclu celular (Fi) prezinta un raport de 1:1 intre catenele 15N si 14N
pentru fiecare molecula de ADN. Acest raport se obtine numai in conditiile
cand sinteza ADN este semiconservativa.
Pentru esantioanele de ADN extras din generatiile F2, F3,...etc,
raportul intre moleculele hibride ADN 15N/14N si ADN-ul cu ambele catene
marcate 14N (conform experimentului fig. 19) va creste in progresie
geometrica in favoarea ADN-ului 14N.
O remarca : raportand numarul catenelor marcate cu N si N din
ADN-ul generatiilor Fi,F2,F3,...etc.,se observa un „raport mendelian"
(fig.20).
Experimentul Meselson si Stahl permite urmatoarele evaluari:
- ADN-ul celular se replica semiconservativ;
- Continutul relativ egal intre G si C, si respectiv intre A si T;
- Separarea ADN-ului nativ dublu helicoidal, de ADN-ul denaturat
non helicoidal;
- Studierea denaturarii si renaturarii ADN-ului;
- Separarea ADN-ului nuclear (cromozomial) de ADN-ul
mitocondrial (citoplasmatic). ADN-ul mitocondrial are o componenta
diferita in bazele azotate, fata de ADN-ul nuclear.

7.3. Enzime si proteine implicate in replicarea ADN

La organismele procariote si eucariote sunt identificate urmatoarele

complexe enzimatice implicate in mecanismele replicarii si sintezei
moleculelor ADN:
- ADN polimeraza I este denumita si enzima Romberg. Estd
enzima monomerica, cu o masa moleculara de 103 Rd. Lantul polipeptidic
al enzimei poate fi clivat in doua segmente : produsul mare de clivare de 68
Rd, denumit si fragmentul Klenov si fragmentul mic de clivare de 35 Kd. 1
Fragmentul mare are actiune polimerazica si exonucleazica 3'-5',
iar fragmentul mic are functia exonucleazica 5'-3', si care excizeaza
grupuri mici de nucleotide (segmente polinucleotidice mici).
Ca rol ADN polimeraza I intervine in mecanismele de replicare si
corectare a erorilor ce apar in timpul formarii catenei de „novo". Este
enzima care introduce primul dezoxiribonucleotid la capatul 3'-0H al
primerului ARN, cand incepe sinteza de „novo". Dupa cuplarea
72
nucleotidului la pozitia 3'OH al ARN primer, ADN polimeraza I se
decupleaza si intra in functie catalitica enzima ADN-polimeraza III, care
asigura elongarea lantului polinucleotidic al catenei de novo care se
smtctizeaza.
ADN polimeraza I este implicata in alungirea fragmentelor
Okazoki.
ADN polimeraza I, ca enzima moderat progresiva, are si rol
exonucleazic de tip 3'-5' si 5'-3', determinand si o hidroliza a unui lant
ADN. polimerizand segmente pana la 10 nucleotide.
Actiunea exonucleazica 3'-5' corecteaza erorile posibil aparute in
timpul sintezei catenei de „novo", iar actiunea exonucleazica 5'-3'se
materializeaza prin sinteza catenei de „novo" prin indepartarea ARN
primer.
- ADN polimeraza II - Rolul este putin cunoscut dar este si ea
implicata in replicare.
- ADN polimeraza III - Catalizeaza (replicarea) sinteza ADN-ului
directionata de matrita ADN. Este enzima inalt procesiva polimerizand
aproximativ 1000 de nucleotide. Pentru a asigura aditia precursorilor
dezoxiribonucleozizi-trifosfat, enzima necesita prezenta unui primer ARN
cugruparea 3'-OH libera. ADN polimeraza III asigura sinteza catenei de
„novo" in directia 5'-3\ rol important in sinteza. Aceasta enzima este
multimerica. Holoenzima este un caomplex de 900 Kd.
Daca la procariote sunt implicate ADN polimerazele I, II si III, la
eucariote s-a identificat un important complex enzimatic implicat in
replicare.
La eucariote sunt implicati mai multi factori in replicarea ADN-ului,
iarcomplexul enzimatic cu rol catalitic este reprezentat de enzimele:
- ADN polimeraza de tip a (alfa). Are o structura complexa
formata din mai multe subunitati, toate implicate in replicarea ADN-ului.
Masa moleculara variaza intre 110-220 Kd.
Argumentele care intaresc ipoteza ca ADN polimeraza a are rol
major in replicare sunt urmatoarele:
- blocarea activitatii polimerazei a cu aphidicolina (drog), sinteza
ADN-ului este stopata ;
- mutantii conditionali ai genei ce actioneaza la temperatura de 42°C
(temperatura nepermisiva), enzima nu se mai implica in replicarea ADN-
ului;
- enzima nu are activitate 3'-5' exonucleazica.
Enzima a polimerazica, pe langa activitatea de tip ADN
polimerazica are si o activitate primazica.

73
 - ADN polimeraza p (beta). Este localizata in nucleul celulei
eucariote. Are o masa moleculara de 45 Kd. Activitatea catalitica se
cupleaza cu repararea ADN-ului cand apar erori in replicare. Activitatea de
reparare a erorilor asigurata de ADN polimeraza (3 se cupleaza cu
polimeraza 8 (epsilon).
- ADN polimeraza 8 (delta). Are proprietati apropiate de
polimeraza a si impreuna pot fi identificate la nivelul complexului de
initiere a replicarii ADN. Deoarece inhibitorii sunt comuni si cu efecte
asemanatoare cu cele ale tipului a, se presupune ca cele doua enzime ar
avea un precursor comun. Activitatea importanta a polimerazei 8 este 3'-5'
exonucleazica. Pentru ca enzima polimerazica sa fie activa (conditional)
este necesara prezenta cofactorului ciclina sau PCNA (prolifferating cell
nuclear antigen). Concentratia polimerazei 8 este crescuta in stadiul
interfazic „S".
- ADN polimeraza y (gama). Este identificata in mitocondrie. Are o
masa moleculara de aproximativ 60 Kd. Este implicata in replicarea ADN-
ului mitocondrial. Se crede ca activitatea sa este corelata cu o gena
cromozomala din nucleu.
- ADN polimeraza £ (epsilon). Ca si polimeraza p, aceasta enzinr
are rol important in repararea erorilor sau a mutatiilor punctiforme ce ap-in
timpul replicarii ADN-ului.
Alte complexe enzimatice implicate in replicarea moleculelor AD
sunt:
- ADN helicazele - care separa catenele complementare al
moleculei in curs de replicare. Activitatea acestui complex enzimati
necesita o sursa energetica asigurata de prezenta ATP-ului. Aceste belie*
asigura inaintarea ruperii puntilor de hidrogen si despiralizarea catenelor*
zona furcilor de replicare.
- ADN topoizomerazele I si II . Despiralizeaza helixul ADN-ul
sectioneaza catenele la nivelul axului fosfodiesteric, deruleaza molecu
dupa care resudeaza fisura produsa in respectivele catene. Topoizomeraza
sectioneaza o singura catena din ADN-ul in replicare. Topoizomeraza
sectioneaza ambele catene ale ADN.
- ARN primaza sau ARN polimeraza. Este enzima c*
sintetizeaza secvente scurte de ARN - amorsa implicate in sinteza no"
catene de ADN.
- ADN ligaza - este enzima care catalizeaza legatura fosfodiest
intre 3'-OH de la un capat al unei catene ADN si gruparea 5'-fosfat de
capatul catenei complementare a ADN-ului dublu helix. Reactia absoarbe
energia data de NAD (nicotinamid adenindinucleotid) si de ATP.

74
 In replicarea ADN-ului sunt implicate proteine de tipul:
- Proteina dnaA - declanseaza despiralizarea dublui helix al
moleculei ADN si initiaza sinteza ARN-primer sau ARN-ul amorsa;
- Proteina dnaB - coparticipa la declansarea despiralizarii dublului
helix;
- Proteina rep (helicaza) -deasemeni coparticipa la despiralizarea
dublului helix;
- Proteina SSP (Single Strand binding-protein) - dupa ce puntile
dehidrogen au lost rupte si s-au scparat catenele polinucleotidice ale
ADN-|ului, aceasta proteina stabilizeaza monocatena.

7.4.Mecanismul molecular de replicare a ADN-ului

Ul.Etapele sintezei moleculei ADN.

a)Despiralizarea ADN-ului in curs de sinteza. Procesul incepe

de
kstusul de origine al replicarii. Zona este denumita situs „oriC",
avand o
lungime de aproximativ 245 pb. Pentru inceperea si controlul
replicarii
moleculei ADN, metilarea adeninei din secventa GATC este
esentiala.
Situsul „C" se va cupla cu proteina dnaA, formand complexul
care declanseaza reactiile de despiralizare a ADN-ului, initiind si
sinteza ARN-primer. Sinteza ARN-primer se face prin activarea
enzimei ARN-primaza. [Reactiile initicrii si activarii situsului de
origine „C" sunt amplificate de Iproteinele dnaB si de helicaza.
b)Stabilizarea monocatenelor. Prin ruperea puntilor de
hidrogen
si separarea monocatenelor, pe segmentele unde s-a produs
despiralizarea,
monocatenele sunt mansonate de proteinele SSP. Prin mansonare
monocatenele devin stabile fara a se mai recupla.
c) Sinteza ARN-primer (amorsa). Primaza este enzima care
asigura sinteza ARN-primer. Dupa sinteza ARN-ul primer se
localizeaza la
situsul de initiere, unde incepe sinteza catenei de „novo", care,
impreuna cu
catena complementara - matrita, va construi viitoarea molecula
ADN.
r Laprocariote este un singur situs de initiere pentru replicarea
ADN-j u l u i .
La eucariote, datorita complexitatii genomului (prin numar
cromozomi si cantitate ADN) sunt mai multe situsuri de initiere la
nivelul aceleiasi molecule ADN.

75
 Initiata replicarea si ruperea puntilor de hidrogen, prin separarea
monocatenelor complementare, progresiv, se formeaza „furca de replicare"
(fig. 21).
La eucariote furca de replicare este bidirectionata, in sensul ca
ruperea puntilor de hidrogen, despiralizarea si separarea progresiva a
catenelor complementare din ADN sunt directionate in ambele sensuri
(sensuri opuse) ale moleculei in replicare.
Fig. 21 Mecanismul si enzimele implicate in sinteza ADN la E.coli (furca de
replicare)

76
 d) Sinteza lantului pleading si logging4". ') Dupa initierea separarii
catenelor „matrita" a ADN-ului in replicare, sinteza catenelor de „novo"
complementare in raport cu catenele matrita este neuniforma (Kornberg,
1968). Kornberg a observat ca pe catena matrita cu esterificarea 5' - 3',
sinteza catenei „de novo" urmeaza un flux continuu (leading)- este lantul
conducator. Pe catena „matrita" din ADN cu esterificarea in sensul 3'-5',
[sinteza este discontinua. Este lantul Jogging" - intarziat sau discontinuu .
- Sinteza pe catena leading - in prezenta ARN-primer cuplat la furca de
replicare, ADN-polimcraza III incepe esterificarea si cuplarea in flux
continuu a nucleotidelor pe matrita a carei esterificare este directionata in
ordinea 5'-3'. Pentru formarea catenei de nuovo, coparticipa helicaze, ATP,
proteina SSP si giraza ncgativa (enzima care asigura supraspiralizarea unor
nolecule). Pe masura ce se esterifica nucleotidele pe catena de nuovo, ele se
vor cupla complementar cu nucleotidele prezcnte pe catena matrita,
finalizand progresiv molecula de ADN.
- Sinteza pe catena logging - Pe catena la care esterificarea este
[directionata in ordinea 3'-5' sinteza este diferita fata de catena leading. Pe
aceasta catena esterificarea si sinteza catenei „de novo" este discontinua :
complexa si intarziata.
Deoarece sinteza catenei „de novo" se face sub actiunea enzimei ADN-
polimeraza III numai in directia 5'-3', pe catena matrita esterificata 5' sinteza
este complexa cu participarea unor factori si mecanisme particulare. Cel care
a descifrat mecanismul sintezei pe catena logging a catenei „de novo" a fosl
Okazaki. El a demonstrat ca pe catena logging sinteza are loc pe fragmente
polinucleotidice. Sinteza este fragmentara. ■cesul se demleaza astfel: ADN -
polimeraza III realizeaza esterificarea B' a unui fragment polinucleotidic, al
carui numar de nucleotide poate variaintre 1000 si 2000. Sunt fragmented
Okazaki. Pentru esterificare si ■ca fragmentelor Okazaki este necesara
prezenta ARN-amorsa (primer). Pe acest ARN-amorsa se asambleaza
nucleotidele in directia 5'-3' 1 , 2 1 ) .

Leading= lantul „conducator", cu sinteza continua a

ADN; Log ging = lantul „intarziat", cu sinteza
discontinua a ADN.

77
7.4.2.Replicarea ADN si modelul aditiei primerilor

Structura antiparalela a catenelor din molecula ADN in curs de

replicare „complica" mecanismul sintezei catenelor „de novo".
Este demonstrat ca prin avansarea separarii catenelor „matrita" cu
formarea furcii de replicare, catenele „de novo" se sintetizeaza pe ambele
catene „matrita". Dar furca de replicare prezinta pe un ram esterificarea in
directia 5'-3' iar pe al doilea esterificarare in directia 3'-5'. Cum sinteza
catenelor „de novo" necesita prezenta ARN-primer (amorsa), acest ARN-
primer urmeaza urmatoarele etape de formare si cuplare pe catena „matrita" a
ADN-ului in replicare:
- pe matrita ADN se sintetizeaza o secventa de ARN-primer.
Capatul 3'-OH al ARN-primer este elongat de o ADN-polimeraza;
- ARN-ul preformat se cupleaza cu matrita ADN, ceea ce permite
propriului capat;
3'-OH sa fie folosit in sinteza ADN;
- un capat al ARN-primer generat in duplexul ADN este implica!
intr-un mecanism elementar de producere a unei incizii;
- in reactia directa de identificare a unui nucleotid cu participarea
ADN-polimerazei III, primeaza proteina.
Pe catena matrita „leaging" sinteza catenei „de novo" avanseaza in
directia 5'-3', iar pe catena „logging" sinteza se extinde pe directia 3'-5',CB|
formarea de fragmente scurte care sunt sintetizate (in prealabil) pe directia
5'-3'. Aceste fragmente monocatenare pot fi ulterior extinse in directie
inversa fata de deschiderea furcii de replicare. Aceste fragmente
(fragmentele Okazoki) pot fi marcate, analizate si urmarite in dinamica
procesului de replicare si sinteza a ADN-ului.
Datorita diferentelor de sinteza intre catenele „leading" si Jogging"
sunt consemnate urmatoarele particularitati:
- lantul polinucleotidic pleading" necesita prezenta unui singiu
ARN-primer;
- lantul polinucleotidic clogging" solicita prezenta unui numar mare
de molecule ARN-primer.Numarul mare de molecule ARN-primer pentn.
catena logging este determinat de numarul fragmentelor Okazoki ce se
formeaza pentru sinteza ADN cu matrita esterificata in directia 3'-5'. Este
demonstrat ca fiecare fragment Okazoki incepe sinteza in prezenta unui
ARN-primer. De retinut ca aceste molecule ARN-primer au dimensiuni
foarte mici, continand circa 10 baze lungime.

78
 Sinteza moleculei ARN-primer este catalizata de enzima ARN-
Ipolimeraza, enzima determinata genetic de gena dnaG.

7.5.Etape in sinteza catenelor „de novo" in replicarea ADN

In 1970 Temin si Baltimore au demonstrat transcrierea „inversa"

ARN'->ADN in timplul replicarii si sintezei moleculei de ADN. Ei au
Herimentat pe ribovirusul Rauscher pentru leucemia murina si pe
)ribovfrusul sarcomului Raus. Incuband acesti virusi in prezenta
■HP(d-nucleozid trifosfat) a ionilor de Mg2+ sau de Mn2' au obtinut un
iimer ADN sensibil la hidroliza cu dezoxiribonucleaza. Autorii au
Hat ca prin tratarea amestecului obtinut din respectiva hidroliza cu
nbonucleaza, sinteza ADN-ului nu avea loc. Bazandu-se pe aceste rezultate
pnin si Baltimore au emis ipoteza ca ARN-ul viral este esential pentru
■Dlimerizarea si sinteza ADN-ului.
I Acest experiment elaborat de Temin si Baltimore a evidentiat ca
..ADX-polimeraza dirijata de ARN" sau „transcriptaza inversa" este enzima H
foloseste ARN-ul, hibrizii ARN-ADN si ADN-ul ca matrita pentru
■carea ADN-ului din genomul celulelor.
[ Enzima „transcriptaza inversa" a fost izolata din oncovirusuri din
Alele umane si murine (precum soareci, sobolani). La om si murine
■area transcriptazei inverse s-a realizat atat din celule normale cat si din |
cclulc canceroase.
[ Mecanismul de actiune a transcriptiei inverse este prezentat
ftnatic in fig. 22. 23. schema elaborata de Watson. loose si Kurtz in 83
(..Recombinant DNA").

79
 ADN giraza de reducere a spiralizarii
ADN(despiralizarea)

Helicaza de despiralizare a ADN Proteina SSB de conversie a

singurei catene ADN

Primozomul forma primara

Holopolimeraza III

Topoizomeraza de
relaxare a tensiunil
SSB Proteina deplasata
de catena in crestere

Catena
intarziata
ndepartarea primerulw
si completarea spatiulii

Polimeraza
Catena Leading rapida
(conducatoare)

Ligaza

Fig. 22 Factorii implicati in replicarea ADN-ului (proteinele implicate) dupa

Adams si col. 1992, si reprodusa dupa Clark si Wall, 1992.

80
 ARN Termina
te poliA
5' 3" (poliade
ninicS)
AAAA
AAAA
TTTT
flevers transcriptase Primer
oligotimidinic virala"
i
ADNc AAAAAA
c—■ AA TTTT
B u c I S "ac de
par*

NaOH

e i
TTTT

ADN poiimeraza I

i
ADNc '
£
\
Nucleaza* SI

/;;'. JJMecanismul transcriptiei inverse.

Analizand etapele transcriptiei inverse in sinteza ADNc dublu

catenar, cu implicarea ARN- primer, se poate stabili urmatorul mecanism:
terminatia poliadenilica din catena ARNm este hibridizata cu o
catena scurta oligotimidinica. Secventa oligotimidinica serveste ca primer
pentru actiunea revers-transcriptazei ce foloseste catena ARN ca „matrita"
pentru sinteza catenei ADNc (ADNc= ADN complementar);
ADNc rezultat prezinta terminal o bucla in „ac de par";

81
c) prin degradarea ADNm cu NaOH, bucla terminala a ADNc devine
„primer" pentru enzima ADN-polimeraza I;
d) in prezenta nucleazei Si, bucla este clivata rezultand molecula de
ADNc dublu catenara.
Proprietatea revers transcriptazei (transcriptaza inversa) de a sintetiza
ADN-ul cu ajutorul matritei de ARNm, este folosita la sintezele artificiale ale
genelor, pornind de la un ARN-mesager corespunzator („complementar"
structurii unei gene). Se mai foloseste la sinteza ADN-c ca sonda moleculara.
Steele (1979) sugereaza ca ARNm din mutatiile somatice poate fi
grins'' (acrosat) de un virus si transferat in gonade, iar cu ajutorul revers-
transcriptazei sa produca ADN-c, care poate fi integrat in genomul celulelor
gametice. Ipoteza lui Steele ar sustine rationamentul cu privire la mecanismul
genetic de mostenire a caracterelor dobandite in cursul vietii individului.
Desi ordinea etapelor nu este bine cunoscuta in totalitatea proceselor
implicate, pot fi considerate urmatoarele etapizari:
- sinteza ARN-primer;
- extensia sa cu ADN-ul;
- indepartarea ARN-primer si inlocuirea lui cu un fragment ADN-
complementarizat(ADNc) de ARN-ul primer;
- legarea (covalenta) fragmentelor Okazaki adiacente.

ARN-ul primer este sintetizat de un primozom, care este un complex

proteic format din:
- ARN potimeraza - ADN dependenta, enzima denumita primaza
care este codificata de gena DNA-G
- doua proteine codificate de genele DNA-B si DNA-C. Sunt proteine
care se asociaza cu primaza;
- proteinele i, n, n', n" si care recunosc loculde sinteza ARN-primer.
Primozomul exercita rolul in sinteza ARN-primer implicat in
procesele urmatoare:
- pe masura ce helicazele actioneaza pentru ruperea puntilor de
hidrogen si separearea monocatenelor complementare din structura ADN-
ului in replicare, proteinele SSB, care mansoneaza catenele pentru a nu se
recupla, nu mansoneaza ultimul segment al catenelor complementare, care
va prezenta forma unui „ac de par". Acest ultim segment va fi recunoscut
de primozom. Este segmentul unde se initiaza sinteza ADN-ului.

82
 Initierea sintezei ADN-ului in prezenta primozomului si a ARN-
primer, catalizata de ADN-polimeraza III, incepe la extremitatea 3'-OH
libera a moleculei de ARN-primer. Sensul esterificarii si de cuplare a
nucleotidelor ce vor structura catena „de novo'Va fi 5'-3\ Pe masura ce se
sintetizeaza catena „de novo" si cuplarea complementara cu catena matrita,
proteinele SSB sunt indepartate.
Acest proces se deruleaza pe catena leading.
Pe catena logging, unde procesul este discontinuu, in esterificarea 5'-
3' si formarea catenei „de novo", sunt implicate variante ale enzimei ADN-
polimeraza III, deoarece aceasta enzima este compusa din subunitati
functionale, care sunt codificate de gene diferite.
Pe catena logging discontinua pe care, ca prima etapa, se sintetizeaza
fragmentele Okazaki, sinteza ADN-ului este intarziata.
Fragmentul Okazaki a carei dimensiune ajunge la 1000-2000 b, dupa
sinteza sa realizeaza o rotatie de 180° in axul longitudinal al catenei matrita
cu care se va cupla complementara. La rotatia de 180° a fragmentului
Okazaki este implicata o enzima-invertaza. Rolul invertazei este urmatorul:
catena logging are directia de esterificare 5'-3'. Initial fragmentul Okazaki
sintetizat are directia de esterificare tot 5'-3'. Pentru a se cupla cu catena
matrita logging se produce rotatia in ax longitudinal al fragmentului Okazaki.
Dupa rotatie directia de esterificare a fragmentului Okazaki devine 3'-5'. In
aceasta stare fragmentul Okazaki se va cupla complementar pe catena
logging. In urma acestei cuplari catenele devin antiparalele cu formarea in
final a moleculei ADN.
Dupa sinteza si cuplarea fragmentului Okazaki cu catena matrita
logging, ARN-primer este indepartat, iar „golul" lasat este completat de
ADN-polimeraza I care prin activitatea exonucleazica, va introduce un nou
fragment Okazakic de ADN. Capatul 3'-OH al fragmentului ce se va asocia
incontinuare este adiacent capatului fosfat 5'-OH al fragmentului anterior.
Legarea fragmentelor Okazaki este realizata de o enzima ADN-ligaza.
Zona cuprinsa intre punctul de initiere si fragmentele de ADN replicat
este denumita replicon. La om, lungimea repliconului variaza in limite foarte
largi, intre 100 si 300 kb, dimensiunea repliconului flind determinata de
Huberman si Riggs, inca din 1968.
In genomul mamiferelor (si la om) numarul unitatilor de replicare (a
repliconilor) variaza intre 2000 si 3000. La mamifere situsurile de initiere a
replicarii apar pe zone aleatorii, nu in puncte specifice. Aceste zone contin
un niimar de secvente prezente in genom. Fiecare zona are importanta
deoarece actioneaza ca initiator al replicarii (fig.24).

83
 originea replicarii

_______i_______
Furca Xj j j j j j \ Furca

5'------------------► 3' 5'------------------>3'

3' 4--------------------5' 3'«-

Crestere Crestere

Fig. 24 Replicarea bidirectionala in sinteza ADN.

Spre deosebire de procariote, complexitatea zonelor de initiere a replicarii

este consecinta naturala a genomului, care este complex si necesita mecanisme
ample de activare si reglare a replicarii.
Se presupune ca activarea unei zone de origine si initiere a replicarii ADN-
ului ar depinde de pozitia in structura tridimensionala si cuaternara a cromozomilor
si mai putin de compozitia specifica in nucleotide a repliconului.
Huberman si Riggs (1968) au observat ca rata replicarii este diferita la
eucariote fata de procariote. Folosind tehnica autoradiografica de analiza a
replicarii ADN-ului a observat ca furca de replicare la mamifere ar inainta cu
3kb/min.
Dupa initierea replicarii ADN-ului rata de alungire a catenelor „de novo"
pare a fi constanta, ca derulare, pentru fiecare tip de celula din organism.
De exemplu la procariote, intregul ADN din unicul cromozom inelar se
replica in 20 minute.
La Escherichia coli cromozomul prezinta o singura zona de initiere a
replicarii. Are un singur replicon cu doua furci de replicare care inainteaza in
sensuri contrare pana cand se vor intalni. Fiecare furca de replicare are o rata de
1600 pb (perechi baze) pe secunda.
La om rata replicarii in celulele somatice este mult redusa valoric. Se
estimeaza ca ar fi de aproximativ 100-150 pb/sec pentru fiecare furca de replicare.

cS4
 Daca luam in consideratie numanil cromozomilor, tipul si cantitatea
de ADN (repetitiv si nonrepetitiv), arhitectura moleculelor ADN, prezenta
histonelor si arhitectura cuaternara a cromozomilor (nucleozomi, solenoizi,
bucle, etc.) la eucariote, sunt consemnate deosebiri esentiale intre procariote si
eucariote.
Procariotele au un singur replicon, un singur situs de initiere in
replicarea ADN-ului, genomul este lipsit de histone si tipuri diferite de
ADN (Cairn, 1962).
Spre deosebire de procariote, eucariotele au in genomul celular o
cantitate foarte mare de molecule ADN, care insumeaza in total un numar
de aproximativ 3.5 x 109 pb. Ca urmare prin structure si componenta
repetitiva si nerepetitiva este putin probabil existenta unui singur situs de
initiere in replicarea ADN (Cairn).
La eucariote, replicarea intregului ADN genomic se face intr-un timp
limitat, in stadiul interfazic S'. La eucariote apar doua probleme
fundamentale in replicarea ADN-ului genomic:
- probleme de ordin topografic determinate de structura cromatinei
cromozomiale: nucleozomii, solenoizii, buclele. Sunt elemente legate de
arhitectura cromozomilor care pot „introduce" „superspire negative" in
morfologia cromozomilor;
- o alta problema este ca moleculele ADN-ului in dublu helix, cuplate
cu histonele si prezentand si secvente repetitive, trebuie sa se replice
integral, intr-un interval foarte scurt de timp.
Daca am raporta procesul la eucariote fata de procariote, prin
cantitatea si heterogenitatea ADN-ului, ar trebui ca la eucariote timpul
necesar pentru replicarea integrala a ADN-ului sa fie de peste 100 ori mai
mare la om fata de procariote.(Eschericia coli).
Asa cum s-a mentionat, Huberman si Riggs au identificat formarea
mai multor puncte de initiere in replicarea ADN-ului cromozomial, puncte
ce se gasesc la distante intre ele de 100-300 kb. In raport cu numarul
punctelor de initiere putem aprecia numarul repliconilor / cromozom.
In genomul uman punctele de initiere s-ar gasi la 150-200 kb distanta
intre ele. Luand in consideratie numarul perechilor de nucleotide si distanta
intre punctele de initiere, se aproximeaza un numar de aproxiativ 3000
situsuri de initiere.
La om repliconii nu se replica sincron. Se observa o replicare
asincrona. Asincroniile sunt legate de momentul activarii situsului de initiere
si de elongatia repliconului. Asincronia replicarii ADN-ului se observa in
stadiul interfazic „S".

85
 Asincronia in activitatea repliconilor este determinata si de forma de
condensare a fibrilei de ADN, de abundenta cuplurilor complementare G = C in
structura repliconilor, de cantitatea de ADN repetitiv per molecula si cromozom.

7.6.Erori de replicare a ADN si repararea erorilor in

genomul uman

ADN-ul din componenta genomului celular, prezent la procariote si/sau

eucariote, datorita interrelatiei cu factorii ambientali ai organismelor vii, poate fi
influentat, distructiv , de interferenta „agresiva" a unor factori exogeni sau
endogeni (vezi cap. mutatii). Aceste distructii mutationale in structura ADN-ului
genomic au ca efecte directe modificarea mesajelor genetice inscrise, iar ca efecte
secundare aparitia unor caractere noi, care la om se manifesta ca sindroame severe
pe fond genetic.
Daca s-ar mentine erorile induse in structura si functiile ADN-ului,
frecventa, incidenta bolilor pe fond genetic, ar fi alarmant de ridicata. Mai mult, cu
fiecare generatie care succede frecventa ar fi in permanenta crestere valorica.
Se apreciaza ca frecventa erorilor punctiforme in structura ADN-ului,
manifestate ca boli genetice, ar fi de 10~6 la nivelul intregii populatii umane. Dar
ADN-ul genomic dispune de mecanisme si procese prin care sa-si corecteze erorile
din structura proprie.
In cazul cand ADN-ul n-ar avea capacitatea de autoreparare structurala,
atunci valoarea mutatiilor punctiforme ar creste de la 10"6, cat se considera
mutatiile spontane in populatiile umane, la peste 1000 de ori.
Dar ADN-ul genomic uman isi corecteaza propriile erori mutationale, ceea
ce explica incidenta scazuta a mutatiilor genice la nivel populational.
Factorii populationali ce indue erori in structura ADN-ului genomic pot fi
endogeni si/sau exogeni.
a) Factorii endogeni - intracelulari. La nivel intracelular pot avea loc o
serie de procese care favorizeaza producerea leziunilor in structura ADN-ului
genomic. Acestea sunt:
pierderea unei baze purinice sau pirimidinice, urmarea hidrolizei
legaturilor glicozidice;

86
 trans form area adeninei in hipoxantina, care modiflca raportul de
complementaritate. In urma dezaminarii adeninei, hipozantina ce rezulta va
complementariza cu guanina;
radicalii de oxigen rezultati in concentratii crescute pot interfera
distructiv (mutagen) ADN-ul;
prin procese de metilare a bazelor azotate cu modificarea
complementaritatii.
b) Factorii exogeni ce produc leziuni in ADN. Factorii exogeni, potentiali
mutageni, cu actiune distructiva a structurii si functiei ADN-ului sunt:
factori fizici (radiatii ionizante, ultraviolete);
factori chimici;
factori medicamentosa
factori biologici.
Catalogul acestor factori mutageni este impresionant valoric si mult
diversificat (vezi cap. mutatii).

7.6.1.Mecanisme de reparare a erorilor in structura ADN

In prezent s-a demonstrat ca in genomul celular au loc procese

reparatorii, care asigura integritatea structurala si functia ADN-ului.
In procesele de reparare si realizarea integritatii ADN-ului celular
sunt implicate complexe enzimatice in mecanismele desfasurate in genomul
eucariotelor.

a) Complexe enzimatice ce intervin in repararea erorilor ADN.

Endonucleazele - Actioneaza asupra situsurilor

apurinice/apirimidinice dupa excizia bazelor, excizie indusa de ADN-
glicozidaze , sau prin incorporarea eronata a bazelor in structura ADN-ului
genomic.
Unele endonucleaze isi intensifica activitatea de reparare dupa
iradierea genomului cu UV (ultraviolete). Prin iradierea cu UV unele
endonucleaze excizeaza dimerii pirimidinici care se formeaza pe cateneie
ADN-ului. Acest grup de endonucleaze este denumit UV-endonucleaze.
ADN-polimerazele - Sunt implicate catalitic in repararea exciziilor
din cateneie ADN-ului care prezinta terminatii 3'-OH.

87
 ADN-ligazele - Sunt enzime care cupleaza doua catene din structura
moleculei ADN prin formarea de legaturi difosforice intre hidroxilii3'-OHsi5'-OH.
Topoizomerazele I si II - care pot sectiona una sau ambele catene ale
ADN-ului unde s-au produs erori in molecula.

b) Mecanismele de reparare a erorilor din ADN la eucariote

Spre deosebire de procariote, la care mecanismele de corectare a erorilor

din ADN-ul genomic sunt bine studiate, la eucariote, datorita complexitatii
genomului (numar mare de cromozomi, numar mare molecule ADN, etc.)
mecanismele nu sunt complet elucidate si cunoscute.
Erorile pot rezulta prin cuplarea incorecta intre purine/pirimidine. In
timpul replicarii semiconservative cuplarea complementara intre nucleotide nu
este „respectata" datorita interferentei distructive a unor factori ambientali
„agresivi".
Erorile se produc in urmatoarele situatii:
cand incepe despiralizarea si separarea catenelor, este posibila fisura pe
una sau ambele monocatene;
nerespectarea principiului complementaritatii intre purine si I pirimidine
(normal A-T si G-C) a nucleotidelor care se esterifica pe catena I „de novo" in
raport cu catena „matrita". Se pot forma „dimerii", cupluri I nucleotidice false
(necomplementare);
cand asupra nucleului, ADN in replicare, actioneaza factori potential
mutageni, inducand suprimare de nucleotide, substitutie sau insertie de baze in
catena matrita sau in cea „de novo";
formele tautomere ale bazelor azotate, sau ionizarea lor, modifica I raportul
de complementaritate cu formarea de dimeri si erori in structura I ADN.
Sunt cercetatori care mentioneaza ca sunt posibile erori, dar in I procente
foarte mici, datorita cuplarii gresite (eronate) intre purine si I pirimidine.
Dupa Covic si Stefanescu (2004), conform reactiilor |
stoichiometrice , greselile de necomplementaritate intre nucleotidele de pe catena
„matrita" si cele esterificate pe catena „de novo" se pot produce in raport de
1/10000.

5
Stoichiometria (gr. Stoikheion = element + metron = masura). Chimia fizica
ce studiaza raporturile cantitative intre elemente in combinatii sau in reactii
chimice.

88
 In genomul celulelor eucariote (sau procariote) sunt sisteme care I
identifica eroarea lezionala sau insertionala din ADN, iar pe cale enzimatica pot
fi corectate (fig.25 si fig.26).
Repararea poate fi realizata prin mecanisme enzimatice implicate in I
urmatoarele procese: fotoreactivarea enzimatica, repararea prin excizie, I
repararea postreplicare, sau repararea prin alchilare sub actiunea metil
transferazei (Anca-Michaela Israil, 2000). Ca mecanisme la eucariote mai
consemnam:
Mecanismul BER (Base Excision Repair) - Cand ADN
-polimerazele nu catalizeaza incorporarea gresita intre bazele azotate pe |
catena nou sintetizata, producand distorsiuni in dublul helix al ADN.
Capacitatea de autocorectie a ADN-polimerazelor care asigura I
complementaritatea corecta intre cuplurile nucleotidice in timpul sintezei fc)N-
ului.
Rata de corectare a erorilor in timpul replicarii ADN-ului este de
110' -lO"6 prin mecanismul BER si de peste 1000 de ori prin capacitatea
4

ADN-polimerazelor de autocorectare a erorilor din ADN (Covic si

Stefanescu, 2004).
La om sunt identifiacate complexe genice care codifica sinteza
proteinelor MSH2, MSH3 si GTBP. Aceste proteine pot recunoaste erorile
de imperechere, iar cuplul MSH2 / MSH3 are capacitatea de a identifica
insertiile si deletiile punctiforme ce survin in structura ADN.
Restitutia moleculei ADN lezata poate fi:
completa, fiind identica cu structura initiala a moleculei ADN;
restitutie partiala a moleculei;
reparatie nerezolvata, molecula ADN necorectata va fi prezenta in
genom ca molecula mutanta.
Prin lipsa capacitatii de reparare a „leziunilor" apar „disfunctii" severe
in organism.
De exemplu, indivizii care prin mutatie isi pierd capacitatea de
reparare a ADN-ului la actiunea UV, prezinta maladia cunoscuta sub
denumirea „Xerodermie pigmentara".

89
 u.v.

i i i i i i i i i ] ii i i i■• i
i i i i i i i i i II i i i i
i i i i i i i i i i i i i i i i i

• **> /y
s
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ii
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ii
i i i i i i i i i i i i i i i i i i i ii

Fig.25 Schema generala de reparare a ADN: 1 -

leziunea produsa de UV;
2- formarea dimer-timinei;
3- ruperea catenei de catre ADN - endonucleaze si ADN-glicozidaze;
4- incepe corectarea leziunii catenei „de novo", de ADN-polimeraze si I
ADN-ligaze;
5- excizia completa a regiunii lezate de UV de catre topoizomerazele I I
sill;
6- cuplarea si completarea sectiunii lezate si refacerea ADN-ului.

90
-**"!"'■

|
I T G
1 T1 C1 1
A
1 1 1 C|
T G 1
|
G
| |
C A
1
C
' A C G A A
c G C T G
A I c G G
11 11 1iradiere UV 1 1

"f G T C A
A C A G T
T dimer timinic
G C C G
A A C G G C

fotoliaza' (pozitionare)

absorb tie onerqie UV

'I

TT# I
Id)
T C
A
G
T
J___I___I___I___L
eliberarea enzimei
*
G T C A T 1 G C C C A
C A G T A A C G G G T

26 Etape in repararea erorilor moleculei de ADN

91
CAPITOLUL III

ANATOMIA GENOMULUI UMAN

CROMOZOMII

La organismele eucariote si om, cea mai mare cantitate de ADN este

localizata in nucleu in formatiuni pe care Weldever (1883) le-a denumit
cromozomi.
Prin definitie, cromozomii sunt elemente cu aspect filamentos de natura
nucleo-proteica, prezenti permanent in nucleul celulei. Individualizarea si analiza
cromozomilor este posibila in fazele ciclului mitotic sau meiotic, in special in
metafaza mitotitca, precum si studiul lor la microscopul electronic.
In interfaza ciclului celular la eucariote, cromozomii sunt condensati
formand asa numita cromatina nucleara, ca in mitoza sa prezinte aspectul
filamentos hipercondensati.
Cromozomii sunt elemente dinamice si constante, a caror functie si
activitate genetica sunt esentiale pentru viata celulei, pentru viata organismului.
Cromozomii se gasesc la toate organismele eucariote, si unele procariote,
la care numarul, forma, talia sunt trasaturi caracteristice fiecarei specii.

92
1. Etape in analiza genomului uman
Geneticianul francez Dutrillaux (1976) considera parcurgerea a trei
etape principale in analiza si studiul genomului uman si anume:
- etapa socului hipotonic
- etapa trizomiilor
- etapa bandarii cromozomilor
Totusi o etapa istorica in studiul aparatului genetic la om este
„Proiectul Genomului
Uman" care, primele rezultate obtinute de geneticieni, au fost publicate in
anul 2000.
Pana in 1956, genetica era abordata conceptual, fiind consemnate si
unele cercetari experimentale de certa valoare stiintifica cum sunt
experientele lui Gr. Mendel (1865) facute pe Pissum sativum (mazare), iar
Th. Morgan (1903-1911) pe Drosophila melanogaster (musculita de otet).
Rezultatele lor sunt deosebit de valoroase pentru fundamentarea stiintifica a
geneticii. De exemplu Mendel a formulat legile segregarii si transmiterii
caracterlor ereditare, legi care au caracter universal in lumea vie a
organismelor cu reproducere sexuata, iar Morgan a elaborat teoria
cromozomiala a ereditatii.
Dar, datorita dezvoltarii tehnicilor si metodelor cu aplicabilitate de
studiu in genetica umana (in mod deosebit) a inceput cercetarea diversificata
si aprofundata asupra genomului uman.
De exemplu, cercetatorul Hsu (1956), introducand socul hipotonic
asupra celulelor mitotice, a reusit pentru prima data, sa stabileasca numarul
corect de cromozomi in celulele somatice la om. Aceasta descoperite a fost
considerata atat de importanta incat atomistul Hanschka (1961) a declarat
„Homo sapiens a cunoscut nucleul atomic inainte de a cunoaste numarul
cromozomilor din celulele propriului corp".
Cu ajutorul acestei metode s-a efectuat studiul analitic al
cromozomilor umani la subiectii normali sau cu diverse sindroame genetice.
De exemplu intre 1956 - 1970 s-a studiat morfologia cromozomilor, originea
cromozomilor - materni si paterni (Ford si Hamerton 1956), iar in 1959
Legeune, Gauthie si Turpin au stabilit ca etiologie a sindromului Down,
prezenta unui cromozom acrocentric 21, in plus (cariotipul: 47,XX + 21 sau
47,XY + 21).

93
 A urmat apoi identificarea modificarii numarului de cromozomi, ca
etiologie genetica in sindroamele: Turner, Patau, Eduards, Klinefelter,
superfemele, etc. Etapa trizomiilor.
O data memorabila este anul 1970 cand incepe o noua etapa in analiza
si studiul genomului uman. Este etapa „bandarii cromozomilor,,■
Prin bandarea cromozomilor se identifica omologia corecta a
cromozomilor, precum si eventualele modificari, in structura cromatidelor
cromozomale, care, cu microscopul optic si metoda Hsu nu puteau fi
identificate. Incepand din anul 1980 pana in prezent analiza cromozomilor
umani se extinde asupra infrastructurii si secventializarii nucelotidelor din
genomul uman. Aceste studii deschid noi orizonturi de analiza teoretice dar
mai ales cu aplicabilitate in patologia umana. Este etapa „Proiectul
Genomului Uman".

2. Numarul cromozomilor la om

Primele enuntari legate de genomul uman apartin lui Fleming (1882)

care introduce notiunea de ,,crornatina'', considerand cromozomii segmente
colorabile ale nucleului.
Dupa ce Waldeyer introduce notiunea „cromozom" a urmat incercari
nereusite de a stabili numarul cromozomilor la om. De exemplu, Hansemann
(1897), considera ca celula somatica la om ar avea intre 16 si 36 cromozomi,
iar Winiwater (1912) lanseaza ipoteza ca barbatii ar avea 47 cromozomi (47,
X) in celula somatica iar femeia 48 cromozomi (48, XX).
In 1920, H.Winkler introduce notiunea de „genom". Dupa el,
genomul este setul haploid de cromozomi din celula gametica.
In prezent, prin genom se considera setul complet de gene particulare
fiecarei specii.
Anul 1956 este important deoarece s-a stabilit numarul corect al
cromozomilor in celula somatica: 2n = 46 cromozomi.
Studiile citogenetice comparate la diverse specii eucariote au
evidentiat variatii numerice in limite foarte largi (Tabel III).

94
Tabel III. Numarul cromozomilor la unele specii de eucariote

Specia Numar diploid de

Homo sapiens (om) 46 V ,
Macaca mulata (maimuta Rhesus) 42 ^
Pan troglodytes (cimpanzeu) 48
Bos taurus (bovine) 60
Canis familiaris (cainele) 78 V
Felis domestica (pisica) 38 ^
Eqvus cabalus (cal) 64 V
Mus musculus (soarece) 40 V
Raltus norvegiens (sobolan) 42 V
Cyprinus carpio (crap) 104 \/
Drosophila melanogaster 8 v
Musca domestica 12
Ascaris megalocaphala univaleus 2 V

Din exemplele din tabel observam ca numarul cromozomilor in

celulele somatice nu respecta gradul evolutiei bio-genetice si complexitatea
structurala si functionala a speciilor. In consecinta numarul cromozomilor nu
este criteriu taxonomic sa stabilim evolutia si pozitia filogenetica a speciilor.
De exemplu la vertebtrate sunt specii „inferioare filogenetic" cum este
Cyprinus carpio cu 104 cromozomi, in timp ce omul are 46.
Speciile cu reproducere sexuata poseda doua tipuri de celule, diferite
prin numarul de cromozomi:
celulele sexuale (gametii) au un set simplu de cromozomi - denumit
set haploid sau garnitura gametica, notat cu „n";
celulele somatice cu numar dublu de cromozomi, garnitura diploida,
notata cu „2n". In nucleul celulei somatice diploide, fiecare cromozom este
dublu reprezentat, unul de origine materna, adus de ovul, al doilea patern,
adus de spermatozoid. Ei alcatuiesc perechea de cromozomi omologi,
deoarece au aceeasi dimensiune, aceeasi morfologie si aceeasi valoare
genetica. Cum numarul diploid se realizeaza in procesul de fecundatie,
rezultand zigotul, el poate fi numit si garnitura zigotica.
Omul este specie somatica diploida, cu gameti haploizi6. Numarul
cromozomilor din setul haploid gametic este de 23 (n - 23). Celula

Scurtarea fazei haploide in favoarea celei diploide este caracteristica

organismelor eucariote superioare

95
somatica diploida contine 46 cromozomi (2n = 46), respectiv 23 perechi de
cromozomi, respectiv suma a doua seturi haploide.
Dupa functia genetica in celule exista doua grupe de cromozomi:
autozomi (somatici) si heterocromozomi sau gonozomi. Heterocromozomii
sunt numiti si cromozomi sexuali deoarece determina sexul genetic al
individului. De exemplu, in celula somatica diploida sunt 44 autozomi,
dispusi in 22 perechi de cromozomi omologi, doi cate doi. Dar in celula
somatica exista si doi cromozomi sexuali, care, raportati la cele doua sexe nu
prezinta omologie morfo-structurala si functionala, si anume: la femeie avem
doi cromozomi X (XX), la barbat un X si un Y (XY).
La om, specie cu reproducere sexuata, dupa pubertatea ontogenetica,
gasim un tip de celule care difera de celulele somatice, prin numarul
cromozomilor. Sunt celulele sexuale (gametii) la care numarul cromozomilor
este redus la jumatate, fata de celulele somatice.
La om celulele sexuale au 23 de cromozomi: 22 autozomi si un
cromozom sexual, care, in functie de sex poate fi X sau Y.
Cum la femeie intre ovulele ce pot fi elaborate prin ovogeneza nu
exista diferente genetice, prezentand aceeasi formula cromozomiala - 23 X,
inseamna ca ea va elabora acelasi tip de ovula. Deci femeia este
homogametica. La barbat, dataorita neomologiei cromozomilor sexuali (XY),
in spermatogeneza se vor repartiza cromozomul X intr-un garnet, iar Y in
altul. Ca urmare, barbatul elaboreaza doua tipuri de gameti care se deosebesc
prin tipul de cromozom sexual prezent, X sau Y. Deaceea barbatul este
considerat heterogametic.
Prin fuzionarea a doua celule haploide gametice se obtine zigotul,
celula diploida din care se va dezvolta viitorul organism uman.
La om, ca la toate speciile cu reproducere sexuala, ontogenetic este
parcursa alternanta intre celulele somatice diploide ca numar de cromozomi
(diplofaza) si celulele gametice haploide (haplofaza) (fig. 27).

96
 «" Diplofaz
a

®
6,XY^-^ 46.XX
Ovul fecundat
(zigot)
(2N)
▲

Spermato- Ovul
zoid (N) (N) •-•

•^ Ovogonie

I Spermatogonie •""•
(2N
Haplofaza
^ f(2N)

Fig. 27 Alternanta genomului la om: diplofaza - haplofaza

Sunt cazuri cand starea fiziologica a organismului sau influenta unor

factori agresivi externi, pot influenta ciclul celular (meioza sau mitoza),
modificand numarul cromozomilor. Prin aceste modificari apar celule aneuploide
(vezi mutatiile). Sunt deviatii de la numarul cromozomilor in celula somatica sau
gametica.
In cazul cand in organism exista o populatie celulara aneuploida, numeric
crescuta, se indue dereglari in morfologia, anatomia si functia orgnanismului, a
caror etiologie clinica se incadreaza in grupul „sindroamelor genetice".
Aneuploidia apare foarte rar la subiectii normali fiziologic. De exemplu C.
Brown (1966) a constatat la unele persoane normale, dar inaintate in varsta,
existenta unor celule la care lipseste un cromozom. El a gasit un procent de
aproximativ 7% limfocite, cu 45 cromozomi (monozomie) la unele femei care au
depasit varsta de 60 ani. Cromozomul

97
absent probabil, fund cromozomul X. La barbatii peste 60 de ani, unii aveau
in sangele periferic 1-2% limfocite cu 45 cromozomi, absent fiind probabil
cromozomul Y. Deci aneuploidie prin pierderea unui cromozom.

3. Dimensiunea genomului uman

Desi structura fizica a nuceleelor celulelor la eucariote este similara

pentru toate speciile, sunt consemnate diferente de lungime, de dimensiune a
genomului.
De exemplu, la eucariotele inferioare genomul poate avea o lungime
de aproximativ 10 Mb, in timp ce la eucariotele superioare lungimea
genomului depaseste 100 000 Mb .
Deasemenea apar diferente de dimensiune si lungime a genomului
intre procariote si eucariote. Unii geneticieni considera ca lungimea
genomului este concordanta cu complexitatea structurala a speciilor analizate
(tabel IV) .

Tabel IV
Exemple de dimensiune a genomului la diverse specii de organisme
(publicate si analizate in cadrul proiectului de secventializare)

Specia Lungimea Autorii

genomului
in Mb
Venter si col. (2001); HGSC
Homo sapiens 3200 (2001)
Mus musculus (soarece) 3300 -//-
Drosophila melanogaster 180 Adams si col. (2000)
Nematode 97 CESC(1998)
Saccharomyces cerevisiae 12,1 Goffean si col. (1996)
Escherichia coli K12 4,64 Blattnersicol. (1997)
Mycobacterium tuberculosis 4,41 Cole si col. (1998)
Streptococcus pneumoniae 2,16 Tettelin si col. (2001)
Triticum aestivum 16000 -//-
Fritillaria assyriaca 120000 -//-

Lungimea genomului este in concordanta cu complexitatea

structurala o organismelor (vezi tabelul). Astfel la ciuperci dimensiunea

98
genomului este foarte redusa (12,1 Mb) in timp ce la vertebratele superioare
poate ajunge pana la 3200 Mb (la om) si 3300 Mb (la soarece). Iar la unele I
specii de plante dimensiunea genomului este impresionanta de 16 000 si chiar
120 000 (la exemplele din tabel).
Dimensiunile foarte crescute la vertebratele superioare sunt legate de
numarul genelor din genom, care la om este de aproximativ 30 000 - 40 000
gene informational active.
Marea variatie a dimensiunii genomului la eucariotele superioare, este
legata si de numarul secventelor repetitive care variaza de la 106 pentru ADN
inalt repetitiv pana la 103-10 pentru ADN-ul moderat repetitiv, fata de cateva
zeci de mii de copii pentru ADN cu secvente „unice".
Legat de paradoxul valorii C, s-a crezut mult timp ca exista o corelatie
intre complexitatea structural-morfologica si functionala a organismelor si
dimensiunea genomului nuclear la eucariote.
Daca la eucariotele inferioare este o cantitate foarte mica de ADN in
I genomul nuclear, in raport cu existentul in genomul eucariotelor superioare
I (vertebrate) explicatia ar fi urmatoarea : la eucariotele inferioare genele
I functionale sunt mai grupate si au mai putin ADN repetitiv in timp ce la
vertebratele superioare este o accentuata dispersare a genelor functionale in
genom, distantate de secventele repetitive din genom.
Dar moleculele ADN sunt in strctura si functia cromozomilor. In
Iconsecinta lungimea totala a genomului nuclear, o gasim repartizata pe
„segmente" moleculare in cromozomi. Ca urmare in functie de cantitatea
ADN prezenta in fiecare cromozom din totalul genomului nuclear,
cromozomii pot avea dimensiuni variabile. Deasemenea dimensiunea
cromozomilor este conditionata si de prezenta (variabila cantitativ)
moleculelor de ADN, repetitiv si nerepetitiv, precum si in raport de functia
exercitata de celula in organism.
In aceste conditii putem admite ca la eucariote putem face o
clasificare a cromozomilor dupa dimensiune (talie, grosime) in raport cu
genomul diferitelor specii eucariote.
De exemplu la eucariote putem observa urmatoarele dimensiune ale
cromozomilor:
- cromozomi mici, intalniti la unele nevertebrati inferioare, la
reptile, la pasari;
- cromozomi mari, intalniti la vertebratele superioare si om;
- cromozomi uriasi sau politeni, prezenti in glandele salivare la
diptere (insecte).
In raport cu factorii implicati, lungimea si grosimea cromozomilor
variaza in limite foarte largi.

99
 De exemplu, la om lungimea (talia) cromozomilor variaza intre 1,5 -
10 /I, iar diametrul (grosimea) intre 0,2 - 2 /x .
Dar lungimea si grosimea cromozomilor variaza si in raport cu fazele
ciclului celular. Daca in interfaza ciclului celular, cromozomii dispusi in
tandem (sinapsis) sunt sub forma de filamente foarte fine si lungi (grosimea
putand varia intre 35-100 A) formand cromatina nucleara, in ciclul mitotic ei
se individualizeaza si sunt usor de analizat.
In ciclul mitotic incepe spiralizarea si hipercontractia
(hipercondensarea) fibrilei de ADN din cromozomi (hiper - hiper -spiralizarea
- polisolenoidica, a polibuclei, forma si condensarea fibrilei de nucelo-
proteina).
Prin procesele de hiper-spiralizare si condensare (contractia
cromatidelor) cromozomii se vor scurta considerabil ca talie. De exemplu,
Onuki (1968) si Ruzicka (1973) analizand cromozomii la microscopul
electronic au observat ca intr-o faza amitotica, progresiv, filamentul de ADN
se hiperspiralizeaza si condenseaza (contractia fibrilei). Aceste procese
observate sunt maxime in metafaza mitotica.
Prin aceste procese, grosimea creste, urmata de reducerea taliei
cromozomilor.
Talia sau lungimea cromozomilor poate fi apreciata cu ajutorul
urmatoarei relatii:

P + q
L=
Y.22A + X

L = lungimea relativa a cromozomului.

p+q = lungimea totala a cromozomului ( p este bratul scurt, q este
bratul lung al cromozomului);
E = este suma lungimii a 22 autozomi + cromozomi sexual X
(lungimea cromozomilor dintr-un set haploid).

Se apreciaza ca prin hiperspiralizare si condensarea fibrilei de ADN,

talia cromozomilor s-ar reduce (aproximativ) de 20 ori, in raport cu extensia
posibila a fibrilei.
Dar lungimea si grosimea cromozomilor, pot fi modificate ireversibil
atunci cand asupra celulei actioneaza unele medicamente (ex. citostatice ),
unele noxe chimice sau agenti fizici.
De exemplu, daca ciclul mitotic se deruleaza la temperatura ridicata
sau in prezenta colchicinei, cromozomii se scurteaza si se ingroasa

100
considerabil. In schimb prezenta unor compusi alchilanti indue o
ireversibila despiralizare si decontractare a cromozomilor.

4. Morfologia cromozomilor

Prin analiza cromozomilor in metafaza ciclului mitotic la microscopul

optic, se pot observa unele particularitati legate de morfologia cromozomilor,
datorita procesului de hiperspiralizare si condensare in aceasta faza.
Elementele legate de morfologia cromozomilor sunt urmatoarele
(fig.28)

101
 c.s.

cm

c.s.

Fig.28 Morfologia generala a cromozomilor

a)- Cromatidele (fig.28)

 Intr-un ciclu celular cromozomii parcurg doua etape distincte
morfologic: etapa de cromozom monocromatidic si cea de cromozom
dicromatidic.
Etapa de cromozom monocromatidic o parcurge anafaza si telofaza
ciclului mitotic precum si in stadiul Gi interfazic.

102
 Etapa de cromozomi dicromatidici - Stadiul de cromozom
dicromatidic il gasim in stadiul G2, interfazic, precum si in profaza si
metafaza mitotica.
O referire speciala este pentru stadiul S-interfazic. In stadiul S are loc
replicarea semiconservativa a fibrilei de ADN din cromozomul
monocromatidic. Prin replicare se dubleaza cantitatea de ADN. Progresiv, pe
masura ce fibrila de ADN se replica semiconservativ, fibrilele rezultate se
vor separa, rezultand doua cromatide identice sau surori. Cele doua
cromatide se mentin cuplate pana la sfarsitul metafazei, in punctul numit
centromer.
La sfarsitul metafazei are loc clivajul ecuational la nivelul
centromerului avand ca rezultat separarea celor doua cromatide. Din
momentul separarii fiecare cromatida devine cromozom monocromatidic
(fig.29) pentru urmatorul ciclu celular.

,Gj_______SjJ»_______, PROFAZA METAFAZA ANAFAZA_______TELOFAZ.A

INTERFAZA MITOZA INTERFAZA

Fig.29 Alternanta mono - si dicromatidica a cromozomilor intr-un ciclu

celular.

In anafaza, fiecare cromatida separata prin clivajul centromerului

(cromatidele dupa separare devin cromozomi monocromatidici) se va deplasa
spre unul din polii celulei in mitoza, sau in anafaza meiozei secundare.
Prin aceasta repartitie a cromatidelor surori la cei doi poli ai celulei in
diviziune (a cromozomilor monocromatidici) se asigura repartitia „identica" a
materialului genetic in celulele fiice rezultate.

103
 b)- Centromerul - ultrastrucutra -
Centromerul, numit si constrictie primara este zona unde cele doua
cromatide surori, rezultate prin replicare semiconservativa, raman unite pana
la sfarsitul metafazei mitotice si in metafaza secundara meiotica.
Centromerul este o particularitate morfologica constant prezenta la
nivelul fiecarui cromozom, mentinandu-si pozitia la nivelul cromatidelor.
La cromozomii umani, centromerul apare ca o conexiune
punctiforma, deoarece cromatidele in acea zona de cuplare au o grosime
foarte mica. Datorita acestui aspect, i s-a atribuit si denumirea de constrictie
primara.
Imaginea electronomicroscopica arata ca centromerul, la cromozomii
umani ca la toate eucariotele superioare, este alcatuit din trei domenii:
domeniul central, domeniul de imperechere si kinetocorul, domenii care au
fost descrise de Politi si colaboratorii (2002).
Bogat in heterocromatina, centromerul este un complex de proteine si
ADN repetitiv, neinformational si netranscriptibil. Miezul centromerului
format din ADN alfa satelit, datorita variatiei numarului de cupluri
nucleotidice in secventele repetitive (variaza intre 5 pana la 171 pb), prezinta
un accentuat polimorfism. Polimorfismul centromerului poate fi observat prin
variatiile cantitative ale heterocromatinei centromerice constitutive.
ADN-ul alfa satelit, asociinduse cu proteinele centromerice (ex:
CENP-A, CENP-C, CENP-I) este implicat in organizarea centromerului
(proteinele centromerice identificate sunt: CENP-A, B, C, D, E, F, G, H si
I).
ADN centromeric, asociat cu proteina CENP-A(proteina omoloaga
histonei H3) se replica la mijlocul stadiului S interfazic. Aceasta asociere este
prima etapa in determinarea morfologica a centromerului.
Ross (1977) si Clophan (1978) au stabilit ca centromerul
cromozomilor are o structura complexa. Initial ei au confirmat ca la nivelul
centromerului apar doua formatiuni cu aspect granular pe care le-au denumit
cu kinetocor, formatiuni care se dispun simetric axului longitudinal al
cromozomilor, cu ajutorul carora se cupleaza de fusul mitotic.
Kinetocorii sunt domenii distincte si tranzitorii din structura
centromerului. Formandu-se la sfarsitul profazei sunt activi in metafaza si
anafaza, ca in telofaza sa aiba parte o dezansamblare.
In 1999 Van Hooser si col., examinand kinetocorii la microscopul
electronic, observa ca au structura trilaminata si anume:
stratul extern dens a carei coroana este vizibila numai cand
kinetocorul nu este atasat de microtubuli;

104
 stratul intermedial" luminos ingust si clar, care separa stratul extern
de stratul intern;
stratul intern dens, care se continua cu heterocromatina comisurala,
prin care cromatidele sunt cuplate pana la clivajul ecuational al
cromozomilor.
In stratul extern sunt incluse proteinele motorii CENP-E precum si
proteinele punctului de control al fusului mitotic de tipul Madl, 2, Bubl, 3
etc.
Kinetocorii indeplinesc trei functii:
se ataseaza de captetele microtubulilor fusului de diviziune;
genereaza forte pentru deplarasarea cromozomilor deveniti prin clivaj
monocromatidici;
de a nu incepe anafaza pana cand toti cromozomii sunt toti atasati
fusului de diviziune.
Prin pozitia centromerului in cromozom, cromatidele sunt subdivizate
in doua brate, care pot fi egale sau inegale ca lungime. Conventional, bratui
scurt, numit si brat proximal se noteaza cu „p" si bratui lung sau distal notat
cu „q".
Pentru a stabili corect pozitia centromerului si diferenta de lungime
intre bratele „p" si „q", se folosesc urmatorii indici de calcul si exprimare:
indicele centromeric (i.e.) =----------= lugimea bratului scurt x 100 /
p+q
lungimea totala a cromozomului;
diferenta de lungime intre brate (d) = q-p
raportul intre brate (r) = —.
P
Vezi tabelele V si VI.
Prin pozitia centromerelor si diferentelor de lungime intre brate, in
genomul uman se identifica trei tipuri morfologice de cromozomi: (fig.30).
cromozomi metacentrici, care au centromerul in pozitie centrala, iar
bratele „p" si „q" aproape egale (p ~ q );
cromozomi submetacentrici. Au centromerul pozitionat spre
extremitatea cromatidelor, iar bratele sunt inegale ca lungime. De exemplu
bratui „p" reprezinta ca lungime aproximativ 1/3 din lungimea totala a
cromozomului, iar bratui „q" 2/3;
cromozomi acrocentrici. Sunt cromozomii care au bratui „p" foarte
scurt (de aproximativ 2-3/10 din lungimea cromozomului), iar bratui „q" lung
(aproximativ 7-8/10 din lungimea cromozomului). La cromozomii

105
acrocentric! putem considera ca centromerul este in pozitie aproape
terminala.

METACENTRIC SUBMETACENTRIC ACROCENTRIC

SATEUT
PUNTE
CROMATICA

CENTROMER

18
17 21 22

Fig. 30 Tipuri morfologice de cromozomi umani

Tabel V. Clasificarea tipurilor de cromozomi dupa lungime si pozitia

centromerelor.

Lungimea Pozitia centromerului

cromozomil Metacentrici Submetacentri Acrocentric!
or
Mari A1;3 E B 2,4-5 -II-
Mijlocii 16 F C6-12.X D 13-15
Mici 19-20 E 17-18 G21 -22,Y

Tabel VI. Valoarea indicelui centromeric ( i.e.) la tipul morfologic de

cromozomi.

Tipul de Valoarea I.e.

Metacentric 46-49
Submetacentric 26-45
Acrocentric 17-30

b) - Constrictiile secundare
Sunt cromozomi care au constrictii si in alte zone ale bratelor
cromatidice. Deoarece este o pozitie aleatorie, nu toti cromozomii le prezinta
si nu intotdeauna sunt observabile, au fost numite constrictii secundare. La
unii cromozomi (1, 9 si 16) pozitia constrictiei secundare este constatnta in
generatiile celulare care succed. Prin pozitia constanta

106
constrictia secundara este o particularitate morfologica de a indentifica un
cromozom, precum si omologul sau.
Ca zone de decondensare a fibrilei de nucleoproteina, constrictiile
secundare pot fi identificate si cu ajutorul microscopului optic la
cromozomii 1, 9 si 16, la care pozitia este pe bratele "q", in apropierea
centromerului.
Uneori apare constrictie secundara in zona mediana a bratului "q" a
cromozomului sexual y, precum si pe bratele "p" la cromozomii
acrocentrici.
Daca pozitia constrictiei secundare poate fi constanta pentru unii
cromozomi, in schimb zona de extindere pe cromatida este variabila: spatial
redusa sau extinsa.
0 observatie interesanta a fost facuta de Sasaki si Makino (1963) care,
cultivand celulele timp de sase ore pe un mediu de cultura lipsit de calciu, a
constatat accentuarea constrictiei secundare la bratele "q" a cromozomilor 1,
9 si 16. Conform observatiei facute de ei, se pare ca ionul calciu, ar fi implicat
in gradul de nespiralizare a fibrilei de nucleoproteina in zona constrictiilor
(nespiralizare prin lipsa calciului).
Mai tarziu Dutrillaux (1971) a consemnat ca gradul de extindere
spatiala a constrictiei secundare pe bratul "q" al cromozomului 9 variaza in
limite foarte largi: de la 1 la 5 unitati. El a stabilit ca aceste variatii
dimensionale sunt caracteristici individuale.
In 1972, Gagne si Laberge au emis ipoteza ca variatiile de extindere spatiala
a constrictiei secundare ar fi determinate de prezenta unui situs fragil, unde
este ADN repetitiv.
Lubb si Ruddle (1971) au identificat o constrictie secundara pe bratul
"p" la cromozomul 9 uman, constrictie, ca localizare, frecvent prezenta la
populatia negroida din SUA.
Datorita polimorfismului de dimensiune, constrictia secundara poate
servi ca marker morfologic pentru identificarea indivizilor, cu valoare
antropologica, dar si ca marker pentru cartografierea cromozomilor.
De exemplu, constrictia secundara de pe bratul "q" al cromozomului 1
a servit ca marker pentru a stabili locusul genei pentru sistemul eritrocitar
genetic Duffy, iar colectivul de geneticieni de la facultatea de Medicina din
Craiova, condus de profesorul Chita a constatat la pacientii cu handicap psiho-
neurologic (deficienta mentala), o extensie spatiala a constrictiei secundare
pe bratul "q" la la cromozomul 9. Deci locusul genei pentru dezvoltarea
psiho-neurologica ar fi in zona limitrofa constrictiei secundare pe bratul "q"
cromozom 9. Prin extensie respectiva sau respectivele gene au fost
"represate".

