Laborator 1

Diagnosticul patogenetic al proceselor inflamatorii

Inflamația este răspunsul organismului la agresiuni nespecifice (factori chimici,

traumatici sau infecțioși). Agresiunea are loc la nivel biochimic. O cerință de bază este
vascularizația țesutului agresat. Răspunsul inflamator este un proces complex ce implică
răspunsuri umorale și celulare și decurge în trei etape principale:
(1) Vasodilatație – creșterea fluxului de sânge, ceea ce favorizează distribuirea
fagocitelor, factorilor de coagulare, anticorpilor, etc., în zona afectată.
(2) Permeabilitate crescută a vaselor de sânge - permite proteinelor plasmatice să
părăsească circulația și să ajungă în zona agresată.
(3) Migrarea leucocitelor la locul agresiunii.

Răspunsul inflamator este prin urmare un răspuns de apărare, destinat să

elimine cauza și consecințele agresiunii tisulare. Dacă inflamația care rezultă este
deficitară sau excesivă apare un răspuns inflamator patologic, asociat cu agravarea
leziunilor inițiale. In același timp are loc eliberarea în exces a mediatorilor inflamatori și
se asociază o reacție sistemică masivă, care în cele din urmă duce la leziuni tisulare și
disfuncție de organ. Sindromul de răspuns inflamator sistemic (SIRS), numit sindromul
inflamator sistemic (SIS), este non-specific și poate fi cauzat de ischemie, inflamație,
traumatisme, infecție sau o combinație de mai multe dintre acestea. Bone (1996)
rezumă relațiile dintre inflamație și SIRS ca un proces în trei etape:
• Etapa I: După o insultă, sunt produse citokine cu scopul de a iniția un răspuns
inflamator, promovând astfel vindecarea rănilor.
• Etapa II: cantități mici de citokine locale sunt eliberate în circulație pentru a
îmbunătăți răspunsul local. Acest lucru duce la o stimulare a factorilor de creștere și
recrutarea macrofagelor și trombocitelor. Acest răspuns de fază acută este de obicei
bine controlat de o scădere a mediatorilor proinflamatori și eliberarea factorilor
antiinflamatori.
• Etapa III: Dacă homeostazia nu este restaurată, apare o reacție sistemică semnificativă.
Eliberarea în exces de citokine duce la agravarea leziunilor, sunt activate numeroase
cascade umorale și sistemul reticulo-endotelial, rezultând pierderea ulterioară a
integrității circulației și insuficiența de organ.

Testele diagnostice patogenetice pentru inflamație au menirea de a pune

diagnosticul pozitiv de proces inflamator. Se completează cu teste etiologice,
etiopatogenetice, funcţionale (în funcție de organul afectat) şi teste pentru complicaţiile
posibile.

MECANISM Semne/ Teste

simptome
SPUNSUL INFLAMATOR LOCAL: H
Răspuns vascular:

I. Arteriole, sfinctere
precapilare: Dozarea mediatorilor
1. vasoconstricţie (activă): paloare inflamatori:
2. vasodilataţie (activă): hiperemie Eritem cald  prostaglandine
 leucotriene
 tromboxani
e
1
 II. Capilare, venule  PAF
postcapilare  Substanţa P
1. vasodilataţie (pasivă) exudat,  Cytokine …
2. creşterea permeabilităţii tumefiere,
durere, Analiza exudatului:
reducerea  Reacţia RIVALTA
Răspuns celular: funcţiei  Reacţia PANDY (LCR)

1. migrarea leucocitelor  Biopsie tisulară

2. fagocitoza :  Test de fagocitoză in vitro
mecanismele de distrucţie oxigen-  Testul NBT (nitro-blue-
dependent (SRO, SRN), oxigen- tetrazolium)
independed (enzime lizozomale,  Mieloperoxidaza (MPO)
proteine cationice)  Protease (MMP)
 ANCA
 Lactoferina
 Specii reactive ale oxigenului
(SRO)
 Specii reactive ale azotului
(SRN)
 Radiofarmaceutice pentru
marcarea leucocitelor

