Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
MOSORA”BUZAU
LUCRARE DE DIPLOMĂ
COORDONATOR ABSOLVENT
AS.PR LAB PODOSU GABRIELA RIMNICEANU LILIANA DOINA
IULIE 2012
BUZAU
SCOALA POSTLICEALĂ SANITARĂ ‘’FLORENTINA
MOSORA”BUZAU
DIAGNOSTICUL DE
LABORATOR IN TUMORI
EPITELIALE OVARIENE
COORDONATOR ABSOLVENT
AS.PR LAB PODOSU GABRIELA RIMNICEANU LILIANA DOINA
IULIE 2012
BUZAU
CUPRINS
Argument.........................................................................................................6
I.Introducere....................................................................................................7
II. Etiopatogenia cancerului ovarian...............................................................9
1.Factori de risc..........................................................................................11
a). Paritatea.............................................................................................11
b). Alăptarea...........................................................................................12
c). Infertillitatea şi stimulatoarele ovulaţiei............................................13
d). Vârsta la menarhă şi menopauză.......................................................13
e. Hormonii exogeni...............................................................................14
f). Ligatura tubară şi histerectomia.........................................................15
g). Talcul.................................................................................................15
h). Factorii alimentari.............................................................................16
i). Istoricul familial.................................................................................17
2.Factori de crestere ai celulelor epiteliale ovariene..................................17
Factori hormonali...................................................................................18
Anomaliile cromozomiale.....................................................................20
III. Clasificarea histopatologica a tumorilor ovariene...................................21
CLASIFICAREA OMS A TUMORILOR OVARIENE............................21
1. TUMORI EPITELIALE.....................................................................21
B. Tumori mucinoase.............................................................................22
C. Tumori endometrioide.......................................................................23
D. Tumori de celule clare (mezonefroide)..............................................23
E. Tumori Brenner..................................................................................24
F. Tumori mixte epiteliale......................................................................24
G. Carcinoame nediferentiate.................................................................24
H. Tumori epiteliale neclasificabile.......................................................24
2. TUMORI ALE MEZENCHIMULUI SI CORDOANELOR SEXUALE
...................................................................................................................24
3. TUMORI CU CELULE LIPOIDICE....................................................24
4. TUMORI CU CELULE GERMINALE................................................24
5. GONADOBLASTOM:..........................................................................25
6. TUMORI ALE ŢESUTURILOR MOI NESPECIFICAT......................25
IV. Clasificarea stadiala a cancerului de ovar...............................................25
V. Aspecte clinice in cancerul de ovar...........................................................27
VI. Explorari paraclinice...............................................................................30
Imunohistochimia sau IHC.....................................................................45
VII. Diagnosticul diferential.........................................................................48
VIII. Evolutie si prognostic...........................................................................50
1. Calea peritoneala...................................................................................50
2. Calea limfatica.......................................................................................51
3. Calea sanguina.......................................................................................51
IX. Tratament................................................................................................52
Interventia chirurgicala..............................................................................52
Chimioterapia............................................................................................53
a. Monoterapia........................................................................................53
b. Polichimioterapia...............................................................................54
Radioterapia ..............................................................................................54
Hormonoterapia.........................................................................................55
Imunoterapia..............................................................................................55
X. Prognostic.................................................................................................56
XI.CONCLUZII............................................................................................59
XII.Anexe si statistici....................................................................................60
XIII.FISE TEHNICE.....................................................................................63
RECOLTAREA SANGELUI PRIN PUNCTIE VENOASA PENTRU....63
ANALIZE MEDICALE............................................................................63
Determinarea antigenului CA 125.............................................................67
TEHNICA HISTOLOGICA UZUALA.....................................................69
Tehnica Imunohistochimica (IHC)............................................................74
Bibliografie...................................................................................................78
Motto:
R. Augier
Argument
Fig 3.Paritatea
Efectele vârstei la prima naştere precum şi a sarcinilor incomplete
(avortul, naşterea unui nou-născut mort, sarcina ectopică) asupra riscului
pentru cancer ovarian, nu au fost încă complet elucidate.