107
 Dutrillaux (1972) considera ca fragilitatea constrictiilor secundare ar
fi responsabila de unele translocatii intercromozomiale cum ar fi translocatia
reciproca intre cromoxomul X si banda 1 q 31.
d) Satelitii cromozomiali sunt mase mici de cromatina localizate la
extremitatea terminala a bratelor "p" (scurte), la cromozomii acrocentrici,
separati de centromer prin prezenta unei constrictii secundare accentuate. Cu
aspect corpuscular, sunt intens si uniform colorati cu colorantii specifici. La
om, satelitii sunt observati la nivelul cromozomilor acrocentrici din grupa D
(cromozomii 13 - 15) si grupa G (cromozomii 21 si 22). Toate cele cinci
perechi de acrocentrici pot avea sateliti, dar numarul cromozomilor satelizati
dintr-o anumita celula este variabil si nu depaseste, de regula cifra 9
(Fergusson Smith si Handmarker 1963). Mai rar, apare formatiune satelitica
si pe cromozomul 17. Pe cromozomul y (acrocentric) nu apar sateliti.
Dimensiunea variabila si aditia diferentiata a colorantilor bazici specifici
asigura un polimorfism accentuat al cromozomilor, iar filamentele de cuplare
la cromozom, prin grosime si lungime, prezinta o mare diversitate. Aceste
elemente servesc drept criterii de comparatie intre indivizi, de a identifica un
individ (in raport de tipul constitutional genetic) de a stabili (in anumite
limite) filiatia genetica.
Uneori se observa sateliti divizati in doua portiuni de cromatida
datorita prezentei a doua constrictii secundare la distante mici, pe bratul "p"
al acrocentricilor.
Filamentele de cuplare ale satelitilor de cromozom sunt de natura
hetero cromatina constitutiva.
Frecvent in timpul mitozei sau meiozei, extremitatile satelitare se
asociaza, fenomen denumit asociatie satelitara rezultand translocatiile
echilibrate (t. robertsoniene).
Luciani si col. (1968) au stabilit ca la nivelul filamentelor satelitice
sunt localizate genele, complexul de gene, care codifica sinteza moleculelor
de ARNr (ARNR: ARNr 5S si ARNr - 5,8 S) de aceea, acest nivel se
asociaza cu denumirea de organizator nucleolar (fig.31).
Formatiunile satelitice, desi sunt implicate direct in patologia
genetica, pot servi ca marked morfologici pentru elucidarea unor mecanisme
ce se produc in ciclul mitotic sau meiotic. Satelitii, datorita polimorfismului
accentuat, pot fi folositi ca marked in urmatoarele cazuri:
- care cromozom acrocentric supranumerar este corect identificat din
grupele D sau G (in sindrom Patau, Down etc.);
- care genitor este "responsabil" de non-disjunctie meiotica in
trizomiile acrocentricilor;

108
 - sa stabilim daca non-disjunctia s-a produs in meioza primara sau
secundara. De exemplu daca celula, genetic, este diplosomica (adica avem
uncromozom acrocentric in plus, numarul cromozomilor fiind de 24 in loc
de 23) iar doi cromozomi acrocentrici au satelitii cu aceleasi particularitati
[morfologice si intensitatea de aditie a colorantilor bazici speciflci, non-
disjunctia a avut loc in meioza secundara. Daca intre cromozomii
acrocentrici nu consemnam identitate, non-disjunctia s-a produs in meioza
primara.
Satelit (J
ADNr
Satelit p
Sateliti 2
Satelit a r<~ Satelit a
Satelit p
Sateliti 2 §i 3

Satelit 1
21
tig. 31 Dispozitia ADN-ului satelit la nivel centromeric si telomeric -
dupa itrachan (1996), Read. Human Molecular Genetics (1996)

109

§i 3
5. Organizatorii nucleolar!

Exista dovezi care confirma ca formarea nucleolilor este dependent!

de constrictiile secundare, dintre sateliti si bratul scurt al cromozomilo
acrocentrici; in zona de sinteza a ARNr, considerate regiuni organizator
nucleolari.
Organizatorii nucleolari sunt regiunile cromatidice unde, in mo<
exceptional AND-ul este transcris cu constituirea unei structuri nuciean post-
mitotice - nucleolul.
S-a demonstrat ca la nivelul organizatorilor nucleolari sunt situsuril<
informationale codante ale ADN pentru sinteza ARNr
Marcandu-se preparatele nucleare cu nitrat de argint si examinare la
microscopul electronic, s-a putut stabili dimensiunea situsului ADN prii
"masurarea" lungimii moleculei de ARNr.
In genomul uman organizatorii nucleolari sunt asociati cu satelitii 1
perechile de cromozomi acrocentrici 13, 14, 15, 21 si 22. (fig. 32)

110
Fig. 32 Metafaza cu cromozomi bandati (mitoza in celula umana).
Evidentierea organizatorilor nucleolari NORs.

Aparent, secventele ADN din regiunea organizatorilor nucleolari sunt

constante si stabile in ciclul mitotic, in timp ce in meioza se pot forma noi
constelatii genice pentru ARNr, datorita (probabil) crossing-over inegal ce s-
ar produce in profaza primara a meiozei. Daca acceptam aceasta ipoteza,
putem explica existenta regiunilor variabile si regiunile invariabile la nivelul
ribozomilor. Acest aspect este important daca luam in consideratie ca in
aceste regiuni „organizatori nucleolari" exista complexe repetitive care ar
grupa 200-300 gene si aproximativ 2000 pseudogene, implicate in sinteza
ARNr.
Clark si Wall (1996) studiind organizatorul nucleolar la cromozomul
21 uman au stabilit ca orientarea genelor componente incepe de la telomer la
centromer.

Ill
 Deasemenea ei an mai constatat urmatoarele : "filamentul' dintre I satelit si
centromer se caracterizeaza printr-un polimorfism accentuat ca I dimensiune. Desi
lung filamentul nu s-a putut identifica un crossing-over I inegal la organizatorii
nucleolari pe cromozomul 21 (prin analize I citogenetice).
Totusi, marcarea organizatorului nucleolar cu nitrat de argint, sau I prin
tratarea cu acizi tari se obtin benzile N (de la organizator nucleolar), I punandu-se in
evidenta situsurile active si non-active ale organizatorului nucleolar, confirmandu-
se polimorfismul accentuat al acestei zone cromatidice care se transmite
mendelian.
Sunt probe care demonstreaza ca prezenta organizatorului nucleolar este
esentiala pentru viata si dezvoltarea celulelor. De exemplu L'Heritier (1971) a
observat ca deletia completa a organizatorului nucleolar are efect letal asupra
celulelor.
Filogenetic s-a stabilit ca secventele invariabile ale organizatorilor I
nucleolari sunt "conservate" constant, fara a se modifica structura ADN- i ului in
respectivele zone, in timp ce secventele variabile sunt particulare fiecarei specii.
Datorita specificitatii situsurilor de ADN ale secventelor variabile, se
presupune ca in celula n-ar exista doi ribozomi identici prin tipul de ARNr
Secventele variabile se modifica cu fiecare generatie celulara datorita crossing-
over-uk" inegal ce are loc.
Deci este o pronuntata labilitate a secventelor variabile.
Studiile filogenetice au evidentiat ca primatele inferioare au o singura
pereche de cromozomi omologi cu organizatori nucleolari, in timp ce soarecele si
urangutanul au in genom opt perechi de cromozomi cu organizatori nucleolar.

112
 6. Telomerele

La nivel molecular, telomerele sunt succesiuni receptive terminale ale

cromozomilor si extremitatilor liniare ale ADN (Brawn, 2002 , Dubrana
sicol.,2002).
Telomerele sunt complexe dezoxiribonucleo-proteice.
Daca reluam defmitia emisa de Muller, pe baza observatiilor
efectuate, telomerele sunt segmente cromatidice terminale a fiecarui
cromozom din genom.
Telomerele, desi au in componenta lor protenie si secvente
repetitive de ADN, nu contin infomatie genetica (Uchiumi, 1998). Secventele
repetitive din structura telomerelor pot fi: -telomere cu secvente uniform
repetitive; -telomere cu secvente si lungimi variabile; - telomere cu secvente
diferit repetitive, distribute neuniform.
Ele au capacitatea sa programeze transcriptia, blocand diferitii factori
implicati in transcriptie.
Dupa Chang si col. (1995) si Griffith si col. (1998) telomerele nu sunt
degradate, nu fuzioneaza cu alte capete ADN. Protejeaza cromozomii de
distrugere, asigura individualitatea lor pe tot parcursul ciclului celular si
protejeaza cromozomii de rearanjamente.
Griffith mentioneaza ca telomerele au rol in organizarea
tridimensionala a nucleului.
Telomerele, ca structuri nucleoproteice la capetele cromozomilor din
celula eucariotelor, sunt formate din ADN frecvent repetitiv. Secventele care
se gasesc in sute de copii, dispuse in tandem, sunt alcatuite din succesiuni
hexanucleotidice TTAGGG. Hexanucleotidul 5' - TTAGGG -3' studiat inca
din 1985 de catre Cooke si col. Ei au studiat telomerele la comozomii sexuali
X si Y la om, prezinta o mica extensie la capatul 3' terminal al moleculei de
ADN in dublu helix din telomer (Tham si Zakian, 2000). Aceasta extensie la
capatul 3', bogata in guanina, in anumite conditii se poate asocia in structuri
cuaternare 4G.
Aceasta extensie 3' masoara la mamifere 150-350 nucleotide si sunt
prezente la ambele capete ale cromozomului (Williamson si col. , 1989;
Wright si col; 1997; Zhong si col. 1992). Extensia 3' permite enzimei
telomerazei sa mentina lungimea telomerelor.

telomer = (gr.) telos= capat; meros= parte

113
 Extensia terrninala 3', bogata in guanina (G) urmata de o secventa
bogata in citozina (C) poate autocomplementariza, realizand o structura in
forma "ac de par" respectiv un palindrom terminal (fig. 33).

AATTTTCCG / '. ADN

________________ . secventa
TTAAAGGC *. / unica"

Fig. 33 Structura telomerica „ac de par".

Strucura palindromului "ac de par" la capatul terminal 3' al ADNului

telomeric asigura:
- integritatea structural - moleculara a telomerului
- individualitatea morfologica a cromozomului.
Lungimea repetitiilor hexoanucleotidice din structura teleomerelor din
cromozomii umani este de aproximativ 10-15 kpb, apreciata de Kipling si
Cooke (1990), folosind tehnica Sounthern Blot TRF (terminal restriction
fragments)
Tot cu tehnica TRF8 s-a apreciat ca telomerele mai lungi sunt prezente
pe cromozomii 1 si 2 (aproximativ 5 681 Mpb) iar cele mai scurte pe
cromozomii 21 si 22 (Suda si col. 2002).
Dar la nivelul cromozomi lor au fost identificate secvente repetitiv
telomerice si in alte zone cromatidice decat cele terminale (Strachan si Read,
1996). De exemplu au fost puse in evidenta astfel de secvente telomerice in
jurul centromeruiui, prezenta care confirma mecanisme dinamice in evolutia
"filogenetica" a cromozomilor la vertebrate si om.
S-a emis ipoteza ca secventele repetitive telomerice din zona
centromeruiui reprezinta ADN ancestral, restant dupa fuziunea telomerica a
doi cromozomi acrocentrici, fmalizandu-se o singura entitate cromozomala
(exemplu fuziunea robertsoniana).
Se presupune ca pozitia centromerica a secventelor repetitive
telomerice ar fi consecinta reductiei telomerice prin translocatie robertsoniana
, cum este cazul celulelor tumorale, sau consecinta erorilor in replicarea si
repararea ADNului (ex. Cazul sindromului Bloom).

TRF = telomeric repeat binding factor

114
 Sindromul Bloom se caracterizeaza prin dilatarea vaselor mici din
dermul fetei (teleangiectazie), o fotosensibilitate cu grave leziuni cutanate,
nanism intrauterin, uneori cu evolutie catre hemopatie maligna.
Dar secventele repetitive telomerice se cupleaza cu proteine
specifice ce asigura stabilitate extremitatilor cromozomale, protejand I
ADNul de degradare si fuziune (Wei si Price, 2003).
Proteinele associate ADNului telomeric, sunt implicate in mentinerea
lungimii telomerelor prin formarea buclei "t" telomerice (vezi palindromul
"ac de par"), consemnat de Griffth si col. 1999).
Bucla "t" nu permite accesul telomerazei la ADNul telomeric.
La nivelul telomerelor cromozomilor umani, Buyon si Cach (1999) au
identificat doua clase de proteine specifice care se cupleaza cu
secventele repetitive ale ADNului telomeric si anume: -proteine de tip TRF1
si TRF2 care se cupleaza cu ADNul telomeric dublu catenar;
- proteine cuplate cu repetitiile secventelor hexonucleotidice 5'
-TTAGGG-3' din monocatena 3'.
Functiile acestor proteine sunt :
TRF1: controleaza lungimea telomerelor, cu rol de reglator negativ de
a mentine dimensiunea telomerelor, prin inhibitia telomerazei care ar
actiona la capetele cromozomilor;
TRF2: mentine structura corecta a telomerelor protejand fuziunea cap-
la-cap a cromozomilor si cu rol de a tranzita celula in diversele stadii ale
ciclului celular, dar si cu rol de a mentine configuratia corecta a ADNului
din extensia telomerica 3'. In caz ca proteina TFR2 se pierde, dispar cozile G
cu posibilitatea fuziunii cromozomilor (Kanoh si col. 2003).
La nivelul ADN-ului telomeric gasim si proteine de tipul:
Pin 2 cu rol in reglarea mitotica (Kishi si Lu, 2002);
PinXi un inhibitor al activitatii telomerazei;
TIN 2 (TFR1- interacting nuclear protein 2) cu rol in reglarea
lungimii proteinelor;
Trankiraza cu rol de a elibera TRF1 endogen de pe telomere.

Sunt identificate si alte tipuri de proteine telomerice cum sunt:

- proteinele: Ku;
- proteinele h Rapl (human represor activator protein 1);
- proteinele Patl (protection of telomeres);
- proteinele PTOP (Pot interacting protein);

115
6.1. Replicarea si repararea telomerelor

Prin identificarea telomerazei, complex ribonucleoproteic, s-a stabilit ca

ADN-ul telomeric se replica printr-un mecanism particular care antreneaza o
degradare progresiva a repetitiilor telomerice.
Koering si Gilson (1998) considerau ca eroziunea telomerelor controleaza
numarul de diviziuni celulare, prin pierderea controlului asupra diviziunii. Prin
pierderea de ADN telomeric consecintele ar fi:
- o semnificativa instabilitate a cromozomilor;
- o modificare a expresiei genelor ce pot preveni modificarile arhitecturii
nucleului.
Pierderea de ADN telomeric cu fiecare ciclu celular ar putea fi explicata
prin incapacitatea ADN-polimerazelor de a replica in intregime capatul 3 al catenei
intarziate si indepartarea segmentului ARN amorsa de la capatul 5' al catenei
conducatoare (vezi sinteza ADN). Aceasta ipoteza a fost lansata de Dahse si col.
(1997) de Cong si Bacchetti (2000).
Telomeraza sintetizeaza ADN-ul telomeric pe matrita de „ARN primer,
amorsa".
Implicarea ARN-ului primer si a telomerazei in sinteza telomerelor a fost
demonstrata prin metoda clonarii telomerelor la cromozomii eucariotelor. Prin
clonare s-a observat ca in telomer are loc o „sinteza de novo pe matrita de ADN
sintetizat de novo". S-a stabilit ca ARN-ul primer, amorsa, este eel care introduce
matrita pentru sinteza secventei repetitive 5'-TTAGGG-3', iar telomeraza activeaza
aceasta sinteza.
Sunt probe care confirma ca activitatea telomerazei are specificitate de
tesut sau de linie celulara. De exemplu, la cromozomii umani din celulele gametice
lungimea telomerelor este mai mare decat a telomerelor din cromozomii celulelor
somatice. Explicatia ar fi ca in celula gametica numarul secventelor telomerice
repetitive este mai mare (ex. in cromozomul y). Reducerea lungimii telomerelor in
celulele somatice impune o reducere a activitatii telomerazei, avand ca efect
pierderea progresiva de cromatina cromozomala cu fiecare ciclu celular. Ipotetic,
acest proces de pierdere de cromatina cromozomala poate fi considerat un
„mecanism" de „programare" si evolutie progresiva a „secventei" si moartea
celulara. De aceea se presupune ca reducerea si/sau absenta activitatii telomerazei
ar fi consecinta pierderii progresive a secventelor de ADN repetitive din telomere,
justificand incetarea ciclului mitotic i moartea celulelor.
Pe baza acestui rationament, ipotetic, se considera ca imunosenescenta
precoce in sindromul Down ar fi cauzata de pierderea

116
 progresiva si recesiva a telomerelor. Counter si Herby presupun acelasi
mecanism si la subiectii cu senescenta ontogenica.
O observatie importanta si de mare perspectiva pentru „terapia
genetica" este studiul facut pe tumorile ovariene la femei privind prezenta si
activitatea telomerazei, mai exact intensitatea activitatii enzimei.
Un asemenea studiu facut de Clark si Wali (1996), dar mai ales prin
valoarea datelor obtinute, va pune problema prevenirii „senescentei si mortii
celulare" prin deletii telomerice. Ar fi o masura profilactico-preventiva
deoarece in senescenta celulara, dar mai ales in celulele canceroase,
activitatea telomerazei este redusa sau chiar absenta. De aceea mentinerea
integritatii celulare (integritatea genetica), pentru supravietuirea si
prelungirea vietii unei linii celulare normale ar presupune o refacere/reparare
a telomerelor in urma fisurilor care au avut loc la acest segment
cromozomial.
In acest context, telomeraza este foarte eficienta in mentinerea
repetitiilor telomerice existente (Biessmann si Mason, 2003), iar Dahlen si
col. 2003 considera ca datorita existentei unei relatii stranse intre replicare si
complexul telomerazic se mentine lungimea telomerelor si stabilitatea
telomerazei, iar o mutatie la nivelul unui component din acest complex
afecteaza mentinerea lungimii telomerelor.
Ipoteza repararii telomerelor se bazeaza pe unele cercetari facute la
nevertebrate.
S-a demonstrat ca un cromozom, dupa ce a suportat o fisura
telomerica (deletia telomerica), nu se mai scurteaza in urmatoarele cicluri
celulare. Acest aspect evidentiaza ca secventa repetitiva care a ramas in
telomer, realizeaza prin intermediul ARN-ului matrita (primer) si activitatii
telomerazei o crestere a numarului de secvente telomerice repetitive,
mentinand cromozomul in stare functionala din punct de vedere genetic si
supravietuirea celulelor.

6.2. Efectele secundare determinate de nerepararea

telomerelor
In prezent nu s-au semnalat mecanisme active de reparare a
telomerelor, dar sunt bine cunoscute efectele secundare induse de
microdeletiile telomerice care nu sunt reparate. De exemplu, microdeletiile
telomerice prin care se pierde ADN indue o „insuficienta" haploida a
genomului cu efecte severe asupra produsului de conceptie.
Asemenea microdeletii telomerice sunt identificate, ca etiologie
genetica, in sindromul Wolf- Hirschom (4p") si sindromul Miller - Dieker
(17p").

117
 S-a lansat ipoteza ca in celulele canceroase se produc deletn
telomerice ale cromozomilor urmate de translocatii criptice „ascunse" ce s-ar
stabiliza prin aditionari repetate de telomere provenite, prin deletia, de la alti
cromozomi. Un asemenea mecanism se presupune pentru cromozomul 6
uman in melanom.
Deasemenea, un alt criteriu etiologic de diagnostic in diversele tipuri
de tumori canceroase, este analiza lungimii telomerelor. S-a observat ca in
diversele celule tumorale lungimea telomerelor variaza „anormal" fata de
telomerele cromozomilor din celulele normale. O confirmare a valorii acestui
criteriu sunt studiile efectuate pe celulele canceroase din tumorile
intracraniene. De exemplu, prin investigarea a 60 de pacienti cu tumori
cerebrale s-a constatat ca in 41 din cazuri cromozomii prezentau telomere
foarte lungi, fata de normal, in 21,7 cazuri telomerele erau foarte scurte si
numai in 36,7 din cazuri telomerele aveau lungimea in limitele normale.
Acest studiu a fost facut, luandu-se ca celule de referinta.

6.3. Rolul telomerelor

Telomerele nu contin informatie genetica, dar sunt de importanta
deosebita pentru fiecare ciclu celular parcurs de o celula somatica. Ca urmare
telomerele au urmatoarele atributii in viata celulei:
a - datorita structurii secventelor repetitive de ADN si a
„palindromului" in „ac de par", telomerele asigura integritatea celulelor si
stabilizarea - individualitatea fiecarui cromozom;
b - se presupune rolul telomerelor initierea cuplarii cromozomilor
omologi in zigonemul profazei primare a meiozei reductionale, rezultand
bivalentii;
c - telomerele ar functiona ca niste terminatii cromatidice „inerte" cu
rol in prevenirea scurtarii cromozomului la fiecare ciclu mitotic.
d - telomerele ar avea „capacitatea" de a recunoaste ADN-ul defect,
nereparat. Recunoasterea cromozomilor intacti sau cu ADN defect ar explica:
- repararea cromozomilor in zona telomerica;
- „regenerarea" unei linii celulare, supravietuirea celulelor, cuplata
functia cu activitatea telomerica
- stoparea senescentei si moartea celulei.
e - scurtarea telomerelor prin microdeletii, proces posibil a avea loc cu
fiecare ciclu celular (respectiv ciclu mitotic), influenteaza numarul de
diviziuni al respectivei linii celulare, ducand la senescenta si apoptoza
celulara. Rata scurtarii telomerelor variaza intre 50-150 pb/diviziune

118
celulara. Un aspect de retinut legat de scurtarea telomerelor este
cromozomul 17p uman, care, datorita prezentei telomerelor scurte nu se
pierde printre primii cromozomi. Blasca (1999) a observat ca scurtarea
telomerelor la cromozomii umani 22p, lp si 5p, acelereaza senescenta
celulelor;
f - Counter (1992), cercetand ciclurile mitotice si meiotice la om a
observat urmatoarele:
- cromozomii cu telomere scurte nu sunt recombinogenici;
- telomerele sever scurtate, due la pierderea integritatii
cromozomiale, indue instabilitate genetica si pierderea capacitatii celulei de
a se divide;
g - Stabilizarea lungimii telomerelor cu ajutorul telomerazei asigura
prelungirea vietii celulei si o senescenta celulara tardiva;
h - lungimea telomerelor la mamifere si om este influentata de
structura cromatinei telomerice. Confirmarea ese cromozomul X inactiv
interfazic. Cromozomul sexual X inactiv fund heterocromatic, hipermetilat
si cu histone subacetilate, ar sugera o corelatie intre structura cromatinei si
mecanismul de mentinere a lungimii telomerelor.

7. Structura moleculara a cromozomilor la eucariote

In celulele eucariote cromozomii au in structura lor urmatoarele

molecule: ADN, proteine histonice, proteine nonhistonice, ARN, Mg, Ca,
glucide, lipide.

a)- ADN-ul cromozomial

ADN-ul este o prezenta constanta in structura cromozomului.
In celula somatica la eucariote, in nucleu exista 97-99% din totalul
ADN-ului celular, iar 1-3% gasim in mitocondriile citoplasmatice.
In cromozomi cantitatea de ADN este de 30-40%>. Genomul uman
contine 3 x 10 pb pentru fiecare cromozom. In fiecare cromozom se gaseste o
molecula liniara de ADN care cuprinde ADN cu secvente unice, ADN
moderat repetitiv si ADN inalt repetitiv (cu secvente foarte scurte
necodificatoare care se repeta de un numar foarte mare de ori). (a se vedea
tipurile de ADN celular, capitolul II).
Cantitatea ADN-ului cromozomial nu exprima un raport direct
proportional cu complexitatea structural functionala, cu evolutia j
filogenetica a speciilor. De exemplu, amfibienii au cea ma mare cantitate de I
ADN in genomul celular in raport cu existentul ADN in genomul celulei

119
umane. Un exemplu interesant il reprezinta lalelele (plante) care au in genom
o cantitate de 10 ori mai mult ADN fata de genomul uman.
Prin analizele fizico-chimice si stabilirea masei moleculare a ADN, in
componentele nucleotidice (3,2 Gb - giga baze) s-ar gasi 3,2 x 10 pb.
Dupa Kaplan (1989), fiecare cromozom contine o molecula de ADN.
La unele eucanote lungimea moleculelor din componenta
Q

cromozomilor variaza intre 6,7 x 10 pana la 1x10 pb.

Casperson, folosind metoda microspectrofotometrica in UV a stabilit
ca, in general, continutul ADN-ului intracromozomial este proportional cu
lungimea fiecarui cromozom. De exemplu, cromozomul 1 cu lungimea cea
mai mare din genomul uman, contine 279 Mb, iar cromozomul 22, eel mai
mic, acrocentric, are 48 Mb.
Continutul pb in cromozomi umani, de la 1 la 22 (autozomii), valoric
descreste progresiv de la 279 Mb pana la 45 Mb pentru cromozomul 21, si 48
Mb pentru cromozomul 22.

b) - ARN-ul cromozomial
In extractele nucleare s-au identificat molecule hibride ADN -ARN.
Asemenea complexe hibride variaza cantitativ cu fazele ciclului celular. De
exemplu, in stadiul interfazic Gl, cantitatea de ARN in cromozomi este
crescuta. Aceasta crestere a moleculelor de ARN in nucleu este motivata
deoarece in acest stadiu are loc in celula o activitate intensa de sinteza a
proteinelor, iar moleculele de ARN sunt necesare si implicate in aceste
procese de sinteza.
Cantitatea complexului hibrid ADN - ARN este crescuta in zonele
eucromatice ale cromozomului.
In stadiul interfazic „S" cand are loc replicarea ADN-ului
cromozomial, cantitatea de ARN este foarte redusa. In general in cromozomi
cantitatea de ARN variaza intre 12 si 13 %.

7.1. Proteinele cromozomale

La eucariote, ADN-ul din cromozomii nucleari este asociat cu

proteinele, formand complexe de nucleoproteine sau fibra de cromatina.
Proteinele din fibra de cromatina pot fi de doua tipuri: proteine de tip
histone si proteine non histone. In ansamblu cantitatea de proteine histonice
si nonhistonice din cromozomi este de 68-72 %.

120
7.1.1 Proteinele histonice
Histonele reprezinta o clasa de proteine bazice, cu masa moleculara
mica si incarcatura pozitiva. Ele interactioneaza cu gruparile fosfat din ADN
prin fortele electrostatice si ionice pentru a neutraliza incarcatura negativa a
acestor grupari.
Asocierea histonelor cu molecula ADN, cu fibrila ADN-ului
cromozomial, se face in stadiul S interfazic al ciclului celular, in imediata
vecinatate a bifurcatiei de replicare a ADN-ului.
Cuplarea histonelor cu ADN-ul si prezenta lor in structura
cromozomilor este numai la organismele eucariote. Genomul procariotelor
este lipsit de histone.
Structural, histonele lipsite de activitate enzimatica controleaza:
structura tertiara in dublu helix a moleculei de ADN, sunt implicate in
structura polinucleozomica a flbrilei de cromatina a cromozomilor nucleari.
Deasemenea histonele asigura spiralizarea si condensarea cromatinei, maresc
stabilitatea ADN-ului cromozomial.
Functional, histonele actioneaza ca represori ai activitatii genice prin
condensarea cromatinei si superspiralizarea ADN-ului, ADN care nu mai
poate functiona ca matrita in replicare, si transcriere in stare superspiralizata.
Prin metilare, acetilare si fosforilare, histonele indue modificari in procesele
de transcriptie ADN —* ARN.
Histonele au in structura lor o proportie crescuta de aminoacizi cu
sarcini pozitive (diamino-dicarboxilici), ceea ce permite cuplarea cu
gruparea fosfat din structura moleculei de ADN.
Histonele sunt alcatuite dintr-o catena polipeptidica cu un continut
bogat in aminoacizi bazici (lizina si arginina). In raport cu continutul in
aminoacizi bazici, histonele se grupeaza in:
-histone bogate in lizina si sarace in arginina;
-histone sarace in lizina dar bogate in arginina;
-histone sarace in lizina si putini amioacizi arginina.
Weintraub (1976), folosind metoda electroforetica si cromatografia cu
schimbatori de ioni, a identificat existenta a cinci tipuri de histone in
structura genomului la eucariote. Aceste histone au fost simbolizate cu
notatiile Hi, H2A, H2B, H3 si H4 (tabel):
-Hi este foarte bogata in lizina;
-H2/\ contine raporturi cantitativ egale de lizina si arginina;
-H213 contine un numar mai mare de lizina fata de arginina;
-H3 si H4 contin un numar foarte mare de arginina.

121
 Folosind electroforeza in gel, Weintraub a observat modificari
posttranslationale, identificand si subtipuri de histone.
Modificarile produse la nivelul histonelor „altereaza" incarcatura
electrica a moleculei, afectand interrelatia ADN - histona.
De exemplu, Matsumoto si col. (1980) au observat ca fosforilarea
histonei Hi se asociaza cu condensarea cromozomilor: fosfokinaza - histona
Hi initiaza mitoza si regleaza condensarea cromozomilor. Au demnostrat ca
acetilarea aminoacizilor din histona H4 determina deschiderea nucleului
histonic, proces asociat cu transcrierea regiunilor cromatinelor nucleare si
activarea ADN-ului ca matrita in transcrierea mesajului genetic.
Histonele H2A, H2B, H3 si H4 au secventa de aminoacizi conservata
filogenetic, ele fiind in raport echimolecular cu ADN-ul. Raportul ADN-
histona are valoarea ~ 1 pentru cele patru tipuri mentionate.
Prin tratarea fibrilei polinucleozomice cu tripsina si eliminarea
histonei Hi, fibrila polinucleozomica nu-si modifica structura, confirmandu-
se ca histona Hi nu participa la structura nucleozomului.

Tabel VII
Numarul de aminoacizi si masa molecuKi... a histonelor din timusul de
vitel (dupa Elgin si Wintraub, 1976 )

Tipul de Caracteristic Numar Masa

histona a generala aminoaci molecular
Hi Foarte bogata zi 216 a 21.500 d
in lizina
H2A Bogata in lizina 129 14.000 d
si arginina in
raporturi egale
H2B Contine mai 125 13.775 d
multa lizina, mai
putina arginina
H3 Bogata in arginina 135 15.320 d
H4 Bogata in arginina 102 11.280 d

Histonele sunt prezente in genomul tuturor eucariotelor. Totusi,

interesanta este identificarea unei proteine cu o structura apropiata de
histonele eucariotelor la Escherichia coli. Aceasta proteina a fost notata H,
desi procariotele nu au cromozomul cu structura nucleozomica.
Histonele Hi, cu o masa moleculara de 21500 d, reprezinta un grup de
proteine relativ heterogen. H] are 0 structura variabila la diferite specii.

122
Variabilitatea subtipurilor de histona Hi, apre ca modificari post-
translationale suferite. Pentru Hi se apreciaza o evolutie mai accelerata,
confirmata de identificarea a 15 - 30 subtipuri Hi la diverse specii, si
aproximativ 15 subfractii H] in diferitele tesuturi ale aceluiasi organism.
Histonele H2A, H2B, H3 si H4 se caracterizeaza printr-un
conservatorism structural, fara a prezenta subtipuri histonice. Datorita
conservatorismului celor patru tipuri de histone, consemnam 0 asemanare (nu
identitate) a raportului de aminoacizi la histonele din genomul regnului
vegetal si animal. De exemplu histona H4 de la Pissum sativum (mazare) are
secventa in aminoacizi aproape identica cu cea de la Bos taurus (vitel).
Histonele H2A, H2B, H3 si H4 sunt proteine cu o masa moleculara
cuprinsa intre 22000 d si 14000 d. Datorita numarului mare de aminoacizi
bazici (diaminoacizi) valoarea pH ajunge la ~ 10. Ca urmare, prin gruparea -
NH2 din structura, aminoacizii interactioneaza cu electronii negativi din
gruparea fosfat a ADN-ului cromozomial.
Structura invariabila filogenetic a histonelor H2A, H213, H3 si H4
explica rolul universal si important in structura cromozomilor.
Daca Hi are o variabilitate accentuata filogenetic, determinata de
modificarile post-translationale, eventualele diferente ale histonelor H2A,
H2B, H3 si H4 ar fi determinate de unele divergente evolutive.
Cele mai conservatoare histone, prin structura, sunt histonele H2A, H3
si H4 . De exemplu, histona H4 are 0 rata a evolutiei de 0,06 mutatii pe 100
reziduuri de aminoacizi in 100 milioane de ani, in timp ce rata evolutiei
fibrinei este de 80 mutatii, iar a hemoglobinei de 20 mutatii in 100 milioane
de ani.
Histonele H2A, H2B, H3 si H4 sunt hidrofobe - acide la capatul C-
terminal si hidrofobe -bazice la capatul N-terminal. Regiunea C-terminala ire
aspect globular si e bogata in aminoacizi hidrofobi - leucina si izoleucina -
sau in aminoacizi destabilizatori ai duplexului ADN- glicina si 3rolina.
Presiunea selectiva a conservat regiunea globulara din necesitatea nteractiunii
histona-histona, sau histona-nonhistona.
S-a constatat ca prin fosforilare, acetilare sau metilare a histonelor
ipar modificari post - translationale. De exemplu, prin fosforilare se >roduce
o crestere a sarcinilor pozitive (+), prin acetilare sau metilare are oc o
scadere a sarcinilor pozitive (+) dar cresc sarcinile negative (-). Prin iceste
modificari de sarcini (+) si/sau (-) se modifica fortele de interactie ntre
familia histonelor H2A, H2B, H3 si H4 si ADN, interactional^ in irocesele
de translatie si replicarea genelor, avand rol de modulare.

123
 Histona Hi se asociza, ca „monomer", cu ADN-ul, in timp ce H2A,
H2B, H3 si H4 formeaza dimeri care se vor asocia intre ei, rezultand un
octamer, in jurul caruia se infasoara duplexul ADN, formand nucleozomul.
Legarea histonelor de ADN se face prin legaturi ionice intre gruparea
fosfat a ADN-ului si gruparile amino ale histonelor.
De exemplu Hi, H2A si H2B se leaga prin resturile lizina la perechile A-
T, iar H3 si H4 se leaga prin resturi de arginina la cuplul complementar G -C.
Histonele se cupleaza cu ADN in depresiunea (adancitura) mare a
moleculei ADN, atat in zonele eucromatice, cat si heterocromatice.
Genele care codifica familia proteinelor histonice sunt localizate si
dispuse in tandem pe aceeasi molecula ADN, ele fiind prezente in multe copii
in genom.
Genele care codifica histonele sunt reprezentate de secvente scurte.
Unele gene de sinteza a histonelor sunt inserate printre secventele ADN-ului
moderat repetitiv. Aceste gene sunt denumite si „histogene". Se presupune ca
histogenele sunt rezultate prin duplicatia secventelor nucleotidice din genom,
sau prin crossing-over inegal intragenic.
Histonele bogate in arginina inhiba sinteza ARN-ului, iar cele bogate
in lizina au un proces de inhibitie a ARN mai moderat, mai redus.
La eucariote, histonele sunt sintetizate sub controlul secventelor
oligonucleotidice, incluse discontinuu si in ADN-ul moderat repetitiv.
Genele care codifica sinteza histonelor sunt transmise numai in
stadiul S interfazic al ciclului celular. Moleculele de ARNm pentru histone,
cu numar mic de nucleotide, nu sunt poliadenilate, sunt lipsite de introni.
Omul contine pe cromozomii 1, 6 si 12 aproximativ 20 de gene care
codifica histonele.
Genele care codifica histonele sunt grupate pe o secventa a moleculei
ADN de 6-9 kb, iar transcrierea lor se face separat.
Numarul mare al secventelor genice repetate pentru histone ar fi
urmarea recombinarilor intragenice inegale selectionate in evolutia bio-
genetica.

7.1.2. Proteinele non-histonice

Pe langa proteinele histone, in structura cromatinei cromozomiale

intra si proteinele non-histonice sau hertonele. Este o clasa foarte heterogena
de proteine acide.

124
 Sunt mult diversificate, aproximativ 115 proteine cu proprietati fizico -
chimice si biologice diferite. Non-histonele nu se caracterizeaza prin
histospecificitate marcata.
Sunt bogate in aminoacizi cu pH acid, cum sunt: ac. glutamic, ac. aspartic,
triptofanul. pH-ul acestor proteine non-histonice variaza pe o scara larga, intre pH
3—■» 10.
Proteinele non - histonice sunt reprezentate de un complex de enzime ca:
ADN-polimeraza, ARN-polimeraza, NAD-sintetaza (nicotinamid-adenin-
dinucleotid-sintetaza), metilaze, acetilaze, nucleaze, fosfokinaze. Este complexul
enzimatic necesar replicarii, transcriptiei si maturarii ARNm, replicarii moleculei
de ADN, etc. Din grupa proteinelor non-histonice fac parte activatorii si represorii
genelor din structure si activitatea operonilor, proteinele contractile de tipul
tubulinei, actinei si miozinei, proteine care intervin in mecanica fusului de
diviziune in metafaza si anafaza ciclului mitotic sau meiotic. Unele non-histone
sunt sensibile la prezenta hormonilor steroizi, tiroxina etc.
Un grup majoritar de proteine non-histonice este reprezentat de proteinele
HMG (Hight Mobility Group) prezente la toate eucariotele. Sunt identificate patru
tipuri principale de HMG: HMGi, HMG2, HMG14 si HMG17. Structura acestor
proteine este bipolara: la o extremitate a moleculei sunt localizati aminoacizii
bazici, la extremitatea opusa, aminoacizii acizi. Aceasta dubla polaritate
structurala este presupusa ca fiind interactiunea lor cu histonele si ADN-ul din
cromatina nucleara. In perioada interfazica le gasim, ca localizare in citoplasma,
ca apoi, in stadiul S sa migreze spre nucleu, unde pot fi implicate in replicarea
ADN si in transcriptie. S-a mai constatat ca numai HMGi si HMG2 tree din
citoplasma spre nucleu, in timp ce HMG14 si HMGi7 se gasesc permanent in
nucleu, unde interactioneaza cu nucleozomii.
Pentru complexul de proteine non-histonice in special pentru clasa HMG
in genomul nuclear exista un mare numar de gene repetate. Se presupune ca in
genom ar exista intre 20-30 gene copii (repetate) pentru fiecare tip de HMG.
Aceste gene HMG sunt lipsite de introni ca si genele care codifica histonele (si ele
sunt lipsite de introni).
In genomul uman, singurele gene donate pana in prezent care codifica
proteinele non-histonice sunt genele pentru HMG14 si HMGi 7.
Tot din grupa non-histonelor fac parte doua peptide, notate: Scl de 170 kd9
si Sc2 de 135 kd (Sc provine de la scafoid = schela). Acest grup de

kd (kilodalton) = 1000 daltoni. 1 dalton (d) este o unitate atomica a masei moleculare.

125
nonhistone au fost identificate, in celulele HeLa1 dupa eliminarea histonelor.
Se presupune ca grupul de peptide Scl si Sc2 ar avea rol in conservarea
cromozomului metafazic, asigurand integritatea cromozomului.
In prezent sunt identificate peste 120 tipuri diferite de nonhistone care
se deosebesc intre ele si prin masa moleculara care variaza in limite foarte
largi: intre 10-150 kd.
Proteinele non-histonice sunt sintetizate in citoplasma celulei, dupa
care vor traversa porii anvelopei nucleare, trecand in nucleu. Proteinele non-
histonice au o rata de sinteza foarte crescuta, dar si de degradare.
Cantitati crescute de non-histone sunt gasite in nucleii celulelor cu
activitate foarte intensa.
Eucromatina contine mari cantitati de non-histone, iar
heterocromatina o cantitate foarte mica. Non-histonele pot interactiona cu
histonele, cu ADN-ul si ARN-ul.
Cantitativ, non-histonele variaza in raport cu fazele ciclului celular,
sau cu tipul de celula din organism.
Deoarece non-histonele sunt implicate in activarea specifica a
genelor, fosforilarea lor este esentiala.
Non-histonele, interactionand cu ADN-ul, modifica transcriptia (o
influenteaza) si stimuleaza sinteza ARNm.
Sinteza lor, independenta de sinteza ADN, se desfasoara pe intreg
ciclul celular.
Cu rol esential in expresia genelor in timpul ciclului celular, pot
recunoaste specific, secvente nucleotidice din ADN.
Pana in 1973, configuratia spatiala, ADN-proteine a fost interpretata
si analizata cu „erori". In prezent prin analiza imaginilor electrono-
microscopice si a datelor rezultate din tratarea enzimatica a fibrilei ADN-
proteine, sau interpretarea spectrelor de difractie a razelor X, asocierea ADN-
proteine si configuratia in interiorul cromozomilor este corect si complet
elucidata.
Unitatea de referinta pentru a analiza configuratia fibrilei de ADN-
proteine a fost cromozomul acrocentric numarul 13 din genomul uman.
Cromozomul 13 prezinta urmatoarele componente valorice:
- molecula de ADN in dublu helix, din cromozom, dispusa liniar, are
o lungime de 32000 JU;

HeLa - linie de celule epiteloide umane provenite dintr-un carcinom de col

uterin, prelevate de la bolnava si mentinute in cultura celulara continua.

126
 - ca dimensiuni, cromozomul 13 are o lungime de 5,8/x si grosimea
de 0,8/z.
Cercetatorii au cautat sa clarifice care este conformatia „anatomica" a
fibrilei ADN-proteine in cromozomi, cu respectarea dimensiunii
cromozomului si exercitarea functiilor de baza ale ADN. Au clarificat
implicarea proteinelor de tip histone in aceasta configuratie, rolul lor.
Primele observatii apartin lui Golumb si Bahr (1974) care au
confirmat ca fibrila ADN-proteine cu diametrul de 2,5 - 6 nm, este integrata
intr-o structura fibrilara mai complexa a carei rata de pliere, stabilita de ei
este de 20/1, observatii confirmate de Kornberg (1974), Weintraub (1976),
Finch (1977) s.a.
Cercetarile care au urmat (Burkholder, 1988 si Strachan-Read, 1999)
au evindentiat ca fibrila de ADN din cromozom, formeaza mici bucle in jurul
unor molecule proteice de tip histone.

8. Configuratia „anatomica" a cromozomiior

La eucariote, genomul celular este reprezentat de seturi de molecule

„liniare" de ADN, fiecare set fiind inclus in structura si arhitectura unui
cromozom.
Comparandu-se talia cromozomiior cu numarul si lungimea
moleculelor de ADN se constata diferente valorice impresionante,
cromozomii avand dimensiuni de ordinul micronilor.
De exemplu intr-un cromozom de talie medie din grupa III ( a carui
lungime sa fie de 4,5/x) se gaseste un filament ADN a carui lungime liniara
ajunge la aproximativ 5 cm.
In aceste conditii putem considera ca fibrila de ADN cuplata cu
histone are o configuratie „anatomica", o anume dispozitie ca „arhitectura,,
supramoleculara, pentru a depozita respectiva fibrila de ADN - histona de 5
cm intr-un cromozom micrometric. Configuratia fibrilei de ADN asigura un
depozit impresionant de informatie genetica in fiecare cromozom.
La organismele eucariote sistemul conformational este bine organizat
asigurand, intergral functiile ADN-ului cromozomial:
functia autocatalitica;
functia heterocatalitica;
functia de variabilitate a aparatului genetic.
Sistemul conformational al ADN-ului in cromozomi este conditionat,
prin asociere, de proteinele de tip histone.

127
 Asocierea ADN-histone era cunoscuta inainte de anul 1970. S-a
stabilit ca ADN-ul se cupleaza cu histonele, formand fibrila de nucleo-
proteica, dar mecanismul de asociere si stabilitate nu era corect definit.
Asocierea a fost denumita „fibrila fina de tip A" formata din ADN si
histone.
Kornberg (1974), Burkholder (1988) si Romarkrishnam (1997) au
constata ca fibrila fina de tip A, spatial, are o dispozitie complexa,
determinand o crestere in dimensiune, pe care au denumit-o „fibrila
elementara de tip B" cu grosimea de 20-30 nm.
In 1999, Shachan si Read, folosind metoda difractiei razelor X, au
constatat ca dimensiunea fibrilei fine de tip A este de 10-11 nm, iar prin
supersuper-spiralizare si trecuta in fibrila elementara de tip B, dimensiunea
depaseste 20-30 nm. Prin aceste observatii se confirma datele lui Golumb si
Bahr (1974) ca fibrila de tip B, este o stare conformational- spatiala a fibrilei
de tip A. Fibrila B avand o arhitectura mai complexa.
In prezent se accepta ca fibrilele de tip A si B sunt doua stari fizico-
chimice a ADN- histone datorita fortelor de atractie intre moleculele de
histone pentru fibrila fina de tip A si interactiei intre nucleele proteice
invecinate, pentru fibrila elementara de tip B.
Fibrilele A si B sunt etape de aranjare complexa a asocierii ADN-ului
cu histonele.
Datele actuale confirma ca in fiecare cromozom exista o fibrila de
ADN cu lungime si numar perechi de baze caracteristice.
Fibrila de ADN-histona realizeaza o arhitectura si conformatie
„anatomica", particulara fiecarui cromozom din genomul uman.
S-a mai demonstrat ca in metafaza ciclului mitotic sau meiotic fibrila
de nucleo-proteina realizeaza niveluri de pliere, supersuperspiralizare,
condensare si rasucire care reduc considerabil lungimea fibrilei, pana la
1/10000. Prin aceasta conformatie supramoleculara este acceptat imensul
depozit de material genetic intr-un cromozom micrometric.

8.1. Arhitectura supramoleculara sau „anatomia"

cromozomilor umani

Folosindu-se metode biochimice (enzimatice) difractia razelor X si

imaginile electronomicroscopice s-a observat ca in cromozom, fibrila de
nucleo-proteina realizeaza o „arhitectura" dispusa pe patru nivele de
organizare si dispozitie spatiala (fig. 34):

128
nivelul sau structura primara a cromozomilor - nivelul nucleozomic; nivelul
sau structura secundara - nivelul solenoidic; nivelul sau structura tertiara -
nivelul bucleiform; structura cuatemara - hiperspiralizarea si condensarea
buclelor cromozomale.

Fig. 34 Arhitectura supramoleculara a fibrilei de ADN in cromozomii

eucariotici (dupa Strachan si Read, 1999).

8.1.1 -Nucleozomui- structura primara a cromozomului

Unitatea de baza a structurii cromatinei nucleare este nucleozomui. Ca

nivel al structurii primare, nucleozomui este unitatea fundamentala a fibrilei
fine de tipA, cu aspect perlat sau corpuscular, cu diametrul de 1 lnm.
Formatiunile corpusculare sunt separate intre ele de secvente nucleotidice din
structura ADN-ului, secvente ce au un diametru de aproximativ 2nm (fig. 35).

129
 Nucleu proteic (8
molec. de histone)

Fig. 35 Nucleosomi
a) structura nucleosomului
b) imaginea electronomicroscopica a polinucleozomica la pasare
(300.000 X)
fibrei de cromatina

Supusa actiimii enzimelor s-a stabilit ca formatiunea corpusculara

care cuprinde si segmentul intercorpuscular, are un numar de aproximativ
200 pb.
Prin metoda socului osmotic si analiza electronomicroscopica s-a
evidentiat ca structura primara a cromozomului are aspect „perlat". Fiecare

130
„perla" sau corpuscul este compus dintr-un nucleu proteic, format din 8 molecule
de histone, cate doua molecule de H2A, H2B, H3 si H4, deci un octomer.
Nucleozomii au fost denumiti si corpusculi „m" sau particule

Structura completa a nucleozomului este urmatoare octomerului de

histone, care se asociaza cu o secventa de 140pb din molecula ADN, care se
inruleaza cu o rotatie completa de 360° si trei sferturi. In componenta
nucleozomului intra si unele proteine non-histonice de tipul nucleoplasminelor Ni
si N2. Un nucleozom este separat de nucleozomul urmator de o secventa de 60 pb.
Stabilitatea nucleozomului este asigurata de fortele de atractie stabilite
intre histonele din nucleul proteic, iar stabilitatea fibrilei polinucleozomice este
determinata de fortele de interactie existenta intre nucleozomi.
S-a constatat ca „in vivo" asamblarea histonelor in nucleozom se face in
prezenta nucleopasminelor Ni si N2, care sunt proteine non-histonice acide, cu
rolul de a neutraliza respingerea electrostatica dintre histone, cupleaza histona-
histona, determinand stabilitate nucleozomului.
S-a stabilit ca histonele au un centru hidrofob cu radicali bazici datorita
aminoacizilor arginina si lizina.
In cazul acetilarii, metilarii sau fosforilarii histonelor, considerate
modificari epigenetice, nucleozomul nu mai prezinta stabilitate, se disociaza.
Aceste modificari au loc in timpul transcrierii mesajului genetic inscris in secventa
de nucleotide spiralizata in jurul nucleului din zonele eucromatice ale
cromozomului.
Cu ajutorul topoizomerazei, a nucleoplasminelor Ni si N2 nucleul proteic
poate fi disociat intr-un tetramer compus din H3 si H4. Tetramerul H3 si H4 se
cupleaza cu tetramerul format din histonele H2A si H2B intregind structura nucleului
proteic.
Histonele H3 si H4 formeaza zona centrala a nucleului proteic pe care se
inruleaza superhelixul de ADN. Histonele H2A si H2B se ataseaza, cate doua
molecule pe fiecare fata a tetramerului H3 si H4.
Daca H3 si H4 asigura proprietati asemanatoare nucleozomului si in
absenta lui H2A si H2B , histonele H2A si H2B nu asigura proprietati nucleozomice in
lipsa celorlalte tipuri (H3 si H4).
Spatial, forma geometrica a nucleozomului este ca 0 sfera turtita sau
cilindru turtit cu diametral de l l n m si 5,5 nm inaltime. Datorita turtirii discoidal
biconvexe, nucleozomul a fost denumit si platisom.

131
 Histona Hi nu participa la structura nucleozomului. Hi este localizata
pe secventele a cate 23 pb la intrarea si iesirea fibrilei de ADN, inainte si
dupa ce a realizat inrularea in jurul nucleului proteic. Aceasta Hi induce o
rigiditate secventei polinucleotidice asigurand separarea nucleozomilor, in
fibrila polinucleozomica din cromozomi. Aceasta secventa polinucleotidica
dintre doi nucleozomi vecini se numeste fragment de legatura sau „ADN-
linker".
Fosforilarea histonei Hi este semnalul care determina condensarea
cromatinei cromozomale si declansarea ciclului mitotic sau meiotic.
Prin realizarea fibrilei polinucleozomice din cromozom, fibrila
elementara de ADN isi reduce lungimea de 6-7 ori.
In timpul replicarii ADN-ului sau de transcriere a mesajului genetic
intr-o molecula de ARNm, stabilitatea nucleozomului este redusa datorita
modificarilor ,,epigenetice". Prin metilare acetilare sau fosforilarea
aminoacizilor lizina si/sau arginina sunt modificate fortele de atractie histona-
histona, nucleozomul se disociaza iar ADNul poate sa transcrie mesajul sau sa
se sintetizeze prin autoreplicare.

8.1.2 -Solenoidul- structura secundara a cromozomului

Structura secundara a cromozomului a fost si este studiata prin metode

cristalografice, spectre de difractie a razelor X, difractia neutronilor si analiza
imaginilor electronomicroscopice. Datele obtinute de Vogel si Matulsky
(1982,1988) si Vogel si Grumwald (1994) au permis enuntarea urmatoarei
ipoteze : ADNul din cromozomii eucariotelor se cupleaza cu histonele
formand nucleozomii, rezultand fibrila poli-perlata, polinucleozomica sau
„super - helixul cromatinian". Fibrila polinucleozomica realizeaza la randul ei
o superinrulare de tip levogir rezultand „structuri" inalt ordonate ale
cromozomilor. Aceste structuri echivaleaza cu „super-super-helixuri". In
aceste super-super-helixuri nucleozomii adiacenti sunt grupati intr-un helix
comun ADN-proteina. Formatiunea care rezulta este numita solenoid, avand
dimensiune variabila (intre 30-60 nm) (fig. 36).

132
"

Fig. 36 Cromatina superspiralizata (solenoidul)

Prin suprainfasurare si gruparea a 6-7 nucleozomi la o rotatie de 360°
se formeaza si solenoidul.
Aceasta conformatie „arhitecturala" este stabilizata de fortele de
interactie ale nucleozomilor adiacenti de interactiuni intre regiunile
hipervariabile N-terminale si COOH terminale ale histonelor Hi prezente pe
secventa polinucleozomica ce se inruleaza. Rolul histonei Hi in formarea
solenoidului este important deoarece prin prezenta a doua lanturi
polipeptidice asigura urmatoarele interactiuni: un lant polipeptidic
interactioneaza cu ADNul dintr-un nucleozom, iar cu eel de-al doilea lant va
interactiona cu ADN-ul din nucleozomul urmator.

133
 Histona Hi ar actiona ca o „grefa" care grupeaza nucleozomii, asigurand
stabilitate superstructurii in solenoid.
La aceasta conformatie „anatomica" supramoleculara sunt implicate si
proteinele non-histonice din clasa HMG prin subtipurile HMG14 si
HMG17.
Prin dispozitia polisolenoidica fibrila de ADN din cromozom, in stadiul
G2 interfazic, isi reduce lungimea de 50 de ori, fata de stadiul Gi cand fibrila
polinucleozomica are 0 reducere de 7 ori.
Gradul eel mai inalt de compactare solenoidica a cromatinei s-a observat in
nucleul spemiatozoidului cand histonele sunt inlocuite cu protamine. Dupa
fecundatie histonele sunt reintroduse in structura fibrilei de ADN.
O observatie interesanta apartine lui Lima de Faria (1975) care a anticipat
notiunea de solenoid prin folosire de imitate cromomer . Dupa Faria cromomerele
sunt configuratii sferice in permanenta schimbare. Nu erau considerate replicari sau
unitati de transcriere. Cromomerele erau considerate structuri cromozomale de
tranzit, ca un „fenotip cromozomal".

8.1.3 Bucla cromozomala ca structura tertiara

Tratarea cromozomilor in metafaza mitotica sau meiotica folosind 0 solutie

de NaCl 2M, acestia prezinta 0 retea fibroasa orientata axial, inconjurata de un
halou de fibre ADN cu structura solenoidica. Aceste fibre au aspect bucleiform,
dimensiuni variabile find orientate in toate directiile (fig. 37).
Aceste bucle au ca baza axul longitudinal al cromozomului.
Ca structura moleculara, buclele contin intre 5 pana la 200 kb ADN, cu o
valoare medie de 65kb.

134
 Retea interna

Fig. 3 7 Organizarea bucleiforma a flbrilei de ADN in cromozom. Structure

tertiara. ADN-ul genomic este organizat in bucle de 5 si 200 Kb. Buclele sunt
ancorate cu proteine scheletice foarte specifice ADN-ului din regiunile SARs
(Scaffold Associated Regions). Dupa Clark si Wall 1992, reprodusa dupa
Gosser si Laemli, 1987).

Formarea buclelor din fibrila polisolenoidica si „conservarea" lor in

timpul metafazei cromozomilor este determinata de proteinele non-histonice
de tipul Scl si Sc2 („Scazzold"). Proteinele Scl si Sc2 asigura interactiuni
ADN-proteina si proteina-proteina. Prin interactiuni se formeaza o ampla
retea de fibre polisolenoidice dispuse bucleiform, orientate pe axul
longitudinal al cromozomului. Se presupune ca buclele ar reprezenta
subunitati functionale genetic si de replicare a cromozomilor, prin prezenta
asa numitelor replicari.

135
 Structura tertiara bucleiforma, realizeaza o reducere a lungimii fibrei
elementare de ADN in cromozom de aproximativ 1000 de ori.

8.1.4 Structura cuaternara a cromozomilor

In metafaza mitotica sau meiotica la eucariote, cromozomii sunt

supusi unei hipercondensari a buclelor cu orientare in spirala (rasucire) a
fibrilei de ADN bucleiform, urmand axul longitudinal al cromozomului
(fig.38).

Fig. 38 Structura cuaternara a cromozomului - Model propus de Filipski si

col.(1990) si reprodusa de Clark si Wall (1992).

136
 Fibrila bucleiforma se dispune spatial in razele hexametrice cu un
continut ADN de aproximativ 300 kb. In final, se obtine o fibra de 200-300
nm grosime pe axul longitudinal cromozomial.
Fibrila de ADN dispusa in razele bucleiforme hexametrice, prin
rasucire are imaginea unei bobinari.
Din imaginile electromicroscopice se apreciaza ca o rotatie de 360° a
fibrilei bucleiforme ar cuprinde aproximativ 30 rozete hexametrice. Prin
rasucirea rozetelor hexametrice si hipercondensare se stabilesc
particularitatile morfo-strcuturale ale cromozomului in metafaza mitotica si
meiotica.
Filipski (1990), analizand cromozomii metafazici la mamifere,
apreciaza ca intr-un cromozom s-ar realiza intre 29-33 rotatii a rozetelor
hexametrice. Numarul de rotatii a rozetelor hexametrice si hipercondensate
est in raport cu cantitatea de ADN din cromozom.
Prin studiul arhitecturii cromozomilor metafazici de catre Helsop-
Harrison si col. (1988) s-a constatat ca la „bobinarea" rozetelor hexometrice
si condensare ar participa circa 30 proteine non-histonice de tipul HMG.
Colectivul condus de Heslop-Harrison a indentificat ca antigenul
nuclear AF2 este implicat direct in „bobinarea" si condensarea fibrilei
bucleiforme.
S-au mai identificat o clasa majora de non-histone desemnate Scl si
Sc2.
Sc2, cu masa moleculara de 135Kda, nu i se cunoaste inca rolul pe
care il are in structura cuaternara a cromozomilor.
Scl, cu masa moleculara de 170 Kda si in cantitate mai mare, a fost
identificata ca topoizomeraza II a ADNului / taza II. Se gasesc cate trei
molecule de taza II pentru fiecare bucla de ADN, cu localizare la baza
buclelor. Se presupune ca ar avea rol in condensarea cromatinei.
Proteinele non-histonice de tip MARs (matrix- associated regions),
interactionand cu topoizomerasa II asigura hipercondensarea cromozomilor
metafazici.
Bobinarea a cca 30 de rozete hexometrice la o rotatie de 360°, ar
realiza o grosime de 200-300 nm. Fiecare „bobina" ar echivala cu o banda
„G" la cromozomii umani.
Cromozomul 1 din genomul uman are prezenta in jur de 30 de rozete
hexametrice condensate.
In prezent sunt identificate majoritatea proteinelor non-histonice
esentiale, asociate cu structura retelei fibroase axiale cu rol in condensarea
cromozomilor in mitoza sau meioza.

137
 Prin bobinarea in spirala a fibrei de ADN bucleiform, insotita de
hipercondensare, firbila elelemtara de ADN isi reduce lungimea in metafaza
de aproximativ 10000 de ori.
Identificandu-se, etapizat, structura si arhitectura complexa a fiecarui
cromozom, intelegem si acceptam posibilitatea depozitarilor unor cantitati
mari de ADN, de ce in cromozomi exista in forma codificata o cantitate
impresionanta de infonnatie genetica pentru codificarea caratcterelor
exprimate fenotipic, in cromozomi cu dimensiune de ordinul micronilor.

9. Starile fizice ale cromozomilor

Heterocromatina si eucromatina

Emil Henilz (1935) a observat la plante si insectele cercetate,

cromozomi, sau secvente din cromozomi, uniform si intens colorati
(colorate), denumiti(denumite) heterocromatina.
Cercetarile au stabilit ca este o asociere intre ADNul nuclear si
proteinele histone, iar in raport de pliere, dispozitia fibrilei de nucleo-proteina
si starile functionale in interfaza celulara, colorantii bazici specifici sunt
puternic sau slab fixati in cromatina nucleara. In dinamica functionala a
ciclului celular, cromatina nucleara se prezinta, discontinuu, neuniform
colorata: heterocromatina si eucromatina.

9.1. Heterocromatina (He)

Heterocromatinele sunt segmentele cromatidice sau cromozomii cu

structura condensata, uniform si intens colorati in telofaza si interfaza
timpurie a celulei eucariotelor.
Semnalata initial la cromozomii sexuali, s-a observat ca si
cromozomii somatici (autozomi) au secvente heterocromatice.
Heterocromatina este determinata de secvente de ADN (moderat si
inalt) repetitiv, cuplate cu histone, cu un coeficient ridicat de pliere si
condensare pe lungimi si dimensiuni variabile. Extinderea si numarul

138
zonelor heterocromatice sunt particularitati caracteristice fiecarui
cromozom din genomul celular.
Regiunile heterocromatice sunt situsurile secventelor repetitive si
inactive informational, care au o replicare tardiva in stadiul S interfazic.
ADNul din zonele heterocromatice (repetitiv) isi exercita numai rolul
„egoist" de autoreplicare.
Sunt cateva exceptii de la regula de non-functionalitate a
heterocromatinei.
De exemplu, segmentele distale ale telomenelor, desi iieterocromatice,
indeplinesc functii vitale pentru celula, asigurand nentinerea in anumite
limite, dimensiunea si integritatea structural-morfo-iinctionala a
cromozomilor pe parcursul ciclurilor celulare. Aceste structuri elomerice
opresc scurtarea progresiva a cromozomilor. Daca ar lipsi ,mecanismul
telometric de protectie" a dimensiunii, structurii si functiei romozomilor din
genomul celular, celula ar fi distrusa (vezi structura elomenelor). Rolul
„protector" este asigurat de secventele hexanucleotidice TTAGGG- repetitive
care, filogenetic, sunt foarte bine conservate.
Exceptie de la regula nonfunctionalitatii heterocromatinei
romozomiale sunt si regiunile centromerilor si organizatorii nucleolari.
De exemplu, incadrat in definitia de heterocromatina, centromerul ste
implicat in dinamica fiecarui cromozom, datorita kinetocorului din
ltrastructura centromerica . Si anume kinetocorul se cupleaza cu fusul de
iviziune, implicat in procesul de citodiereza a cromozomilor in anafaza
litotica sau meiotica. Aceeasi exceptie de la regula nonfunctionalitatii
snetice prezinta „regiunile organizatori nucleolari ai acrocentricilor (RON,
ride, pe langa secventele inalt repetitive noninformationale, se gasesc
mltiple locusuri pentru genele care transcriu sinteza ARN-ribozomal).
Dupa Yunis si Yasmineh (1971) heterocromatina joaca un rol, in ;enta
„structural", protejand regiunile vitale ale genomului de actiunea structiva a
factorilor mutageni din mediul extern. Protejeaza genele de la velul
organizatorilor nucleolari de efectul mutatiilor si recombinarilor.
Tot heterocromatina poate stabili „bariere de fertilitate", cu lplicatii in
diversitatea animalelor in cursul evolutiei si speciatiei )arlington 1937),
facilitand translocatiile viabile de tip robertsonian jziuni centromerice)
(Petrov, 2001).
Cantitatea de heterocromatina reprezinta in medie 1/5 - 1/3 din talul
ADNului genomului nuclear.
Aspectul caracteristic al heterocromatinei este de cromocentri, adica
lomerari de cromatina condensata care depasesc (ca diametru) elementele
ucturale ale eucromatinei.

139
 He se caracterizeaza prin alociclie, adica diferente de spiralizare intre
diversele segmente cromatidice ale cromozomului, sau prin heteropicnoza.
Heteropicnoza se caracterizeaza prin afmitati tinctoriale de colorare si gradul
de condesare a unui cromozom.
In raport cu regiunile eucromatice care sunt izopicnotice,
heteropicnoza poate fi pozitiva sau negativa, respectiv colorare mai puternica
sau mai slaba decat eucromatina.
In raport de stabilitate, constanta si prezenta raportata la cuplurile de
cromozomi omologi, heterocromatina nucleara este de doua tipuri: He
constitutiva si He facultativa.

9.1.1 Heterocromatina constitutiva

Heterocromatina constitutiva este formata din ADN inalt repetitiv

(ADNul satelit), cu localizare precisa in cromozomi, prezenta constanta pe
parcursul ciclurilor celulare care succed. Raportata la cuplul de cromozomi
omologi, He constitutiva are aceeasi localizare, extindere dimensionala, aditia
de coloranti (ca intensitate) si comportament, identic in evolutia si dinamica
omologilor in fazele ciclului celular.
La om, He constitutiva, evidentiata prin tehnica pentru benzile „C" ,
constant, este localizata in zona centromerilor. He constitutiva are si localizari
extracentromerice, intercalata printre segmente scurte de eucromatina a
bratului lung al cromozomului Y, la nivelul telomerelor, constrictiilor
secundare si pe bratele scurte „p" ale acrocentricilor.
Reparatia extra centromerica intercalara a He constitutive este
evidenta la perechile de cromozomi autozomi 1,9, 16 si Y si in regiunile
organizatori nucleolari.
He constituiva nu prezinta specificitate tisulara sau celulara, dar prin
extindere, ca dimensiune intracromozomala, este particulara fiecarui individ.
Folosindu-se metoda de hibridatre a ADNului in situ din cromozomul
y s-a evidentiat dispunerea in tandem a secventelor inalt repetitive. Supuse
actiunii unor endonucleaze de restrictie si analizata componenta nucleotidica
s-a constatat ca secventele din ADN inalt repetitive sunt bogate in cuplul A-T,
iar Miller (1974) a observat ca secventele inalt repetitive din cromozomii
antozomi sunt bogate in 5-metil-citozina.
Acest ADN este denumit si ADN- satelit privit ca un ADN „banal" si
inactiv.

140
 Ohno (1974) considera ca ADNul „banal" s-ar fi acumulat in cursul
evolutiei biologice la eucariote prin autoduplicari succesive. Ohno sustine ca
secventele dispuse in tandem in zonele heterocromatice ar „separa" genetic
actiunea agentilor potentiali mutageni.
Opus ipotezei lui Ohno cercetatorul Gagne, care folosind metoda
analizelor autoradiografice a constatat o oarecare activitate in aceste zone
heterocromatice. El se bazeaza pe observatia ca in spermatocite si ovocite, la
om, apar nucleoli in vecinatatea constitutiva care contine ARNr transcris de
genele limitrofe zonelor heterocromatidice.
Daca prin defect mutational sau aditional, He se extinde pe spatii mai
mari in cromozomi, respectivele zone limitrofe zonelor heterocromatice isi
inceteaza functia, efectele fiind severe pentru om.
Se presupune, ca efecte genetice ca He aditionala ar induce scaderea
capacitatii de reproducere a omului, accelerarea proceselor tumorigenetice,
tendinte comportamentale deviante (criminali). In raport de cantitatea de He
constitutiva (sau chiar facultativa) se incearca a se stabili o corespondenta cu
diversele sindroame pe fond genetic.
Deoarece studiile fllogenetice au evidentiat ca He are rol important in
evolutia biogenetica a vertebratelor, identificarea si compararea cantitatii de
He la Homo sapiens, este recomandata in studiile antropologice ca
diferentiere intracromozomale intre diferitele populatii umane.

9.1.2 Heterocromatina facultativa

He facultativa este segmentul cromatidic unde condensarea fibrilei de

ADN si fixarea uniforma si intensa a colorantior specifici, nu au
corespondent pe cromozomul omolog. Datorita condensarii particulare a
fibrilei de ADN si inactivitatea genetica din zonele cromatidice ale
cromozomului, apar similitudini asemanatoare cu He constitutiva. Aspectul
heterocromatic nu prezinta segmente heterocromatice omoloage constante la
nivelul cromozomilor omologi.
He facultativa poate fi limitata pe segmente cromatidice dintr-un
cromozom, sau extinsa la nivelul unui cromozom (total).
Brown (1966) arata ca un cromozom total, heterocromatic este numai
cromozomul X la femeie, cromozom care are aspect heteropicnotic in
interfaza ciclului celular.
He constitutive care contin ARNr transcris de genele cu locusuri in
aceste zone cromatidice.