RĂSPUNSUL INFLAMATOR
SISTEMIC:
febră  Curba febrilă
1. Răspunsul de fază acută al
stare generală
sistemului nervos: febra
alterată
2. Răspunsul hepatic de fază acută:
sinteza proteinelor de fază acută  Proteine serice totale
 Proteina C reactivă
 complement (C3, C4)
 VSH
 Lipide totale
 lipoproteine
3. Răspunsul medular de fază
acută:  număr total de leucocite
leucocitoză  formula leucocitară
 număr de hematii
 hemoglobină, hematocrit
 sideremie
 număr de plăcuţe

2
 LEUCOGRAMA
Una din cele mai sensibile teste ale reacţiei de fază acută este creşterea
numărului şi imaturităţii neutrofilelor circulante, leucocitoză cu neutrofilie.
Eliberarea neutrofilelor se datorează acţiunii directe a interleukinei-1 asupra măduvei
osoase hematogene.

VSH
VSH este cel mai utilizat test non-specific în diagnosticului inflamaţiei pentru
afecţiuni reumatologice. VSH este afectată de modificări ale concentraţiei proteinelor
plasmatice cum sunt fibrinogenul, proteina C reactivă şi imunoglobulinele. Concentraţia
acestor proteine creşte rapid în caz de leziuni tisulare sau ca răspuns la stimuli
inflamatori. Când hematiile se grupează în rulouri, ca urmare a creşterii concentraţiei
serice de proteine asimetrice, cum sunt reactanţii de fază acută (fibrinogen,
haptoglobină, macroglobulină) scade potenţialul negativ al hematiilor (responsabil de
menţinerea eritrocitelor normale în suspensie), și hematiile vor sedimenta mai rapid,
determinând creşterea VSH.
În afecţiuni cronice ca şi tuberculoza sau bolile maligne creşterea VSH se
asociază cu modificări ale imunoglobulinelor plasmatice.
Valori normale la adultul sub 50 de ani, 0 – 20 mm/h şi valorile cresc cu vârsta.
Boli în care VSH nu creşte: policitemie, anemii asociate cu poikilocitoză,
hipofibrinogenemie.
În bolile reumatice, când creşte VSH (adesea de 30 – 100 mm/h) poate fi utilizat
ca indice de severitate a inflamaţiei, iar când scade, este util în urmărirea terapiei.

RĂSPUNSUL HEPATIC DE FAZĂ ACUTĂ

La 8 – 12 ore de la inițierea reacției inflamatorii ficatul va creşte sinteza de
proteine de fază acută . În cadrul răspunsului vor creşte proteine care se găsesc în
mod normal în plasmă, dar vor apare şi unele proteine noi care pot fi utilizate ca
markeri pentru evenimentul patologic. Răspunsul de fază acută este reglat de citokine.
Dintre acestea, interleukina-6 (IL-6) reprezintă stimulul major pentru majoritatea
proteinelor de fază acută. Alte citokine inflamatorii cum sunt interleukina-1β (IL-1β),
factorul de necroză tumorală α (TNF-α), interferonul gama (IFN-γ), şi factorul de
creştere şi transformare β (TGF-β) reglează anumite tipuri de proteine de fază acută.
Astfel creşte de mai multe ori faţă de normal concentraţia a mai multor proteine
plasmatice: haptoglobina, anumite proteaze inhibitorii ca alfa-1-antitriipsina, alfa-
1-antichimotripsina, alfa-2-macroglobulina, glicoproteina acidă alfa-1,
componentele complementului (C1 – C4), ceruloplasmina, feritina şi fibrinogenul.
Totuşi, adevăraţii reactanţi de fază acută cresc de câteva sute de ori: amiloidul seric A,
un precursor al amiloidului în amiloidoza secundară şi proteina C reactivă.
Dintre toţi reactanţii de fază acută, fibrinogenul, proteina C reactivă şi
amiloidul seric A sunt cei mai importanţi din punct de vedere clinic şi pot fi dozaţi în
majoritatea laboratoarelor clinice ca markeri ai reacţiei de fază acută.
Valorile plasmatice normaleale fibrinogenului sunt 200 – 400 mg/dL şi
cresc în primele 24 de ore de la evenimentul declanşant.
Proteina C reactivă
Proteina C reactivă (PCR) se sintetizează primar în hepatocit; sinteza sa este
iniţiată la 4-6 h după agresiune. PCR activează complementul via calea clasică pentru a
opsoniza şi a îndepărta microorganismele, şi în plus acţionează ca o proteină reglatoare
în activarea complementului pe cale alternativă. Nivelul plasmatic normal al
proteinei C reactive este sub 1 mg/dL, dar creşte dramatic şi foarte rapid în prezenţa

