Apoptoza.

Implicatii in patologia maligna

1.Introducere

Moartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si

functionarea normala a organismelor multicelulare. Celulele non-
necesare, deteriorate si potential nocive trebuie inlaturate din
microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale
si functionale a tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost
observate la aproape toate tipurile celulare pe parcursul dezvoltarii si
maturarii. Pe parcursul dezvoltarii embrionare modelarea celulara
specifica si organogeneza sunt asigurate de un program spatiotemporal
definit genetic de proliferare si moarte celulara. In tesuturile adulte,
moartea celulara fiziologica apare de asemenea proeminent in interiorul
tesuturilor ciclic stimulate sau dependente hormonal, cum sunt
endometrul, prostata si glanda mamara, dar si in turnoverul “stady-state”
al multor alte tesuturi. Moartea selectiva a celulelor este fundamentala
pentru dezvoltarea, reglarea si functionarea sistemului imun, incluzand
eliminarea timocitelor auto-reactive, selectia negativa a limfocitelor T si
B si distrugerea celulelor realizata de limfocitele T citotoxice. Celulele
ce au suferit deteriorari genetice ireparabile sunt de asemenea detectate
de procese endogene, probabil limitandu-se astfel diseminarea leziunilor
genetice potential nocive. Limfocitele ce invadeaza tesuturi privilegiate
din punct de vedere imunologic sunt rapid eliminate, astfel protejandu-
se regiunile sensibile de o deteriorare produsa printr-un raspuns
inflamator (1). Conceptul unificator al tuturor acestor circumstante
diverse este acela ca procesul de moarte celulara este mediat de un set
comun de evenimente si se desfasoara pe cai biochimice similare
conducand la o dispunere stereotipa a modificarilor structurale. Aceasta
moarte celulara este numita apoptoza.
Apoptoza este un proces innascut, conservat din punct de vedere
evolutiv, prin care celulele sistematic isi inactiveaza, isi dezasambleza si
isi degradeaza propriile componente structurale si functionale pentru
desavarsirea propriului lor deces. Acest proces poate fi activat
intracelular printr-un program de dezvoltare definit genetic sau
extracelular prin intermediul proteinelor endogene, citokinelor si
hormonilor ca si de componente xenobiotice, radiatii, stresul oxidativ si
hipoxia. Abilitatea unei celule de a intra in apoptoza ca raspuns la un
semnal de “moarte” depinde de statusul sau proliferativ, pozitia ciclului
celular si de expresia controlata a genelor care promoveaza, inhiba si
afecteaza programul de moarte. Reglarea stricta a acestor parametri
modulatori ai mortii trebuie mentinuta pentru asigurarea contextului
fiziologic propice aparitiei apoptozei. Disfunctiile ce apar in oricare
dintre punctele caii de moarte programata, pot duce la un proces
apoptotic eronat determinand astfel la exprimarea unor conditii
fiziopatologice.
Importanta apoptozei deriva din natura sa activa si din potentialul
sau de a controla sistemele biologice.
Moartea celulara a fost considerata la inceput un proces haotic.
Totusi, asa cum o celula isi poate echilibra metabolismul, penduland
intre anabolic si catabolic, tot astfel un organism multicelular trebuie sa
echilibreze ratele de proliferare celulara si de moarte celulara pentru
mentinerea homeostaziei. De asemenea, un organism trebuie sa
indeparteze celulele senescente, deteriorate sau anormale care ar putea
sa interfere cu buna functionare a unui organ sau s-ar putea transforma
malign. Ca urmare, alterarile survenite in domeniul reglarii mortii
celulare ar putea contribui la patogeneza bolilor degenerative si
neoplazice. Desi moartea celulara “fiziologica” se cunoaste de decenii,
interesul pentru aceasta problema a fost reactualizat in 1972, cand Kerr,
Wyllie si Currie au descris in detaliu modificarile ultrastructurale
caracteristice celulelor muribunde si au propus termenul de apoptoza
pentru descrierea acestui proces (2). Ei au evidentiat faptul ca moartea
celulara fiziologica nu este un proces randomic, ci are trasaturi
morfologice distincte. De obicei apoptoza afecteaza celule individuale
si, odata initiata, se propaga rapid.
Ingestia celulelor apoptotice de catre macrofage nu induce
eliberarea enzimelor proteolitice sau a oxigenului singlet care e toxic.
Fragmentarea celulelor are loc fara scurgerea continutului celular in
spatiul extracelular, iar indepartarea celulelor apoptotice nu provoaca un
raspuns inflamator. Absenta inflamatiei reprezinta o trasatura cruciala
permitandu-se astfel moartea celulei fara deteriorarea celulelor
adiacente.

2. Apoptoza versus necroza

Moartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un

organism multicelular. Dovezile sprijina ipoteza existentei unui
“program de sinucidere” inerent in celulele vertebratelor care este
activat atunci cand moartea celulei este dorita pentru binele restului
comunitatii celulare.
In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte
celulara cu morfologie distincta: apoptoza si necroza (3, 4), insa
mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca complet intelese.
NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si
apare cand celula nu-si mai poate mentine homeostazia ionica. Pe
masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si gradientul ionic
transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se
dilata. Initial se observa inmuguriri reversibile ale membranei,
modificari timpurii in conformatia si functia mitocondriilor si celula
devine rapid incapabila de a mentine homeostazia. Depasind un prag,
procesul devinde ireversibil. Membrana celulara poate deveni situsul
major al alterarilor pierzandu-si astfel capacitatea de reglare a presiunii
osmotice, celula se umfla si crapa. Deteriorarile membranelor interne
permit eliberarea enzimelor lizozomale, continutul celulei este
imprastiat in spatiul tisular inconjurator si provoaca un raspuns
inflamator nespecific.
Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul
inconjurator al celulei, ce determina leziuni severe si bruste, provocate
de exemplu de ischemie, hipertermie mentinuta sau traume fizice sau
chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic (5),
(figura 1).
 Figura 1. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care
au loc in apoptoza (2-6) si necroza (7 si 8). (1)Celula normala. Apoptoza
timpurie (2) se caracterizeaza prin compactarea si marginalizarea
cromatinei, condensarea citoplasmei si plierea membranelor, nucleara si
plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul se fragmenteaza si
protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma
corpii apoptotici, care (4), sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6)
degradate in lizozomi (7). Necroza este asociata cu gruparea neregulata
a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a membranelor
(8). Apoi membranele se dezintegreaza dar, in general, celula isi
mentine intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele
mononucleare.
 APOPTOZA este o forma de moarte celulara in care procesul este
mult mai subtil. Este adesea echivalata cu moartea celulara programata,
dar este bine sa mentinem cele doua concepte distincte - cel morfologic
si cel escatologic. Apoptoza se refera la o serie de modificari
morfologice pe parcursul procesului de moarte celulara, modificari
diferite de cele observate in necroza, fiind asociata cu procesul normal
de reglare a tesuturilor (fig. 1). La vertebrate, moartea celulara este
acceptata ca un proces obisnuit si chiar accentuat previzibil, dar
“programarea” ei nu se face in sensul acceptat la nevertebrate, ca o
moarte a celulelor individuale, care in anumite cazuri poate fi apreciata,
cu mare acuratete, ca fiind programata (6, 7). In ultima vreme suntem
fortati sa acceptam observatia, aparent paradoxala, ca moartea celulara
este atat programata cat si stohastica. De exemplu, pe parcursul
dezvoltarii populatiilor de celule B, aproximativ 95 % din celule vor
muri dintr-unul dintr-o varietate de motive (rearanjament genic
imperfect sau absenta stimularii) dar este imposibil de prevazut dinainte
care dintre ele se va produce.
Apoptoza apare in celule individuale dispersate, nu in grupuri de
celule invecinate, asa cum se intampla in necroza.
Se pare ca apoptoza prezinta cea mai comuna morfologie atunci
cand moartea celulara este determinata fiziologic. Referindu-ne la
mamifere, exemplele includ moartea celulelor cu perioada de
injumatatire scurta (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive;
involutia celulelor lipsite de factorii de crestere necesari; moartea
morfologica a celulelor pe parcursul evolutiei embrionare si
postembrionare timpurii; si omorarea celulelor care servesc drept tinte
celulelor T, celulelor natural ucigase (NK), sau mecanisme citotoxice
mediate celular dependente de anticorpi.
 Motivul pentru care celulele trebuie sa moara este diferit de la un
tip celular la altul la fel si mecanismul de declansare. Deseori semnalul
de sinucidere provine din mediul inconjurator, ca in expunerea la sau
retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori de crestere. Acest
aspect este incitant din punct de vedere conceptual, atata vreme cat se
traduce prin faptul ca soarta unei celule este dependenta de activitatea
alteia; chiar daca moartea este programata, locusul programului este in
afara celulei care trebuie sa moara. In alte cazuri, de exemplu turnoverul
neutrofilelor, se pare ca celula are un ceas intern autonom care ar
controla programul de moarte a celulei (adevaratul program de moarte
celulara autonom a fost identificat la nematode si genele ce controleaza
acest proces au fost elucidate (8). Caile de activare a apoptozei vor fi
diferite in diferite celule, dar mecanismul de moarte in sine va fi mereu
acelasi, ceea ce inseamna ca exista o cale finala comuna. Este foarte
important ca in studiul apoptozei sa incercam sa facem distinctia dintre
procesele care sunt specifice celulei de cele care sunt specifice mortii.
Se pare ca exista multe mecanisme declansatoare ale cailor de
sinucidere, chiar si intr-un singur tip de celula. Nu toate acestea vor fi
recunoscute imediat ca fiind “programate”. De exemplu, pentru a activa
calea apoptotica, timocitele pot fi semnalizate de catre glucocorticoizi
sau de o cross-linkare a receptorului pentru antigen, in acest caz, ambii
stimuli fiind considerati fiziologici. Dar, timocitele vor suferi un proces
apoptotic identic dupa expunerea la o doza mica de radiatii ionizante sau
la o otrava. Deoarece nici unul dintre acesti agenti nu este fiziologic, in
acest caz moartea celulelor nu poate fi strict definita ca fiind
programata. Totusi definitia poate fi largita in sensul ca in anumite
celule, cand sunt deteriorate nespecific, se poate activa fiziologic o
“moarte programata”. Aceasta presupune ca deteriorarea sa nu fie foarte
severa pentru ca programul sa poata fi exprimat: daca timocitele sunt
mentinute la 43ºC vor muri prin necroza, dar daca se revine, suficient de
rapid, la o temperatura de 37ºC, vor muri prin apoptoza. S-a sugerat ca,
ar fi prea periculos pentru limfocite sa incerce repararea unor astfel de
tipuri de leziuni, atata vreme cat o reparare imperfecta ar putea duce la
instalarea autoimunitatii sau a leucemiei in astfel de cazuri celulele
activandu-si mecanismul apoptotic.

3. Fazele procesului apoptotic

Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin

intermediul ciclului celular este compus dintr-un sistem
multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3 optiuni
posibile (fig.2).
Celula poate fi:
1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare
si nici cel de apoptoza (celula aflata in faza G0);
2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare
(G0→G1→S→G2→mitoza)
3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe
calea programata (G0→D1→F→D2→fragmentare celulara
apoptotica), fie pe calea neprogramata (necroza) (figura 2).
Figura 2. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei
celule aflate in faza G0. D1 defineste perioada pe parcursul careia se
activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta pentru inducerea
fragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se
fragmenteaza in corpi apoptotici.

Celulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate

din orice faza a ciclului celular de proliferare (G 1, S sau G2). Semnalele
locale sau sistemice ale factorilor de crestere ce regleaza progresia in
interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular si sunt
independent determinate ca parte a fenotipului de diferentiere a celulei
in cauza. Astfel, acelasi factor de crestere (ex: factorul transformant de
crestere – β1) poate avea efecte agoniste sau antagoniste in cadrul
ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor al proliferarii
celulare in celulele mezemhimale sau inductor al arestului in G0 sau
progresia prin fazele apoptozei pentru celulele epiteliale).
Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:
- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal
devine ireversibil angajata pe calea mortii;
 - executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor
structurale;
- clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate
prin fagocitoza.
Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au
fost descrise pentru prima data de Kerr si colaboratorii (2), iar acum sunt
din ce in ce mai bine intelese din punct de vedere al mecanismului.

4. Morfologia apoptozei

Pe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si

biochimice coordonate in interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si
membranei plasmatice. Modificarile morfologice care se observa cel
mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului. Cromatina
condenseaza si formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare
relevand un model conformational semilunar. Caracterizarea
morfologica a cromatinei demonstreaza o degradare ordonata a ADN-
ului de catre o nucleaza endogena dependenta de cation (9), intai in
fragmente mari de 30-50 kilobaze (10) pana la fragmente nucleozomale
de 180-200 perechi de baze (11). Totusi, clivarea cromatinei la
fragmente nucleozomale nu are loc in toate tipurile celulare si poate fi
inhibata fara a bloca celelalte modificari ale apoptozei (12,13). Odata cu
condensarea cromatinei este alterata ultrastructura nucleara. Lamina
nucleara si reteaua de filamente intermediare care mentine integritatea
anvelopei nucleare si distributia porilor nucleari sunt clivate proteolitic
(14-16). Astfel, distrugerea structurii retelei nucleare ar putea permite
alaturarea porilor nucleari (17) si faramitarea nucleului in fragmente ce
contin cromatina, care, majoritatea mentin vestigii ale membranei
nucleare. Celelalte organite citoplasmatice raman intacte din punct de
vedere structural cu toate ca difunctiile mitocondriale sunt asociate cu
apoptoza (18) (figura 3).
Modificarile nucleare sunt precedate de reducerea potentialului
transmembranar mitocondrial, necuplarea transportului de electroni de
la sinteza ATP-ului si cresterea generarii de specii reactive de oxigen. In
citoplasma apare cross-linkarea de proteine prin actiunea
transglutaminazelor (19), filamentele citoscheletale se agrega in
formatiuni paralele si reticulul endoplasmic se dilata si fuzioneaza cu
membrana plasmatica creand cratere in forma de sac la nivelul fuziunii.
Se poate specula faptul ca celula sufera o alterare profunda a
citoscheletului. Cu toate ca, pana in momentul de fata, aceasta problema
nu a fost studiata in detaliu, exista exemple in care distrugerea
citoscheletului duce la angajarea celulei pe calea apoptotica, in timp ce,
stabilizarea citoscheletului inhiba apoptoza. In apoptoza, membrana
celulara se umfla si se cuteaza intr-o masura mult mai mare decat in
necroza, fenomenul a fost numit zeioza. Integritatea structurala a
membranei este ulterior compromisa prin pierderea asimetriei
fosfolipidice, a microvililor si a jonctiunilor intercelulare. Celula se
sfericizeaza, se indeparteaza de vecinii sai si se contracta dramatic si
expulzeaza protuberante care se separa in “corpi apoptotici” inveliti in
membrana. In interiorul tesuturilor, celulele apoptotice si corpii
apoptotici sunt recunoscuti si fagocitati rapid de catre celulele vecine
sau macrofage.
 Figura 3. Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt
observate mai bine in culturi izolate atata vreme cat in vivo ar interveni
fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma dispersata si cromatina
nucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b) Celula
a pierdut o parte din volum si organitele citoplasmatice sunt strans
impachetate, se observa ingramadiri ale cromatinei. In acest stadiu sunt
prezente modificarile membranare care duc la fagocitoza. (c) Celula
etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea ei in forma de
semiluna de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de
70 fL. (e) Nucleul are acum aspectul unei gauri negre. (f) Nucleul se
fragmenteaza in sfere, iar membrana se cuteaza vormand vezicule. (g)
Fragmentele celulare continute in corpii apoptotici care, pentru o vreme,
continua sa excluda colorantul vital.