141
 Deoarece He constitutiva este prezenta in cromozomul tuturor
eucariotelor la toate speciile de mamifere, se presupune ca ar „proteja"
centromerii si organizatorii nucleolari si ca ar interveni in proceseie de
„atractie" si sinapsis a cromozomilor omologi in zigonemul profazei primare
din meioza. Atractia ar fi determinata de He constitutiva din segmentele
telometrice. Este He cariotipica.

9.1.2.1 Inactivarea cromozomului X

Inactivarea totala a unui cromozom X din cuplul XX, este

caracteristica numai mamiferelor si omului (fig. 39).

Fig. 39 Aspect morfologic al cromatinei sexuale. Apendicii perinucleari din

polimorfonucleare, la om.

142
 Forma heteropicontica a cromozomului X inactivat a fost descoperita
de Barr si Bertrand (1949) in nucleele hipoglosului de pisica.
In 1961, Lyon si Rusell au aratat ca la inceputul embriogenezei, in
ziua a 16a dela fecundatie, la embrionii de mamifere XX incepe inactivarea
unui cromozom X, care in raport de originea cromozomului X - patern sau
matern, inactivarea este aleatorie.
Folosind metoda de marcare a cromozomilor Lyon a observat
urmatoarele:
inactivarea cromozomului X, de origine materna sau paterna este
aleatorie;
inactivarea cromozomului X poate fi totala sau partiala;
dupa inactivare, procesul este ireversibil pentru clonele celulare
descendente.

Prin inactivarea unui cromozom X la femeie se asigura un echilibro

genie functional, la cele doua sexe (barbat si femeie) pentru caracterele
somatice codificate de genele cu locusuri pe cromozomul X.
Cromozomul X inactivat in interfaza ciclului celui ce reprezinta ca o
formatiune intens si uniform heterocromatica. Este starea heteropicnotica de
corpuscul Barr.
De retinut ca la Homo sapiens cromozomul X nu este inactivat total.
In partea distala a bratului scurt (p) ramane segmentul Xpter-Xxp 22.3
neinactivat. Regiunea Xpter-Xp 22.3 neinactivata contine genele care
codifica unele caractere, cum ar fi: steroid sulfataza, sistemul genetic
eritrocitar Xg, sindromul Kellman, retardul mental, etc.
Neinactivate sunt si regiunile Xp 21.1 - Xp 22.2, Xp 11.1 - Xp 11.3 si
zona limitrofa a bratului q, zone unde isi au locusurile alte gene codante.
Inactivarea incompleta a fost consemnata atat la femei, dar si la
barbati cu sindrom Klinefelter (XXY). De ce inactivarea se realizeaza pe
segmente cromatidice ale cromozomului X si nu total, a fost preocuparea
multor cercetatori. De exemplu Lyon (1998), Riggs, Brown (1991), Migeon
(1994) Heard si col. (1997) s.a. folosind observatiile la diverse specii de
mamifere (in special marsupialele) si datele obtinute din experientele pe
culturi celulare provenite de la diverse mamifere si om, au lansat unele
ipoteze explicative.
Ei au descoperit existenta unui centru de inactivare pe cromozomul X,
notat XIC, care intervine in inactivarea - cis a cromozomului X.
Dupa Riggs, Brown si Migeon, inactivarea cromozomului X se
realizeaza in mai multe etape (stadii):

143
a) Initierea si activarea centmlui de inactivare XIC. Folosindu-se
marcarea cromozomilor X si metilarea, constata ca procesul de inactivare
incepe de la centrul XIC. Tot prin aceleasi procedee de analiza si identificare,
au observat ca in interfaza celulei somatice 46,XX procesul de inactivare are
loc numai la unul din cromozomii homomorfi X. Acesta poate fi de origine
materna sau paterna.
b) Disperesia intracromozomiala a procesului de inactivare. Riggs si
Migeon si recent Ballabio si Willard (1991) considerau ca procesul de
inactivare - cis are loc pe axul longitudinal al X-ului. Coreleaza evolutia
procesului de inactivare cu diminuarea, progresiva, a activitatii de transcriptie
a genelor codante limitrofe centrului XIC. Ei au mai observat ca in regiunea
Xqll, langa centrul XIC se gaseste Xist care influenteaza inactivarea, sau
reactivarea, cromozomului X. Prin structure sa, gena Xist poate transcrie un
ARN de 15kb. Gena este activa numai in cromozomul inactivat, iar rolul ei a
fost pus in evidenta folosindu-se metoda de hibridizare „in situ" si marcare cu
fluorocrom. Activitatea genei este dependenta de gradul de metilare - 5
terminal al genei. O alta observatie facuta de Riggs si Migeon este ca in
regiunea Xqll exista si o suita de insule GpC, considerate insule de metilare.
In cazul cand in regiunea GpC metliarea se extinde asupra promotorului si a
primului exon, acoperind o secventa de 1,5 kb din structure gena Xist,
inceteaza transcrierea ARN-ului, iar procesul de inactivare a X-ului
progreseaza.

In aceste conditii se poate afirma ca activitatea genei Xist si gradul de

metilare a ADN-ului influenteaza inactivarea.
Dar procesele implicate in inactivarea cromozomului X sunt mult mai
complexe, devenind o importanta tema de cercetare.
Pe baza datelor experimentale obtinute pe culturile celulare, Clark si
Wall presupun ca „in vivo" procesul inactivarii cromozomului X ar fi
asemanator cu eel observat „in vitro". Se presupune ca centrul XIC ar
modifica arhitectura fibrilei de ADN, iar centrul de initiere a inactivarii sa
actioneze in directia —> Xist —>ARN.
Deasemnea, considerandu-se ca un cromozom, are aproximativ 150
Mb ADN, inactivarea ar incepe in mai multe situsuri ce se gasesc la distante
de 30-300 kb, dispuse in axul longitudinal al cromozomului X. Deci existenta
mai multor centre initiator al inactivarii (XIC).
De la centrele XIC incepe inactivarea cromozomului.

144
 Inactivarea s-ar realiza prin alunecare progresiva gratie unor enzime
ie restrictie EcoB si EcoK, enzime care ar cupla situsurile, formand o suita
le bucle infasurate.
Procesul s-ar desfasura in cascade. Cand s-a incheiat inactivarea
ntr-un segment cromatidic, procesul trece la urmatorul centru XIC,
:ontinandu-se inactivarea.
Progresiv are loc si heterocromatizarea si condensarea excesiva a
mclelor (formate din ADN).
Cand procesul este terminat pe toata lungimca, cromozomului X,
iuclele hipercondensate si infasurate sunt mentinute in aceeasi stare de
roteinele de esafodaj, cu formarea corpusculului Barr.
) Mentinerea inactivarii. Starea heteropicnotica (heterocromatinizare) a
romozomului sexual X inactivat incepe din ziua de a 16a a perioadei
mbrionare.
Odata inceput, procesele de inactivare si starea de corpuscul Barr in
iterfaza ciclului celular au loc pe tot parcursul vietii unei femei. Aceste
rocese sunt conditionate de gradul de metilare - 5' a genei Xist si de inctia
de a transcrie sinteza ARN a acestei gene.
I Reactivarea cromozomului X inactivat. Este cunoscut ca in zigot si in
imele 16 zile de la fecundatie cuplul de cromozomi X homomorfi este activ
inctional. Dar dupa acest interval de timp incep procesele de inactivare a XLlk" [nsa
in stadiul S interfazic si in timpul ciclului mitotic sau meiotic, are loc
izinactivarea cromozomului. Reactivarea cromozomului X este dependenta :
mecanismul inactivarii. Se considera ca reactivarea insumeaza procesele
verse ale inactivarii.

145
 Izocromozomul X
Normal X

Centromer

Centromerul activ

(a)

Pozitia centromerului
inactiv

Figs 40 Cromozom X bandat.

a) cromozo
m X normal.
b) Y cromozom.

9.1.2.1.1 Numarul cromozomilor X inactivati

La sexul feminin unde in celula somatica diploida exista doi

cromozomi X homomorfi, in interfaza celulara numai un cromozom X este
inactivat. Prin urmare, la o femeie normal a gasim un singur corpuscul Barr.
Prezenta si identificarea corpusculului Barr ca stare morfologica a
cromozomului X inactivat, prezinta un dublu rol:
a) Stabilirea sexului genetic primar. Este sexul cromozomial la femeie.
b) Valoare diagnosctica. Sunt cazuri clinice de disgenezii gonozomale
(heterocromozomiale) determinate de non-disjunctia cromozomilor X in
gametogeneza la barbat sau la femeie. Consecinta non-disjunctiei, in meioza
se pot obtine gameti diplogonozomici (24,XX sau 24,XY), care, in urma
fecundarii cu gametii normal, se obtin zigorii cu XXX a sexul feminin sau
XXY la sexul masculin.
Avand in vedere ca in celulele somatice numai un singur cromozom
X este activ genetic, iar ceilalti sunt inactivitati inseamna ca:

146
 la produsul de conceptie cu formula gonozomala XXX, vom gasi in
elulele somatice (in interfaza) doi corpusculi Barr;
la produsul de conceptie XXY la barbat (sindrom Klinefelter) vom
gasi in interaza celulelor somtice un corpuscul Barr.
In concluzie, Clark si Wall considera ca inactivarea completa a
cromozomului X este rezultatul de interferenta intre coeficientul de
heterocromatizare, metilare si compartimentizarea cromozomului X.
Cercetatorii Riggs (1990), Hayman (1990), Migeon (1994), Sincler
(1990) s.a au elaborat o terie in care se mentioneaza ca modelul de inactivare
in mozaic a cromozomului X prezinta un avantaj, bio-genetic, deoarece
previne activitatea unor gene recesive ce pot determina aparitia unor boli in
patologia umana. Bolile legate de X.

f.1.2.2 Cromozomul Y in inter fata celulara

Conform ipotezei lansata de Rice (1994), Migeon (1994), Clark si

Wall (1996). Cromozomul Y a acumulat o cantitate crescuta de
heterocromatma in cursul evolutiei sale, determinata de cresterea cantitatii
de ADN repetitiv, care confera starea de heterocromatina pe bratul lung
if-
Datorita starii fizice a ADN-ului repetitiv, respectiva zona jromatidica
este intens heterocromatica. In aceste conditii, cromozomul Y )oate fi
evidentiat in interfaza celulelor somatice la barbati.
De exemplu, daca tratam celulele somatice de la barbat cu ;hinacrina,
cromozomul Y apare la periferia nucleului interfazic ca un :orpuscul intens
fluorescent. Datorita fluorescentei intense este denumit :orpusculul „F".
Numarul corpusculilor „F" este direct proportional cu numarul
romozomilor Y prezenti in celula somatica sau gametica.

9.2. Regiuni dublu „minut" (DM) si regiuni marcate imogen

Caracteristica genomului mamiferelor si in mod deosebit in culturile

slulare umane este prezenta regiunilor dublu „minut" (DM) si regiunile
larcate omogen (RMO).
Bertino si col. (1982), Schimke (1982) sustin ca regiunile DM si MO
din genomul celular sunt amplificari de material genetic specific.

147
 Ei au remarcat prezenta acestor regiuni in culturile celulare umane. in
special in celulele tumorale, asociindu-le cu rezistenta la unele medicamente.

9.2.1 Regiuni dublu „minut" (DM)

Regiunile dublu „minut" (DM) se prezinta, ca aspect, asemanator cu

cromozomii normali din genomul celular, dar sunt lipsiti de centromer (A.
Harvey 1996). Fiecare regiune DM are un continut de aproximativ 1000-
2000 kb ADN. Desi se autoreplica aceste DM nu sunt implicate in
mecanismele ciclului mitotic, ele segregand aleatoriu ca repartitie in celulele
fiiice care rezulta. Urmare a acestei segregari aleatorii se pot obtine celule cu
o cantitate inegala de ADN.
Clark si Wall mentioneaza ca DM se pot pierde prin „micronucleere".
Studiile efectuate de Bertino si col (1982) si de colectivul condus de
Bermer (1991) pe culturi celulare provenite din diversele tipuri de tumori
canceroase au evidentiat existenta liniilor celulare tumorale rezistente la
activarea unor medicamente antimetabolice care se administreaza in
tratamentul bolii canceroase.
De exemplu Bertino a stabilit ca linia celulara K-562, provenita de la
persoane cu leucemii este rezistenta la chimioterapia cu metotrexat (MTX).
Bertino si col. pun aceasta rezistenta la MTX pe seama amplificarii genei
care codifica sinteza dihidrofolat reductaza (DHFR), enzima care este
cantitativ crescuta la pacientii tratati cu MTX.
Schimke (1982) si Bertino au identificat ca din 200 tumori primare
umane 182 linii celulare tumorale (91%) prezentau in nucleu DM. In celulele
tumorale rezistente la MRX s-au identificat si 20 cromozomii cu DM.
S-a mai observat ca DM sunt labile. Aceasta observatie a fost posibila
experimental, si anume introducand in cultura concentratii mici de hidroxine,
DM dispar din celula.

9.2.2 Regiuni marcate omogen (RMO)

In 1982, Schimke a observat ca in cromozomii cu material genetic

amplificat, apar segmente cromatidice, extinse spatial, care nu sunt bandate

148
indiferent de tehnica de bandare folosita, segmente colorate omogen.
Schimke si Bertino considera ca RMO sunt urmarea amplificarii de material
genetic in respectivii cromozomi. Observatiile lor au fost suplimentate de
Benner si col (1991), care sustineau ca o astfel de amplificare de material
genetic marcate omogen (RMO) s-ar realiza la locul genei care codifica
sinteza enzimei dihidrofolat reductaza. Aceasta ipoteza lansata de ei se
bazeaza pe observatiile facute pe linii celulare de soarece tratate cu
metotrexat. Si anume, au identificat aparitia de RMO pe cromozomul 2 din
genomul celular de soarece, in zona mediana a cromozomului unde se
gaseste gena dhfr, gena care, amplificata, sintetizeaza o cantitate crescuta de
enzima dihidrofolat reductaza, conferind rezistenta la MTX.
Benner presupune ca RMO ar fi si rezultatul ruperii sau translocarea
RMO deja existente in ciclurile celulare anterioare.
Interesanta este ipoteza lui Schimke si Benner care considera ca DM
ar fi precursori in formarea RMO. Ideea se bazeaza pe observatia ca liniile
celulare resistente la MRX, sunt mentinute pe mai multe cicluri celulare
anterioare.
Interesanta este ipoteza lui Schimke si Benner care considera ca DM
ar fi precursori in formarea RMO. Ideea se bazeaza pe observatia ca liniile
celulare rezistente la MTX, mentinute mai multe cicluri celulare in cultura,
apare o extindere a regiuni lor DM si RMO, sunt mai alungite in axul
longitudinal al cromozomilor.
RMO sunt apreciate ca suplimentari stabile de ADN in cromozomi
obtinute prin amplificari succesive, deoarece nu sunt modificate ca
dimensiune si prezenta in cromozomi la tratamentul cu concentratii mici de
hidroxiuree.
Regiuni marcate omogen apar in foarte putine celule din tumorile
primare. Din totalul tipurilor de tumori primare, numai in 13 (6,5%) apar
regiuni marcate omogen (RMO), iar in cinci tipuri (2,5%) apar atat DM cat si
RMO.

9.3. Eucromatina cromozomala

Cromozomul, pe langa segmentele heteropicnotice si supercondensate

cu aditia intensa a colorantilor bazici specifici, prezinta si ?one izopicnotice
denumite zone de eucromatina. Zonele eucromatice au ^respondent pe
cromzomii omologi din genomul celular.
Eucromatina prezinta urmatoarele caracteristici:

149
 - are o activitate intensa in interfaza celulara, prin prezenta ADN-ului
reprezentativ si informational activ;
- in zonele de eucromatina cu ADN nerepetitiv sunt locusurile tuturor
genelor cu determinism genetic in exprimarea fenotipica a caracterelor, gene
implicate in procesele de crestere, dezvoltare a organismului;
- colorare slaba (normala) in interfaza celulara;
- zonele de eucromatina cu ADN nerepetitiv prezinta o condensare si
despiralizari normale;
- eucromatina are o replicare ciclica normala fata de alociclia
(tardiva) de replicare a ADN-ului repetitiv din zonele heterocromatice.

10. Cromozomii celulari „B"

Sunt cromozomii supranumerari aditionali complementului normal de

cromozomi al unei specii.
Cromozomii B, care nu se deosebesc de cromozomii „A" (normali),
nu sunt esentiali pentru cresterea, diferentierea si reproducerea indivizilor in
conditii normale.
Indivizii cu cromozomi supranumerari „B" nu se deosebesc fenotipic
de indivizii conspecifici lipsiti de cromozomi „B".
Cromozomii ,,B" prezinta unele insusiri cu caracter general si anume:
prezinta o morfologie diferita fata de cromozomi;
au talia foarte mica in raport cu cromozomii normali de tip „A";
au o cantitate foarte mare de heterocromatina constitutiva;
cromzomii „B" nu se cupleaza cu cromozomii „A" in zigonemul
profazei primare a meiozei;
nu contin gene cu informatii majore pentru activitatea celulei, a
organismului;
activitatea unor gene de pe cromozomii „B" se cumuleaza cu genele
informational active de pe cromozomii „A".
se caracterizeaza prin transmitere nemendeliana de la o celula la alta
de la o generatie la alta, acolo unde sunt cromozomi „B". Este o mostenire
nemendeliana. In ansamblu transmiterea nemendeliana a cromozomilor „B"
de la o generatie celulara (de indivizi) la alta generatie, poate fi
150
asemanatoare cu ereditatea nemendeliana a ADN-ului mitocondrial.
Repartitia cromozomilor „B" in nucleii viitoarelor celule fiice, este aleatorie,
ceea ce explica diferente de numar intre celulele organismului cu astfel de
cromozomi (Romera (1991).
S-a emis ipoteza ca acesti cromozomi „B" ar avea originea intr-o trizomie a
cromozomilor „A" si in mod deosebit trizomii ale cromozomilor sexuali,
deoarece au o structura omoloaga cu acestia (Sandery si col. 1990). Jones si
Rees (1982) au identificat la unii cromozomi „B" secvente unice din ADN-ul
component, iar la unele insecte s-au pus in evidenta secventa de ADN
ribozomal.
Genele cu locusuri pe cromozomii „B" au efecte cantivative asupra
unor caractere, cumulate cu efectui genelor ce codifica unele caractere, ce au
locusuri pe cromozomii „A". Cromozomii „B" nu indue, genetic, efecte
salitative in fenotipul indivizilor.
Uneori cromozomii „B" pot influenta cuplarea cromozomilor „A" in )
rofaza primara a meiozei iar cromozomii „A" pot influenta segregarea
;romozomilor „B" in timpul diviziunii (in anafaza mitotica sau meiotica).
frin aceasta segregare aleatorie explicam, de ce in populatiile celulare, ale
iceluiasi organism, apar diferente de numar ale cromozomilor „B".
Jones si Rees (1982) considera ca prezenta cromozomilor „B" in
irofaza primara a meiozei influenteaza comportamentul cromozomilor „A"
are isi pot modifica mecanismele de formare a chiasmelor.
Deasemenea Jones si Rees considera ca influenta exercitata de
romozomii „B", ar fi determinata de controlul secventelor de metilare si
emetilare din cromozomii „A".
Se presupune ca prezenta cromozomilor B la foarte multe specii de
lante si animale, ar avea consecinte evolutive, deoarece prin influentarea
omportamentala a cromozomilor A in meioza, ar explica existenta unui
lecanism genetic de adaptare la prezenta unor factori externi ce pot etermina
procesele de recombinare genetica.
Se considera ca prezenta cromozomilor B, ca numar suplimentar ita
de complementul cromozomial normal ar avea un efect genetic aditiv ;upra
organismelor, favorizand si inducand cresterea adaptativa a ganismelor la
fluctuatiile factorilor din mediu.

151
11. Benzile cromozomale

In 1969, Casperson a observat ca fiecare cromozom din setul haploid

prezinta in prometafaza si metafaza mitotica sau meioza o succesiune de
benzi diferit colorate: clare si intunecate. El a mai observat ca numarul,
dimensiunea si ordinea benzilor sunt asemanatoare daca se studiaza fiecare
cuplu de cromozomi din celula diploida. Deasemenea, numarul, ordinea si
dimensiunea benzilor sunt caracteristice pentru fiecare cuplu de cromozomi
omologi, dar si caracteristice fiecarui individ din populatie.
Ca definitie, banda cromozomala este segmentul cromatidic clar
delimitat de segmente diferit colorate.
Folosindu-se tehnici diferite de colorare, benzile evidentiate pot fi
identificate ca benzi fluorescente si non-fluorescente, benzi intens colorate cu
Giemsa si slab colorate, etc.
Dupa tratare si colorare specifica, cromozomii prezinta si o alternanta
discontinua de benzi intunecate si luminoase, dispuse pe axul longitudinal al
fiecarui cromozom.

11.1. Factori implicati in formarea benzilor

In aditia discontinua a colorantilor si delimitarea intercalara a benzilor

intunecatte si palide, intens fluorescente sau slab fluorescente sunt implicati
factori, dintre care mentionam:
ADN-ul repetitiv si nerepetitiv;
prezenta particulara a unor baze complementare pe diverse segmente
ADN;
distributia „perlata" a proteinelor histonice;
plierea neuniforma a fibrilei elementare de ADN.

a) ADN-ul repetitiv si nerepetitiv, factor implicat in formarea benzilor

cromozomale.
Cercetarile lui Guenot (1973) au scos in evidenta ca in cromozom, pe
langa ADN-ul nerepetitiv, exista o cantitate apreciabila de ADN repetitiv.
Guenot aduce urmatoarele argumente: Escherichia coli, cu un cromozom
inelar, cantitatea de informatie asigura existenta a circa 4000 de gene
informational active (E.coli are 4736.000 pb-40000 b) ce determina

152
 sinteza de proteine celulare. Cum codul genetic este universal, iar masa
moleculara a proteinelor sensibil egala, pe baza calculului asemanator cu eel
facut la bacterii, in genotipul mamiferelor ar trebui sa existe 3x410 gene active.
De exemplu, soarecele ar trebui sa contina in genom de 1000 de on mai
multe gene fata de E.coli, iar omul ar trebui 3500.000 gene.
Pentru a accepta acest rationament legat de stricta corespondenta a
cantitatii de ADN si numarul genelor active din genomul eucariotelor ar fi
trebuit indeplinita urmatoarea conditie: tot ADN-ul din celulele eucariotelor
saprezinte numai scvente nerepetitive, dispuse liniar pe cromozom.
Dar, in 1968, Britten si Kohne (s.a.) au descoperit ca in cromozomii
mamiferelor (si la om) exista o mare cantitate de ADN repetitiv, care se
pliaza (plicatureaza). Prin aceasta plicaturare in anumite secvente
cromatidice cantitatea de ADN este abundenta si comasata, iar aditia
colorantilor este mai intensa si uniform dispusa (benzile): aspect
heterocromatic sau fluorescent.
b) Diferente in componenta bazelor din ADN.
Un factor care asigura configuratia neuniforma a ADN-ului si aditia
colorantilor specifici cu formarea benzilor cromozomale este distribuita
cuplurilor complementare a bazelor azotate. Pe fibrila elementara de ADN
cromozomal, sunt zone unde predomina cuplul complementar A-T, iar in
altele G-C. De exemplu in segmentele polinucleotidice repetitive bogate in
A-T se fixeaza mai puternic substantele fluorescente, iar in zonele bogate in
G-C fluorescenta este slaba.
c) Distributia neunifonna a proteinelor histonice din fibrila
polinucleozomica si polisolenoidica a ADN-ului cromozomal. Prin
hidroliza enzimatica a cromozomilor metafazici, s-a constatat ca ADN-ul
bogat in G-C se asociaza cu histonele bogate in arginina, iar secventele
bogate in A-T se asociaza cu histonele bogate lizina. Deoarece secventele
din ADN bogate in A-T sau G-C sunt distribuite pe segmente cromatidice
evidentiate ca benzi intercalate si distributia histonelor bogate in lizina sau
arginina din ADN-ul cromozomal are loc dupa acelasi tipar de benzi.
In 1965, Littan considera ca histonele bogate in lizina produc
condensarea cromatinei in cromozom, iar cele bogate in arginina ar preveni
condensarea. Ca urmare Meisner (1973) afirma ca histonele au rol important
in mentinerea structurii tridimensionale a cromozomilor.

153
11.2.Tipuri de benzi in cromozomii eucariotelor

In 1971, la Paris a avut loc a treia reuniune a geneticienilor pentru

standardizarea nomemclaturii, codificarii de analiza si interpretare a benzilor
cromozomale, reuniune la care s-a decis denumirea lor in benzi Q, G,R siC.
(fig. 41)

C
-".
(9
S*'
»
K I
S
3*3
* A
^^

13 H
** & i:
fto
•» is
21 22 .XX

Fig. 47 Micrografia cromozomilor

a) Metafaza celulei in diviziune
b) Cariotipul (46, xx) - Cromozomii - hidroliza enzimatica si
colorare cu Giemsa.

154
Fig. 41 bis Cromozomii bandati prin digestie enzimatica. Cariotip normal de
femeie.
1- Compararea benzilor R la stanga, benzi Q in centru si benzi G la
dreapta (digestie enzimatica a cromozomului 1 uman).

In 1972, Gagne, Laberge si apoi Babrow au descris o varianta a

3enzilor C si anume benzile T sau telomerice. Dutrillaux si col. (1973) au
^ompletat sistemele de marcaj si bandare evidentiind benzi „particulare"

155
prin folosirea, unei coloratii cu acridin orange, dupa tratamentul cu 5-
bromdeoxiuridina (BUDR).

11.2.1. Benzile Q

In 1968, Casperson, folosind clorura de chinacrina (agent alchilant

fluorescent), a observat un model de benzi fluorescente pe cromozomi,
separate, de zone nonfluorescente. Casperson a denumit aceste benzi, benzi Q
(initiala de la quinacrina).
In 1972, cercetatorii Weisblum si Haseth au stabilit ca substanta
fluorescenta chinacrina se fixeaza puternic in segmentele cromatidice unde
este ADN foarte bogat in cupluri complementare A-T. Miller (1973) colorand
cromozomii denaturati cu anticorpi fluorescenti „anti-adenina" confirma
ipoteza lui Weisblum si Heseth, obtinand benzi de tip Q.
Benzile Q evidentiaza heterocromatina care contine putine gene
informational active.
Fiecare pereche de cromozomi omologi se caracterizeaza printr-o
diversitate de benzi fluorescente ca: numar, ordonare, dimensiune,
intensitatea substantei fluorescente fixata.
Clorura de chinacrina se fixeaza preponderent in ADN-ul foarte bogat
in A-T precum si secventele repetitive LINES. Sunt benzile cromatidice care
se replica spre sfarsitul stadiului interfazic S.
Termenii de apreciere a intensitatii gradului de fluorescenta a
cromozomilor sunt: negativ, aproape fluorescent, palid fluorescent, mediu
fluorescent, intens fluorescent, stralucitor.
Metoda fluorescenta este folosita, in mod deosebit, pentru studiul
cromozomului Y in scopul identificarii unor eventuale translocatii Y, intre
cromozomul Y cu cromozomul X, sau cu autozomii. Deasemenea metoda
fluorescenta poate fi folosita ca „marker" pentru identificarea cromozomului
numarul 3 din genomul celular.
Benzile Q prezinta un polimorfism „mendelian" polimorfism
transmisibil si caracteristic fiecarui individ in populatie.
Analiza benzilor Q este recomandata pentru studii antropogenetic
(etnice), familiale, medicolegal, criminalistice.
Bobrow (1971) si Casperson (1971) recomanda analiza benzilor Q in
studiul derularii spermatogenezei la om si animale.

156
 1.2.2. Benzile G

Ca si benzile Q, benzile G care se suprapun ca numar, ordonare,

idimensiune, evidentiaza ADN-ul bogat in heterocromatina uniform
condensata care cuprinde putine gene informational active. Benzile G sunt
echivalente cu benzile Q fluorescente.
Pentru evidentierea benzilor G, tehnica frecvent folosita este hidroliza
enzimatica urmata de colorare cu Giemsa (Dutrillaux 1971).
Prin metoda Dutrillaux, cromozomii apar cu aditia discontinua a
colorantului Giemsa. O alternanta de benzi intens colorate si benzi palide sau
foarte slab colorate (sau chiar decolorate). Colorarea neuniforma a
cromozomilor ar fi determinata de „reconsctructia" diferentiala a
;romozomilor dupa distorsionarea (cauzata enzimatic) prin mutarea
;ationilor, sau de „alterarea" diferentiata a complexului ADN- histone.
Benzile G apar in zonele unde exista o cantitate mare de ADN repetitiv jogat
in A-T cu grad ridicat de pliere a fibrilei de ADN si bogata in lecvente
repetitive LINES.
In aceste regiuni cromatidice replicarea ADN-ului este tardiva in
tadiul interfazic S.
Constrictiile secundare de pe cromozomii 1, 9 si 16 sunt benzi G
lozitive, dar Q negative.
Sunt cercetatori care considera ca benzile G sunt urmarea stabilizarii
au extractiei unor proteine acide. Daca adaugam actinomicina D cu cateva
re inainte de obtinerea preparatelor cromozomale, apar benzi G, fara alt
•atament de fixare. Actinomicina nu reactioneaza cu histonele, dar se leaga e
ADN in faza interfazica G2 a ciclului celular, cand cromozomii se regatesc
pentru condensarea premeiotica sau premitotica. Exceptie de la yidentiere
pentru benzi G este cromozomul Y.

1.2.3. Benzile C

Benzile C reprezinta sctructurile cromatidice unde este localizata

;terocromatina constitutiva. Primii care au evidentiat si analizat benzile C i
fost Amighi-Hsu (1971) si Yunis si col. (1971).
In functie de tehnica folosita cromozomii sunt supusi unui tratament
nic (mediu puternic alcalin) sau unui tratament termic, urmat de o ilorare cu
Giemsa.

157
 In prima etapa dupa denaturarea termica sau ionica a ADN-ului
urmeaza renaturarea ADN-ului satelit. ADN-ul moderat repetitiv si
nerepetitiv nu se renatureaza imediat.
Aparitia benzilor C presupune o separare hidrolitica a bazelor purinice
urmata de-o eliberare de tip p a partilor depurinizate in timpul tratamentului
termic.
Studiul benzilor C scoate in evidenta:
continutul de ADN satelit;
evidentiaza crossing-overul inegal intre cromozomii omologi si
meioza;
evidentiaza segmentul extins de heterocromatina centromerica spre
bratul q al cromozomului 1, 9 si 12.
evidentiaza segmentul extins de heterocromatina in zona distala a
bratului q si o banda subtire in zona centromerului pe cromozomul Y;
metoda de analiza in hibridarea celulara om-soarece.

11.2.4. Benzile R (reverse)

Benzile R se obtin prin denaturarea termica moderata si colorarea cu

acridin orange. Sunt reversul benzilor G si Q.
Benzile R evidentiaza situsurile ADN bogate in G-C.
Metoda de evidentiere a benzlior R a fost elaborata de Dutrillaux si
Lejeune(1971).
S-a observat ca olicomicina, cromomicina A, sau nitromicina,
introduse in mediul de cultura indue aparitia benzilor R.
Benzile R evidentiaza zonele eucromatice cu „densitatea" cea mai
mare de gene informational active in timp ce zonele de heterocromatina sunt
foarte colorate.
In zona benzilor R replicarea ADN-ului este timpurie.
Se recomanda analiza benzilor R pentru identificarea remanierilor
cromatidice in zonele terminale ale cromozomilor.

158
11.2.5. Benzile T (telomerice)

Folosind o tehnica modificata de identificare a benzilor R, Dutrillaux

(1973) a observat ca sunt evidentiate numai telomerele bratelor
cromozomului.
Principiul metodei modificate este urmatorul: supusi cromozomii
metafazici tratamentului termic puternic si colorare cu acridin orange in
ultraviolete (UV) cromozomii au coloratia slab portocalie, iar telomerele apar
colorate fluorescent - verzui, a caror intensitate este variabila de la un
cromozom la altul, de la un individ la altul si care se transmit mendelian.
Benzile T reprezinta fractia de ADN-R cea mai rezistenta la
tratamentul termic puternic.
Metoda de analiza a benzilor T serveste pentru identificarea
rearanjarilor telomerice ca translocatii terminale intercromozomice,
translocatii roberstoniene, prezenta cromozomilor inelari, inversiile
paracentromerice, anensomia de recombinare.

11.2.6. Benzile NOR (organizatori nucleolari)

Cromozomii acrocentrici din genomul celulelor umane, prezinta pe

bratul scurt „p" regiuni corespunzatoare organizatorilor nucleolari, regiuni
unde, prin prezenta genelor specifice se sintetizeaza ARNr.
Organizatorii nucleolari pot fi evidentiati prin colorare cu nitrat de
argint (Goodpasture si Bloom, 1975; Howell si col. 1975, Deuton si col.
1976). Cu aceasta colorare, benzile NOR se prezinta cu o tenta galbena usor
bruna.

12. Cromozomii si fazele ciclului celuiar

Morfologia cromozomilor in raport cu fazele ciclului celuiar, este

studiata prin analiza imaginiior electronomicroscopice, autoradiografia
cromozomilor marcati cu izotopi radioactivi, prin tehnici diferentiate de
bandare, etc.
Ca definitie, prin ciclul celuiar se considera ansamblul de modificari
ce au loc in celula, dupa formarea sa prin diviziunea celulei mama si
momentul cand aceasta celula finalizeaza, prin diviziune proprie, formarea
adoua celule fiice fig. 42.

159
 Mitoza
SintGza ARN Sinteza proteicS
\"l Sinteza ARN

Replicarea
ADN

S
Sinteza redus3 de
ARN si proteine
Sinteza de
histone

Fig.42 Ciclul celular

12.1.Cromozomii in interfaza ciclului celular

Interfaza este intervalul cuprins intre sfarsitul unei diviziuni si

inceputul diviziunii celulare a ciclului celular.
In interfaza ciclului celular, cromozomii nucleari formeaza cromatina
nucleara. Deoarece cu fiecare ciclu mitotic sau meiotic cromozomii se
individualizeaza in acelasi numar, talie, forma ce caracterizeaza specia, se
considera ca in interfaza se pastreaza

160
mdividualitatea. In interfaza cromozomii sunt decondensati, au talia mai nare
fata de metafaza mitotica, cu aspect filamentos si alungit.
In interfaza cromozomii „pastreaza" zone cu heterocromatina
;ondensata pe care, unii cercetatori le mai denumesc cromocentre.
Dimensiunea si numarul cromocentrelor interfazici difera de la o specie la
klta.
La om in interfaza, „condensat" heteropicnotic, este cromozmul
;exual X, in celula somatica la femeie. Forma „condensata" este cunoscuta
iub denumirea de corpuscul Barr sau cromozom X inactivat interfazic.
In interfaza, datorita spiralizarii si condensarii foarte reduse, rrosimea
fibrilei elementare de ADN-histone este de aproximativ 100 A (10 lm), iar in
unele regiuni fibrila avand si grosimea de 2-3 nm (Tanaka si col. 974).
Evenimentul major al cromozomilor interfazici este replicarea
iparatului genetic, respectiv ADN-ul. La inceputul interfazei fiecare
romozom este monocromatidic, dar dupa replicarea semiconservativa a
VDN, cromozomii devin dicromatici (vezi morfologia cromozomilor)
Interfaza se subdivide in trei stadii : (fig.42)
stadiul Gl;
stadiul S;
stadiul G2.

2.1.1. Stadiul Gl

Este stadiul care urmeaza dupa terminarea ciclului mitotic, rezultand

elulele fiice.
Durata stadiului Gl variaza in raport cu tipul de celule somatice
:udiate (Tabel VIII).

abel VIII. Perioada stadiilor interfazice la om in raport de tipul de celula

nalizata.

Total
Tipul de celule G1 G2 ore
s
Cultura limfocitara (sange
periferic) 4,60 9,60 3,50 17,70
Cultura fibroblasti embrionari 11,00 12,70 8,00 31,70
Cultura celule HLA 8,00 6,00 5,00 19,00

161
 La mamifere si om, stadiul Gl variaza, in medie, intre 5-10 ore,
exceptand celulele canceroase la care stadiul este foarte scurt sau absent.

a) Sintezele in stadiul Gl. La inceputul stadiului Gl, cromozomii sunt

moncromatidici continand o cantitate de ADN caracteristic speciei. Fiind
celula somatica, cu numar diploid de cromozomi, cantitatea de ADN este 2n
(fig.43). La om sunt 46 cromozomi prin dispunerea, in tandem (contiguitate),
a cromozomilor. In acest stadiu se sintetizeaza ARNm care asigura
producerea de proteine necesare cresterii celulare. In Gl nu are loc sinteza de
ADN. El fiind denumit si stadiul de presinteza sau preduplicare a ADN-ului.

12.1.2. Stadiul S

Cu o durata de 5-10 ore; se caracterizeaza prin replicarea totala a

ADN-ului cromozomial, rezultand o cantitate dubla de ADN (4n) in cursul
acestui stadiu.
In celulele eucariotelor replicarea este orientata, bidirectionala si
semiconservativa (vezi sinteza ADN-ului).
In stadiul S replicarea ADN-ului din cromozomii eucariotelor, se
realizeaza in aproximativ 400 minute, ceea ce arata ca replicarea se face,
simultan in mai multe situsuri. Daca sinteza nu s-ar declansa simultan in mai
multe situsuri si avand in vedere cantitatea de ADN din celula somatica umana
ar fi trebuit sa se replice, in totalitate, in aproximativ 14 zile.

162
 cantitate ADN

G1 G2 M G1

Fig.43 Cronologia ciclului celular

12.1.3. Stadiul G2

Se caracterizeaza prin incetinirea sintezei histonelor si incetarea

sintezei ADN-ului din cromozomi. Are o durata de 4-5 ore. Stadiul G2 incepe
dupa ce sinteza ADN-ului cromozomial este completa. In acest stadiu persita
sinteza ARN, desi cantitatea de ADN este dublata. Stadiul G2 pregateste
celula pentru mitoza.

12.2.Cromozomii mitotici

Mitoza distribuie egala cantitatea de ADN intre cele doua celule fiice
care vor rezulta dupa incheierea telofazei (fig.44).

163
A.
B.

4f
C. D.
c

E.
F.

Fig. 44 Fazele ciclului mitotic reprezentare schematica

Mitoza intereseaza toate elementele nucleare (cariodiereza) si toate

elementele citoplasmatice (citodiereza).

164
12.2.1. Profaza

Durata profazei este de 10-15 minute, dupa aspectul si „structura"

cromozomilor, profaza se subimparte in:
a) - Profaza timpurie : cromozomii sunt inca filamentosi si subtiri, cu
distributie neuniforma in nucleu. In profaza timpurie se observa la
microscopul electronic o usoara infasurare (spiralizare) intre cromatidele
surori.
b) - Profaza tarzie: cromozomii devin mai scurti, mai grosi si rigizi
(drepti). Incep a se distinge elementele morfologice ale cromozomilor:
centromerul, constrictiile secundare si satelitii pe acrocentrici.

12.2.2. Metafaza

Este faza care urmeaza profazei cu o durata de aproximativ 23-35

minute.
Cromozomii sunt mult ingrosati si scurtati datorita formarii „super-
super-helixurilor" buclelor si rasucirii fibrilei elementare a ADN+histone.
In metafaza, cromatidele surori ale fiecarui cromozom sunt clar
delimitate, iar cromozomii sunt bine individualizati.
Dupa ruperea anvelopei nucleare si formarea fibrelor fusoriale,
cromozomii dicromatidici migreaza catre planul ecuatorial al celulei,
dispunandu-se perpendicular pe fibrele fusoidale, formand placa ecuatoriala
sau metafazica.

12.2.3. Anafaza

Cu o durata de 5-8 minute, cromozomii se cliveaza in plan

longitudinal, clivajul ecuational cand cele doua cromatide se separa. Fiecare
cromatida, dupa clivajul ecuational, devine autonoma si se transfonna in
cromozom monocromatidic independent. Dupa separare, cromozomii,
monocromatidici incep sa migreze, in numar egal, spre cei doi poli ai :elulei.

165
12.2.3. Telofaza

Incepe dupa ce cromozomii au migrat spre polii celulei. In cele 20

minute cat dureaza telofaza, cromozomii se regrupeaza in evantai intr-o masa,
compacta heterocromatica.
Incepe procesul invers fata de cum s-a derulat in profaza.
Cromozomii incep a se decondensa, devin filamentosi, contur difuz.
Tot in telofaza are loc citodiereza, respectiv separarea citoplasmei in
doua jumatati, fiecare continand cate un nucleu cu numar 2n (diploid) de
cromozomi monocromatidici.
In finalul telofazei rezulta doua celule fiice identice intre ele si
identice cu celula mama.

13. Cariotipul uman normal

Cromozomii individualizati in mitoza sau meioza, prezinta in

metafaza mitotica o morfologie care permite o analiza de identificare (fig.
45).
In raport de talie, morfologie si prin tehnici de bandare, cromozomii
pot fi identificati in cupluri omoloage si ordonati in cariotip.
Perfectand tehnica culturilor celulare, Tjio si Levan (1956), au stabilit
ca in celula somatica diploida omul are 46 cromozomi (numar normal,
caracteristic speciei Homo sapiens).
In 1971, s-a trecut la analiza cromozomilor folosindu-se tehnici de
bandare (Paris, 1971)
Analiza cromozomilor metafazici se face pe celule recoltate din
tesuturile cu potential mitotic ridicat, sau in culturile celulare.
In metafaza ciclului mitotic cromozomii sunt dicromatidici, bine
delimitati si individualizati, motive pentru care analiza cariotipului este
recomandata in aceasta faza

166
 Mi to/a premeiotica Ultima faza S a ,eptoten Zygoten
replicarii ADN

Fazele mcio/ci Cromo/omi

matcrni: alb Cromozomi
paterni: ncgru

Fig. 45 Schema cu fazele meiozei

Examenul citogenetic care grupeaza un ansamblu de metode si

tehnici, permite studiul cromozomilor pentru citodiagnostic in cazul copiilor
nascuti cu multiple malformatii congenitale, de a stabili cauza unor

167
esecuri de reproducere, de a identifica aberatiile cromozomiale embrio-fetale
in cazul avorturilor spontane, etc.
Examenul citogenetic contribuie la o mai buna cunoastere a hartilor
cromozomale la om, la intelegerea cat mai corecta a mecanismelor genetice in
oncogeneza si imunogeneza, la stabilirea filiatiei genetice, sau in antropologia
genetica si antropogeneza.
Criteriile de intocmire si analiza a cariotipului respecta principiile de
identificare si codificare stabilite la Denwer (1960), Lonrda (1963), Chicago
(1966) si cele de la Paris (1971).

13.1. Recomandarea analizei cariotipului la om

Deoarece metodele de analiza sunt neeconomice (costisitoare),

necesita timp indelungat pentru a se obtine rezultatul si un personal
specializat si aparatura corespunzatoare, se impune o „selectie" a cazurilor
clinice supuse unei astfel de investigatii.
a) Examenul prenatal - Datorita posibilitatii de recoltare a lichidului
amniotic, in care se gasesc celule provenite de la embrio-fat, se poate
analiza citogenetic, genomul produsului de conceptie. Criteriile care impun
examenul citogenetic prenatal sunt:
- varsta inaintata a persoanei gestante (primi geste, primi - para. De
exemplu Golbus si col. (1981) apreciaza ca sindromul Down este de 0,9%
pentru copii nascuti din mame primigeste - primipare in jurul varstei de 35 ani
si de 5,5% la cele peste 43 ani;
- riscul de recurenta in familia unde s-a nascut copil cu aneuploidie;
- cand un membru din cuplul parental prezinta o modificare in
structura si morfologia unui cromozom. De exemplu Thompson (1986)
apreciaza, ca riscul teoretic, este de 50% de a se naste cu copil cu cariotip
„dezechilibrat" daca unul din genitori prezinta modificari cromozomale;
-stabilirea sexului genetic al fatului
b) Examenul postnatal - ca prioritati sunt urmatoarele:
- analiza citogenetica a nou - nascutului cu multiple morfo si
histodisplazii;
- ambiguitate gonadica - hermafroditisml
- deficiente de crestere postnatala, retard psiho-neurologic;
- adolesenti cu un aspect impuber cum ar fi atrofia testiculars
ginecomastia la baieti, deficiente in dezvoltarea caracterelor sexuale
secundare;
- in tulburari grave de comportament;

168
 - la cuplurile cu infertilitate sau sterilitate fara cauze clinice;
- la cuplurile cu repetate esecuri de reproducere, pierderi zigotice
(„avorturile" menstruale), sau cu avorturi spontane repetate;
- persoanele iradiate accidental sau terapeutic, sau supuse timp
indelungat unui climat cu noxe chimice poluante (boli profesionale), dupa
ingerare de medicamente cu efecte secundare severe (efecte cancerigene).

14. Replicarea cromozomilor umani

Functia de conservare (sincronica) si transmitere a informatiilor

genetice in succesiunea generatiilor celulare, sau a indivizilor din populatie,
este asigurata de capacitatea de autoreplicare a cromozomilor din genomul
celular.
Replicarea cromozomilor este determinata de structura moleculara
ADN, care prin replicarea semiconservativa si dublare cantitativa, se
repartizeaza egal in cele doua cromatide.
Watson si Crick, dupa ce au stabilit structura in dublu helix si
capacitatea de replicare a ADN-ului, au sugerat ca si cromozomii se replica
semiconservativ.
S-a demonstrat ca in stadiul S interfazic, cromozomii se replica
semiconservativ. Citologic, replicarea cromozomilor a fost demonstrata prin
urmatorele metode:
- metoda elaborata de Taylor (1957) de analiza autoradiografica prin
marcarea cromozomilor cu timidina tritiata (3H);
prin folosirea 5-bromdezoxiuridina (BrdU) si analiza
cromozomilor.

14.1. Experimentul Taylor

Taylor (1957) a lucrat pe planta Vicia faba (bobul) cultivata pe un

mediu marcat cu timidina tritiata, precursor ce poate fi incorporat in structura
ADN-ului in timplul replicarii semiconservative (fig 46).
In mediul marcat cu 3H (mediu „cald") se introduce radacina
plantulelor de V.faba, unde vor fi tinute aproximativ 8 ore (timp pentru o
singura replicare a ADN-ului, respectiv a cromozomilor). Replicarea
semiconservativa se deruleaza in stadiul S interfazic al ciclului celular.

169
 Dupa 8 ore in mediul marcat, plantele sunt scoase, se spala radacina
pentru indepartarea aderentelor de suprafata a substantei radioactive. Din
varful radacinilor se recolteaza un esantion celular, care, dupa tratare cu
colchicina si socul hipotonic vor fi supuse analizei autoradiografice.
Urmeaza trecerea plantelor, crescute in primul mediu „cald" pe al
doilea mediu, care este „rece", respectiv lipsit de precursori marcati cu
timidina tritiata.
Dupa 8 ore se scot din mediul doi si tree pe mediul trei, tot „rece". La
fiecare generatie de 8 ore, pe mediul doi si trei se recolteaza cate un esantion
celular, colchicinizat si supus socului hipotonic, se analizeaza
autoradiografic.
Taylor a folosit pentru analiza trei esantioane celulare, care reprezinta
trei generatii de celule provenite de la plantulele de V. faba crescute pe
respectivele medii de cultura.
Din analiza autoradiografiei s-au obtinut urmatoarele date (fig. 46):
Primul esantion celular (prima generatie) prezinta:
- Toate placile metafazice marcate cu timidina tritiata;
- Toti cromozomii din placa metafazica marcati;
- Ambele cromatide ale fiecarui cromozom marcat; Deci
un marcaj de 100%.
Al doilea esantion celular ( a doua generatie de celule) prezinta:
- Toate metafazele marcate cu timidina;
- Toti cromozomii metafazici marcati;
- Analizat fiecare cromozom, va prezenta o cromatida marcata cu
timidina tritiata, a doua cromatida nemarcata.
Al treilea esantion celular (generatia a treia) se prezinta
autoradiografic:
- Fiecare metafaza jumatate din numarul cromozomilor din genom cu
ambele cromatide nemarcate, jumatate din numarul de cromozomi
componenti marcati;
- Fiecare din cromozomii marcati prezinta o cromatida marcata cu
timidina tritiata si o cromatida nemarcata.

170
 Prereplicare cu Marcate Marcate Marcate 50% si
timidina 100% 50% Nemarcate 50%

Fig .46 Experimental Taylor de a demonstra natura semiconservativa de

replicare a ADN in cromozomi (dupa Clark si Wall, 1992).

Dupa Taylor aceste rezultate sunt posibile numai prin replicarea

semiconservativa a cromozomilor ca rezultat al replicarii semiconservative a
ADN-urilor din structura lor si repartizarii egale a ADN-ului in cele doua
cromatide.
Rationamentul lui Taylor este urmatorul:
(1) - Celulele din radacina plantulelor de Vicia faba, inainte de a fi
crecute pe mediul „cald" marcat cu timidina tritiata, au moleculele de ADN
cu ambele catene nemarcate (vezi sinteza ADN).
In mediul marcat, ADN-ul din fiecare cromozom, in stadiul S
interfazic incepe sa se replice semiconservativ. Prin separarea celor doua
monocatene, fiecare va servi ca tipar (matrita) pentru sinteza noilor catene
(complementare), prin acest mecanism cu timidina tritiata, datorita
incorporarii respectivului nucleotid in structura moleculei de ADN.
Dublandu-se cantitatea de ADN, in stadiul S incepe si cromozomul,
care initial este monocromatidic, sa se replice semiconservativ pentru a
repartiza egal moleculele de ADN in cele doua cromatide. Dar moleculele de
ADN fiind marcate, prin repartitia egala si cele doua cromatide vor fi
marcate.
Aceasta imagine autoradiografica demonstreaza ca cele doua
cromatide sunt indentice prin continutul de ADN care a rezultat prin replicare
semiconservativa.

171
 In concluzie, in esantionul unu toate metafazele au cromozomii
marcati si ambele cromatide marcate.
Analiza celulelor din esantionul doi reprezinta generatia a doua de
celule, cand toti cromozomii metafazici sunt marcati dar fiecare cromozom
cu o cromatida marcata si a doua nemarcata ; rationamentul este urmatorul:
Inainte de a fi introduse in primul esantion ADN cromozomal avea
ambele catene nemarcate. Introduse plantulele in mediul „cald" prin
replicarea semiconservativa, fiecare molecula ADN va avea o catena marcata,
a doua nemarcata. Are loc clivajul ecuational al cromatidelor, care devin
cromozomi monocromatidici, fiecare cromozom continand ADN cu o catena,
marcata, una nemarcata. In generatia a doua, celulele puse in mediu nemarcat,
in stadiul S. ADN-ul se replica semiconservativ. Prin separarea catelenor una
marcata, a doua nemarcata si servind ca matrita, noile catene vor integra in
structura lor nucleotide nemarcate. Ca urmare vor rezulta doua molecule: una
marcata (catena provenita cu marcare de la prima generatie celulara), a doua
molecula total nemarcata. Cum cromozomii metafazici din celulele generatia
a doua, prezinta o cromatida marcata, a doua total nemarcata, explica
repartitia moleculelor de ADN in cele doua cromatide, rezultat al replicarii
semiconservative: intr-o cromatida se repartizeaza molecula de ADN
marcata, in a doua cromatida, ADN nemarcat.
Acelasi rationament si pentru esantionul celular generatia a treia.
In concluzie replicarea cromozomilor se desfasoara in baza replicarii
semiconservative a ADN-ului component. Acest mecanism, consemnat si la
nivel cromozomial demonstreaza rolul cromozomilor in dinamica celulara, de
a asigura transmiterea informatiei genetice de la o generatie celulara la
generatiile care succed. Se asigura functia de ereditate ( sincronica).
Confirmarea si demonstrarea ca replicarea cromozomilor este
semiconservativa are loc in stadiul S interfazic; s-a realizat prin metoda
fuziunii celulare.
De exemplu: fuzionand o celula in stadiul G2 interfazic, cu o celula in
metafaza mitotica, cromozomii incep sa se individualizeze in G2, sa se
hipercondeseze cu delimitarea celor doua cromatide ale fiecarui cromozom;
daca se fuzioneaza o celula in stadiul Gl cu o celula in metafaza,
cromozomii in G2 se condenseaza si se individualizeaza, dar vor prezenta o
singura cromatida.

Concluzia este ca replicarea cromozomilor eucariotici are loc intre

stadiul Gl si G2, adica in stadiul interfazic S. Ori replicarea ADN-ului are

172
loc tot in stadiul S. Ca urmare, replicarea cromozomilor se desfasoara
semiconservativ in stadiul S, pe masura ce se dubleaza cantitatea de ADN
prin replicarea proprie.
Prin acest mecanism, cromozomii asigura transmiterea integrala a
informatiei genetice de la celula mama spre celulele fiice, deci continuitatea
genetica a materialului ereditar, conservarea informatiei in succesiunea
generatiilor celulare.

14.2. Cromozomii se replica asincron

Stadiul S, are durata de 6-8 ore, iar timpul necesar pentrti sinteza unei
molecule de ADN este de cateva minute. Daca sinteza moleculelor de ADN si
a cromozomilor s-ar desfasura uniform, o replicare sincrona, timpul necesar
pentru sinteza totala a ADN-ului din genom ar fi de ordinul minutelor.
Insa datele experimentale au stabilit ca sinteza ADN-ului si replicarea
semiconservativa a cromozomilor sunt asincrone, necesitand un interval de
timp de aproximativ 6-8 ore pentru totala replicare a cromozomilor din
genom.

14.2.1. Asincronia inter- si intracromozomala

Autoradiografic s-a stabilit comportamentul cromozomilor in stadiul S

interfazic, momentul cand se declanseaza replicarea, mecanismul si timpul
necesar, stadiului S pentru replicarea semiconservativa a tuturor
cromozomilor din genom.
Rezultatele confirma asincronia de procesare si timp, in replicarea
cromozomilor din genomul celular.
De exemplu, in culturile limfocitare umane s-au observat urmatoarele
diferentieri:
cromozomul 1: telomerele si segmentele de eucromatina incep
replicarea la inceputul stadiului S. In segmentele distale ale bratelor si zona
pericentromerica replicarea este tarditva, iar constrictiile secundare replica
spre sfarsitul stadiului S.
Cromozomul 2 - incepe replicarea mai tarziu in stadiul S. Dar in timp
ce zona pericentromerica incepe replicarea, telomerele o sfarsesc.

173
 Cromzomul 3 - in general, replica tardiv. Replicarea incepe de la
telomere si progresiv, inainteaza spre centromer.
Cromozomii 4 si 5 - replica tardiv. In momentul initierii replicarii pe
bratele q, procesul este mai rapid si de scurta durata, iar bratele p replica
incet.
Cromozomii 6-12 - au comportament asemanator intre ei prin
desfasurarea replicarii, ca proces, evolutie si timp.
Cromozomii 13-15 - Cromozomul 15 replica la inceputul stadiului S,
iar cromozomul 13 spre finalul stadiului (foarte tardiv). Cromozomul 14
incepe replicarea cand o sfarseste cromozomul 15 si o termina cand se initiaza
replicarea pe cromozomul 13.
Cromozomii 16-18 - cromozomul 17 replica la inceputul stadiului S,
cromozomul 18 la sfarsit, iar cromozomul 16 la mijlocul timpului stadiului S.
Cromozomii 19-20 - replicare timpurie.
Cromozomii 21-22 - replicare timpurie.

S-a mai constatat ca desfasurarea in timp a replicarii ADN-ului nu

este conditionata de talia cromozomilor. De exemplu perechile 1 si 2 cu talie
mare replica mai rapid fata de cromozomii 13, 16 si 21, cromozomi cu talie
medie si foarte mica.
Diferente sunt consemnate intre cromozomii 1 si 2: cromozomul 2
incepe replicarea dupa ce la cromozomul 1 procesul este in plina desfasurare.
Desi cromozomul 2 incepe mai repede decat cromozomul 1 replicarea, o
termina mai repede.
Diferente in ritmul si timpul de replicare apar in functie de tipul
celulei.
Pentru cromozomii sexuali X si Y, replicarea este tardiva. De
exemplu, cromozomul X heteropicnotic (corpuscul Barr) initiaza replicarea la
2 ore si jumatate dupa initierea replicarii pe autozomi.
Stabilirea si cunoasterea asincroniei replicarii semiconservative a
cromozomilor are importanta deosebita in aprecierea interferentei proceselor
cu actiunea dereglanta indusa de agentii potentiali mutageni (a se vedea
mutageneza).

174
15. Polimorfismul cromozomilor umani

Se apreciaza ca aproximativ 5-7% dintre indivizii conspecifici se

diferentiaza prin minim o particularitate morfologica sau arhitecturala a
cromozomilor din genom.
De exemplu daca luam ca elemente de reper, bandarea sau
fluorescenta cromozomilor putem aprecia un accentuat polimorfism
cromozomial de pana la 50% indivizi din populatie.
Elementele care stabilesc criteriile de polimorfism cromozomial in
genomul indivizilor din populatie sunt:
constrictiile secundare: extindere, aditia colorantilor in respectivele
zone (Krag - Obsern, 1980)
variatii ale satelitilor: dimensiune, proeminenta, distanta de centromer,
sateliti dubli sau in tandem, absenta lor;
lungimea bratului „p" la acrocentrici (Waditu si col. 1980);
variatii de aditie a colorantilor pe segmente cromatidice sau a gradului
de fluorescenta (Simi si Tursi, 1982)
lungimea bratului q a cromozomului Y.

Un polimorfism accentuat este consecinta replicarilor aditionale, a

inversiilor, duplicatiilor, deletiilor, translocatiilor (Prokofieva -Belgovskaia,
1977).
Dupa Verma (1983) se crede ca variantele morfologice ar fi implicate
in procese ca : riscul non-disjunctiei cromozomilor (ex. acrocentrici lor),
translocatiile robertsoniene etc.
Polimorfismul fiziologic este distinct de polimorfismul mutational.

175
16. Mecanismele si factorii implicati in evolutia genomuiui
uman

Informatiile aduse de genetica si datele oferite de genetica populatiilor au

deschis cai noi pentru descifrarea si interpretarea mecanismelor antropogenetice si
evolutia bio-genetica a speciilor.
Daca ne limitam la clasa hominidelor (si om), afirmam ca dispunem de
probe care evidentiaza schimbari esentiale in structura si numarul cromozomilor,
considerate mecanisme genetice in antropogeneza.
Studiile incepute in 1962 de Chlarelli, au fost reluate, extensiv si intensiv
in 1972-1973 de cercetatori ca Grouchy, Turleau, Pearson, Babrow, s.a., gratie
perfectionarii tehnicilor si metodelor de studiu citogenetic.

16.1. Comparatie intre genomul uman si al pongidelor

Turleau (1972), Grouchy (1972, 1975) intr-un studiu comparat, constata

semnificative diferentieri de structura, morfologie si numar intre cromozomii
umani si ai pongidelor (in special Pan troglodytes -cimpanzeu).
Ca diferentieri cromozomice consemnam:
datorita absentei segmentului cromatidic ql, pe cromozomul uman apare
constricita secundara care lipseste la cimpanzeu. Deasemenea pe bratul
cromozomului 1 uman lipsesc benzile q2i si q22- La cimpanzeu sunt prezente;
prin analiza benzilor, s-a constatat ca benzile Q si G de la cromozomul 2
uman corespund, prin numar, dimensiune cu cele consemnate la perechea 2 de
cromozomi omologi la cimpanzeu. Grouchy (1972), considera ca la om,
cromozomul 2 s-a format prin dispunerea in tandem la nivelul telomerelor bratelor
p, a celor doi cromozomi din cuplul omolog 2 (translocatie robertsoniana).
Prin aceasta translocatie robertsoniana, s-a redus numarul de cromozomi la
46 (numar total) cat are omul actual, fata de 48 cromozomi la Pan troglodytes
(cimpanzeu). Lejeune (1970, 1973) considera aceasta fuziune centromerica un
mecanism important in „speciatia" cromozomala.

176
De exemplu, prin translocatia 2p si 2q a cromozomilor de cimpanzeu, la
cromozomul 2 uman apare o lacuna.

16.2. Factori etiologici implicati in evolutia genomului uman

Ca factori etiologici primordiali in evolutia cromozomilor umani sunt

remanierile de tip mutational, cu efecte comportamentale si aparitia de noi
caractere exprimate fenotipic. Dintre factorii etiologici in evolutia cromozomilor
umani mentionam:
a) Efectele induse de remanierile cromozomiale sunt in raport direct
cu numarul indivizilor din populatie care au suportat remanierile
cromozomale, cu distanta intre generatiile care au succedat. De exemplu, la
Homo sapiens frecventa inversiilor pericentrice este de 0,16 x 10" .
Stabilirea starii de homozigotie este urmarea directa a remanierilor
cromozomale care se produc in raport cu starea de homogamie1 a populatiei.
Frecventa remanierilor si realizarea starii de homogamie este invers
• •17

proportionala cu „dimensiunea" unei populatii panmictice .

In populatiile mici homogamia (consangvinitatea) este mai frecventa, deci
si evolutia cromozomilor este rapida.
Specia Homo sapiens, reprezentata de o populatie cu numar foarte mare de
indivizi, prezinta, la fiecare generatie remanieri cromozomale frecvente (modificari
de structure, morfologie si functie). Deoarece la om coeficientul de cosangvinitate
fiind foarte redus valoric, posibilitatea ca remanierile sa ajunga la stadiul de
„homozigot" pentru cuplul de cromozomi omologi, este foarte mica. Exceptie il
face incestul sau izolatele umane.
b) Un factor care influenteaza evolutia cromozomilor la om este rata
mutatiilor si „patologia" genica. Exemplu care conflrma rata mutatiilor
^enice, ca factor in „evolutia" cromozomilor, sunt in patologia umana:
lanismul telangiectazic si ataxia telangiectazica (ataxia cerebrala

1
Populatie homogama - populaia realizata prin incrucisarea indivizilor de
sexe opuse, dar u asemanari fizice, psihice, genetice si cu un stramos comun.
" Populatia panmictica - populatia a carei membri componenti se
incruciseaza aleatoriu: -ira selectie preferentiala, fara mutatii, fara un stramos
apropiat, comun (nu onsangvinitate).

177
progresiva, cu deficiente imunologice - Ig A- si oculo-cutanate). Este cauza
genetica determinata de instabilitatea cromozomala prin deficienta
endonucleazei ce favorizeaza remanieri cromozomale de tipul: translocatia
14ql2 pe cromozomul 7 din genom, sau segmentul respectiv translocat pe
cromozomul omolog 14.
Remanieri cromozomale si o rata crescuta a mutatiilor cu efecte
„deviante" in fentotip apar si in infectiile virale.
In familiile consangvine riscul de homozigotare, prin remanieri
cromozomale, este foarte crescut.
c) Gradul crescut de consangvinitate favorizeaza un coeficient ridicat
de homozigotare prin remanieri genice si cromozomale. Efectele sunt:
aparitia de noi caractere fenotipice, care se fixeaza usor in genom si devin
transmisibile.
 Consangvinitatea accelereaza mecanismele genetice in evolutia
speciilor, prin:
- trecerea in stare homozigota a genelor cu aparitia de situsuri care
indue rupturi cromozomale;
- formarea rapida a caracterelor noi, cauzate de genele recesive rare;
- cumularea efectelor compartimentale a remanierilor cromozomale
cu aparitia de noi caractere.

16.3. Mecanisme in evolutia cromozomilor

(1) Primii care au stabilit ca inversiile pericentrice sunt remanierile

structurale cele mai frecvente in evolutia cromozomilor umani au fost
Grouchy si col. (1972). Concluzia lor se bazeaza pe studiile de citogenetica
comparata intre Homo sapiens si Pongidele actuale.
Ei au consemnat atat inversii pericentrice cat si paracentrice, a caror
valoare sunt:
a) Inversii pericentrice:
- intre Homo sapiens si Pan troglodytes - 6 inversii;
- intre Homo sapiens si Gorilla - 8 inversii;
- intre Homo sapiens si Pongo - 7 inversii.
b) Inversii paracentrice (mai rare):
- Homo sapiens fata de Pan paniscus - inversie la
cromozomul 7;
- Homo sapiens fata de Gorilla - doua inversii la
cromozomii 7 si 16;

178
 - Homo sapiens fata de Pongo - trei inversii la cromozomii
7, 10, 17.
Aceste inversii s-au produs pe un segment cromatidic relativ scurt.

(2) Translocatiile - Un alt mecanism observat de Grouchy in evolutia

cromozomilor sunt translocatiile. Desi la Homo sapeins sunt frecvente, in
general, raportata ca element citogenetic, comparatie cu Pongidele, s-a
constatat o singura translocatie majora intercromozomala. La om este
translocatia intercromozomala prin fuziunea telomerica 2p si 2q care la Pan
paniscus reprezinta un cuplu de cromozomi 2 omologi (translocatie
robertsoniana).

(3) Translative reprezinta un mecanism in evolutia cromozomilor

umani. De exemplu:
- banda q 13 de la cromozomul 11 de la Pongo este prezenta si
pe cromozomul 11 la Homo;
- la Pongo pe bratul scurt al cromozomului este banda pi3,
prin translatie, la Homo o intalnim pe bratul q al cromozomului 20, probabil
intre qll si ql2.

16.4. Efectele remanierilor asupra structurii cromozomilor

a) Efecte cantitative. La Homo Sapiens duplicatia sau deletia unui

segment cromatidic are efect morbid sau letal asupra indivului afectat. In
consecinta, se apreciaza ca deletia si duplicatia au jucat un rol minor in
evolutia cromozomilor de la Pongide la Homo.
b) Efecte compartimentale - Modificarea structurii cromozomilor
deregleaza meioza datorita neomologiei pe segmente cromatidice intre
cromozomii omologi. De exemplu remanieri de tipul translocatiei echilibrate
sau aneusomia'3 recombinarilor (recombinari complexe sau efecte
intercromozomale) due la diminuarea fertilitatii.
Aneusomii cu efecte compartimentale intracromozomice la Homo
Sapiens sunt: inversiile pericentrice (mecanism de remaniere foarte activ),
translocatiile.

13
Aneusomie - orice modificare de structura sau de numar a cromozomilor
din genom.

179
c) Efecte asupra fenotipului - Remanierile echilibrate nu modifica
fenotipul individului purtator. Ca remanieri echilibrate, translocatiile, pot fi
reciproce, tralslocatie, prin fuziune centrica, insertii.
Sunt si translocatii reciproce care indue modificari fenotipice. De
exemplu, translocatia reciproca intre cromozomul X si un autozom, care
determina monozomia partiala a autozomului.
Insertia poate determina gruparea unor gene, care, normal, se gasesc
la mare distanta pe cromozomi.
Inversia pericentrica modifica secventa de citire a mesajului inscris in
gene.
Fuziunea telomerica a doi cromozomi, perturba reglarea respectivelor
gene, daca citirea codificata se face de la centromer spre telomer.