Rezultatele studiilor cumulative efectuate în spital în S.U.A. şi Europa
sugerează o creştere a riscului de cancer ovarian odată cu creşterea vârstei la
prima naştere, invers faţă de rezultatele studiilor populaţionale .
Unele studii au arătat existenţa unui efect protector pentru sarcinile
incomplete similar sarcinilor duse la termen, alte studii au arătat existenţa
unei relaţii invers, proporţionale nesemnificative, iar alte studii au putut
demonstra existenţa unei corelaţii între acestea şi riscul pentru cancerul
ovarian .
Diferenţe în analiza datelor, includerea în studiile efectuate în spital şi
a altor condiţii ginecologice, precum includerea nou-născuţilor morţi şi alte
discrepanţe metodologice, fac dificilă interpretarea acestor rezultate .
Fig 4.Alaptarea
Femeile care au alăptat au prezentat o reducere cu 60 % a riscului
ameninţător de viaţă comparativ cu nuliparele.
Între multipare, riscul ameninţător de viaţă prin cancer ovarian este cu 40 %
mai scăzut la cele care au alăptat faţă de cele care nu au alăptat .De
asemenea, riscul apariţiei cancerului ovarian pare să scadă cu durata
lactaţiei, efectul protector în primele 6 luni de lactaţie .
e. Hormonii exogeni.
Contraceptivele orale combinate, reduc riscul de cancer de ovar, iar efectul
lor protector este unul din rezultatele care a fost probat în cadrul celor mai
consistente studii epidemiologice ale cancerului ovarian.
g). Talcul.
Asocierea dintre talcul cosmetic şi cancerul ovarian a fost presupusă
avându-se în vedere patru lucruri evidente, o relaţie ontogenică între epiteliul
ovarian şi mezoteliul peritoneal, relaţia chimică dintre depozitele minerale
de talc şi azbest, corelaţia dintre azbest şi mezotelioamele pleurale şi
peritoneale şi posibilitatea talcului de a pătrunde în cavitatea peritoneală
de-a lungul căilor genitale, precum şi faptul că au fost evidenţiate particule
de talc în ţesutul ovarian normal şi canceros .Rezultatele studiilor publicate
în literatura de specialitate referitoare la rolul etiologic al pudrei de talc în
etiologia cancerului ovarian sunt contradictorii.
Factori hormonali
3. Oncogenele
4. Antioncogenele
5. Anomaliile cromozomiale
1. TUMORI EPITELIALE
A. Tumori seroase
- Benigne si border-line (la limita malignitati): chistadenom si
chistadenomul papilar; papilom de suprafata; adenofibrom si
chistadenofibrom. Nu se deosebesc macroscopic de tumorile epiteliale
comune benigne corespondente şi anume: formele seroase şi mucinoase apar
mai frecvent ca proliferări chistice multiloculare, cu mici vegetaţii
intrachistice.
B. Tumori mucinoase
- Benigne si border-line: chistadenom; adenofibrom si chistadenofibrom.
- Maligne: adenocarcinom; adenofibrom malign.
C. Tumori endometrioide
- Benigne si border-line: adenom si chistadenom; adenofibrom si
chistadenofibrom.
- Maligne: carcinom, adenocarcinom, adenoacantom,
adenochistadenofibrom malign si chistadenofibrom; sarcom endometroid de
tip stromal; tumora mixta mezodermica homiloga si heterologa si tumora
mixta mulleriana. Sunt în general chistice cu arii solide întinse. Conţinutul
chistic este de cele mai multe ori şocolatiu.
G. Carcinoame nediferentiate
Fig 14.Limfangiografia
b. Markeri enzimatici:
- Fosfataza alcalina (izoenzima Regan). Izoenzimele fosfazatei alcaline
apar in ser derivand din ficat, os, plaman, tract intestinal si placenta.
Izoenzima placentara a fosfatazei alcaline apare in ser la valori crescute in
cazul mai multor tipuri de cancer, printre care si cel ovarian.