Recunoasterea celulelor apoptotice de catre fagocite poate implica

interactii ale lectinelor macrofagelor endogene cu resturi zaharidice N-
acetil specifice exprimate pe suprafata celulelor apoptotice, interactiile
specific mediate de receptori cu fosfatidilserina din stratul exterior al
membranei plasmatice si interactiile trombospondina/receptori de
suprafata celulara, ce contin resturi incomplet caracterizate, de pe
suprafata celulelor apoptotice (20). Exista evidente ce sugereaza ca
mecanismul de recunoastere poate fi diferit in functie de populatia de
fagocite. Semnificativ pentru strategia centrala a acestui tip de moarte
celulara este clerance-ul rapid si eficient al resturilor apoptotice de catre
fagocitele vecine, amatoare sau profesioniste, deoarece previne
raspunsul inflamator care, altminteri, ar urma calea distrugerii celulare si
deversarea proteinelor intracelulare si a acizilor nucleici in spatiul
extracelular.
Odata ce faza de executie a apoptozei este activata, intregul
proces demareaza rapid si este complet terminat in cateva ore (21).
Durata acestei faze este relativ invariabil in raport cu tipul celular si
stimulul apoptotic sugerand ca stadiul final al apoptozei trece printr-o
cale comuna. Totusi, stadiul de angajare, timpul de la receptarea
stimulului apoptotic pana la initierea fazei ireversibile de executie este
extrem de variabil si depinde de tipul celular, de stimulul apoptotic, de
situarea in cadrul ciclului celular si de expresia diversilor factori
modulatori ai mortii. Multi factori care influenteaza angajarea sau
susceptibilitatea celulara la apoptoza sunt implicati direct in receptia si
transmiterea semnalului apoptotic. Acesti factori reglatori sunt frecvent
selectati pentru a bloca procesul pe parcursul transformarii neoplazice
sau dezvoltarii rezistentei la medicamente si sunt subiectul modificarii
virale.
Perioada de fragmentare a ADN (figura 2, faza F) poate fi
utilizata pentru dividerea in serii temporale a evenimentelor implicate in
apoptoza mai mult decat perioada sintezei de ADN (figura 2, faza S) ce
este utilizata pentru impartirea ciclului celular proliferativ (22). Pe
parcursul fazei D1 apoptotice, celula sufera o reprogramare genetica,
proces pe parcursul caruia gene care erau normal exprimate acum sunt
supresate si invers (23-26). Aceste modificari epigenetice au ca rezultat
fragmentarea dublu catenara a ADN pe parcursul fazei F. Pe parcursul
acestei faze F morfologia nucleara se schimba (marginalizarea nucleara
a cromatinei urmata de condensarea nucleara si eventual de
fragmentarea nucleului insusi), cu toate ca membranele plasmatica si
lizozomala sunt inca intacte si mitocondria inca functionala. Pe
parcursul urmatoarei faze, portiunea D2, apare inmugurirea membranei
si eventual fragmentarea celulara in clustere de corpi apoptotici inveliti
in membrana.

5. Biochimia apoptozei

Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar

electrono-micrografiile evidentiaza o citoplasma extrem de condensata
cu organite ce par a fi normale. Cea mai plauzibila explicatie ar fi aceea
ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare imediata,
probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise
leziuni specifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate
intr-un mod adecvat. A fost observata umflarea cisternelor reticului
endoplasmic.
Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine
urmata de degradarea lor, dar sincronizarea acestor evenimente in raport
cu modificarile morfologice nu este inca bine caracterizata. Totusi,
initial s-a crezut ca tranzitia de la normal la contractarea apoptotica se
realizeaza atat de rapid incat nu poate fi observata o stare intermediara,
citometria in flux poate ajuta la caracterizarea modificarii si in
combinatie cu sortarea celulara poate inlesni o patrundere mai profunda
in ordinea evenimentelor.
 Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea
fiziologica de moarte celulara, poate fi de asemenea provocata de
stimuli patologici. In general, orice stimul ce produce necroza prin
distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celula
initial supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns
celular coordonat la stimuli vatamatori care nu sunt imediat letali. Nu se
poate vorbi de o serie invariabila de evenimente metabolice ce au loc in
cursul apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multe tipuri celulare
apare o crestere sustinuta a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul,
poate activa latent enzime care contribuie la modificarile structurale din
cursul apoptozei. Aceste enzime includ o endonucleaza nucleara calciu
dependenta care cliveaza invariabil ADN si o transglutaminaza care
crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu dependente
(calpaina) degradeaza citoscheletul (figura 4) (27-29).
In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de
ATP, reclama sinteza activa a ARN si proteina depinde de tipul celular
si stimulul apoptotic. In limfocitele mature, agentii care inhiba ARN-ul
sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei; din contra, in
neutrofilele imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusi
amplifica apoptoza. Una din explicatiile acestei contradictii este ca
majoritatea celulelor contin proteine reglatoare care pot inhiba sau
promova moartea celulara fiziologica. Intr-un tip particular celular,
comparand ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poate
determina daca sistarea sintezei de ARN si proteice previne sau induce
apoptoza.
 Figura 4. Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru β-

tubulina inainte de aparitia modificarilor morfologice si a clivajului
DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si in citoplasma cantitati crescute de β
-tubulina. Probabil ca, genele pentru β-tubulina sunt degradate impreuna
cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa (30).
Agentii care interfera cu polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B,
s-a aratat ca previn inmugurirea celulara ce duce la formarea corpilor
apoptotici fara a bloca fragmentarea nucleului sau clivajul DNA (31).

5.1. Activitatea endonucleazica, structura cromatinei si degradarea

ADN in apoptoza
 Nucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice
ce au loc in apoptoza. Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul
microscopiei electronice de transmisie (figura 5), dar au fost deja
vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor fluorescenti cum
sunt acridin oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificarilor difera de
la un tip celular la altul dar, in general, nucleul se contracta si cromatina
devine foarte densa, se fragmenteaza si, in final se leaga strans de
anvelopa nucleara.
Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea
ADN in subunitati regulate ce formeaza o “scara” ca rezultat al ruperii
dublu catenare, aparent randomice la nivelul regiunilor linker dintre
miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste un milion de astfel
de rupturi ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are
loc sistarea transcriptiei (32).
In ultimii ani a existat o controversa cu privire la
dimensiunile fragmentelor de ADN, produse pe parcursul apoptozei,
responsabile de angajamentul ireversibil pe calea mortii celulare.
Figura 5. Modificarile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei.
Imaginea superioara reprezinta o celula normala. Imaginea inferioara
reprezinta o celula in cursul procesului de apoptoza; sagetile indica
fragmente de cromatina condensata.

Exista o serie de rapoarte ce precizeaza ca atunci cand celula intra

in apoptoza ADN-ul genomic este degradat in fragmente mici
nucleozomale (repetari de cate 200 pb). Totusi au existat rapoarte ce
sustineau ca celulele pot intra in apoptoza pe criterii morfologice fara
producerea “scarii” de ADN nucleozomal (33-36, 37).
O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de
fragmentarea letala a ADN in apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza
I care, pentru activare, depind de calciu (Ca2+) (11, 38). De asemenea,
intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza sub diferite
forme, s-a demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de
calciu intracelular (Cai) (39-43) care s-a sugerat ca ar fi necesari pentru
activarea endonucleazelor de aproximativ 23 kD (44, 45). Celulele
raspund la o crestere a Cai prin pomparea calciului in interiorul unei
organite intracelulare sau in afara celulei prin membrana citoplasmatica.
Astfel de transport de Ca2+ este catalizat de schimbul membranar de Na 2+
- Ca2+ si de proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze Ca2+cere un
proton pentru transportul vectorial al Ca2+ in afara celulei un astfel de
transport ar putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sau
transportat in afara celulei (46).
In modelul propus de Filipski in 1990 (figura 6) este privit ca
fiind ordonat in bucle de cromatina bine stabilizate de cate 50 Kb, aceste
bucle sunt infasurate in structuri hexamerice numite rozete si continand
aproximativ 300 Kb de ADN. Rozetele formeaza subunitatea de baza a
cromatidei rasucite.
Au fost studiate activitatile endonucleolitice asociate cu
fragmentarea ADN cu masa moleculara mare cu ajutorul tehnicii PFGE
(pulsed field gradient gel electrophoresis). S-a observat, in toate tipurile
de celule studiate, o activitate dependenta de Mg 2+ capabila de
producerea fragmentelor de la 50 Kb la 300 Kb, iar ionii de Ca au fost
necesari pentru fragmentarea ulterioara la oligonucleozomi (47-49).
Aceaste experimente au sugerat ca ar putea fi necesare doua enzime
separate pentru fragmentarea completa a ADN pe parcursul apoptozei.
Totusi, utilizand chelatori ai Ca2+ intracelular (50) s-a observat ca pentru
degradarea ADN de masa moleculara mare sunt de asemenea necesare
cantitati nanomolare de calciu, complicand astfel explicatia fenomenului
de clivare. De asemenea s-a observat ca fragmentarea internucleozomala
de ADN poate fi blocata de catre zinc, cunoscut inhibitor al
endonucleazelor Ca2+ si Mg2+ dependente (51, 52).
In continuare s-a demonstrat faptul ca fragmentarea
internucleozomala a ADN in apoptoza nu este randomica (53).
Fragmentarea apare preferential in elementele repetate ale ADN care au
un rol in organizarea structurala a cromatinei.

Figura 6. Modelul Filipski et al. (1990) ce prezinta structura cromatinei.

Sagetile corespund situsurilor de clivare ale cromatinei.
De asemenea, se pare ca nucleozomii sunt eliberati de preferinta
din regiunea domeniilor “rozeta” si/sau “bucla” ce contin elemente
repetitive ale ADN pe parcursul fazei secundare de degradare. S-a aratat
ca sensibilitatea generala a cromatinei la nucleaze nu este alterata pe
parcursul apoptozei (54). Aceasta indica faptul ca in conditiile unui
nivel ridicat de Ca2+ fragmentarea de ADN are loc in interiorul
“buclelor” de ADN la un numar strict de loci si nu e dependent de
gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determina accesibilitatea
generala a regiunilor linker (55). Luand in considerare toate aceste date
se poate spune ca fragmentarea endogena a ADN pe parcursul apoptozei
se produce in 3 etape (fig. 6). Prima etapa incepe cu activarea unei
endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni de atasare a
matricei si citoscheletului) bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii
mari ale cromozomului la matricea nucleara. Concentratia nucleara
endogena de Mg2+ este suficienta pentru activitatea ei. Nu este nici o
cerinta de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar. S-au evidentiat
astfel o serie de fragmente monocatenare de ADN pe parcursul
procesului de apoptoza. A doua etapa implica propagarea acestei
degradari la alte clase de SAR. Aceasta propagare are o dependenta de
Ca2+ sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-G si toata
cromatina este redusa la fragmente de ~ 300 kb. In etapa a treia se
cliveaza ADN internucleozomal la regiunile linker din interiorul
“buclelor” si genereaza “scara” ADN. Aceasta clivare este relativ
independenta de secventa (in termeni legati de situsurile ce leaga
nucleaza) dar necesita Ca2+ pentru cinetica. De asemenea, aceasta etapa
necesita proteoliza (56). Factorii aditionali implicati in aceasta etapa ar
putea realiza extensia finala a fragmentarii ADN ce difera mult de la un
tip celular la altul. Toate aceste etape de degradare sunt catalizate de o
enzima sau doua pool-uri de enzime cu proprietati DNaza-I like.
ADN-ul mitocondrial nu sufera fragmentare (57). Se presupune
ca aceasta clivare a ADN-ului nuclear, intr-o etapa timpurie a
procesului, poate avea un rol protector prin evitarea transferului de
material genetic potential activ celulelor vecine dupa fagocitarea
corpilor apoptotici (58). Exista si tipuri celulare in care apoptoza tipica,
care include modificarile nucleare, este observata microscopic ca fiind
lipsita de clivajul nucleozomilor ADN. Totusi, in putinele sisteme in
care a fost studiata, au fost observate anumite forme de deteriorare a
ADN (ruptura monocatenara extinsa, rare fragmentari dublu-catenare),
necesare modificarilor morfologice profunde. Nu exista un consens
privind rolul pe care il joaca fragmentarea ADN ce are loc inaintea
mortii celulare. Desi transcriptia este oprita, ea insasi nu este atat de
rapid letala precum este apoptoza, ceea ce inseamna ca sunt implicate si
alte procese. S-a constatat faptul ca acidul aurin tricarboxilic, care
inhiba nucleaza, este un ihibitor al tuturor aspectelor legate de apoptoza;
dar este incorect sa concluzionam ca, prin urmare, distrugera ADN este
pasul critic in procesul apoptozei, atata vreme cat aurinul inhiba multe
alte reactii metabolice celulare.