16.5. Ipoteze asupra mecanismelor evolutiei cromozomilor la om

Evolutia cromozomilor implica un mare numar de mecanisme. Se

pare ca remanierile cromozomale in evolutia genomului, sunt dependente de
structura, ultrastructura si morfologia cromozomilor.
a) Ipoteza sintezei de material nou sau pierdere de material. Studiile
citogenetice comparate intre Homo si Pongidae, au evindentiat ca spre
deosebire de Pongidae, la Homo apar benzi Q terminale pe bratui „p", iar la
bratui „q" lipsa benzilor Q terminale. Deasemenea apar diferentieri de
localizare a heterocromatinei, precum si aparitia benzilor Q
juxtacentromerice la cromozomii umani.
Grouchy mentioneaza ca bratui p al cromozomilor acrocentrici
prezinta o regiune heterocromatica, care formeaza sateliti a caror dimensiune
este variabila (la om pe cromozomi 13, 14, 21, 22). Dupa Grouchy, acesti
sateliti ar fi rezultatul sintezei de „novo" de material genetic, sau consecinta
duplicarii unei benzi, deja existenta pe bratui scurt
„p".
Heterocromatina si regiunea telomerelor sunt zone cromatidice unde
pot avea loc remanieri structurale datorita localizarii lor in raport cu
centromerul. Se cunoaste ca centromerul si telomerele au rol important si
determinant in replicarea normala a cromozomilor.
b) Ipoteza schimbului neechilibrat de segmente cromatidice intre
cromozomi . In profaza primara a meiozei reductionale are loc un schimb
echilibrat de material genetic prin crossing-over echilibrat (egal). Sunt insa

180
si cazuri cand se realizeaza schimb neechilibrat datorita unui crossing-over
inegal realizat intre cromozomii omologi.
c) Ipoteza modificarii formulei cromozomale, Modificarea formulei
numarului de cromozomi se realizeaza prin reducerea sau crestera numarului
de cromozomi in genomul celulei.
• Reducerea numarului de cromozomi din genomul organismului se
poate realiza prin doua procese:
malsegregarea, repartitia inegala a numarului de cromozomi intre
celulele fiice rezultate din meioza si mitoza (exemplu este sindromul Turner la
om);
fuziunea centromerica si/sau telomerica. Malsegregarea, repartitia
inegala a numarului de cromozomi, determina in finalul diviziunii obtinerea a
doua celule fiice diferite prin numarul cromozomilor: celula monozomica,
numar redus de cromozomi si celula trizomica cu un cromozom in plus.
Monozomia unui cromozom autozom, sau prezenta in celula numai a
cromozomului Y (lipsind cromozomul X), la om sunt cu efect letal. Cand
monozomia este legata de pierderea unui cromozom X la femeie (ex.
sindromul Turner , 45, X) are ca efecte pierderea unor activitati genetice care
se exprima fenotipic prin: disfunctii, histodisplazii sau morfodisplazii.
Fuziunea centromerica , descrisa pentru prima data in 1916 de
Robertson, determina reducerea numarului de cromozomi in genom.
Fuziunea telomerica. Exemplu cromozomul 2 uman provine din
fuziunea telomerica a cromozomilor submetacentrici 2p si 2q de la Pan
troglodytes, iar la locul fuziunii apare o lacuna.
• Cresterea numarului de cromozomi in genomul celular. Legat de
cresterea numarului de cromozomi in genom s-au elaborat mai multe
ipoteze.
Formarea de noi cromozomi prin sinteza de material centromeric.
Ipoteza neacceptata.
Prezenta de structuri asemanatoare centromerului, rezultate din fuziuni
intercromozomice precedente, in evolutia genomului. Prin separare, aceste
structuri isi reiau functia centromerica.
Achizitia de cromozomi prin malsegregare.
Formarea microcromozomilor. Mecanism ce poate explica prezenta
centromerilor si telomerele de „rezerva". De exemplu, la om, prezenta unui
microcromozom (in exces) poate fi transmis la descendenti. La copil
microcromozomul mostenit se poate duplica, rezuitand doi microcromozomi,
identificabili prin cuplarea lor in zigonemul profazei primare a meiozei.
Microcromozomii nu indue modificari fenotipice

181
deoarece ADN-ul lor nu contine informatie genetica pentru a fi decodificata
in ARNm.
Prezenta lui in genom poate avea urmatoarele urmari: sa primeasca,
prin translocatie echilibrata, un brat de la cromozomii cu centromer, devenind
genetic functional.

16.6. Relatii intre structura si remanierea cromozomilor

- Localizarea constrictiilor secundare, rezultate prin remanieri

cromozomale, pot produce modificari fenotipice majore.
- Existenta situsurilor fragile pe cromozomii remaniati (exemplu pe
cromozomii 10 si 14 la om).
- Fisuri cromatidice la nivelul benzilor T si R, si inversii paracentrice
(ex. cromozomul 7 uman).
- Formarea unor structuri ce favorizeaza endoreduplicarea
segmentului distal al cromozomului 2q, fuziunea sau translocatii
intracromatidice.

17. Arhitectura si evolutia cromozomilor sexuali (gonozomii)

La Homo sapiens, specie cu reproducere sexuata, exista un cuplu de

cromozomi, care, prin structura, morfologie si functii sunt diferiti de
cromozomii autozomi. Sunt cromozomii sexuali sau gonozomii, care la barbat
sunt reprezentati XY, la femeie XX.
Acest cuplu, XX sau XY, se constituie in momentul fecundarii si
constituirii zigotului reprezentand sexul cromozomial, genetic, al fiecarui
subiect din populatia umana.
Cromozomii X si Y, intervin in formula sexului genetic.
Acesti cromozomi se caracterizeaza printr-un accentuat polimorfism,
de talie, zone pseudoautozomale, grad de heterocromatinizare, etc. (fig. 47).

182
Fig. 47 Cromozomul X si Y (supersia prin crossing-over) - bandare
enzimatica.

17.1. Arhitectura cromozomului Y.

Datorita rolului esential in conditionarea sexului genetic si somatic la

barbati, este necesara o analiza deosebita a cromozomului Y.
Ca talie, cromozomul Y este eel mai mic din genomul urnan, avand
aproximativ 60 Mb, ceea ce reprezinta 2-3%, cantitate ADN din setul
haploid.
Prin folosirea tehnicilor de bandare, s-a observat ca acest cromozom
Y, prezinta regiuni distincte in strcutura sa, cum sunt: regiunile
pseudoautozomale PARI si PAR2, regiunile eucromatice si heterocromatice.
Regiunile pseudoautozomale ale cromozomului Y le gasim in zona
terminala (distala) a bratelor cromozomului. Acestea sunt: PARI in zona
terminala a bratului scurt (p) si PAR2 in zona terminala a bratuiui lung (q).
Cele doua regiuni pseudoautozomale insumeaza 2920 Kb, din care 2600 Kb
PARI si320KbPAR2.
S-a observat ca in profaza primara a meiozei reductionale, se poate
realiza schimb de material genetic cu regiuni omoloage de pe cromozomul
>exual X. Se apreciaza ca cele 2920 Kb din regiunile pseudoautozomale ar
>rezenta 5% din totalul ADN-ului component al cromozomului Y.

183
 S-a mai stabilit ca regiunea PARI a bratului scurt este importanta,
asigurand fertilitatea masculina. Acesta observatie este urmarea efectului
producerii de deletii in regiunea bratului terminal „p". Si anume deletia
acestui segment cromatidic stopeaza meioza, determinand azoospermia
(Kostiner Dana, 1988).
Cromozomul Y prezinta regiunile eucromatice si heterocromatice
reprezentand 95% din ADN-ul cromozomului. (Foote si col. 1992).
Sunt regiunile Y-specifice, denumite si NRY (Non Recombining Y).
Regiunea eucromatica Y - specifica - este paracentromerica pe bratul
„q", in regiunea centromerica si in regiunea paracentromerica a bratului „p".
(Foote si col. 1992).
Regiunea heterocromatica a cromozomului Y . Aceasta regiune este
localizata in zona Yq distala si corespunde benzii cromozomale Yq^. Este
considerata regiunea „inerta" datorita inactivitatii de codare, este non-
codanta, dar se caracterizeaza printr-un accentuat polimorfism, stabilit prin
analiza markerilor genetici la indivizii conspecifici.
Polimorfismul regiunii heterocromatidice este consemnat in banda
Yqn si in regiunea centromerului, regiuni care contin secvente repetitive.
Aceste secvente repetitive pot fi grupate in trei mari familii:
DyZ^.Este familia la care unitatea repetitiva are 3,4 Kb. Aceasta
familie ar insuma 4000-6000 secvente repetitive.
DyZ2. Unitatea repetitiva are apfoximativ 2,1 Kb si ar contine
aproximativ 2000 secvente repetitive.
DyZ^ este ADN-ul satelit de tip alfoid, in regiunea pericentromerica a
cromozomului Y.
In structura moleculara a cromozomului Y se gasesc si doua clase de
secvente repetitive si anume SINES( Short Interspersed Elements) si LINEs
(Long Interspersed Elements), secvente care se gasesc si pe cromozomii
autozomi.
Clasa SINEs este reprezentata de secvente Alu. Secventele Alu de pe
Y sunt inalt divergente in raport cu secventele Alu de pe autozomi. Clasa
SINEs contine secvente de 300 pb, insumand intre 300.000 - 900.000 unititati
repetitive.
Clasa LINEs. Este reprezentata de o singura familie de secvente pe
cromozomul Y uman - familia Kpn, a caror membri ocupa aproximativ 6,4
Kb.
S-a stabilit ca in cromozomul Y aproximativ 50% este ADN cu
secvente repetitive non-codante.
Cartografierea cromozomului Y a evidentiat doua clase de gene care

184
insumeaza aproximativ 40 gene. Repartizarea in cele doua clase a avut drept
criterii functiile respectivelor gene. Cele doua clase sunt:
- genele derivate din perechea ancestrala de autozomi. Dintr-o
pereche ancestrala de cromozomi autozomi au evoluat cromozomii sexuali X
si Y. Respectivele gene, in copie unica, sunt intotdeauna exprimate ca functie
si au alele omoloage pe cromozomul X. Aceasta clasa de gene este localizata
in regiunea pseudo-autozomala a cromozomului Y;
- gene achizitionate in cursul evolutiei. Achizitionarea noilor gene pe
cromozomul Y s-a realizat prin mecanismul de translocatie de la autozomi.
Sunt localizate in regiunea nerecombinativa genetic din cromozomul Y.
Majoritatea genelor din aceasta clasa se gasesc in copii multiple.
Numai gena SRY (Sex determining Region of the Y), care codifica proteine
cu functie Jnductor morfogenetic" in diferentierea testiculului, se gaseste in
doza unica:
Gena SRY nu are gena omoloaga pe cromozomul X.

17.2.Evolutia cromozomilor sexuali la om

Cromozomii sexuali reprezinta un tip special de evolutie genomica la

mamifere si om.
Datorita variabilitatii accentuate, determinata de particularitati de
structura, morfologie si functie genetica, intre cromozomii X si Y, motiveaza
ipoteza ca heteromorfismul gonozomilor este rezultatul unui lung proces si
modificari complexe in evolutia separata a cromozomilor X si Y(Ohno, 1969;
Marshall si Watson, 1991).
Din datele experimentale si studiul filogenetic al cromozomilor
sexuali au fost emise diverse ipoteze ca heteromorfismul dintre X si Y ar fi
rezultatul unor mecanisme genetice.
Ohno (1969), lanseaza ipoteza unei evolutii particulare a
cromozomilor X si Y in raport cu evolutia autozomilor. El considera ca la
speciile ancestrale de vertebrate, cromozomii ancestrali cu rol in sexualitatea
speciilor erau morfologie identici, iar determinarea sexului era controlata de
gene, de un sistem de cupluri alelice. Acest complex de cupluri alelice
implicate in sexualitate nu era o necesitate absoluta. In functie de raporturile
de homo - si heterozigot era determinat sexul.
De exemplu cromozomii „sexuali" ancestrali cu morfologie identica,
care aveau cuplul homozigot al genelor sexualizante ar fi determinat un sex,
iar starea heterozigota sexul opus.

185
 Conform ipotezei lui Ohmo, sustinuta de cercetarile lui Grouchy
(1987), Riggs (1990), Rice(1994) s.a, la mamifere si om, cuplul de
cromozomi sexuali X si Y provine dintr-o pereche homomorfa de cromozomi
ancestrali. Mecanismele care au precedat heteromorfismului gonozomilor
umani au inceput si s-au derulat pe parcursul a 200 milioane de ani in evolutia
bio-genetica a vertebratelor pana la omul actual.
Heteromorfismul gonozomilor, exprimat prin accentuata diferentiere
de structura, dimensiune si functie genetica existenta intre X si Y, a
determinat elaborarea ipotezei ca cei doi cromozomi sexuali (la mamifere si
om) au evoluat separat, independent (Bull, 1983, Charles Worth (1978),
Marshall - Watson (1991) si Jablouka (1990).
Conform argumentelor aduse de cercetatori, heteromorfismul
cromozomilor sexuali X si Y s-a realizat intr-un lung proces evolutiv prin
modificari graduale, cum ar fr.
supresia partiala sau totala a crossing - over-ului in doi cromozomi
omologi la sexul heteromorfic ce difera prin gena sexualizata.
„degenerarea" functiei genetice a cromozomului Y, cromozom
heteromorf.

17.2.1. Supresia prin crossing - over

Ipotezele lansate considera ca genele sex-linkate cu efecte opuse

asupra unor caractere la cele doua sexe, ar avea un avantaj selectiv la unul din
sexe, urmarea recombinarilor interlocusuri (fig. 47)
Reducerea marcata a structurii realizata prin schimbul genetic extins
prin deletie, ar determina variante genetice care ar asigura exprimari
fenotipice ale unor caractere, cum ar fi: afectare psihica, morfologica,
diferentieri comportamentale. Asemenea modificari fenotipice ar putea fi
considerate avantajoase pentru sexul heterogametic si neavantajoase pentru
sexul homogametic.
Supresia crossing-over-ului s-ar fi realizat prin urmatoarele
mecanisme:
a) Supresia genelor - Un factor care diminueaza recombinarea
intracromozomica a gonozomilor este selectia genelor, considerat factor
initiator in evolutia cromozomilor sexuali, in special pentru cromozomul Y.
Selectia genelor, diferentiat la X si Y, dar mai ampla selectia la nivelul
cromozomului Y, a dus la izolarea si separarea cromozomilor sexuali X si Y.
Supresia genica s-ar fi realizat prin deletia intracromatidica prin care

186
sunt eliminate unele gene, urmata de aditia altor gene, cu informatii genetice
diferite fata de cele eliminate.
b) Modificari conformationale - Modificarile conformationale includ
heterocromatinizarea si „alternarea" timpului de replicare prin care se
deosebesc cromozomii X si Y intre ei, care la randul lor se deosebesc de
cromozomii autozomi. Modificarea conformationala explica replicarea tardiva
a cromozomilor sexuali.
c) Modificari structurale. Ele se pot produce prin inversii pericentrice si
paracentrice. Modificarile structurale modifica ordonarea omologiei
segmentelor cromatidice si imposibilitatea de cuplare completa a
cromozomilor sexuali in stadiul de zigonem al profazei primare din meioza.
Datorita cuplarii incomplete in meioza, segmental necuplat se va inactiva prin
modificari conformationale. Asemenea inactivari ar fi consecinta inversiilor.
Rearanjamentul strcutrural al cromozomului Y, care este diferit de al
cromozomului X, determina partial, supresia crossing - over-ului in meioza.
Datorita neomologiei intre X si Y, in zigonem nu se formeaza sinapsele
intercromozomale si are loc, frecvent , crossing - overul. Crossing-overul se
poate realiza numai la nivelul segmentelor pseudoautozomale, sau prin deletia
bratului „p" al cromozomului Y. Datorita neomologiei cromatidelor intre X si
Y cuplaroa in meioza este incompleta. Daca in meioza s-ar produce un
uossing-over intre cromozomii XX in zona unde a avut loc inversia
intracnwnatidica, ar rezulta gameti „aneuploizi" (corect o monozomie
partiala).
Dar, datorita cuplarii incomplete pe segmental cromatidic necuplat in
meioza, se pot produce modificari conformationale in cromozomii sexuali.
Clark si Wall (1996) considera ca supresia crossing-over-ului poate fi
influentata si de modificarea structurii si conformatiei cromozomilor sexuali
X si Y.
Modificarea conformatiei determina degenerarea unor structuri
cromozomale a heterocromozomilor X si Y. Consecinta degenerarii structurii
intre X si Y este diferentierea genetica si modificarea functiilor, precum si
izolarea heterocromozomilor. Va rezulta un cromozom Y cu talia foarte mica,
iar cromozomul X cu talia mijlocie.
Degenerarea structurii este realizata si prin acumularea de mutatii
cauzate de „alterarea" strcuturii ADN-ului din cromozomi.
d) ^Degenerarea" functionala. La sexul feminin homogametic XX
exista un rise crescut de acumulare a mutatiilor. Dar, datorita omologiei
celor doi cromozomi X, este posibila o reducere a coeficientului de mutatie,

187
deoarece in meioza poate avea loc recombinarea prin crossing-over intre
omologii X, precum si o rata crescuta a proceselor de reparare a „defectelor"
genetice produse.
Clark si Wall considera ca rata mutatiilor la nivelul
heterocromozomilor X si Y este apropiata valoric. Insa rata de fixare a
mutatiei este mai crescuta la cromozomul Y. Cauza acestor diferentieri este
urmatoarea: cromozomul Y, desi foarte mic dimensional, datorita
neomologiei cu X, este lipsit de crossing-over si reparare a mutatiilor, sau s-ar
produce foarte putine, in schimb, cuplul de cromozomi X, fiind omologi, in
meioza este o rata crescuta de crossing-over si reparare a mutatiilor. Aceste
particularitati legate de dinamica heterocromozomilor, determina
diferentierile heterocromozomilor, determina diferentierile degenerative a
functiilor intre X si Y.
Clark si Wall (1996), Rice (1994), Migeon (1994) s.a, considera ca
degenerarea functionala a cromozomului Y ar fi consecinta acumularii unei
cantitati crescute de heterocromatina, urmarea modificarilor conformational si
structurale. Conform ipotezelor lansate de ei, se considera ca acumularea de
heterocromatina ar fi consecinta unei acumulari crescute de ADN „parazit" de
catre cromozomul Y, ADN a carui unica functie este autoreplicarea .
Acumularea de heterocromatina ar fi avut loc dupa stabilizarea
supresiei crossing over-ului si degenerarea functionala stabila.
Dar degenerarea functionala a cromozomilor Y nu este stabila la toate
speciile de mamifere. De exemplu, la Homo sapiens (omul actual)
instabilitatea degenerarii cromozomului Y este evidentiata de polimorfismul
accentuat in populatiile umane. Datorita relativei instabilitati degenerative
sunt posibile supresii genice, modificari conformationale si structurale,
achizitii de noi mutatii. Prin aceste mecanisme si procese se accentueaza
degenerarea functionala a cromozomului Y fata de X.
In concluzie: acumularea efectelor genice, modificarilor
conformational-structurale si acumularea de mutatii, sunt elemente care
determina degenerarea functional - genetica a cromozomului Y.
Un exemplu de degenerare functionala, intre cei doi
heterocromozomi, este ca pe bratul scurt (p) al Y-ului este locusul genei SRY
(Yp 11.3) care determina sexul masculin, cromozomii X fiind lipsiti de
aceasta gena, sexul va fi feminin.
In meioza, posibilitatile de cuplare intre cromozomii X si Y sunt la
nivelul segmentelor pseudoautozomale, deoarece contin secvente omoloage.

188
 Conservarea cromozomilor sexuali la mamifere si om este
remarcabila, fiind considerata ca un mecanism de protejare si asigurare a
dozajului genelor X linkate.
Enzimele polimeraze participa la elongarea noilor catene care se vor
cupla, complementar, cu catenele matrita, intergind moleculele de ADN dupa
replicare. Replicarea fiind semiconservativa, fiecare molecula rezultata va fi
compusa din catena veche (matrita) si catena nou sintetizata
(complementara).
Fiecare diviziune celulara este precedata de replicarea corecta a ADN-
ului genomic.
Modelul Watson-Crick prezice existenta „ furcii de replicare" la
molecula ADN in curs de sinteza .
Furca de replicare a fost evidentiata si studiata la bacterii. Prin
marcarea ADN-ului din celula bacteriana cu timidina tritiata,
autoradiografiile obtinute au fost examinate la microscopul electronic ( J.
Cairns 1963).

189
CAPITOLUL IV
CONCEPTUL DE GENA

Johanssen introduce notiunea de gena (1909), fiind considerata, in

prezent, unitatea informational - activa si determinanta, care codifica sinteza
unei proteine cu structura si functii specifice.
Interesanta este definitia, elaborata de Th. Morgan (1915), exponent
al geneticii clasice, data genei: gena este unitatea de functie, recombinare si
mutageneza a aparatului genetic celular.
In prezent, definitia genei a fost corectata si completata, gratie
tehnicilor si metodelor de analiza a ADN-ului, elaborate dupa 1970 si in
prezent.
Pana in 1970 conceptul asupra notiunii de gena se limita la a aprecia
ordonarea nucleotidelor care realizeaza mesajul genetic pentru ordonarea
aminoacizilor (numar si tipuri) in lanturile polipeptidice, determinand
structura si proprietati specifice proteinelor. Dar nu existau tehnici prin care sa
poata fi izolata gena din genomul eucariotelor.
Tehnicile elaborate de Nierenberg si Kharana (1960-1965) desi
valoroase, n-au reusit sa stabileasca dimensiunea unei gene din genom.
Dificultatea era urmatoarea: disproportia intre dimensiunea genei, apreciata la
cateva mii de perechi si baze, in raport cu numarul pb din ADN-ul celular,
estimat la aproximativ 3.500.000.000 pb.
Aceasta a putut fi eliminata prin elaborarea unor tehnici care au
revolutionat studiul genomului uman, care au permis studiul structurii
complexe a unei gene din genom.
Noile tehnici au permis:
o Cu ajutorul revers - transcriptiei s-a putut transcrie „in vitro" o
molecula de ARNm complementara cu o secventa de nucleotide din
structura ADN-ului (Baltimore, Termin 1976)
o Prin folosirea endonucleazelor de restrictie s-a putut realiza
decuparea ADN-ului cromozomial in fragmente cu un continut de
aproximativ lOOOpb. Prin acest procedeu genomul uman, cu un continut de

190
3xl09 pb, a putut fi decupat in cca 106 situsuri. In prezent sunt folosite peste 200
tipuri de endonucleaze (enzime de restrictie) pentru tot atatea situsuri I din
ADN-ul genomic (Roberts si col. 1988).
I o Inserarea de fragmente scurte de ADN (plasmide de 5 kb sau 40 kb
I in timpul replicarii repliconilor ADN-ului genomului uman, sunt incercari I de
recombinare „in vitro" a ADN-ului celular prin introducerea de segmente ADN
straine in respectiva celula. Prin acest procedeu se realizeaza amplificarea,
puriflcarea si dimensiunea genei. Este procesul ce premerge clonarii genei ca
metoda ce a revolutionat genetica actuala. (Old siPrimnoze 1980)
o Secventializarea genei - prin stabilirea secventei aminoacizilor din
lantul polipeptidic, polipeptid codificat genetic de gena din genomul celulei.
Pentru secventializarea genei s-au folosit enzime ca ADN-polimeraze (Sanger
si Coulson, 1975; Maxam si Gilbert, 1978).
Din studiile efectuate pana in prezent putem defini ca gena este

I
unitatea functionala a ADN-ului cromozomal sau mitocondrial care detine
mesajul genetic in forma codificata pentru determinarea si sinteza unei
proteine specifice, intermediara fiind molecula de ARNm, care decodifica
mesajul genetic din ADN. Gena, cu dispozitie liniara si adiacenta altor
gene se inlantuie cu acestea formand grupuri linkate in axul longitudinal al
cromozomului, care se transmit grupat de la o celula la generatiile celulare
care succed.
Grupate, dispuse liniar, fiecare gena ocupa o pozitie pe cromozom,
pozitie intercalata de genele vecine. Gena nu este delimitata de granite
morfologice sau de componente chimice particulare. Gena are o delimitare
functionala, relevata de semnificatia mesajului genetic inscris in structura sa
nucleotidica delimitata fiind de cordonul „non-sens" cu rol de punctuatie
informationala.
Functionarea genei este conditionata de integrarea intr-un sistem
autoreplicativ, desi ea functioneaza independent" in determinismul calitativ al
proteinei sintetizate in celula. Cromozomul nu este un simplu depozit de
gene. El reprezinta un sistem armonios de relatii intergenice.
Ordonarea genelor intracromozomale, s-a dezvoltat gradat in cursul
evolutiei bio-genetice. Tot in cursul evolutiei bio-genetice s-a realizat
structura cromozomului, duplicatiile genice implicate in structura fiecarui
tesut, a fiecarui organ.
Este acceptat si demonstrat ca gena este o secventa polinucleotidica
din molecula ADN-ului cromozomal inzestrat cu capacitatea de autoreplicare.

191
 In cursul evolutiei biologice s-a realizat structura chimica,
dimensiunea si stricta specificitate informationala delimitate de codonii „non-
sens terminatori".
Desi ca unitate de functie in genomul celular si entitate stabila, gena
poate suporta modificari in structura ei, in conditiile cand asupra ADN-ului
actioneaza factori exogeni agresivi, potentiali mutageni, cu efecte secundare
asupra caracterelor exprimate fenotipic (malformatii congenitale pe fond
genetic).

LStrutura genelor la eucariote

Analizate moleculele de ADN din cromozomul procariotelor si din

cromozomii eucariotelor s-a constatat urmatoarele diferentieri:

La procariote:
un singur cromozom care contine o molecula gigant de ADN;
ADN-ul din cromozomul procariotelor nu este cuplat cu proteinele de
tip histone;
ADN-ul procariotelor nu contine secvente nucleotidice repetitive;
tot ADN-ul este informational genetic, activ, reprezentand in forma
codificata, mesajele genetice pentru determinarea sintezei propriilor proteine
specifice;
genele lipsite de introni.

La eucariote:
existenta unui numar variabil de cromozomi in genom (omul are 46
cromozomi);
ADN-ul din componenta fiecarui cromozom este cuplat prin legaturi
sterice, cu proteinele de tip histone (Hi, H2A, H2B, H3 si H4), formand
complexe nucleo-proteice;
ADN-ul eucariotelor este heterogen in raport cu structura primara,
cromozomii continand ADN repetitiv (moderat si inalt repetitiv
-noninformational) si nerepetitiv (informational).
Structural, gena este complexa, continand introni-exoni;
Existenta familiilor de gene implicate in edificarea aceluiasi caracter;
In ADN-ul din genomul uman exista 3,2 -3,5 x 109 perechi de
nucleotide.

192
 Luandu-se in considerate aceste diferentieri structural, cantitative si
functionale, s-au emis ipoteze confirmate, ca genele la eucariote sunt
fundamental diferite fata de procariote. De exemplu genele individuale
considerate de Morgan entitati functionale indivizibile, sunt reprezentate de
segmente nucleotidice care pot fi „fragmentate" in subunitati structurale
-functionale sau nonfunctionale.

1.1.Structura genei din genomul eucariotelor

Din totalul ADN-ului cromozomal al eucariotelor numai o cantitate

foarte mica de ADN este exprimata informational in structurile proteice. Se
estimeaza ca din totalul ADN-ului nuclear aproximativ 5-10% este codant.
Genetica moleculara a consemnat neconcordanta intre dimensiunea
moleculei de ARN premesager, care a decodificat structura integrala a genei
si care este identificat in nucleu si masa moleculara a ARNm prezent in
citoplasma celulei. Discordanta masei moleculare intre cele doua stari (etape)
ale ARNm, a dus la elaborarea ipotezei ca gena are o structura discontinua
sau in mozaic, la eucariote.
Din punct de vedere molecular gena la eucariote este o „colectie"
liniara de secvente informational active si secvente non-informationale. Dupa
1977 se cunosc incercari si analize moleculare, care, prin rezultate, au dus la o
redimensionare a notiunii de gena.
De exemplu Sharp (1977), Gilbert si Tonegam (1978), Crick (1979),
Gilbert (1985) s.a, pe baza propriilor observatii, formuleaza ipoteza ca
structura unei gene, ca unitate de transcriptie a ADN-ului genom, prezenta pe
un locus in cromozom, are masa moleculara mai mare in raport cu ARNm
citoplasmatic care a decodificat-o.

1.1.1. Structura discontinua a genei sau gena in „mozaic"

Din punct de vedere al geneticii formale, gena este considerata

unitatea de functie, recombinare si mutageneza, mostenita si transmisibila.
Dar din punct de vedere molecular, gena este o „colectie" liniara de
secvente nucleotidice din ADN-ul cromozomial, care determina sinteza unei
molecule de ARN, care precede sinteza unui polipeptid in citoplasma celulei.
Datorita neconcordantei masei moleculare a ARN hibrid premesager;
precursor al ARNm matur care se sintetizeaza la nivelul genei

193
din ADN-ul cromozomial, s-a preconizat ca structura genei care detine mesaj
genetic este complexa, este secvential heterogena.
Studiile lui Sharp si Roberts (premiul Nobel pentru medicina, 1993)
au evidentiat ca genele din genomul uman, ca la toate eucariotele, au structura
informational discontinua. Ei au observat prezenta unor structuri secventiale
„suplimentare" de nucleotide non-informationale intercalate printre
segmentele nucleotidice cu mesaj genetic.
Sharp si Roberts au numit secventele cu mesaj genetic informational
exoni, iar secventele liniare non-informationale introni.(fig.48)

1
I
P INC EXONI EXON2
EXON3NC]

INTRON1 INTRON2

Fig. 48 Schema generala a unei „gene" la eucariote. - -

ADN non transcrisa:
SA: secvente adiacente
P: promotor (semnal ATA)
I: initierea transcriptiei.
Secventa noncodanta transcrisa si prezenta pe
ARNmm (mesager matur)
EXON
Secventa codanta (transcrisa si tradusa)
Secventa noncodanta (transcrisa dar absenta din ARNm matur)

Exonii din structura genei sunt transcrisi in molecula de ARN pre-

mesager (precursor) iar mesajul lor il gasim, in totalitate, in molecula de ARN
mesager matur. Acest ARNm matur este eel care, dupa traversarea anvelopei
nucleare in citoplasma, asigura sinteza unei proteine, cu structura si functii
specifice, mai corect sinteza unui lant polipeptidic ce va structura o molecula
proteica.
Intronii sunt transcrisi in molecula hibrida de ARN pre-mesager
(precursor) impreuna cu exonii, dar nu sunt inclusi in structura fnala a
moleculei de ARNm matur. Ei vor fi eliminati prin restrictie enzimatica, din

194
ARN premesager, in timp ce exonii vor fi recuplati de enzimele ligaze,
formand ARNm niatur (vezi sinteza ARNm si a proteinelor).
Decodificarea si sinteza ARN pre - mesager (precursor) este catalizata
de enzima ARN-polimeraza II.
In 1990, Kaplan si Delpech, considerau ca intron este orice segment
transcris din ADN, dar eliminat dupa transcrierea primara.
Deci intronii nu vor fi prezenti in structure unui ARNm matur.
S-a observat ca numarul exonilor si intronilor variaza in limite largi in
genele eucariotelor. De la un intron pana la 50 introni si chiar mai mult.
De exemplu, gena care codifica sinteza actinei are un singur intron.
Gena care codifica sinteza (3 - globulinei confine doi introni, in timp de gena
care la pasari codifica sinteza precolagenului are 50 de introni.
Un alt exemplu care confirma numarul variabil de introni in
componenta genelor este gena pentru hemofilia A la om. Aceasta gena
confine 186.000 pb, insumand nucleotidele din exoni si introni, respectiv
0.1% din totalul ADN-ului din cromozomul sexual X. Dar in molecula
ARNm matur se gasesc numai 9000 pb. Deci numai 9Kb corespund
segmentelor exonice, diferenta semnificativ mai mare, sunt nucleotidele din
intronii non-informationali.
O alta observatie a lui Shaip si Roberts este ca primul si ultimul
segment polinucleotidic din structura genei in „mozaic", sunt exoni.
Ca urmare, o gena structurata in mozaic, va confine ca numar de
introni egal cu al exonilor mai putin unul (ex 2n-l; de unde 2n este numarul
exonilor din componenta genei structurale).
Deasemenea s-a constatat ca, in general, primul intron este relativ
scurt prin prezenta nucleotidelor care-1 structureaza, iar al doilea intron este
mai lung. Ceilalti introni componenti ai genei structurale au lungimi variabile
cuprinse intre 45 pb pana la aproape 5000 pb. De exemplu, la mamifere este o
gena care determina genetic sinteza dehidrofolat reductaza (DHFR, care
contine sase exoni. Gena existenta in ADN-ul cromozomal (in mozaic
structural) contine 31000 pb in timp ce ARNm matur numai 2000 pb. Sau
gena pentru tireoglobulina in ADN, contine 300 Kb iar ARNm matur are 8
Kb, in timp ce gena pentru distrofina, a carei lungime este de 2500 Kb,
transcrie un ARNm matur de 14Kb.
Din toate aceste exemple se constata neconcordanta intre structura
genei din ADN cu locusul pe cromozom si structura prin numar de nucleotide
din ARNm matur. Putem retine ca prin lungime si numar de nucleotide
intronii sunt mult dimensionati fata de componenta exonilor. Deci gena
contine un numar mare de secvente lipsite de mesaj genetic
(noninformationale).

195
 Prin folosirea metodelor de cartografiere prin „restrictie" si
secventializarea oligonucleotidelor prin marcarea precursorilor s-au
evidentiat unele caracteristici ale genelor cu structura discontinua si anume:
• ordinea exonilor din structura genei din ADN-ul cromozomial este
respectata si in structura ARNm matur. Ca urmare se poate afirma ca gena in
„mozaic" este „fragmentata" pe secvente nucleotidice liniare, exoni-introni si
nu dispersate. Concluzia: ca structura genei este discontinua.
• Intronii din componenta genei contin codoni terminatori „non-sens",
in toate fazele de transcriptie a genei in ARN pre mesager (precursor).
• Componenta unei gene structurale din genomul organismului este
aceeasi in toate celulele, indiferent care este tesutul sau organul din care fac
parte celulele;
• In marea lor majoritate intronii incep in pozitia 5 cu dinucleotidele
GT si sfarsesc cu dinucleotidele AT in pozitita 3', al capatului opus al
intronului. Sunt putine exceptii de introni care incep la un capat 5' AT si
sfarsesc la capatul 3' AC. Structura 3' AT are importanta ca asigura decuparea
corecta a intronilor din structura genei mozaic.
• Gena in mozaic incepe cu primul exon in pozitia 5, iar ultimul exon
va sfarsi in pozitia 3', ordinea fiind stabilita din analiza ARNm matur rezultat
din transcriptie si dupa eliminarea intronilor.
• Cand o gena structurala din genomul unui eucariot este lipsita de
introni, carta de restrictie a ADN-ului pentru respectiva gena corespunde
exact cu a ARNm obtinut prin transcrierea inversa cu ajutorul revers
transcriptiei a ADNc sau a ADNm (mitocondrial). Este cazul histogenelor sau
a genelor din genomul procariotelor (la care ADN-ul nu este cuplat cu
histonele si nu exista secvente repetitive de tipul intronilor). De exemplu 20
histogene cu locusuri pe cromozomii 1, 6 si 12, constituind grupe de
„pseudogene";
• Cand din ARN-ul m matur lipseste o secventa ce corespunde unui
exon in raport cu componenta exonilor din gena care a transcris ARN
premesager, apare modificare in carta de restrictie a ADNc.

196
1.1.2. Mecanisme in evolutia genelor cu structura
discontinua

Asupra originii si evolutiei genelor cu structura discontinua (in

„mozaic") s-au emis diverse ipoteze. De exemplu, Chambon (1981) si Siidhof
(1985) considera ca intronii eucariotelor ar fi relieve ale evolutiei codului
genetic. Ei considera ca intronii ar fi resturi din molecula ADN-ului repetitiv
ancestral. Acesti introni ca relieve ancestrale, prezentand in structura lor
microsecvente repetitive, se mentin non-informationali, lipsiti de mesaj
genetic, iar exonii ar fi secvente „minimale", limita capabila de determinism
genetic a sintezei unui lant polipeptidic, a unei proteine.
Datorita metodelor si tehnicilor tot mai perfectionate de studiu in
genetica, cum este metoda in care se folosesc fragmentele de restrictie, s-au
emis si alte ipoteze privitor la originea, mecanismele si evolutia genelor cu
structura discontinua la eucariote.
Avantajele metodei fragmentelor de restrictie sunt urmatoarele:
se poate stabili daca un fragment specific identificat este inrudit cu
alte secvente din genom.
prin clonare, fragmentele de restrictie pot servi ca trasori in
hibridizarea ADN-ului cu scopul identificarii secventelor repetitive.
prin folosirea sondelor exonice putem identifica prezenta unui exon si
structura diverselor gene structurale din genom.
Folosirea metodei fragmentelor de restrictie dar si a clonarii acestor
fragmente (ca sonde de identificare) au permis enuntarea unor ipoteze asupra
mecanismelor posibile in evolutia genei cu structura discontinua.
Aceste mecanisme posibile ar fi urmatoarele:
a) Evolutia genei prin duplicatia exonilor. Este mecanismul care ar
motiva existenta la eucariote a genelor cu secvente exonice repetitive. De
exemplu, gena care codifica colagenul la pasari contine un exon format din
54pb, exon care se multiplica de multe ori in componenta genei.
b) Conversia segmentelor nucleotidice este un mecanism posibil in
evolutia genei care codifica globina si care contine trei exoni si doi introni.
Un alt exemplu este gena pentru mioglobina umana care are o structura
identica cu structura a trei exoni prezenti in structura genei pentru globina.
c) Duplicatia genei si excizia intronilor. Este mecanismul care motiveaza
existenta genelor omoloage dar cu un mesaj genetic diferit. Ca exemplu,
genele pentru sinteza insulinei si anume: mamiferele si pasarile

197
detin in genom o singura gena care codifica insulina, iar rozatoarele au doua
gene.
Daca la pasare gena contine doi introni, la soarece o gena are doi
introni (la fel ca la pasari), a doua gena numai un intron. Aceasta diferentiere
in introni a geneleor pentru insulina, prezente la rozatoare, este explicata prin
excizia intronilor. Si anume se considera ca gena ancestrala pentru insulina a
avut doi introni, iar prin evolutie s-a pierdut unul la gena omoloaga.
d) La rozatoare prezenta a doua gene pentru codificarea insulinei,
care difera structural si informational ar fi cosecinta a doua mecanisme in
evolutia genei: un mecanism legat de duplicatia genei ancestrale; al doilea
mecanism, excizia unui intron la una din cele doua gene. Dupa cum se
observa prin aceste mecanisme incepe diversificarea structural-functionala
a genelor, incepe polimorfismul molecular (fig.49).
Un exemplu este gena pentru ovotransferina la pasari care cotine 17
exoni, fata de gena ancestrala presupusa ca ar fi avut 8 exoni si 7 introni.
e) Duplicatia genelor si insertia de introni. Este posibil ca prin duplicatia
unei gene, in componenta ei sa fie insertionat, un segment polinucleotidic
non-informational, corespunzator unui intron ca lungime si structura micro-
repetitiva.
f) Crossing-over inegal. Este mecanismul prin care se pot forma gene
duplicate separate de un intron non-repetitiv.

2. Caracteristicile genei in raport cu cromozomii din genom

Gena, ca unitate de structura, functie si recombinare, exprimand o

secventa polinucleotidica cu mesaj genetic din molecula ADN-ului
cromozomal, prezinta unele caracteristici in raport cu cromozomii.
Datorita heterogenitatii structural - functionale, a tipurilor de acizi
ribonucleici (ARN), se considera ca locusurile in cromozomi pot fi ocupate
de trei clase de gene:
- gene ribozomale, care transcriu sinteza ARN ribozomal sub
actiunea ARN- polimeraza;
- gene din componenta operonilor, sunt genele implicate in sinteza
si reglarea genetica a proteinelor, transcriptia catalizata de ARN-polimeraza
II;
- gene care codifica sinteza ARN transport sub actiunea ARN
polimerazei III.

198
2.1.Locusul si formele alternative ale genei prezente pe
cromozomi

La eucariote, inclusiv la om, genele au o dimensiune si ocupa o

anumita pozitie in crornozom pe care o denumim locus.
Deci locusul este spatiul si pozitia unei gene in crornozom.
In genomul celular, gena se poate prezenta sub forme alternative.
Formele alternative ale genei „salbatice" sau ancestrale le numim alele. Alela
este varianta modificata a unei gene intr-un locus dat pe crornozom.
Formele alele sunt rezultate evolutive realizate prin urmatoarele
mecanisme: mutatii punctiforme, crossing-over inegal, prin dedublarea
accidentala a unei gene sau prin dedublarea asociata cu mutatia unei gene.
Prin dedublare si mutatia genei se presupune ca mecanism in evolutia
lanturilor polipeptidice din componenta globinei din structura hemoglobinei
(Hb).
Alela, ca forma contrastanta a genei, salbatice determina exprimari
fenotipice diferit nuantate ale aceluiasi caracter in raport cu eel determinat de
gena ancestrala sau de origine.
Sunt cupluri de cromozomi omologi care au pe un locus variante
alelice. Cum genele alele, convergent, sunt implicate in definirea aceluiasi
caracter sunt numite cupluri alelomorfe. Cuplul alelomorf ocupand acelasi
locus pe cromozomii omologi, poate fi separat prin diviziimea reductionala in
meioza organismelor cu reproducere sexuata.

2.1.1. Polialelismul

In evolutia bio-genetica, o gena salbatica a suportat o succesiune de

evenimente care au determinat modificarea mesajului informational initial.
De exemplu prin mutatii punctiforme, dedublari sau recombinari intergenice
(crossing-over inegal), sumativ, ca efecte genice s-au realizat variante alele
pentru acelasi caracter, fiecare tip de alela exprimand trasaturi graduale ale
caracterului manifestat fenotipic.
Cand in locusul ocupat intitial de gena ancestrala sau „salbateca" (de
origine) gasim variante alelice, se considera polialelism sau polimorfism
alelic.
Polimorfismul alelic poate fi stabilit prin metoda cartarii genetice sau
prin metoda de restrictie genica.

199
 Prin cartarea genica se identifica situsurile unde s-au produs mutatii
genice, cu efecte secundare in modificarea caracterelor exprimate fenotipic.
Metoda permite identificarea variantelor alelice nonnale sau mutante in
constitutia genetica a individului, sau in genofondul populatiei.
Cartarea de restrcitie este metoda de identificare a seriei liniare a
situsurilor din fibrila de ADN cromozomal. Este metoda de cartare a
situsurilor de restrictie secventiala, dar nu identifica mutatiile din fibrila
ADN.
Indivizii componenti ai populatiei prezinta caracterul determinat de
gena salbatica, sau unul determinat de variantele alelice derivate din gena
salbatica, care, uneori, pot fi cu efecte „deviante" fenotipic, consecinta unui
mecanism de mutageneza genica.
Prin metoda de cartare a fragmentelor de restrictie s-a evidentiat
existenta in genom a genelor cu locusuri diferite pe cromozom, cu dimensiuni
inegale, dar care au si exoni comuni. Prezenta genelor nealelice prin locusul
ocupat, dar cu exoni comuni asigura sinteza de proteine „identice" sau
inrudite.
Se considera ca dispersia acestor gene in locusuri diferite pe
cromozom este rezultatul duplicatiei genice ca mecanism in evolutia bio-
genetica. Se considera (ca principiu al duplicatiei genice) ca prin acest proces,
o copie a genei ancestrale (de origine) a evoluat catre o mutatie cu schimbarea
locusului, in timp ce alta, a ramas la functia si locusul initial (fig-49).
In functie de numar, lungimea exonilor si intronilor din structura
genelor duplicate, se considera ca duplicatia genelor ancestrale a fost mai
putin divergenta pentru exoni si accentuat divergenta pentru introni. Aceasta
ipoteza ar fi un argument explicativ de ce exonii comuni in genele nealelice
au lungimi foarte scurte, in timp ce intronii, care le diferentiaza, au lungimi
variabile.
Genele cu exoni comuni, dar cu locusuri diferite in cromozom,
rezlutate prin duplicatii seriate si mutatii seriate plecand de la gena salbatica
(ancestrala), formeaza o gnipare numita familie multigenica sau baterie
mutligenica.
S-a mai constatat ca familia multigenica poate fi grupata pe acelasi
cromozom, sau cu locusuri pe cromozomi diferiti in genomul celulei.

200
 GENJL

Y~?
IV MUTATIS
W L€T,-
LETALA
DUBLAf?E\
GENETICAK AC CI
DEN-J \

GENE DUPLICATE

T
OMUTAT/E GENICA
NELETALA

CONTINUAREA MUTATlEi SI
SELECTIA NATUff'ALA

GENE CU OOUA FUNCTtl

OIF Eft IT E

Fig.49 Duplicatia genei in evolutia genomului.

Este posibil ca familia multigenica distribuita pe cromozomi diferiti sa
fie rezultatul unei divergente genice insotita de conversia genica .

Regruparea genelor cu exoni comuni este conditia de a mentine

sinonimia functionala a genelor cu convergenta transcriptionala in edificarea
unui caracter. Familia de gene inrudite grupate pe un cromozom, nu sunt
inrudite cu genele prezente pe acelasi cromozom dar care ocupa locusuri
diferite si codifica alte caractere exprimate fenotipic.

14
Conversia genica - inlocuirea de material de pe un situs ADN din cromatida
unui cromozom, cu material genetic de la un cromozom neomolog, dar care
ocupa aceeasi pozitie in raport cu cromozomul care a raportat conversia.
Conversia genica este sinonima cu transcriptia (Finchman - Day, 1971).

201
 Familia de gene este regrupata deoarece, prin duplicari au rezultat gene
„identice" (implicate in definirea aceluiasi caracter, dar diferite fenotipic) aliniate
in tandem.
Cand genele inrudite se gasesc cu locusul pe cromozomi neomologi, este
consecinta translocatiei genelor, a conversiei genice. Sunt mecanisme posibile in
evolutia genomului, cand, dupa duplicatia genica si separarea genelor din familia
multigenica, a avut loc o evolutie „divergenta".
Se considera ca dispunerea in tandem a unei gene cu formarea unei familii
multigenice pe un cromozom, ar fi o consecinta evolutiva a necesarului de proteina
codificata de respectiva familie, sau a unor componente transcrise, necesare in
cantitate mai mare pentru activitatea celulei, a organismului.
In genomul uman gasim multiple „baterii mutligenice" sau familii de gene,
ordonate in tandem pe fibrila ADN-ului cromozomal, implicate in determinarea
unui grup de caractere cu functionalitati sinonime sau „inrudite".
Din genomul uman putem prezenta ca exemple urmatoarele familii
multigenice:
Familiile de gene pentru histone si ARNr;
Familia de gene pentru sistemul HLA (human leucocyte antigen) localizata
in cromozomul uman 6p2105-p23. formata din: HLA- A cu 30 variante alelice,
HLA-B cu 40 variante alelice,HLA-C cu 8 vairante, HLA-D cu 12 variante si
HLA-Dr cu 10 variante alelice;
Familia de gene pentru antigenele imunoglobulinelor, localizata pe
cromozomul 14 uman reprezentata de: IgAi, IgA2, IgDj, IgE, IgGi, IgGi, IgG3, Igl
si IgM;
Familia de gene pentru IgJ, IgK, IgKC, IgKV cu localizare pe bratul „p" al
cromozomilor 21;
Familia geneleor care determina sinteza histonelor localizata pe
cromozomul 7q32 - q36, reprezentata de histonele Hi, HIA, H3 si H4 constitutiva
din 10-40 secvente repetitive, dispuse in tandem;
Familia genelor pentru globulinele p, y, 5, e localizata pe cromozomul lip
1205 -pi208;
Familia genelor pentru sistemul eritrocitar Rh respectiv gene C,D,E,
localizate pe cromozomul lp32 .

202
2.1.2. Liniaritatea genelor in cromozom

Consemnata de Morgan si Muller la Drosophila melanogaster, a fost

demonstrata de Yanovski prin mecanismul „suprimare cu acoperire".
Exemple care confirma liniaritatea genelor pe cromozomii umani sunt
multiple. Cel mai demonstrativ este exemplul legat de genele p si 5 care au
locusul pe cromozomul 11 uman. S-a observat ca prin crossing-over inegal a
rezultat o gena „hibrida" care contine un amestec de secvente nucleotidice, in
numar inegal de la gena (3 si 5.
Efectul acestui crossing-over inegal il gasim in patologia umana,
cunoscut ca sindromul Hb - Lepore varianta Hollandia care are un lant
polipeptidic combinat : 22 aminoacizi corespund mesajului din gena 5, iar 50
aminoacizi de la gena p. Este o recombinare inegala. Crossing-over inegal
realizat pe bratul „p" al cromozomului 11 uman unde, liniar, sunt ordonate
locusurile genelor s, y , y , (3 si 5. Cum genele p si 8 sunt adiacente (vecine),
in profaza meiozei reductionale s-a produs un schimb inegal de segmente
cromatidice, realizat in zona genelor p si 8. Acest mecanism demonstreaza
liniaritatea genelor in cromozomi. ( S-a demonstrat si experimental
liniaritatea genelor de catre Yanovski care a lucrat pe molecula ADN-ului de
la bacteriofagi ).

2.1.2. Linkage genie sau inlantuirea genelor in cromozomi

In genomul uman exista un numar foarte mare de gene ce detin mesaj

genetic codificat, cu implicare in mecanismele si procesele de crestere,
diferentiere si dezvoltarea organismului.
Dar fibril a de ADN este organizata si dispusa pe toata lugimea
cromozomului, formand o fibrila unica fara discontinuitati spatiale.
Cum genele sunt secvente informationale din fibrila ADN
cromozomal, care este fara discontinuitati spatiale, rezulta ca si genele sunt
linkate, sunt inlantuite intre ele, fund transmise grupat.
Conceptul de „linkage genie" este extins si la cromozomii umani,
referindu-se la genele cu locusuri foarte apropiate si la genele cu locusuri
indepartate intre ele, dar prezente pe acelasi cromozom.
Conceptul de „linkage genie" a fost elaborat inca din 1951, pe baza
studiilor familiale a sistemelor genetice eritrocitare si plasmatice, sau prin
interrelatia familiala a sistemului genetic eritrocitar cu diverse sindroame
genetice din patologia umana.

203
 In perioada 1951-1955 erau acceptate trei grupe de ^linkage genie" pe
cromozomii autozomi din genomul uman:
linkage intre genele sistemului genetic Lutheran si sistemul secretor
(Mohrl951)
linkage intre sistemul Rh si eliptocitoza stabilit de Lawler (1954);
linkage genie intre sistemul ABO si sindromul Nogel-Patella
(Renwick si Lawler (1955)).
Renwick (1966), referindu-se la genele cu locus pe acelasi cromozom,
introduce notiunea de sintenie, adica prezenta a doua sau a mai multor gene
pe un singur cromozom. Renwick considera ca doua gene pot fi in raport
sintenie (pe acelasi cromozom) dar nu si cuplate prin vecinatatea pozitiei pe
cromozom, desi genele sunt inlantuite.
Un exemplu prin care sa demonstram linkage genie este complexul de
gene care codifica sistemele genetice pentru Rh si Duffy. Sistemul Rh este
determinat de trei cupluri alelice CDE, care pot fi dominante sau recesive. In
populatie, indivizii pot fi Rh+ sau Rh", reactia antigenica pozitiva fiind
determinata, genetic de alela dominanta D (in stare homozigota DD sau
heterozigota Dd) iar reactia negativa la alela recesiva „d" in stare homozigota.
Sistemul Duffy fiind conditionat de un cuplu alelic Fya (dominanta) si
b
Fy (recesiva).
Pentru analiza linkage-ului genie se poate folosi metoda „double
-backross", in care un genitor sa fie dublu heterozigot Dd / Fya Fy , iar celalalt
genitor dublu homozigot receziv (dd / Fy Fy ), urmand a se observa exprimarea
fenotipica a celor doua caractere in filiatia familiala. Analizandu-se
caracterele determinate de doua cupluri de gene nealelice D si Fy la
descendenti stabilim genele primite de un copil, de cuplul parental heterozigot,
iar in cazul nostru caracterele sunt pentru Rh si Duffy (fig.50).

204
 F b

d d

f u
,

50% Rh* si 60% Rh- si

Duffy pozitiv Duffy negativ

Fig. 50 Raport de segregare 1:1.

Linkage-ul genie al genelor CDE si Duffy (+ si -) pe cromozomul n°l
urnan .

Genele celor doua sisteme genetice inlantuite au locusurile pe bratul

„q" al cromozomului 1 uman.
Daca locusurile genelor pentru Rh si Duffy nu s-ar fi gasit pe acelasi
cromozom, inlantuite teoretic, ar fi trebuit ca descendentii sa prezinte patru
genotipuri diferite si tot atatea asocieri fenotipice a respectivelor caractere:
VA Dd / Fya Fyb; % DD Fyb Fyb; % dd Fya Fyb; % dd Fyb Fyb, adica un raport
de segregare de 1:1:1:1, ceea ce ar fi insemnat ca genele sa fie neinlantuite si
sa se combine aleatoriu, conform configuratie „cis" sau „trans". Dar raportul
de segregare fund de 1:1, se confirma ca cele doua cupluri de gene pentru
doua caractere diferite, au locusuri diferite pe acelasi cromozom si se transmit
grupat.
J. Thomson si M.Thomson (1986) au elaborat un rationament si calcul
pentru a stabili linkage-ul genie si anume:

205
 Sunt cazuri cand raportul de segregare a genelor inlantuite nu exprima
un „linkage echilibrat".Apar raporturi de segregare ca abateri de la legile
mendeliene cu un linkage genie neechilibrat.
Aceste abateri, care determina un dezechilibru in frecventa genelor
legate intre ele (inlantuite) sunt rezultatul unor mecanisme in evolutia
genomului, de dinamica unei populatii, sau posibilitatea reproducerii
indivizilor din populatii diferite.
Ca mecanisme si factori implicati in nerespectarea segregarii intre
genele inlantuite cu locusuri pe acelasi cromozom, mentionam:
Aparitia de neomutatii in populatie la nivelul genelor analizate si
exprimate fenotipic.
Remanierile cromozomale ca: inversiile, duplicatia, deflcienta etc.,
care modifica raporturile si pozitia genelor pe cromozomii omologi;
Prezenta combinatiilor alelice cu frecvente variabile (crescute sau
reduse) in populatie, pot fi si rezultatul unor selectii naturale favorabile sau
nefavorabile;
Prin amestecul a doua populatii cu frecvente diferite a cuplurilor
alelice inlantuite, cand numarul de generatii care au succedat din momentul
amestecului a fost mic si insuficient pentru realizarea combinatiilor alelice in
populatia devenita heterogena genetic.
In concluzie se poate spune ca intr-o populatie panmictica, naturala, in
absenta crossing-over-ului cromozomilor omologi, in absenta remanierilor
cromozomale, sau absenta neomutatiilor, caracterele controlate de cupluri
alelice diferite dar inlantuite, cu locusi diferiti pe cromozomi omologi, prin
segregare si transmitere la descendenti, raportul de segregare, este asemanator
monohibridarii (analiza unui singur cuplu alelic).
In exemplul mentionat, fiind cazul a doua cupluri de gene nealelice
pentru doua caractere diferite daca aceste cupluri n-ar fi inlantuite, atunci am
fi avut un raport de segregare de 9/16; 3/16, 3/16; 1/16, care ar fi corespuns
dihibridarii. Dar s-a demonstrat ca raportul de segregare a doua cupluri
nealelice, inlantuite pe acelasi cromozom este XA: XA (50 : 50) in loc de V*\ lA;
l
A; lA.

206
2.1.3. Crossing-over-ul
O alta particularitate a genelor in raport cu cromozomul pe care an
locusul, este crossing-over-ul (fig. 51).
Crossing-over-ul este schimbul de segmente cromatidice intre
cromozomii omologi in profaza primara a diviziunii reductionale, in meioza.
Este mecanismul fiziologic de recombinare intre cromatidele
cromozomilor omologi.
Prin crossing-over se constituie noi constelatii genice de dubla origine
- materna si paterna pe acelasi cromozom.(Procesul va fi dezvoltat la
variabilitate, vol. II)

207
 entromer

Doi cromozom't omologi treclnd

prin sinopsa In meioza pent i 2
cro
Fiecare cromozom duplicat

1
pentru a
forma

ma tide

diviziune
meiotica

C e n t r o m e r e .duplicate a doua
diviaiune meiotica urmata

Cro sing over Intre

o pereche de
cro ma tide

P a t r u gameti hapIoi21 format!,aici 2 cross.over si doi noneross.over

gameti
Fig. 51 Interpretarea teoretica a crossing-overului.

208
2.1.4. Tipuri de gene in genomul eucariotelor

Luand in consideratie rezultatele obtinute din „Proiectul Genomului

Uman" (inceput in 1980 si reorganizat), se estimeaza ca in genomul uman s-
ar gasi in jur de 35000 - 40000 gene functionale, in care sunt inscrise mesaje
genetice.
In raport de functie, activitate si dispunerea in genom, precum si in
raport de enzima care catalizeaza transcrierea mesajului in molecula de ARN,
distingem clase, familii si superfamilii de gene.

a) Clasa genelor complexe.

Sunt genele implicate in sinteza si reglarea sintezei de proteine in celulele
eucariotelor. Genele din clasa complexa sunt prezente si active in genomul
fiecarei celule din structura organismului, unde indeplinesc functii esentiale
pentru viata celulelor sau sunt implicate in procesele de citodiferentiere a
unor celule cu structura si functii strict specifice. Conform criteriului de
prezenta si functie in genom, aceasta clasa se subdivide in:
Gene comune sau domestice al caror numar reprezinta 1/5 din totalul
genelor informational active din genom, adica aproximativ 7000 gene, daca
raportam cifra la numarul genelor de 35000 si peste 90% sin genele care
codifica in orice tip de celula (Covic Sefanescu Sandovici, 2004). De regula
sunt catalizate pentru transcriere de ARN polimeraza II. Genele comune sau
domestice alcatuiesc complexul de gene din componenta operonilor (gena
reglatoare promotor, operator, gene structurale). Sunt numite si gene clasa a
Il-a.
Gene specifice, sunt considerate genele care sunt implicate in
citodiferentierea unor celule specifice ca structura si functii, de exemplu
neuronul, muscularul, etc. Pot fi considerate gene specifice , pot fi considerate
si gene supresoare, implicate in „cresterea tumorala". Aceste gene supresoare,
pin produsul transcris si translat - proteina „supresoare" au actiune blocanta
asupra dezvoltarii celulelor canceroase.

Genele din clasa complexa se gasesc in genomul celular in copie unica sau
duplicate.
Gene in copie unica. Genele in copie unica prezente in genomul
celulei se prezinta in cuplu alelic in raport de cuplul cromozomilor omologi
din celula somatica diploida. Se estimeaza ca gena unica are capacitatea sa-si
decodifice mesajul inscris in structura sa aperiodica, intr-o molecula de
ARNm. Gena unica poate sintetiza 104 molecule ARNm, care trecute in

209
citoplasma dupa sinteza sa asigure 10 lanturi polipeptidice identice (Israil,
2000, pg 92).
Gene duplicate. In cursul evolutiei biogenetice a eucariotelor, unele
gene in copie unica s-au duplicat. Prin duplicatie se obtin pseudoenele. Gena
duplicata - pseudogena - este cvasifunctionala in transcrierea mesajului
genetic inscris in structura sa. Genele duplicate se pot stabiliza si functiona
prin selectia genica. Ca exemplu de gene duplicate si devenite functionale
sunt genele unice duplicate care, in prezent, formeaza o familie ce codifica
lanturile polipeptidice din structura globine din Hb. In aceasta familie, este
gena duplicata 0 care codifica sinteza unui lant polipeptidic din clasa p-
globinei.

b) Familii si superfamilii de gene in genomul eucariotelor.

Este clasa de gene care grupeaza genele prezente intr-un numar inalt
de copii in genomul celulei.
Copiile genice pot fi grupate cu dispunere in tandem in cromozom,
formand o familie sau superfamilie de gene, sau copiile genei sunt dispersate
pe diversi cromozomi neomologi din genomul celulei.
Familia genelor ARNr . Este o familie numeroasa, reprezentata de
aproximativ 150- 200 gene. Genele din aceasta familie se gasesc dispuse in
tandem pe bratele scurte (p) ale cromozomilor acrocentrici, in zona
organizatorilor nucleolari. Transcrierea mesajului in moleculele ARNr este
catalizata de enzima ARN- polimeraza I. Sunt geneticieni care desemneaza a
fi o familie de gene clasa I, dupa criteriul enzimei ARN-azei I.
Familia genelor ARNt. Genele acestei familii au secvente nucleotidice
mici, iar transcrierea in ARNt este catalizata de enzima ARN polimeraza III.
Majoritatea genelor ARNt sunt dispuse dispersat sau in tandem, cu localizare
pe cromozomii 1 si 6. Se apreciaza ca aceasta familie ar fi reprezentata de cca
1300 gene.
Superfamilia genelor pentru histone. Datorita numarului foarte mare
si cu o structura aproape identica, genele care controleaza, genetic, sinteza,
histonele alcatuiesc o superfamilie. Genele din componenta acestei familii pot
fi dispuse in tandem sau dispersate pe cromozomi neomologi.
Superfamilia genelor HLA - Genele HLA care formeaza complexul
major de histocomatibilitate (MHC) sunt localizate pe bratul scurt (p) al
cromozomului 6 din genomul uman. Superfamilia HLA, ocupand mai multe
locusuri unde se grupeaza gene diferite, se divide in patru familii de gene
HLA-A, HLA-B, HLA-C si HLA-D. La randul lor, aceste familii se grupeaza
in trei clase:

210
 o Clasa I grupeaza genele HLA-A, HLA-B si HLA-C. De exemplu
genele HLA-A sunt reprezentate de 15 alele diferite notate de la Al la A15;
genele HLA-B de 20 alele diferite, iar genele HLA-C prezinta 5 alele
diferite.
o Clasa II este reprezentata de familiile de gene de tip HLA-D si
HLA-Dr. Genele de tip HLA-D sunt reprezentate de 6 alele diferite.
o Clasa III, contine genele pentru componentele complementului C2,
C4 si proactivatorii C3.
Superfamilia imunoglobulinelor este divizata in cinci familii de gene,
distincte prin specificitatea unor determinanti antigenici, desi ca structura
genele prezinta unele asemanari. Superfamilia imunoglobulinelor contine
familiile : IgA, IgD, IgE, IgG, IgM.
Fiecare familie de Ig este reprezentata de un multiplu de gene diferite.
Organismul uman are un potential genetic de a sintetiza 108 - 1010 tipuri
diferite de anticorpi.
Aceasta capacitate de sinteza a fost evidentiata de existena a trei clase
de gene care codiflca lanturile polipeptide din structura anticorpilor, notate cu
H pentru catenele, /x, y, 5, a, e, cu K si y pentru catenele L.
Fiecare familie este impartita in sub familii. De exemplu familia G,
prezinta sub familiile IgGi, IgG2,IgG3 si IgC4, iar familia genelor pentru IgA
are doua sub familii IgAi si IgA2, etc..
Genele superfamiliei imunoglobulinelor pot fi grupate cu dispunere in
tandem, sau sunt disperate pe cromozomi diferiti.

c) Transpozonii si retrotranspozonii
Reprezinta o clasa foarte importanta prin efectul dezorganizant al
activitatii genomului, dar mai ales prin numarul lor in genomul celular. Din
datele publicate de I.HG.S.C (2001), se apreciaza ca aproximativ 45% din
totalul secventelor repetitive sunt rezultate din transpozoni si
retrotranspozoni.

Transpozonii, sau genele mobile au fost descoperiti de Birnstiel si confirmati

de catre MC. Clintock (1950 - Premiul Nobel in 1983). Prezenta lor in
genomul uman este numeric redusa. In genomul uman s-au identificat
urmatoarele familii de transpozomii: LINES, SINES, Alu si elemente
asemanatoare retrovirusurilor (transpozoni fosili).

211
Retrotranspozonii - sunt secvente nucleotidice transpozate prin intermediul
ARN-ului.
Transpozitia transpozonilor in retrotranspozoni se face sub actiunea
transcriptazei inverse. Exemple de retrotranspozoni sunt familia LINES 1 si
familia Alu.

3.1 nsusi rile si functiile genelor

Genele, in doza unica, sau grupate in clase, familii si superfamilii, au

insusiri particulare indeplinind functii „precise" in mecanismele materializarii
informatiei genetice pe care o detin, finalizand prezenta unor trasaturi de
caracter in fenotipul individului.

3.1. Variatii in expresia genelor

O gena, normala sau mutanta, prezenta in genomul celulei nu-si

exercita intotdeauna capacitatea de a-si exprima mesajul printr-un caracter
fenotipic, sau cand il exprima, caracterul poate avea grade variabile de
manifestare.
Aceste particularitati sunt cunoscute sub denumirea de penetranta si
expresivitatea genelor.
a) Penetranta este capacitatea unei gene de a se exprima, de a induce un
caracter
exprimat fenotipic. Este frecventa unei gene dominanta sau recesiva,
normala sau mutanta de a induce un caracter in fenotipul individului.
Fenomenul de penetranta este bine observat la cuplurile gemelare
univiteline (monozigoti), prin analiza caracterului pe filiatie directa sau in
izolatele umane.
Cand un caracter are un coeficient de exprimare sub valoarea de
100% se considera penetranta redusa sau variabila (incompleta).
Varianta este conceptul „totul sau nimic".
Cand gena dominanta este prezenta in doza unica (heterozigot) sau
doza dubla (homozigot) iar gena recesiva in doza dubla (cuplu alelic

212
homozigot), caracterul (determinat genetic) este exprimat, considerandu-se
penetranta completa1 .
In general penetranta completa este caracteristica genelor dominante.
Exceptie de la aceasta regula este procesul de epistazie, cand gena dominata, desi
prezenta in genomul celulei, este non-functionala, cauzata de o gena recesiva
nealelica, dar cu implicatii convergente in definirea aceluiasi caracter.
Penetranta cu expresivitate completa sau incompleta, ar fi expresia
constitutiei genotipului individului, precum si a relatiilor intergenice, intre gene
nealelice.
Kelly (1980) considera ca penetranta incompleta ar fi rezultatul
interactiunii mai multor alele mutante cu locusuri pe acelasi cromozom, sau pe
cromozomi diferiti, fara o conditie „speciala" a mediului ambiant. Penetranta
incompleta poate fi comparata partial, cu fenomenul de epistazie, proces
caracteristic pentru exprimari fenotipice controlate de alele recesive.

b) Expresivitatea reprezinta gradul de expresie fenotipica a unui caracter, forma

care poate fi moderata, usoara sau severa. Este manifestarea nuantata fenotipic,
calitativ sau cantitativ a aceluiasi caracter la indivizii din grupul familial sau la
indivizii conspecifici. Expresivitatea, ca termen altemativ, este „rata de
manifestare" a unui caracter.
Notiunile de „penetranta incompleta" si „expresivitate variabila", ajuta sa
intelegem mecanismele si factorii care influenteaza expresivitatea, sa intelegem
manifestarea graduala a unui caracter la indivizii din populatia umana.
Manifestarea graduala, cantitativ sau xalitativ, a unui caracter
(expresivitatea variabila) este conditionata de mai multi factori:
natura biochimica si raportul dintre genele alelomorfe, de polialelie, de
raportul cuplurilor alelomorfe cu factorii de mediu (poligenia de exemplu).
Exemple de expresivitate variabila sau incompleta la om pot fi:
manifestarea particulara a hexodactiliei la nivelul membrelor, a etrodactiliei (cand
de la o „simpla" sindactilie, se poate ajunge pana la reducerea numarului degetelor
palmo-plantare).

