Disciplina de Microbiologie UMF Tg.

Mureş
LP2

Cultivarea virusurilor

1. Cultivarea virusurilor pe culturi celulare

Virusurile pot fi izolate pe celule vii, receptive.
Cultura celulară: sistem biologic in vitro alcătuit din celule izolate vii, care îşi păstrează
capacitatea de multiplicare şi nu se organizează în ţesuturi.
Condiţii necesare pentru păstrarea în viaţă a celulelor din cultura celulară:
- condiţii aseptice
- mediu nutritiv (mediu de cultură lichid ce conţine substanţe nutritive, sursă de energie,
factori de creştere, vitamine, sistem tampon, indicator, antibiotice şi antifungice) –
mediile comercializate Eagle, Hanks, M199
- pH adecvat
- temperatură constantă
- atmosferă cu 10% CO2

În funcţie de provenienţa celulelor, culturile celulare se clasifică în:

- culturi de origine animală sau umană
- culturi de celule embrionare sau adulte
- culturi de celule normale sau tumorale

Culturile celulare primare sunt culturi realizate direct din ţesuturile sursă.
Liniile celulare stabilizate derivă din culturile primare, se menţin în viaţă timp nelimitat prin
subcultivări.

Realizarea culturilor primare din ţesuturi solide

- se prelevă ţesutul sursă în condiţii aseptice
- se fragmentează ţesutul în bucăţi de aprox. 1 mm3, se spală cu soluţie salină tamponată
(SST) pentru îndepărtarea sângelui
- disocierea enzimatică a celulelor: tripsinizarea fragmentelor tisulare în soluţie de
tripsină 0,25% (enzimă proteolitică, desface legăturile peptidice) pe agitator magnetic
(ajută la desfacerea legăturilor intercelulare)

1
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

- colectarea celulelor izolate în vas colector – se face prin filtrare pentru a obţine numai
celule izolate
- repetare tripsinizării până la epuizarea ţesutului, în timpul tripsinizării vasul colector
se păstrează la temperatura de 4°C pentru inactivarea tripsinei
- centrifugarea suspensiei de celule izolate, îndepărtarea supernatantului (tripsina),
spălare cu SST, în final suspendarea celulelor în mediu nutritiv
- controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan (se colorează
celulele moarte) – pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie să fie vii)
- numărarea celulelor, ajustarea lor la concentraţie de 300000 celule/ml, repartizare
volume egale în flacoane de culturi celulare
- incubare în poziţie culcată
- urmărirea formării culturii cu microscopul invers

Culturi provenite din celule:

- normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se multiplică până acoperă
peretele flaconului, realizează o cultură monostrat (fenomenul inhibiţiei de contact)
- tumorale: se multiplică şi după acoperirea suprafeţei disponibile, cresc în mai multe
straturi şi în suspensie

Subcultivarea culturilor celulare

După 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizează substanţele nutritive, sursele de
energie, se acidifică mediul. Pentru menţinerea celulelor în viaţă, acestea trebuie pasate,
subcultivate. Se realizează prin versenizare:
- celulele se detaşează de pe peretele flaconului cu soluţie de EDTA (versen)
- se centrifughează
- se spală cu soluţie SST
- se resuspendează în mediu nutritiv
- se verifică viabilitatea celulelor, se numără celulele şi se ajustează la concentraţia
optimă. Se repartizează volume egale în flacoane de cultură celulară.

Culturile primare realizate din celule normale adulte pot fi subcultivate de câteva ori (4-
6) după care celulele mor (apoptoză)

2
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Culturile realizate din ţesuturi embrionare pot fi subcultivate de mai multe ori (celule
nediferenţiate), de 60-80x, după care mor.
Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit. Aceste se obţin din ţesuturi tumorale
(HeLa, KB, Detroit, etc) sau din culturi celulare efectuate din ţesuturi normale care au suferit
transformare malignă spontană (Vero). Liniile celulare sunt bine caracterizate, se manevrează
uşor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.

Inocularea suspensiilor virale în culturile celulare, identificarea izolatelor virale

- se îndepărtează mediul nutritiv şi se introduce în flacon suspensia virală pregătită în
prealabil.
- după o incubare de 1 oră (penetrarea virusurilor în celulele receptive) suspensia se
decantează, se adaugă mediu de întreţinere (mai sărac în substanţe nutritive decât
mediul nutritiv, dar care permite supravieţuirea celulelor)
- se incubează
- în zilele următoare se urmăresc modificările survenite în cultura celulară.
Identificarea izolatelor se face prin metode nespecifice şi specifice.
Metode nespecifice:
• urmărirea efectelor citopatice (desprinderea celulelor de pe suprafaţa pereţilor,
rotunjirea celulelor, agregarea lor în ciorchine, formarea sinciţiilor)
• detectarea incluziilor virale
• hemadsorbţia – se foloseşte la detectarea replicării virale în cazul în care virusul nu
produce efect citopatic (virusul ifluenza): membrana celulelor în care se replică virusul
are structura modificată, hematiile adăugate aderă de acestea
• interferenţa: se bazează pe faptul, că o celulă deja infectată cu un virus nu poate fi
infectată cu un alt virus – se foloseşte pentru detectarea virusurilor neproducătoare de
ecp
• formarea plajelor
• transformarea spontană
• microscopia electronică
Metode specifice
• detectarea antigenelor virale prin reacţii antigen-anticorp
• detectarea acizilor nucleici virali – reacţii de hibridizare, PCR