- LDH (lactat dehidrogenaza) totala este moderat crescuta la cele mai
multe paciente cu neoplazii extinse la nivelul hepatic (metastaze). In cazul
neoplaziilor ovariene cu efuziuni pleuro sau peritoneale valorile LDH sunt
mai crescute in aceste produse decat in ser.
c. Markeri hormonali
- HCG este in mod normal secretat de placenta; creste in cursul sarcinii si in
tumori ovariene.
- β-HCG (hormonul gonadotropic corionic uman fractiunea β) - este
folosit ca marker tumoral in tumorile cu celule germinative (embrionare) de
ovar sau tumori testiculare. Ca si in cazul AFP, este deosebit de utila
determinarea preterapeutica a nivelului b–HCG.
- hormonii androgeni (testosteronul) crescuti mai ales in tumorile
secretante de ovar.
- estrogenii - nivelul lor urinar creste in tumorile asociate cu
hiperestrogenism (tecom, tumora de granuloasa).
Dar studii prin metoda RIA au demonstrat că circa 30% din
carcinoamele ovariene secretă estronă şi androstendion.
Studiile lui Mahlock (1986) au demonstrat că stroma tumorilor ovariene
produce cantităţi mici dar semnificative de androstendion , progesteron şi
estradiol . Valorile plasmatice sunt în legătură cu masa tumorală şi stadiul
clinic; scad după reducerea chirurgicală a masei tumorii sau în urma unor
tratamente chimice eficace , cresc în recidive şi au valoare prognostică
asupra evoluţiei bolii.
Chimioterapia.
Este principala metoda terapeutica adjuvanta actului chirurgical sau
utilizata ca tratament initial in cancerele ovariene avansate .
Chmioterapia poate fi aplicata ca: monoterapie sau polichimioterapie.
Radioterapia .
Este utilizata ca tratament adjuvant in cancerul de ovar, dupa
citoreductie chirurgicala maximala, pentru tratarea unor tumori inoperabile,
care nu raspund la chimioterapie, ca terapie „de salvare” la pacientele cu
boala persistenta dupa tratament primar, chimioterapie si interventii second-
look. Ea poate fi folosita si ca tratament paleativ la pacientele cu mase
pelvine sau metastaze (cerebrale, hepatice, osoase).
Radioizotopii utilizati sunt: Au 196 si P 32. Doza si schemele de fractionare
a dozei iradiante reprezinta un compromis intre dozele tumoricide necesare
pentru distrugerea maselor tumorale si pericolul agresivitatii semnificative
asupra tesuturilor normale.
In concluzie, radioterapia este o metoda cu reale posibilitati in tratamentul
cancerului de ovar, dar locul sau in terapia acestuia este dupa tratamentul
chirurgical si citostatic.
Hormonoterapia.
Introducerea tratamentului hormonal in terapia cancerului ovarian nu
s-a bazat pe prezenta de receptori pentru estrogen si progesteron. Cele mai
folosite preparate au fost: Megace, Medroxiprogesteron, Tamoxifen. Intra in
discutie la femei tinere cu stadiul IA si tumori border-line.
Imunoterapia.
Astăzi se ştie că, pe lângă acţiunea antivirală, interferonii pot afecta
profund anumite celule şi anumite funcţii ale organismului, incluzând
metabolismul, proliferarea celulară, stimularea hormonală, imunitatea şi
dezvoltarea tumorală. Aceasta metoda foloseste administrarea de interferon
gamma, TNF, IL-2, LAK, vaccin cu Corynebacterium parvum, Melphalan,
Levamisol, BCG, Polidin. Imunoterapia nespecifica asociata chimioterapiei
s-a dovedit activa in cancerul ovarian, dar utilizarea singulara a acesteia este
ambigua
X. Prognostic
Studiul retrospectiv are ca scop calcularea frecvenţelor cu care apar anumite tumori ,
gruparea pe intervale de vârstă şi studiul evoluţiei tumorii pe stadii în perioada analizată.
Interval de vârstă Procent / grupă de vârstă
20-30ani 12%
30-40 ani 14%
40-50 ani 33.5%
50-60 ani 28.5%
Peste 60 ani 2%
Total 100%
Media de varsta
Media de vârstă pentru leziunile benigne este aproximativ 37 de ani.