5
Heterozigotii care au gena dominanta in doza unica, aceasta isi exercita
functia de determinism genetic. Homozigotii - cu un cuplu alelic dominant
sau recesiv, ca urmare genele activeaza in doza dubla.

213
 Expresivitatea caracterului depinde de genotipul individului de
factorii endogeni si exogeni, sau de raportul combinatiei cuplurilor de gene
nealelice, implicate in definirea caracterului. Deasemenea expresivitatea
caracterului este conditionat de constitutia genetica corelata, interferential, cu
factorii de mediu.
Penetranta si expresivitatea variabila, particulara diverselor familii, ar
fi consecinta diverselor mutatii.

3.2. Functia heterocatalitica a genelor

Este functia genelor implicate genetic in sinteza proteinelor,

cunoscandu-se ca molecula proteica este etapa primara in definirea fenotipica
a caracterului.
In raport cu rolul exercitat in functia heterocatalitica, genele pot fi:
a) Gena promoter - este necesara pentru initierea transcriptiei informatiei
genetice. Situsul genei promotor precede locusul genei care initiaza
transcriptia informatiei genetice in „structuri" specifice de ARNm, catalizat
procesul de ARN-polimeraza. La eucariote, promotorul care
interconditioneaza cu ARN-polimeraza II ar prezenta secventele consens 5'-
TATA-3' si 5'-CCAAT-3\ care s-ar repeta (Barsh si Eptein (1989)). Dupa
Jones (1987) si Lee (1987), secventa 5'-TATA-3' s-ar repeta aproximativ 750
de ori, ajungandu-se la un numar de cca 3000 pb, iar secventa de 5'-CCAAT-
3', prin repetabilitate, ar contine cca. 80-100 pb. Sunt secventele care preced
locusul de start a genelor implicate in transcrierea ARNm
b) Gena operator - este secventa de nucleotide care are locusul dupa
pozitia genei promotor. Are rolul de a regla activitatea genelor structurale,
putandu-se cupla sau decupla de proteina represor determinata genetic de
gena reglator. Dimensiunea se apreciaza la aproximativ 30 pb.
c) Genele structurale - urmeaza ca locusurile genei operator. Detin
mesaje genetice a caror informatii sunt transcrise moleculelor de ARNn,
ARM si ARNr.
d) Gena reglator - este gena care actioneaza indirect asupra genei
operator din componenta operonului. Ea actioneaza prin intermediul unei
proteine pe care a determinat-o genetic, denumita represor. Are locusul pe
acelasi cromozom cu operonul, sau pe cromozomi diferiti. ( A se vedea
sinteza proteinelor)

214
e) Genele mutante . Modificarea structurii unei gene eveniment rar, este
transmisa generatiilor celulare care succed prin mitoza (mutatii in celulele
somatice), sau este transmisa pe generatii familiale sau in populatie daca
modificarea genei s-a produs in celulele gametice.

Gena mutanta poate fi: o gena structurala, operatoare, promotor, sau

gena reglator.
Consecintele pot fi urmatoarele:
mutatia genei structurale deregleaza sinteza proteinelor (enzimelor),
obtinandu-se molecule cu calitati structural-functionale anormale. In functie
de rolul proteinelor (inductori morfogenetici-explicam etiologia genetica a
malformatiilor), implicarea in infrastructura celulelor, tesuturilor, morfo si
histodisplazii, in componenta enzimelor - dismetabolii, etc.) in organism apar
dereglari in activitatea celulelor, a organismului, sau absenta unor activitati
genice, a caror functie poate fi esentiala pentru integritatea structural-
functionala, esentiale pentru individ;
mutatia genelor reglator, promotor sau operator, induce: sistarea
sintezei de proteine, dereglarea homeostaziei moleculare si functionale a
organismului.
Genele mutante, ca unitati genomice „functionale", au rol etiologic in
majoritatea bolilor cu determinism genetic in familie, in populatie.
Mutatiile genice sunt „responsabile", in anumite limite, de
mecanismele implicate in evolutia bio-genetica a fiintelor vii.

3.3. Activitatea genelor in raport cu perioadele

ontogenetice

Zigotul, rezultat din procesul de fecundatie intre spermie si ovula,

contine intregul potential genetic, in care sunt inscrise, codificat, mesajele
necesare pentru definirea integrala a viitorului individ, ca imitate biologica in
populatie.
Odata constituit zigotul, genele din genomul viitorului organism, nu-si
incep activitatea de determinism genetic, in acelasi moment ontogenetic, cu
implicare in cresterea, diferentierea, dezvoltarea, regenerarea fiziologica, in
general, in toate functiile care, genetic, asigura integritatea structural-
functionala a organismului pe parcursul vietii sale.

215
 Studiile cronogenetice16 au consemnat ca dupa fecundare si
consituirea genotipului zigotic, unele cupluri alelice devin „active",
exercitandu-si functia de determinism genetic, altele isi mentin starea de
„inactivitate", sunt aparent active, sau isi exercita functia strict in anumite
perioade ontogenetice.
Sunt indivizi heterozigoti la care o alela se comporta ca gena
„dominanta" in copilarie si „recesiva" la maturitate in timp ce alela omoloaga
este inactiva in copilarie, dar functionala la maturitate (probabil mecanismelor
de pleiotropie genica, sau un mecanism special de epistazie).
Ca exemplu este cazul unor indivizi care in copilarie au parul blond
sau roscat, iar spre maturitae culoarea parului devine bruneta sau castanie.
Un exemplu care convige despre activitatea genomului pe perioade
ontogenetice, (cand acelasi caracter, etapizat, exprimat diferential fenotipic)
este sistemul genetic eritrocitar al hemoglobinelor umane (Kleihaner, 1970;
Brimhall, 1974, s.a.). In structura hemoglobinei (componenta proteica-
globina) normal, apar cinci tipuri de lanturi polipeptidice, diferite intre ele
prin numarul si ordinea aminoacizilor, sintetizate pe perioade ontogenetice
ale omului. Aceste lanturi polipeptidice sunt notate simbolic : epsilon (e),
alfa(a) , gama(y), beta((3) si delta(8). Structura primara a fiecarui lant
polipeptidic este determinata genetic de genele structurale s, a, y, p si 5.
Ontogenetic, in mod normal, omul prezinta mai multe tipuri de
hemoglobine (tabel IX)

Perioada
Embrionara Gower I - e4
Gower II - 0:2 £2
Fetala Fetala - 01272
Adult A l - (x2p2

A2 - a252

16
Cronogenetica - se ocupa cu dimensiunea temporala a genei. Fiecare gena
are 0 incarcatura calitativa si cantitativa determinata in timp biologic ereditar
al individului (activitate pe perioade ontogenetice).

216
 Tipul de hemoglobina prezenta pe perioade ontogenetice este in raport
cu activitatea cronogenetica a familiei genelor care determina acest caracter:
gene active, gene latente, gene inactive.
Analiza cronogenetica a aparatului genetic care determina
hemoglobinele, este urmatoarea: in primele luni ale embriogenezei se
sintetizeaza hemoglobina Gower I si apoi Gower II. Spre sfarsitul lunii a treia
de sarcina, hemoglobinele embrionare incep a fi inlocuite de hemoglobina
fetala (HbF), hemoglobina care va domina perioada fetala a dezvoltarii
intrauterine a produsului de conceptie.
La nastere HbF reprezinta 70-80% din totalul Hb al nou-nascutului,
deoarece, inca din luna a cincea a perioadei fetale incepe a se sintetiza HbAi,
care la nastere o gasim in concentratie de 20-30%. HbF scade rapid, incat
dupa primul an de viata postnatala o gasim in concentratie de 1-2%, fiind
inlocuita cu HbA]. Spre maturitatea biologica a individului, HbAi este
inlocuita cu HbA2.

217
CAPITOLUL V
SINTEZA SI REGLAREA GENETICA A SINTEZEI
PROTEINELOR

Sinteza proteinelor cu structura si functii specifice este activitatea

fundamentala a fiecarei celule din organism.
Sinteza proteinelor, reglata de fluxul informatiei genetice, este
programata genetic, este inscrisa in structura aperiodica a ADN-ului si
decodoficata de moleculele de ARN (acizii ribonucleic!), (fig. 52, fig. 53).

NUCLEUACITOPLASMA
V

^ unitoieo 30S

unitcteoBOS

ribozo?r.i

©mtroni

TRANSCRIPTIA

^Ank', 7RAN5CI ^ADN ARNp'm

MATURAREA ARN m
TRANSFORMER* proielne

Fig. 52 Schema generala a sintezei proteice la eucariote (dupa Robert, 1983)

218
 Fig 53 STRUCTURA SI SINTE-ZA ARN-ului

Compus ARN sintetizat de

din
ADN

Pnr:
initial este
TRANSCRIPTIA

MONOCATENAR
nu este folosita o are loc pe
catena

CATENA
CATENA NON- MATRITA
TIPAR

catalizator

ARN-POLIMERAZA

se leagS
sinteza

SFAR§ITUL
cornplementantate
31 AL RIBOZEJ
! DIRECTIA 5'-
3'
A=U
G=C
principal! sintezei

COMPLEME
N-
TARITATEA
BAZELOR
1. Acizii ribonucleic/ (ARN)

Structure fundamentals a ARN este aceeasi cu cea descrisa la ADN,

exceptand urmatoarele diferente:
- componenta glucidica din nucleotidele ARN-ului este riboza,
pentoza care asigura polaritate moleculei de ARN;
- baza pirimidinica, timina, prezenta in structura ADN-ului, in
structura ARN-ului este inlocuita cu uracilul;
- ribonucleotidele din molecula ARN-ului contin ademina (A),
guamina (G) - ca baze puternice si citozina (C), uracilul (U) - ca baze
pirimidinice;
- cu exceptia unor virusuri la care molecula de ARN este dublu
catenara, la eucarite si procariote dupa decodificarea mesajului genetic si
sinteza la nivelul ADN-ului cromozomial sau mitocondrial, molecula ARN-
ului este monocatenara. Monocatena ARN-ului este complementary cu
segmental polinucleotidic decodificat din ADN;
- masa moleculara a ARN-ului mai mica si lungimea monocatenei
mult redusa in raport cu molecula dublu catenara a ADN-ului. Lungimea
moleculei de ARN corespunde cu numarului de nucleotide decodificate din
ADN, respectiv de dimensiunea genei decodificate.
Acizii ribonucleici se caracterizeaza printr-o accentuata heterogenitate
structurala si functionala in activitatea celulei. Fiecare tip de ARN exercita
functii „precise" in sinteza proteinelor celulare.
Acizii ribonucleici sunt moleculele care, dupa decodificarea ADN-
ului si sinteza, tree in citoplasma celulei.
In celula eucariotelor distingem trei tipuri de acizi ribonucleici: ARNm
(mesager), ARN,- (ribozom) si ARNt (transport). Aceste tipuri de ARN difera
intre ele prin gradul de polimerizare, masa moleculara si structura moleculei.
Sinteza ARNm este conditional de situsul promotor care initiaza
transcriptia. Dupa sinteza, ARN-ulm este implicat in mecanismele de translate.
Moleculele de ARN,- si ARNt sunt transcrise de matrite genice ale
ADN-ului, si nu prin mecanisme de translate a moleculei de ARNm.

220
1.1. ARN-ul mesager (ARNm)

Molecula de ARNm este monocatenara, are o masa moleculara

variabila (in functie de dimensiunea genei care a fost decodificata), are
capacitatea de reinnoire rapida. Se caracterizeaza printr-o mare instabilitate
metabolica. Durata de supravietuire a unei molecule variaza intre 3' - 5' la
procariote si de cateva ore la eucariote.
Folosindu-se uridina tritiata (marcare cu tritium) s-a costatat ca ARNm
se sintetizeaza in zonele eucromatice ale cromozomului, respectiv in zonele
unde nu este ADN repetitiv. Zonele eucromatice corespund ADN-ului
nerepetitiv.
Cantitatea de ARNm in celula este de aproximativ 5% din totalul
ARN-ului celular.
Prin decodificarea matritei din ADN, ARNm va inregistra si transcrie
mesajul genetic care, prin translatie, va fi inscris in sinteza si structura unei
proteine specifice.

1.2. ARN-ul ribozomal (ARNr)

Prezent in celula in cantitate de 75 - 85% din totalul ARN-ului celular.

II gasim in componenta ribozomilor si/sau mitocondriilor citoplasmatice.
ARN, este heterogen. Hetrogenitatea s-a stabilit in raport de masa
moleculara si constanta de sedimentare (unitati Svedberg).
Ribozomii, ca organite citoplasmatice, descrTselle G. E. Palade, sunt
formati din doua subunitati inegale, diferentiate prin constanta de sedimentare
(S) de 60 S si 40 S.
In absenta ARN-ului, cele doua subunitati sunt disociate si liber
dispersate in citoplasma. In prezenta ARNm cele doua subunitati se cupleaza,
formand ribozomul, declansand procesele de translatie si sinteza proteinelor.
Fiecare subunitate constituie complexul ARN, si proteine, complex
denumit de Tibaldi unitatea functionala a cromozomului.
In subunitatea 40 S, gasim molecula ARN, cu constanta de
sedimentare 18 S si 33 molecule de proteine ribozomale. In subunitatea 60 S
sunt molecule ARNr cu constanta de sedimentare 5,86S, 28S si 5S.
Moleculele ARN,- 28S, 5,86S si 5S au regiuni helicale scurte, prin
cuplarea complementara a bazelor azotate din structura.

221
 ARNr se sintetizeaza la nivelul bratelor scurte (p) a cromozomilor
acrocentric! (13, 14, 15, 21, 22). Sylvester (1986), studiind structura si
organizarea complexelor repetitive la nivelul cromozomilor acrocentrici,
apreciaza la 200 - 300 gene reale si aproximativ 200 pseudogene sunt
implicate in sinteza ARNr 5S. In prezent se estimeaza un numar de cateva
sute si chiar mii de copii care asigura transcrierea ARNr.
Brajele scurte ale acrocentricilor, locul de sinteza a ARNr, sunt
cunoscute si sub denumirea de „organizatori nucleari".
Greutatea moleculara a subunitatilor ribozomale este de aproximativ
1,6 milioane daltoni pentru subunitatea 60 S si de 900.000 d pentru
subunitatea 40 S.
Moleculele de ARNr asigura cuplarea ribozomului cu ARNm si
acceptarea ARNt. ARNr are un dublu rol: structural si catalitic (in formarea
lantului polipeptidic prin legaturi peptidice).

1.3. ARN-ul de transport (ARNt)

Este un ARNt adaptator, care descifreaza mesajul genetic decodificat

de ARNm din ADN, pozitionand si ordonand aminoacizii. Are rolul de
transport al aminoacizilor, activati in prealabil, spre locul de asamblare si
formarea polipeptidelor care se sintetizeaza la nivelul ribozomilor.
ARNt este un micropolimer continand intre 75 - 100 ribonucleotide.
In 1971, Attardi si col. au estimat, experimental, existenta a 1310
gene in genomul uman care codifica moleculele de ARNt. Gavrila (2004)
mentioneaza ca prin metoda draft, care analizeaza secventierea genomului
uman, s-au identificat numai 497 gene care ar codifica ARNt.
Sinteza sa are loc la nivelul ADN-ului cromozomial sau mitocondrial.
Initial este monocatenar, dar, prin autocomplementaritate, va prezenta o
structura secundara secvential dublu catenara si o structura tertiara in trefla.
ARNt prezinta doua situsuri, sau polaritati functionale:
la extremitatea 3'-OH este un brat liber lung, continand o secventa
de trei nucleotide cu bazele CCA (in ordinea proximala -> distala). Adenina
terminala de la bratul liber lung se va cupla cu aminoacidul pe care-1 va
transporta. Prin cuplarea aminoacidului (forma activata a aminoacidului) de
segmentul 3'-OH CCA, ARNt il va vehicula spre ribozom, locul de sinteza a
proteinei;

222
 a doua polaritate functionala (situs) este bucla prezenta in partea
opusa a extremitatii 3'-OH. In bucla exista o secventa de trei nucleotide cu rol
de anticodon. Anticodonul este complementar cu codonul din ARNm unde va
pozitiona aminoacidul.
La molecula ARNt, ca structure terfiara, gasim:
un brat liber scurt care contine nucleotide cu guanina. Este
bratul5' OH fosfosilat;
bucla B care se ataseaza de suprafata ribozomului;
bucla C care se cupleaza cu aminoacid-sintetaza.
Molecula ARNt are masa moleculara ce variaza intre 23000 - 30000
daltoni.
Daca luam in consideratie ca pentru cei 20 aminoacizi sunt 61 triplete
(codoni) cu sens, in celula ar trebui sa identificam existenta a 61 tipui de
molecule ARNt. O molecula de ARNt se deosebeste de celelalte molecule
ARNt prin anticodonul din bucla centrala. Fiecare tip de ARNt are un anume
anticodon pentru un anume aminoacid. In prezent s-au identidficat 40 tipuri
de molecule ARNt. Cum sunt unii aminoacizi recunoscuti de mai multi
anticodoni, se poate considera existenta unei redundante informationale pentru
ARNt. Aceasta redundanta asigura sinteza rapida si „corecta" a proteinelor in
celule.

1.4. ARN-ul interference (i-ARN)

In 2004, Goldman a descoperit existenta unui tip de ARN: s i ARN

(small interferig ARN). Este un ARN cu molecula foarte mica, cu un numar
de cca. 22 nucleotide. Aceasta molecula este considerate un micro interferig
ARN (m i ARN).
Moleculele de pre-mi-ARN sunt procesate de diferiti membri din
familia ribonucleazelor clasa III.
Moleculele mi-ARN ar avea functia de interferenta cu ARNm, dar
unele molecule ar fi implicate in blocarea transcriptiei si fonnarii
heterocromatinei.
Molecula de i-ARN inhiba transcriptia, dar este §i components
integranta in mecanismul de reglare fina in expresia genelor din celulele
normale.
De asemenea, si-ARN serveste ca molecula tinta pentru
medicamentele si agentii terapeutici.
Un alt aspect important este ca i-ARN poate fi folosit in sinteza
insulinei de catre celulele P - pancreatice (M. Stoffel, 2004).

223
 Sunt cercetari efectuate de Hung - Shih (2004) care au evidentiat rolul
mi-ARN in reglarea unor gene implicate in procesul dezvoltarii organismului.
De exemplu, tintele actiunii mi-ARN sunt implicate si in semnalizarea si
cresterea celulara, fiind considerat un factor de transcriptie.
Sunt cercetatori care considera ca i-ARN poate fi foiosit, secvential,
pe un set de gene cu expresie alterata, pentru a identifica eventualele erori in
cazul represiei acestora.
De asemenea, i-ARN permite studiul schimbarilor in expresia uneia
sau mai multor gene. De exemplu, W. Pardrige (2004) a obtinut rezultate
remarcabile in studiul tumorilor cerebrale. Pardridge, impreuna cu
colaboratorii, lanseaza ipoteza ca i-ARN ar putea fi foiosit in terapia genica
asupra unor celule mutante. De exemplu gena EGFR normala sau care a
suferit mutatii. Este gena care determina sinteza receptorului factorului de
crestere epidermic (EGFR) in tumorile cerebrale maligne.

2. Participarea moleculelor ARN la sinteza proteinelor

Materializarea mesajelor genetice, inscrise in structura ADN

(cromozomial sau mitocondrial), respecta fluxul unidirectional si universal al
informatiei genetice, conform teoriei semantice cu respectarea dogmei
centrale a geneticii (fig. 54).
R<.l>ltc,irc TnimcnpUc
\
H ADN h—------------—♦! ARN"
>
ADN - -
pulimet;j/a

fV.'S-, 1|..1!I>U

Fig.54 Dogma centrala a fluxului informatiei genetice.

(Revizuita dupa Diane K. Lavett, 1997).

224
2.1. Fluxul informatiei genetice

Biologia moleculara a permis descifrarea mecanismelor genetice care

stau la baza formarii caracterelor exprimate fenotipic.
Fiecare caracter, morfologic sau molecular, manifestat la indivizi in
populatie, reprezinta „ultimul lant" din seria etapelor biochimice controlate
ontogenetic si filogenetic.
Marea majoritate a caracterelor sunt determinate de gene inscrise,
codificat, in structura ADN-ului celular. Intre informatia genetica, ca
program, si forma finala de exprimare a caracterului se interpun o serie de
etape obligatorii (fig. 55).

ADN
CONTROLUL TRANSCRIPTIEI
ARN-PREMESAGER
PROCESARE CONTROLUL PROCESULUI
AKNpm

ARN-m-MATUR
CONTROLUL TRANSPORTULUI
CONTROLUL ARN-m
DEGRADAT TRANSPORTUL
IN CITOPLASMA

ARN-m INACTIV CONTROLUL TRANSLATIEI

PROTEINA

CONTROLUL DEGRAD ARIIPROTEINEI

PROTEINA
DEGRADAT A]

Fig. 55 Fluxul informatiei genetice la eucariote (Schema Generala)

Elementele si etapele care preced si definesc caracterele ereditare au

urmatoarea ordonare:
- Prima etapa. Este genomul de la care se initiaza fluxul informatiei
genetice.
Genomul este un stoc de informatii biologice, existente in structurile
moleculelor ADN-ului cromozomial sau mitocondrial. Pentru a putea fi
utilizate informatiile biologice, este necesara activitatea coordonata a unor
enzime si proteine, implicate intr-o succesiune complexa de reactii
biochimice denumite expresia genomului. In cadrul acestui complex de

225
reactii biochimice se realizeaza transferul mesajului genetic in structura ARN m.
Sinteza ARN-ului mesager, conform principiului complementaritatii, respecta
riguros structura primara a ADN-ului care este decodificata.
- A doua etapa - Produsul initial al expresiei genomului este
transcriptonul. Transcriptonul este reprezentat de ARN, ca rezultat al
decodificarii genelor din genom. Transcriptonul este reprezentat de tipurile
de acizi ribonucleici implicati in sinteza proteinelor (ARNm, ARNr §i
ARNt).
Transcriptonul se realizeaza prin procese de transcriere, cand genele din
genom sunt copiate prin sinteza moleculelor ARN.
Albert si col. (1994) au constatat urmatoarele: cantitatea totala a ARN-ului
celular se raporteaza la gradul de complexitate structural -functional^ a
organismelor. De exemplu, bacteriile au o cantitate totala de 0,05 - 0,10 pg17 ARN,
iar in celulele mamiferelor cantitatea ajunge la 20 -30 pg.
Dar nu toata cantitatea exprimata reprezinta transcriptonul. Albert si col.
au constatat ca in celule, pe langa tipurile ARNm, ARN,- §i ARNt (care reprezinta
transcriptonul), exista o cantitate apreciabila de ARN care nu este codificat, nu este
integrat in transcripton ca functionalitate.
Astfel, in nucleu exista un ARN nuclear mic, sm ARM (small nuclear),
care datorita bogatiei in uracil (21), este denumit si ARNu. Acest ARNsm ar fi
implicat in procesarea ARNm. In citoplasma se gaseste un ARN mic ARNsc (small
citoplasmatic), a carui functie este inca neelucidata. Nuta §i col. (1998) presupune
ca acest ARNsc, numit si ARNtm (mesagerul ARN de transfer), s-ar ata$a de un
ARNm adaugand peptide in proteinele sintetizate incorect.
- A treia etapa - Dupa formarea transcriptonului, acesta trece in
citoplasma, acolo unde are loc sinteza protenelor. In citoplasma, componente ale
transcriptonului, - ARN,-, si ARNm -, vor forma „nisa" poligon, locul de asamblare
a aminoacizilor in lantul polipeptidic (proteina) pe care ii transports ARN,.
- A patra etapa este sinteza de proteina. Proteina sintetizata este etapa
primara de materializare a mesajului genetic inscris in genom. Este etapa esentiala
de materializare a informatiei genetice.
Proteinele celulare, in calitate de caractere mendeliene, pot fi cercetate cu
metode imunologice sau de biochimie genetica. Rezultatele

7
Picogramul (pg) - este simbolul denumirii submultiplilor unitatilor de
masura. Este unitatea care semnific5 o milionime de milionime (10'12)

226
obtinute cu metodele de biologie moleculara, aplicabilitatea interpretative a
datelor, a facut posibila conturarea homotipologiei, stiinta care se ocupa cu
studiul caracterelor moleculare in populatie.
- A cincea etapa ia in analiza modalitatile de participare si
constituire a caracterelor morfo-anatomice la care proteinele sunt implicate
direct.
Realizate ontogenetic, controlate genetic si influentate de factorii
exogeni, caracterele exprimate fenotipic sunt si particularizeaza pe fiecare
individ in populatie.
Daca urmarim fluxul informatiei genetice, biopolimerii celulari pot fi
clasificati si etapizati dupa gradul semnificatiei genetice si participare la
edificarea caracterelor fenotipice, conform teoriei semantice (Pauling).
Conform teoriei semantice, fluxul informatiei genetice se divizeaza in
etape si subetape, in raport de implicarea fiecarui component in mecanismul
sintezei de proteine.
Fluxul informatiei genetice poate fi analog cu sistemele cibernetice
unde, pornindu-se de la programul „central", acesta trece. printr-o serie de
relee, pana la raspunsul final (produsul final).
Conform teoriei semantice, „releele" genetice sunt divizate in
urmatoarele etape:
- Semantida primara - este reprezentata de molecula de ADN ca
program central, program realizat prin dispunerea aperiodica a
nucleotidelor in structura primara. Aceasta dispunere stabileste programul
informational genetic pentru sinteza unei proteine.
Ca semantida primara, ADN-ul are stabilitate metabolica, capacitate
de autoreplicare si, cand este cazul, autorepararea programului
(autocorectarea).
- Semantida secundara - reprezentata de ARNm, transcrie mesajul
codificat al genelor din semantida primara (ADN). Avand durata scurta de
supravietuire, nu are capacitatea de autoreplicare si reparare.
Acest releu este important deoarece, copiind mesajul genetic din ADN
si trecut in citoplasma, asigura, prin translatie, ordonarea aminoacizilor in
structura proteinei.
Tot in grupul „semantidei secundare" sunt si moleculele de ARNr si
ARNt care, dupa ce au fost transcrise din ADN, indeplinesc functii precise in
mecanismele sintezei de proteine.
- Semantida tertiara - este molecula de proteina, care, rezultat si
control specific, este determinata de semantida secundara (fig. 56).
Conform programului copiat de semantida secundara din molecula de
ADN (semantida primara), semantida tertiara, desi are structura §i

227
functie specifica, nu are capacitatea de a define un program folosit in sinteza
specifica a altor proteine.
Structura si functia sa specifica asigura exprimarea fenotipica a
trasaturilor de caracter prin care se particularizeaza fiecare individ.

Semantida ________^ A.DN

primarS

Semantida
secimdaia
.ARN

MICROMORFOLOGICE
(Moleculaie)
CONTROLUL .\RN-
111 DEGR.\DAT PROTEINE-

ca enzune MACROMORFOLOGICE
(coiifoinuitii aiiatomo-
moxfo-stiuctmale)

LIPIDE
GLUCIDE PRODUSI DE METABOLISM
________ ___________./

MOLECULE EPISEMANTICE

Fig. 56 Fluxul informatiei genetice in acord cu teoria semantica

Caracterele realizate de semantida tertiara (proteinele) pot fi de nivel

molecular sau ca structuri morfo-anatomice. In organism se gasesc un numar
impresionant de molecule proteice sau molecule heteroproteice (Ig, sistemele
genetice eritrocitare si plasmatice, HLA, etc.) care pot fi identificate si care
asigura constitutia genetica moleculara a individului.
Dar sunt proteine implicate in structura diverselor tesuturi si organe,
in infrastructura celulei, finalizand caracterele anatomo-structurale. -
Caracterele episemantice. In celula, in organism se sintetizeaza polizaharide
si polilipide. Sunt caractere episemantice deoarece, ca produs final, nu
exprima total informatia primelor trei semantide. Sinteza lor este asigurata de
proteina specifica din structura si functia unei enzime.

228
3. Codul genetic

Intelegerea fluxului informatiei genetice impune si cunoasterea

modului cum sunt codificate mesajele in structura ADN-ului cromozomial
sau mitocondrial.
Informatia genetica este inscrisa in moleculele acizilor nucleici
(ARN) sub forma codificata, cod realizat prin ordinea aperiodica a bazelor
azotate in structura primara a acestor biomolecule. Ordinea aperiodica
intracatenara a bazelor azotate define§te mesajul genetic.
Ca defmitie, informatia genetica este determinate de secventa
nucleotidelor din structura moleculei de ADN, copiata de ARNm, ca rezultat
al transcriptiei si care ordoneaza, sau codifica specific, secventa
aminoacizilor din structura unei proteine. Informatia genetica este conservata
si multiplicata prin functia autocatalitica a moleculei ADN-ului (prin replicare
semiconservativa).
Orice informatie genetica este reprezentata conventional, prin
simboluri (semne). Totalul simbolurilor care pot servi la realizarea unui mesaj
genetic sau informatie, reprezinta alfabetul genetic. Simbolurile se asociaza
intre ele in „cuvinte de cod" prin care este exprimat mesajul genetic.
Succesiunea cuvintelor de cod ordoneaza, codificat, „fraze logice", se obtine
mesajul integral pentru definirea unei molecule proteice exprimata fenotipic.
Prin asocierea „frazelor logice, codificate" se obtin mesajele genetice
implicate in definirea caracterelor exprimate fenotipic, deflnind individul ca
unitate biologica.
Deci informatia genetica lucreaza „cifrat". Cifm prin care informatia
este logic exprimata, reprezinta codul genetic.
Cunoscandu-se elementele de baza care asigura informatia genetica se
pune urmatoarea problema, cum un alfabet genetic, cuprins din patru
simboluri : A (adenina), G (gnanina), C ( citozina), T (timina) sau U (pentru
ARNm), traduce informatia genetica intr-un limbaj proteic in structura caruia
gasim 20 amioacizi, respectiv „20 litere".
Dupa elucidarea structurii, proprietatilor §i functiei bio-genetice a
ADN-ului s-a trecut la descifrarea codului genetic.
S-a demonstrat ca unitatea de functie a codului genetic este codonul,
notiune introdusa de Crick in 1961. Crick considera codonul o succesiune de
baze azotate, necesare pentru codificarea unui aminoacid din structura unei
proteine.
Initial s-a presupus ca unitatea de functie cu care opereaza codul
genetic este reprezentata de un singur nucleotid, adica codonul univoc.
229
 Daca nucleoidul univoc specifica strict un aminoacid, numarul
codonilor obtinut ar fi de 41 = 4, deci numai patru tipuri diferite de codoni.
Este un numar insuficient de codoni fata de eel al aminoacizilor. Ca urmare, in
structurile proteice indiferent de specie si grad de evolutie sa gasim numai
patru aminoacizi, restui de 16 fiind nespecificati si si ar trebui sa lipseasca din
structurile proteice. Deci codonul univoc nu este acceptat.
Acelasi rationament si in cazul codonului biunivoc cand s-ar obtine 42
= 16 codoni. Numar insuficient de codoni, chiar daca se admite ca in
formarea codonilor joaca rol si ordinea bazelor: A-T, T-A, G-C, C-G ar
specifica fiecare un alt aminoacid. Codonul biunivoc ar specifica numa 16
aminoacizi, patru fiind nespecificati genetic.
Nici codonul biunivoc nu se accepta.
Gratie experientei lui Nierenberg si Matthali (1961), s-a demonstrat si
acceptat ca, dimensional, codonul este de tip triunivoc. Ca fiecare aminoacid
este codificat ca o tripleta, respectiv o succesiune de trei nucleotide adiacente.
Prin aceasta asociere si ordonare, numarul combinatiilor posibile este de 43 =
64. Se obtine un numar mai mare de codoni in raport cu numarul necesar
pentru cei 20 aminoacizi. Codonul triunivoc este acceptat.

3.1. Proprietatile codului genetic

Analizat codul genetic are urmatoarele proprietati:

a) Unitatea de functie a codului genetic este codonul format din
secventa liniara a trei nucleotide. Este o tripleta. De exemplu, daca in gena
ADN-ului avem secventa „...ATTGCCATTATGGCATAA...", codonii
formati vor fi urmatorii: ..."ATT-GCC-ATT-ATG-GCA-TAA"...
b) Codul genetic este degenerat. Numarul codonilor realizati prin
combinarea nucleotidelor - 43 - este de 64. Raportat la numarul de 20
aminoacizi, sau 44 codoni in plus. Plusul numeric de codoni asigura
redundanta informationala. S-a demonstrat ca unii aminoacizi pot fi codificati
de 2, 4 sau 6 codoni. Numai triptofanul si metionina sunt codificati de cate un
singur codon. Pentru 18 aminoacizi, codificarea multipla este asigurata de
codonii sinonimi, justificand denumirea de codon degenerat sau redundant.
Existenta codonilor sinonimi pentru un aminoacid asigura corecta si rapida
sinteza a proteinelor, reprezinta o eventuala protectie contra unor posibile
mutafii si prevenirea efectelor lor in celula.
Din totalul de 64 codoni, 61 codoni specifica cei 20 aminoacizi, sunt
codonii cu sens, iar trei codoni sunt nonsens.

230
 c) Codul genetic nu este ambiguu. Un anume codon cu sens
recunoasje un singur tip de aminoacid.
d) Codul genetic are codon initiator. Codonul AUG care specifica
metionina, este eel de la care se initiaza procesul de translate a mesajului
genetic din ARNm (codonul complementar din structura ADN-ului este
TAC).
e) Codul genetic are semne de punctuatie. Semnele de punctuatie sunt
asigurate de codonii nonsens terminatori. Codonii terminatori cu rol de
punctuatie genetica delimiteaza dimensiunea si continutul mesajului si sunt
reprezentati de triplete bine definite. Codonii nonsens sunt urmatorii: UAA,
UAG, UGA. Prezenta lor semnifica „sfarsitul translatiei" mesajului genetic
necesar pentru sinteza proteinei.
f) Codul genetic inscris in molecula ADN este necunoscut in
structura ARNm prin complementaritatea bazelor, de exemplu: C prin G, G
prin C, T prin A, A prin U.
g) Posibilitatile de amplificare a codului genetic sunt inepuizabile. De
exemplu, secventa de 10 dezoxi ribonucleotide realizeaza un milion de
combinatii sau mesaje genetice diferite pentru sinteza aceluiasi numar de
lanturi polipetidice cu structura, functie si specificitate diferita. Daca am lua
in analiza o secventa de 15 nucleotide combinatii posibile vor fi de 415. Deci
cateva milioane.
h) Codonii din structura ADN (respectiv ARNm) nu sunt separati
intre ei prin prezenta unui nucleotid neintegrat in componenta codonului.
Deci, intre codoni nu sunt „semne" de separare, nu sunt „virgule".
i) Codul genetic nu este suprapus, nesuperpozabil. Deci doi codoni
vecini nu au nucleotid comun. Fiecare codon are bazele proprii care nu
participa la formarea si functia altui codon (Khorana, 1968). Daca ar fi codul
genetic suprapus, ar trebui acceptata si ambiguitatea, adica nerespectarea
corespondentei stricte un codon un anume tip de aminoacid. Ar fi
nerespectarea citirii in flux continuu a mesajului genetic.
De exemplu Korana, pentru a demonstra nesuprapunerea codului
genetic, a facut urmatoarele observatii: secventa ... GAA GAA GAA - ...
poate asigura sinteza unui homopolipeptid format din lizina, arginina sau doar
din ac. Glutamic. Tipul de aminoacid incorporat in homopolipeptid depinde
de punctul de unde este citit mesajul codificat. Daca citirea incepe de la
primul nucleotid, iar tripletele formale vor fi ... GAA-GAA-GAA ... etc,
polipeptidul va fi structurat numai din ac. glutamic. Daca citirea incepe cu al
doilea nucleotid ...G-AAG-AAG-Aag... etc, polipeptidul va avea in
componenta sa lizina. In cazul ca tranzatia incepe cu nucleotidul al treilea

231
vom avea codonii ... GA-AGA-AGA-AGA ... etc, polipeptidul va contine
arginina, deci suprapunerea este exclusa.
j) Codul genetic este universal. Este stabilit ca in structure acizilor
nucleici gasim aceleasi tipuri de nucleotide indiferent regnul (animal sau
vegetal) indiferent care este gradul de evolutie a speciilor (procariote sau
eucariote, bacterii sau mamifere). Deasemenea s-a demonstrat ca un anume
codon va codifica acelasi tip de aminoacid, indiferent specia. De exemplu
codonul UUU specifica fenilalanina la toate speciile.
Datorita universalitatii codului genetic s-a reusit biosinteza
hemoglobinei prin folosirea ribozomilor si ARNm din reticulocitele de iepure,
in prezenta ARNt de la Escherichia coli. Hemoglobina obtinuta avea
caracteristicile Hb de iepure. De ce? Pentru ca tripletele (codonii) din ADN-ul
cromozomilor de la iepure codifica aceeasi aminoacizi ca si codonii de la E
coli. Ceea ce difera insa este ordonarea codonilor in structura acidului nucleic
al fiecarei specii. Distributia pozitionala a aceluiasi codon in mesajul genetic
din ADN confera specificitate structural-functionala a aparatului genetic
pentru fiecare individ, specie.
Aceasta caracteristica, „universalitatea codului genetic", are
importanta in ingineria genetica.
k) Codul genetic se poate modifica prin mecanisme de mutageneza.
Sunt factori exogeni, potential mutageni, prin doza sau efect, care actionand
asupra moleculelor de ADN celular, pot induce modificari in structura ADN-
ului, pot modifica mesajul genetic (fig. 57).
Interesant este calculul probabilistic efectuat de Wright in 1966. El
face urmatorul calcul: daca gena ar avea 1000 nucleotide, posibilitatea
combinarii secventei nucleotide este de 41000 sau 10600. Daca s-ar inlocui o
singura baza din cele 1000 existente, se pot obtine aproape 3000 tipuri de
alele noi (vezi mutatia genetica).

232
 CAT
Gena salbateca ATG : : GCA ; TCiA : ATG | c_____

Gena cu substitutia ATG CTT GCA TGA ATG c

.........
iinei baze
! non-sen*
Gena cu insert 1a unei ATG : OCT TGC1 ATG : AAT GC.
baze
nonsens

Gena cu supriinarea ATG ! CTG CAT GAA ; TGC

unei baze

■nonseiis

Fig. 57 Efecte induse prin procesul de mutageneza (dupa Crick, 1961)

4. Codarea §i decodarea ARN-ului (sinteza proteinelor)

a) Codarea - Transcriptonul este unitatea functionala de codificare a

mesajului genetic in ARN, mesaj inscris in structura primara a moleculei de
ADN.
Codarea transcriptonului cuprinde ARNm, forma transmisa a
mesajului genetic necesar sintezei unei proteine cu structura si functii
specifice.
b) Decodarea este procesul complex de traductie (translate) a
mesajului genetic din ARNm in proteina. In decodare sunt implicare doua
tipuri de ARN: ARNr si ARNt, care fmalizeaza proteomul.
Procesele de codare si decodare sunt complexe, necesitand
unnatoarele etape:
• Accesarea transcriptonului din genom. Este etapa care modifica
structura cromatinei si pozitionarea genelor active din nucleozom, la nivelul
carora se va sintetiza ARNm.
• Ansamblu complex de initiere compus din diverse proteine care
conlucreaza pentru codificarea genelor in ARN. Acest complex este foarte
important deoarece initierea este un proces cu inalta tinta, actionand strict in
zona genelor active.
• Odata inceputa initierea codificarii se va continua cu sinteza
ARN-ului m, care copieaza mesajul genelor din transcripton.

233
• O alta etapa este procesarea molecului ARN-ului. La eucariote, gena
are structura discontinue sau in mozaic continand exoni §i introni. Intronii
sunt subunitati genice noninformationale care sunt codificati impreuna cu
exonii. Din aceasta codificare mixta a genei (exoni-introni) se formeaza ARN
premesager sau primar. Acest ARN precursor pentru a deveni ARN m matur
(functional) este supus unor mecanisme de procesare, la care sunt implicati
spliceosomii (cu rol in cuplarea corecta a exonilor dupa decuplarea de
introni).
• Ansamblul complex al translatiei (traductiei) mesajului genetic din
ARNmm intr-o structura proteica, in structuri proteomice specifice.
• Formarea lantului polipeptidic si formarea structurii proteinei si
configuratia corecta a structurii tridimensionale si cuaternare a proteinelor.

5. Transcriptonul §i transcrierea informatiei genetice m structura

ARNm

Transcriptonul, components semnificativa, confine codul pentru

sinteza ARNm, iar acesta va specifica structura proteomului.
Transcriptorul nu este sintetizat de „novo" in celula, in organism. El
este mo§tenit de la ascendenti, mentinut in succesiunea generatiilor prin
replicare semiconservativa sj transmis la descendenti (a se vedea sinteza
ADN-ului sj aplicarea cromozomilor).
Transcriptia nu rezulta din sinteza transcriptonului. Este rezultatul
decodificarii mesajului din ADN, cod care este trecut in sinteza si structura
ARNm, conform principiului complementaritatii bazelor azotate:
ADN: AGCT ARN UCGA.

Transcriptonul uman.
Transcriptonul uman este substantial mai complex fata de eel al
procariotelor §i al unor levuri (Saccharomyces cerevisiae).
De§i putin cunoscute, genele transcriptonului uman au inceput sa fie
identificate, de exemplu, Caron si col. (2001) studiind transcriptonii din 8 linii
celulare, normale si canceroase, au descoperit diferente cantitative la
moleculele de ARNm care au fost transcrise de transcripton.
Interesanta este descoperirea facuta de ei ca in moleculele codificate
de transcriptoni, cantitatea de ARNm variaza (cantitativ) intre diversele tipuri
de celule canceroase. Exemplu sunt diferentele transcriptonului intre

234
i celulele cancerului de colon si cele ale cancerului pancreatic (Zhang si col, J
1997).
Prin analiza transcriptonului si stabilirea diferentelor calitative si |
cantitative a moleculelor de ARNm, se deschid noi perspective cu implicare J
inpatologie:
- diagnosticul diferential in diversele tipuri de cancer la om;
- descoperirea unor noi modalitati de tratare a bolii canceroase, sau a j
altor boli pe fond genetic.
Cei care au initiat analiza transcriptonului in diagnosticul diferential j
in diversele tipuri de cancer au fost Golub §i col (1999), care, analizand |
transcriptonul in doua forme de leucemie (leucemia limfoblastica acuta si |
leucemia mieloida acuta) au constatat diferente cantitative a ARNm celular.

j 6. Transcnerea transcriptonului

Pentru transcrierea (traductia) mesajului genetic Tnscris si j

transcripton este necesara prezenta urmatoarelor elemente: | - transcriptorul, in
structura ADN-ului celular, ce serveste ca matrifa de \ sinteza a ARNm
precursor (ARN premesager) i - complexul enzimatic al ARN polimerazelorl,
II sj III;
- ribonucleotidelor activate;
- elementelor cis-reglatoare in amonte de latura centrala a transcriptorului din
regiunea laturei 5. Aceste elemente sunt prezentate de casetele 5. TATA sau
GC si CAAT, considerate ca elemente de start al transcriptiei;
- activatorilor: - sunt proteine trans-activatoare pentru fiecare ARN-
polimeraza (la eucariote importanta pentru transcrierea mesajului genetic
i este ARN-polimeraza II).

235
 OPERON

i
asigura

1
TRANSCRIPTIA

Permite opreste
In citoplasma

CONFORMATIA

f
adopta
TRANSLATIA

CONFORMATIA
rezulta

PROTEINE adopta
ENZIME

ARN-m
T
AMINOACID ARN-m
Concentratia crescuta in
aminoacizi___________carid T
concentratia in
aminoacizi scazuta

Fig. 58 Interrelatia cuplarii transcriptiei §i translatiei

Spre deosebire de procariote, la eucariote gena are o structure

discontinua (in mozaic), formata din exoni si introni. Fiind copiate ambele
secvente, intronii si exonii, traductia sau transcrierea mesajului genetic si
maturarea ARNm, pentru a deveni functional, se desfasoara in doua etape:
• prima etapa este codificarea integrala a genei la eucariote
(exonii si intronii) cu formarea molecului de ARN premesager (precursor).

236
• a dotia etapa este procesarea ARN pre-mesager, rezultand
ARNmm (mesager matur), forma sub care trece in citosolul celulei
traversand porii anvelopei nucleare.

6.1. Etapele formarii ARNm.

Pentru sinteza ARNm se parcurg urmatoarele etape:
- initierea transcriptiei;
- elongatia transcriptiei;
- stoparea (terminarea) transcriptiei.

6.1.1. Initierea transcriptiei, elongatia si stoparea.

a) - La procariote. Deoarece gena la procariote nu contine introni

initierea transcriptiei se deruleaza in modul urmator:
ARN-polimeraza actioneaza asupra transcriptonului. In zona „tintita"
pentru initierea transcriptiei, cele doua catene ale moleculei ADN se separa,
iar cateva 5'—->3' va lua aspectul de bucla monocatenara, cu capetele
complementare libere. Despiralizarea situsului de initiere se face sub actiunea
helicazei si enzimei dna. Sinteza ARNm are loc numai pe catena cu directia
5'—»3', considerate catena transcripton sau codanta. Catena complementary
5'—>3' este necodanta sau non-transcripton. Secventa promotor -TATAAT- se
gaseste in amonte de situsul start pentru sinteza ARNm.
Dupa despiralizarea transcriptonului, pe situsul start care corespunde
promotorului si in prezenta proteinei sigma (o), se fixeaza ARN-polimeraza.
Odata cuplata enzima incepe transcrierea codului inscris in structura genei,
rezultand molecula de ARN-m. Sinteza ARN-m pe catena ADN respecta,
principiul complementaritatii bazelor: ADN: - 5'
ATGC......3'-
ARN........UACG............

Dupa o secventa de 10 nucleotide de la inceperea transcrierii

mesajului, proteina sigma (a) se decupleaza de gena promotor.
Pentru procariote, mesajul codificat pentru formarea ARN-m incepe
cu nucleotidul care are adenina A.
Cand transcrierea ajunge spre terminarea genei, actioneaza o proteina
stop, o proteina speciala „rho" care are proprietatea sa recunoasca

237
tripleta „stop" din gena transcrisa. Codonul stop, bogat in GC si recunoscut de
proteina „rho", va incheia sinteza ARNm.
Dupa terminarea transcriptiei, ADN-ul isi reface integritatea
moleculara dublu catenara.
La procariote ARN-polimeraza recunoaste gena care va transmite
ARN-m.
La procariote, din transcrierea codului, rezulta direct molecula de
ARNm functional, deoarece ADN-ul genei nu contine introni.

b) La eucariote. Spre deosebire de procariote, la eucariote transcriptia

mesajului genetic este mai complexa.
Deosebirile intre sinteza ARNm la procariote si eucariote sunt
urmatoarele:
• la procariote gena (lipsita de introni) va fi total transcrisa
rezultand ARNm. La eucariote, la care gena contine introni si exoni, gena va
fi transcrisa in totalitate (si exonii si intronii), rezultand in prima etapa un
ARN premesager (precursor). Ca ARN premesager, acesta este supus unor
etape de procesare pentru a se obtine ARN mesager matur;
• la procariote se transcrie orice gena indiferent de pozitia sa in
molecula ADN. La eucariote, datorita existentei ADN-ului repetitiv
noninformational, codificarea mesajului in ARN p.m. are loc numai in zonele
eucromatice ale cromozomului, unde este ADN nerepetitiv genetic
informational;
• la procariote in sinteza ARNm este implicata numai enzima ARN
polimeraza, in timp ce la eucariote activitatea de transcriere este catalizata de
trei tipuri de enzime:
ARN polimeraza I este prezenta in zona organizatori nucleolari la
cromozomi acrocentrici. Catalizeaza sinteza ARNr;
ARN polimeraza II, este dispersata in nucleoplasms. Catalizeaza
sinteza ARN pre-mesager;
ARN polimeraza HI, prezenta in nucleoplasm^, catalizeaza sinteza
precursorilor ARNt.
Initierea transcriptiei la eucariote are loc la nivelul situsului de
initiere, numai dupa ce s-a fixat enzima ARN-polimeraza II. Fixarea enzimei
are loc numai dupa recunoasterea situsului TATA-box al promotorului de la
capatul 5' —> al transcriptorului. In amonte de situsul de initiere este o
secventa 5'->3' (5' ... CCAGCCATG) implicata in declansarea si prereglarea
sintezei ARN premesager. Deoarece situsul de initiere contine codonul
initiativ TAC pentru metionina, copierea mesajului

238
genetic in ARNpm va incepe cu AUG - corespondentul complementar in
ARNm.

16.1.2. - Accesarea genomului si procesarea ARN -

premesager
Procesarea genomului implica procese ce vor influenta structura
cromatinei sj pozitionarea nucleozonului, acolo unde sunt gene active.
Accesarea va asigura respectivelor gene accesibilitatea de a fi decodificate in
ARN (fig. 59).
AON SE MANIFEST A

Fig. 59 Transcriptia informatiei genetice in structura ARNm (dupa Robert,

1983)

239
 Ansamblul complex implicat in initierea transcrierii mesajului genetic
din gene cuprinde setul de proteine sigma (a) si rho care vor conlucra cu
ARN polimerazele I, II §i III pentru copierea codului in structurile ARN.
Caracteristica ansamblului complex de initiere este „tinta exacta" de
actionare din genom, „tintele" adiacente genelor active.

6.1.2.1. Procesarea pre-ARNm

La eucariote gena este structurata sin exoni si introni. La sfarsitul

transcrierii genei, rezulta ARNm nefunctional, numit pre ARNm sau
precursor. Pentru a-si exercita functia proteomica, acest precursor ARNm
este supus unui complex de procesare.
Dupa ce proteina „rho" a recunoscut codonul stop §i s-a incheiat
transcrierea mesajului din gena, ARN precursor este supus proceselor de
procesare.
Trecerea de la ARN precursor la Arnmm se face in doua etape:
- prima etapa este legata de modificarea capetelor 5' si 3' a ARNm
precursor.
- a doua etapa este procesarea propriu-zisa a ARN precursor..
Pentru prima etapa, modificarile sunt urmatoarele: la capatul 5' al
ARNm precursor se va cupla o molecula 7-metil guanozina, iar la capatul 3' o
secventa poliadenilat, denumita si coada adenilica.
Modificarea celor doua extremitati ale ARNm precursor asigura
urmatoarele semnificatii:
- stabilitate §i protectie fata de actiunea endonucleazelor;
- dupa maturizare, asigura transportul ARNm din nucleu in
citoplasma (faciliteaza traversarea anvelopei nucleare), precum §i cuplarea
cu sub-unitatea ribozomica 60 S.
A doua etapa este procesarea ARNm precursor. Este etapa de
separare a exonilor de introni, separare exacta. Orice eroare modifica mesajul
genetic. Excizia are loc in punctele de contact dintre exoni-introni, unde, in
ARN precursor, exista cuplul 5'-GU, denumita situs donor si cuplul 3'-AG -
situs acceptor.
O remarca! La eucariote nu exista ARNmm lipit de coada
poliadenilica. Lipsa acestuia ar face nefunctional ARNm. Singurul ARNm
lipsit de coada poliadenilica este eel care codifica sinteza histonelor.
Secventa poliadenilat este denumita §i „situs de incheiere a
transcriptiei".

240
 De consemnat: fiecare gena transcrisa este incadrata dc doua situsuri:
- situsul initiator de care se leaga ARN polimeraza II,
- situsul terminator, care urmeaza codonului stop si care, sub actiunea
endonucleazei, ataseaza „coada" poliadenilica de molecula ARNm precursor.
Dupa separarea exonilor de introni, exonii se vor cupla, se vor matisa.
Un rol esential in procesele de matisare il au „spliceosomiP.
Spliceosomii sunt segmente de snARN (small nuclear ARN) cu
capacitate catalitica (enzimatica). In asociere cu ARNm precursor, sunt
implicati in procesul de splicin (matisare). In genomul uman se apreciaza
exitenta a circa 22 gene a caror locasuri ar fi pe cromozoml 17 p 11.2 si 17 q. '
Spliceosomii au un dublu rol: recunosc punctul delimitant dintre exoni
si introni care vor fi recuplati, matisandu-i in ordinea exacta, cum se gaseau in
structura genei transcrise.
In urma recuplarii exonilor si eliminarea intronilor, se obtine molecula
de ARNmm (functionala).
Dupa aceasta procesare care are loc in nucleu, ARNmm trece in
citoplasma celulei unde prin procesele de translate va asigura sinteza unei
molecule de proteina cu structura si functie specifica.
Observand mecanismele de procesare, de matisare a intronilor si
sudarea exonilor, P.Chambon (1981) a incercat sa explice originea,
semnificatia si rolul intronilor in genomul eucariotelor.
Chambon lanseaza urmatoarea ipoteza: spliceosomii (autorul a folosit
termenul de enzima ancestrala) cu rol catalitic operand asupra preARNm
pentru a rezulta ARNm matur, ar fi evoluat plecand de la o singura
ribonucleoproteina ancestrala si care in evolutia biologica, s-ar fi diversificat
in secvente mici de ARN (small nuclear) cu rol in procesele de cataliza si
formare a ARNm matur.
Dupa Chambon, intronii „relicva" ar avea aceeasi origine cu ADN-ul
repetitiv, aparent „fara functie", dar care s-au perpetuat in succesiunea
generatiilor, chiar daca este neutilizabil.
Mai optimista este ipoteza lansata de Gilbert si Tonegawa (1981). Ei
considera ca asa numitele „relicve" intronice ar fi avut si vor avea importanta
deosebita in evolutia biologica. Conform ipotezei lor, intronii „relicva" ar fi
existat la toate organismele vii, dar organismele cu ciclu de dezvoltare foarte
rapid (eubacteriile, drojdia) s-ar fi pierdut in cursul evolutiei, prin actiunea
selectiei.

241
 Dupa Gilbert si Tonegawa, intronii „relicva" n-ar fi inactivi, iar
mecanismul „excizie-lipitura" in timpul procesarii ARNm precursor ar avea un
avantaj evolutiv, pentru ca prin combinatie cu mecanismele de crossing-over inegal
si duplicatie-deficienta ar fi putut crea, si creeaza, noi secvente genice active,
determinand noi proteine, noi caractere (nromale sau patologice).

7. Translatia sau transcrierea mesajului genetic din ARNmm

7.1. Sinteza de proteine

Proteomul este produsul final al genomului, §i cuprinde toate proteinele

dintr-o celula intr-un anume moment. De exemplu, o celula tipica mamiferelor,
celula hepatica se presupune ca are 10000-20000 tipuri diferite de proteine. Ca
hepatocitul ar contine aproximativ 0,5 mg sau 18-20% din greutatea totals a celulei
(Alberts si col., 1994; Lodish si col., 2000) (fig. 60).

242
Fig. 60 Mecanismul asamblarii aminoacizilor si elongatia lantului
polipeptidic (dupa Gallien, 1979).
Dupa cum observam, proteomul, cantitativ, este complet si mult
diversificat calitativ.
Materializarea proteomului este rezultatul unui complex de procese de
translatie (traductie) a mesajului genetic, inscris prin transcriere si matisare in
ARNm matur.
Translafia este procesul de decodificare a informafiei genetice din
ARNmm, care asigura ordonarea secvenfiala specified a aminoacizilor,
polimerizarea lor prin formarea de legaturi polipeptidice intr-o secventS
polipeptidica.

243
 Pentru transcrierea mesajului genetic si formarea lantului polipeptidic
sunt necesare:
- codul genetic mscris prin traductia genei si prezent in citoplasma ca
ARNm matur;
- nisa de asamblare a aminoacizilor, care este ribozomul cu ARNr;
- moleculele care asigura traducerea informatiei genetice din
ARNmm, reprezentate de ARNt ce contin anticodonii;
- polipeptidaze, enzime de formare a legaturilor peptidice intre
aminoacizi;
- aminoacizi;
- factorul de initiere;
- factorul de elongatie si ATP.
Sinteza moleculelor proteice se desfasoara in trei etape:
- initierea;
- elongatia;
- terminalizarea.

7.1.1. La procariote
Pentru translate sunt necesare urmatoarele componente:
- ARNm cu codonl initiator sau start: AUG;
- ribozomii: subunitatile 50S si 30S;
- ARNt initiator: formil - metionil - ARNt;
- factori de initiere EF1, IF2 §i IF3
- o molecula de guanozin trifosfat ca sursa de energie (GTP).
In citoplasma, transcriptorul asigura translatia (citirea) mesajului
genetic, materializat intr-o structure polipeptidica.
Ajuns in citoplasma, ARNm se va cupla cu ribozomii care, compusj
din doua subunitati, au un diametru de 15-20 nm. Cele doua subunitati
inegale vor fi cuplate prin legaturi stabilizate de ionii de Mg + (a se vedea
ARNr).
Fiecare molecula de ARNm va fi „explorata" de un ribozom. S-a
observat insa, ca aceeasi molecula de ARNm poate fi „explorata" seriat de
mai multi ribozomi, formand polizomul sau poliriobozomul (G.E.Palade,
1953, Premiul Nobel 1974).
Posibilitatea ca o molecula de ARNm sa fie explorata de mai multi
riozomi, cu formarea mai multor lanturi polipeptidice identice, este
conditionata de faptul ca in celula avem o cantitate mica de ARNm (ccj 4%),
caracterizat de un „turnover" foarte rapid, o mare instabilitate si degradare
rapida. Gratie formarii polizomului se poate sintetiza, prin amplificare
complexul proteomic din celula.

244
 Pe subunitatea 30S a ribozomului se fixeaza factori de initiere IF1,
IF2 si IF3, impreuna cu GTP (sursa energetica) (IF = factori de initiere, sunt
proteine ce intervin in initierea §i sinteza proteica).
Pe acest complex se fixeaza ARNm si o molecula de ARNt cu
anticodonul complementar codonului de initiere. Este ARNt, care transporta
metionina activata si cuplata sub forma de formil - metionil - ARNti. acest
complex vine in contact cu codonul AUG din ARNm. Dupa cuplare, sub
ictiunea factorului de initiere IF2, subunitatea ribozomica mica se va cupla
:u subunitatea mare constituind ribozomul. Prin cuplarea cu subunitatea
nare, ARNt, care a transportat metionina, va fi integrat in situsul P al
ubunitatii mari, dar subunitatea care, prin cuplare cu subunitatea mica, va
icoperi si codonul ce urmeaza codonului initiator AUG. Spatiul codonului
coperit in aval de codonul initiator reprezinta situsul A al ribozomului,
are, initial, este liber.
Soseste al doilea ARNt2 ce transporta alt aminoacid, ce va fi itrodus in
situsul A liber. Dupa ocuparea celor doua situsuri (P §i A), sub ctiunea
enzimei peptidil - tranferazei si donorului de energie GTP, se Dimeaza
legatura peptidica intre cei doi aminoacizi, rezultand un dipeptid. >upa
formarea dipeptidului, ARNt] din situsul P este eliberat. Prin liberarea
situsului P, ribozomul va inainta pe ARNm ocupand in aval de xlonul de
initiere o secventa de trei nucleotide (al 2-lea codon pe ARNm). rin aceasta
alunecare in directia 5'-3'a ARNm, RNt2 se va gasi acum in tusul P, iar
situsul A liber.
In urma acestei eliberari ajunge ARNt3 ce va transporta al 3-lea
ninoacid pe care-1 va introduce in situsul A. Sub actiunea enzimei, intre
jptidul transferazei si GTP, se stabileste legatura peptidica, intre ninoacidul
2 cu aminoacidul 3, rezultand un tripeptid.
Procesul de avansare a ribozomului pe ARNm si formarea gaturilor
peptidice intre amioacizi este denumit elongatie. In timpul Dngatiei mesajul
genetic transcris in ARNm de la ADN, este materializat tr-o molecula
proteica sintetizata.
In timpul elongatiei cu sinteza polipeptidului sunt posibile erori, ce t fi
corectate sau nu.
Cand ribozomul ajunge la codonul non-sens sau stop (UAG, UAA j
UGA) alunecarea se opre§te. Dupa stopare complexul ribozom-ARNm-
lipeptid se separa, separare facilitate de un factor proteic (PF).
Dupa terminalizarea translatiei §i eliberarea lantului polipeptidic,
ozomul se disociaza in cele doua subunitati, dispersandu-se in Dplasma.
Cand in citoplasma ajunge un alt ARNm, subunitatile

245
ribozomale sunt supuse acelorasi procese si etape in translatia mesajului
genetic.

7.1.2. La eucariote
La eucariote translatia este similara cu cea descrisa la procariote dar
mai complex!
Initierea translatiei la eucariote necesita: (fig. 61,62,63,64)
- ARNmm semnal care contine obligatoriu in pozitia unu, codonul de
initiere AUG in apropierea capatului 5' al ARNmm;
- Aminoacidul initiator - metionina;
- Factorul de initiere, in special IF2;
- ATP, sursa energetica pentru activarea aminoacizilor;
- ARNt;
-GTP.
Ribozomul cu situsurile P si A pe subunitatea mare, are pe
subunitatea mica doua locuri de legatura cu ARNm si ARNt.
Aminoacidul, forma activata a aminoacidului, se cupleaza la bratul
liber lung de adenina distala, dupa prealabila identificare de catre anticodonul
din bucla. Acest anticodon din ARNt va avea un codon complementar in
componenta ARNm. La aceste procese participa ATP ca sursa de energie si
amino-acil-ARNt-sintetaza care va recunoaste aminoacidul activat pentru a fi
transportat. Recunoasterea o asigura anticodonul din ARNt.
ARNt-1-initiator acceptor si ARNt-2-acceptor pentru al doilea
aminoacid, vor ocupa in ordine ti si t2, situsurile P si A din subunitatea 60 S
ribozomala. Dupa ocuparea situsurilor, intre cei doi aminoacizi se stabileste o
legatura peptidica. Din acest moment incepe elongatia sintezei polipeptidului,
datorita ,,alunecarii" ribozomului pe molecula ARNmm.
La factorii de elongatie se implica EF-Tu pe care se fixeaza GTP.
Prin decuplarea EF-Tu de aminoacid - ARNt, se stabileste legatura peptidica
intre aminoacizi, catalizata de peptidul-transferaza din subunitatea mare a
ribozomului.
Elongatia are loc in directia 5'—*3' a moleculei de ARNmm. Prin
alunecare, situsul A se va elibera. Dupa fiecare eliberare a situsului A va fi
introdus cate un aminoacid translocat de ARNt.
Cand se ajunge la codonul stop (UAG, UAA sau UGA), de care se
leaga un factor de eliberare, lantul polipeptidic se va separa de ribozom, si de
ARNmm, urmate de dislocarea subunitatilor ribozomale, si dispersia lor in
citoplasma.

246
 Fig. 61 Nivele de control in sinteza protemelor la eucoriote

SINTEZA PROTEINEI
t

REGLARE

realizata prin

MULTIPLE NIVELE DE CONTROL

?I INFLUENTE

conditionate de
 Fig. 62 REGLAREA ACTTaTATH GENELOR IN SINTEZA DE PROTEINE LA PROCARIOTE (REPRESEE .SI RETROINTHBITIE)

PROTEIN A CONTROL

influetyeazS ■»
ACTIVATOARE
ONDUCTIE)
pozmv

''
PROMOTOR OPERATOR

/
 Fig. 63 REGLARE PRIN REPRESIE ENZIMATICA A SINTEZEI DE PROTEINE

Fonna lnutaiita- GENA

TRANS

to Produce

\
FORMA *)
OPERON INACTTV mi se leaaa de are caracteristica ■
ALOSTERICA

sail nil produce

PROTEINA
REPRESOR

TRANSCRIPTIA

Wocheazri

ARN-POLIMERAZA -se blocheazfl

 Fig.64 Iiuluctia euzunatica a suite zei de proteme la Procariote

GEN TRANS

procuce

PROTEINA ACTIVATOR

nelegate de promotor Permite

legate de

INACTIVA GENA PROMOTOR ARN-POLIMERAZEI

mitiaza cuplarea la

TRANSCRIPTIA
S.Rolul proteinelor nou sintetizate in viata celulei.

Proprietatile fizico-chimice, functia §i specificitatea unei proteine sunt

determinate de numarul, tipul §i succesiunea aminoacizilor, reziduuri
componente in structura lor.
DacS luam in analiza diversitatea mesajelor genetice inscrise in
structura aperiodica a ADN-ului, mesaje codante, ce pot fi transcrise in
ARNm §i traductionate in structuri proteice putem sa acceptam marea
diversitate a proteinelor in celule, in organism.
Datorita imensei diversitati de structura, proteinele au o gama larga de
functii.
Ca functii a proteinelor nou-sintetizate mentionam:
- functia catalitica in reactiile metabolice de sinteza sau hidroliza care
au loc in celula. Functia catalitica a proteinei este sub forma de enzime,
forma care asigura energia celulei. Ca functie catalitica, enzimele sunt
implicate in biosinteza acizilor nucleici, a proteinelor, carbohidratilor,
lipidelor, etc;
- functia in infrastructura celulei. Proteinele sunt integrate in toate
compartimentele ce formeaza citoscheletul celular, la toate nivelele de
organizare morfo-anatomica a organismului;
- functia contractila a proteinelor, de exemplu actina §i miozina din
fibrele citoscheletice ale fibrelor musculare;
- functia de transportator. De exemplu, hemoproteina (hemoglobina)
transporta gazele din si in celula (oxigenul, CO2). Sunt unele proteine care
transporta acizii gra§i, albumina, etc.;
- functia de protectie a celulelor din tesuturi si a corpului. De
exemplu, anticorpii (imunoglobulina) sau unele proteine sunt implicate in
coagularea sangelui.
- functia de depozitare a proteinelor. De exemplu, feritina
inmagazineaza Fe in ficat, gliadinele inmagazineaza aminoacizii in seminte de
graii inactive.
- reglarea proceselor celulare mediate de proteine. De exemplu:
activatorii care leaga genomul de influenta genelor (individuale sau grupuri de
gene), hormonii extracelulari, citokinele (proteine), insulina (regleaza
glicemia), interleukinele regleaza mitoza §i diferentierea celulara etc.