3
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

2. Izolarea virusurilor pe oul de găină embrionată

Membrana proprie

Camera de aer Membrana

corioalantoideană

Embrion
Coaja oului

Cavitatea amniotică

Cavitatea alantoideană
Sacul vitelin

Inocularea virusurilor se poate face pe:

- membrana corioalantoideană
- cavitatea alantoideană sau amniotică
- sacul vitelin
- venele alantoidiene
- embrion
Inocularea pe membrana corioalantoideană
- la ovoscop se notează pe coajă poziţia camerei de aer şi zona unde membrana
corioalantoideană este cel mai bogat vascularizată
- se antiseptizează coaja în cele două locuri notate anterior
- se perforează cu un ac coaja în zona camerei de aer
- cu o freză se decupează un triunghi din coajă la nivelul membranei
- se perforează membrana proprie şi se aspiră aerul din camera de aer cu ajutorul unei
tetine din cauciuc (membrana proprie se dezlipeşte de membrana corioalantoideană)
- se îndepărtează porţiunea vizibilă din membrana proprie, evidenţiindu-se direct
membrana corioalantoideană
- se depune pe membrană produsul de inoculat cu o pipetă
- după inoculare se astupă orificiile create cu lamelă de sticlă şi parafină

3. Izolarea virusurilor în animale de laborator

La această metodă se recurge în momentul în care celelalte metode sunt
nesatisfăcătoare.
4
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Este necesară cunoaşterea metodelor de contenţie a animalelor

Înainte de inoculare animalele sunt marcate, dacă este necesar sunt anesteziate
(intervenţii dureroase), iar locul inoculării se epilează şi se antiseptizează.
Inocularea se face prin diferite căi:
- intradermic
- subcutanat
- intramuscular
- intravenos
- intraperitoneal
- intranazal
- intracerebral

Suspensiile virale sunt inoculate prin injecţie, inhalare, ingestie, badijonare, etc…

5
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Reacţii antigen – anticorp

Componentele structurale ale microorgamismelor joacă rol de antigen, provoacă răspuns imun
din partea organismului infectat, ceea ce rezultă în producere de anticorpi.
Reacţia antigen – anticorp este specifică, antigenul poate fi legat numai de anticorpul ce s-a
produs ca răspuns la stimulul antigenic respectiv.

ag + ac ag-ac

Aceste reacţii pot fi folosite pentru:

- detectarea unui antigen necunoscut cu ajutorul unui anticorp cunoscut (metode de
diagnostic directe)
- detectarea anticorpilor din serul bolnavilor cu antigene cunoscute (serodiagnostic,
metode de diagnostic indirecte).

ag? + ac ag-ac

ag + ac? ag-ac
În cazul în care antigenul corespunde anticorpului, se formează complexul imun antigen-
anticorp. În funcţie de cum se vizualizează/detectează formarea complexului imun există mai
multe metode bazate pe reacţii antigen-anticorp:

- reacţii de precipitare: complexele imune formează precipitat

- reacţii de aglutinare: complexele imune formează aglutinat

- RFC – se detectează consumarea complementului (acesta se leagă de complexele

imune)

- reacţii în care elementul cunoscut este marcat – se detectează elementul marcat din
complexul imun format

6
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Metode clasice

1. Reacţii de precipitare
Antigenele: de natură coloidală (solubile), precipitinogene
Anticorpii: precipitine
Complexul imun: precipitat
Pot avea loc în medii lichide (metode folosite în bacteriologie) sau în medii solide.

Reacţii de precipitare în mediu solid

Precipitinele, precipitogenele au capacitatea de a difuza în gel de agaroză. Unde se întâlnesc
în cantităţi echivalente se formează precipitat vizibil cu ochiul liber.
Metoda Mancini – imunodifuzia simplă (radială)
1. Elementul cunoscut (ag) se inglobează în gel de agaroză.
2. Gelul topit se toarnă în plăci, după solidificare se decupează godeuri.
3. În godeuri se introduce elementul necunoscut al reacţiei (serul de cercetat: ac?).
4. Se incubează în cameră umedă peste noapte la temperatura camerei. Anticorpii din
serul cercetat difuzează în gel, dacă corespund antigenului inglobat, are loc reacţia
antigen-anticorp.
5. În zona echivalenţei se formează precipitat circular.
6. Se măsoară diametrul precipitatului, se raportează la curbe etalon, astfel precizând-
se cantitatea de anticorpi din ser (metodă cantitativă).
În cazul serodiagnosticului este posibilă detectarea seroconversiei: se recoltează probe de ser
duble, la interval de 10 zile.