5.2. Modificarile membranei plasmatice

Fagocitarea rapida a corpilor apoptotici de catre celulele

adiacente, cat timp membranele lor celulare sunt intacte (pentru
prevenirea inflamatiei si lezarii tesuturilor in care se formeaza, in special
cand procesul apare in conditii fiziologice) implica operarea unui
mecanism de recunoastere foarte specific si exista dovezi care sustin
existenta mai multor astfel de mecanisme (59).
In mod normal, fosfolipidele membranei plasmatice sunt
distribuite asimetric. Lipidele ce contin colina, cum ar fi fosfatidilcolina
(FC) si sfingomielina sunt concentrate pe fata externa a membranei
plasmatice in timp ce aminofosfolipidele cum sunt fosfatidiletanolamina
(FEA) si fosfatidilserina (FS) abunda pe fata interna a membranei
plasmatice. Dintre toate fosfatidilserina (FS) este restrictata in
majoritatea celulelor exclusiv la fata interna a membranei (60).
Pierderea asimetriei fosfolipidice si expunerea FS a fost prima oara
demonstrata pentru limfocite (61) dar aceasta descoperire a fost
confirmata intr-o serie de tipuri celulare (62).
Externalizarea FS este rapida sugerand mai degraba un transport
facilitat decat o difuzie pasiva a lipidelor prin bistrat. Aceasta activitate
se presupune ca este mediata de o proteina enzimatica activata de calciu,
ATP independenta si nespecifica din punct de vedere al fosfolipidelor
transportate (63).
Din punct de vedere biologic, expunerea FS la suprafata e
considerata a fi un ligand pentru inlaturarea rapida a celulelor ce-l
exprima. O alta consecinta biologica este legata de faptul ca FS serveste
drept cofactor pentru cascada de coagulare (64) domeniu in care datele
incep sa se contureze sugerand ca FS poate avea o serie de efecte anti-
inflamatoare sau imunosupresive.

6. Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice

Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice

este reprezentat de recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite.
Celulele apoptotice sunt indepartate inaintea lizei lor, acest eveniment
sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafata ce
semnalizeaza fagocitelor legarea si inglobarea lor. Aceste fagocite pot fi
profesioniste (macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale si
celule musculare netede din peretii vaselor de sange). Pana acum au fost
descrisi mai multi receptori pe macrofage si alte celule ce leaga celulele
apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia sunt reprezentati de
receptori lectin-like (65), receptorul pentru vitronectine αvβ3 (66),
CD36, receptorul de recunoastere al fosfatidilserinei (67), inca
necaracterizat, CD14 (68) si receptori scavanger (69). De curand, s-a
demonstrat ca transportorul ABC1, de asemenea implicat in inglobarea
celulelor mamaliene apoptotice, mediaza transportul anionic fiind
omolog genei ced-7 asociata cu fagocitoza corpilor apoptotici in C.
elegans. Mecanismul prin care acesti receptori mediaza fagocitoza
celulelor apoptotice nu este cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu
sunt inca bine caracterizati. Cu toate acestea comun multor celule
ramane expunerea fosfatidilserinei pe fata externa a membranei
plasmatice, acest fosfolipid parand a fi recunoscut intr-o maniera
stereospecifica de catre subseturi de macrofage, de catre celule
melanoma, de celule musculare netede din peretii vaselor de sange si de
celule Sertoli. In mod normal, fosfolipidele de membrana sunt
distribuite asimetric.
Macrofagele sunt “fagocite profesioniste” ce indeparteaza celulele
si corpii apoptotici, dar la acest proces pot participa si alte tipuri
celulare, ca de exemplu celule epiteliale si tumorale ce pot ingloba
celule apoptotice vecine. In timpul inglobarii celulelor apoptotice,
macrofagele nu elibereaza agenti de tipul eicosanoizilor si citokinelor
(70). Lipsa acestui raspuns pare a fi determinata de mecanismul prin
care celulele apoptotice sunt ingerate, dat fiind ca celulele apoptotice,
opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc ai macrofagelor,
induc, de exemplu, eliberarea de tromboxan. Totusi, daca celulele
apoptotice nu sunt preluate de catre macrofage, ele se umfla si se
dezintegreaza eliberandu-si continutul. Daca ar avea loc un astfel de
eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurile
inflamate, eliberarea continutului granulelor citoplasmatice ar avea
consecinte nefaste. Mai mult decat atat, evadarea nedorita a materialului
nuclear din leucocitele moarte, poate fi de asemenea periculoasa,
nucleozomii eliberati din limfocitele apoptotice neingerate pot stimula
sinteza de ADN si imunoglobuline in limfocitele viabile (71). Prin
urmare, este posibil ca dezintegrarea limfocitelor apoptotice (presupus
neingerate) sa constituie o sursa de ADN nucleozomal circulant,
observat de altfel la anumiti pacientii cu lupus sistemic eritematos,
contribuind la stimularea policlonala a celulelor B tipica pentru aceasta
afectiune autoimuna si tintind autoanticorpi catre paturile vasculare,
cum ar fi glomerulii renali, in care componentele nucleozomale
circulante s-ar putea lega (72).
Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor
apoptotice de catre fagocite si de asemenea, mai multe statusuri tinta
etalate de celulele apoptotice.

Lectinele fagocitelor
Un mecanism obisnuit de interactie intercelulara il reprezinta
legarea carbohidratilor de la suprafata celulara a unei celule de lectinele
altei celule, mecanism ce poate fi inhibat specific de catre zaharuri
simple recunoscute de lectine.
Unele din consecintele apoptozei sunt reprezentate de
modificarile specifice ale carbohidratilor de pe suprafata membranei
celulare. Se presupune ca pierderea, printr-un mecanism inca
necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanturile laterale
glicoproteice ar putea sa expuna N-acetilglucozamina, N-
acetilgalactozamina si galactoza, mascate in conditii normale, restituind
aceste reziduuri accesibilitatii interactiunii cu presupusele lectine
macrofagice (73) (figura 7).
 Figura 7. Trei mecanisme prin intermediul carora fagocitele ar putea
recunoaste celulele ce intra in apoptoza.

Receptori trombospondinici ai fagocitelor

Macrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot
recunoaste neutrofile si limfocite umane apoptotice prin intermediul
receptorilor pentru vitronectina (VnR) αvβ3 si receptorii scavenger din
clasa B (CD36) (74). Acesti receptori se leaga de trombospondina ce
serveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice. Se pare ca
aceasta recunoastere este independenta de expunerea fosfatidilserinei le
suprafata membranei celulei apoptotice si pare a fi legata de fenotipul
macrofagului si nu de tipul celulei apoptotice.

Receptorii pentru fosfatidilserina

 Este clar ca macrofagele pot recunoaste fosfatidilserina intr-o
maniera dependenta de doza si de stereospecificitate, fapt ce sugereaza
existenta receptorului pentru FS. Au fost descrisi o serie de receptori cu
rol in medierea recunoasterii FS si anume CD68, CD14, anexinele,
receptorii scavenger, beta2 glicoproteina I si gas-6. Exista si date care
sugereaza recunosterea FS de pe celulele apoptotice de catre fagocite
“amatoare”. Nu se stie totusi daca acesti receptori sunt specifici pentru
FS. Cel mai probabil este ca mai multi receptori pot lega FS, dar ramane
inca sub semnul intrebarii daca ei pot recunoaste FS pe suprafata
celulara.

Foarte multi ani semnificatia fagocitarii celulelor intacte

“nedorite” a fost subestimata. Pana nu demult, inglobarea celulelor
apototice a fost considerata ca o inlaturare protectiva a celulelor nedorite
(75). Recent clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o noua
semnificatie. In functie de context, inlaturarea celulelor apoptotice de
catre fagocite poate supresa inflamatia, poate modula deletia
directionata a celulelor gazda sau a parazitilor invadanti de catre
macrofage si poate regla raspunsul imun (figura 8).
 Figura 8. Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

7. Genetica apoptozei

In pofida numeroaselor progrese ce s-au realizat in cercetarea

stiintifica este foarte dificila identificarea moleculelor responsabile de
apoptoza cu ajutorul demersurilor biochimice si moleculare in sistemele
mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditis elegans reprezinta
un model particular de studiu al reglarii genetice a apoptozei extrem de
util (76). Pe parcursul dezvoltarii embrionare si larvare a nematodului
sunt eliminate 131 din 1090 celule in cadrul unui program foarte bine
caracterizat, invariant din punct de vedere spatio-temporal. Astfel, s-a
identificat un numar mare de mutatii ce afecteaza stadii specifice ale
procesului apoptotic si genele corespunzatoare care au fost ordonate
intr-o schema genetica (figura 9). Aceste gene sunt implicate in decizia
de a intra pe calea mortii, in executia acestei cai, in inglobarea celulelor
muribunde si in degradarea resturilor celulare din cadrul inglobarii.
Doua dintre aceste gene, ced-3 si ced-4 sunt necesare pentru toate
formele de apoptoza din cadrul dezvoltarii si se considera a codifica
efectorii finali ai cai apoptotice. O alta gena reglatoare cheie, ced-9, este
necesara pentru supresia apoptozei in celulele programate sa
supravietuiasca (77). Aceasta gene codifica o proteina omologa cu
familia Bcl-2 din sistemul uman. Mai mult decat atat, expresia lui Bcl-2
poate inhiba apoptoza in nematode si poate chiar substitui partial
pierderea functiei lui Ced-9, ceea ce indica faptul ca cel putin cateva
componente ale caii apoptotice sunt conservate in evolutie. Mutatiile
survenite in 6 gene afecteaza inglobarea corpilor apoptotici de catre
celulele vecine non-profesionale. Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5
si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera comparabila cu omologii lor
mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac mediind reorganizarea si extensia
citoscheletului celulei inglobatoare. Ced-7, omoloaga cu ABC-1
activeaza atat in celula muribunda cat si in cea inglobatoare, posibil in
transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este analog receptorilor
scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza, probabil,
inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6
(78).
Figura 9. Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate
mutatiile din 14 gene diferite ce afecteaza apoptoza in diferitele ei etape.
Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii afecteaza doar un numar mic
de gene. Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune tuturor
celulelor somatice din organism angajate pe calea mortii. Activitatea lui
ced-3 si ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest
proces.

8. Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia cancerului

Implicatiile apoptozei in patologie

Dereglarea procesului apoptotic, ce are ca rezultat o moarte
celulara excesiva, insuficienta sau prematura, constituie fundamentul
initierii si progresiei multor maladii umane. Se presupune ca o
exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la
progresia si severitatea mai multor dereglari neurodegenerative ce
includ maladia Alzheimer, scleroza laterala amiotrofica, atrofia
musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile neuromotorii si chiar
atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este
corelata cu sindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce
manifestarea insuficienta a acestui proces constituie mecanismul de
declansare al anumitor boli autoimune si limfoproliferative. Inhibarea
procesului apoptotic prin pierderea mutatiilor functionale in genele
activatoare ale mortii sau castigarea unor mutatii functionale in genele
supresoare de moarte este incriminata in transformarea neoplazica.
Virusurile si-au dezvoltat mecanisme care manipuleaza calea apoptotica
pentru a-si asigura perpetuarea propriei supravietuiri, inhiband apoptoza
celulelor infectate pentru a permite replicarea virala si activand apoptoza
mecanismelor celulare de aparare ale gazdei. Tinand cont de aceste
realitati, manipularea cailor apoptotice prin interventie farmacologica
sau genetica promite noi oportunitati terapeutice pentru o serie de
maladii.
Circumstantele aparitiei apoptozei se impart in doua mari
categori. Apoptoza apare in tesuturile normale, unde raspunde de deletia
celulelor si este de asemenea observata in contexte patologice specifice.
Cel putin intr-o parte din situatiile din categoria a doua, poate fi sustinut
teoretic faptul ca vine in sprijinul unei semnificatii biologice.
Supravietuirea celulelor in curs de distrugere ar putea fi nociva gazdei.
In contrast, necroza este totdeauna patologica fiind consecinta lezarii
majore a celulei si nu ii poate fi atribuita nici o functie homeostatica (9).
Celulele raspund la leziune, daca pot, prin apoptoza. Daca un
medicament induce apoptoza intr-un limfocit, de obicei ne furnizeaza
mai multe date despre celula decat despre medicament, deci astfel de
experimente trebuie interpretate cu precautie. Implicatiile acestui proces
in terapie sunt evidente: un medicament care inhiba apoptoza poate fi
folosit in prevenirea pierderii celulei acordand timp altor forme de
terapie sa inlature infectia. In cancer, dimpotriva, va avea valoare
terapeutica o cale de stimulare a apoptozei in celulele maligne. Modul
de obtinere al acestui efect cu specificitate adecvata reprezinta o
provocare la fel ca in cazul agentilor chemoterapeutici uzuali. Desigur,
celulele T citotoxice, una din cele mai stralucite inventii ale naturii, stiu
cum sa ucida specific.
O alta potentiala terapie e reprezentata de anticorpii declansatori
ai apoptozei, dar foarte importante sunt si imunotoxinele ce ascund
liganzi ce induc apoptoza.
Concomitent cu explorarea potentialului terapeutic al apoptozei
este necesara descoperirea mecanismelor si moleculelor implicate.
 Evolutiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui
sistem desavarsit, capabil sa elimine celulele nedorite; noua ne revine
dificila sarcina de a descoperi cum sa inducem organismului comutarea
procesului pe “on” sau “off”, la comanda.
Legaturile intercelulare caracteristice formelor superioare de viata
nu ar fi posibile fara un mecanism de indepartare individuala a celulelor
care nu mai sunt necesare sau care nu mai functioneaza normal.
Reglarea defectiva a mortii celulare programate ar putea juca un rol in
etiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune si bolilor degenerative ale
sistemului nervos central. Manipularea farmacologica a apoptozei ofera
noi posibilitati de profilaxie si tratament acestor maladii.