251
Capitolul VI
RELATIILE INTERGENICE SI MEDIUL DE VIATA
ALOMULUI
Pentru intelegerea relatiilor inter-genice si raportul gena-caracter-
mediu, este necesara dezvoltarea notiunilor de genom, genotip si fenotip.
Genomul reprezinta totalitatea genelor existente intr-un set haploid de
cromozomi la organismele cu reproducere sexuata. La eucariotele cu
reproducere sexuata, set haploid exista numai in celulele reproducatoare, in
gameti. Ca urmare, genomul este totalitatea genelor existente in celula
gametica.
Genotipul este constitutia genetica a organismului. Aceasta este
reprezentata de totalitatea genelor existente in cele doua seturi haploide
primite de la genitori (din celula diploida), dar si genele din ADN-ul
mitocondrial.
Dotatia cromozomica din celula diploida (genotipul) este constituita
din doua serii de cromozomi omologi: materni (23 de cromozomi) si patemi
(23 de cromozomi).
In fiecare pereche de omologi sunt inscrise genele care contin
mesajele pentru sinteza unei proteine cu structura specifica pentru definirea
caracterelor unui organism.
Fiecare gena ocupa un locus "precis" in cromozomi. Forma sub care
exista o gena pe un locus dat in cromozom, aparuta prin mutatie, crossing-
over inegal, sau prin duplicitate, etc si care indeplineste functie genetica, este
numita alela. Pe cuplul de cromozomi omologi fiecare gena este dublu
reprezentata, constituind un cuplu alelic sau gene alelomorfe. Alelele avand
"comportament" dominant sau recesiv.
Fenotipul - Genotipului i se "opune" fenotipul. In sens larg, fenotipul
este ansamblul de caractere anatomo-structurale, moleculare si metabolico-
functionale ale fiecarui organism. Caracterele observabile sunt produse prin
interactiunea informatiei genetice existenta in genotipul individului dar si in
mediul sau de viata, de factorii ecologici.
"Identitatile" fenotipice intre indivizi pentru un anumit caracter sunt
rezultatul unei constitute genice sinonime.
Sunt insa diferente fenotipice, cantitative sau calitative in exprimarea
aceluiasi caracter la indivizii conspecifici, sau componenti ai aceleiasi familii.
Caracterele cu exprimari fenotipice diferentiate intre indivizi, sunt
conditionate sau influentate de factorii de mediu. Sunt

252
caractere, in special caracterele poligenice, cu predispozitie genetica, la care
factorii din mediul extern pot influenta exprimarea nuantata, graduala, a
aceluiasi caracter.
Diversitatea fenotipica reprezinta gama de reactii fenotipice a unui
genotip particular (constitutional genetic) ca norma de reactie a individului la
influentele induse sau conditionate de factorii ecologici.
Interferentele conditionale intre genotip si mediul ambiental, in
modelarea si gradul de manifestare a unor trasaturi fenotipice, sunt strans
legate.
Modelarile fenotipice se pot analiza la diverse niveluri de organizare a
biosistemelor: caractere de nivel molecular, tisular, de organ sau sisteme de
organe, care in ansamblul lor definesc individul ca unitate biologica
(morfotipica) in cadrul populatiei, a speciei.

1.Relatiile intergenice
Exprimarea fenotipica a unui caracter ereditar este conditionata de
relatiile existente in cadrul unui cuplu alelic, sau de interrelatiile intre
cuplurile de gene nealelice.

1.1. Relatii intre cupluri alelice.

In cadrul cuplurilor alelice apar relatii de dominanta, codominanta,
raporturi cu efecte semiletale sau letale, etc.
Pentru a intelege corect aceste relatii sunt necesare urmatoarele
notiuni:
- locus - este pozitia si „spatiul" ocupat de o gena in cromozom. In
celula somatica diploida, unde exista o pereche de cromozomi omologi,
cuplurile de gene alelice ocupa aceleasi locusuri in cromozomii respectivi.
- alela - este o varianta a unei gene realizata prin mutatie sau crossing-
over inegal, ocupand acelasi locus ca si gena normala. Doua alele nu pot
coexista pe acelasi locus;
- homozigot - starea in care locusurile omoloage sunt ocupate de alele
identice;
- heterozigot - cand locusurile omoloage sunt ocupate de alele
neidentice;
- dominanta - este gena care exprima fenotipic caracterul atat in starea
homozigota (doza dubla), cat si in starea heterozigota (doza unica);

253
 - recesiva - este gena care asigura exprimarea fenotipica a caracterului
uman in stare homozigota, iar in prezenta genei dominante este
nonfunctionala, sau anemic functionala, fara a se exprima caracterul.

1.1.1. Relatiile de dominanta - recesivitate

Notiunea de dominanta - recesivitate devine evidenta la eucariotele
superioare sexuate, cand se incruciseaza doi indivizi de sexe diferite si care
au gene diferite pentru acelasi caracter.
De exemplu sa presupunem cuplul de alele „A" si „a". Subiectul
heterozigot A/a, la prima vedere, prezinta un fenotip identic cu eel homozigot
A/A. In aceste conditii, alela A este dominanta „prevalenta", pe cand alela
„a" este recesiva „latenta".
Conditiile ca o alela sa fie dominanta sau recesiva sunt urmatoarele:
alela este dominanta cand, in doza unica, este capabila sa
sintetizeze o cantitate suficienta de proteina „activa", care sa
asigure functiile celulei sau organismului; alela este recesiva
atunci cand induce sinteza unei biomolecule „nula functional",
care nu intra in „concurenta" cu proteina „activa" in nici o reactie
in care aceasta ar fi implicata.
La eucariotele superioare normale, alela dominanta este frecvent
prezenta la indivizii speciei care traiesc in conditii naturale, fiind denumita si
alela salbatica (+).
Alela recesiva, ca produs al mutatiei, este de regula eliminata prin
selectie naturala, mentinandu-se in concentratie crescuta numai in
populatiile consanguine, sau cele conservate artificial (notate cu -).
In general, genele mutante corespund recesivilor „letale",
„semiletale" sau fara efecte fenotipice. Si anume in stare homozigota genele
mutante nu permit dezvoltarea , sunt letale, iar in stare heterozigota se mentin
in genotipul hibrizilor, asigurandu-se dispersia lor in genofondul populatiei.
Nu intotdeauna alela dominanta isi mentine absolut, aceasta trasatura.
Acest lucru se poate observa daca sunt folosite tehnici de finete, prin care pot
fi identificate mici diferentieri a caracterului determinat de gena dominanta
la indivizii heterozigoti in comparatie cu cei homozigoti.
Aceasta diferentiere fenotipica poate fi explicata astel si anume, ca o
gena dominanta in starea heterozigota (doza unica) nu intotdeauna este
suficienta prin activitatea sa codanta pentru a asigura in „totalitate" functia
de exprimare fenotipica a caracterului.

254
 Acest aspect il putem consemna la om cand, o gena mutanta
dominanta in stare heterozigota, al carei grad de exprimare fenotipica a
displaziei somatice este diferit in raport cu homozigotul dominant mutant (la
acesta, morfodisplazia este mult mai severa).
De exemplu, Mohr si Wriedt au studiat un cuplu cosangvin, la care cei
doi genitori (el si ea) erau purtatori de brachidactilie moderata. Acest cuplu a
dat nastere la un copil la care lipseau degetele din regiunea palmara si
plantara insotite de multiple malformatii scheletice, determinand moartea la
un an dupa nastere. Cei doi cercetatori au considerat ca genitorii erau
heterozigoti, continand fiecare gena dominanta mutanta (cu efecte semiletale)
iar copilul nascut era homozigot dominant mutant, iar efectul a fost letal la
copil, deoarece in aceasta formula dominanta exprimarea fenotipica
determinata de genele mutante a fost cu expresivitate completa (100%).
Uneori intre cuplurile alelice, sunt raporturi de codominanta (a se
vedea lucrarile practice)

1.1.1.1 .Dificultatile si exceptiile de la leg He dominantei si

recesivitatii

Analiza caracterelor monogenice, dominante sau recesive, au

evidentiat unele dificultati de interpretare si abatere de la legile ereditatii
dominante si recesive. Sunt mai multi factori de "eroare" ce intervin in
interpretarea caracterelor dominante sau recesive.
a)- Dificultati statistice
Studiile genetice de respectare a legilor mendeliene de segregare a
caracterelor mogenice (monofactoriale) stabilesc ca raportul de segregare a
unui caracter dominant este de XA - V% daca unul din genitori este heterozigot
(Aa) (fig.65) sau de 3A - lA cand ambii genitori sunt heterozigozi (A-a)
(fig.65).

255
 A a aa
H■H
f M .
''■•

A a Aa

A a a a
T t T t
A a A a
*Y i6
1
Aa aa ff 0f f f
Aa aa
rr ?f
AA_______Aa______Aa . v aa .

50% (1/2) 50% (1/2) 75%(3/4) 25%(1/4)

Ereditate dominanta
F.reditare recesiva

A - gena dominanta a -••

gena ret*siva

Fig. 65 Ereditatea autozomal dominanta si recesiva

Aceste raporturi de segregare sunt respectate in cazul cand este

analizata o populatie (cazul izolatelor umane) sau sunt studiate un numar
mare de familii cu descendenta numeroasa.
Dar asemenea raporturi de segregare nu sunt respectate in totdeauna in
genetica medicala deoarece numarul familiilor studiate (pentru acelasi
caracter) este mic, sau numarul indivizilor studiati dintr-o populatie
1R
panmictica este mic.
Dificultate in stabilirea caracterului - dominant sau recesiv (transmis
genetic) este si situatia cand ancheta medico -genetica se adreseaza exclusiv
la copiii aparent sanatosi din familie. Dar corecta analiza genetica impune
folosirea sondelor genice pentru a stabili starea de heterozigot a purtatorilor
(in special) de gena recesiva.
b) Exceptii de la legile ereditatii dominante.
Studiile efectuate pana in prezent au identificat exceptii de
nerespectare si interpretare incorecta a legilor ereditatii dominante si recesive.

18
Populatia panmictica - p^pulatia la care incrucisarea intre indivizi este
aleatorie (nu selectiva), fara neomutatii, fara casatorii consanguine.

256
 De la legile ereditatii dominante sunt considerate urmatoarele
exceptii:
i) Penetranta. In mod normal, caracterul autozomal dominant trebuie
sa fie exprimat fenotipic la fiecare generatie ce succede (deoarece caracterul
dominant este exprimat in stare homozigota AA si heterozigota Aa).
Sunt unele caractere dominante care, la nivel familial, se manifesta
saltatoriu. Acest proces poate fi explicat astfel:
Sunt gene dominante cu penetranta variabila. Penetranta poate fi
completa (totala) sau incompleta (la care manifestarea fenotipica a
caracterului dominant este si saltatorie).
Penetranta completa sau incompleta se apreciaza in raport de prezenta
caracterului exprimat fenotipic. Sa urmarim urmatorul exemplu, teoretic:
- daca o familie formata din 10 membri prezinta aceiasi caracter,
penetranta este de 100%(p completa);
- daca respectivul caracter este prezent la 8 din cei 10 membrii,
penetranta este de 80%(p incompleta), s.a.m.d.
Ca urmare, penetranta este un concept statistic deflnit prin frecventa
exprimarii fenotipice a unui caracter determinat de gena dominanta in starea
heterozigota.
Pentru gena dominanta penetranta poate fi determinata de constitutia
genotipica a indivizilor, de mediul "intern" - epistazia sau influentata de
mediul "extern" peristazia19, fie de interferenta ambilor factori - epistazia +
peristazia.
ii) Expresivitatea. Si expresivitatea este un factor ca exceptie de la
legile dominaiitei. Expresivitatea poate fi conditionata de modul de viata al
individului (alimentatia), dar si de alti factori. De exemplu:
- un factor peristatic poate actiona la distanta asupra expresivitatii
unei gene (vezi epistazia);
- varsta si sexul imprima expresivitati marcate a caracterelor
ereditare (de exemplu: guta, calvitia, hemocromatoza, etc).

c) Exceptii de la legile ereditatii recesive.

Exceptiile de la legile ereditatii recesive sunt: expresivitatea variabila
a unui caracter recesiv care este conditionata de aceiasi factori ca cei care
intervin in ereditatea dominanta: epistazia, peristazia. Deasemenea,

19
Peristazia - totalitatea factorilor din mediul exterior care pot influenta
expresia fenotipica a genelor.
257
pleiotropia unei gene poate determina trasaturi fenotipice variabile, precum si la
cuplurile de genitori consanguini.
S-a mai constatat ca raportul de segregare a unui caracter autozomal recesiv,
uneori, depaseste valoarea de lA (conform legilor mendeliene).
Aceasta remarca este rezultatul studiului statistic realizat in fratiile care au
numai copii, fenotipic, normali.

1.1.2.Gene (alele) cu efect letal

Lints (1981) considera ca printre cauzele responsabile de modificarea
raporturilor mendeliene este letalitatea indusa de gena mutanta, sau reducerea
viabilitatii anumitor genotipuri.
Se considera gene letale cand in stare homozigota, indue dereglari morfo-
structural-functionale, severe, neviabile eliminand respectivii indivizi din
populatie. Efectele letale si eliminarea indivizilor din familie, din populatie, pot
avea loc:
- prenatal: - ducand la avortul spontan;
- postnatal: - inainte de varsta pubertatii si reproducerii;
- sau prin inducerea infertilitatii si incapacitatatea de reproducere a
indivizilor tarati.

Exemplu de efect letal al genei mutante este morfo-displazia labio-

palatoschizis (buza de iepure, gura de lup). Investigatiile genetice asupra acestei
morfodisplazii au evidentiat ca unele forme pe fond genetic viabile sunt din punct
de vedere constitutional la indivizii heterozigoti. In stare homozigota efectele
acestei gene mutante sunt letale.

1.1.3.Gene (alele) semiletale.Gena Rhesus la om20

Efectul semiletal indus de o gena poate fi exemplificat prin analiza

sistemului genetic eritrocitar Rh. La om, barbatii sau femeile pot avea Rh+ sau
Rh-. Persoanele Rh+ (caracter determinat de gena dominanta D) pot fi homozigote
D/D sau lieterozigote D/d, iar persoanele Rh- (care au gena recesiva d) pot fi d/d,
homozigote recesive.

Rh este gena responsabila de producerea unui antigen numit Rhesus, care se gaseste si in
sange la Macaca mulata (Maimuta Rhesus).

258
 Persoanele cu gena dominanta D, elaboreaza un antigen, fiind Rh+.
Cele care sunt homozigote recesive sunt lipsite de antigen si sunt Rh-.
Antigenul este substanta (molecula, celula, tesut) care, introdusa in
organismul omului (sau la orice alt mamifer), induce formarea de anticorpi
specifici antigenului.
Indivizii Rh+ (genotip D/d sau D/D) la care gena D este dominanta au
in organism antigenul Rh+. Indivizii homozigoti recesivi d/d Rh -, desi nu au
antigen in organism au capacitatea de a elabora anticorpi anti Rh-.
Sa presupunem ca doi genitori: sotul D/D homozigot Rh+, sotia d/d
homozigot pentru Rh- realizeaza un act de conceptie.Produsul de conceptie va
fi obligatoriu heterozigot D/d, deci Rli+.
Produsul de conceptie, spre sfarsitul perioadei fetale, incepe sa
elaboreze antigenul Rh+, conform constitutiei sale genetice. Antigenul Rh+
de la fat poate traversa placenta, sau prin circulatie fetala, trecand in
organismul matern gestant. Cum mama fiind Rh- si lipsita de antigen, in
prezenta antigenului Rh+ va incepe elaborarea de anticorpi anti Rh.
Elaborarea anticorpilor Rh poate duce la urmatoarele accidente:
- pe perioada fetala a sarcinii, mama trimite spre fat anticorpi anti-
Rh+ in sangele viitorului copil. Fatul, avand antigenul Rh+, va declansa o
reactie anigen-anticorp, inducand o anemie hemolitica, care uneori, poate
duce la moartea nou-nascutului;
- antigenului Rh+ al fatului, trecand in organismul matern , care
elaborand anticorpi anti - Rh+, poate declansa reactia antigen-anticorp la
mama, determinand un proces de izoaglutinare;
- cand o femeie sau un barbat sunt Rh- si au anticorpi anti Rh+, in
cazul unei transfuzii de la o persoana Rh+ apar reactii de incompatibilitati de
Rh. Sunt accidentele de transfuzie. In exemplul nostra, gena d (recesiva), in
stare homozigota are efect semiletal.

1.2. Relatii (raporturi) intre genele nealelice

Un caracter, analizat la nivelul organismului ca imitate biologica,

poate fi conditionat fenotipic de influenta altor gene nealelice, dar prezente in
genomul celular, ca gene diferite.
Un aspect al relatiilor intre cupluri de gene nealelice (gene diferite
informational), dar implicate in definirea unui caracter, este epistazia.

259
1.2.1. Epistazia

Termen introdus de Bateson (1905 si 1909), epistazia este

"interactiunea genica in care o gena dominanta sau recesiva, influenteaza
functia de determinism genetic, in exprimarea fenotipica a unui caracter dat
de gene nealelice" dominante sau recesive.
In relatiile de epistazie, cand ambele tipuri de gene nealelice sunt
prezente in genotip, fenotipul unui caracter depinde, efectiv de una din gene.
Genele "modificatoare" sunt numite epistatice, iar genele a caror
exprimare fenotipica este influentata (fiind non-functionale genetic) de gena
nealelica, sunt numite hipostatice.
Epistazia poate exista sub doua forme: epistazia genelor dominante
(gena dominanta fiind epistatica) si epistazia genelor recesive (gena recesiva,
ca gena epistatica, influenteaza activitatea genetica a genei dominante).
Un exemplu clasic de epistazie este fenotipul Bombay, ca sistem
genetic eritrocitar pentru grupa sanguina ABH(O). Acest sistem este
determinat genetic de doua cupluri de gene nealelice, care ocupa locusuri
diferite pe bratul scurt al cromozomului 9.

260
Fig. 66 EPISTAZIA

GENE
AUTOZOMALE

SEGREGARE
INDEPENDENTA

l
EPISTAZIE

FORME DE

ERORI SI/SAU
RAPORTSEGREG
ARE
MODIFICAT

261
 Locusul H poate fi ocupat de alela dominanta H, care in stare
homozigota (H/H) sau heterozigota (H/h), determina genetic sinteza
antigenului "de baza" H. Acest antigerTde baza" H este un precursor care
cupleaza o molecula de fucoza formand substanta H. Cuplarea este catalizata
de enzima fucoziltransferaza, enzima codificata de gena dominanta H.
Locusul H poate fi ocupat si de alela recesiva h, care in stare homozigota (h/h)
nu are capacitatea de a sintetiza enzima fucoziltransferaza.
Locusul I ocupat de alela A, alela B sau de alela recesiva "i". Alela A
si B sunt codominante.
Alelele IA si IB codifica sinteza unor transferaze specifice care intervin
in cuplarea unor molecule pe substante H ce constituie antigenele de grup
sanguin A sau B.
De exemplu, transferaza specifica, codificata de la IA, va fixa o
molecula de acetilgalactozamina, formand pe substanta H antigenul de grupa
A, iar alela IB, care codifica transferaza specifica, fixeaza pe substanta H o
molecula de galactoza (antigenul de grupa B).
Daca locusul I este ocupat de alela recesiva"i", in stare homozigota i/i
nu se sintetizeaza nici o enzima (transferaza), nu se modifica substanta H, iar
pe eritrocitele respectivului individ nu vom gasi antigenul A sau B, va fi de
grup 0(H).
Dar in situatia cand in locusul H gasim un cuplu alelic homozigot
recesiv h/h in organism nu se mai sintetizeaza substanta H. Lipsind substanta
H, chiar daca in locusul I avem genele dominante IA si IB, nu se formeaza
antigenul de grup A sau B.
Ca urmare alela recesiva h in stare homozigota h/h are rol epistatic
blocheaza "formarea antigenelor, iar alelele I si I care sunt dominante, sunt
gene hipostatice.
Relatia intre genele epistatice si hipostatice este cunoscuta sub
denumirea de fenotip Bombay , deoarece in acest oras indian s-a identificat o
familie in care femeia avea constitutia genetica h/h, IB/i, aparent grupa "O".
Casatorita, sotul avea constitutia genetica H/h, IA/i. Copilul rezultat din acest
cuplu a fost grupa AB.

262
2. Relatii gena - caracter - mediu

Plecand de la relatiile inter-genetice, s-a luat in consideratie ca unui

cuplu de alele cu locus unic pe cromozomi omologi, ii corespunde un efect
"precis", observabil la nivelul fenotipului prin intermediul unei proteine cu
structura si functii specifice.
Dar relatiile gene-caractere pentru eucariotele superioare ca evolutie
(respectiv omul) sunt mult mai complexe. De exemplu, in patologia genetica
transmisibila ereditar, in majoritatea sindroamelor este consemnat un foarte
"bogat" tablou simptomatologic, mult diversificat si sumativ.
In consecinta este greu sa acceptam ca diversificarea morfotipurilor
(normale sau patologice) sunt consecinta unei singure gene normale sau
mutante. Ca urmare studiile genetice au luat in analiza si au considerat
existenta mai multor raporturi si mecanisme genetice intre genotip - fenotip -
mediu, cum sunt pleiotropia, monogenia, polialelismul, poligenia (cu
interferente de raporturi de influenta cu factorii de mediu).

2.1. Pleiotropia

Cand o mutatie duce la aparitia unei gene cu efecte patologice asupra

organismului, este numita pleiotropa.
Ca definitie, prin pleiotropism intelegem cazul cand o gena recesiva,
si factorul proteic determinat genetic de respectiva gena, induce expresivitatea
fenotipica a doua sau mai multor caractere care sunt indisolubil "legate" prin
fenomenul de "cascada" si influenta genetica.
O gena dominanta sau recesiva respecta legile mendeliene de
segregare genotipica si expimare fenotipica a caracterului. Permite sa
apreciem, probabilistic, coeficientul de aparitie a unui caracter la descendenti.
Studiile clinice au evidentiat ca o gena mutanta (recesiva) poate
induce un complex clinic simptomatologie drept criteriu de diagnostic si
etiologic al unei boli. Complexul clinic indus de o gena recesiva mutanta,
poate fi o polidisplazie (un complex multiplu modificat morfo-structural-
anatomic), sau o disfunctie metabolica majora deregland activitatea
tesuturilor, organelor, activitatea celulara. (Figura 67)

263
 GENA MUTANTA RECESIVA CU INFLUENTA PLEIOTROPA

GENA PLEIOTROPA
(RECESIVA) MUTANTA

SINTEZA INDUCTOR SINTEZA UNEI

MORFOGENETIC ENZIME ANORMALA
MODIFICAT

DIFERENTIAZA IN CALE
CASCADA LA DISTANTA METABOLIC
A
SECUNDARA

INFLUENTA DISFUNCTIONALITATI PRODUSI

ALTOR GENE TISULARE/ORGANE SECUNDARI
TOXICI

Fig. 67 Pleiotropia

Grouchy, explica astfel efectul de pleiotropie a unei gene: "o gena

este pleiotropa daca enzima determinata de ea este activa pe un substrat
proteic situat in diverse locuri ale lantului energetic, sau daca enzima
intervine in reactii chimice unde comporta substraturi diferite. A lua in
considerare pleiotropia genelor, trebuie sa cercetam cum respectiva enzima
este activa (diferit) in diversele tipuri de celule si tesuturi (Grouchy). Acest

264
pleiotropism se explica mai bine prin multipotentialitatea unei enzime,
determinata de o gena, sa participe la sinteza directa a mai multor proteine
diferite, ca semantida tertiara, dar mentinandu-si specificitatea de substrat.
Dar, spune Grouchy, este putin probabil ca aceeasi gena, ca segment dintr-un
lant ADN, sa poata sintetiza doua produse proteice diferite " (citat de Tridon,
1966).
Termenul de "relatii pleiotropice" desemneaza situatiile cand o gena
inlocuita cu alela mutanta are repercursiuni fenotipice complexe, modificand
mai multe caractere, distincte, la nivelul organismului.
Acest proces este cauza multor manifestari ereditare normale sau
patologice, cum ar fi: longevitatea, aptitudinile intelectuale sau simptome si
semne clinice variate ce insotesc un sindrom genetic.
La organismele superioare, pleiotropia nu se limiteaza la nivelul
actiunii primare a genelor care, in toate cazurile, este sinteza unei molecule
proteice cu structura si functii strict specifice.
Pleiotropia rezulta din inlantuirea cauzala care leaga activitatea
primara a unei gene mutante "pleiotropa" de procesul de dezvoltare si
morfogeneza embrio-fetala in care este implicata, direct sau indirect,
respectiva gena.
De exemplu, Tuchmann-Duplessis (1972) descria celula embrionara
ca un sistem citologic complex, care detine intregul program genetic pentru
diferentiere.
Cand o celula s-a diferentiat, alte informatii din genotip sunt traduse
in proteine, in enzime, care pot forma lanturi metabolice pentru noi functii
celulare sau tisulare. Unele molecule proteice determinate de o gena, pot
deveni proteine inductor morfogenetic, particapand la diferentierea altor tipuri
de celule sau tesuturi. Consideram ca diferentierea este determinata de
substante inductoare de natura proteica.
Celula diferentiata devine inductoare prin proteina elaborata, devine
inductoare pentru diferentierea altor tipuri de celule, asupra carora proteina
inductor primar, poate influenta gene din respectivele celule (este posibil ca
proteina inductor primar sa fie proteina reglator sau represor asupra functiei
genelor). Este o inductie "in cascada" a carei secventa este riguros programata
genetic cu aparitia unui larg evantai de celule si/sau tesuturi-organe diferite.
Inducerea etapizata a procesului de diferentiere poate fi comparata cu teoria
gradientilor de crestere si diferentiere elaborata de Child.
Conform teoriei lui Child, consideram existenta unor relatii
interferentiale de functii intre gene diferite, interferente de influenta in timpul
proceselor de diferentiere. Fiecare etapa din "cascada" diferentierilor

265
tisulare (etapele reprezentand si organizatori morfogenetici cu potential
genetic primar, secundar, tertiar, etc.) este implicata in a finaliza dezvoltarea
completa a unui tesut, organ sau organism.
Dar, este suficient ca un singur inductor morfogenetic, dintr-o
"cascada" inductiva, sa fie modificat prin mutatia unei gene (ex. recesiva), ca
intregul lant ce urmeaza punctului unde s-a produs mutatia, sa urmeze o
diferentiere patologica.
Acelasi mecanism de interferente protein-enzime este si in dereglarea
proceselor metabolice.
Numai intr-o asemenea inlantuire se insereaza pleiotropia, cand,
schimbarea structurii unei substante active are repercursiuni variate in timpul
dezvoltarii ontogenetice.
Ca urmare, pleiotropia este capacitatea unei gene mutante de a
produce efecte multiple si "aparent" independente. Efectele sunt rezultatul
starii "inalt integrate" a metabolismului celular si dezvoltarii organismului.
In patologie gasim frecvent procesul de pleiotropism indus de gene
recesive mutante, retinand pentru exemplificare urmatoarele:
- sindromul Laurence-Moon-Biedl la care gena are efect pleiotropic,
boala caracterizandu-se prin: obezitate, retinita pigmentara, polidactilie,
cretinism;
- sindromul Holt-Oram prezinta aplazia policelui si comunicare
interventriculara;
- sindromul Hcdlerman-Streiff-Francois- cu dizarmonie cranio-
faciala (fata mica, nas subtire, efilat), anomalii dentare, nanism proportionat
si armonios, hipertricoza si atrofie cutanata, microoftalmie, cataracta,etc.
- sindromul Rubinstein-Taybi in care sunt asociate malformatii de
tipul: falanga terminala la police si haluce cu aspect de paleta, microcefalie,
nas acvilin, cataracta, epicanthus, anoftalmie, atrofie optica, deficienta
mentala;
- sindromul Meckel. Gena mutanta in stare homozigota induce o
asociere de malformatii si anume: polidactilie, rinichi polichistic, meningocel
occipital etc.

2.2. Raporturi de monohibridare si de dihibridare

Mendel (1866) a fost primul genetician care a folosit metoda
incrucisarii si hibridarea la organisme "simple" care se deosebesc intre ele
printr-un caracter unic sau un numar mic de caractere bine delimitate si usor
de reperat. Pentru aceasta a selectat parentali - „linie pura" din populatie
homozigoti pentru caracterele cercetate.

266
 Mendel a incrucisat organisme care se deosebeau printr-un
singur caracter (monohidrare), prin doua caractere (dihibridare), sau prin
mai multe caractere (polihidrare).
Rezultatele obtinute i-au permis sa stabileasca legile
fundamentale ale geneticii - legile segregarii caracterelor la descendenti.
Aceste legi, au caracter de generalitate la organismele cu reproducerea
sexuata, atat pentru caracterele normale, cat si pentru cele patologice.

2.2.1. Legile lui Mendel

Mendel enunta urmatoarele legi sau reguli de transmitere si
segregare a caracterelor:
a) uniformitatea hibrizilor primei .generatii (Fi)
Enuntul legii este urmatorul: "daca este o incrucisare intre doi
indivizi care difera printr-un singur caracter (monohibridare), hibrizii
primei generatii (filiatia Fi) sunt asemanatori intre ei". Fenotipul va fi
asemanator cu al genitorului care este homozigot dominant, dar genetic
heterozigoti la nivelul cuplului alelic (Aa) (fig. 68).
b)Segregarea hibrizilor in generatia F?
Mendel a observat ca in F2 apar indivizi care au fenotipul
asemanator cu al genitorilor din Fi, dar si indivizi care, in procente
"fixe", prezinta fenotipul parentalilor incrucisati initial. Pe baza acestei
observatii a presupus ca fiecare trasatura de caracter este determinate de
o pereche de "factori" ereditari sau gene alele (termen folosit in prezent).
Genele alele se vor separa in meioza genitorilor, segrega, iar prin
fecundatie cele doua alele se vor reintalni refacand cuplul alelomorf.
Deoarece in F2 apare fenomenul de segregare a caracterelor, in
raport de 3:1 cand sunt alele-dominante recesive sau 1:2:1 cand sunt
codominante, se confirma urmatoarele: indivizii parentali (P) sunt
homozigoti A/A si a/a. Din punct de vedere genetic sunt puri pentru
cuplul alelornorf.
Gametii haploizi elaborati de fiecare parental homozigot, vor
contine numai cate un singur factor ereditar, o singura alela. Prin
fecundare, hibrizii F] primind cate o alela de la fiecare parental vor fi
100% heterozigoti Aa. Cand din cuplurile alelice AA si aa ale
parentalilor, rezulta hibrizi Aa, iar fenotipic este exprimat caracterul (A),
inseamna ca alela "A" este dominanta iar alela "a" recesiva.

267
 INTERACTIUNI GENIC'E -
DfflBRIDAREA

Segregate nomiala

O
GO

CODOMINANTA
LINKAGE FAC'TORI EPIGENETK'I PENETRANTA REDUSA
GENIC ENDOGENI/EXOGENI

cand Poate zi

MODIFICA 0 GENA INFLUENTATA DE

INFLUENTEAZA AMBELE ALELE
RAPORTUL BLOCHEAZA EPLSTAZIE SAU EXPRIMA
DE EXPRESI\TTATEA
ACTIVITATEA DE FACTORI DE TRASATURILE DE
SEGREGARE GENEI
ALTEI GENE MEDIU CARACTER

Fig. 68 Dihibndarea
 In cazul cand avem doi parentali, fiecare cu un cuplu alelic dominant
pentru acelasi caracter A1A1 si A2A2, vor rezulta hibrizi A1A2 (heterozigoti)
ce vor prezenta fenotipic si trasatura de caracter determinate de alela Ai, cat
si cea determinate de alela A2. In astfel de situatii consideram ca alelele A] si
A2 sunt codominante.
Incrucisandu-se genitori hibrizi din Fi - A/a x A/a, heterozigoti,
descendentii lor, care, in raport cu parentalii reprezinta generatia F2, vor
prezenta trasaturi fenotipice distincte: 75% vor prezenta caracterul dominant
A (asemanator parentalului homozigot dominant A/A) dar si al genitorului
hibrid Fi heterozigot A/a, iar 25% descendenti cu fenotipul recesiv "a"
(asemanator cu al parentalului homozigot recesiv a/a). Va rezulta un raport de
segregare valoric de 75/25%, respectiv un raport de segregare 3:1.
Dar descendentii F2 cu trasatura de caracter dominanta A, nu sunt
uniformi din punct de vedere genotipic. Verificarea a fost demonstrate prin
analiza descendentului F3 rezultati prin reincrucisarea parentalilor a/a cu
hibrizii F2. Rezultatele sunt urmatoarele: hibrizii F2 au constitutia genetica in
urmatoarele raporturi: 25% sunt homozigoti dominanti A/A, 25% homozigoti
recesivi a/a si 50% heterozigoti A/a. Cum alela A este dominanta, caracterul
fenotipic determinat de aceasta alela se va exprima atat in stare homozigota
A/A, cat si in starea heterozigota A/a, iar caracterul recesiv "a" se va exprima
numai in stare homozigota a/a.
In cazul alelelor codominante, incrucisandu-se doi hibrizi heterozigoti,
fiecare A1/A2 (A1A2 x A1A2) in Fi se vor obtine raporturile: 25% homozigoti
A1A1, 25% homozigoti A2A2 §i 50% homozigoti A1A2, iar raportul de
segregare va fi 1:2:1 .
O remarca: in cuplul alelic dominant/recesiv A si a, in starea lor
heterozigota A/a nu este corespondenta intre genotip, care este Aa si fenotip,
manifestat caracterul dominat de alela dominanta.
O analiza neavizata ar considera ca alela recesiva "a" ar fi eliminate
din genotipul hibrizilor Fi.
In realitate, ea exista in genotip, dar este "mascata" de alela
dominanta. Caracterul recesiv apare numai cand se reintalnesc doi
heterozigoti purtatori cu acelasi tip de alela recesiva rezultand ca probabilitate
de 25%, homozigoti a/a.
Exceptie de la aceasta regula este epistazia. Aceasta remarca ajuta sa
intelegem corect transmiterea bolilor autozomal recesive.
c) Segregarea independents a caracterelor sau legea asortarii
independente.

269
 Aceasta lege a fost stabilita prin analiza dihibridarii, respectiv segregarea a doua caractere diferite, determinate de
cupluri nealelice (gene diferite) ce au locusuri pe cromozomi neomologi. Legea segregarii independente a caracterelor
demonstreaza ca genele diferite cu locusuri pe cromozomi diferiti (neomologi), nu sunt inlantuite (linkage genie), vor
segrega si asorta independent. Aceasta lege, sau legea numerelor mari, a fost analizata matematic de catre Hardy si Weinberg
la studiul genetic al poputiilor panmictice. Raportul constant de segregare este respectat in urmatoarele circumstante:
incrucisarea indivizilor sa fie aleatorie, in populatie, nu selectiva, in respectiva populatie sa nu apara mutatie la genele
analizate, sa nu existe emigrari, imigrari, fara consanguinitate a cuplurilor de genitori, factori care modifica raportul valoric
al segregarii caracterelor (fig. 69).
 270
Fin 69 INTERACTRTNI GENICE

-J AMBELE
OGENA ALELE
BLOCHEAZA EXPRMAT
EXPRESIACELEI E
DE-ADOUAGENE

INCOMPLETASAU
C0D0M1NANTA
DATORITA
EPISTAZIEI
SAUMEDIU
LUI

FARA
REGREGARE MASCULII SE
INDEPENBENTA DIFERENTIAZA
DE FEMELE
2.2.2. Tipuri de trasnmitere mendeliana a caracterelor
monofactoriale la om

Legile mendeliene, datorita caracterului de universalitate bio-

genetica, sunt aplicate si verificate §i la om.
Aplicarea legilor mendeliene la om intampina unele dificultati de
interpretare cauzate de:
- daca la plante si animale interpretarea §i stabilirea raportului de
segregare incepe de la cuplu parental homozigoti (dominat si recesiv), la
specia umana nu este conceput, experimental, a se efectua "incrucisari"
consanguine pentru a se obtine linie "pura";
- la om, pentru edificarea unui caracter participa mai multe sisteme,
motiv pentru care urmarirea legilor care guvemeaza transmiterea caracterelor
ereditare este dificila;
- numarul mic de descendenti si de generatii ce pot fi analizate,
plecandu-se de la cuplul parental.
Pentru a studia legile mendeliene la om, se impune a studia sisteme
relativ simple, controlate monofactorial, de un cuplu alelic.
Studiul transmiterii mendeliene impune cercetarea sistematica a unei
boli la nivel familial pe generatiile ce succed, la descendentii rezultafi pe
fiecare generatie, atat pe filiate directa, cat si la heredocolaterali.
Conform raportului "gena-caracter" la om sunt caractere care segrega
mendelian. Raportui de segregare si exprimarea fenotipica a caracterelor sunt
condifionate de: raportui de functionalitate genetica existent intre genele
alele, de numarul cuplurilor de alele examinate, de locusul alelelor pe
cromozomi: autozomi sau pe cromozomii sexuali.
La om sunt analizate urmatoarele tipuri de trasmitere a caracterelor:
ereditatea monogenica (monofactoriala) si ereditatea poligenica
(multifactoriala).

2.2.3. Transmiterea autozomal dominanta

Sistemul Rhesus (Rh) este determinat de trei cupluri de gene

inlantuite pe bratul q al cromnozomilor perechi 1: CDE - dominante, cde
-recesive.

272
 Contrar acestui complex de gene nealelice, indivizii in populatii se
grupeaza in doua clase: Rh+ in proportie de circa 86% si Rh- 16%. Antigenul
"D" care da caracterul de Rh+ este determinat genetic de alela D (indivizii
putand fi D/D - homozigoti dominant sau D/d heterozigoti).
Caracterul de Rh- este determinat genetic de alela "d", dar numai in
stare homozigota. Sistemul Rh limitat numai la cuplul alelic D/d poate fi
considerat (aparent) un caracter "mendelian simplu" monofactorial.
Pentru a demonstra transmiterea autozomala "pentru comoditatea
exemplului", sa admitem ca locusul genei pentru Rh ar fi ocupat de un singur
tip de gena: D alela dominanta, "d" alela recesiva. Sa consideram o incrucisare
Tntre un barbat

Generatia parentala D/D(? D D

d/d $
D Dd Dd
Generatia FI
(descendentii primei generatii) A Dd Dd

Rh+, homozigot dominant D/D si o femeie Rh- homozigota recesiva

d/d. din acest cuplu toti descendentii vor fi genetic heterozigoti D/d, dar
fenotipic vor fi Rh+. Pentru aceasta prima generatie, consemnam
noncorespondenta intre genotip si fenotip. Toti descendentii ce vor rezulta
dintr-un cuplu parental homozigoti D/D si d/d, vor fi Rh+, oferind falsa
imagine ca acesti descendenti ar fi mostenit numai gena D. cum gena "d" este
recesiva, in prezenta genei dominante "D" nu-si exercita functia de
determinism genetic.
Daca indivizii FI heterozigoti (D/d) se incruciseaza intre ei, in
gametogeneza lor, se vor obtine in meioza 50% gameti cu alela dominanta D
si 50% cu alela recesiva d.

Genitori din FI c?Dd D d

$Dd
Generatia F2 D DD Dd
(descendentii generatiei a doua)
D Dd dd

Descendentii rezultati din cuplul heterozigot D/d, prezinta urmatoarele

posibilitati de combinare genetica si segregare fenotipica:
Constitutia genetica a fiecami descendent prezinta urmatoarele
probabilitati de combinare a gametilor si constituire a zigotului, din care

273
potential, se va dezvolta: 25% homozigot dominant D/D, 50% heterozigot
D/d si 25%) homozigoti recesivi d/d. cum gena dominanta D determina
caracterul in stare homozigota D/D si heterozigota D/d, inseamna ca
probabilitatea ca un descendent sa prezinte exprimat fenotipic starea de Rh+
va fi de 75%o, iar cea de Rh- de 25%>, procent care reprezinta probabilitatea
ca zigotul sa fie homozigot recesiv d/d. daca starea de Rh+ va fi de 75% in
F2, iar cea de Rh- de 25%o. Prin simplificare se obtine un raport de segregare
de 3:1, cand urmarim un caracter determinat de o gena dominanta normala sau
patologica.
Respectand acelasi rationament si cuplare aleatorie intre indivizii
conspecifici in populatie se pot realiza §ase variante de cupluri (casatorii) si
anume:

Cupluri de genitori Descendenti posibili

l)D/DxD/D - Toti descendentii vor fi Rh+ homozigoti
(D/D);
2) D/D x D/d - Toti descendentii vor fi Rh+, dar 50% vor fi
homozigoti D/D, 50%> heterozigoti D/d.
3) D/D x d/d - Toti descendentii vor fi Rh+, dar heterozigoti
D/d.
4) D/d x D/d - 75%) descendenti pot fi Rh+, iar 25% Rh-dintre
care 25% D/D, 25%o d/d si 50% D/d -constitute
genetica.
5) D/d x d/d - 50%o descendenti Rh+ si 50%o Rh-. Dar vor fi
heterozigoti D/d pt.Rh+ si homozigoti d/d pt.
Rh-.
6) d/d x d/d - Toti descendentii vor fi Rh- si homozigoti
d/d.'

Caracterele monofactoriale (sistemele moleculare episemantice:

sistemele genetice eritrocitare si plasmatice, molecule specifice active,
protein-enzime etc.) respecta acest model de segregare si combinare
independenta a caracterelor la indivizii din populatie, cu exceptia
fenomenului de epistazie genica.
Aceleasi raporturi de segregare si combinare independenta pot fi
consemnate in transmiterea unor boli autozomal dominante. De exemplu,
acondroplazia, absenta incisivilor laterali, acro-osteoliza, brachi, dactilie
colaboni retinian, polidactilia, etc.

274
 in tabelul urmator vom prezenta riscul de transmitere si aparitie a
acondroplaziei la descendenti, notandu-se cu "A" gena dominanta pentru
acondroplazie, si cu "a" gena recesiva "normala".

Genotipul Gameti Descendentii

parental genotipuri Fenotipuri
l.A/AxA/A (A) x (A) A/A Toti bolnavi.
2.A/A x A/a (A) x (A sau a) Vi A/A; Vi A/a Toti bolnavi.
3.A/A x a/a (A) x (a) A/a Toti bolnavi.
4. A/a x A/a (A sau a) x (A sau a) VA A/A; 2/4 A/a; '/4 VA bolnavi, VA
a/a normali
(sanatosi)
5.A/a x a/a (A sau a) x (a) !/2 Aa, '/2 a/a Vi bolnavi, V2
sanatosi
6.a/a x a/a (a) x (a) a/a Toti sanatosi.

Criteriile de interpretare a unui pedigree (arbore genealogic) familial

pentru caracterele normale sau patologice si stabilirea ca se transmit
autozomal dominant:
- caracterul se manifesta in egala masura la ambele sexe. Uneori sunt
si factori "secundari" ce pot influenta frecventa si expresivitatea caracterului,
modificand raportul "sex ratio";
- caracterul se manifesta si in starea de heterozigot a subiectului.
Pentru o boala cu transmitere autozomal dominanta, starea de homozigot
induce efecte severe, incat produsul de conceptie devine neviabil inca din
perioada embrio-fetala aerstat spontan (neviabil);
- nasterea unui copil cu caracterul dominant (normal sau patologic),
necesita ca eel putin unul din parinti sa prezinte caracterul iar genotipic sa fie
heterozigot sau homozigot;
- cand un parental este heterozigot, riscul sau sansa de a naste copil cu
respectivul caracter determinat de gena dominanta va fi de " (50%). Abated de
la aceasta regula apar in cazurile de epistazie;
- caracterul autozomal dominant se transmite pe filiatie directa
(bunici—^parinti —->copii —mepoti ...), pe verticala.

275
2.2.4. - Transmiterea autozomal recesiva

Caracterul determinat genetic de o gena recesiva, se exprima fenotipic

numai la subiectii homozigoti. In stare heterozigot, gena recesiva, in prezenta
alelei dominante este "inactiva", este mascata.
Pentru a demonstra transmiterea si raportul de segregare a unui
caracter determinat genetic de gena recesiva, vom folosi sistemul genetic
plasmatic de secretor (Se) si nesecretor (se).
Din punct de vedere genetic, gena pentru secretor este dominanta
(Se), iar pentru nesecretor este recesiva (se).
In populatie indivizii pot prezenta, drept constitute genetica, unul din
cuplurile alelice: Se/Se homozigoti dominanti, se/se homozigoti recesivi si
Se/se heterozigoti.
In tabelul urmator expunem ca probabilitate, urmatoarele cupluri de
genitori:

Genotipul Gameti Descendentii

parental Genotipuri Fenotipuri
1. se/se x se/se (se) x (se) se/se Toti nesecretori
2. se/se x Se/se (se) x (Se sau Vz se/se si Vz Vi necesretori, XA
se) Se/se secretori
3. Se/se x Se/se (Se sau se) x (Se VA se/se; XA l
A nesecretori; lA
sau se) Se/se, 2/4 Se/se secretori, 2/4
secretori
4. se/se x Se/se (se) x (Se) Se/se Toti secretori
5. Se/se x Se/Se (Se sau se) x Vi Se/se, Vi Toti secretori
(Se) ' Se/Se
6. Se/Se x Se/Se (Se) x (Se) Se/Se Toti secretori

In populatiile umane sunt identificate multe caractere normale cu

transmitere autozomal recesive, dar §i foarte multe boli.
Boli cu transmitere autozomal recesive pot fi urmatoarele (cateva
exemple): oligofrenia fenil piruvica (fenilcetonuria), siclemia, tatasemia
majora, acatalazemia, alcaptomenia, mucoviscidioza, albinismul, etc.
Criteriile de analiza si interpretare a unui pedigree (arbore genealogic)
pentru a stabili ca un caracter (normal sau patologic) es+e transmis si
determinat genetic de gena autozomal recesiva, sunt urmatoarele:
- caracterul se manifests in egala masura la ambele sexe;

276
 - indivizii heterozigoti, purtatori in genotip de gena recesiva sunt
lipsiti de caracterul recesiv, deoarece gena recesiva, in prezenta alelei
dominante, este inactiva, mascata;
- nasterea unui copil care sa prezinte caracterul autozomal recesiv (m
stare homozigota) este posibila daca ambii parentali sunt heterozigoti,
purtatori de gena recesiva, probabilitatea de a naste copil cu caracterul recesiv
este E (25%);
In casatoriile consanguine, caracterul autozomal recesiv are o
frecventa mai mare.

2.2.5 - Transmiterea autozomal codominanta

Cand doua alele, cu acelasi locus pe cromozomi omologi, sunt

dominante, cand se combina prin fecundare, rezultand cupiul alelelor
codominante, fiecare isi exercita functia de determinism genetic, exprimandu-
se fenotipic, caracterul va fi nuantat identificand trasaturile de caracter
corespunzator fiecarei alele din cupiul alelomorf.
Pentru demonstratie ne vom folosi de sistemul genetic plasmatic al
haptoglobulinelor (Hp). Genele codominante care determina acest sistem
sunt: gena dominanta Hpl pentru tipul de Hpl si gena dominant! Hp2 pentru
Hp2.

277
 in populatie sunt posibile urmatoarele cupluri parentali:

Genotipul Gametii Descendentii

parental genotipuri Fenotipuri
l.Hpl/Hpl x (Hpl)x(Hpl) Hpl/Hl Toti cu haptoglobin^
Hpl/Hpl Hpl
2. Hpl/Hpl x (Hpl)x(Hpl sau Hpl/Hpl sau i/icuHpl !/2cuHp
Hpl/Hp2 Hp2) Hpl/Hp2 l-Hp2
3. Hpl/Hpl x (Hpl) x (Hp2) Hpl/Hp2 Toti cuHpl-Hp2
Hp2/Hp2 (heterozigoti)
4. Hpl/Hp2x (Hpl sau Hp2) x l
A Hpl/Hpl X
A vor avea Hpl-
Hpl/Hp2 (Hpl sauHp2) !/4 Hp2/Hp2 Hpl lA vor avea
2/4 Hpl/Hp2 Hp2-
Hp2 2/4 vor avea
Hpl-
Hp2
5.Hpl/Hp2x (Hpl sau Hp2) x 1
/2Hpl/Hp2 Yi Vi vor avea Hpl-
Hp2/Hp2 (Hp2) Hp2/Hp2 Hp2 Vi vor avea
Hp2~
Hp2
6. Hp2/Hp2 x (Hp2) x (Hp2) Hp2/Hp2 Toti cu Hp2-Hp2 .
Hp2/Hp2

2.2.6.- Ereditatea legata de cromozomii sexuali

La mamifere si omul actual, cele doua sexe se diferentiaza genetic

prin cuplul de cromozomi sexuali x si y.
Sexul feminin are doi cromozomi x(xx): un cromozom x este de
origine paterna, al doilea de origine materna, cuplu care se stabileste prin
procesul de fecundare a gametilor si formarea zigotului diploid.
La sexul masculin intre cromozomii sexuali X si Y se remarca o
accentuata neurologie morfologica, dimensional^, si functionala.
Lyon (1962), plecand de la aceste diferente a cuplurilor de
cromozomi sexuali la cele doua sexe, si consemnand diferente si in
activitatea genetica intre cromozomul X si Y, a studiat comportamentul
cromozomilor X la femeie unde avem un cuplu XX, in raport cu sexul
masculin care are un singur cromozom X, al doilea fiind Y.

278
 Observatiile lui Lyon sunt urmatoarele: pentru a se mentine, valoric,
un echilibru constant genetic si fenotipic a caracterele determinate de genele
cu locusuri pe cromozomii X intre cele doua sexe, la sexul feminin, in
celulele somatice (m interfaza) un cromozom X este inactivat, identificat ca o
formatiune corpusculara (1,5-2 p diametru) intens heterocromatic. Prin aceasta
inactivare se asigura un echilibru intre genele X-linkage de pe cromozomul
X la sexul masculin si cromozomul X neinactivat de la sexul feminin.
Alte observatii facute de Lyon sunt urmatoarele:
a) - Inactivarea cromozomului X matern sau X-ul patern in celula
somatica la femeie este aleatorie. Unul va fi inactivat. Dar, dupa inactivare,
acel cromozom X inactivat, matern sau patern, va fi inactivat in toate
generatiile celulare ce succed din respectiva celula.
b) - Inactivarea cromozomului X nu este realizata in totalitate.
Exceptie de la acest proces face segmentul distal al bratului p a
cromozomului X. Genele X-linkage din acest segment cromatidic nefiind
inactivate isi vor exercita functia de determinism genetic in cupluri alelice,
din corespondentul omolog al cromozomului X noninactivat. Ca acest
segment din bratul p al cromozomului X inactivat isi exercita activitatea
genetica in cuplul alelomorf cu a cromozomului noninactivat se confirma
prin diferenta valorica a doua tipuri de molecule (determinate de gene cu
locusuri pe bratul Xp) prin care se diferentiaza cele doua sexe: gena care
determina genetic sinteza de steroid, sulfataza si gena pentru antigenul Xg
eritrocitar.
Aceste molecule sunt produse in cantitate dubla la femeie, fata de
continutul la barbat.
La barbat cromozomul X si cromozomul Y raman activi la nivelul
intregii populatii celulare din organism. In cazul cand pe cromozomul X de
origine materna se gasesc unele gene mutante, la barbat aceastea isi pot
exercita functia genetica in doza mica, exprimand fenotipic, caracterul
determinat de gena mutanta.
La femeie, daca un cromozom x are o gena mutanta, boala nu se
manifesta, gena fiind recesiva in raport cu gena omoloaga (dominanta) de pe
cromozomul x normal. Ca urmare femeia se considera purtatoare si
transmitatoare a genei mutante, fara a i se manifesta fenotipic boala. In
meioza, prin disjunctia cromozomilor sexuali se pot obtine urmatoarele tipuri
de gameti, diferiti prin cromozomii sexuali:
La femeie, in ovogeneza, ovulul poate avea cromozomul x fara gena
mutanta, sau cromozomul x cu gena mutanta prezenta. RaportuI valoric fiind
50% ovul cu x normal si 50% ovul cu x mutant.

279
La barbat, in spermatogeneza, obtinem doua tipuri de spermii: spermie care
are cromozomul y si spermie cu cromozomul x, care, fiind de origine
materna, poate contine gena mutanta sau nu.
Prin fecundare se pot obtine zigoti diploizi care, limitat la cuplul de
cromozomi sexuali pot prezenta: XX; XX*m; XY; X*mY.
Datorita omologiei genelor alelomorfe intre cromozomii X la femeie
si neomologiei genice intre cromozomii X si Y la barbat, segregarea
caracterelor respects legile mendeliene, dar transmiterea genelor mutante si
manifestarea fenotipica a respectivelor caractere este diferita in raport cu
determinismul genetic al genelor autozomale.
La om caracterele X-linkage si Y-linkage se transmit: ereditatea legata
de Y; ereditatea recesiva legata de X si ereditatea dominanta legata deX.

a) - Ereditatea Y-linkata sau holandrica

pe cromozomul Y, pe bratul scurt se gaseste gena TDF (factorul determinant
testicular) care nu se gaseste pe cromozomul x. Caracterul determinat genetic
de TDF este un exemplu de ereditate holandrica sau a cromozomului Y. Prin
intermediul cromozomului Y, barbatii vor transmite gena TDF numai la
descendentii de sex masculin. Cum cromozomul X nu poseda gena TDF,
fiicele nu vor primi aceasta gena. Un alt exemplu de ereditate holandrica este
gena pentru hipertricoza urechilor. Este un caracter care, la unii barbati, se
prezinta cu par lung la lobul urechilor.

b) - Ereditatea X-linkage recesiva

in cazul cand unul din cei doi cromozomi X la femeie are o gena mutanta, ea
va fi recesiva in raport cu alela omoloaga normala dominanta.
Ca urmare, o femeie heterozigota, purtatoare a genei mutante
recesive, nu va manifesta boala, in schimb este potential transmitatoare a
respectivei gene la descendentul de sex masculin la care se va manifesta
boala.
Probabilitatea ca un ovul dezvoltat in meioza sa prezinte cromozomul
x cu gena mutanta este de 50%.
Ca exemplu demonstrativ de transmitere a unui caracter determinat de
gena X-linkage recesiva vom folosi „distrofia musculara Duchene". Aceasta
distrofie caracterizata prin slabirea progresiva a musculaturii proximale, este
urmarea unei sinteze masive a enzimei creatin kinazei (C.K.).
Cum boala se manifesta numai la sexul masculin cu debut inca din
copilarie si decesul la 20 de ani, boala este determinate de gena recesiva X-

280
linkage.
Cand o femeie purtatoare a respectivei gene mutante se casatoreste cu
un barbat normal rezultatul, ca probabilitate de recombinare prin fecundatie,
va fi: 25% fetite normale XX, 25% fetite purtatoare XXCK, 25% baieti
normali Xy si 25% baieti cu distrofia musculara Duchene X*CKY.
Observam ca fiicele care au primit X-ul matern cu gena mutanta devin
purtatoare si potential transmitatoare, dar somatic sanatoase. Cand zigotul Xy
primeste prin ovul cromozomul X matern cu gena mutanta, devenind X*CKy,
copilul de sex masculin care se va dezvolta si naste va fi bolnav de distrofia
musculara Duchene.
Ceilalti posibili descendenti XX si Xy, vor fi normali si nepurtatori de
gena mutanta.
In prezent sunt identificate 310 gene recesive X-linkage la om. Ca boli
date de gene recesive X-linkage care se manifesta la barbati mentionam:
daltonismul, hemofilia, albinismul, diabetul insipid nefragen, deflcienta in G6
PD (glucoza - 6 - fosfat de hidrogenaza) s.a. .

c) - Ereditatea X-linkage dominanta sunt cunoscute cazuri familiale

cand pe cromozomul X se gase§te gena mutanta, care are raport de dominanta
fata de gena „normala" recesiva.
In populatie, genotipurile si fenotipurile pot fi:
XX femeie normala; XX* femeie heterozigota bolnava; Xy barbat
normal; X*y barbat bolnav.
Daca mama este heterozigota XX* (bolnava si gena mutanta
dominanta prezenta), va transmite boala atat la fetite cat si la baieti:

XX* x XY

XX XY XX* X*Y
9normala (^normal $bolnava (^bolnav
heterozigota

281
 Daca tatal poseda pe cromozomul X gena mutanta dominanta, va
transmite boala numai la fetite, baietii vor fi sanatosi:

XX x X*Y
/\
X X v* ^

XX Xy XX* Xy
fetita bolnava
heterozigota
Cand dominanta este completa, toti purtatorii genei mutante va
manifesta fenotipic boala. Femeile heterozigole manifesto semnele morbide
atenuat. Pentru sexul masculin, unele gene mutante dominante cu locus pe
cromozomul X, pot avea si efecte letale.
Exemplu de boala data de gena dominanta X-linkage este rahitisml
vitamina-D-rezistent care se manifesta atat la barbati catr si la femei.
Deosebirea prin care se manifesta boala la barbati si femei este urmatoarea: la
barbati este uniform severa, in timp ce la femeia heterozigota, datorita
lyonizarii unui cromozom X, este variabil afectata (cu variatii de manifestare
a bolii).
Sistemul eritrocitar Xg, hipoplazia emailului, hipoplazia dermala, sunt
deasemenea ereditare cu transmitere X-linkage dominanta, precum si
hiperkeratoza foliculara („Keratosis follicularis spinulosa decalvans eum
ophian"). Persoanele cu hiperkeratoza foliculara au o pierdere totala sau
partiala a genelor, sprancenelor si a parului capilar.
Efectele keratozei foliculare sunt mai severe la barbati X*ky decat la
femei. Aceasta diferenta de exprimare fenotipica se explica prin starea de
heterozigot a femeii, care, avand o alela normala, compenseaza, prin atenuare,
activitatea genei mutante dominanta.

282
2.3. Ereditatea poligenica - multifactoriala. Ereditatea
"cantitativa"

Inca din 1889, Galton a observat la speciile studiate, prezenta unor

caractere care nu respectau continuitatea naturala sau "identitatea" manifestata
la fenotipul descendentilor. El a constatat caractere a caror exprimare
fenotipica variaza in limite foarte largi (+ la -), de la o extrema la alta, pe care
le-a denumit "caractere cantitative" sau "biometrice".
Studiile care au urmat observatiilor lui Galton au stabilit urmatoarele:
daca trasaturile de caracter (calitative), care respecta legile mendeliene,
particularizate prin "discontinuitate mendeliana", caracterele "cantitative"
(inteligenta, talia, greutatea, susceptibilitatea la boli cu predispozitie genetica
ca: diabetul, boala canceroasa, procesele degenerative pe fond genetic,
melanodermia), prin manifestarea fenotipica graduala, au o distribute
gaussiana la membrii familiei, la indivizii conspecifici.
Acest tip de transmitere este determinat genetic de un multiplu de
cupluri genice nonalelice care au locusuri diferite pe cromatidele
cromozomului, sau pe cromozomi diferiti.
Fiecare cuplu genie cu activitate convergenta in definirea caracterului
determinat poligenic, are efecte sumative: efecte negative prin diminuarea
progresiva in exprimarea caracterului somatic, sau cu efecte pozitive,
caracterul accentuandu-se progresiv pe parcursul ontogeniei indivizilor.

Poligenia determina fenotipuri "valoric" diferite ale unui caracter chiar

in cadrul familial
Ereditatea poligenica nu respecta legile mendeliene de transmitere si
segregare a caracterelor. Genele cu actiune convergenta asupra unui caracter
poligenic pot fi dominante sau recesive. Datorita dispersiei genelor pe
cromozomi diferiti, in meioza are loc disjunctia cuplurilor de cromozomi
omologi (materni - paterni) rezultand gameti haploizi. Prin fecundarea
gametilor se realizeaza recombinarea genomica, definirea zigotului diploid.
Datorita disjunctiei si recombinarii cromozomilor (recombinare aleatorie) se
asigura si o recombinare a genelor cu locusuri pe respectivii cromozomi,
rezultand constelatii genice care nu respecta, ca determinism si segregare,
legile mendeliene, ci distributia caracterelor exprimate fenotipic fiind de tip
gaussian.
Sub aspect "cantitativ" caracteru exprimat fenotipic, variaza in limite
foarte largi (+ spre -).
283
 Caracterele poligenice nu pot fi catalogate pe grupe: cantitativ sau
calitativ distincte. In mod normal, acest grup de caractere se incadreaza in
limitele de toleranta ale speciei, ale populatiei.
Un exemplu de caracter poligenic prezentat este melanodermia.
Melanodermia, caracter poligenic cu distribute geografica este
determinat si transmis poligenic. Se considera ca pigmentatia cutanata este
transmisa poligenic. Pigmentatia cutanata o gasim accentuata la populatiile
negroide si nepigmentata (sau slab pigmentata) la populatiile caucaziene
(albinos). Arbitrar, sa presupune ca melanodermia ar fi determinata de trei
cupluri de gene nealelice, cu locusuri difeilie pe cromozomi celulari. Genele
pentru melanodermie sunt dominante la populatia negroida si recesive la
caucazieni.
Sa consideram existenta urmatoarelor genotipuri in respectivele
populatii, triplu homozigote dominante si recesive:
- AA, BB, CC - homozigoti in populatia negroida, cupluri dominante;
- Aa, bb, ce - homozigoti recesivi pentru populatia caucaziana
Formarea unui cuplu de genitori: femeie alba, triplu homozigota
recesiva, cu un barbat negroid, triplu homozigot dominant; putem observa ca
descendentii mulatri vor fi descendenti cu pigmentatia cutanata asemanatoare
cu a genitorului negroid, de§i descendentii vor avea genotipurile heterozigote:
Aa, Bb, Ce, ceea ce confirma caracterul dominant al cuplurilor de gene pentru
melanodermie.
Daca se vor cupla doi descendenti mulatri heterozigoti (Aa, Bb, Ce
fiecare), descendentii vor prezenta o melanodermie variabil nuantata
fenotipic, pigmentatia variind, gradual, intre alb si negroid.
Diversificarea fenotipic in F2 este rezultatul combinatiilor genotipului
celor sase cupluri de gene nealelice heterozigote, ilustrand segregarea
independenta a caracterelor poligenice, ilustrand continuitate fenotipica a
melanodermiei.

2.3.1. Relatii genotip - mediu sau caractere poligenice

multifactoriale
Caracterele poligenice, desi determinate genetic, sunt influentate de
interference ale factorilor de mediu intern ale indivizilor, sau mediul extern
(factori ambientali, de mediu) (fig. 70)
Factorii externi indue influente cantitative sau calitative asupra
caracterelor poligenice, sau cu predispozitie genetica.
Factorii externi (ecologici) ce actioneaza asupra fenotipului pot
induce influente ce pot depasi limitele de toleranta ale speciei, ale

284
individului, determinand modificari asupra caracterelor care, uneori, sunt
neconforme cu legile geneticii formale. Raspunsul sistemelor poligenice
variaza in raport cu doza, tipul factorilor de influenta a mediului, depinde de
intensitatea masurabila a factorilor de "interventie".
Sunt cazuri cand nu putem detecta intensitatea interventiei unor factori
de mediu in "modelarea" unui caracter poligenic exprimat fenotipic. In aceste
cazuri implicat este numai genotipul, complexul genelor nealelice care indue
variatii (vezi poligenia).
Ereditatea multifactorial a, unde este o "conlucrare" conditionata intre
factorii genetici si cei din mediul ambiental in edificarea unui caracter, nu
trebuie confundata cu ereditatea poligenica.
Ereditatea multifactoriala particularizeaza variatiile caracterelor
masurabile, metrice si mai putin descriptibile. Variatia are un aspect continuu,
indivizii prezentand orice valoare posibila cuprinsa intre doua limite extreme.
Dublul determinism a caracterelor cantitative poate fi ilustrat daca
analizam talia corpului la om. Se stie ca talia, determinata de complexe de
gene nealelice dominante sau recesive, cu locusuri pe cromozomi diferiti, este
influentata de factorii alimentari, de mediu. De exemplu, o alimentatie bogata
in proteine stimuleaza cresterea taliei individului.
De asemenea, multe malformatii congenitale multiple sunt expresia
ereditatii multifactoriale, urmarea interferentelor dintre sistemul poligenic si
influenta nefavorabila a unor factori "agresivi" din mediu care deregleaza
mecanismele de diferentiere embrio-fetala (Fraser, 1980; Friedman si col.,
1992; Frets si Niermajer, 1990).

285
 DEZVOLTAREA /CRESTEREA SI
DIFERENTIEREA EMBRIOFETALA

imp ica
DIFERENTIERII __ ca DEZVOLTAREA
parte a DECIZIILOR

REGLAREA -care implies

LA MAI Care pot
MULTE implica'
NIVELE

LEGATURI PREZENTA
(CORELARI) SAU REARAHJARI
ALTERNATIVE ABSENTA ALE ADN
GENELOR
SPECIFICE
pnn

Perdru a
produce '
RECOMBINAREA
SITUSURILOR
COMUTATOARE COMUATATOARE (REGIUKILOR)
SPECIFICE SPECIFICE DE SPECIFICE
DE ACTIVARE/ CRESTEREA
DEZACTIVARE

care permit

LANTURI (NODURI) ACTIVARE/DEZ ACTI VA RE VARIABILITATII

AUTOREGLATOARE
COMUATATOR DE
ACTI VARE/DEZ ACTI VA RE
PENTRU ALTE GENE
Perdru fmalisarea
Carasjvms la
Ce condace la

DECIZIILOR DEZVOLTAREA
ANTERIOARE RELEELOR MEDIU
DIRECTIONATfl

Ca're

DIFERITE CAI

Fig. 70 Diferentierea in cascada

286
3. Notiuni de cronogenetica si cronobiologie asupra caracterelor
multifactohale
Analiza corecta si extinsa asupra caracterelor poligenice cu
dependenta de factorii de mediu au consemnat ca exprimarea fenotipica
variaza pe parcursul ontogenezei individului. In consecinta putem mentiona
ca sistemele poligenice cu activitate convergenta in definirea unui caracter
"respecta" principiile cronogenetice si cronobiologice in dezvoltarea
organismului, in evolutia exprimarii fenotipice a respectivelor trasaturi morfo
-structurale si functionale.