7
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

3 Figura nr. 1. Metoda Mancini

Godeurile nr. 1, 2 conţin serurile pereche ale aceluiaşi
bolnav, recoltate la interval de 10 zile.
Diametrul precipitatului format în jurul godeului 2 este
mai mare decât diametrul celui din jurul godeului 1. A
4 avut loc seroconversia, diagnostic pozitiv pentru boala
1 cercetată. Godeurile nr. 3 şi 4 conţin serurile recoltate de
la un alt pacient, la interval de 10 zile. Cercurile de
precipitat formate în jurul acestora au diametre identice,
nu s-a detectat seroconversia. Deşi acest pacient prezintă
anticorpi specifici faţă de antigenul cunoscut, lipsa
seroconversiei indică faptul, că pacientul a venit în contact
cu antigenul respectiv în trecut, prezintă anticorpi faţă de
acesta la un nivel constant. Diagnosticul este negativ.
2

2. Reacţii de aglutinare
Antigenele: de natură corpusculară, aglutinogene
Anticorpii: aglutinine
Antigenele corespund cu anticorpii + sunt prezente în cantităţi echivalente: se formează
aglutinatul (reţea tridimensională de complexe imune), vizibil cu ochiul liber sub forma de
grunji.

a. Reacţia de hemaglutinare, hemaglutino-inhibare (RHA-HAI)

• se foloseşte pentru detectarea virusurilor care prezintă pe suprafaţă hemaglutinine

(HA)
• HA: structură virală antigenică + aglutinează hematiile
• anticorpii formaţi faţă de acestea sunt neutralizante (HA neutralizate cu anticorpi nu
produc aglutinarea hematiilor)
8
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Hemaglutinare

buton stelat

Inhibarea hemaglutinării

depunerea normală a hematiilor

HA
virus

hematii

ac antihemaglutinină

9
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Aplicaţii ale RHA-HAI:

- metoda Hirst: detectarea anticorpilor antihemaglutinină din serul bolnavilor de gripă

convalescenţi

- metoda Smorodinţev: detectarea antigenelor virusului gripal (HA) şi determinarea

serotipului din produsul patologic

b. Reacţii de aglutinare pe suport

Elementul cunoscut al reacţiei imune este ataşat de un suport:

- hematie – hemaglutinare pasivă (hematia nu participă direct în reacţia ag-ac)

- particulă latex - latexaglutinare

- proteina A extrasă din tulpina de stafilococ Cowan – coaglutinare

suport îmbrăcat cu ac cunoscuţi

virus – ag?

Aglutinare pe suport – formarea aglutinatului

10
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Reacţia de neutralizare
• capacitatea infectantă a unui virus este neutralizată de anticorpii corespunzători
• amestec ag-ac: nu produce infecţie (culturi celulare, animal de laborator)
Virusneutralizare: ac + ag?
Seroneutralizare: ac? + ag

Metode moderne – metode care folosesc un reactant imunologic marcat

1. Reacţia de imunofluorescenţă (RIF)

Fluorocromii:
- se leagă covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat
- emit fluorescenţă dacă se expun la raze UV
- izotiocianatul de fluoresceină (galben-verzui), rodamina (portocalie)
- nu sunt stabili în timp

1.1 Metoda directă

Preparatul de examinat se montează pe lamă. Se adaugă conjugatele. În cazul în care
se găsesc ag corespunzătoare anticorpilor marcaţi, se formează complexele imune. Prin
spălare se îndepărtează conjugatele nelegate. Preparatul se examinează la microscopul cu
fluorescenţă. Puncte fluorescente pe fond întunecat: în preparatul examinat au fost prezente
antigenele căutate (rezultat pozitiv).
Absenţa punctelor fluorescente: în preparat nu au fost prezente antigenele căutate
(rezultat negativ).

antigen din preparatul montat pe lamă (preparat histologic

sau suspensie de pe culturi de celule infectate)

anticorp marcat cu fluorocrom

11
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

1.2 Metoda indirectă

La preparatul montat pe lamă se adaugă anticorpi specifici nemarcaţi. . În cazul în care
există ag corespunzătoare anticorpilor, se formează complexele imune. Prin spălare se
îndepărtează ac nelegaţi. Se adaugă anticorpi antiglobulinici marcaţi cu fluorocrom. Dacă
există în preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline. Examinarea: la
fel ca la metoda directă.