Transformarea maligna
Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari
moleculare pentru a atinge fenotipul malign si datorita faptului ca aceste
schimbari sunt deseori induse de agenti sau tratamente care, in timp,
altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deteriorate sau
initiate promoveaza carcinogeneza.
In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de
celulele normale din punct de vedere morfologic. Variatiile legate de
marimea si forma celulelor si a nucleilor lor corespund pleomorfismului
celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale
(hiper- sau hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara,
nucleoli proeminenti, singulari sau multipli. Exista o crestere a
raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celule “bizare”, cu nuclei
polilobati sau multipli si celule gigantice. Aceste modificari reprezinta
semnele citologice ale malignitatii. Exista si exceptii, in anumite
varietati de cancer, celulele tumorale au un aspect morfologic foarte
apropiat de celulele normale; ca urmare diagnosticul de malignitate este
dificil de hotarat si in astfel de situati se apeleaza la alte criterii, in
particular arhitecturale.
Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de
celule in diviziune. Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau
multipolare. Indicele mitotic, definit prin numarul de mitoze pe unitatea
de camp microscopic, are o valoare data contribuind la evaluarea
prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice
mitotic ridicat, ca cel care se poate observa in patologia nontumorala.
Totusi, in anumite tipuri de cancer, diagnosticul de malignitate se
bazeaza pe indicele mitotic (79).

Apoptoza si cancerul
Oncologii au fost traditional preocupati in principal de
proliferarea celulara, cu toate acestea in ultimul timp atentia lor se
indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre studiul apoptozei (2,
11, 80).
Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta.
Cu peste 20 de ani in urma s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de
o mare parte din pierderile celulare ce apar in tumori, observatii obtinute
in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei si activarea in
tumori ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice:
iradierea, chemoterapia citotoxica, ablatie hormonala (81,82). Totusi, in
ultimii ani, extinderea cunostintelor despre controlul apoptozei la nivel
molecular a dus la largirea semnificatiei ei potential oncologice
depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletia
celulelor tumorale. In particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate
fi reglata de produsii unor anumite proto-oncogene si de gena supresor
tumoral p53, a deschis noi drumuri viitoarelor cercetari.
 Atunci cand modificarile de la nivelul ADN cauzeaza acumularea
anormala de celule se produce transformarea maligna. Ratele
comparative, ale mortii celulare si ale diviziunii celulare, determina
viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult
mai incet decat celulele normale, dar, cancerul continua sa se extinda
datorita prelungirii timpului de viata al celulei.
Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu
enzimele necesare pentru replicarea corecta a ADN. Celula poate
raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri: poate intarzia
diviziunea celulara pana la rerpararea leziunii, poate suferii apoptoza
sau poate progresa fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.
Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii
maligne deoarece ea indeparteaza celulele care poseda alterari genetice.
Apoptoza anormala poate promova dezvoltarea cancerului, atat prin
permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin blocarea
indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Inca nu se
cunosc factorii care determina celula sa urmeze una din cele trei cai:
intrarea in apoptoza dupa leziune, repararea deteriorarii sau continuarea
ciclului celular. Paradoxal, anumite gene care stimuleaza diviziunea
celulara, cum este c-myc, participa la deciderea caii de urmat (81).
Concentratiile de ARN si proteina pentru c-myc cresc timpuriu in
apoptoza si supraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza in
fibroblaste (82).
Oncogena bcl-2 ar putea fi “supresorul general al mortii celulare”
pentru genele care regleaza direct apoptoza (83). Toate celulele
hematopoetice si limfoide, multe celule epiteliale si neuronii contin gena
bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticul
endoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B poseda o concentratie
crescuta de proteina Bcl-2, datorita translocatiei [t(14:18)] care plaseaza
gena bcl-2 sub controlul unui promotor puternic, cel al genei ce codifica
pentru lantul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusului Epstein-Barr
cresc nivelul expresiei genei bcl-2 in celulele limfomului Burkitt (84).
Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprima bcl-2
supravietuiesc mai mult in cultura dupa privarea de factori de crestere si
sunt rezistente atat la radiatii ionizante cat si la glucocorticoizi. De
asemenea, concentratiile crescute de Bcl-2 protejeaza celulele de
apoptoza indusa de catre c-myc (85). Soarecii transgenici, care au fost
inginerizati pentru a supraproduce proteina Bcl-2, in limfocitele B,
deseori dezvolta limfoame imunoblastice cu celule mari si difuze. La
jumatate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarca
translocatia genei c-myc (86).
Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia
progresia ciclului celular inaintea initierii sintezei replicative de ADN.
Multe cancere umane poseda mutatii sau deletii la nivelul genei p53
(87). Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea lega
si inactiva proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova
dezvoltarea cancerului prin permiterea duplicarii DNA in celulele cu
mutatii secundare, inainte de o reparare completa. Totusi, p53 este doar
un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta ca o
“apoptogena” directa (o gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea
proteinei p53 normale, in linia celulara leucemica mieloida, induce rapid
moartea celulara prin apoptoza (88) (figura 10).
 Figura 10. Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.

In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin doi stimuli

externi, uneori numiti semnale de competenta si progresie. Semnalele de
competenta declanseaza evenimentele metabolice comune atat replicarii
cat si apoptozei; semnalul de progresie abate celula spre replicare,
altminteri survine apoptoza.
Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa care distruge
celulele incapabile sa strabata “punctul de vama” inainte de replicarea
ADN si se petrece in celulele competente activate, cand un semnal de
progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara o
leziune intr-o perioada critica.
 Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai
topoizomerazei, agenti alchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti,
produc apoptoza in celulele sensibile (89). In urma acestor observatii
este subanteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar de
interactia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor
metabolice conducand la apoptoza poate, de asemenea, influenta
raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca, in diferite cancere
umane, concentratia endonucleazelor calciu dependente, care
degradeaza ADN pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei
celule cancerigene de a suferi apoptoza poate fi importanta in special
pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta de crestere, care sunt
de obicei rezistente la agenti citostatici.