3
infecţiilor bacteriene, când valoarea sa ajunge >100 mg/L. Odată cu rezoluţia acestor
infecţii, nivelul PCR scade în câteva zile. Nivele moderat crescute de PCR de 10-100
mg/L se întâlnesc în boli inflamatorii cum este lupusul eritematos sistemic (LES), bolile
maligne, insuficienţa cardiacă congestivă şi în sarcină. În infecţiile virale nivelul PCR
este normal până în momentul suprainfecţiei bacteriene. PCR este extrem de util ca
marker inflamator de urmărire a pacienţilor operaţi. În cazurile necomplicate, nivelul
PCR creşte atingând un vârf în primele 48-72 de ore postoperator, şi revine la normal în
primele şapte zile. Dacă apar complicaţii postoperatorii, ca inflamaţii sau stare septică,
nivelul de PCR rămâne crescut.
Concentraţia de PCR nu creşte în infecţiile virale sau cele cu spirochete. Astfel, în
absenţa traumei, concentraţiile foarte mari pot fi sugestive pentru infecţia bacteriană. În
plus, concentraţiile măsurate în dinamică sunt utile pentru monitorizarea răspunsului la
terapia antimicrobiană. La pacienţii cu meningită bacteriană, concentraţiile foarte mari
pot fi utilizate ca markeri predictivi pentru sechelele neurologice.
Răspunsul PCR la inflamaţie apare chiar şi în perioada neonatală, când nivelele
serice sunt importante în diagnosticul de stare septică bacteriană.
Spre deosebire de celelalte proteine de fază acută, cum sunt 1-antitripsina şi
haptoglobina, PCR nu este afectată de hormonii estrogeni sau de medicaţia
antiinflamatorie şi imunosupresivă.
Concentraţia de PCR este utilă şi în evaluarea clinică a evoluţiei unor afecţiuni ca:
artrită reumatoidă, lupus eritematos sistemic, colită inflamatorie sau infarctul miocardic.

Proteina C reactivă de înaltă sensibilitate (High Sensitivity PCR - hs-CRP)

Proteina C reactivă este considerată un marker de evaluare a pacienţilor cu risc
moderat de boală coronariană. Testul hs-CRP poate detecta concentraţii mai mici ale
proteinei, fiind mai sensibil decât testul standard de detectare a PCR. Se ştie acum că
inflamaţia joacă un rol important în ateroscleroză. Există studii care au demonstrat că
dozarea PCR prin metoda mai sensibilă de hs-CRP, poate identifica riscul de boală
coronariană la persoane aparent sănătoase. La aceşti indivizi cu risc crescut, valorile
sunt predictive pentru riscul de infarct miocardic, accident vascular cerebral, moarte
subită cardiacă şi boala arterelor periferice, chiar la o concentraţie de colesterol aflată în
limite acceptabile.
Grupe de risc pentru dezvoltarea bolii coronariene
 risc scăzut < 1,0 mg/dL
 risc moderat 1,0-3,0 mg/dL
 risc major > 3,0 mg/dL

Amiloidul seric A (ASA)

Amiloidul seric A (ASA) face parte dintr-o clasă de apolipoproteine asociate cel
mai frecvent cu lipoproteinele plasmatice cu densitate mare (HDL), fiind exprimate
diferit la diverşi indivizi ca răspuns la stimuli inflamatori. Deşi sinteza primară are loc la
nivelul ficatului, există şi alte ţesuturi care exprimă ASA. Amiloidul seric A este legat de
inflamaţie, apărarea antimicrobiană, metabolismul HDL şi transportul colesterolului, şi
a fost astfel implicat în mai multe afecţiuni cum sunt ateroscleroza, artrita reumatoidă,
boala Alzheimer şi cancerul. Cel mai bine se cunoaşte rolul ASA în reacţia de fază acută
ca răspuns la un stimul inflamator, o leziune tisulară sau un traumatism. Concentraţia sa
poate să crească de până la 1000 de ori în cursul inflamaţiei acute.