Media de vârstă pentru leziunile borderline este aproximativ 50 de ani.
Media de vârstă pentru leziunile maligne este aproximativ 58 de ani.
Media de vârstă per total este aproximativ 48 de ani.
60
50
40
30
Media de varsta (ani)
20
10
0
Benign Borderline Malign Total
CLASIFICAREA STADIALA FIGO A CANCERULUI DE OVAR
ANALIZE MEDICALE
Pregătirea materialelor:
1 formularul de cerere analize trebuie completat corect şi clar cu
datele pacientului, analizele cerute, data şi ora recoltării, numele medicului
care indică analizele.
2 eprubetele trebuie alese cu grijă în funcţie de analizele care se cer şi
de aditivii pe care îi conţin
3 fiecare eprubetă trebuie completată corect şi clar cu datele
pacientului
Recoltarea:
1 se spală mâinile bine şi se pun mănuşi
2 confirmarea identităţii pacientului (pentru a se evita confuzia şi a
nu se lua analize la un alt pacient)
3 se comunică pacientului ce i se va face, i se va explica procedura
pentru a-i reduce anxietatea şi a ne asigura de cooperarea sa
4 se face o scurtă anamneza referitor la ce a simţit pacientul şi la
eventulele incidente în cazul unor recoltări anterioare (lipotimii, ameţeli)
1 recoltarea se face cu pacientul întins în pat sau stând în scaun, cu
mâna sprijinită pe suportul special al scaunului sau de o masă
2 evaluarea celui mai bun loc de puncţie venoasă
3 se observă şi se palpează vena pentru o mai precisă localizare
4 se montează garoul proximal faţă de zona aleasă pentru puncţie.
Dacă venele nu s-au dilatat corespunzător se cere pacientului să închidă şi să
deschidă pumnul de câteva ori. (pacientul trebuie sa ţină pumnul strâns în
timp ce se puncţionează vena şi să-l deschidă după ce se introduce acul în
venă).
5 se dezinfectează zona aleasă pentru puncţie cu paduri cu alcool
până acesta rămâne curat. Curăţarea zonei se face dinăuntru spre în afară
pentru a se preveni contaminarea zonei puncţionate cu flora existentă pe
pielea din jur.
6 nu se combină folosirea padurilor cu alcool cu cele pe bază de iod,
deoarece alcoolul neutralizează efectul dezinfectantelor pe bază de iod.
7 după dezinfectarea zonei se asteaptă să se usuce înainte de
puncţionare
8 se imobilizează vena presând cu policele exact sub locul ales pentru
puncţie şi se întinde de piele
9 se puncţionează vena sub un unghi de 30 grade. Dacă se foloseşte
eprubeta, ea se va umple automat până la nivelul la care este marcată. Dacă
se foloseşte seringa, se va evita aspirarea bruscă şi rapidă, deoarece se va
colaba vena.
10 holderul trebuie menţinut într-o poziţie sigură pentru a evita iesirea
lui din venă
11 se va îndepărta garoul imediat ce sângele începe să curgă adecvat,
pentru a preveni staza şi hemoconcentraţia sângelui ce pot afecta rezultatele
probelor recoltate
12 se va evita să se ţină garoul mai mult de 3 minute
13 se schimbă cu atenţie eprubetele care trebuie umplute pentru a nu se
scoate accidental acul din venă sau a se perfora vena
14 după umplere, fiecare eprubetă se va agita cu blândeţe pentru
amestecarea aditivilor cu sângele
15 se desface garoul întotdeauna înainte de scoaterea acului
16 se pune o compresă sterilă deasupra acului la nivelul locului de
puncţie şi se scoate cu blândeţe acul din venă. Întotdeauna se scoate întâi
eprubeta din holder şi apoi se scoate acul
17 se presează locul puncţiei pentru 2-3 minute sau până când se
opreşte sângerarea dacă aceasta durează mai mult de atât. Aceasta previne
extravazarea sângelui în ţesutul din jur şi formarea hematomului.