Aparitia spontana a apoptozei in tumori

Apoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi
s-au efectuat putine studii cantitative precise (90), evaluarile histologice
indica faptul ca extinderea apoptozei in anumite tumori umane se
apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapida
evidentiind semnificatia sa cinetica, uneori considerabila.
Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in
tumori sunt, indubitabil, diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta
mai ales la locusul de confluenta cu necroza, unde se presupune ca
ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta este o cauza
cunoscuta a activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice (91, 92).
S-a aratat ca, TNFα (factorul de necroza tumoral) induce apoptoza
in liniile de celule tumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene
apoptotice observate in vivo in tumori ar putea fi atribuite eliberarii
acestei citokine de catre macrofagele infiltrante. In alte cazuri, apoptoza
poate fi rezultatul atacului tumorii de catre limfocitele T citotoxice.
Totusi, un nivel ridicat al apoptozei este observat si in locusurile
preneoplazice si in nodulii ce se dezvolta in ficat dupa administrarea de
carcinogeni chimici (93), este improbabil ca factorii mentionati ar putea
fi operativi in aceste circumstante. Este posibil ca prezumtivele
mecanisme reglatoare ale populatiilor celulare, descrise mai sus,
actioneaza intr-o etapa timpurie a procesului de carcinogeneza, cu o
apoptoza crescuta ce echilibreaza temporar cresterea proliferarii
celulare. In sfarsit, nivelurile crescute de apoptoza in tumori pot fi
rezultatul unui proces intrinsec al acestor celule. Ratele de apoptoza
gasite in tumori similare difera fiind rezultatul expresiei diferitelor
oncogene.
LP – 2
IMUNOLOGIE TUMORALA
Dupa malignizare, membrana citoplasmatica este cea mai
modificata structura celulara. Semnalele reglatoare de control al cresterii
si multiplicarii, care actioneaza în primul rând prin intermediul
receptorilor membranari, nu-si mai gasesc tinta structurala.
Incapacitatea celulelor de a receptiona semnalele reglatoare ale
cresterii si diviziunii sau de a raspunde adecvat acestor semnale, este
cauza principala a comportamentului invaziv al celulelor maligne.
Pierderea inhibitiei de contact este reflectarea modificarilor suprafetei
celulare.
Adeseori, malignizarea este însotita de sinteza unor molecule noi,
localizate în oricare din compartimentele celulei si care se comporta ca
antigene tumorale.
Orice structura chimica a celulei maligne, absenta în sau pe
celulele normale ale tesutului de origine a tumorii, susceptibila de a
induce o reactie imunitara la gazda primara sau dupa injectare la o
noua gazda, poate fi considerata ca antigen tumoral.
ANTIGENE TUMORALE
Se disting urmatoarele categorii de antigene tumorale:
1. Antigenele tumorale de diferentiere, denumite si antigene
oncofetale, deoarece se gasesc atât pe suprafata celulelor unor tumori,
dar sunt prezente si în timpul unei faze de diferentiere embrionara. Ele
lipsesc pe suprafata celulelor organismului adult sau se gasesc în
cantitati foarte mici, nedectabile.
a) Antigenul carcinoembrionar (CEA) s-a izolat din sângele unui
pacient cu cancer de colon (1965). Este o glicoproteina de 180-200 kD,
localizata pe membrana celulelor normale ale tractului digestiv la fat,
dar se gaseste în cantitati foarte mici la subiectii normali adulti.
La fat, CEA este sintetizat în celulele mucoasei gastro-intestinale
si este concentrat în glicocalix, pe suprafata luminala a acestor celule. In
celulele embrionare normale, CEA pare a avea rol în aderenta celulara,
dar probabil favorizeaza metastazarea celor maligne.
CEA este un grup foarte heterogen de molecule, cu o cantitate
foarte variabila de glucide. Raportul proteine/glucide variaza între 1/1 si
1/5. Componenta glucidica este reprezentata, în primul rând, de acidul
sialic. Imunogenitatea moleculei este conferita de componenta proteica.
La adult, CEA se gaseste în cantitati mici pe mucoasa colonului, în
plamân, în tesutul mamar, dar reapare în cantitati mari pe celulele
maligne ale tractului digestiv uman (intestin subtire, pancreas, ficat,
stomac, colon, rect). CEA se gaseste nu numai asociat suprafetei
celulelor maligne, dar trece si în sângele a 60-80% dintre pacientii cu
cancer de colon. Nu se cunoaste mecanismul prin care CEA ajunge în
sânge.
Din sângele pacientilor neoplazici, CEA sintetizat de celulele
maligne, este epurat la nivelul ficatului. De aceea, cele mai mari
concentratii de CEA apar la neoplazicii cu insuficienta hepatica
(metastaze hepatice, ciroze).
CEA este un antigen nespecific, deoarece poate sa apara, în
concentratii mici (10 ng/ml), în sângele unor pacienti cu maladii
nemaligne: la cei cu ciroza alcoolica a ficatului sau cu insuficienta
renala, astfel ca speranta detectarii cancerului prin depistarea CEA în
sânge, s-a naruit.
Leziunile de orice natura ale mucoasei tractului gastrointestinal
sunt însotite de cresterea sintezei si secretiei CEA, care trece si în
sânge: în maladia inflamatorie a intestinului, în colita ulcerativa, polipi
ai tractului digestiv, tumori ale tractului gastrointestinal.
Unele tumori secreta CEA, mai ales dupa o metastazare hepatica
(adenocarcinomul colonului, tumorile de pancreas, ficat, plamân).
Nivelul CEA foarte crescut, reflecta o evolutie rapida a tumorii.
b) Alfafetoproteina (AFP) este o glicoproteina majora a fatului
timpuriu, o globulina normala (69 kD)a sângelui fetal uman si a
celorlalte mamifere, descoperita în 1956. Continutul glucidic este de
3,5%. Din punct de vedere structural, AFP este asemanatoare albuminei.
Genele codificatoare ale celor doua proteine au organizare similara.
AFP se detecteaza în plasma la embrionul de 4 saptamâni si creste rapid
în
primul trimestru de sarcina. Nivelul maxim (2-3 mg/ml) se gaseste la
fatul de 14 saptamâni si scade la valorile caracteristice adultului, la
vârsta de 6-10 luni. AFP se gaseste nu numai în plasma, ci si în fluidele
fetale: lichidul amniotic, lichidul cerebrospinal, urina. Cantitati mici de
AFP (500 ng/ml) strabat placenta si se gasesc în serul femeilor gravide.
În timpul vietii fetale, AFP se sintetizeaza în ficat, în celulele
gastrointestinale. La adultul normal, concentratia sa este nedetectabila
prin metodele imunochimice obisnuite, dar creste în neoplaziile de
carcinom hepatic. Circa 70% din cancerele hepatice primare sunt
însotite de cresterea nivelului seric al AFP. AFP creste si în alte
neoplazii: testiculare, ovariene. Nu toate hepatoamele si tumorile
testiculare produc AFP, dar cele care sintetizeaza aceasta glicoproteina,
o produc în cantitati foarte mari.
Cresterea concentratiei AFP în sânge nu este totdeauna asociata
cu malignitatea: AFP creste în starile patologice de hepatita virala,
hepatita cronica, ciroza, fapt ce reflecta regenerarea celulara.
AFP creste în maladiile inflamatorii ale intestinului: boala Crohn,
colita ulcerativa.
AFP este un marker util pentru depistarea cancerului hepatic la
populatiile cu risc înalt (chinezi, japonezi, eschimosi din Alaska), dar
este inutila pentru celelalte populatii, datorita cresterii nivelului sau în
afectiuni nemaligne.
În lichidul amniotic, nivelul crescut al AFP este asociat cu defecte
ale tubului neural (spina bifida).
2. Antigenele de transplantare a tumorilor (TATA = tumor
associated transplantation antigen).
a) Antigenele specifice de organ se exprima la un nivel înalt pe
celulele tumorale, în timp ce exprimarea lor pe celulele normale este
foarte scazuta sau este limitata la un anumit stadiu al dezvoltarii
tesutului.
Antigenul specific prostatei (PSA) este fosfataza acida prostatica,
o glicoproteina cu activitate proteolitica asupra gelului seminal, pe care-
l hidrolizeaza. PSA se gaseste în tesutul prostatic normal, în adenomul
benign si în carcinomul malign. Este produs de celulele acinare ale
prostatei. În ser, PSA este legat cu alfa1-antichimiotripsina, ceea ce
influenteaza valorile furnizate de determinarea sa cantitativa.
PSA creste mult în cancerul prostatic, cel mai comun cancer la
vârsta de peste 75 se ani, dar creste si în hipertrofia prostatica benigna.
Concentratia sa se coreleaza cu volumul prostatei, cu stadiul cancerului
prostatic, cu raspunsul la terapie.
Glicoproteinele mucinoase sunt antigene de suprafata celulara, cu
greutate moleculara mare.
Sunt formate dintr-o axa polipeptidica, de care se ataseaza
numeroase catene oligozaharidice. Glucidele reprezinta 60-80% din
greutatea lor moleculara. Sinteza glicoproteinelor mucinoase este
consecinta pierderii controlului metabolismului celulei neoplazice.
Uneori, celula maligna pierde capacitatea de sinteza a unor
glicoproteine de suprafata, ca de exemplu antigenul de grup sanguin A
si sintetizeaza molecule absente în celulele normale.
Glicoproteinele mucinoase se exprima pe suprafata celulelor
epiteliale si se detecteaza în ser, saliva, ori sunt adsorbite pe eritrocite.
Ele s-au identificat odata cu disponibilitatea anticorpilor monoclonali:
CA 15-3, CA 125, asociate cu cancerele ovariene, CA 19-9, identificat
într-o tumora colorectala (CA = cancer associated). Modificarea
cantitativa a glucidelor membranare poate modifica dramatic
malignitatea, influentând potentialul de metastazare.
Markerii tumorali imunoglobulinici se identifica prin electroforeza
serului sau a urinii. Apartin izotipurilor IgG, A, M, E sau sunt catene k
sau gama-delta libere. Aproximativ, 1% din adulti au proteine serice M
(monoclonale), iar din acestea 25% au semnificatie nedeterminata. 50%
din totalul proteinelor serice M sunt datorate mielomului multiplu.
Determinarea proteinelor M în sânge sau urina este utila pentru
monitorizarea raspunsului la terapie.
b) Antigenele specifice fiecarei tumori sunt antigene individuale
(TSTA = tumor specific transplantation antigen), proprii fiecarei tumori.
Sunt exprimate numai în celulele tumorale si nu sunt niciodata
detectabile în tesuturile normale. Sunt caracteristice tumorilor induse
chimic (L. Gross, 1953). Chiar tumorile multiple induse de acelasi agent
chimic (metilcolantren), în acelasi tesut (tegument) al unui organism,
sunt diferite în ceea ce priveste specificitatea antigenelor de
transplantare. Aceasta semnifica faptul ca informatia genetica
declansatoare a malignizarii, rezida în gene diferite, care sufera mutatie
sub actiunea agentului chimic.
Fig. 1. Tumorile tegumentare induse de un agent chimic (de exemplu,
metilcolantrenul) poseda antigene tumorale strict individuale.
Toate celulele unei tumori induse de metilcolantren sunt identice
din punct de vedere antigenic, fapt demonstrat experimental: soarecele
imunizat cu mojarat de celule tumorale, respinge ulterior o grefa de
celule vii ale aceleiasi tumori.
Datorita unicitatii lor antigenice, fiecare tumora indusa chimic,
stimuleaza imunitatea fata de antigenele proprii, iar reactiile încrucisate
sunt absente totdeauna.
Antigenele tumorale specifice de transplantare sunt complexe
glicoproteice sintetizate în celula si inserate în membrana
citoplasmatica.
Celulele maligne pot sa prezinte simultan, atât antigene tumorale
comune, cât si antigene specifice.
Tumorile care apar în mod natural sunt slab sau deloc antigenice.
Nu se stie daca antigenele tumorale sunt prezente de la început
pe toate celulele tumorale sau daca celula devine maligna, fara sa
dobândeasca markerii distinctivi de malignitate. Antigenele tumorilor
induse de agenti chimici pot fi stabile si se transmit de la o generatie
celulara la alta, dar majoritatea tumorilor induse de agenti chimici,
trebuie considerate heterogene din punct de vedere antigenic, datorita
instabilitatii genetice.
Antigenele suprafetei celulelor maligne sunt supuse modificarilor
cantitative si calitative.
La om, 90% din tumori sunt induse de agenti chimici.
3. Antigenele de origine virala sunt comune si se gasesc la toate
tumorile induse de acelasi virus, chiar la specii diferite.
Antigenele tumorilor induse de oncodnavirusuri sunt codificate de
programul timpuriu al informatiei genetice virale. De exemplu,
virusurile polioma si SV40 induc tumori la animalele de experienta, iar
virusul papiloma este implicat în geneza tumorilor de cervix uterin
uman.
Virusurile oncogene ADN induc sinteza antigenelor tumorale cu
localizare nucleara si membranara. Sunt proteine nestructurale, care se
disting de antigenele capsidei virale. In celulele transformate cu
oncodnavirusuri, nu se detecteaza antigene capsidale, deoarece
programul tardiv al genomului viral nu este transcris si virusul progen
nu este asamblat.
SV40 codifica sinteza a doua proteine virale (antigene tumorale),
de 94 si respectiv 17 kD, iar virusul polioma codifica sinteza a trei
antigene, de 100, 55 si respectiv de 22 kD. Antigenul T de 100 kD are o
localizare aproape exclusiv nucleara si se sintetizeaza atât în celulele
infectate productiv, cât si în cele transformate. Antigenul de 55 kD este
o proteina fosforilata ce se asociaza cu oncoproteina Src, o chinaza
tirozin-specifica, codificata de protooncogena c-src. Interactiunea cu
antigenul viral produce o stimulare de circa 50 de ori a activitatii
chinazice a oncoproteinei celulare Src.
Antigenele T sunt comune si pentru alte virusuri ale grupului.
Toate tumorile induse de un virus, au antigene comune, chiar la specii
diferite. Imunizarea organismului receptor de grefa de tesut tumoral cu
celule tumorale iradiate sau cu mojarat de celule tumorale de acelasi tip
este protectoare fata de dezvoltarea tumorii transplantate.
Antigenele T, codificate de oncodnavirusuri nu se gasesc în
structura virionului (proteine nestructurale). De aceea, virionii inactivati
nu imunizeaza si nu protejeaza organismul fata de suspensia de celule
tumorale omologe (transformate de acelasi virus).
Antigenele tumorale codificate de oncornavirusuri sunt comune
pentru toate tumorile induse de un virus, indiferent de specificitatea
antigenica a celulei. Majoritatea sunt antigene proteice virale
structurale, adica se regasesc în structura virionului, ceea ce le
deosebeste net de antigenele codificate de oncodnavirusuri.
Antigenele tumorilor induse de oncornavirusuri sunt codificate de
gena env si au specificitate de grup. Multiplicarea oncornavirusurilor nu
interfera cu capacitatea celulelor de a creste si de a se divide. Deoarece
antigenele tumorale sunt proteine structurale ale virionilor, imunizarea
organismului cu o suspensie virala inactivata, confera protectie fata de
celulele transformate de virusul omolog.
Spre deosebire de antigenele induse chimic, care pot fi tari sau
slabe, antigenele codificate de virusurile oncogene sunt foarte
imunogene.
La om, circa 10% din totalul tumorilor sunt cauzate de virusuri:
carcinomul hepatocelular (indus de virusul hepatitei B)
cancerul de col uterin (indus de papilomavirusuri – HPV 16,
HPV18)
limfomul Burkitt si carcinomul nazofaringian (induse de virusul
Epstein-Barr)
leucemia celulelor T mature (indusa de HTLV-1).
4. Antigenele tumorale codificate de protooncogene . Mutatiile
punctiforme ale oncogenelor – genele ce regleaza cresterea normala si
diferentierea - si mutatiile genelor supresoare ale oncogenelor, ca de
exemplu, p53 si Rb, produc substitutii ale unui singur aminoacid în
catena polipeptidica codificata, care le transforma în antigene tumorale,
codificate de genom. Ele au localizare nucleara, citoplasmatica sau
membranara. S-au descris peste 10 antioncogene (supresoare ale
oncogenelor) si circa 100 de oncogene (de exemplu, genele ras), ale
caror mutatii punctiforme determina sinteza unor molecule cu substitutii
punctiforme de aminoacizi, unice sau multiple si care se deosebesc de
moleculele normale. Antioncogena p53 codifica o proteina nucleara,
reglatoare a diviziunii celulare. In celulele maligne, p53 se sintetizeaza
în exces.
Dupa localizare, antigenele tumorale sunt:
antigene expuse la suprafata celulei. Sunt cele mai importante,
deoarece sunt accesibile efectorilor raspunsului imun (TSTA, TATA);
antigene intracelulare, localizate în nucleu sau în citoplasma.
Ambele categorii de antigene, se pot elibera fie din celulele vii, fie
dupa necroza si se gasesc în circulatie, la distanta de tumora.
Eliberarea lor poate stimula raspunsul imun sau are un efect de blocare
a reactivitatii imunitare, prin fenomenul de inundare antigenica.
Anticorpii antitumorali se obtin prin injectarea celulelor tumorale
viabile, ori a mojaratului tumoral, la organismele altei linii genetice sau
altei specii, care poarta alte molecule CMH. Celulele vor fi respinse ca o
grefa alogenica. Antiserul contine anticorpi anti-antigene tumorale, dar
si anticorpi anti-antigene CMH. De aceea, serul imun trebuie absorbit cu
antigene tisulare normale. Astfel s-a evidentiat CEA la pacientii cu
tumori de colon si AFP la cei cu hepatoame. Antigenul evidentiat de
anticorpi în serul absorbit poate fi un antigen tumoral sau un antigen
normal, exprimat abundent pe celulele tumorale.