RADIOFARMACEUTICE PENTRU MARCAT LEUCOCITE

1. Proceduri ex vivo:
4
 In ziua de scanare, pacientul donează o probă de sânge integral și apoi se
izolează celulele albe. Cea de a doua parte a procedurii implică marcarea leucocitelor
izolate cu un produs radiofarmaceutic selectat.
99𝑚𝑇𝑐-HMPAO
111ln-oxină
99𝑚 𝑇𝑐-Tin Fluorul coloid

2. Moleculele de origine biologică (anticorpi) :

LeukoScan și Scintimun, sunt produse utilizate pentru imagistica
infectiilor/inflamatiilor din osul pacienților cu suspiciune de osteomielita și cu ulcere
ale piciorului diabetic. După injectarea intravenoasă, radioactivitatea se acumulează la
locul inflamator în următoarele 1-8 ore
Nanocoll este un produs folosit pentru a prepara-99mTc albumină nanocolloid, indicat
pentru scanarea inflamației în alte zone decât abdomenul.

3. Molecule sintetice care markează leucocite neutrofile polimorfonucleare

(PMN) și fagocitele mononucleare din focarul inflamator.

DIAGNOSTICUL INFLAMAȚIILOR CRONICE

In inflamațiile cronice trebuie evaluat procesul inflamator, etiologia si complicațiile
acestora. De exemplu în artrita reumatoidă :
 pentru evaluarea procesului inflamator se determină VSH, PCR,
hemoleucograma (anemie hipocromă, leucocite normale/crescute – scad în
splenomegalie, trombocite crescute proporțional cu severitatea afecțiunii);
 pentru etiologia autoimună se determină factorul reumatoid (anticorpi anti
regiunea Fc a IgG), anticorpi anti proteină citrulinată(antiCCP)( pozitivă înainte
de debutul clinic al bolii);
 analiza lichidului articular (pentru diagnosticul artritei septice) și a altor organe
afectate de complicații.

REACȚIA RIVALTA
Reacția Rivalta este un test care face diferența între exudat și transudat.
Produsul testat poate fi recoltat din cavitățil seroase.
Soluția Rivalta este o soluție de acid acetic 2% care induce precipitarea
proteinelor atunci când ele constituie peste 3 g%, ca în cazul exudatului.
Mod de preparare: un cilindru cu 100ml soluție Rivalta + o picătură din produsul
recoltat = proteinele precipită ca un "nor de fum" în cazul în care acesta este un exudat.

TESTUL DE FAGOCITOZĂ IN VITRO

După inducerea unei inflamații experimentale fagocitele sunt activate și în
contact cu un substrat adecvat vor fagocita și distruge substratul.
Mod de preparare:
• de la un animal cu inflamație experimentală indusă prin injectarea de ulei de
terebentină 0,6ml / 100g-greutate corporală în laba posterioară, trebuie să fie recoltate
probe de sânge pe o soluție anticoagulantă.
• Se pun într-o eprubetă siliconată 100μl probă de sânge + 20μl suspensie de E. coli, ca
substrat pentru fagocitoză
• După 30 de minute de rotație lentă la 370C, din eșantion sunt pregătite frotiuri care
vor fi colorate May-Grünwald Giemsa.

5
• Pe frotiurile sunt numărate 200 leucocitele și se calculează doi indici: procentul de
leucocite care au fagocitat cel puțin un agent patologic (PI = indicele de fagocitoză);
numărul de bacterii fagocitate de 100 leucocite (PA = activitatea fagocitară).

Figura Frotiu de sânge de neutrofile de leucocite care prezintă modificări morfologice

asociate cu fagocitoza. Primele patru cadre arată neutrofile nestimulate normale într-un
fond de eritrocite. In partea de jos patru cadre arată neutrofile fagocitând particule de
zymosan opsonizate de complement (C3bi). Cadrele de la stânga la dreapta arată
progresia fagocitozei.

FEBRA EXPERIMENTALĂ
Șobolani masculi se injecteazăt i.p. cu soluție pirogen 1 ml. După 45 de minute se
măsoară:
 Ritmul cardiac
 Rata respiratorie
 Temperatura rectală
 Numărul total de leucocite
 Formula leucocitară.
În conformitate cu rezultatele la 45 min trebuie diagnosticat stadiul febrei.