18 după oprirea sângerării se aplică un bandaj adeziv
19 a se evita agitarea puternică şi bruscă a eprubetelor deoarece se
poate produce hemoliză.
20 se reverifică locul puncţiei pentru a se vedea dacă s-a produs
hematom. În cazul în care s-a produs hematom se va presa energic locul
timp de 5 minute, după care se aplică comprese calde.
21 se descarcă materialele folosite în containerele speciale, separate.
Consideraţii speciale:
1 nu se va recolta niciodata de pe braţul sau piciorul care au fost
folosite deja pentru diverse terapii intravenoase sau transfuzii, deoarece
rezultatul analizelor poate fi afectat.
2 de asemenea, se va evita recoltarea de sânge din zone edemaţiate,
sunturi arterio-venoase, zone cu hematoame sau răni vasculare
3 dacă pacientul are vene vizbile, pronunţate, se va recolta evitând
folosirea garoului, prevenindu-se astfel formarea de hematoame.
4 dacă pacientul are tulburări de coagulare sau este sub tratament cu
anticoagulante, se va presa ferm locul puncţiei cel puţin 5 minute pentru
prevenirea formării hematomului şi se va specifica tratamentul anticoagulant
pe cererea de analize ce se trimite la laborator
5 se va evita puncţia venoasă din picior deoarece poate creşte riscul
apariţiei tromboflebitei
Pregatire pacient
Se recolteaza a jeun (pe nemancate).
Metoda
Se foloseste metoda imunochimica cu detectie prin
electrochemiluminiscenta (ECLIA).
Limite si interferente
CA 125 nu poate fi utilizat pentru screening-ul cancerului ovarian in
populatia generala, datorita lipsei sale de sensibilitate pentru stadiul precoce
al bolii.
Cresteri usoare ale marker-ului se pot intalni in timpul menstruatiei, primul
trimestru de sarcina, diferite afectiuni benigne ale sferei genitale
(endometrioza, fibromatoza, boli inflamatorii pelvine), dar si in alte afectiuni
benigne non-ginecologice (pancreatita acuta sau cronica, hepatita, ciroza,
insuficienta renala, boli autoimune etc.).
Interferente analitice
Pot produce interferente cu unele componente ale kit-ului si conduce la
rezultate neconcludente urmatoarele:
- tratamentul cu biotina in doze mari (>5 mg/zi); de aceea se recomanda ca
recoltarea de sange sa se faca dupa minimum 8 ore de la ultima administrare;
- titrurile foarte crescute de anticorpi anti-streptavidina si anti-ruteniu;
- anticorpii monoclonali proveniti de la soarece administrati la unii pacienti
in scop diagnostic sau terapeutic.
TEHNICA HISTOLOGICA UZUALA
1. RECOLTAREA BIOPSIILOR
Biopsia consta in recoltarea unei mostre de tesut din organism in scopul
examinarii in laborator. Tesutul analizat la microscop ajuta la confirmarea
unui diagnostic. In unele cazuri, pentru prelevare este suficienta doar
zgarierea suprafetei (acest lucru se intampla, de exemplu, in cazul frotiului
de col uterin).
In timpul investigatiilor specifice intestinului gros, cu ajutorul endoscopului,
se poate realiza si o biopsie, daca medicul considera ca aceasta investigatie
este necesara. In alte cazuri, de exemplu, biopsia de ficat sau rinichi, proba
de tesut se recolteaza prin intermediul unui ac hipodermic mare.
· se realizează cu ajutorul unor instrumente fine si tăioase
· piesa recoltata trebuie sa fie reprezentativa, conţinând zone cu modificări
macroscopice, precum si ţesuturi de la limita leziunilor, evitându –se zonele
cu ţesuturi necrozate si cu zone de hemoragie;
· fragmentele recoltate trebuie sa fie de 0,5 cm si sa aibă feţele netede si
paralele
· păstrarea întregii piese de rezecţie sub fixator
2. FIXAREA
· fixarea are ca prim scop oprirea evoluţiei celulelor si ţesuturilor intr-o stare
cat mai apropiata de momentul recoltării blocarea reacţiilor enzimatice si
stoparea degenerării autolitice
· fixarea biopsiilor curente se face la temperatura camerei;
· fixatorii, pentru a pătrunde in ţesuturi, trebuie sa aibă anumite calităţi: o
presiune osmotica mare, concentraţie electrolitica optima (de 24 ori mai
mare ca a sângelui), pH acid.