3.1 Cronogenetica si cronobiologia in activitatea

genomului uman
Dupa fecundare si constituire, zigotul confine zestrea genetica
mostenita de la genitori. Este zestrea genetica pentru definirea caracterelor
moleculare, celulare, tisulare, organe si activitatea psiho-neurologica a
individului care se va dezvolta.
Zigotul este "toti-potent" genetic. Insa, dupa constituirea zigotului, nu
intreg genomul, nu toate genele inscrise codificat in genom, isi incep
activitatea de determinism genetic. Este o etapizare ontogenetica «in
activitatea genomului constitutional a gruparilor poligenice implicate,
convergent, in definirea unui caracter multifactorial.
De aceea putem vorbi de cronogenetica si cronobiologia activitatii
genomului si dezvoltarii organismului.
Pentru intelegerea corecta a notiunilor de cronogenetica si
cronobiologie sunt necesare cateva precizari: Einstein (1905), elaborand teoria
relativitatii formuleaza simplist notiunea de cronogenetica: "un paradox al
ceasurilor". Ulterior, Langevin inlocuieste orologiile lui Einstein cu doi
gemeni: "unui trimis in spatiul cosmic, celalalt ramas pe pamant". El
considera ca la mtoarcere, geamanul trimis in spatiu ar trebui sa fie mai tanar
fata de eel ramas pe pamant. Din comparatia elaborata de Langevin, se
desprinde ideea ca studiul gemenilor univitelini ajuta sa analizam si sa
stabilim caracterele poligenice normale sau patologice.
Cronogenetica se ocupa cu dimensiunea temporala a genei, cu
etapizarea activitatii genelor din constitutia genetica a individului, raportata
activitatea la perioadele ontogenetice.
Cronogenetica se ocupa cu "timpul biologic primitiv", cu "timpul
ereditar" mo§tenit si, potential, transmis de fiecare individ din familie, din
populatie.

287
 Timpul ereditar poate fi supus mecanismelor de variabilitate prin
recombinare si/sau mutageneza.
Fiecare gena are o incarcatura de informatie in forma codificata
determinata in cursul evolutiei bio-genetice, ce poate fi exprimata cantitativ
sau calitativ in cursul dezvoltarii ontogenetice a fiecarui individ.
Este timpul biologic ereditar al fiecarei gene. Din definitia
cronogeneticii se poate consemna:
- gena define a patra dimensiune, care este timpul sau durata de
functionare;
- variabilitatea genotipului este si temporara, gena activand intr-o
anume etapa ontogenetica in dezvoltarea individului. Gena nu este numai
calitativa-cantitativa;
- se presupune ca timpul genetic respecta partial legile mendeliene
Sincronismul activitatii genelor confirma ca manifestarea unui
caracter normal sau patologic poate fi repetat exprimat in aceleasi perioade
ontogenetice la membrii familiei, sa prezinte aceeasi evolutie si durata in
timp, dar fara identitate (sincronism) in aspectul cantitativ sau calitativ al
caracterului, exprimat la membrii componenti ai familiei. Se poate observa ca
un caracter poligenic prezinta variatii, o gradualitate fenotipica in raport cu
etapa ontogenetica a individuali. Variatii graduate apar, repetate la aceleasi
perioade ontogenetice atat la membrii componenti din familie, cat si la
descendentii familiilor.
Aceasta diferentiere in exprimarea aceluiasi caracter la membrii
familiei, sau la indivizi conspecifici, este cunoscuta ca "izocronism familial".
Sincronismul genelor si izocronismul familial sunt epifenomene de
origine genetica. Epifenomenul confirma existenta timpului biologic primar
(genetic).
Intre timpul fizic exogen ritmic si timpul biologic primar se stabilesc
interrelatii conditionale. Rezultatul acestor inter-relatii reprezinta timpul mixt.
Mathe' (1979) lanseaza ipoteza ca timpul biologic primar (genetic),
factor genetic determinant poate fi modificat prin "alterari" mutationale.
Studiul parametrilor timpului biologic primar pot fi teste reale de
referinta, de identificare, prevenire si prognoza in exprimarea fenotipica a
caracterului poligenic, normal sau patologic. Alterarea timpului biologic
primar (genetic) se produce prin mutatii, autoduplicatii, crossing-over inegal
sau prin recombinare intra- si intercromozomica. Aceste modificari s-au
produs in cursul evolutiei bio-genetice a organismelor, sau in diverse perioade
ontogenetice ale individului.

288
 Cronobiologia studiaza relatia dintre timpul fizic si timpul biologic.
Aceasta relatie reprezinta ritmurile timpului fizic in raport cu ritmul de
raspuns al organismului la actiunea si influenta factorilor de mediu. Ritmul de
raspuns al organismului la actiunea mediului este timpul exogen. Este un timp
ritmic de solicitare a proceselor vitale ale organismului, la care timpul
biologic primar (genetic) aduce un aport substantial ca raspuns la timpul
exogen (la actiunea factorilor de mediu).
In notiunea de cronobiologie sunt integrate caracterele multifactoriale
cu dependenta partiala de influenta factorilor externi. Sunt caracterele cu
dualitate interferentiala: factorii genetici (mosteniti) si influenta factorilor de
mediu, care prin efectul aditiv si sumativ sunt diversificat exprimate valoric,
sau calitativ, in fenotipul indivizilor.
In notiunea de timp mixt este inclusa notiunea de getiotip temporal,
componenta esentiala a timpului biologic primitiv. Genotipul temporal
reprezinta functia de stabilitate relativa a genei. Este timpul ce corespunde
activitatii genei intr-o anume perioada ontogenetica. Dupa exercitarea
functiei, gena isi poate inceta activitatea fund represata de alte gene, prin
epistazie temporala, prin pleiotropie sau prin neomutatie.
In conceptul timpului mixt putem consemna latura operationala si
latura cauzala. Operationala deoarece aparatul genetic constitutional
determina inductia informational determinanta a genelor ce definesc
ontogenetic caracterele.
Timpul mixt nu este antagonist timpului biologic primar (genetic), nu
este in contradictie in conditiile dezvoltarii individului in limite de toleranta
nomiala ale mediului. Daca limitele de toleranta normala sunt depasite (- sau
+) apar efecte antagonice intre timpul mixt si timpul biologic primar. Apar
caractere modificate fata de normal determinate de influenta distructiva,
indusa de factori agresivi din mediu, apar diverse boli.

3.2 Stabilitatea genei sau ergon

In contextul temporal, gena demonstreaza o variabilitate normala sau

deviant-mutanta, datorita capacitatii de raspuns la actiunea factorilor endogeni
sau exogeni ai organismului.
Ergonul sau stabilitatea genei este rezultatul existentei si mentinerii
factorilor poligenici mosteniti.
Ergonul este rezultatul a trei nivele de conditionare:
- stabilitatea fizico-chimica sau sinonimia;
- stabilitatea repetarii informatiei sau redundanta informationala;
- stabilitate prin repararea structurii genei.

289
 a) Stabilitatea fizico-chimica sau sinonimia
Plecand de la proprietatile fizico-chimice ale ADN-ului s-a constatat
ca aceasta biomolecula are o mare stabilitate metabolica fata de moleculele
ARN sau proteine.
Datorita acestei stabilitati metabolice si capacitatii de replicare
semiconservativa, se asigura latura sincronica, de conservare si continuitate a
informatiei genetice, se asigura sincronismul informational in spatiu si timp
al genomului uman, iar informatiile genetice sunt inscrise codificat in
stmctura aperiodica a ADN-ului genomic.
Caracterele poligenice normale sau patologice beneficiaza de
redundanta informationala. Desi cu redundanta informationala, caracterele
poligenice prezinta variatii fenotipice si in raport cu perioadele ontogenetice
ale individului.
Variatiile cantitative sau calitative ale caracterelor determinate
genetic de complexe poligenice ar fi explicate astfel:
- dualismul interferential stabilit intre componentele genice
(dominante si/sau recesive) si factorii externi. Acest dualism determina
exprimari variabile asupra caracterelor poligenice. Variatiile, cantitative sau
calitative, ale caracterelor poligenice isi gasesc explicatia urmatoare:
componenta genetica este constant mostenita, prezenta si functionala in
genomul individului, dar factorii de mediu pot prezenta variatii ca doza,
intensitate, timp si tipul de factor, ceea ce ar induce un raspuns diferentiat al
organismului;
- este posibil ca genele din complexul poligenic de control al unui
caracter sa fie represate dupa o perioada de activitate ontogenetica, de alte
gene din componenta complexului. De exemplu, sistemul hemoglobinelor
umane ilustreaza aceasta ipoteza. Astfel, la om, diferentiem diferite tipuri
de hemoglobina, prezente pe perioade ontogenetice diferite si anume:
Hb e4 (embrionara I), Hb a2s2 (embrionara II), Hb a2y2 (fetala), Hb
a2p2 (adulta I), Hb a282 (adulta II). Modificarea fenotipica a caractemlui ar fi
si consecinta genelor transpozabile ce pot influenta activitatea unor gene;
- un alt argument care explica variatiile individuale in manifestarea
fenotipica a caractemlui poligenic este urmatorul: cand factorii extemi
depasesc limita de toleranta (- sau +), iar actiunea lor este exercitata timp
indelungat asupra genomului, acestia pot deveni factori agresivi potential
mutageni, dezechilibrand complexul poligenic cu modificarea, valorica, a
caractemlui exprimat.
Observam ca sinonimia genei poate fi "dezechilibrata" functional in
genomul celular in raport de factorii extemi sau factorii proprii individului.

290
 De exemplu, sunt caractere a caror exprimare fenotipica variaza in
raport cu varsta individului, cum ar fi hemoglobinele umane. In aceste
conditii apare notiunea de "cronon". Stabilitatea relativa a genei explica
variabilitatea timpului biologic primar, intra- si interindividual.
Insasi Watson considera variabilitatea timpului biologic intra- si
interindividual ca fiind neintamplatoare, ca o consecinta a evolutiei bio-
genetice primare a genomului.
La organismele cu reproducere sexuata, prezenta cromozomilor
omologi asigura redundanta informational - genetica. Fiecare gena structurala
este o "repetitie" in dublu exemplar.
Ca semnificatie bio-genetica redundanta informationala asigura:
- variabilitatea fenotipica a caracterului exprimat si determinat
genetic;
- asigura variabilitatea informatiei genetice pe perioade echivalente
de timp;
- redundanta non-mutanta garanteaza dezvoltarea nonnala a
individului si manifestarea in limite de toleranta normala a caracterelor,
garanteaza evolutia "corecta", etapizata ontogenetic a caracterului.
Dar selectia adaptativa stabileste valoarea redundantei pentru fiecare
gena. Pentru aprecierea valorii redundantei pot fi folositi urmatorii parametri:
- raportarea proceselor desfasurate pe fiecare etapa ontogenetica;
- in raport de "epuizarea" progresiva a redundantei genice;
de actiunea factorilor agresivi externi ce tintesc, distructiv, genele
redundante;
- de variabilitatea coeficientului de reparare a genelor redundante
"alterate";
- de sistemul polinucleozomic care protejeaza, conditioneaza si
individualizeaza ergonul genie.
Stabilitatea fizico-chimica a genelor sinonime poate diferi de la o gena
la alta. Diferentierea este determinata de componenta in cuplurile
complementare si anume: sunt gene sinonime care au acelasi mesaj genetic
pentru determinarea sintezei unei proteine; dar ele se diferentiaza prin
tripletele componente, prin numarul puntilor de hidrogen in raport de cuplul
complementar A = T sau G = C. O gena din complexul genelor sinonime,
poate avea un numar mai mare sau mai mic de cupluri complementare A = T si
G = C, ca urmare diferente in numarul puntilor de hidrogen, ceea ce
determina o diferenta a timpului necesar pentru decodificare. Aceste diferente
indue variatii in stabilitatea si timpul de functionare a genelor sinonime.
Aceasta diferenta in sinonimia genelor poate fi transmisa

291
descendentilor.
Se apreciaza ca o gena sinonima difera de gena omoloaga prin ± 12,5
- 15% din totalul puntilor de hidrogen, diferenta rezultata din cuplurile
complementare a bazelor azotate componente.
Variabilitatea timpului biologic individual poate fi determinata si de
alti factori cum sunt: raportul dintre valoarea puntilor de hidrogen si
temperatura de denaturare, de mediul acid, de concentratia mediului. Tot
factor de influenta este ordinea crescanda a complexitatii structurii genelor
sinonime cum ar fi: ordinea poli-A, poli A + T, poli A + G + T etc.
Deci stabilitatea poate fi "deteriorata" prin procese si mecanisme
diverse. Sunt factori de variabilitate a sinonimiei si redundantei care
influenteaza coeficientul de stabilitate a genelor implicate in definirea unui
caracter multifactorial, precum si a timpului de functionare a informatiei
codificata de structura acestora.

Durata informatiei sau chronomul

Chronomul sau dimensiunea temporala a genei este durata de timp

cat functioneaza o gena pentru determinarea sintezei tipului de ARN-m si
edificarea proteinei cu structura si functii specifice. Chronomul sau
dimensiunea temporala a genei este conditionat de:
• Raportul dintre dimensiunea mesajului genetic inscris in structura
genei, de cantitatea informatiei daca toate nucleotidele componente ce
formeaza mesajul genetic ar fi echiprobabile. Mesajul complet pentru
edificarea unui caracter ar reprezenta maximum de informatie genetica,
masura a redundantei.
Dupa Britten si Davidson (1968), redundanta informationala a ADN-
ului este asigurata de sinonimia genelor in raport de complexitatea formarii
caracterelor poligenice. Redundanta asigura entropia materiei vii, elimina
dezordinile in organism;
• Factor conditional al chronomului este si raportul valoric intre
cantitatea de informatie existenta in ADN si calitatea informatiei
decodificata in ARNm, care trecuta in citoplasma, va fi transcrisa in
structura unei proteine.
Teoretic, intre mesajul decodificat din ADN si eel ajuns in citoplasma
ar trebui sa existe valori identice. Dar datorita structurii in mozaic a genei la
eucariote, ARNm, prin mecanisme de restrictie enzimatica, de eliminare a
intronilor si actiunea ligazei, de recuplare a exonilor informationali, se pot
produce defecte. In consecinta, nu intotdeauna ARNm cuprinde in totalitate
Chronomul genei din ADN.

292
 • In durata informatiei si functiei genei timpul temporal (chronomul)
poate fi influentat de eventuale imbolnaviri ale organismului care modifica
mecanismele activitatii unor gene.
Este posibil ca unele boli pe care individul le prezinta in diverse
perioade ontogenetice, sa induca modificari in structura unor gene, care
acumulate, pot fi materializate in sinteze eronate de molecule proteice sau
dereglari in reglajul genetic al sintezei de proteine.
Ca informatia genetica sa fie citita in totalitate si materializata in
structuri proteice trebuie respectate inter-relatiile redundantei si limitele de
toleranta normala asigurate intre: cantitate, calitate, ergon, chronon. Gena
neomutanta prezinta alta dimensiune temporala fata de gena salbatica.
In concluzie, consideram ca redundanta genei este asigurata pe un
timp limitat, stabilitatea fiind relativa, partiala.

Sistemul ergon/chronon (E/C)

Sistemul ergon/chronon reprezinta a patra dimensiune a genei.

Aceasta dimensiune a fost demonstrata prin studiul cuplurilor gemelare
univiteline ("homozigoti").
Studiul confirma ca fenotipic caracterele poligenice sunt exprimate cu
o coincidenta valorica de aproximativ 0,90% pe perioade ontogenetice la
gemenii proveniti din acelasi cadru familial, in aceleasi conditii socio-
biologice, economice si acelasi nivel de cultura. Nu aceeasi valoare a fost
stabilita la gemenii bivitelini (raportul fiind de aproximativ 0,50%).
Evaluarea raportului E/C permite sa apreciem gradul de stabilitate a
genei (ergonul), sa apreciem timpul potential de activitate a genei
(chrononul). Raportul E/C permite sa apreciem stabilitatea genotipului
constitutional al individului.
Stabilitatea genei este evaluata in raport de durata de functionare si
manifestare a caracterului determinat genetic (ergonul), iar chrononul genei
este evaluat pentru fiecare individ din cuplul gemelar.
Chrononul este o notiune "simpla". Ergonul este o notiune "complexa"
care insumeaza mai multe componente: factorii de mediu pot induce mutatii
ireversibile in structura genelor. Mutatiile se produc cu viteze invers
proportionate cu chrononul, cu gradul de stabilitate a genei.
Ergonul unei gene difera de ergonul altor gene din complexul
poligenic ce determina un caracter. Datorita particularitatilor ergonice ale
fiecarei gene din complexul sistemului poligenic explicam diferentele E/C.
Dobzhausky facea urmatoarea rem area: "este raspandita opinia
conform careia genotipul unui individ ramane neschimbat din momentul

293
fecundatiei si pana la moarte, in timp ce fenotipul se modifica continuu.
Aceasta afirmatie nu este corecta, deoarece la adult functioneaza alte gene,
care existau in genom in perioada embrionara sau copilarie".
Dobzhausky (1965) confirma ca factorii de mediu au influente aditive
in expresivitatea fenotipica a caracterelor poligenice, dar pot influenta
distructiv structura si functia unei gene. Aceste distructii genice pot avea
efecte secundare nefavorabile pentru organism, iar prin depasirea limitelor de
toleranta normale se trece in patologia individului.
Factorii externi pot modifica raportul E/C prin:
- modificarea stabilitatii structurii genei;
- alterarea inform atiei genetice inscrisa in structura genei;
- introducerea interactiunii operative de tip represie si transcriere, intre
informatia - genetica si factorii de mediu.

Parametrii de calcul a raportului E/C, respectiv a patra dimensiune a

genei, sunt:
- stabilitatea moleculara a genei;
- redundanta informationala a genelor implicate in definirea
caracterului poligenic;
- capacitatea de reparare a ADN unde este inscrisa, codificat,
structura genei.

In raportul E/C factorul timp modifica valoarea interactiunii alelice si

intergenice din complexul poligenic. Uneori raportul E/C poate fi modificat
chiar in cadrul aceluiasi operon datorita neconcordantei interactiunilor
(influenta si raspuns) dintre gena reglator si genele structurale.
Neconcordantele cronogenetice E/C pot fi determinate de repartitia pe
cromozomi diferiti a operonilor implicati in edificarea aceluiasi caracter.
Neconcordanta este determinata de momentul inceperii functiei de
decodificare a mesajelor inscrise in structura genelor structurale dar si a
timpului necesar decodificarii. Sunt operoni cu activitate rapida, altii cu ritm
variabil. Timpul activitatii diferentiate a genelor din complexul poligenic si
ritmul de functionare sunt datorate componentelor nucleotidelor
complementare: numar crescut sau redus al cuplurilor A = T sau G = C.
Aceste neconcordante in activitatea operonilor pot influenta variatii
ontogenetice in manifestarea unui caracter.

294
3.3 Metode de analiza a caracterelor poligenice
multifactoriale

Perfectionarea metodelor citogenetice, genetica antropologica,

biologie moleculara, bio-sociologie a evidentiat ca variatiile fenotipice ale
caracterelor poligenice sunt determinate de doi factori:
- factorii genetici determinant din constitutia individului;
- factorii de mediu, conditionali si influenta, in care se dezvolta individul pe
tot parcursul vietii sale.
Pentru a demonstra dualitatea conditional si interference intre
constitutia genetica primara si influentele induse de factorii de mediu, pentru
a stabili "cuantumul valoric" al componentei genetice a individului si
influenta aditiva indusa de factorii externi sunt folosite metodele:
- studii familiale si analiza pedigree-ului;
- studiul cuplurilor de gemeni;
- studiul copiilor adoptati;
- studiul susceptibilitatii caracterelor biologice si markerilor genetici.

a) Studii familiale si analiza pedigree-ului

Analiza membrilor componenti din familie este o metoda clasica

pentru studiul geneticii umane.
Folosita initial de Galton, metoda se bazeaza pe principiul stabilirii
"riscului" familial ca probabilitate de transmitere a unui caracter normal sau
patologic la indivizi, pe filiatie directa si heredocolaterali. In esenta, metoda
este un studiu comparativ al caracterelor prezente la parinti si manifestate la
descendenti.
Metoda impune un studiu familial dinamic, unnarindu-se manifestarea
caracterului poligenic pe perioade ontogenetice.
Metoda se bazeaza pe principiul ereditarist, deoarece fiecare
descendent mosjeneste de la fiecare parental 50% din constitutia genetica
realizata prin fecundare. Valorile inregistrate se compara intre membrii
familiei si cu valorile indivizilor neinruditi din populatie.
Prin aceste studii comparative stabilim o anume relativitate, gradul si
componenta genetica familiala, precum si substratul genetic predispozant.
Aceasta analiza permite sa stabilim riscul familial al unor boli poligenice.
Datele obtinute, statistic, evidentiaza ca heritabilitatea conflrma conceptul
ereditarist.
Metoda are un caracter relativ limitat ca interpretare si aplicabilitate.
Permite o evaluare subiectiva asupra trasaturilor poligenice.
295
 Ca varianta a studiilor familiaie este intocmirea si analiza pedigree-ului.
Daca metoda studiului familial stabileste similitudiunea si heritabilitatea
intre membrii familiei, pedigree-ul stabileste mecanismele comportamentului
dominant sau recesiv al genelor din complexul poligenic implicat in edificarea
caracterelor cu manifestare multifactoriala (genotip-mediu).
In analiza pedigree-ului se impune necesitatea elaborarii unor modele
statistice pentru a stabili concordanta genetica in cadrul familial.
Caracterele poligenice nu confirma legile mendeliene, concluzie rezultata
din studiul pedigree-ului.
Pentru caracterele poligenice sunt elaborate noi concepte de analiza a
pedigree-ului. Noile concepte pun accentul pe studiul penetrantei incomplete sau
cu determinism genetic variabil, de fenocopii sau cazuri familiaie sporadice. De
exemplu, Miron Baron (1990) apreciaza ca penetranta redusa explica manifestarea
variabila a caracterului intre indivizi.
Dintre, modelele genetice folosite la studiul pedigree-ului mentionam:
- modelul locusului unic major - SML ("single major locus");
- modelul poligenic multifactorial - MFP.Daca variatiile ar respecta
modelul SML, transmiterea si segregarea caracterului pot evidentia participarea
unui singur cuplu alelic, respectand legile mendeliene. In aceste conditii la
membrii familiei ar trebui sa existe genotipurile: homozigoti dominanti,
homozigoti recesivi si heterozigoti.
Baron considera ca parametrii modelului SML sunt urmatorii: frecventa
alelelor, exprimarea fenotipica a genotipurilor mentionate, pragul si masura
variatiei mediului.
Dar caracterele multifactoriale sunt determinate de multiple cupluri de
gene nealelice. In consecinta, se alege modelul MFP. Acest model ia in analiza doi
factori de concomitenta si influenta: complexul de gene si factorii de mediu ce
influenteaza caracterul exprimat fenotipic. Fiecare din cei doi factori are efecte
minime, dar sumative. Prin metoda MFP se obtine un prag care evidentiaza
limitele de toleranta ale individului pentru fenotipul caracterului determinat
poligsnic. Pragul valoric corespunde gradului de implicare al factorilor genetici si
al factorilor de mediu in edificarea caracterului poligenic. La analiza valorica a
pragului pot fi asociati si factorii non-genetici, cum ar fi influentele culturale,
educative, socio-economice.

296
 Geneticienii au conceput si alte modele de analiza in transmiterea
caracterelor poligenice, normale sau patologice, cum sunt:
- modelul mixt al carui principiu este: "combina transmiterea unei gene din
fondul poligenic si efectele mediului";
- modelul analizei a doua locusuri care urmareste analiza a doua cupluri de
gene nealelice care interactioneaza in grade diferite;
- modelul SML cu mai mult de doua alele;
- modelul poligenic prin care se apreciaza efectele sumative ale fiecarui locus
genie din sistemul poligenic. Uneori, pedigree-ul poate prezenta erori de
interpretare cauzate de epistazia genica , de pleiotropie etc.
- modelul multifactorial cu prag
Metodele prezentate, metoda studiului familial si metoda de analiza a
pedigree-ului la studiul caracterelor poligenice, impun argumente si
interpreted mai ample, in special a datelor obtinute din studiul familial.
Caracterele multifac tori ale continue au distribute gaussiana in
familie, in populatie.
Caracterele multifactoriale pot fi grupate in trei clase:
- trasaturi multifactoriale cu variatie continua, valorile scalei gaussiene fiind
cuprinse intre cele doua extremitati ale scalei;
- trasaturi multifactoriale cu prag "fenotipic"; caractere cu manifestari
fenotipice diferentiate pe perioade ontogenetice ale indivizilor.

La om, un caracter poligenic cu variatie continua are o distribute

normala in familie, in populatie.
In cazul cand se depaseste de doua ori variatia standard (x2 ±2G)
normala se considera valori exceptional ce depasesc limitele de toleranta.
Ca urmare, pentru studiul familial si analiza pedigree-ului este
necesara calcularea heritabilitatii genetice, concept care separa influentele
relative genotip-mediu. Cu cat heritabilitatea este mai accentuata, factorii
genetice sunt mai importanti.
Fenotipul caracterelor multifactoriale reprezinta "suma" a trei valori:
- "g"- contributia factorilor genetici aditionali cu varianta "G";
- "b"- contributia mediului in functie de varianta "B";
- "e"- contributia factorilor intamplatori din mediu, varianta "E".

Relatia pentru a exprima heritabilitatea va fi:

H2 = G/ (G + B + E)
Heritabilitatea este masura prin care stabilim rolul factorului genetic
in definirea caracterului poligenic.

297
b) Studiul cuplurilor gemelare
S-a facut observatia ca studiul familial si metoda pedigree-ului ofera
date nerelevante asupra caracterelor poligenice. Ca urmare s-au cautat alte
criterii de a studia poligenia caracterelor.
Un criteriu de analiza cu un aport substantial de stabilire a
cuantumului valoric al complexului poligenic, corelat cu aportul factorilor de
mediu in definirea unui caracter multifactorial, ii reprezinta studiul cuplurilor
gemelare.
Metoda respecta o regula elaborata de Tourraine: "cand concordanta
este regula iar discordanta exceptia, caracterul este determinat genetic, dar
gradul de exprimare fenotipica este cu dependenta de factorii de mediu".
Aceasta regula isi gaseste aplicabilitate interpretativa pentru caracterele
poligenice. Importanta este aplicabilitatea metodei si in studiul bolilor
multifactoriale din populatiile umane. Cuplurile gemelare pot fi:
- cuplul gemelar monozigot (MZ), rezultat dintr-un singur ovul
fertilizat. Au aceeasi zestre genetica, identitatea fiind de aproape 100%.
Gemenii monozigoti (MZ) au acelasi sex, aceeasi marked genetici, cu un
fenotip aproape identic. La MZ se pot consemna unele diferentieri in
expresivitate (variabila) pentru caracterele cu dependenta de mediu.
- cuplul gemelar dizigot (DZ) rezulta din fecundarea, concomitenta, a
doua ovule de catre doua spermii, cu formarea a doi zigoti. Gemenii DZ pot fi
de sexe diferite, au 50% identitate genetica, markerii genetici cu identitate de
50%, iar manifestarea caracterelor multifactoriale mult diferentiata.
La cuplurile gemelare MZ si DZ se poate urmari si stabili gradul de
influenta a factorilor de mediu in expresivitatea caracterelor poligenice.
Astfel de studii incepute de Galton (1905) si continuate de diversj cercetatori
(Larmat 1977, Jones 1993, Lean 1992, Monod 1970, Reinberg 1991,
Athanasiu 1995 s.a.) au urmarit analiza diferentelor intre sistemul poligenic
determinant al unui caracter si gradul de influenta a factorilor de mediu.
Pentru a se obtine date concludente, un studiu corect respecta
urmatoarele criterii de analiza a cuplurilor gemelare:
- gemeni univitelini care se dezvolta in acelasi mediu familial;
gemeni univitelini care prin separare se dezvolta in conditii diferite de mediu
si viata socio-economica;
- gemeni bivitelini care se dezvolta in acelasi mediu familial;
studiul fratriei gemenilor cu aceleasj conditii de viata cu a cuplului gemelar;
- studiul aceluiasi caracter la indivizii neinruditi.Rezultatele pe care Larmat
(1977) le-a sintetizat sunt urmatoarele (tabel):

298
Lffturi studiate Neumansi Burt Erlenmeyer Schields Zozzo
col. Kimling Jarvik

Gemeni MZ 0,92 0,94 0,87 0,76 0,90

crescuti
impreuna
Gemeni >,1Z 0,86 0,77 0,75 0,77 -
crescuti separat
Gemeni DZ 0,53 0,55 0,53 0,51 0,6
crescuti
impreuna
Fratria crescuta 0,50 0,54 0,49
impreuna cu
cuplurile
gemelare
Fratria crescuta 0,42 0,41 0,42
separat de
cuplurile
gemelare
Indivizi 0,25 0,28 0,23
neinruditi dar
crescuti
impreuna cu
fratria si cuplul
gemelar

Exprimarea coeficientului de corelare multifactorial a la cuplurile

gemelare in raport de fratrie si indivizii neinruditi (dupaLarmat, 1977).

- Coeficientul de corelare intre gemenii univitelini crescuti in acelasi

mediu familial variaza in limite statistic nesemnificative, fiind obtinute valori
cuprinse intre 0,90 - 0,94 (in raport de autorui studiului). Diferentele mici,
nesemnificative, in expresivitatea caracterelor poligenice sunt consecinta
raspunsului diferit, neuniform, la aceiasi factori de mediu.
- Coeficientul de corelare intre MZ, separati si dezvoltati in conditii
diferite de mediu, prezinta o diferenta semnificativa valoric. Diferenta
coeficientului de corelare poate ajunge pana la 25%. Explicatia acestei
diferentieri este urmatoarea: gemenii MZ au aceeasi zestre genetica

299
(~ 100%), dar fiind separati si dezvoltati in alte conditii geografice, socio-
economice si culturale, acesti factori au indus modificari asupra caracterului
poligenic. Geamanul separat de mediul familial a reactionat diferit la noile conditii
de dezvoltare, uneori unii factori putand modifica gene din complexul poligenic.
Prin separare si dezvoltarea in conditii de mediu diferite, expresivitatea fenotipica
diferita a aceluiasi caracter evidentiaza influenta aditiva (pozitiv sau negativ)
indusa de factorii de mediu asupra genotipului.
- Valorile total diferite in expresivitatea caracterelor poligenice intre
gemenii MZ si DZ, care, desi dezvoltati in acela§i mediu familial, sunt cauzate de
constitutia genetica diferita intre acesti gemeni. Diferenta ajunge pana la 50% la
DZ fata de MZ. Ca urmare si raspunsul DZ la aceleasi conditii de mediu va fi total
diferit fata de MZ.
- Cat priveste coeficientul de corelare intre cuplurile gemelare si fratrie,
valorile sunt apropiate cu valorile corespunzatoare gemenilor DZ. Aceasta
corespondenta valorica in expresivitatea unui caracter in fratrie fata de DZ este
datorata genotipului constitutional care prezinta acelasj raport - de 50%o fata de
MZ.
- Analiza coeficientului de corelare intre indivizii neinruditi dar
dezvoltati in acelasi mediu familial cu DZ, MZ si fratria, prezinta diferente
ce pot ajunge pana la valori de aproape 75% fata de MZ si de 25% daca
raportarile se fac la DZ si fratria cuplului gemelar DZ.
Rezultatele obtinute la cuplurile MZ, dar separati prin adoptie, camine
familiale sau orfelinate, unde au alte conditii de dezvoltare, confirma
diferentele de corelare, cu influenta factorilor de mediu, a caracterelor
multifactoriale.
Deci nu putem neglija influenta mediului asupra caracterelor poligenice.
Ace§ti factori au efecte aditive si interferand cu constitutia genetica, determina
diferente graduale in expresivitatea fenotipica a aceluiasj caracter la indivizii
conspecifici, sau diferente de expresivitate a aceluiasj caracter pe perioade
ontogenetice ale individului
Concluziile ce se desprind din studiul cuplurilor gemelare (MZ si DZ) si
fratriile acestora sunt:
caracterele poligenice - multifactoriale, cu predispozitie genetica si cu
dependenta partiala de factorii de mediu vor avea expresivitatea fenotipica in raport
de numarul cuplurilor de gene nealelice (dominante sau recesive) cu actiune
convergenta in determinarea caracterului, dar si de prezenta si influenta factorilor
de mediu ce actioneaza asupra genotipului.
rezulta din aceste studii ca nu se absolutizeaza conceptul ereditarist
constitutia genetica nu are rolul singular determinant in expresivitatea

300
aracterului poligenic nu se neaga rolul ambientului in dezvoltarea
rganismului si edificarea caracterelor poligenice - conceptul ambientalist 5
remarca o dualitate interferentiala intre genotip si influenta mediului are, prin
efecte sumative, asigura variatii fenotipice in manifestarea aracterelor
poligenice. e confirma conceptul dualist.

.4 Heritabilitatea caracterelor multifactoriale

Pentru stabilirea efectului sumativ de influenta a factorilor de mediu ;upra
genotipului in expresivitatea unui caracter poligenic se foloseste letoda de calcul
a heritabilitatii.
Calculul heritabilitatii caracterelor poligenice, initiat de Holzinger si
izvoltat de Larmat ("Genetica inteligentei", 1977 pg.76), se bazeaza pe itele
obtinute din studiile cuplurilor gemelare MZ siDZ.
Criteriile de calcul sunt:
- "diferenta medie a expresivitatii caracterului stabilita la MZ )MZ) cu
acelasi genotip, raportata la fiecare membru din cuplul gemelar Z, reprezinta
variatia ambientala; decalajul valoric mai mare intre DZ, DZ, exprima suma
variatiei de influenta a factorilor de mediu si egalitatii genotipului intre gemenii
DZ
diferenta intre valorile DMZ si DDZ a indivizilor din fiecare cuplu
melar exprima efectele sumative ale cuplurilor de gene nealelice fectele
determinismului genetic)." Respectand aceste criterii de calcul se •tine
urmatoarea relatie a expresivitatii heritabilitatii:
H = (DDZ - DMZ) / DDZ (1)
Diferenta rezultata din aceasta relatie poate fi exprimata ca rianta
VMZ2' prin relatia: H = (VDZ - VMZ)/ VDZ (2)

5 Calcularea variatiei caracterelor poligenice

Varianta genotipica. Geno tipul, componenta principala in exprimarea

lotipica a caracterului poligenic, rezulta din valoarea raportului dintre rianta
genotipului (VG) si varianta fenotipului (VF): VG/VF.
Aportul constitutiei genetice a complexului poligenic in expresivitatea
lotipica a caracterului poate fi apreciat in raport de aportul componentei

'ML = varianta MZ este media patratelor decalajului dintre performantele obtinute de

:are individ din cuplul MZ in raport cu valoarea medie a cuplului MZ.

301
mediului. Acest aport se stabileste prin mas ararea caracterului exprimat fenotipic
la gemenii DZ sau MZ separati prin adoptie, astfel incat vor avea conditii de mediu
diferite.
Varianta genotipica este suma a trei valori: valoarea ameliorarii aditive a
caracterului (VA), valoarea data" de dominanta genelor (VD) si valoarea data de
interactiunile intergenice (VI). Ea se exprima prin relatia: VG = VA + VD + VI.
Varianta indusa de mediu. Ca varianta negenetica, reprezinta valoarea
sumativa indusa de influenta factorilor de mediu extern asupra gradului de
exprimare fenotipica a caracterului multifactorial - poligenic.
Aportul mediului plus componenta genetica influenteaza diferenjial
valoarea si gradul expresivitatii fenotipice a caracterelor poligenice la om.
Varianta data de mediu este inclusa in varianta totala a caracterelor.
Covarianta. Sunt cazun cand apar diferente intre variatia indusa valoric de
mediu si variatia genotipica. In aceste cazuri un factor din mediul extern poate
amplifica sau diminua valoric manifestarea caracterului multifactorial, fata de
valoarea variantei dezvoltarii normale a individului.
Cand individul se dezvolta in alte conditii de mediu sau cand la conditiile
normale actioneaza un factor suplimentar capabil a influenta expresivitatea
caracterului poligenic, se introduce notiunea de covarianta (COVGE). COVGE
este varianta valorilor geno tipice (VG) si variatia valorilor fenotipice (E), ca efect
sumativ "suplimentar" (aditional) a factorilor de mediu modificati. Relatia va fi:
VE = VG + VE + 2COVGE Covarianta se introduce in calculul VE
(variantei fenotipice) numai in conditiile carid membrii cuplului MZ, prin
separare, se dezvolta in conditii diferite de mediu.
Varianta (variatiile individuale). Abaterea de la valoarea medie a familiei
sau a populatiei este exprimata prin varianta. Varianta este media acestor diferente
ridicata la patrat. Componentii variantei sunt:
VG - varianta genotipica rezultata din recombinarile
aparatului genetic;
VE - varianta devierilor induse de mediu;
EF - varianta totala a fenotipului caracterului poligenic.
VF = VA + VD + VI + VE

~~ Covarianta - capacitatea mai multor factori de a varia similar sau suplimentar,

influentand un caracter

302
apitoiul VII
&RTOGRAFIEREA, INGINERIA GENETICA §1
LONAREA GENOMULUI UMAN
RINCIPII

Suportul molecular din genomul organismelor, care determine si *ura

functiile de ereditate si variabilitate, a inceput sa fie studiat intensiv,
extensiv, din anul 1944 cand Avery si Mc Leod au demonstrat, lerimental,
rolul ADN-ului in transformarea virulentei la bacterii.
Studiile ce au urniat au stabilit structura tridimensionals a moleculei
ADN, din genomul celulelor umane, ultrastructura sau arhitectura tiala
(cuaternara) a cromozomului celular, au stabilit functiile si vitatea
semantics in definirea unor caractere exprimate fenotipic.

Progresele tehnice, perfectionarea metodelor au permis abordarea r

studii care au revolutionat genetica: incercari de cartografiere a omului
uman, principii si aplicabilitatea ingineriei genetice si clonarea omului
uman.
Intelegerea importantei acestor studii impune prezentarea etapelor,
norabile, in analiza genomului, a ADN-ului, care, prin structura si ;tiile
sale, stabileste tipul constitutional genetic caracteristic fiecarui vid
conspecific.

303
1. Tipul constitutional genetic

Daca in conceptia filozofilor antici prin constitute se intelegea

structura fizica a individului, starea sa anatomica stabila, ulterior au fost
elaborate definitii si ipoteze referitor la tipul constitutional al individului.
Aceste ipoteze §i definitii au fost elaborate de psihologi, psihiatri,
neurologi, endocrinologi §i geneticieni, etc.
De exemplu, Kretschmer (1921), in lucrarea ,,Structura corporala si
caracterul", definea tipul constitutional in urmatorii termeni: „este ansamblul
caracterelor unui individ grefate pe ereditatea sa".
In 1922, Pende, exponent al scolii constitutional italiene considera
tipul constitutional ca un ansamblu de particularitati morfologice, fiziologice
§i psihologice, prin care se caracterizeaza individul. Sunt particularitati
determinate genetic, spune Pende, adapate la influentele modificatoare ale
mediului inconjurator.
Mai tarziu, I.C.Parhon (1930) definea tipul constitutional ca o ...
„conformatie morfologica a unui individ dat, compozitia sa chimica, modul de
functionare a diverselor organe si felul in care el se comporta din punct de
vedere psihic".
In 1934, Kretschmer redefine§te notiunea de tip constitutional
considerand-o un „ansamblu al intregului organism, in masura in care acesta
formeaza, o entitate somato-psihica cu o interpretare activa si o
interdependent^ constants a morfologiei, fiziologiei §i caracterologiei".
Pentru intelegerea corecta a conceptului „tip constitutional genetic"
al individului uman, pentru a valorifica efortul de cartografiere a genomului,
a evidentia progresele realizate in ingineria genetica cu implicatii in
patologia umana, se impune elaborarea unei formulari cuprinzatoare care sa
exprime esenta constitutiei bio-genetice.
Dupa o suita de formulari, incomplete sau eronate, s-a ajuns la o
definitie cuprinzatoare elaborate de Delaunay (1969). El considera terenul
sau tipul constitutional al individului uman „o stare a materiei vii care
rezulta din prezenta in celula a unui mare numar de constituenti chimici. 0
stare relativ stabila deoarece depind in ultima instanta de factorii genetici.
Dar in acela^i timp este sj o stare care poate deveni instabila pentru ca pot
interveni factori externi organismului, sau inerenti lui".
Nascuta din neccsitatea de a explica functiile de ereditate §i
variabilitate (sincronica si diacronica), normale sau patologice ale omului,
definitia contureaza clar ca trasaturile morfo-fiziologice §i comportamentele

304
reprezinta raportul de interdependenta stabilit intre factorii genetici si factorii
externi.
Caracterele morfologice exprimate fenotipic au un determinism genetic,
sunt inscrise, in forma codificata, in genomul fiecarui individ. Au continuitate
genetica.
Totusi, stabilitatea este relativa deoarece in perioada dezvoltarii embrio-
fetale, mecanismele genetice implicate in diferentierea viitorului organism pot fi
„dereglate". Consecintele acestor „dereglari" in aparatul genetic pot fi:
- aparitia unor dezechilibre in tiparele informational-codificate
genetic, care controleaza diferentierea celulara, tisulara, organogeneza;
- „instabilitatea" caracterelor ereditare, consecinta actiunii factorilor
mezologici „agresivi". Sunt procese si factori ce pot duce la modificarea
tipului constitutional al individului.
Latura morfologica si componentele tipului constitutional au valoare
practica si teoretica deosebita deoarece stabileste particularul si individualul
fenotipului: forma corpului, talia, greutatea, pigmentatia, trasaturile de caracter,
comportamentul, temperamentul, trasaturile normale, deviante sau patologice.
Toate trasaturile de caracter, macro- si micromorfologice, moleculare,
comportamentale au un determinism genetic mostenit de individ de la ascendenti.
Desi mostenite caracterele de la ascendenti, prin zestrea genetica, consemnam
diversitate in exprimarea fenotipica, consemnam diferentieri, lipsa unei totale
identitati somatice. Neidentitatea fenotipica intre genitori si descendent este
rezultatul diversitatii genotipurilor realizate prin recombinarea genetica a
genomului in meioza genitorilor si unirea aleatorie a gametilor haploizi (ovul-
spermie, cu formarea zigotului din care se dezvolta un nou organism).
La organismele cu reproducere sexuata si om, posibilitatile de recombinare
a aparatului genetic, valoric sunt amplificate. Ele se realizeaza prin recombinari
inter- si intracromozomale, in meioza fiecarui genitor. Aceste posibilitati de
recombinare a genomului indue marea diversitate a constelatiilor genice. De aceea
se considera ca fiecare individ este o fiinta unica, originala si irepetabila genetic,
prezentand o constitute bio-moleculara, structurala, morfologica si functionala in
raport cu indivizii conspecifici.
Deci principiul biologic de realizare a termenul constitutional genetic isi
gaseste fundamentul in ADN-ul genomic. Se cunoaste ca ADN-ul cromozomal din
nucleu, este relativ constant pentru specie, dar calitativ este particular fiecarui
individ.

305
 Daca diversitatea constelatiilor genice este consecinta recombinarilor
inter- si intracromozomice, in schimb specificitatea structurii fiecarei
molecule de ADN (in care sunt inscrise codificat informatiile genetice pentru
fiecare trasatura de caracter) este explicate prin posibilitatea de ordonare
aperiodica a celor patru baze azotate (A, G, T, C). In prezent se cunoaste ca in
genomul uman se gasesc aproximativ 3,5 miliarde perechi de nucleotide.

2. Metode de analiza a structurii ADN

Principii

In studiul genomului uman sunt etape care au pernis elaborarea

proiectului de decodificare, cartografiere si clonare, cu implicatii in practica
bio-medicala si inginerie genetica.
Ca prima etapa, este anul 1944 cand Avery si Mc Leod, experimented
pe Diplococcus pneumoniae au stabilit rolul ADN-ului in ereditate, cand, prin
transformarea moleculei, a modificat virulenta la microorganisme. Este etapa
conturarii noului compartiment de cercetare: „biologia si genetica
moleculara".
A urmat anul 1953 cand, Waxon §i Crick (laureatii premiului Nobel)
au stabilit structura tridimensionala a ADN-ului, iar Chargaff
complementaritatea bazelor azotate. Aceste studii au permis descifrarea §i
implicarea ADN-ului in ereditatea si variabilitatea organismelor vii.
O etapa deosebita in studiul biologiei §i geneticii moleculare incepe in
anul 1970. este anul marcat cu o descoperire de importanta bio-medicala
esentiala: „ingineria genetica sau tehnologia ADN-ului recomnbinant". In
prezent, datorita microaparaturii §i metodelor de cercetare realizate pentru
cartografierea genomului, ingineria genetica §i clonarea genomica, impune
cunoa§terea structurii ADN-ului (vezi capitolul 2 - Structura ADN-ului
celular).
Descifrarea structurii ADN-ului a fost posibila folosind metode sj
tehnici moderne de studiu si cercetare.

306
 Ca principii, metodele folosite pentru analiza structurii ADN-ului sunt
urmatoarele:
a) - Absorbtia in ultraviolete (U.V.)
metoda absorbtiei ADN-ului in UV a fost elaborate de Casperson in 1936.
Principiul metodei se bazeaza pe proprietatea moleculei de ADN de a
absorbi specific, lumina UV in lungimea de unda de 260 nm23.
Aceasta metoda, calitativa, nu ajuta la stabilirea structurii totale a
moleculei de ADN. Ca metoda calitativa, UV ajuta sa identificam prezenta acestor
molecule in celuUL

b) - Spectrul de difractie a razelor X

Este o tehnica cristalografica, bazata pe capacitatea moleculei de ADN de a
cristaliza in saruri de litiu si sodiu. Datele se aduna pe clisee spectrale de difractie a
razelor X si analizate prin ecuatiile transformarii Fourier. Metoda descrie structura
ADN-ului pana la nivelul a 10 milionimi de milimetru.

c) - Ultracentrifugarea in gradient de densitate

Metoda a fost elaborata de Meselson si Stahl in 1958 pentru a demonstra ca
ADN-ul dublu catenar (respectand principiul complementaritatii bazelor azotate de
cupiare a celor doua catene polinucleotidice) se replica semiconservativ.
Metoda se bazeaza pe urmatorul principiu: ADN-ul extras din celula si
purificat, se introduce intr-o solutie de CsCl (clorura de cesiu), apoi se supune
centrifugarii la 140.000 g24, timp de 24 ore. Pentru identificarea catenelor si,
respectiv, a moleculelor de ADN, nucleotidele se vor marca cu N14 sau N15,
analiza facandu-se pe generatii celulare in functie de atomul marcat folosit.

d) - Denaturarea - renaturarea prin variatii termice

23
" 'A = 10"'° m = 0,1 nm (nanometri)
24
G = acceleratia gravitationala = 9,81 m/'sec2
307
 Principiul metodei este urmatorul: se incalzeste ADN-ul in solutie
apoasa. In aceste conditii termice cele doua catene complementare ale
moleculei se separa prin ruperea puntilor de hidrogen, iar vascozitatea scade.
Cand solutia se raceste lent, catenele complementare se recupleaza, se
realizeaza renaturarea moleculei. In aceste conditii denaturarea este
reversibila. Daca solutia este racita brusc, catenele nu se mai recupleaza,
catenele raman separate. Denaturarea se considera ireversibila. Metoda se
foloseste in hibridarile moleculare ADN-ADN sau ADN-ARN.
Denaturarea moleculei de ADN se face timp de 10 minute la
temperatura de 100° C in solutie apoasa.
Prin denaturare creste absorbtia in UV a bazelor azotate libere.
Parametrii care asigura gradul si viteza de renaturare a ADN-ului
denaturat sunt: concentratia initiala (Co) si timpul (t) de refacere a moleculei
ADN. Cot este produsul dintre concentratia molara a ADN si timpul de
reactie pentru reasociere care se exprima in secunde: Cot - cot = valoarea de
comparare a vitezei de reasociere a secventelor monocatenare de ADN.
In raport cu valoarea Cot rezultatul si interpretarea sunt urmatoarele:
cu cat valoarea Cot este mai mica, cu atat valoarea de asociere a catenelor
complementare este mare si invers.
Viteza de repetabilitate este determinata de complementaritatea
secventelor polinucleotidice: secvente complementar repetabile sau secvente
nerepetabile.Secventele repetitive se reasociaza intr-un timp rapid, in timp ce
secventele nerepetitive reasociaza lent, intr-un timp mai indelungat.

e) - Studiul ADN-ului la microscopul electronic cu transmisie

Incepand din 1960, gratie metodei puse la punct de Cairus, se
examineaza molecula de ADN prin vizualizare la microscopul electronic.
Primele observatii au fost facute pe ADN-ul bacteriofagilor dupa prealabiia
distrugere si eliminare a capsidei proteice.

308
. Metode de analiza a genelor. Cartografierea
enomului uman

Identificarea, locusul si analiza unei gene din cromozomul genomic, ;

dau posibiliatea de a elucida comportamentul si amplificarea unei gene :
poate fi clonata, clarifica mecanismele translatiei infonnatiei genetice,
:scifreaza reglarea genetica a sintezei de proteine.
Studiul genelor din genomul celular da posibilitatea de a urmari pe
ape ontogenetice, activitatea lor. Respectand principiul cronogenetic si
onobiologic, identificam prezenta genelor in genom, momentul inceperii
stoparii activitatii lor, efectele deviante a unei gene mutante asupra
nului.
Prin metoda hibridizarii moleculei de ADN evidentiem daca gena
utanta este mostenita de la ascendenti, daca este un produs mutagen „de vo"
(neomutatie), sau identificam formarea unei clone celulare capabila initieze
un proces genetic tumorigen etc.
De asemenea, sunt metode care, prin identificarea si structura
genei, ;usul exact al genei pe cromozom, pot fi folosite in mecanismele de
*inerie genetica, in terapia bolilor pe fond genetic (determinate de gene
itante), in modificarea virulentei bacteriilor, in industria de medicamente

1. Hibridizarea ADN-ului genomic

Una din metodele recomandate pentru complexul de activitati si

:ntificare a genelor este hibridizarea ADN-ului din genomul celular.
Pentru aceasta analiza se folosesc sondele genetice care recunosc lele
normale sau anormale, cu respectarea complementaritatii ileotidelor din
structura genei investigate si nucleotidele ordonate in ida genetica, sau prin
identificarea diversilor markeri genetici.
Principiul metodei este urmatorul: separam termic catenele
nplementare din molecula ADN. Dupa separare se identified pozitia,
lensiunea si componenta nucleotidica a genei folosindu-se sonde

309
monocatenare de ADN, care au structura cunoscuta. Sondele sunt marcate
cu izotopi radioactivi, sau sonde fluorescente.
Conform principiului complementaritatii bazelor, sonda (sau
sondele) se va / se vor cupla complementar pe secventa monocatenara
„omoloaga" a ADN-ului analizat, refacand structura bicatenara a ADN.
Deci, hibridizarea, prin folosirea sondelor genetice, este realizata
daca: ADN-ul separat termic monocatenar are structura omoloaga cu sonda
folosita. De exemplu: sa presupunem secventa polinucleotidica pe
monocatena ADN:
........A T T T C G G C ATTGATTGG.......................
|<------------------------------>|
daca sonda artificial sintetizata si marcata cu 32p are componenta §i
ordonarea in nucleotide de tipul: .... AAGCCGTAACTA....................
Conform principiului complementaritatii, sonda se va cupla pe
secventa monocatenei din ADN genomic, separata termic, astfel:

ADN............ATT TC G G C A T T G A T T G G .....................
IIII III III III III IIIIII III II
Sonda................. A AG C C G T A AC A....................

Se folosesc diverse metode de hibridizare moleculara.

a) Metoda Southern - Blot

Principiul metodei: se foloseste o sonda specifica, marcata cu 32p,
care, complementar, se va cupla cu o secventa omoloaga din genomul
celular, respectiv cu o gena, care a fost separata sub actiunea enzimelor de
restrictie. Este metoda de transfer Southern - Blot. Etapele metodei Southern
- Blot sunt urmatoarele:
- extragenea ADN-ului genomic din limfocite, fibroblasti, celule
amnidice, vilozitati coriale, etc.;
- eliberarea ADN-ului extras (fragmentare) cu ajutorul unei enzime
de restrictie corespunzatoare. La nivelul siturilor de restrictie se pot obtine,
prin fragmentare, secvente cu o dimensiune pana m 20 Kb;
-denaturarea fragmentelor de restrictie pentru separarea
monocatenelor;
310
 - trecerea fragmentelor monocatenare pe geluri de agaroza, sau prin
ipilarizare, unde vor fi imobilizate;
- prepararea sondelor si marcarea lor radioactiva;
- se hibridizeaza fragmentul monocatenar cu sonda preparata
ntetic. Cuplarea respecta principiul complementaritatii bazelor azotate;
- complexul format - molecula hibrida dublucatenara din fragmentul
DN monocatenar restrictionat si sonda complementary se supun spalarii;
- evidentierea complexului hibrid dublu catenar cu ajutorul unui
mnal care este un indicativ pentru identificarea dimensiunii si pozitiei
igmentului hibridizat.
Avantajul metodei Southern - Blot este urmatorul:
- identificarea unei gene normale in genomul celular, pentru ibilirea
tipului constitutional al individului analizat;
- identificarea genelor cu mutatii punctiforme din genom, prin
icrodelatii sau prin insertii genice.
Metoda permite identificarea organismului, daca este heterozigot ntru
o gena mutanta, stabilim tipul de gena, si diagnosticul prenatal, jasemenea
ajuta sa stabilim care dintre genitorii unui copil are in genomul Dpriu gena
mutanta transmisa descendentului.
Este o metoda cu aplicabilitate in consultul si sfatul genetic familial,
criminalistica. In medicina legala, in antropologie, in stabilirea tipului netic
si incompatibilitafile genetice intre indivizi.

Metoda Northern - Blot

Principiu: se foloseste molecula de ARNm extras din celula
>anismului investigat. ARNm va complementariza cu o sonda mocatenara
de ADN marcat cu ~ p (ADNc denaturat), care la randul sau
complementariza cu oligonucleotidele ADN-ului antisens.

Metoda FISH sau hibridizarea in situ a ADN

Analiza se face direct pe genomul celular, cand cromozomii se sesc in
prometafaza ciclului mitatic. Pentru identificarea si pozitia genei folosesc
sonde marcate cu substante fluorescente (FISH), sau cu izotopi tioactivi de
tipul 32p.
Metoda permite identificarea si localizarea genei pe cromozom, sau
ntificarea microdeletiilor.

311
 Metodele de hibridizare a ADN-ului genomic au importanta si
aplicabilitate in biologie si medicina. Cu ajutorul lor putem obtine
urmatoarele date cu valoare interpretativa:
- identificam numarul secventelor repetate in genom, numarul de
copii polinucleotidice;
- stabilim gradul de rudenie intre indivizi, identitatea genetica a
indivizilor conspecifici, precum si filiatia genetica;
- identificarea ADN-ului viral, evidentierea secventelor specifice de
ADN si ARN din celule si tesuturi;
- stabilirea diagnosticului genetic prenatal si postnatal pentru bolile
pe fond genetic;
- ajuta, ca principiu genetic, in practica grefelor si transplantelor, la
stabilirea compatibilitatii sau incompatibilitatii genetice;
- permite identificarea markerilor genetici specifici, celulari sau
tisulari.

3.2. Cartografierea genelor prin secventierea ADN-ului

genomic

Inca din 1909 atenfia geneticienilor s-a concentrat asupra identificarii

si localizarii genelor in genomul organismelor, asupra cartografierii
genomului uman.
Cartografierea genomului uman este de importanta deosebita,
deoarece permite:
- stabilirea si cunoasterea tipului constitutional genetic al fiecarui
individ din familie sau populatie;
- diagnosticul bolilor genetice;
- analiza incarcaturii genetice a populatiei prin imigrarea indivizilor si
asimilarea unor gene ce le erau particulare in genafondul populatiei
autohtone;
- consultul genetic, sfatul genetic si aprecierea riscului de
transmitere si aparitia unor boli pe fond genetic.
Pe parcursul cercetarilor efectuate s-au folosit si se folosesc variate
metode pentru localizarea genelor pe cromozomi, pentru cartografierea
genomica.

312
3.2.1. Cartografierea genetica

Metodele clasice de a realiza cartografierea genelor sunt legate de

analiza linkage-ul genetic si recombinarea intra- si intercromozomica in
timpul diviziunii reductionale - meioza. a) Linkage-ul genie
Daca raportam numarul cromozomilor din genomul celulei umane, a
numarului perechilor de nucleotide din genom, si dimensiunea unei gene
informational activa, la diversitatea si multitudinea trasaturilor fenotipice de
nivel molecular, celular, tisular, de organ, organism in ansamblu, se desprinde
urmatoarea observatie si concluzie: numarul genelor codante din structura
ADN-ului cromozomial este considerabil de mare.
Datorita raportului valoric stabilit intre numarul genelor si numarul
cromozomilor din genom, se considera ca fiecare cromozom are in
componenta sa un numar foarte mare de gene, care ocupa locusuri proprii.
Cum in meioza, setul de gene din fiecare cromozom se repartizeaza in
gametii haploizi impreuna cu cromozomul „gazda", confirmand ca genele cu
locusuri pe un cromozom nu sunt izolate, nu sunt independente. Ele se gasesc
intanite si se transmit grupate. Este „linkage-ul genie".
Morgan este primul cercetator care a demonstrat linkage-ul genelor.
Genele care se gasesc inlantuite si ocupa un segment cromatidic din
cromozom formeaza un haplotip. In mod natural haplotipul genelor inlantuite
se transmite grupat. Ca exemple de haplotipuri genomice mentionam:
sistemul HLA pe bratul scurt al cromozomului 6, sistemul Rh si Duffy pe
bratul lung al cromozomului 1, s.a.
Pentru evidentierea si valoarea genetica vom analiza sistemele
genetice eritrocitare Rh si Duffy (a se vedea sistemele genetice) (fig. 71).
Analiza si interpretarea de transmitere si segregare a caracterelor
determinate de genele din haplotip, incepe de la cuplul parental (P) care sunt
dublu homozigoti si anume, un genitor dublu homozigot dominant Rh+
Df+/Rh+ Df+, al doilea dublu homozigot recesiv Rh- Df-/Rh- Df-.

313
 Fl Rh+y \7 Rh+
Dff OO Dfr

F2

Homozigo
t dominant Heterozigoti Homozigot recesiv
, 25% 50% 25%
V. «,_.,.,___*M___, ,____________„'

25% Rh- Df-

75%Rh+Df+
B.aport de segregare 3:1

Fig. 71 Linkageul genie intre genele pentru Rh si Duffy pe bratul q al

cromozomului 1.

314
Legenda:
Rh+ y
mi- if
Rh- Q
Df- •

Modul de transmitere si regregarea genetica cu exprimarea fenotipica

a celor doua caractere diferite confirma linkage-ul genie §i anume:
Cuplul parental elaboreaza gameti haploizi care: la genitorul dublu
homozigot dominant, fiecare garnet va contine numai cromozom cu Rh+ Df+,
iar celalalt genitor, homozigot recesiv, va elabora numai gameti Rh-Df- (vezi
figura).
Prin fecundatia celor doua tipri de gameti vor rezulta descendenti,
care, genetic, 100% vor fi heterozigoti Rh+ Df+/Rh- Df-, iar fenotipic toti vor
fi Rh+ Df+ (caractere codioficate de gene dominante). In cazul cand
descebndentii heterozigoti Rh+ Df+/Rh- Df- se vor cupola pentru
reproducere, fiecare va elabora doua tipuri de gameti ce se vor diferentia prin
cromozomul care contine Rh+ Df+ si Rh- Df-.
Prin fecundarea acestor gameti „puri" din punct de vedere genie, vor
rezulta descendenti, care, probalistic, vor poseda urmatoarele genotipuri si
fenotipuri exprimate: 25% dublu homozigoti dominanti (Rh+ Df+/Rh+ Df+),
50%o dublu heterozigoti (Rh+ Df+/Rh- Df-) si 25% dublu homozigoti recesivi
(Rh- Df-/ Rh- Df-); fenotipul posibil exprimat va fi de 75% Rh+ Df+ si 25%
Rh- Df-. Acest raport probalistic este determinat de gena dominanta care este
functional codanta atat in cuplu homozigot cat si in starea heterozigota, iar
Rh- Df- este functional numai in cuplu alelic homozigot.. Daca raportam
valorile ce se pot obtine, stabilim raportul de segregare fenotipica de 3:1.
Deci in F2 este un raport de segregare 3:1 care aminteste de raportul
de segregare monofactonal (monohibridare). Dar in modelul prezentat sunt
doua caractere distincte. Cum raportul de segregare va fi de 3:1, inseamna ca
respectivele gene Rh+) prezentate de o suita de trei gene, C D E dominante,
sau c d e recesive, dar caracterul de Rh+ este dat de gena dominanta D) si
gena Df (dominanta Df+ sau recesiva Df-) se confirma ca respectivele gene au
locusuri pe acolo si cromozom (cromozom 1) sunt linkate si se transmit
grupat.

315
b) - Analiza crossing-over-ului
Observatiile facute pana in prezent plecand de la observatiile clasice,
au evidentiat ca disjunctia independents a caracterelor nu este intotdeauna
conforms cu legile mendeliene de segregare.
Primele observatii apartin lui Morgan care a observat la Drosophila
melanogaster necorcondanta intre genotipul genitorilor si fenotipul
descendentilor, in sensul abaterii de la raportul de segregare mendeliana.
Aceste abated, ca „accidente" genetice, au fost denumite „crossing-over".
Crossing-over-ul, dupa Morgan, s-ar produce intr-un numar mic de celule
genetice in timpul profazei primare a primei diviziuni meiotice reductionale.
Crossing-over-ul s-a demonstrat a fi un mecanism de recombinare intre
cromozomii omologi (intracromozomica) si care modifica valoric raportul
probalistic de segregare fenotipica a caracterelor mendeliene.
Ca definitie, crossing-over-ul este schimbul reciproc de segmente
cromatidice intre cromozomii omologi in timpul meiozei.
Se apreciaza ca frecventa de realizare a crossing-over-ului este direct
proportionala a distantei locusului unei gene in raport cu centromerul
cromozomului. Unitatea de masura a crossing-over-ului este centrimorfanul
(1 cM = 1000 kb; 1 Kb = 1000 perechi de nucleotide). Frecventa de
producere a crossing-over-ului este raportul dintre descendentii recombinati
si numarul total de descendenti.
Frecventa de recombinare serveste drept criteriu, la a aprecia distanta
intre gene, cu locusuri pe acelasi cromozom, permite sa stabilim harta
cromozomica pentru identificarea genelor cu locusuri pe cupluri de
cromozomi omnologi.

c) - Metoda sondelor si a amprentelor genetice

Pentru identificarea genotipului si cartografierea cromozomi lor,
diagnostic si explorarea produselor genice se folosesc sondele si amprentele
genetice.
Sonda are rolul de a recunoaste gena pentru care este
complementary, recunoasterea fiind bazata pe hibridizarea moleculara. Gena
„sonda" are rolul de a recunoaste markerul genetic de interes.
O sonda ADN sau ARN trebuie sa contina o secventa de eel putin 20
nucleotide.
Sondele pot fi directe sau indirecte.
Sondele directe au omologie cu gena din ADN-ul genomului celular
supus studiului.
Se folosesc frecvent urmatoarele sonde directe:

316
 - ADNc - sunt sondele obtinute prin clonare, sau copii de ADNc
sintetizate de ARNm;
- Sonde de ADN genomic. Aceste sonde pot identifica secventa
exonica sau intronul din structura genei studiate. Ambele tipuri de gene sunt
incluse intr-un vector recombinant;
- ribosondele, sunt secvente de ARN monocatenar, obtinute cu
ARN-polimeraza.
-oligosondele de sinteza. Sunt secvente scurte de nucleotide de ADN
monocatenar.
Sondele indirecte. Sunt fragmente de ADN din ADN-ul genomului
celular. Ele sunt folosite pentru explorarea unei gene necunoscuta sau care nu
este inca clonata.
Sondele indirecte nu vor contine secvente dispersate de ADN inalt
repetitiv, dar pot contine unele secvente ce corespund ADN-ului moderat
repetitiv. Sondele indirecte evidentiaza RFLP-ul (polimorfismul lungimii
fragmentului de restrictie) considerat marker genetic.
Pentru analiza ADN-ului genomic se foloseste, frecvent, metoda
Southern. Este metoda care permite vizualizarea unei secvente unice.
Etapele de lucru ale metodei Southern sunt urmatoarele (vezi capitolul
VII, punctul 3.1, a si b):
- fragmentarea ADN-ului genomic prin electroforeza in gel de
agaroza;
- denaturarea secventelor polinucleotidice ale ADN-ului „in situ";
- trecerea secventelor denaturate prin capilarizare pe un suport solid
(filtru de nitroglicerina sau nylon);
- denaturarea prin hibridizare in prezenta unei sonde monocatenare
marcata cu izotopi radioactivi;
- identiflcarea duplexuri lor formate prin complementaritate intre
sondele marcate si secvente din ADN.
Metoda sondelor ajuta sa identificam deletiile complete homozigote,
sau hemizigote daca semnalul radioactiv lipseste.
Deasemenea putem identifica deletiile partiale greu identificabile.
Pentru siguranta si explorare corecta se pot folosi mai multe tipuri de
enzime de restrictie pentru a stabili daca modiflcarea identificata de o anume
enzima de restrictie este sau nu rezultatul unei mutatii punctiforme prin care
s-ar putea creea un situs suplimentar.
Inconvenientele metodei sunt:
- necesita un timp foarte lung de executie si foarte complicata ca manevre de
lucru (in special capilarizarea secventelor denaturate);
- metoda nu poate fi automatizata.