Fig. 2. Modificari ale suprafetei celulei, asociate cu transformarea

maligna (dupa Roitt, 1997).
Procesul dezvoltarii tumorii are loc în câteva trepte :
transformarea celulei normale în celula maligna
cresterea exponentiala a celulei maligne si constituirea tumorii
primare
angiogeneza
invazia tesutului înconjurator
intravazarea si eliberarea celulelor tumorale individuale, în
vasele sanguine si limfatice, unde trebuie sa supravietuiasca
oprirea celulelor tumorale în diferite localizari (ficat, plamân etc.)
extravazarea celulelor tumorale si invazia acestor tesuturi
cresterea tumorii la noile situsuri de metastazare si angiogeneza.
Fiecare etapa a dezvoltarii tumorii este influentata de factori
imunologici si neimunologici. De exemplu, integrinele conditioneaza
interactiunile dintre celule. Cu cât aderenta celulelor maligne este mai
bine exprimata, cu atât tendinta ei de metastazare este mai limitata.
Celulele maligne elibereaza unele componente membranare, ca de
exemplu, fibronectina. Pierderea fibronectinei pare sa determine
scaderea aderentei majoritatii tipurilor de celule maligne si precede
metastazarea. Componentele glicocalixului sunt eliberate sub actiunea
proteazelor, pe care le secreta celulele tumorale. Proteazele (din
categoria metaloproteazelor) modifica consistenta substantei
fundamentale a tesutului conjunctiv, degradeaza colagenul si
proteoglicanii, usurând metastazarea si invazia.
RASPUNSUL IMUN ANTITUMORAL
Cresterea anormala este prevenita prin diferite mecanisme de
control: mecanisme de reparare a ADN, actiunea genelor supresoare
ale oncogenelor (antioncogene) sau prin apoptoza celulelor care au
suferit leziuni ireversibile. Daca aceste mecanisme nu mai sunt
operative, celula continua sa prolifereze. Celula maligna se afla într-o
interactiune dinamica cu micromediul, ce determina supravietuirea sau
moartea ei.
Imunogenitatea tumorilor pentru gazda si stimularea timpurie a
raspunsului imun antitumoral a condus la formularea conceptului
imunosupravegherii, în acord cu care, organismele elimina celulele
potential canceroase care apar în cursul vietii individuale. Conform
acestui concept, cancerul clinic este consecinta scaparii celulelor
maligne, de actiunea mecanismelor protectoare. De aceea, factorii care
interfera cu reactivitatea imunitara, predispun la malignitate. In
conceptia actuala, malignizarea este rezultatul activarii oncogenelor sau
pierderii functiei genelor supresoare ale oncogenelor (antioncogene).
Teoria supravegherii imune afirma ca sistemul imunitar,
monitorizeaza constant organismul, pentru aparitia celulelor tumorale si
ca majoritatea acestor celule aberante suntdetectate si lizate de
sistemul imunitar, înainte de a produce tumori clinice. Asa se întâmpla
cu celulele tumorale intens imunogene. Majoritatea (sau toate) celulele
tumorale care apar spontan, sunt imunogene si raspunsul imun inhiba
cresterea tumorii.
Argumentele în favoarea sau contra acestei teorii sunt greu de
obtinut. Ele sunt extrapolate din observatii asupra tumorilor clinice.
Disparitia spontana a tumorilor si recuperarea completa a
pacientilor cu cancer diseminat, este rara, dar exista si este explicata
prin insuficienta vascularizatiei, prin procese de diferentiere a celulelor
tumorale, prin mecanisme psihosomatice. O explicatie imunologica, este
ca raportul dintre cresterea tumorii si raspunsul imun antitumoral este în
favoarea raspunsului imun. Exista dovezi care sugereaza ca organismul
uman raspunde la prezenta tumorilor, prin mecanisme imunitare:
regresia spontana, în special a meloanoamelor maligne, a
carcinoamelor renale, a neuroblastomului si retinoblastomului,
semnalata în peste 100 de cazuri publicate;
unele tumori evolueaza latent, o lunga perioada, adica cresc
foarte încet sau sunt complet inactive si apoi brusc metastazeaza.
Latenta se poate explica prin echilibrul dintre tumora si sistemul
imunitar;
frecvent tumorile sunt infiltrate cu celule mononucleare: limfocite,
monocite, putine plasmocite. Celulele T si macrofagele sunt prezente
abundent în tumorile umane, sugerând un raspuns imun antitumoral.
Celulele T activate fata de tumora autologa, s-au izolat din câteva tipuri
de tumori(melanom malign, carcinom renal, cervical). Ele recunosc
peptide asociate cu moleculele CMH I, care sunt represate în celulele
normale sau peptide derivate din proteinele mutante;
carcinoamele asociate cu reactie inflamatorie evolueaza mai lent
decât cele care nu manifesta un raspuns inflamator;
tumorile sunt mai frecvente la organismele foarte tinere (datorita
imaturitatii sistemului imunitar) si la cele vârstnice (datorita senescentei
sistemului imunitar);
anumite categorii de tumori (cancerele de piele cu papiloma
virus, limfoamele pozitive pentru antigenele EBV) au o incidenta
crescuta la pacientii cu transplant, supusi imunosupresiei.
Imunosupresia prelungita (20 de ani), este asociata cu cresterea
incidentei tumorilor de origine virala, în timp ce incidenta celorlalte
categorii de tumori, creste foarte putin. Dovezile clinice sugereaza ca
raspunsul imun este orientat predominant fata de infectia cu virusuri
oncogene si neoncogene, iar rata aparitiei altor tumori este relativ
nemodificata. Aceasta arata, indirect, ca supravegherea antitumorala
este relativ ineficienta. Datele experimentale sprijina ideia ca
supravegherea imuna este orientata, în primul rând, fata de virusuri
oncogene ADN si nu fata de oncorna- sau fata de tumorile induse de
agentii chimici carcinogeni.;
celulele metastatice sunt comune la pacientii cu cancer, dar
frecventa implantarii lor si cresterea tumorilor secundare este mica.
Efectorii raspunsului imun antitumoral
Daca sunt prezente, multe antigene tumorale stimuleaza
raspunsul imun la animalele de experienta si pot induce o stare de
rezistenta antitumorala fata de celulele transplantate. Raspunsul imun
antitumoral are o eficienta foarte variabila, în functie de natura
antigenelor. Astfel, antigenele induse de virusurile oncogene sau ale
tumorilor induse de radiatiile UV, sunt foarte imunogene si stimuleaza
raspunsul imun protector, iar antigenele de transplantare ale tumorilor
induse chimic sunt slabe. Tumorile care apar spontan la animale si la
om sunt putin antigenice si induc un raspuns imun de mica intensitate.
Antigenele asociate celulelor tumorale sunt recunoscute ca
nonself, de sistemul imunitar al gazdei, dar tumorile secreta antigene
solubile, care tind sa produca fenomenul de inundare antigenica si
paralizie imunitara.
Raspunsul imun antitumoral este humoral si celular. Anticorpii
specifici, de cele mai multe ori, nu au eficienta antitumorala. Cel mai
adesea, celulele tumorale supravietuiesc actiunii factorilor humorali si se
multiplica. Ineficienta actiunii lor s-a demonstrat în experiente cu celule
maligne închise în camere poroase, permeabile numai pentru molecule,
amplasate în cavitatea abdominala a unor organisme imunizate cu
mojarat de tesut tumoral. Anticorpii sunt efectori eficienti fata de
celulele
maligne de origine limfoida (leucemii, limfoame). Dupa activarea
complementului, se produce liza celulei tinta.
Efectorii imunitatii antitumorale sunt celulele. Rolul lor s-a
demonstrat cu acelasi gen de experimente, cu celule maligne plasate în
camere poroase, care permit trecerea celulelor efectoare ale
raspunsului imun. Rezultatul actiunii celulelor imunitare este liza celulei
tinta.
Fig. 3. Antigenul tumoral poate fi prezentat celulelor T, pe diferite cai:
direct, în absenta co-stimulilor necesari, rezultatul fiind anergia; direct
de celula tumorala care exprima molecule co-stimulatoare, rezultând
activarea celulelor Tc; direct de celulele tumorale si indirect via CPA,
producând activarea limfocitelor Tc si Th (dupa Roitt, 1997).
Imunitatea celulara antitumorala este mediata de celule capabile
sa lizeze celulele tinta, prin interactiune specifica sau de celule care nu
necesita procese de recunoastere specifica.
Rolul celulelor NK
Celulele NK sunt cei mai importanti efectori ai imunitatii
antitumorale. Actiunea lor nu este limitata de identitatea moleculelor
CMH si îsi exercita efectul prin contact direct. Celulele NK nu necesita
prezentarea antigenului de catre celulele accesorii. Mecanismul
molecular al interactiunii lor cu celula tinta nu este cunoscut.
Activitatea celulelor NK se modifica cu vârsta: are nivel scazut la
nastere, atinge maximum la pubertate si scade gradat cu vârsta.
Activitatea lor fata de celulele maligne, in vitro, este invers
proportionala cu nivelul moleculelor CMH I, exprimate pe suprafata
celulelor maligne.
Exprimarea moleculelor CMH I poate duce chiar la scaparea celulelor
tumorale de a fi recunoscute de celulele NK, in vivo. Se presupune ca
celulele NK controleaza celulele pentru nivelul expresiei CMH I.
Celulele care au pierdut total sau partial moleculele CMH I, par a fi
recunoscute ca tinte si lizate. Deoarece actiunea celulelor NK nu este
restrictiva în raport cu moleculele CMH, ele sunt active fata de celulele
tumorale singenice, alogenice si chiar xenogenice.
Importanta functionala a celulelor NK pentru protectia antitumorala
este argumentata de faptul ca liniile de soareci congenital atimici sau cei
timectomizati neonatal au un numar mare de celule NK
Celulele K interactioneaza cu celula tinta prin intermediul
receptorilor pentru Fc . Celula tumorala tapetata cu IgG este astfel
usor recunoscuta de celulele K. Ele se activeaza si lizeaza celula tinta
prin fenomenul ADCC.
Activitatea celulelor NK si K din sânge, testata in vitro, scade
odata cu progresia tumorii. La contactul cu celula maligna, direct sau
mediat de anticorpi, celula efectoare elibereaza factori citotoxici
solubili:
perforina, proteaze, TNF-beta, limfotoxina (TNF-beta). Mecanismul
eliberarii factorilor litici este acelasi, descris pentru limfocitulTc.
Celulele NK, activate in vitro de IFN-alfa si de IL-2, se numesc LAK
(celule killer activate de limfochine).
Activarea celulelor NK si K nu produce memorie imuna. Nu exista
diferente între raspunsul imun primar si secundar.
Citotoxicitatea mediata de macrofage
Macrofagul neactivat (de la indivizi normali) exprima un nivel
minim de citotoxicitate antitumorala.
Macrofagul activat distinge celulele tumorale de celulele normale
si poate sa omoare selectiv, celulele tumorale. Activitatea sa citotoxica
este independenta de moleculele CMH, dar este dependenta de factori
genetici.
Macrofagul se activeaza în urmatoarele situatii:
dupa ce leaga prin receptorul pentru Fc, moleculele de
imunoglobulina fixate pe determinantii antigenici ai celulei maligne sau
complexele Ig—Ag tumoral solubil;
sub actiunea factorilor eliberati de celulele T sensibilizate (IFN )
sub actiunea endotoxinelor bacteriene
sub actiunea antigenelor de Mycobacterium, Listeria,
Toxoplasma sau dupa infectia cu aceste microorganisme intracelulare.
Activarea consta în amplificarea ratei metabolice si macrofagul
devine killer potential al celulelor tumorale. Macrofagul activat nu
interactioneaza cu antigenele tumorale specifice, dar ca si celulele NK,
pare sa distinga între celulele maligne si cele normale, prin mecanisme
moleculare necunoscute.
Macrofagele activate secreta diferite molecule antitumorale:
enzime hidrolitice care degradeaza tesutul conjunctiv
IFN-alfa, activator al celulelor NK
TNF-beta (casectina) cu efect stimulator asupra altor celule care
elibereaza IL
H2O2 si produsi de oxidare a glucozei, cu efect toxic direct
asupra celulei tinta, prin perturbari membranare
oxidul nitric (NO), toxic pentru celulele maligne. NO se formeaza
prin combinarea oxigenului cu azotul derivat din dezaminarea
enzimatica oxidativa a L-argininei. Reactia este catalizata de
nitric-oxid-sintaza. NO mediaza citotoxicitatea macrofagului,
dependenta de L-arginina.
Una din cauzele primare ale patologiei maligne este metastazarea,
adica eliberarea celulelor din situsul tumorii primare, pentru a initia la
distanta, cresterea unei noi tumori. Celulele metastazate au aceleasi
antigene de suprafata, ca si tumora primara. Principalele situsuri de
metastazare sunt ganglionii limfatici, plamânul, ficatul.
În studiile experimentale, macrofagele activate s-au dovedit a fi
foarte eficiente în reducerea incidentei metastazelor unor tumori.
Imunitatea mediata de celulele T
Imunitatea antitumorala mediata de celulele T, ca mecanism, este
analoga raspunsului imun fata de alte antigene T-dependente (de
exemplu, antigenele CMH). Experientele in vitro au evidentiat ca
antigenele tumorale stimuleaza proliferarea tuturor subpopulatiilor de
limfocite T (Th, Ts, Tc). Functiile efectoare ale limfocitelor T sunt
stimulate de limfochine si monochine (IL-1 si TNF- beta), sintetizate si
secretate de macrofagele care prezinta antigenele tumorale solubile.
IL-1 stimuleaza proliferarea celulelor B, T si NK. IL-1 produce si
raspunsul febril în reactia inflamatorie, iar TNF- beta determina necroza
celulelor tumorale.
Limfocitele TCD4 (si NK) secreta IL-2, cu efect stimulator asupra
celulelor care o secreta.
IFN este secretat de celulele TCD4 (si NK) si activeaza macrofagele si
celulele NK. Interferonul are efect antitumoral direct, dar este si
imunomodulator.
Limfocitele Tc au rol important în liza celulelor tumorale, daca
acestea exprima molecule CMH I. Interactiunea limfocitului Tc cu
celula maligna este specifica. Limfotoxina produsa de limfocitul Tc are
efect litic direct asupra celulelor tumorale.
Celula tumorala expune pe suprafata ei, antigene asociate cu
moleculele CMH I, dar elimina si molecule solubile, care sunt preluate
de CPA si prezentate limfocitelor Th. Acestea secreta IL-2, activatoare
pentru toate tipurile de celule cu functie imunitara, specifica sau
nespecifica.
În concluzie, reactia imuna fata de celulele tumorale are doua
trepte. In prima etapa sunt activate celulele efectoare nespecifice
(macrofage, eozinofile, neutrofile, celule NK) si se produce o reactie
inflamatorie locala. Reactia nespecifica usureaza reactia imuna
specifica, prin diminuarea ratei de crestere a tumorii si cresterea
nivelului de prezentare a antigenelor tumorale de catre celulele maligne,
prin modularea exprimarii moleculelor CMH. In faza a II-a, celulele Tc
asigura protectia imuna fata de cresterea tumorii.
Celulele efectoare ale imunitatii mediate celular, specifica si
nespecifica, sunt eficiente în detectarea si liza celulelor tumorale izolate
si transplantate. Deoarece detecteaza celulele tumorale izolate, ele sunt
eficiente în prevenirea metastazelor, dar sunt ineficiente fata de celulele
care constituie o microtumora.
Mecanisme de scapare a celulelor tumorale
Antigenele tumorale se gasesc pe suprafata celulelor tumorale.
Ele sunt antigene TSTA, mai concentrate sau mai diluate. Antigenele
CMH normale nu dispar, dar diminua cantitativ.
Cresterea tumorilor, în conditiile activarii raspunsului imun, nu este
explicata satisfacator. S-au propus mai multe mecanisme prin care
celulele tumorale evita recunoasterea de catre efectorii raspunsului
imun. Când sistemul imunitar este alertat, tesutul tumoral este prea
dezvoltat si nu mai poate fi înlaturat.
De cele mai multe ori, tumora nu este imunogena. Lipsa
imunogenitatii nu se datoreaza absentei antigenelor tumorale, ci faptului
ca celulele tumorale nu sunt eficiente în prezentarea antigenului.
Cel mai surprinzator si cel mai studiat mecanism de evitare a
raspunsului imun este modularea antigenica. Fenomenul modularii
antigenice defineste capacitatea tumorii de a masca sau de pierde
antigenele, în prezenta efectorilor imunitari. De exemplu, celulele
leucemice transplantate la soarecele imunizat cu mojaratul celulelor
leucemice care contin antigenul TL, au pierdut antigenul TL, dar