· durata fixării variază cu tipul de fixator utilizat, fiind intre 3 ore si 24 de
ore
· o proprietate importanta a fixatorului utilizat este penetrabilitatea, care
depinde atât de compoziţia chimica a fixatorului, cat si de structura ţesutului
care fixează; in general ţesuturile parenchimatoase sunt penetrate mai repede
de fixator in comparaţie cu cele conjunctive
Ţesuturile fixate in formaldehida sunt relativ dure, elastice si pot fi
secţionate uşor.
Fixarea uzuală se realizează cu formaldehida la temperatura camerei.
Metoda este utila si pentru secţiunile destinate reacţiilor IHC. Fixarea in
formaldehida permite păstrarea pieselor pentru perioade îndelungate.
Mecanismele fixării
- fixatorii induc coagularea proteinelor si parţial polimerizarea lor (ex.
formaldehida se
- combina cu molecule proteice);
- consecinţe ale coagulării proteinelor:
- țesuturile fixate in formaledehidă sunt relativ dure, elastice si pot fi
secționate
- blocarea reacţiilor enzimatice si stoparea degenerării autolitice
Practica fixării
Fixarea uzuala se realizează cu formaldehida la temperatura camerei; pot fi
identificate cu acuratețe mucinele, dar numai o parte din lipide (secţiuni la
gheata). Metoda este utila si pentru SH destinate reacţiilor IMH. Fixarea in
formaldehida permite păstrarea pieselor pentru perioade îndelungate pana la
clarificarea diagnosticului.
INCLUDEREA SI SECTIONAREA
3.Includerea la parafină
Includerea
- este procesul care permite infiltrarea specimenelor cu un material semidur,
cu punct de topire fix si care poate fi secţionat dupa solidificare
- cel mai cunoscut mediu de includere este parafina histologica, cu punct de
topire 56 grade; parafina este o mixtura de hidrocarburi solide derivate din
petrol, fiind incolora, alba si uneori translucida.
Tehnici SPECIALE
1. COLORATII TRICROMICE (Van Gieson şi MASSON)
· evidenţierea fibrelor de colagen
· colorează diferenţiat fibrele de colagen, ţesutul epitelial si nucleii
2. COLORATII PENTRU MUCINE (Albastru Alcian + PAS)
· AA si PAS demonstrează prezenta de mucine neutre
3. PAS
· evidenţierea prezentei glicogenului, mucine neutre, conturului membranei
bazale,fungilor si paraziţilor
4. GIEMSA
· evidenţierea elementelor limfoide, a mastocitelor
5. COLORATII PENTRU FIBRE ELASTICE (WEIGERT / EVG)
· evidenţierea fibrelor elastice
6. RETICULINA (Metoda GordonSweet)
· evidenţierea fibrelor de reticulina si a membranei bazale.
7. COLORATII PENTRU HEMOSIDERINA (Perls)
· evidenţierea fierului in ţesuturi
8. COLORATII PENTRU AMILOID (Roşu Congo)
· evidenţierea amiloidului la microscopul optic si cu polarizare
9. PTAH (acid fosfotungstic hematoxilin)
· varianta de colorare tricromica pentru fibrele intracitoplasmatice (din
celule
musculare si celule gliale)
10. COLORATII PENTRU MICRORGANISME
· evidenţierea bacililor (Gram + sau ),BK (ZiehlNeelsen),
fungi si paraziţi (PAS)
11. TEHNICI DE MICROSCOPIE ELECTRONICA
inclusiv membrana bazala.