317
c) - Dozajul genie la subiectii cu aberatii cromozomiale
Metodele „morganiene", respectiv analiza linkageului genie si
crossing-over intracromozomal, sunt metode limitate, care se bazeaza pe
observarea simultana a diverselor caractere, si urmarite, ca distribute, in
succesiunea generatiilor intrafamiliale sau in populatie.
Ca o imbunatatire a modalitatilor de cartografiere genica a fost
ipoteza lansata de Harris (1965). El elaboreaza ipoteza „efectului cantitativ" al
genelor in genomul organismului.
Ipoteza Harris raspunde la doua concepte:
- ca genele controleaza metabolismele prin codificarea determinata in
sinteza proteinelor, a enzimelor;
- ca fiecare alela structural^ codifica, cantitativ, produsul proteic celular,
produsul cantitativ al enzimei.
Conform ipotezei lui Harris, se considers ca doua gene alelomorfe,
care codifica aceasi enzima (proteina) asigura o activitate de 100%, in
conditiile fiziologice. Dar s-a constatat ca in anomaliile cromozomiale de
numar (trizomii sau monozomii), in anomaliile cromozomiale de structura
(trizomiile partiale realizate prin translocatii cromatidice, sau monozomiile
parti ale, consecinta a deletiilor cromatidice) apar modificari corespunzatoare
in cantitatea de proteina specific sintetizata sau in activitatea enzimelor.
Aceste efecte sunt explicate prin existenta unui supradosaj genie in genom, in
cazul trizomiilor complete sau partiale sau sub dozaj genie in cazul
monozomiilor complete sau partiale. De exemplu, verificand ipoteza lui
Harris, cercetarile lui Sinet, Bethare, Junien (1978) au semnalat ca in trizomie
activitatea unei enzime va fi de 150%, iar in monozomie se va reduce la 50%,
confirmand ipoteza. In functie la care pereche de cromozomi s-a produs
respectiva mutatie se poate stabili locusul respectivelor gene.
Daca incercarile de cartografiere genica a cromozomi lor prin analiza
linkge-ului genie si crossing-over-ul erau un ,joc de estetica stiintifica", de
mica importanta pentru perioada 1911, ulterior s-au intensificat cercetarile
pentru realizarea cartografierii genomului la organismele vii.
De exemplu, cercetarile lui Lederberg si Tatum (1946), Cavalli-Sforza
(1950), Lederberg (1952), Hayes (1953) s.a, folosind procesul de conjugare
bacteriana au cartografiat genomul procariotului Escherichia coli. La om,
primele incercari apartin lui Barski si col. (1960), apoi au urmat cercetarile
lui Eplirussi si Weiss (1965), Harris si Watkins (1965), Weiss si Green
(1967), Migeori (1968) s.a.

318
 Cartografierea genomului uman, pentru timpul respectiv, a intampinat
dificultati legate de:
- numar relativ mare de cromozomi omologi (la om 23 perechi);
- complexitatea aparatului genetic, exprimat prin numarul foarte
mare de gene;
- un ciclu reproductiv tardiv si limitat (la distanta de aproximativ 20
ani intre generatii);
- existenta sistemelor poligenice cu activitate convergenta pentru
acelasi caracter (caracterele poligenice), a caror gene au locusuri pe
cromozomi neomologi;
- obstacolul etic de a nu se experimenta la om „in vivo";
- uneori, incertitudinea filiatiei genetice „legale";
- lipsa tehnologiei performante, a metodelor de finete care ar fi
permis patrunderea in infracosmosul structural si functional al genomului
uman.
La Inceputul anului 1980 a fost lansata ideea „Proiectul Genomului
Uman" de catre D. Botstein si R. Davis. Ideea, lansata ca metoda de studiu, a
fost cartografierea genomului uman prin folosirea amprentelor electrofonetice
de fragmente de restrictie a ADN-ului, cu lungimi polimorfice.
Elaborarea „Proiectului Genomului Uman" a fost posibila datorita
urmatoarelor cercetari „cheie" anticipate si anume:
- secventierea genomului virusului Q174, a fagului H si a virususlui
SV40 intre anii 1977-1982;
- programele de cercetare care au dezvoltat hartile fizice a clonelor
inserate cu informatia genetica specifics genoamelor la Saccharamyces
cerevisiae, care au demonstrat fezabilitatea idei asamblarii fragmentelor cu
secventa mica in genomuri complexe si complete. Hartile fizice au permis
izolarea genelor bazata numai pe pozitia acestora pe cromozom;
- dezvoltarea noilor tehnici performante si metoda de secventiere a
fragmentelor de ADN complementar (ADNc), cum este „random shatgun
sequencing", au permis folosirea ESTs („Expressed sequenci taglin"), tehnica
de secventiere automata.
„Proiectul Genomului Uman" a avut finalitate in 1999, cand s-au
descifrat cu succes, secventele polinucleotidice din ADN-ul genomului uman,
cu o acuratete de 99,99%. Secvente fara Gap-uri informationale. In aceeasi
pcrioada s-a realizat „construirea" de cromozomi bacterieni artificiali
(Bacterian artificial chromosome - Bac), care au asigurat dezvoltarea unui
sistem de clonare prin insertia in genom a fragmentelor de

319
ADN de lungime mare, care prezentau mai multa stabilitate decar cele
inserate in cosmide.

3.2.2. Polimorfismul de restrictie

Polimorfisml de restrictie (RPLP = polimorfismul lungimii

fragmentelor de restrictie), consemnat in cartografierea cromozomului si
analiza tipului constitutional genetic la om, reprezinta marked genotipici
codominanti.
RFLP sunt variatii individuale ale secventelor de ADN ce pot fi
identificate prin modificarea hartii de restrictie, folosindu-se metoda
Southern.
RFLP este determinat de cuplul sonda-enzima de restrictie ce
corespunde unui locus din ADN-ul cromozomial.
Fiecare fragment de restrictie, ca tip variabil in genom, se transmite
mendelian, reprezentand (ca valoare genetica) un marker genetic.
Pentru organismele cu reproducere sexuata, fiecare tip de fragment de
restrictie se prezinta in cuplu alelic pe cromozomii omologi. Daca este
homozigot, cuplul alelic de restrictie prezinta identitate dominanta, la
individul heterozigot raportul cuplului alelic de restrictie este codominant. In
consecinta, fiecare sistem alelic de restrictie este particular „specific" unui
locus polimorf.
RFLP-urile pot fi intragenice sau extragenice. Genomul uman
prezinia o paleta larga de variatii dimensionale individuale a situsurilor de
restrictie, dar care, in majoritate, sunt neutre.
Variabilitatea RFLP-urilor este determinate de diferenta de 1 la 200
nucleotide (1/200). Aceasta diferenta punctiforma determina o paleta foarte
mare de locusuri polimorfe.
Explorarea polimorfismului secvential a situsurilor de restrictie se
realizeaza in urmatoarele etape:
- hibridarea prin ribosonda care corespunde unei gene sau fragment
din gena si care corespunde si evidentiaza RFLP exonic sau intronic.
Ribosonda este asociata, pentru detectare, cu o enzima de restrictie. Cand
sondele sunt lungi, enzimele de restrictie le fragmenteaza, ceea ce amplified
numarul locusurilor explorate de sonde;
- hibridarea cu o sonda ADN urmata de detectarea „mis-watch-en"
prin denaturarea in gel.
- amplificarea secventierii unui segment cuprins intre doua amorse.

320
RFLP-urile bialelice corespund polimorfismului prin mutatii punctiforme
dand un singur situs de restrictie. In aceste cazuri cuplul sonda/enzima induce
doua variante ca alternative:
Este sistemul +/- ce poate fi analizat pe autoradiograma prin metoda
Southern.
RFLP-urile bialelice pot fi exprimate valoric prin legea Hardy-Weinberg,
cand o alela este notata cu p, omoloaga cu q. Conform legii Hardy-
Weinberg, putem calcula PIC-ul (polymorphism information content) al
unui RFLP autozomal, conform relatiei: PIC = 1 - (p2 + 2 p2 q2 + q2)
respectiv PIC = 1 - (p2 + q2).
Cu ajutorul relatiei PIC se poate aprecia polimorfismul de restrictie la
nivelul unei populatii, polimorfismul frecventei alelice in populatie. Prin
relatia PIC putem calcula frecventa teoretica a unui cuplu alelic, care poate fi
homozigot sau heterozigot, iar valorile obtinute pot fi comparate cu valorile
determinarilor practice a RFLP-urilor. In acest mod se stabileste daca
genotipurile din genofondul unei populatii se gasesc in echilibru sau nu.
In cazul cand se folosesc variate tipuri de enzime de restrictie, aceeasi
sonda poate identifica mai multe RFLp-uri diferite. Acest aspect confirma ca
un cuplu sonda-enzima defmeste un sistem alelic diferit. Cand pe acelasi
cromozom se asociaza doua sau mai multe variante non-alelice avem un
haplotip.
RFLP-urile multialelice reprezinta un polimorfism de repetitie sau de
rearanjare liniara a genelor componente ale unui cuplu de cromozomi
omologi.

4. Notiuni de inginerie genetica §i clonare

Incepand cu anul 1944 s-a conturat un nou departament de cercetari

genetice: genetica moleculara (Avery).
Genetica moleculara a revolutionat medicina moleculara prin folosirea
unor metode de diagnostic, de sinteza, examinare, analiza si manipularea
materialului genetic.
Clonarea si ingineria genetica insumeaza procedee efectuate „in
vitro", cu gene, cromozomi, sau celule, in scopul obtinerii de noi structuri
genetice, sau organisme nou reprogramate genetic.
Ca istoric, ingineria genetica incepe inca din 1969 cand Beckwith si
col, au izolat, pentru prima data, complexul genelor ce formeaza operonul

321
„lac" la Escherichia coli. Folosind mecanismul transductiei bacteriene,
bacteriofagul care se multiplied in bacterie ca celula gazda, produce liza
genomului bacterian. Urmarea lizei, ADN-ul genomic se fragmenteaza. Gena
„lac" acrosandu-se de molecula ADN a bacteriofagului, iar acesta folosind
alta bacterie ca gazda, insertioneaza gena in noul genom inducand un nou
caracter (sinteza lactozei).
Metodele ingineriei genetice elaborate se bazeaza pe molecula „ADN
vector" sau „caraus", care transports si introduce gena sau cromozomul dorit,
in genomul primitor, sau viitoarea gazda.
Tehnicile pot fi:
- inginerie genetica celulara, cand sunt fuzionati protoplastii celulei;
-inginerie genetica moleculara, bazata pe tehnologiile ADN-ului
recombinat.
Prin tehnologia ADN-ului recombinat „in vitro" se obtin molecule de
ADN recombinate care pot fi folosite in clonarea genelor.
Tehnologiile de inginerie genetica se bazeaza pe „constuctia" de
vectori de clonare, pe izolarea genelor folosire in clonare, gene denumite
initial, ADN pasager sau ADN heterolog. - Tehnica ADN - recombinant
foloseste un complex de enzime cum sunt: endonucleazele de restrictie,
ADN-ligozele, polimeraze, exonucleaze, reverstranscriptaze, fosfotaze
alcaline, etc.
Frecvent, cu rol de vector se folose§te genomul viral. Sunt insa si
metode non-virale pentru transferul genelor din genomul celular sau al
individului, ca donatori spre genomul primitor sau viitoarea gazda. Ca
metode non-virale, folosite pentru insertionarea directa a genei in genomul
celulelor tinta, mentionam:
- socul electric, bombardarea cu particule ADN, lipozomii,
transfexie cu laser, electroporatia, microinjectia cu ADN, §.a.
In raport cu posibilitatilor de studiu a exprimarii fragmentelor de
ADN-pasager insertionate, vectorii se clasifica in (Covic si col., 2001):
- vectori de clonare, care nu contin secvente de tip promotor. Sunt
vectorii care insertioneaza un singur ADN-pasager la un situs unic de
restrictie al vectorului ( nu ofera posibilitatea de a se analiza exprimarea
mesajului genetic in genomul primitor pe care il aduce ADN-ul pasager);
- vectori de clonare si exprimare. Au in structura lor secvente de tip
promotor. Prezenta promotorului in genomul vectorului permit clonare si
analiza exprimarii fragmentului de ADN pasager clonat;
- vectori de clonare prin inlocuire - ADN-ul clonat inlocuieste
(substituie) un fragment din molecula ADN-ului vectorial, dupa prealabila
digestie enzimatica cu endonucleaza de restrictie.

322
In raport de structura si mod de actiune, vectorii pot fi:
- vectori plasmidiali - prezenti in citoplasma bacteriilor. Sunt
alcatuiti dintr-o molecula mica de ADN, cu replicare independents fata de
cromozomul bacteriei;
- vectori virali - au originea si structura de genom viral;
- vectori hibrizi. Sunt bacteriofagi mici a caror structura hibrida este
compusa din genomul filamentos de bacteriofag si de plasmid;
- vectori cosmide cu structura hibrida: bacteriofag si plasmid. Vectorii
pot fi clasificati si dupa modul de actiune asupra gazdei. Ei sunt:
- vectori cronogenici. Au actiune de vectori numai la tulpinile din
acelasi gen taxonomic. Nu actioneaza divergent, n-au actiune distributive.
Sunt unitaxonomici.
- vectori naveta (shuffle). Sunt vectorii care au replicare stabila.
Sunt folosifi ca vectori de fragmente ADN-pasager pentru tulpini bacteriene
de genuri (taxonomii) diferite.
Ingineria genetica cu implicatii in clonarea genomurilor heterogene,
are la baza tehnici ale ADN recombinant, cand se pot realiza amplicari
selective a unei gene sau detectia specifica a unei gene.

323
Tabel X
Vectori folositi pentru ADN-ul recombinant
Tipul de vector Avantaje Dezavantaje
Retrovirusuri - Integrarea in genomul - Integrare semialeatorie.
celulei gazda. - Necesita diviziuni
- Toate genele virale celulare pentru
pot fi inlaturate. amplificarea ADN-
- Recombinant relativ recombinant.
singur. - Titru relativ scazut.
Adenovirusuri - Titru important. - Toxicitate
- Traductia eficienta in - Imunogenitate
celulele in repaus „in semnificativa
vitro" si „in vivo" - Frecvente pre-
expuneri.
Virusuri adeno- - Toate genele virale - Numai pentru
asociate (AAV) pot fi inlaturate. fragmente mici de ADN.
- Recombinant singur. - Obtinerea este dificila.
- Expresia este stabiia - Genom incomplet
- Transductia la nivelul elucidat.
celulei in repaus
Lipozomi - Inofensivi, nu - Transfer genie nuclear
formeaza agenti ineficient
infectiosi. - Integrarea
- Imunogenitate nepersistenta in nucleu
neglkijabila - Lipsa specificitatii de
- Fragmentele ADN pot tesut
avea dimensiuni mari
Cosmide - Folosesc bacteria
drept gazda. Permit
insertia.
 - Cupleaza fragmente
de ADN genomic.
Cromozomi artificiali Incorporeaza fragmente
BACs §i YACs foarte lungi de ADN -
sunt plasmide cu
centromere si talomere
impale

- ajuta la cartografierea cromozomilor si elaborarea hartii genetice la

om.
- putem cunoaste si elucida mecanismele de reglare in expresivitatea
genei, prin procedeul de inductie sau represia operonului;
- serveste la identificarea markerilor genetici cu aplicabilitate in
medicina legala, criminalistica, antropologie, etc.;
- ajuta la identificarea si izolarea unei clone genetice;
- sa identificam mutatiile punctiforme;
- este tehnica amplificarii genelor „in vitro" (PCR), daca se
foloseste ADN-ul ca matrita.

4.1. ADN-ul recombinant

Principiu

Recombinarea naturala a ADN-ului genomic are loc in meioza

(elaborarea gametilor) si fecundatie,. Acest mod de recombinare are un rol
important in evolutia speciilor, in diversificarea genotipurilor intre indivizii
conspecifici, cu expresivitati fenotipice variabile. Este recombinarea
(naturala) care asigura incadrarea indivizilor conspecifici in limitele normale
de toleranta ale speciei.
Opus recombinarii naturale, este recombinarea artificiala sau
tehnologia ADN-ului recombinant realizata in vitro (in conditii de laborator),
cand se foloseste o tehnologie complexa, cunoscuta sub denumirea de
inginerie genetica.
Recombinarea artificiala a ADN-ului (Genetic Enginering), progres al
biotehnologiei moderne, se bazeaza pe introducerea unei cantitati de
informatie genetica suplimentara in genomul unui organism (bacterie, vegetal,
animal).
325
 Ca tehnologie, recombinarea ADN-ului „in vitro" se realizeaza in
urmatoarele etape:
- sectionarea ADN-ului in fragmente specifice. Fragmentele
obtinute sub actiunea enzimelor de restrictie prezinta capete adezive;
- sectionarea ADN-ului din genomul vectorului, care va cupla
vectorul specific de la „donator". Fiecare fragment din ADN-ul vectorului
prezinta capete adezive;
- cuplarea fragmentului specific cu un fragment ADN al vectorului la
nivelul capetelor adezive. Cuplarea este catalizata de enzime ADN-ligaze;
- dupa cuplarea celor doua fragmente, segmentul rezultat (ADN vector +
ADN fragment specific) se introduce in celula gazda (primitor);
- odata introdus fragmentul in celula gazda, se urmareste in dinamica,
comportarea fiecarui segment: segmentul specific provenit de la donator si
segmentul ADN al vectorului;
- daca fragmentul de ADN recombinant este acceptat de celula gazda
(primitor), vor incepe procesele de transcriere si translate a mesajului inscris in
segmentul specific provenit de la donator, finalizand sinteze proteice cu structura si
functii specifice asa cum se prezentau in celula donator.
Dupa insertionarea fragmentului ADN donor, celulele primitor incep a se
multiplica, dupa prealabila replicare a ADN-ului genomic. In replicarea genomului
celulei primitor este implicat §i segmentul specific de ADN provenit de la celula
donator, iar celulele rezultate din diviziunile realizate, vor confine si segmentul de
ADN recombinant.
Aceste procese sunt rezultatul ingineriei genetice, iar mecanismele sunt
denumite „clonarea ADN".
Deci, prin cuplarea a doua fragmente ADN, ce provin de la specii sau
organisme diferite, se obtine un ADN heterogen ca origine informationala. Este
molecula de ADN recombinant. Cuplarea fragmentelor de ADNc heterogenetic se
realizeaza prin intermediul capetelor complementare coezive. Prin cuplarea
fragmentelor ADN, prin intermediul ligazelor, se obtine ADN-ul recombinant, sau
ADN-ul hibrid.
In ingineria genetica sunt doi factori genetici esentiali: genomul
primitorului (este eel care accepta insertionarea genei vehiculate de vector spre
celula tinta (viitoarea gazda) si gena de interes, obtinuta artificial sau izolata din
genomul altei celule normale, care va fi introdusa in celula primitor.
Ca celule tinta (primitor) folosite in ingineria genetica sau clonare pot fi:

326
 - celulele somatice in scopul cercetarii limitate a unor disfunctii
genetice ale individului, direct analizat;
- celulele gametice (germinale) pentru a se preveni prin inginerie
genetica transmiterea defectului la descendenti.
Analiza genotipului, metodele folosite in cartografiere, inginerie
genetica si clonare, servesc pentru explorarea gradului de exprimare
fenotipica a produselor determinate de genele informational-active, servesc la
corectarea unor defecte genice, servesc explorarilor genice cu valoare
diagnostic^.
Ca importanta bio-medicala a acestor explorari consemnam
urmatoarele:
- ajuta sa. stabilim etapele ontogenetice in activitatea genelor
-respectiv aspecte cronogenetice in activitatea genomului uman;
- permit o analiza a influentelor etapizate ontogenetic, induse de
factorii de mediu asupra genotipului. Este o analiza cronobiologica a
interferentelor dintre genotip-fenotip-factori de mediu;
- serveste la identificarea cromozomului sexual X lyonizat interfazic
la nivelul celulelor unui tesut sau organ;
- ajuta la stabilirea manifestarilor fenotipice a caracterelor genetice
caracterizate prin penetranta si expresivitate variabila (completa sau partiala);
- permit sa determinam daca un sindrom pe fond genetic este cauzat
de insertionarea in genomul uman al unui genom strain (de exemplu
retrovirusii, virusul HIV).

4.2. Analiza functieie genei artificiale

Pentru a stabili functia unei gene artificiale (ADNc) „in vitro", sunt
folosite diverse sisteme de analiza. Dintre aceste sisteme mentionam:
- cotransformarea;
- cotransfectia;
- microinjectia.

a) Cotransformarea. Este procesul de analiza directa a unui ADN-

exogen in culturile celulare la eucariote. Acest procedeu are un randament
slab, deoarece s-a observat ca intr-o populatie celulara in cultura de 103-106
celule, numai 1-2 pot manifesta competenta de incorporare a genei exogene,
si sa devina stabila si functionala.

327
 Acest procedeu, cu incercari reusite, este legat de gena timidinkinaza
(TK).S-a lucrat cu fibroblasti de soarece TK- (celule L, lipsite de gena pentru
timidinkinaza). Fibroblastele TK- au fost transformate in fibroblaste TK+ prin
intermediul virusului Herpes simplex (HSV1), virus care detinea in genomul
sau gena TK (de origine exogena si acrosata de la o alta celula TK+).
La om incercari reusite s~au obtinut cu gena p (beta) a globulinei,
prin introducerea in zona stabila a genei p globulinei umane in celulele
teratocarcinoame de soarece.

b) Cotransfectia. Principiul procedeului este cuplarea fizica a unei

gene din genomul eucariotic, la genomul ADN al unui virus. Introducerea
genei prin cotransfectie, de catre virusul care a acrosat gena, in genomul
unei celule eucariote pe care a folosit-o ca gazda. Insertionarea este
realizata in culturile celulare. Inconvenientul procedeului este ca
insertionarea genei in celula eucariota se poate realiza numai „in vitro".
Prin acest procedeu s-a reusit insertionarea genelor pentru P
globulina, provenite de la iepure si soarece in celulele renale de maimuta,
dezvoltate in cultura. Genele au fost vehiculate de virusul SV40-

c) Microinjectia. Este metoda de studiu a promotorilor specifici

pentru ARN-polimeraza II si III. Ca procedeu tehnic este introducerea unei
gene (direct) in ovocitele de xenopus (ariciul de mare).

4.3. Metoda PCR (polymerase chain reaction)

Metoda PCR este procedeul de clonare acelulara a ADN-ului. Metoda
asigura amplificarea directs, rapida si selectiva a unei secvente ADN sau
ARN dintr-un amestec complex, atunci cand sunt cunoscute secventele
capetelor fragmentului de ADN.
Metoda foarte sensibila. Amplificarea PCR este o reactie in lant a unei
secvente ADN, datorita existentei unor oligonucleotide amorsa care initieaza
sinteza secventei ADN.
Metoda PCR (polymerase chain reaction) a fot elaborate in 1985 de
catre Kary Mullis (Premiul Nobel pentru chimie in 1993).
Metoda a fost perfectata prin folosirea ADN-polimerazei termostabile,
care a simplificat toata procedura de executie si elaborarea unei aparaturi care
sa asigure cicluri simple de temperatura (ciclizator termal). Datorita acestor
noi descoperiri si aparatura ciclizatorului termal,

328
toda PCR este intensiv folosita in cercetare, dar si in laboratoarele de letica
clinica pentru geno-diagnostic.

Ca aplicatii, metoda PCR permite:

- diagnosticul clinic in: P-talasemie, fibroza chistica, a-1-itripsina,
distrofia miotonica, Coreea Huntington, fenilcetonurie, emie, polipoza
adenomatoasa familiala, s.a.;
- determinarea sexului: primerii flancheaza regiunea tinta a /entelor
specifice ale cromozomului sexual Y;
- detectarea patogenilor;
- determinarea unor noi secvente de ADN;
- determinarea mutatiilor si neomutatiilor;
- izolarea si constituirea unor noi clone de ADN etc.

Principiul metodei este urmatorul: se foloseste ca matrita o secventa :ifica

de ADN monocatenar, cu ajutorul careia se sintetizeaza „in vitro" lant
complementar ADNc in prezenta ADN polimerazei si a unui onucleotid primar
(amorsa) in componenta caruia exista 15-20 eotide. Oligonucleotide primer are
capatul 3'-OH liber de care se vor oligonucleotide^ ADN si vor forma noul
lant. Alungirea amorsei se in sensul 5'-3'.
Metoda de amplificare PCR este o reactie in lant a unei secvente de ^, prin
denaturari termice si polimerizarea secventei de ADN in enta
oligonucleotidelor amorsa. Procedeul este denumit clonare jlara.
Prin acest procedeu secventa poate fi amplificata de aproximativ 1 ird de
ori.
Daca se foloseste enzima reverstranscriptaza, se poate amplifica Jm.
Primerii oligonucleotidici sunt denumiti si amplimeri.
Extensia primerilor urmeaza urmatoarele etape: i prima etapa este
denaturarea ADN-ului ce va fi folosit ca matrita cu ml unei ADN-polimeraze
si prezenta de dNTP;
I a doua etapa urmeaza o suita de denaturari ale ADN-ului dublu lar matrita.
Aceste denaturari sunt realizate astfel:
- denaturarea termica a ADN-ului dublu catenar;
- „calirea" primerilor prin racirea secventelor ADN denaturate;
- extensia primerilor cu ADN-polimeraza la temperatura optima de ie a
enzimei.

329
 Fiecare repetare a sintezei catenelor, reprezinta un ciclu de
amplificare. Fiecare sinteza a lantului nou de ADN, devine, la randul ei,
matrita pentru un alt ciclu de amplificare. Prin acest mecanism explicam de ce
secventa de ADN tinta amplificata se poate amplifica selectiv, ciclu dupa
ciclu, pana la 1 miliard de ori. Numarul final de cicluri de amplificari
succesive ale regiunii tinta poate fi exprimat prin formula: (2n - 2n)x, in care:
- n = numarul de cicluri;
- 2n = primul produs obtinut dupa primul ciclu si produsii secundari, cu
lungimea nedeterminata obtinut dupa ciclul2;
- x = numarul de copii ale matritei initiale.
Calculele apreciaza ca dupa o suita de 20 cicluri PCR, se ajunge la o
rata de aplificare exponentiala a genei tinta, ADN primer, de 220 daca
eficienta este de 100% pentru fiecare ciclu.
Datorita excesului de tinta moleculara numarul ciclurilor repetabile
este modificat ca eficienta dupa 25-30 cicluri. Modificarea eficientei este
cauzata de posibilitatea cresterii enzimei ADN-polimerazei termostabila, care,
in conditii optime se limiteaza la o rata de amplificari de 106, datorita
excesului de tinta moleculara.

4.4. Metode fizice Tn clonare §i ingineria genetica

Tehnica ADN-ului recombinant, cu variate procedee de lucru (grefa

de nuclei heterostadiali sau heterospecifici, transferul cromozomilor la specii
diferite, hibridizarea celulara) sau metoda PCR dau posibilitatea inducerii de
noi functii celulare in genomul gazda, de a stabili diagnosticul clinic genetic a
unor maladii, de identificare a unor mutatii, neomutatii sau a unor secvente
noi de ADN in genomul celulei umane.
Dar geneticienii, biochimistii si biofizicienii au diversificat si perfectat
metodele de cercetare genetica, folosite in ingineria si clonarea genetica,
elaborand metode fizice de lucru.
Ca metode fizice de clonare mentionam:
- Microinjectia cu ADN. Se injecteaza gena interesata, sau secventa de
oligonucleotide, direct in genomul din nucleul celulei primitor.
Metoda se aplica „in vitro" pe celule sau linii celulare, dar si pentru a
genera animale transgenice.
Datorita considerentelor etice, metoda nu este acceptata si aplicata la
om.

330
- Electroporatia (electrotransfectia)
Principiul metodei este urmatorul: se formeaza pori hidrofili in
membrana celulei tinta, sub actiunea unui camp electric. Prin acesti pori va
penetra ADN provenit de la donator, in celula tinta (primitor).
Metoda este eficienta cand se aplica unei populatii celulare care are un
indice ridicat de proliferare celulara.
c) - Bombardamentul cu particule ADN
Este un transfer genie balistic. Bombardamentul consta din particule
din aur acoperite cu ADN precipitat. Este forma de a transfera si a introduce
gena in celula tinta. Metoda a fost elaborata de Yang si col., in 1990. Este
aplicabila celulelor monocite, limfocite si in culturile de fibroblasti. Rezultate
foarte bune au fost obtinute de Yang (1992) sj Cheng si col. (1993) la soared,
sobolani, hamsteri, Rhesus.

d) - Transfectia cu laser
Celulele mamiferelor pot f\ transfectate cu gene de la donator
folosindu-se un femtosecond pulse laser.
Pentru reusita transfectiei genice arhitectura celulei nu trebuie sa se
modifice.
Reusita clonarii este de 100%.

331
 CUPRINS

PREFATA.........................................................................................................7

CAPITOLUL 1.................................................................................................9
OBIECTUL DE STUDIU AL GENETICII UMANE..................................9

CAPITOLUL II..............................................................................................12
EREDITATEA LA OM.................................................................................12
l.SUPORTUL MOLECULAR AL EREDITATII............................................14
2. STRUCTURA MOLECULEI DE ACID DEZOXIRIBONUCLEIC (ADN)17
2.1. Unitatea de structura a moleculei de ADN......................................18
2.2. Structura primara a ADN.................................................................21
2.3. Structura secundara a ADN.............................................................25
2.4. Structura tertiara a ADN..................................................................28
3. FORMELE IZOMORFE DE ADN..........................................................................31
(FORME „GEOMETRICE " DEADN).....................................................................31
4. ADN-UL NUCLEAR........................................................................................34
4.1. Denaturarea si valoarea Cot de renaturare a ADN-ului celular....38
5. HETEROGENITATEA ADN-ULUI DIN GENOMUL UMAN SI
FUNCTIILE LUI ..........................................................................................41
5.1 Familii de ADN repetitiv...................................................................41
5.2. Tipuri de ADN inalt repetitiv............................................................44
5.3. Elemente genetic transpozabile........................................................52
Transpozonii............................................................................................52
5.4. Palindromul......................................................................................56
6. GENOMUL MITOCONDRIAL SAU EREDITATEA CITOPLASMATICA
57
6.1............................................................................................................C
aracteristicile sifunctiile ereditatii citoplasmatice.................................59
6.2............................................................................................................Er
editatea citoplasmatica sau matroclina..................................................60
6.3............................................................................................................M
utatii in genomul mitocondrial si efecte induse......................................61
7.REPLICAREA ADN-ULUI......................................................................63
7.1. Principiul si mecanismul replicarii.................................................65

332
 7.2. Metode de studiu....................................................................................66
7.3. Enzime si proteine implicate in replicarea ADN.....................................72
7.4.Mecanismul molecular de replicare a ADN-uhd......................................75
7.4.1.Etapele sintezei moleculei ADN......................................................75
7.4.2.Replicarea ADN si modelul aditiei primerilor.................................78
7.5.Etape in sinteza catenelor ,, de novo'' in replicarea ADN.........................79
7.6.Erori de replicare a ADN si repararea erorilor in genomul uman...........86
7.6.1 .Mecanisme de reparare a erorilor in structura ADN........................87

:APITOLUL HI...........................................................................................................92
VNATOMIA GENOMULUI UMAN......................................................................................92

:ROMOZOMII............................................................................................................92
1. ETAPE IN ANALIZA GENOMULUI UMAN....................................................................93
2. NUMARULCROMOZOMILORLAOM..............................................................................94
3. DLMENSIUNEA GENOMULUI UMAN ...........................................................................98
4. MORFOLOGIA CROMOZOMILOR.............................................................................. 101
5. ORGANIZATORII NUCLEOLARI................................................................................ 110
6. TELOMERELE...................................................................................................113
6.1. Replicarea si repararea telomerelor.....................................................116
6.2. Efectele secundare determinate de nerepararea telomerelor.................117
6.3. Rohd telomerelor..................................................................................118
7. STRUCTURA MOLECULARA A CROMOZOMILOR LA EUCARIOTE....................................119
7.1. Proteinele cromozomale.......................................................................120
7.1.1 Proteinele histonice........................................................................121
7.1.2. Proteinele non-histonice................................................................124
8. CONFIGURATIA „ANATOMICA" A CROMOZOMILOR.....................
127
8.1. Arhitectiira supramolecidara sau „anatomia " cromozomilor umani.. 128
8.1.1 -Nucleozomul- structura primara a cromozomului........................129
8.1.2 -Solenoidul- structura secundara a cromozomului.........................132
8.1.3 Bucla cromozomala ca structura tertiara........................................134
8.1.4 Structura cuaternara a cromozomilor.............................................136
9. STARILE FIZICE ALE CROMOZOMILOR............................................
138
HETEROCROMATINA SI EUCROMATINA..............................................
138
9.1. Heterocromatina (He)...........................................................................138
9.1.1 Heterocromatina constitutiva.........................................................140

333
 9.1.2 Heterocromatina facultativa...........................................................141
9.1.2.1 Inactivarea cromozomului X..................................................142
9.1.2.1.1 Numarul cromozomii or X inactivati....................................146
9.1.2.2 Cromozomul Y in interfata celulara.......................................147
9.2. Regiuni dublu ,,minut" (DM) si regiuni marcate omogen......................147
9.2.1 Regiuni dublu „minut" (DM).........................................................148
9.2.2 Regiuni marcate omogen (RMO)...................................................148
9.3. Eucromatina cromozomala...................................................................149
10. CROMOZOMII CELULARI„B"............................................................................150
11. BENZILE CROMOZOMALE....................................................................................152
11.1. Factori implicati in formarea benzilor................................................152
11.2.Tipuri de benzi in cromozomii eucariotelor..........................................154
11.2.1.Benzile Q....................................................................................156
11.2.2.Benzile G....................................................................................157
11.2.3.Benzile C....................................................................................157
11.2.4.Benzile R (reverse).....................................................................158
11.2.5.Benzile'T (telomerice)................................................................159
11.2.6.Benzile NOR (organizatori nucleolari)........................................159
12. CROMOZOMII SI FAZELECICLULUI CELULAR..........................................................159
12.1. Cromozomii in interfaza ciclului celular..............................................160
12.1.1. Stadiul Gl...................................................................................161
12.1.2. StadiulS......................................................................................162
12.1.3. Stadiul G2..................................................................................163
12.2. Cromozomii mitotici............................................................................163
12.2.1.Profaza.......................................................................................165
12.2.2.Metafaza.....................................................................................165
12.2.3.Anafaza.......................................................................................165
12.2.3. Telofaza......................................................................................166
13. CARIOTIPUL UMAN NORMAL..........................................................166
13.1. Recomandarea analizei cariotipului la om..........................................168
14. REPLICAREACROMOZOMILORUMANI...........................................169
14.1. Experimentul Taylor...........................................................................169
14.2. Cromozomii se replica asincron.........................................................173
14.2.1. Asincronia inter-si intracromozomala........................................173
15. POLIMORFISMUL CROMOZOMILOR UMANI
175
16. MECANISMELE SI FACTORII IMPLICATI IN EVOLUTIA
GENOMULUI UMAN . 176

334
 16.1. Comparatie intre genomul uman si al pongidelor...............................176
16.2. Factori etiologici implicati in evolutia genomului uman.....................177
16.3. Mecanisme in evolutia cromozomilor.................................................178
16.4. Efectele remanierilor asupra structurii cromozomilor........................179
16.5. Ipoteze asupra mecanismelor evolutiei cromozomilor la om...............180
16.6. Relatii intre structura si remanierea cromozomilor.............................182
17. ARHITECTURA SI EVOLUTIA CROMOZOMILOR SEXUALI
(GONOZOMII)...........................................................................................
182
17.1. Arhitectura cromozomului Y...............................................................183
17.2.Evolutia cromozomilor sexuali la om...................................................185
17.2.1. Supresia prin crossing- over.......................................................186

CAPITOLUL IV................................................................................................190
CONCEPTUL DE GENA.................................................................................190
l.STRUTURAGENELORLA EUCARIOTE................................................
192
1.1.Structura genei din genomul eucariotelor..............................................193
1.1.1. Structura discontinua a genei sau gena in „mozaic"......................193
1.1.2. Mecanisme in evolutia genelor cu structura discontinua...............197
2. CARACTERISTICILE GENEI IN RAPORT CU CROMOZOMII DIN
GENOM......................................................................................................
198
2. l.Locusul siformele alternative ale genei prezente pe cromozomi.............199
2.1.1. Polialelismul.................................................................................199
2.1.2. Liniaritatea genelor in cromozom..................................................203
2.1.2. Linkage genie sau inlantuirea genelor in cromozomi....................203
2.1.3. Crossing-over-ul...........................................................................207
2.1.4. Tipuri de gene in genomul eucariotelor........................................209
3.INSUSIRILESI FUNCTIILE GENELOR..................................................212
3.1. Variatii in expresia genelor..................................................................212
3.2. Functia heterocatalitica a genelor........................................................214
3.3. Activitatea genelor in raport cu perioadele ontogenetice......................215

CAPITOLUL V..................................................................................................218
SINTEZA $1 REGLAREA GENETICA A SINTEZEl PROTEINELOR... 218
1. ACIZII RIBONUCLEIC! (ARN)......................................................................220
/. /. ARN-ul mesager (ARNJ.........................................................................221
1.2. ARN-ul ribozomal (ARNr).....................................................................221

335
 1.3. ARN-ul de transport (ARNJ...........................................................222
1.4. ARN-ul interference (i-ARN).........................................................223
2. PARTICIPAREA MOLECULELOR ARN LA SINTEZA PROTEINELOR
224
2.1. Fluxul informatiei genetice............................................................225
3. CODUL GENETIC..................................................................................229
3.1. Proprietatile codului genetic.........................................................230
4. CODAREA SI DECODAREA ARN-ULUI (SINTEZA PROTEINELOR)233
5. TRANSCRIPTONUL SI TRANSCRIEREA INFORMATIEI GENETICE IN
STRUCTURA ARNM................................................................................234
6. TRANSCRIEREA TRANSCRIPTONULUI..............................................235
6.1. Etapele formarii ARNm..................................................................237
6.1.1. Initierea transcripjiei, elongafia §i stoparea............................237
6.1.2.- Accesarea genomului si procesarea ARN - premesager.......239
6.1.2.1. Procesarea pre-ARNm.....................................................240
7. TRANSLATE SAU TRANSCRIEREA MESAJULUI GENETIC DIN
ARNMM.....................................................................................................242
7.1. Sinteza deproteine..........................................................................242
7.1.1. La procariote............................................................................244
7.1.2. La eucariote..............................................................................246
8JR.OLUL PROTEINELOR NOU SINTETIZATE IN VIATA CELULEI......251

CAPITOLULVI............................................................................................252
RELATIILE INTERGENICE SI MEDIUL DE VIATA AL OMULUI252
1 .RELATIILE INTERGENICE...................................................................253
1.1. Relatii intre cupluri alelice.......................................................253
1.1.1. Relatiile de dominanta - recesivitate.......................................254
1.1.1.1 .Dificultatile si exceptiile de la legile dominantei si
recesivitatii
.......................................................................................................255
1.1.2.Gene(alele)cuefectletal............................................................258
1.1.3.Gene (alele) semiletale.Gena Rhesus la om............................258
1.2. Relatii (raporturi) intre genele nealelice.......................................259
1.2.1. Epistazia................................................................................260
2. RELATII GENA - CARACTER - MEDIU.........................................................263
2.1. Pleiotropia......................................................................................263
2.2. Raporturi de monohibridare si de dihibridare...............................266
2.2.1. Legile lui Mendel....................................................................267

336
 2.2.2. Tipuri de trasnmitere mendeliana a caracterelor monofactoriale la
om 272
2.2.3. Transmiterea autozomal dominanta..............................................272
2.2.4. - Transmiterea autozomal recesiva...............................................276
2.2.5 - Transmiterea autozomal codominanta.........................................277
2.2.6.- Ereditatea legata de cromozomii sexuali......................................278
2.3. Ereditateapoligenica - multifactoriala. Ereditatea "cantitativa"...........283
2.3.1. Relatii genotip - mediu sau caractere poligenice multifactoriale.. 284
3. NOTIUNI DE CRONOGENETICA SI CRONOBIOLOGIE ASUPRA
CARACTERELOR
MULTIFACTORIALE.................................................................................287
3. 1 Cronogenetica si cronobiologia in activitatea genomului uman...........287
3.2 Stabilitatea genei sau ergon...................................................................289
3.3 Metode de analiza a caracterelor poligenice multifactoriale.................295
3.4 Heritabilitatea caracterelor multifactoriale...........................................301
3.5 Calcularea variatiei caracterelor poligenice..........................................301

CAPITOLUL VII...............................................................................................303
CARTOGRAFIEREA, INGINERIA GENETICA §1.....................................303
CLONAREA GENOMULUI UMAN...............................................................303
PRINCIPII.........................................................................................................303
1.TIPUL CONSTITUTIONAL GENETIC...........................................................................304
2. METODE DE ANALIZA A STRUCTURII ADN................................................................306
PRINCIPII..............................................................................................................306

3. METODE DE ANALIZA A GENELOR. CARTOGRAFIEREA GENOMULUI UMAN 309

3.1. Hibridizarea ADN-ului genomic...........................................................309
3.2. Cartografierea genelor prin secventierea ADN-ului genomic...............312
3.2.1. Cartografierea genetica.................................................................313
3.2.2. Polimorfismul de restrictie...........................................................320
4. NOTIUNI DE INGINERIE GENETICA §1 CLONARE.............................321
4.1. ADN-ul recombinant............................................................................325
Principiu.....................................................................................................325
4.2. Analiza functieie genei artificiale.........................................................327
4.3. Metoda PCR (polymerase chain reaction)............................................328
4.4. Metode fizice in clonare si ingineria genetica.......................................330

337
 Bibliografle Selectiva

• Adams R.P.L s.a (1986) - The Biochemistry of the Nucleic Acid, 1

Oth Edition, Chapmann and Hall, London, New York
• Alberts B, et all (1989) - Molecular Biology of the cell.
• Anderson S.G.E. (1998) - Genomic Sequence. Nature, 397, 176-180.
• Angelier N, et all (1996) - Does the Chaperone Heat Shock Protein
hsp 70. Play a Role in the Control Development Process Int. J. Dev.
Biol.40;521-529
• Athanasiou A (1995) - Chronopsihologia - Med. Modern, vol U no
10.
• Athanasiou A(1998) - Tratat de psihologie medicala. Ed. Oscar
Print, Bucuresti.
• Attardi G. et all.(1979) - The organisation of the genes in the human
mitochondrial Genom and their mode of identification Acad. Press, New
York, pg 443-469
• Avery O.T. McLeod CM., Mc Carty, M.(1994) - studies on the
chemical nature of the substance inducing transformation of pneumocaccal
types.
• Baas F et all (1985) - The human thyroglobin gene a polymorphic
marker localised distal to C - MYC on chromosome 8 band q 24. Hum. Genet.
69, 138-143.
• Batimore D.(1976) - Viruses Polymerases and Cancer Science,
192,632-636.
• Batimore D.(1985) - Retrovirus and Retrotranscription. The Role of
Reverse Transcription in Shaping the Eukariotic Genome Cell, 40, 481-482.

338
 • Benner S.E., Wahl G.M., Von-Hoff D.D. (1991) - Double minute
chromosomes and homogeneously Staining regions in tumors taken directly
from patients versus human tumor cell lines. Auth - Cancer. Drugs, 2, 11-25.
• Bernardi G.(1995) - Human Genome Organisation Curr. Opin.
Genet. Develop. 5,315-322.
• Bertino J.R. et all (1982) - Gene amplification in a methotrexate
-resistant human leukemia line K - 562. In Gene Amplification (Ed. R.T.
Schimke). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
• Bird A (1999) - DNA methylation de nova. Science, 286, 2287
-2288.
• Blasco M.A, Gasser S.M., Linger J (1999)- Telomeres and
telomerase. Genes & Dev., 13,18;2353 - 2359.
• Boivin R. et all (1948) - L'acide desoxyribonucleique du noyan
cellulaire, depositaire des caracteres hereditaires; arguments d'ordre
analytique. C.R.A.C. Sc. 226, 1061-1063.
• Bouffer S.D. et all (2001) - Telomeric sequences, radiation
sensitivity and genomic instability Int. J. Radiat. Bref. 77, 995 - 1005.
• Brewer G., Sing Ch.F. - Genetics .
• Britten R.J., Kohne D.E. (1968) - Repeated sequences in DNA.
Science, 161,529-540.
• Britten R.M., Davidson E.H. (1968) - Redundanta informationala
-Science, CLXV, 349.
• Burchner J. (1996) - Supervising the Fold; Functional Principles of
Molecular Chaperones. The FASEB J; 10, 10-19.
• Burkholder G. (1988) - The analysis of Chromosome Organisation
by Experimental Manipulation. Chromosome Structure and Function -Edited
by J.P.Gustawson and R.Appels Plenum Press, New York.
• Carathers A. (1997) - DNA Damage, Mutation and Repair
-Encyclopedia of Cancer - Acad. Press New York, 484 - 500.
• Cavazzana - Calva M. et all (2000) - Gene therapy of human severe
combined immunodeficiencys, Science, 288, 669 - 672.

339
 • Cech T.A. (1986) - RNA as an Enzyme - Sci. Amer. 255,(5), 64-75.
• Chamberlin M(1982)- Bacterial DNA - dependent RNA
-Polymerase. Acad. Press the Enzymes. 15, 61- 108.
• Chargaff E, Davidson J (1955) - The Nucleic Acid Academic Press.
• Chargazz E.(1950) - Chemical Specificity of Nucleic Acids and
Mechanism of their Enzymatic degradation. Experientia; 6, 201-209.
• Charlerbois R.L. (1976) - The Modern Science of Bacterial
Genomics. ASM New, 62,(5), 255- 259.
• Cohen S.N. (1976) - Transposable Genetic. Elements and Plasmid
Evolution. Nature, 263, 731 - 738.
• Cohen S.N., Shapiro J.A. (1980) - Transposable Genetic Cod for
Proteine. Nature, 192, 1227 - 1232.
• Conrat E, Williams R.C. (1955) - Reconstruction of active tabaco
mosaic virus from its protein and nucleic acid components. Proc. Nat. Acad.
Sci. USA. Vol. 31 no.10.
• Counter CM. et all.(1992) - Telomere shortening associated with
chromosome instability is arrested in immortal cells which express
telomerase activity. EMBO Journal, 11, 5:1921 - 1929.
• Craciun T, Luana - Leonaro Jensen (2004) - Genetica si viitorul
omenirii. Ed. Albatros, Buc.
• Crivell L.A. (1983) - Mitochondrial DNA. Sci. Amer. 248, (2), 78-
89.
• Darnell J.E. Jr. (1985) - RNA Sci Amer, 253,(4), 68-78.
• Dave - U.P. et all (2004) - Gene therapy insertional mutagenesis
insights. Science. 303, 333. Dubinin N.P. (1966) - Genetica moleculara si
actunea radiatiilor asupra ereditatii. Ed. Stiintifica, Buc.
• Davidson E.H. et all (1973) - General interspresion of repetitive with
nonrepetitive sequence elements in the DNA of Xenopus. Jour. Moi. Biol. 77,
1-23.

340
 • Deka N, et all (1986) - Repetitiv human DNA sequences, Properties
of transposon - like human element Cold Spring Harbor Syanp. Quant. Biol.
51,471-477.
• Demongeot J., Besson J. (1996). The Genetic Code and Cyclic
Codes - C.R. Acad. Sci. Paris, 319, 443- 451.
• Dennis W. Ross (2002) - Introduction to Molecular Medicine - Ed.
Spinger, pg. 37; 42-45.
• Dib. C, et all (1996) - A comprehensive genetic map of the human
genome based on 5.264 microsatellites. Nature, 380, 152-154.
• Dickerson R.E. (1983) - The DNA Helix and how it is read. Sci.
Amer. 249, (6), 92-111.
• Dickerson R.E., et all (1982) - The Anatomy of A-,B-, and Z-DNA.
Science, 216, 475 - 485.
• Doolittle W.F., Sapienza C(1980) - Selfish genes the phenotype
paradigm and genome evolution. Nature, 284, 601-603.
• Earnshaw W.C.(1988) - Mitotic chromosome structure. Bio Essays.
9, 147- 150.
• Einstein A. (1968) - Jl. Significato della relativita. Torino.
• Fedoroff N.V. (1984) - Transposable Genetic Elements in Maise
-Scientific American (June).
• Filatov L. et all (1998) - Chromosomal instability is correlated with
telomere erosion and inactivation of G2 checkpoint function in human
fibroblasts expressing human papillomavirus type 16E6 oncoprotein
-Oncogene, 16.14, 1825- 1838.
• Filipski J. et all (1990) - Periodicity of DNA Folding in Hinger Order
Chromatin Structure EMBOJ. 9,1319-1327.
• Franklin R.E., Gosling R.(1953) - Molecular configuration of sodium
thymonucleate - Nature, 740 - 741.
• Friedberg E.C., Wagner R, Rodman H(2002) - Specialised DNA
polymerases, cellular survival and the genesis of mutations Science, 296,
1627-1630.
• Galton F.(1889)- Natural inheritance. Mc Millan, London.

7/1.1
 • Gedda L., Brenci G.(1971) - Chronology of the gene. Ann. Genet.
Med. Ge, XX, 323.
• Gedda L., Brenci G.(1972) - II tempo biologica e la sua eredita.
Scienzo & Tecnica, pg 169, Milano.
• Gedda L., Brenci G.(1980) - Cronogenetica l'eredita del tempo
biologico - Edition Scientifiche e Tehnichs: Ed, Mondaroni S.P.A. Milano
• Gellert M (1981) - DNA Topoisomerases. Ann. Rev. Biochem.
50,879-910.
• Georgopoulus C (1993) - Role of the Major Shock Proteins as
Molecular Chaperones. Ann. Rev. Cell. Biol; 9; 601-634.
• Gerbr S.A. (1986) - The Evolution of Eukaryotic Ribosomal DNA.
Biosystems 19,247-258.
• Goldman M.A. (2004) - RNAi for research and therapy Genome
Biology, 5, 342-.
• Goodman M, Tashian R.E. (1976) - Molecular Antropology, New
York.
• Goodman M.F. et all (1993) - Biochemical Basis of DNA
Replication Fidelity. Critical Rev. Biochem, Molec. Biol. 28(2), 83 - 126.
• Gray M.W.(1989) - Origin and Evolution of Mitochondrial DNA.
Ann. Rev. Cell, Biol; 5,25-50.
• Green D.M. (1990) - Muller's rachet and the evolution of
supernumerary chromosomes. Genome, 33, 818-824.
• Green M.M. (1969) - Mapping a Drosophila melanogaster
"controlling element" by interallelic crossing-over. Genetics, 61, 423 - 428.
• Griffith F (1928) - The signifiance of pneumococcal types. Jour
Hygiene. 27,113-159.
• Grossman L.I., Shoubridge E.A.(1996) - Mitochondrial Genetics and
Human Diseases. Bio. Essays, 18(12),983-911, ICSU Press.
• Gudas L.J., Pardee A.B. (1978) - Model for the Regulation of E. Coli
DNA Repair Functions. Proc Nat. Acad. Scu USA; 72, 2330 - 2334.

342
 • Gupta S.L. et all(l 971) - Movement of the Ribosome along the
Messenger Ribonucleic Acid during Protein Synthesis. Biochemistry, 10,
4410-4421.
• Hacein - Bey - Alinas et all (2003) - A serious adverse event after
successful gene therapy for x-linked severe combined immunodeficiency.
New Engl. J. Med. 348, 255 - 256.
• Hames B, Higgings S(1985) - Nucleic Acid Hybridization a Practical
Approach I.R.L Press, Oxford.
• Hardman N. (1986) - Structure and Function of Repetitive DNA in
Eucariotes - Biochem J. 234, 1-11.
• Hardy G.H. (1908) - Mendelian propositions in a mixed population.
Science, 28, 49 - 50.
• Hedges R.W., Jacob A.E. (1974) - Trans position of ampicillin
resistance from RP4 to other replicons. Molec. Gen. Genet 132, 31-40.
• Hershey A.D., Chase M (1952)- Independent functions of vival
protein and nucleica acid in growth of bacteriophage - Jour. Gen. Physiol.36,
39-56
• Herskowitz I.H. (1973) - Principles of Genetics. MC. Millan, New
York.
• Heslop - Harrison J.S. et all (1988) - Chromatin and centromeric
structures interphase nuclei. Kew Chromosome Conference III (Ed. P.E.
Brandham), HMSO, London, 19, 209 - 217.
• Hopfield J.J. (1978) - PNAS, 75, 4334
• Hoppfield J.J. (1977)- La recherche, 83, 989
• Hull R, Covery S.N. (1996) - Retroelements, Propagation and
Adaptation. Vims Genes 11 (2/3), 105 - 118.
• Hung - Shih J.(2004). Beyond Genome - Conference, San Francisco
USA.
• Hung Shib J (2004) - Beyond Genome - Conference, San Francisco,
USA.

343
 • I.H.G.S.C. (International Human Genome Sequencing Consortium -
2001) - Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409,
860-921.
• Israil Anca Michaela (2000) - Biologie moleculara. Prezent si
perspectiva.
• Isvoranu M, Cilievici Olga (1973) - Biologie Medicala - Litografia
UMF
• Isvoranu M. (1993) - Genetica Umana - Ed. Didactiva si
Pedagogica, Buc.
• Isvoranu M. ,Albu D.F1. (1998) - Genetica Umana - vol. I. Ed Info
Medica - Buc
• Isvoranu M.(l 984) - Litografia UMF
• Isvoranu M.(1988) - Elemente de Biologie si Genetica Umana. Ed.
Medicala, Buc.
• Jacob F (1970)- La logique du vivant Ed. Gillimord
• Jacob F, Brenner S, Cuzon F. (1963) - On the Regulation of DNA
Replication in Bacteria Cold. Spring. Harb. Quant. Biol, 28;329.
• Jacob F, Monad J. (1961) - Genetic Regulatory Mechanism in the
Synthesis of Proteins J.Mol.Biol. 1961,(3),318-356.
• Jarvik L.F. (1978) - Chronogenetics. Springfield III. II tempo e la
vita, Torino.
• Jelinek W.R., Schmid C.W. (1982) - Repetitive sequences in
eukariotic DNA and their expression Ann. Rev. Biochem. 51,813-844.
• Jones K, Myrray K. (1975) - A Procedure for Detection of
Heterologons DNA Sequence in Lamdoid Phase in Situ Hybridation, J.Molec,
Biol. 51,393-401.
• Jones R.N., Rees H (1982) - B- Chromosomes. Acad. Press New
York.
• Jones S. (1993) - the Language of the Genes. Ed. Harper. Collins,
Flamingo, London.
• Keats U. (1981) - Ed de Clark M.S. si Wall W.L. in Chromosomes.
The complex code Ed. Chapman & Hall, pg. 189.

344
 • Kornberg A (1960) - Biologic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid.
Science;131,1503-1508.
• Kornberg A (1962) - Enzymatic Synthesis of DNA. New York, John
Wiley and Sous. Inc.
• Kornberg A (1968) - The Synthesis of DNA. Scientific American of
prints - W.H. Freeman and Co.
• Kornberg R.D. (1974) - Chromatin Structure; A Repeating Unit of
Histones and DNA. Science; 184,868-871.
• Kornberg R.D., Klug A(1981) - The Nucleosome - Sci. Amer;9,122-
124.
• Laemmli U.K. et all (1977) - Metaphase-chromosome structure the
role of nonhistone proteins Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. XLII ,
351 -360.
• Lean S (1992) - Instinct, Enviroment, and Behaviour S.E.G.
Cambrige, University Press.
• Lecomte de Noily P. (1969) - II tempo e la vita - Torino.
• Legeune J, Turpin R, Gautier M. (1959) - Le mongolisme premier
exemple d'abberation autosomiene humaine. Aun. Genetique. Paris; 1, 41-49.
• Leib - Mosch Chr, Seifarth W (1996) - Evolution and Biological
Significance of Human Retroelements. Virus Genes. 11(2/3), 133-145.
• Li W.H., Gu Z, Wand H, Nekrutenco A (2001) - Evolutionary
Analyses on the Human Genome. Nature; 409, 847 - 849.
• Lindall T (1982) - DNA Repair Enzymes, Ann. Rev. Biochem. 51,
61-87.
• Lints F. (1981) - Genetique - Office Inter - national de Libraire 30,
avemus Marnix 1050 Bruxelles.
• Lints F.A. (1978) Genetics and Ageing. Karger, Bassel.
• Lyon M. F. (1962) - Sex chromatin and gene action in the
mammalion X - chromosome. Amer. J. Hum. Genet; 14, 135.
• Maitra V. et all (1982) - Initiation Factors in Protein Synthesis. Aun.
Rev. Biochem; 51,869-900.

345
 • Marmur J. et all (1963) - Denaturation and renaturation of DNA.
Progr. Nucl Ac. Res.; 1,232-300.
• Marshall E (1999) - Genetherapy death prompts review of
adenovirus vector - Science, 286, 2244-2245.
• Mathe G. (1979) - Cancer: des reponses a vos questions. Le Figaro,
23 febr., no2.
• Mc Clintock B. (1950) - The origin and behavior of mutable loci in
maize. P.N.A.S. 36, 344 - 355.
• Mendel G. (1866) - Versuchen aber Pflanzen hybriden. Verh, naturf.
Ver. Brunn; 4,3-44.
• Meselson M., Weigle J.J. (1961) - Chromosome breakage
accompanying genetic recombination in bacteriophage. P.N.A.S.; 47, 857-
868.
• Messing J. et all (1981) - A system for Shotgun DNA sequencing
-Nucleic Acid Res.; 9,309-321.
• Michael A, Goldman G.(2004) - RNAi for research and therapy.
Genome Biology;5,342.
• Miles J.S., Wolf C.R. (1989) - Principles of DNA Cloving. Br. Med.
J.;299, 1019-1022.
• Mirsky A.E., Ris H (1949) - Variable and constant components of
chromosomes. Nature.; 163, 666 - 667.
• Noller H.P. (1984). Structure of Ribosomal RNA. Ann. Rev.
Biochem; 153,119-162.
• Nomura M. et all (1984) - Regulation of the Synthesis of Ribosomal
components - Science;53,75-117.
• Old R.W., Primrose S.B. (1980) - Priciples of Gene manipulation.
An introduction to genetic engineering. Blacweil Scientific Publications,
Oxford.
• Orgel L.E., Crick F.H.C. (1980) - Selfish DNA: the ultimate
parasite. Nature; 284, 604-607.
• Osava S, Jukes Th. H. (1988) - Evolution of the Genetic Code as
Affected by Anticodon Content. Trends in Genetics; 47,191-198.

346
 • Otelea D. si col. (1995) - Aplicatii ale biologiei moleculare in
taxonomie si epidemiologie. Bacteriol. Virusol. Parazitol. Epidemiologie;3-4,
171- 180.
• Pardridge W. (2004) - Beyond Genome Conference San Francisco.
• Pardue M.J., Gall, J.G. (1971) - Chromosome structure studied by
nucleic acid hybridisation in cytological preparations. Chromosomes
today;3,47-52.
• Pauling L.H.A et all (1949) - Sickle cell anemia: A molecular
disease. Science, 110, 543- 548.
• Petrov D.A. (2001) - Evolution of Genome Size : New Approaces to
an Old Problem. Trend Genet.; 17, 23-28.
• Polback J.R., Iver V.R. (2002) - Characterizing the phycal genome.
Nat. Genet.; 32(suppl), 515-521.
• Protchard R.H. et all (1969) - Control of DNA Synthesis in Bacteria
Microb. Growth. Symp. Soc. Microbial. Cambrige Univ. Press; 19,263-270.
• Pruss D, Hayes J.J., Wolffe A.P. (1995) - Nucleo - somal Anathomy
where are the Histones ? Bioessays; 17, 161- 170.
• Rabson A.B., Babson A.S. (1983) - Recombinant DNA. Technology
and Laborator Medicine. Arch. Pathol. Lab. Med.; 107, 505-509.
• Radman N (1975) - SOS Repair Hypothesis; Phenomenology of an
inductible DNA Repair which is accomparied by Mutagenesis. Piemen Press
New York.
• Ramakrishnan Y (1997) - Histone HI and Chromatin, higher -Order
Structure- Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression; 7,215-230.
• Rees H., Jones R.H. (1977) - Cromosome Genetics Edward Arnold,
London.
• Reinberg A. et all (1991) - Chronobiologie et Chronotherapeutique -
Ed. Flammarion, Paris.
• Rizki A., Lundblad V. (2001) - Defects in mismatch repair promote
telomerase - Independent proliferation. Nalure; 7;41,713-716.

347
 • Roberts R.J. (1981) - Restriction and Modification Enzymes and
their Recognition sequences. Nucleic Acids. Res.; 9,275-296.
• Rosenthal N.(1995) - Fine Structure of a Gene - DNA Sequencing
N.Engl. J. Med.;332,589-591.
• Rosenthal N.(1995)- DNA and the Genetic code N. Engl. J. Med;
331,39-41.
• Rownd R.H. (1996) - Plasmid Replication DNA Synthesis. Present
and Futur. Ed. Jan Molinaux and Mosanichi Kogiyama. Plenum Publishing
Corporation; 751-772.
• Saenger W. (1984) - Principles of Nucleic Acid Structure. Mit.
Press, Cambridge, Mass.
• Sambrook J. et all.(1989) - Molecular Clonning. A Laboratory
Manuam, Second Ed. Band 1-3 Cold Spring Harbour Laboratory, Press.
• San. Miguel P., Tikhonov A et all (1996) - Nested Retrotransposous
in the Intergenic Regions of the Genome. Science;274, 765-768.
• Sanger F, Coulson A (1975) - A Rapid Method for Determining
Sequences in DNA by Primed Synthesis with DNA Polymerase. J. Molec.
Biol.;94, 441-448.
• Sanger F. (1981) - Determination of nucleotide sequences in DNA.
Science; 214, 1205-1209.
• Sanger F., Nicklen S., Coulson A. (1977) - DNA sequencing with
chain termination inhibitors Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 74, 5463- 5464.
• Sapienza C. (1989) - Genom imprinting and dominance modification
. Ann. N.Y. Acad. Sci, 564; 24-38.
• Schimke R.T. (1982) - Gene Amplification - Cold Spring Harbour
Laboratory Press. New York.
• Seidel H.M. et all (1992) - Exons as Microgenes. Science; 257,1489-
1490.
• Shapiro J.A. (1977) - Les genes santeurs. La Recherche; 81,784-787.

348
 • Shapiro J.A. (1983) - Mobile Genetic Elements. Acad. Press New
York, pg. 329-361.
• Sharps P.A. (1985) - On the Origin of RNA splicing and Introns.
Cell; 42, 397-400.
• Sherman S.L. (1991) - Combining genetic and physical maps.
Cytogenet. Cell. Genet.;58,l842-1843.
• Smith C.L. et all (1987) - Strategies for mapping and cloning
macroregions of mammalion genomes. Methods Enzymol.; 151, 461-489.
• Sroffel M. (2004) - Beyond Genome - Conference San Francisco
USA.
• Stachan T., Read A.P. (1999) - Human Molecular Genetics. 2nd
Edition. Bios Scientific Publishes, Oxford.
• Stent G.S., Calender R (1978) - Molecular Genetics. A Introductory
Narrative. Ed. Freeman, San Francisco.
• Stocking M. (1997) - The Human Genome Project and Molecular
Anthopology. Genome. Res.;7,87 - 91.
• Stoffel Markus (2004) - Beyond Genome - San Francisco USA.
• Stryer L. (1991) - Biochemistry . W.H. Freeman and Company New
York.
• Summer A.T., Chandlay A.C. (1993) - Chromosomes Today. Vol.
11, Chapman & Hall, London.
• Suzuki D.T. et all (1986) - An introduction to Genetic Analysis. Ed.
W.H. Freeman and Company, New York.
• Swift H.M. (1950) - The desoxiribose nucleic acid content of animal
nuclei. Physiol. Zool.;23,169-198.
• Tartof K.D. (1975) - Redundant genes - Ann. Rev. Gen.;9,335-385.
• Taylor J.H. et all (1957) - The Organisation and Duplication of
Chromosomes as Revealed by autoradiographic studies using Tritium. Labeled
Thymidine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA;43,122-128.
• Temin N. (1976) - Previous Hypothesis;The Establishment and
Implications of RNA - directed DNA Synthesis. Science; 192, 1075-1080.

349
 • Tham W.H., Zakian V.A. (2000) - Telomeric Tethers Nature;
403,34-35.
• The International Human Sequencing Cosortium (2001) - The
Human Genome. Sequencing and Initial Analysis. Nature;409,860-921.
• Tjio J.H., Levan A. (1956) - The Chromosome Number of Man.
Hereditas; 42,1-6.
• Travers A (1999) - The Location on the Linker Histone on the
nucleosome - Trends Biochem. Sci.;24, 4-7.
• Uday Tirlapur Kussten Konig (2002)- Laser-transfection. Nature;
418,290-291.
• Vafa O, Sullivan K.F. (1997) - Chromatin Containing CENP-A and
alpha - satellite DNA is a makor component of the inner kinetochore plate
Curr. Biol.;7,897-900.
• Van Steensel B.,et all.(1998) - TRF2 protect human telomeres from
end -to-end fusions Cell.;92, 401-413.
• Vandenberg S.G. (1968) - Progress in human behaviour genetics.
Baltimore, John Hopkins.
• Venter J.C. et all (2001) - The sequence of the Human Genome.
Science.;291,1304-1354.
• Walker F.M., Gaastra W (1983) - Tehniques in Molecular Biology.
Croom Helm, London.
• Walker P.M.B. et all (1969) - Highly repetitive DNA in rodents, in
Hand - book of molecular cytology. Ed. Lima de Faria, North - Holland,
Amsterdam.
• Wang A.H.J et all (1979) - Molecular Structure of a Left - Handed
Double Helical Fragment at Atomic Resolution. Nature; 282,680-686.
• Wang J.C. (1982) - DNA Topoisomerases Sci. Amer.; 247 (1), 94-
109.
• Wang J.C. (1987) - Recent Studies of DNA Topoisomerases.
Biochem. Biophys.; 909,1-9.
• Watson J.D. (1976) - Molecular Biology of the Gene. 3rd Benjamin,
Menlo Park.

350
 • Watson J.D., Crick F.H.C. (1953a) - Molecular Structure of Nucleic
Acid. A structure for Deoxyribose Nucleic Acid. Nature; 171, 737-738.
• Watson J.D.,Crick F.H.C (1953b) - Genetic Implication of the
Structure of Deoxyribonucleic Acid. Nature; 171,964-967.
• Weide H.J. et all (1991) - Biotechnology. Fischer Verlag, Stutgart.
• Weinberg W. (1908) - Uber den Nachweis der Vererbung bei
Menschen. Jh. Ver. Vatel Naturk. Wurtt; 64,369-382.
• Whitfield L.S. et all (1995) - 41 Kilobases of analyzed sequence
from the pseudo - autosomed sex - determining regions of the short arm of
human y chromosome. Genomics; 27,306-311.
• Wilkins MHF et all (1953) - Molecular Structure of Deoxipentose
Nucleic Acids. Nature, 738 - 740.
• Williamson R. (1993) - From genome mapping to gene therapy.
Trends Bio. Technol. ; 11,159-161.
• Winkler H (1930) - Die Konversion der Gene . Ed. Gustav Fisher,
Jena.
• Wlker G.C. (1985) - Inducible DNA Repair Systems. Ann. Rev.
Biochem; 4,425-457.
• Young M.W. (1979) - Middle repetitiv DNA; a fluid component of
the Drosophile genome. P.N.A.S.; 76,6274 - 6278.
• Zuckerkandl E, Pauling I (1962) - Molecular disease, evolution and
genic heterogenerty, in Horizons in Biochemistry Academic Press, New York

-■

351