antigenul reapare dupa transplantul celulelor leucemice la soarecii care
nu au anticorpi serici anti-TL.
Imunoselectia. Antigenele exprimate pe suprafata celulelor
tumorale activeaza raspunsul imun mediat celular, iar antigenele
solubile stimuleaza sinteza anticorpilor. Unele celule tumorale, ca
rezultat al instabilitatii genetice, pierd antigenele initiale si astfel evita
efectorii raspunsului imun specific. Ele devin dominante în masa
tumorii.
Noile variante antigenice induc raspunsul imun specific, dar fenomenul
schimbarii specificitatii antigenice se repeta. Raspunsul imun nu induce
schimbarea specificitatii antigenice a suprafetei celulei maligne, ci
selecteaza celulele care au suferit modificarea antigenica si astfel au
devenit rezistente la actiunea efectorilor imunitari.
Diminuarea reactivitatii imunitare pe cale naturala sau artificiala
este însotita de cresterea incidentei neoplaziilor. Imunosupresia naturala
este mediata de limfocitele Ts. Antigenele tumorale par sa activeze mai
usor celulele Ts decât limfocitele Th. Limfocitele Ts sunt mai
numeroase la pacientii neoplazici si pot sa represeze raspunsul imun
pâna la ineficienta totala.
Celulele tumorale secreta citochine cu actiune imunosupresoare,
prin efectul lor inhibitor asupra interleuchinelor. Celulele maligne
produc IL-10, detectata în lichidul peritoneal si în serul pacientelor cu
cancer ovarian sau cu alte neoplasme intraperitoneale. IL-10 inhiba
exprimarea moleculelor CMH II pe suprafata monocitelor si
macrofagelor si diminua reactivitatea imunitara prin efectele sale
multiple asupra limfocitelor, monocitelor, celulelor NK si celulelor
dendritice.
Reactivitatea imunitara poate sa diminue datorita mascarii
antigenelor tumorale. De exemplu, sialomucina, abundenta pe suprafata
celulelor unor tumori, mascheaza antigenele tumorale si le face
inaccesibile recunoasterii imunitare si efectorilor imunitari. Sialomucina
poate fi îndepartata, in vitro, prin tratamentul celulelor cu neuraminidaza
de Vibrio cholerae si celulele îsi dobâdesc sensibilitatea la actiunea
litica a efectorilor imunitari.
Diminuarea reactivitatii imunitare se poate datora inundarii
organismului cu antigenele tumorii. Fiind o celula foarte activa din
punct de vedere metabolic, componentele membranei sale au un turn-
over ridicat. Antigenele eliberate se complexeaza cu anticorpii specifici
sau cu receptorii specifici ai limfocitelor, facându-i ineficienti în
recunoasterea celulelor maligne. Efectul imunosupresor al antigenelor
tumorale este proportional cu dimensiunile tumorii si dependent de
existenta metastazelor.
Efectul de inundare cu antigenele tumorii este argumentat de
experientele de transplant tumoral. Numarul celulelor transplantate este
determinant pentru dezvoltarea tumorii. Grefarea unui numar mic de
celule (prin injectarea suspensiei) este urmata de respingere, iar
grefarea unui numar mare de celule este urmata totdeauna de cresterea
tumorii. Dupa ce organismul a respins un numar mic de celule maligne
transplantate, se va apara fata de un numar progresiv crescând de
celule de acelasi tip. Imunitatea de transplantare fata de antigenele
tumorale poate fi depasita de un numar de 100-10 000 mai mare de
celule tumorale, decât numarul de celule necesar grefei tumorii la
animalele neimunizate.
Efectul imunosupresor al tumorii. Pacientii purtatori de tumori mari
nu raspund la antigenele tumorale, iar limfocitele lor in vitro, au o slaba
activitate citotoxica fata de celulele tumorale autologe.
Antigenele tumorale exercita un efect imunosupresor în gradient.
La un situs îndepartat de tumora, efectul imunosupresor diminua si
inoculul mic de celule tumorale este respins. Dupa ce tumora a dobândit
dimensiuni importante, efectul imunosupresor este sistemic. Antigenele
tumorale circulante se asociaza cu celulele efectoare ale sistemului
imunitar, chiar în sângele circulant, producând paralizia raspunsului
imun.
Cresterea tumorii poate fi stimulata prin fenomenul de
enhancement imunitar. Fenomenul de enhancement, descoperit
experimental, se defineste ca un proces de intensificare a cresterii
tumorii, în prezenta anticorpilor specifici. Tumorile au fost transplantate
la organisme imunizate cu mojarat celular al aceleiasi tumori, pentru
sinteza anticorpilor specifici. Anticorpii nu numai ca nu resping celulele
grefate, ci determina un efect invers, de stimulare a cresterii tumorii,
comparativ cu cresterea sa la animalele neimunizate. Anticorpii cu efect
de enhancement sunt IgG, la titru mic.
Fenomenul de enhancement se explica astfel:
Alfa anticorpii ar putea induce un efect imunosupresor, deoarece prin
feed-back inhiba sinteza anticorpilor potential citolitici;
alfa anticorpii de enhancement sunt citofili, adica se leaga specific pe
suprafata celulelor tumorale, formându-se complexe Ag-Ac, care
blocheaza fizic atasarea efectorilor humorali sau celulari.
Evolutia tumorii este conditionata, într-o oarecare masura, de tipul
anticorpilor care se sintetizeaza.
Toleranta imunitara este un mecanism eficient de scapare a
celulelor tumorale de actiunea efectorilor sistemului imunitar. Toleranta
se datoreaza lipsei de reactivitate a limfocitelor Tc si B, care la contactul
cu antigenele tumorale nu se sensibilizeaza si nu genereaza raspunsul
imun, desi fata de alte antigene, reactivitatea imunitara este normala.
Toleranta survine datorita stimularii repetate cu cantitati mici de
antigene, dar un rol esential în inducerea tolerantei imunitare pare sa
revina raportului dintre limfocitele Th si Ts.
Diferite produse tumorale, altele decât antigenele, pot sa interfere
cu functia imunitara si sa favorizeze instalarea tolerantei imunitare. De
exemplu, prostaglandinele diminua nivelul exprimarii moleculelor CMH
II pe suprafata celulelor prezentatoare de antigen si pot de asemenea sa
suprime activitatea celulelor NK.
Factorii genetici, neidentificati, influenteaza evolutia tumorii. Unele
neoplazii sunt asociate cu incapacitatea limfocitelor T de a activa
raspunsul imun, probabil datorita incapacitatii lor de a recunoaste
antigenul.
În concluzie, micile acumulari de celule tumorale, stimuleaza
raspunsul imun. Dar, chiar tumorile imunogene continua sa creasca la
gazdele imunocompetente, datorita eficientei scazute a raspunsului
imun antitumoral in vivo. Tumorile evita actiunea distructiva a
efectorilor imunitari sau blocheaza chiar raspunsul imun.
Abordari terapeutice ale neoplaziilor
Terapia neoplaziilor este abordata pe urmatoarele cai:
chirurgicala, radioterapia, chimioterapia si imunoterapia. Oricare ar fi
modalitatea de tratament, este necesara reducerea prealabila a masei
tumorale prin rejectie chirurgicala.
Terapia chirurgicala are ca scop reducerea dimensiunilor tumorilor
solide, în stadiile timpurii ale neoplasmelor de sân, colon, plamân,
prostata - cele 4 malignitati majore la om, ce reprezinta peste 50% din
totalul tumorilor solide.
Radioterapia poate fi primara sau secundara. Cea primara se
practica în cancerele capului, gâtului si în maladia Hodgkin (neoplazie a
ganglionilor limfatici, din diferite regiuni ale corpului). Radioterapia
este
mai eficienta pentru tesuturile moi, în arii adiacente maxilarelor si cailor
nazale. Iradierea totala se practica înainte de transplantul maduvei
osoase si este foarte eficienta pentru anumite leucemii acute, refractare
la chimioterapie si pentru tratamentul unor tumori solide (cancer de
sân), care au revenit dupa câtiva ani de remisiune.
Chimioterapia consta în tratamentul cu medicamente citotoxice,
majoritatea fiind produse de sinteza chimica. Scopul chimioterapiei este
de a omorî selectiv celulele maligne, deoarece au o rata superioara de
crestere si diviziune. Cele mai sensibile la chimioterapie sunt leucemiile.
Efectul medicamentelor citotoxice este dependent de doza. Dozele prea
mici nu produc efect, iar cele mari au efecte toxice asupra organismului,
în special asupra maduvei osoase si asupra celulelor cu o rata mare de
diviziune. Doza se calculeaza la aria de suprafata corporala, preferabila
raportarii la greutate. Majoritatea agentilor citotoxici se administreaza
intravenos, calea orala fiind adecvata pentru ciclofosfamida (si pentru
tamoxifen).
Agentii chimioterapeutici, în functie de mecanismul actiunii lor,
apartin mai multor clase.
Agentii alchilanti induc formarea legaturilor transversale stabile
între cele doua catene ale AND (prin legarea de N7 a guaninei) si inhiba
replicarea moleculei de ADN. Interactiunea poate sa se produca cu una
sau cu ambele catene ADN. Alchilarea guaninei induce împerecherea
anormala cu timina sau depurinarea prin excizia resturilor de guanina.
Consecinta este ruperea catenei de ADN. Daca legatura transversala se
face între resturile de guanina ale celor doua catene, excizia reparatorie
poate sa rupa molecula de ADN si sa rezulte o mutatie letala pentru
celula. Agentii alchilanti reactioneaza chimic cu gruparile sulfhidril,
amino, hidroxil si fosfat. Actiunea lor nu are specificitate de faza a
ciclului celular, dar celulele sunt mai sensibile în faza G 1 si S. Efectul
se
manifesta prin blocarea ciclului celular dupa faza G 2.
Mecanismul rezistentei dobândite la agentii alchilanti poate sa
conste într-o retentie scazuta a agentului în celula, în cresterea sintezei
compusilor sulfhidril cu greutate mica si în cresterea capacitatii de
reparare a leziunilor ADN. Desi au mecanisme asemanatoare de
actiune, diferentele structurii moleculare reduc gradul rezistentei
încrucisate între compusii subclaselor majore. Efectele secundare sunt
gastrointestinale (greata, voma) si hematologice (mielosupresie).
Ciclofosfamida este cel mai folosit agent alchilant, în tratamentul
malignitatilor hematologice si a tumorilor solide. Este convertita la
forma
activa în ficat
Compusii platinei (cisplatin, carboplatin) nu sunt agenti alchilanti,
dar actioneaza printr-un mecanism similar, adica se leaga de N 7 al
guaninei si realizeaza legarea încrucisata a catenelor de ADN. Se leaga
si cu alte molecule: adenina, citozina, ARN, proteine.
Antimetabolitii (citarabina, fluorouracil, metotrexat,
mercaptopurina, hidroxiureea) sunt analogi ai bazelor azotate si inhiba
sinteza ADN, ARN sau sinteza proteinelor. Sunt agenti cu specificitate
de faza a ciclului celular.
Antagonistii pirimidinelor. Citarabina (Ara-C) este un compus cu
specificitate de faza S. Este metabolizata în celula la forma activa,
ara-CTP, inhibitor al ADN-polimerazei si al sintezei ADN. Ara-C este
încorporata în ADN si blocheaza alungirea catenei, ca si legarea
fragmentelor în molecula de ADN nou sintetizata.
Antagonistii purinelor. 6-mercaptopurina si 6-tioguanina sunt
convertite la forma nucleotidica de hipoxantin-guanin fosforibozil
transferaza (HGPRT). Metabolitii lor inhiba unele enzime ale caii
purinice. Unii metaboliti ai
6-tioguaninei sunt încorporati în ADN si în ARN.
Fludarabina este analog al adeninei. Derivatul sau,
fludarabin-trifosfat, actioneaza prin inhibitia ADN-polimerazei si
ribonucleotid-reductazei si prin încorporarea în ADN
Antagonistii acidului folic (metotrexat, aminopterina) sunt analogi
structurali ai acidului folic.
Alcaloizii din plante (vincristina si vinblastina, izolati din Vinca
rosea), produc agregarea tubulinei si dezorganizarea microtubulilor
celulari. Vinblastina este toxica pentru maduva hematopoetica, iar
vincristina are efecte toxice majore asupra terminatiilor nervoase
periferice, producând neuropatii senzoriale (parestezie, adica lipsa
senzatiei de durere) si motorii, în degete.
Pentru un numar mare de categorii de tumori, chimioterapia
determina o citoreducere importanta. Dar, la câteva luni sau la câtiva
ani, cresterea tumorala este reluata si continua chiar în conditiile
reinstituirii tratamentului. Cresterea reflecta dobândirea rezistentei
specifice la medicamentele administrate.
În general, dezvoltarea rezistentei la un medicament este
considerata ca rezultat al unei rate înalte a mutatiilor celulelor maligne,
consecinta fiind aparitia unor subpopulatii heterogene, din care unele
sunt rezistente la diferite medicamente. Cea mai importanta mutanta
este cea cu rezistenta medicamentoasa multipla, mediata de
glicoproteina P, o glicoproteina membranara, care functioneaza ca o
pompa de eflux, dependenta de energie. Pompa elimina activ din celula,
o varietate de agenti citotoxici: alcaloizii din plante, antibioticele
(dactinomicina, doxorubicina, daunorubicina) si unii agenti sintetici
(melphalan). Celulele maligne mutante, care exprima gena codificatoare
a glicoproteinei P, sunt rezistente la o larga varietate de medicamente
anticanceroase.
Imunoterapia încearca sa distruga celulele maligne, prin
manipulari de stimulare a reactivitatii a sistemului imunitar.
Injectarea citochinelor sau stimularea in vitro, cu IL-2, a
limfocitelor autologe, obtinute din sângele pacientului, are efecte
stimulatoare asupra raspunsului imun. Rareori s-a produs remisiunea
completa a neuroblastomului, a carcinomului renal sau a melanomului
malign, ceea ce evidentiaza ca raspunsul imun fata de aceste neoplazii
poate fi stimulat.
Fig. 134. Modelul unei celule maligne care exprima glico-proteina P, o
proteina
transmembranara care functio-neaza ca o pompa de eflux. Ea are situsuri
acceptoare la
care se leaga diferite medicamente anti-canceroase (naturale sau artifi-
ciale), dupa care
sunt pompate la exteriorul celulei. Functia glico-proteinei P poate fi
inhibata competitiv
de agenti chimio- sensibilizatori ca verapamil.
Cea mai obisnuita forma de terapie imuna a neoplaziilor este
utilizarea anticorpilor monoclonali (AMC) cu specificitate tumorala,
cuplati cu toxine (toxina difterica, toxina de ricin) sau cuplati cu agenti
chimici (I131, medicamente citotoxice), ce suprima proliferarea
celulara.
In ansamblu, terapia cu AMC nu a reusit. Cele mai frecvente tumori (de
colon, de sân, de plamân, de prostata) poarta antigene proteice
intracelulare, inaccesibile AMC. Strategiile chimioterapeutice au
progresat mult si ofera mai multe sanse de reusita, la un pret de cost
inferior.
În tratamentul limfoamelor celulelor B se folosesc AMC
anti-idiotipici fata de imunoglobulina membranara a limfomului.
Stimularea nespecifica a tesutului limfoid este o metoda
terapeutica introdusa de G. Mathé. El a administrat BCG pentru terapia
leucemiilor limfoblastice la copii. Remisiunile se prelungesc ca durata.
Celulele de Corynebacterium parvum au efecte antitumorale, în
asociere cu chimioterapia, iar celule de C. parvum si BCG injectate
direct în masa tumorii, inhiba cresterea tumorii. Antigenele bacteriene
stimuleaza imunitatea mediata celular. Celulele limfoide sunt atrase în
numar mare la locul injectarii si actiunea lor este orientata asupra
celulelor tumorale. Macrofagele se activeaza la contactul cu antigenele
bacteriene si dobândesc proprietati citotoxice fata de celulele tumorale,
evidentiate in vitro.
Interferonul (produs de leucocite) se utilizeaza în tratamentul
unor leucemii si în tratamentul limfoamelor, dar este toxic, ceea ce
impune limitarea dozei. Majoritatea pacientilor, dupa administrarea
interferonului, fac un “sindrom al starii gripale”: febra, senzatie de frig,
dureri de cap, dureri musculare. Aceste simptome diminua pe parcursul
terapiei si sunt controlate, partial, cu diferiti agenti farmacologici.
Imunoprofilaxia cu vaccinuri, pentru anumite virusuri, a avut
succes la animale. Boala lui Marek, produsa de un herpesvirus, este o
maladie limfoproliferativa la puii de gaina. Incidenta leucemiei felinelor
a
scazut, ca rezultat al unui program de vaccinare. Nu exista vaccinuri
protectoare fata de neoplaziile umane.
Bibliografie