12. TEHNICI DE IMUNHISTOCHIMIE (IHC)
· evidenţierea de antigene specifice
13. TEHNICI DE EVALUATRE (METODA CANTITATIVA)
· apreciază cantitativ indicele /gradul de proliferare pentru evaluarea
tumorilor neoplazice
14. METODA GROCOTT PENTRU FUNGI
· pentru evidenţierea de bacili (Gram +/),actinomyces, nuclei si alte
elemente tisulare
15. COLORATIA ALBASTRU ALCIAN (AA)
· pentru evidenţierea glicozaminoglicanilor
16. IDENTIFICAREA CELULELOR NEUROENDOCRINE
· metoda de dubla impregnare argentica, tehnica Grimelius
Tehnica Imunohistochimica (IHC)
Antigenele (Ag)
Antigenele sunt substanţe care determină din partea organismului un răspuns
imun, cu producerea de anticorpi (Ac). Antigenele trebuie sa aibă 2
proprietăţi principale:
-imunogenitate – capacitatea de a induce formarea Ac şi
- reactivitate specifică – cu anticorpul a cărui formare a indus-o antigenul
însuşi.
Pot fi :
· antigene de diferenţiere care pot fi prezente in celule embriofetale
(HCG, AFP, CEA), in celule adulte normale si in celulele corespondente
tumorale (filamente intermediare ale citoscheletului sau molecule de
adeziune intercelulara);
· antigene de citotip molecule de tip secretor (alfalactalbumina, caseina),
molecule de tip neuroendocrin (cromogranin, neuronspecific enolaza),
hormoni;
· oncogene si produsele lor implicate in oncogeneza (p53, cerb2),
cu implicaţii in tratamentul genetic al tumorilor;
· factori de proliferare evidenţiabili cu IMH (Ki67, PCNA), utili intro
Monitorizare mai atenta a terapiei din unele tumori, terapie altfel foarte
agresiva;
· antigene virale si microbiene (HPV, CMV, Pneumocistis carinii)
Anticorpii (Ac)
Marcajul vizual
Existenta mai multor cromogeni, diferit colorati, pentru o anumita enzima
permite colorarea succesiva cu diferiti Ac si pentru localizarea mai multor
Ag pe aceeasi sectiune.
In toate cazurile in care se utilizeaza un sistem oarecare de imunperoxidaza,
cromogenul preferabil este 3,3’ diaminobenzidina (DAB) ce determina o
coloraţie maro.
Alt cromogen este aminoetilcarbazolul (AEC), ce determina un precipitat
roşu.
Protocolul de imunohistochimie.
1. Secţiunile la parafină de 4 microni se aplică pe lame special tratate cu o
mare adezivitate (am folosit lame SuperFrost ® Plus)
2. Deparafinarea se face în 3 băi de xylen câte 5 minute, urmată de 3 băi de
etanol (100°, 70°, 50°) câte 3 minute (la urma se spală in PBS1X; apoi
urmează incubarea cu diluantul).
3. Introducerea lamelor ½ oră în PBS x1
4. Incubarea lamelor la temperatura camerei (RT) ½ oră cu diluant DAKO.
5. Se scutură lamele fără spălare, se şterge porţiunea dintre secţiuni.
6. Demascarea situsurilor antigenice dacă este necesară
7. Incubarea lamelor la temperatura camerei (RT) 1
oră cu primul anticorp, diluţie de 1:200.
8. Spălare cu PBS x1 de 5 ori energic
9. Blocarea peroxidazelor endogene cu reactiv DAKO. Se utilizeaza şi
soluţie 0,3% H2O2. După aplicarea picăturii de sol. 0,3% H2O2 se
incubează 5 minute la temperatura camerei.
10. Spălare cu PBS x1 de 5 ori energic
11. Aplicarea celui de-al doilea anticorp, diluat 1:100 şi incubare ½ oră la
temperatura camerei.
12. Spălare cu PBS x1 de 5 ori energic
13. Se prepară DAB dintr-o picătura DAB şi 1 ml de substrat. Se depune
DAB şi se lasă maximum5 minute la întuneric, la temperatura camerei.
14. Se opreşte reacţia cu apă de robinet
15. Se face contracolorarea cu Hematoxilina Mayer’s.
16. Se reiau etapele până la montare cu Eukit. Se lasă să se usuce 24 de ore.
17. Se examinează la microscop.
Bibliografie