anticorp antiglobulină marcat cu fluorocrom

anticorp specific antigenului căutat în preparat

2. Metoda imunoperoxidazică (IPO)

- marcare enzimatică – peroxidază (descompune peroxidul); vizualizarea se realizează prin
adăugarea substratului cromogen – rezultă un precipitat maroniu, insolubil, vizibil la
microscopul optic
- se realizează la fel ca şi RIF
- avantaje: - preparatele pot fi păstrate în timp
- nu este necesar microscop special
antigen din preparatul montat pe lamă
(preparat histologic sau suspensie de pe
culturi de celule infectate)

anticorp marcat cu peroxidază

12
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

3. Metode imunoenzimatice (RIE, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay)

Permit detectarea antigenelor libere şi a anticorpilor. Este posibilă determinare cantitativă.
La reacţii participă:
- un reactant imunologic cunoscut ataşat de un suport solid (plăci cu godeuri, lame,
baghete). Se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A)
- un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza
- substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare detectabilă
spectrofotometric (determinare cantitativă)
- substanţe pentru stoparea reacţiei (baze sau acizi puternici)
Reacţiile au loc în aparate automate, semiautomate.
Între reacţii – spălare cu soluţii tampon

Detectarea antigenelor

anticorpi specifici

anticorpi marcaţi enzimatic

antigen?

substrat cromogen

Detectarea anticorpilor
stoparea reacţiei

anticorp antiglobulinic marcat

anticorp?

antigen cunoscut

13
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

Identificarea microorganismelor prin detectarea acizilor

nucleici

Genomul conţine secvenţe specifice pentru fiecare microorganism, detectarea prezenţei

acestora într-un produs patologic sau în culturi celulare are valoare diagnostică.

1. Metode de hibridizare
Principiu: fragmente monocatenare de oligonucleotide marcate (sonde), având secvenţă
cunoscută (caracteristică unui virus) se vor ataşa pe baza complementarităţii de secvenţe
complementare situate pe acizii nucleici ale microorganismului de identificat.
Etape de lucru:
- extragerea acizilor nucleici
- denaturarea acizilor nucleici şi fixarea acestora pe un suport
- hibridizare: adăugarea sondelor (marcate enzimatic, cu fluorocrom sau cu substanţe
radioactive) şi ataşarea acestora de secvenţele omoloage
- eliminarea sondelor nefixate
- vizualizarea hibridizării
Vizualizarea se face în funcţie de tipul marcajului folosit.

A T T G C A A T
C G C G
G C G C
denaturare T A T A

1.1 Metoda Southern blot

Se detectează secvenţe specifice de nucleotizi de ADN.
Etape:
- extragerea ADN-ului
- denaturarea ADN-ului – se obţin lanţuri monocatenare
- fragmentarea lanţurilor cu enzime de restricţie (acestea acţionează în locusuri
determinate, rezultând fragmente de lungime diferită, caracteristice)
14
 Disciplina de Microbiologie UMF Tg.Mureş
LP2

- separarea electroforetică a fragmentelor în gel de agaroză (separarea se face în funcţie

de mărimea fragmentelor)
- transferarea pe membrană de nitroceluloză
- adăugarea sondelor marcate cu substanţe radioactive – ataşarea de secvenţele
omoloage
- se îndepărtează sondele în exces, nelegate
- vizualizare prin autoradiografie
Pe principiu similar se bazează metodele:
1.2 Northern blot – se detectează ARN, este necesară revers-transcriptaza
1.3 Western blot – se detectează proteine

2. Reacţia în lanţ a polimerazei (PCR – polimerase chain reaction)

Se detectează secvenţe specifice de acid nucleic după o prealabilă amplificare.
Etapele de lucru - detectarea ADN-ului
- extragerea ADN-ului
- amplificare: se realizează în aparatul PCR şi constă din mai multe cicluri identice
- denaturare (900C)
- alinierea primerilor (500C) – 2 secvenţe de oligonucleotide care se leagă prin
complementaritate pe cele două catene la o anumită distanţă între ele.
- sinteza lanţurilor complementare (700C ) – elongaţie; este necesară prezenţa
enzimei polimerază (Taq) şi a nucleotidelor – se formează lanţurile complementare
astfel se dublează cantitatea de ADN
- reluarea ciclului de n ori – se obţin 2n copii ale secvenţei de identificat
- vizualizarea produşilor de amplificare
- produşii de amplificare obţinuţi se separă electroforetic
- colorare cu bromură de etidiu
- vizualizare cu raze UV – prelucrare computerizată

Multiplex PCR – se amplifică mai multe gene odată

Real time PCR
RT-PCR - este necesară revers-transcriptaza

15