1. T.S. Griffith, T. Brunner, S.M. Fletcher, D.R. Green, and T.A.

Ferguson, Science 270, 1189-1192 (1995).
2. J.F.R. Keer, A. H. Wyllie, and A. R. Currie, Br. J. Cancer 26, 239-
257 (1972).
3. A. H. Wyllie, Cell death in Biology and Pathology, 9-34 (1981)
4. C. Dive and J.A. Hickman, Br. J. Cancer 64, 192-196 (1991)
5. C. Dive, C.D. Gregory, D.J. Phipps, D.L. Evans, A.E. Milner and A.
H. Wyllie, Bioch. Biophy. Acta 1133, 275-282 (1992)
6. H.M. Ellis, and H.R.Horvitz, Cell 44, 817-829 (1986)
7. R.S. Malyapa, and S. Sawada, Radiat. Res.,125 , 134-140 (1991)
8. J.Y. Yuan, and H.R. Horvitz, Dev. Biol. 138, 33-41 (1990)
9. A. H. Wyllie, J.F.R. Keer, and A. R. Currie, Int. Rev. Cytol. 68, 251-
305 (1980).
10.F. Oberhammer, J. W. Wilson, C. Dive, I. D. Morris, J. A. Hickman,
A. E. Wakeling, P. R. Walker, and M. Sikorska, EMBO J. 12, 3679-
36-84 (1993).
11.A. H. Wyllie, Nature 284, 555-556 (1980).
12.M. D. Jacobson, J. F. Burne, and M. C. Raff, EMBO J. 13, 1899-
1910 (1994).
13.K. Schulze-Osthoff, H. Walczak, W. Droge, and P. H. Kramer, J.
Cell Biol. 127, 14-20 (1994).
14.S. H. Kaufmann, Cancer Res.49, 5870-5878 (1989).
15.D. S. Ucker, J. Mayer, and P. S. Obermiller, J. Immunol.149, 1583-
1592 (1992).
16.Y. A. Lazebnik, S. Cole, C. A. Cooke, W. G. Nelson, and W. C.
Earnshaw, J. Cell Biol. 123, 7-22 (1993).
17.S. Raipert, B.M. Raipert, J.A. Hickman and T.D. Allen, Cell Death
Differ., 3, 131-139 (1996)
18.G. Kroemer, P. Petit, Z. Naofal, J.-L. Vayssiere and B. Mignotte,
FASEB J., 9, 1277-1287 (1995)
19.L. Fesus, V. Thomazy and A. Falus, FASEB J., 224, 104-108 (1987)
20.J. Savill, Biochem. Soc. Trans. 224, 1065-1069
21.W. Burch, S. Pafe, B. Putz, G. Barthel, and R. Schulte-Hermann,
Carcinogenesis 11, 847-853 (1990)
22.R. Berges, and J.T. Jsaacs, Clin. Chem. 39, 2-8 (1993)
23.J.T. Jsaacs, P.I. Lundmo, R. Berges, P. Martikainen, N. Kyprianos,
and H.F. English, J. Androl., 13, 457-464 (1992)
24.D.K. Armstrong, J.T. Jsaacs, Y.L. Ottaviano, and N.E. Davidson,
Cancer Res., 52, 3418-3424 (1992)
25.R.J. Smeyne, M. Vendrell, M.Hayward, S.J. Baker, G.G. Miao, K.
Schilling, L.M. Robertson, T. Curran, and J.I. Morgan, Nature, 363,
166-169 (1993)
26.G.E. Deng, and E.R. Podack, Proc. Natl. Acad. Sci U S A, 90, 2189-
2193 (1993)
27.S. Orrenius, D.J. McConkey, G. Bellomo, and P. Nicotera, Trends
Pharmacol. Sci., 10, 281-285 (1989)
28.M.J. Arends, R.G. Morris, and A.H. Wyllie, Am .J Pathol., 136, 593-
608 (1990)
29.C.R. Knight, R.C. Recs, and M. Griffin, Biochim. Biophis. Acta,
1096, 312-18 (1991)
30.S.M. Pittman, M. Geyp, S.J. Tynan, C.M. Gramacho, D.H.
Strickland, and M.J. Fraser, Tubulin in apoptotic cells, Harwood
Academic Publishers, 315-323 (1993)
31.T.G. Cotter, S.V. Lennon, J.M. Glynn, and D.R. Green, Cancer Res.,
52, 997-1005 (1992)
32.F. Oberhammer, J.W. Wilson, C. Dive, I.D. Morris, J.A. Hickman,
and A.E. Wakeling, EMBO J, 12, 3679-3684 (1993)
33.F. Obsehammer, W. Burch, W. Parzefall, P. Brett, E. Erben, M.
Stadler, and R. Schulte-Hermann, Cancer Res., 51, 2478-2485
(1991)
34.D.S. Ucker, P.S. Obermiller, W. Eckhart, J.R. Apgar, N.A. Berge and
J. Meyers, Mol. Cell. Biol., 12, 3060-3069 (1992)
35.D. Barbieri, L. Troiano, E. Grassilli, C. Agnesi, E.A. Cristofalo, D.
Monti, M. Capri, A. Cossariza and C. Franceschi, Biochem. Biophy.
Res. Commun., 187, 1256-1261 (1992)
36.L.D. Tomei, J.P. Shapiro and F.O. Cope, Proc. Natl. Acad. Sci U S A,
90, 853-857 (1993)
37.D.G. Brown, X-M. Sun and G.M. Cohen, J. Biol. Chem., 268, 3037-
3039 (1993)
38.J.J. Cohen and R.C. Duke, J. Immunol., 132, 38-42 (1984)
39.P. Nicotera, P. Hartzell, G. Davis and S. Orrenius, FEBS Lett., 209,
139-140 (1986)
40.M. Poenie, R.Y. Tsien and A-M Schmitt-Verhulsm, EMBO J., 6,
2233-2238 (1987)
41.N.L. Allbritton, C.R. Verret, R.C. Wooley and H.N. Eisen, J. Exp.
Med., 167, 514-519 (1988)
42.D.J. McConkey, P. Hartzell, Nicotera and S. Orrenius, FEBS Lett., 3,
1843-1949 (1989)
43.M.Perotti, F. Toddei, F. Mirabelli, M. Vairetti, G. Bellomo, D.J.
McConkey and S. Orrenius, FEBS Lett., 269, 331-334 (1990)
44.R.A. Schwartzman and J.A. Cidlowski, Endocrinology, 133, 591-599
(1993)
45.M.C. Peitsch, B. Polzar, H. Stephan, T. Crompton, H.R. MacDonald,
H.G. Mannerz and J. Tschopp, EMBO J., 12, 371-377 (1993)
46.J.T. Issacs, Curr. Opin. Biol., 6, 82-89 (1994)
47.J. Filipski, J. Leblanc, T. Youdale, M. Sikorska and P.R. Walker,
EMBO J., 9, 1319-1327 (1990)
48.P.R. Walker, V.M. Weaver, B. Lach, J. Leblanc and M. Sikorska,
Biochem.Cell.Biol., 213, 100-106 (1994)
49.X.M. Sun and G.M. Cohen, J.Biol.Chem., 269, 14857-14860 (1994)
50.B. Zhivotovsky, B. Cedervall, S. Jiang, P. Nicotera and S. Orrenius,
Biochem.Biophys.Res.Commun., 202, 120-127 (1994)
51.C. Giannakis, I.J. Forbes and P.D. Zalewski,
Biochem.Biophys.Res.Commun., 181, 915-920 (1991)
52.P.D. Zalewski, I.J. Forbes and W.H. Betts, Biochem. J., 296, 403-408
(1993)
53.M. Loukkamaki, K. Servomaa and T. Rytomaa, Int. J. Radiat. Biol.,
63, 207-213 (1993)
54.M.J. Arends, R.G. Morris and A.H. Wyllie, Am. J. Pathol., 136, 593-
608 (1990)
55.P.R. Walker and M. Sikorska, Biochemistry, 25, 3839-3845 (1986)
56.W.M. Weaver, B. Lach, P.R. Walker and M. Sikorska, Biochem.
Cell Biol., 71, 488-500 (1994)
57.M. Murgia, P. Pizzo, D. Sandona, P. Zanovello, R. Rizzuto and F. Di
Virgilio, J. Biol. Chem., 267, 10939-41 (1992)
58.M.J. Arends,R.G. Morris and A.H. Wyllie, Am J Pathol., 136, 593-
608 (1990)
59.J. Savill, V. Fadok, P. Henson and C. Haslett, Immunol Today, 14,
131-136 (1993)
60.V.A. Fadok, D.L. Bratton, S.C. Frasch, M.L. Warner and P.M.
Henson, Cell Death Differ., 5, 551-562 (1998)
61.V.A. Fadok, D.R. VoelkerP.A. Campbell, J.J. Cohen, D.L. Bratton
and P.M. Henson, J. Immunol., 148, 2207-2216 (1992)
62.A. Shiratsuchi, M. Umeda, Y. Ohba and Y. Nakanishi, J. Biol.
Chem., 272, 2354-2358 (1997)
63.B. Verhoven, R.A. Schlegel and P. Williamson, J. Exp. Med., 182,
1597-1601 (1995)
64.R.F.A. Zwaal and A.J. Schroit, Blood, 89, 1121-1132 (1997)
65.L. Falasca, A. Bergamini, A. Serafino, C. Balabaud and L. Dini, Exp.
Cell Res., 224, 152-162 (1997)
66.J. Hughes, Y. Liu, J. VanDamme and J. Savill, J. Immunol., 158,
4389-4397 (1997)
67.D. Pradhan, S. Krahling, P. Williamson and R.A. Schlegel, Mol. Cell
Biol., 8, 767-778 (1997)
68.A. Devitt, C. Raykundalia, O.D. Moffatt, J.D. Capra, D.L. Simmons
and C.D. Gregory, Nature, (1998)
69.K. Murao, V. Terpstra, S.R. Green, N. Kondratenko, D. Steinberg
and O. Quehenberger, J. Biol. Chem., 272, 17551-17557 (1997)
70. S.J. Weiss, New Engl. J. Med., 320, 365-375 (1989)
71.D.A. Bell and B. Morrison, Clin. Immunol. Immunopth., 60, 13-26
(1991)
72.S.R. Batsford, APMIS, 99, 1-9 (1991)
73.R.G. Moris, A.D. Hargreaves, E. Duvall and A.H. Wyllie, Am. J.
Path. , 115, 426-436 (1984)
74.J.S. Savill, N. Hogg, Y. Ren and C. Haslett, J. Clin. Invest., 90,
1513-1522 (1992)
75.R.E. Ellis, J. Yuan and R.H. Horvitz, Annu. Rev. Cell Biol., 7, 663
(1991)
76.H. Steller, Science, 267, 1445-1449 (1995)
77.J. Savill and V. Fadok, Nature, 407, 784-788 (2000)
78.N. Platt, R.P. da Silva and S. Gordon, Trends Cell Biol., 8, 365-372
(1998)
79.J.Audouin, M.A. de Maublanc and T. Maolina, Cancerologie
Aujourd’hui, 4 (2), 51-69 (1995)
80.P. Goldstein, D.M. Ojcius and J.D. Young, Immunol Rev., 121, 29-65
(1991)
81.M. Oren M, Cancer Metastasis Rev., 11, 141-148 (1990)
82.G.I. Evan, A.H. Wyllie and C.S. Gilbert, Cell, 69, 119-128 (1992)
83.S.J. Korsmeyer, Surveys, 15, 105-118 (1992)
84.J. Finke, R. Firtzen and P. Temess, Blood, 80, 459-469 (1992)
85.R.P. Bissonette, F. Echeverri, A. Mahboubi and D.R. Green DR,
Nature, 359, 552-554 (1992)
86.T.J. McDonnel and S.J. Korsmeyer, Nature, 349, 254-256 (1991)
87.A.J. Levine, J. Momand and C.A. Finlay, Nature, 351, 453-456
(1991)
88.E. Yionish-Rouach, D. Resnitsky, J. Lotem, L. Sacha, A. Kimchi and
M. Oren, Nature, 353, 345-347 (1991)
89.J.A. Hickman, Cancer Metastasis Rev., 11, 121-139 (1992)
90.C.E. Sarraf and I.D. Bowen, Cell Tissue Kinet., 21, 45-49 (1988)
91.J.F.R. Kerr, J Pathol., 105, 13-20 (1971)
92.G.C. Gobe, R.A. Axelsen and J.W. Searle, Lab Invest., 63, 770-779
(1990)
93.A. Columbano, G.M. Ledda-Columbano, P.M. Rao, S. Rajalakshmi
and D. Sarma, Am. J. Pathol., 116, 441-446 (1984)